Carla Aparecida Pinheiro

Caracterizaccedilatildeo da Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em

Condrossarcomas

Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo da Fundaccedilatildeo PIO XII ndashHospital de Cacircncer de Barretos para obtenccedilatildeo do Tiacutetulo de Mestre em Ciecircncias da Sauacutede Aacuterea de Concentraccedilatildeo Oncologia Orientador Prof Dr Adhemar Longatto Filho Co-orientador Prof Dr Iberecirc Cauduro Soares

Barretos SP 2014

Este projeto foi elaborado e estaacute apresentado de acordo com as normas da Poacutes-Graduaccedilatildeo

do Hospital de Cacircncer de Barretos ndash Fundaccedilatildeo Pio XII baseando-se no Regimento do

Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Oncologia e no Manual de Apresentaccedilatildeo de Dissertaccedilotildees e

Teses do Hospital de Cacircncer de Barretos Os pesquisadores declaram ainda que este

trabalho foi realizado em concordacircncia com o Coacutedigo de Boas Praacuteticas Cientiacuteficas (FAPESP)

natildeo havendo nada em seu conteuacutedo que possa ser considerado como plaacutegio fabricaccedilatildeo ou

falsificaccedilatildeo de dados As opiniotildees hipoacuteteses e conclusotildees ou recomendaccedilotildees expressas

neste material satildeo de responsabilidade dos autores e natildeo necessariamente refletem a visatildeo

da Fundaccedilatildeo Pio XII ndash Hospital de Cacircncer de Barretos

Embora o Nuacutecleo de Apoio ao Pesquisador do Hospital de Cacircncer de Barretos tenha

realizado as anaacutelises estatiacutesticas e orientado sua interpretaccedilatildeo a descriccedilatildeo da metodologia

estatiacutestica a apresentaccedilatildeo dos resultados e suas conclusotildees satildeo de inteira responsabilidade

dos pesquisadores envolvido

IacuteNDICE

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma 1

12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer 3

13 Cultura celular 6

2 JUSTIFICATIVA 8

3 OBJETIVOS

31 Objetivos Gerais 9

32 Objetivos Especiacuteficos 9

4 MATERIAL E MEacuteTODOS 10

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias 11

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo 12

42 Tamanho da Amostra 14

43 Metodologia Estatiacutestica 14

44 Avaliaccedilatildeo dos Riscos Benefiacutecios 14

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias 15

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo 15

52 Cultura de Fibroblastos Normais 18

53 Tecido crio-preservado 19

531 Dados Cliacutenicos 19

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo 31

533 Analise dos dados 43

6 DISCUSSAtildeO 46

7 CONCLUSAtildeO 49

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 50

ANEXOS

Anexo 1 52

Anexo 2 53

Anexo 3 55

Anexo 4 56

RESUMO

Pinheiro CA Caracterizaccedilatildeo da Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Condrossarcomas

Dissertaccedilatildeo (Mestrado) Barretos Hospital de Cacircncer de Barretos 2014

INTRODUCcedilAtildeO O condrossarcoma eacute uma neoplasia maligna de origem mesenquimal O

tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico pois este tumor natildeo responde nem a quimioterapia

nem a radioterapia As alteraccedilotildees geneacuteticas envolvidas com a agressividade desse tumor

ainda natildeo estatildeo bem esclarecidas Uma possiacutevel causa da instabilidade cromossocircmica

envolvendo erro da segregaccedilatildeo mitoacutetica seria a anormalidade funcional eou numeacuterica dos

centrossomos A amplificaccedilatildeo dos centrossomos foi detectada em vaacuterios cacircnceres soacutelidos e

hematopoieacuteticos e estaacute implicada com um mecanismo de geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo

do centrossomo estaacute relacionada com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de

pacientes com tumores malignos OBJETIVO Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

amostras de tecidos tumorais crio-preservados de pacientes portadores de condrossarcoma

MATERIAL E MEacuteTODOS Estudo observacional longitudinal coorte histoacuterica Foi realizada a

anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de tumores de trecircs pacientes

operados em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos

histologicamente classificados na escala de I a III e em tecidos tumorais crio-preservados de

10 amostras pacientes portadores de condrossarcoma atendidos no mesmo serviccedilo

utilizando o anticorpo monoclonal anti y-tubulina por meio dos meacutetodos de

imunocitoquiacutemica e imuno-histoquiacutemica Como controle negativo foram usadas culturas de

fibroblastos linhagem CCD 1059 SK pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica para a anaacutelise da

amplificaccedilatildeo do centrossomo RESULTADOS As culturas celulares de condrossarcoma foram

obtidas de trecircs pacientes com quatro amostras no total pois uma segunda amostra foi

coletada de uma recidiva do mesmo paciente Sendo que esta recidiva era de uma paciente

do sexo feminino grau histoloacutegico III com siacutendrome de Ollier Os outros dois casos eram

grau I e grau III A amplificaccedilatildeo do centrossomo nestas ceacutelulas de cultura primaacuteria variou de

15 a 64 das ceacutelulas A cultura de fibroblastos apresentou uma amplificaccedilatildeo de 4 das

ceacutelulas Nos tecidos crio-preservados dois observadores independentes analisaram cada

amostra e contaram as ceacutelulas coradas com a gama-tubulina verificando a porcentagem de

ceacutelulas acometidas O analista A encontrou amplificaccedilotildees em de meacutedia 14 jaacute o analista B

encontrou em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters nestas

ceacutelulas o analista A encontrou de 0 a 3 clusters por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters

jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters em meacutedia 1 cluster Os centrossomos se

apresentaram amplificados em todas as amostras tanto nas amostras de tecido crio-

preservado como nas amostras de cultura primaacuterias Conclusatildeo A amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do condrossarcoma e

em todas as amostras de tecido crio-preservado sendo que culturas primaacuterias apresentaram

as taxas maiores em relaccedilatildeo agraves amostras de tecido crio-preservado As culturas primaacuterias

todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade dos casos) houve a

formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

PALAVRAS CHAVES Condrossarcoma Teacutecnicas de Cultura de Ceacutelulas Centrossomo Imuno-

histoquiacutemica Prognoacutestico Recidiva Local de Neoplasia

ABSTRACT

Pinheiro CA Characterization of centrosome amplification in chondrosarcomas Dissertation

(Masteracutes degree) Barretos Barretos Cancer Hospital 2014

INTRODUCTION Chondrosarcoma is a malignant tumor that originates from the

mesenchyme layer Surgical treatment is the only option for curative treatment because

chondrosarcoma is highly resistant to chemotherapy and radiotherapy The genetic

background involved in the chondrosarcoma aggressiveness is poorly understood One

possible cause of malignant transformation is chromosomal instability which involves an

error in mitotic segregation due to numerical andor functional abnormalities of

centrosomes The centrosomes amplifications were detected in many solid and

hematopoietic tumors and were recognized to be part of the mechanism responsible for

generating multipolar mitosis chromosomal instabilities and aneuploidy Currently

centrosome amplification is associated with chromosomal instability and the prognosis of

patients with malignant tumors OBJECTIVE To evaluate the centrosome amplification in

cryopreserved samples of patients with chondrosarcoma tumor tissues MATERIAL AND

METHODS We analyzed three primary cultures of tumors of patients operated on in 2012 at

the Department of Orthopedics Barretos Cancer Hospital (Barretos Brazil) and histologically

classified the cryopreserved tumor specimens from 10 patients on a scale of I to III The

patients with chondrosarcoma were treated in the same service using the monoclonal

antibody anti-y-tubulin with immunocytochemistry and immunohistochemistry For the

negative control for the analysis of the centrosome amplification for the

immunocytochemistry technique we used fibroblast cultures CCD line SK 1059 RESULTS

Four samples of chondrosarcoma cultured cells were obtained from three patients One case

was a recurrence of a histological grade III tumor in a female patient with Olliers syndrome

The other two cases were grade I and grade III The centrosome amplification of primary

cultures ranged from 15ndash64 of the cells The cultured fibroblasts showed an amplification

of 4 of that of the cells For the cryopreserved specimens two independent observers

analyzed each sample and counted the cells stained with the gamma-tubulin verifying the

percentage of affected cells Analyst A found amplifications of 14 on average and analyst B

found an average amplification of 1352 With respect to the formation of clusters in these

cells analyst A found 0ndash3 clusters per slide (an average of 08 clusters) and analyst B found

values ranging from 0ndash6 clusters (an average of 1 cluster) The centrosome amplification was

found in all samples CONCLUSION The centrosome amplification was detected in all

samples from primary culture of chondrosarcoma in all samples and cryo-preserved tissue

and primary cultures exhibited higher rates for samples cryo-preserved tissue Primary

cultures all showed clustering And in five cases (half the cases) was the formation of clusters

in cryo-preserved tissues

KEY WORDS Chondrosarcoma Cell Culture Techniques Centrosome Immunohistochemistry Prognosis Neoplasm Recurrence Local

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de

carcinogecircnese (Chan 2011) 4

Figura 2

Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo

imunocitoquimica para anticorpo S100 12

Figura 3

Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas

Imagens obtidas em microscoacutepio invertido com contraste de fase

Orange aumento de 10x 17

Figura 4

Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de

Imunocitoquiacutemica A seta (preto) mostra a formaccedilatildeo de um

cluster com quatro centrossomos 17

Figura 5

Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de

Imunofluorescecircncia 18

Figura 6

Radiografia panoracircmica de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica

em siacutenfise puacutebica direita que se estende tanto para o ramo

puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico inferior com rotura

da cortical e halo de esclerose medular 27

Figura 7

Cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise

puacutebica e anel agrave direita pouco captante com baixa probabilidade

de metaacutestase oacutessea 27

Figura 8

Tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo

liacutetica de anel e halo de esclerose com ruptura da cortical B 28

reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

Figura 9

Ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia

ponderada em T2 com saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo

expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise puacutebica

poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

30

Figura 10

Radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da

siacutenfise puacutebica e ramos puacutebicos 31

Figura 11

Lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em

parafina corada com hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com

presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com aumento da

celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X 32

Figura 12

Radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo

diafisaacuteria em terccedilo meacutedio com aspecto em flocos de neve que

invade partes moles com limites indefinidos Este caso era

acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna

(osteocondroma) que sofreu uma transformaccedilatildeo maligna 33

Figura 13

Exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista

na radiografia figura anterior com circulaccedilatildeo colateral 34

Figura 14

Tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo

de aspecto vegetante em diaacutefise de uacutemero 35

Figura 15

Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas agraves vezes binucleadas e com ateacute

3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a 38

uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e

aumento de 200 vezes

Figura 16 Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I histoloacutegico secundaacuterio a

uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X 39

Figura 17

Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2

centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X 40

Figura 18

Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2

centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X 41

Figura 19

Material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I

histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X 42

Figura 20

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 submetida a

protocolo de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina

A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X 43

Figura 21

Material crio-preservado do caso 2 submetido a protocolo de

imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que

6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

44

Figura 22

Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas

com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico

tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X 45

Figura 23

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento

de 1000 X 46

Figura 24

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no

primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X 47

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

49

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

50

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas

primaacuterias de condrossarcomas)

16

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas

primaacuterias de condrossarcomas

16

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de

fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de

imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

18

Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-

preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica

20

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas analisados por dois

observadores independentes

31

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores

independentes

32

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

44

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster

menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45

LISTA DE ABREVIATURAS

CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa

degC Graus Celsius

Ca +2 Iacuteon caacutelcio

cm2 Centiacutemetros quadrados

CO2 Dioacutexido de carbono

CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular

DAB Diamino Benzidina

DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico

F Feminino

g Gramas

H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio

HE Hematoxilina e eosina

M Masculino

ml Mililitros

MMII Membros inferiores

MMSS Membros superiores

PAF para-formaldeiacutedo

PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)

PCM Material pericentriolar

QT Quimioterapia

RT Radioterapia

TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase

LISTA DE SIacuteMBOLOS

ᵞ Gamma

microg Micrograma

Porcentagem

lt Menor

1

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma

O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e

de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes

estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de

suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]

O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida

Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro

mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]

Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no

tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute

de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]

Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e

metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do

tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente

em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor

[1]

Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de

recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em

contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a

recorrecircncia local eacute de 10 [4]

Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A

radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida

paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave

quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando

inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a

expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o

ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)

inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o

inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que

2

este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento

quimioteraacutepico [7]

Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em

modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores

Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente

agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um

citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de

remodelamento oacutesseo [9]

O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do

gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2

pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]

O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da

localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da

malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta

metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos

casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]

A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que

pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10

anos de 20 a 40 [4 2 9]

O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de

diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a

amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como

estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves

terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros

3

12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer

O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do

nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os

rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o

centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo

do fuso mitoacutetico [10]

O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e

a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle

apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo

frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante

a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e

morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente

dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o

agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos

moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute

comeccedilando a emergir [11]

A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do

centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente

agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e

contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]

Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para

a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos

Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo

de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A

presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois

centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do

fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de

sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o

desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]

4

Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]

Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada

com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]

[14] [15]

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e

sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma

maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas

gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos

perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]

Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as

alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens

celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no

gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da

amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees

5

dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos

foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]

Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores

gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos

tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo

do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor

[20]

Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles

analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As

amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees

malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo

encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos

centrossomos [17]

Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como

biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma

melhor estimativa do prognoacutestico [14]

O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA

genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo

cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo

estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a

ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do

centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor

tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou

regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral

que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53

causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo

centrossomo [21]

A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar

que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de

centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos

soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]

6

A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a

instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim

este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica

em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de

condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes

para os pacientes com condrossarcomas

13 Cultura celular

A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um

meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas

que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um

experimento

Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-

fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do

fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a

partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o

campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se

mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo

explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas

de ceacutelulas dispersas

A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam

rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo

de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas

estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas

manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem

ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo

das ceacutelulas em cultura [26]

A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas

foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais

frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram

7

denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas

isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]

As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais

Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito

mais alta em uma placa de cultura [27]

Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as

ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas

proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e

com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou

EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]

Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas

Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver

multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de

tecidos[26]

Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de

culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser

removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria

dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas

ou meses [26]

Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto

pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade

de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]

8

2 JUSTIFICATIVA

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como

uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral

Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo

baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos

extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica

diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do

centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa

maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese

O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre

tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio

eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau

histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau

histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos

Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e

radioterapia permanecem por serem elucidados

Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com

e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

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16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

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51

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21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

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28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

Este projeto foi elaborado e estaacute apresentado de acordo com as normas da Poacutes-Graduaccedilatildeo

do Hospital de Cacircncer de Barretos ndash Fundaccedilatildeo Pio XII baseando-se no Regimento do

Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Oncologia e no Manual de Apresentaccedilatildeo de Dissertaccedilotildees e

Teses do Hospital de Cacircncer de Barretos Os pesquisadores declaram ainda que este

trabalho foi realizado em concordacircncia com o Coacutedigo de Boas Praacuteticas Cientiacuteficas (FAPESP)

natildeo havendo nada em seu conteuacutedo que possa ser considerado como plaacutegio fabricaccedilatildeo ou

falsificaccedilatildeo de dados As opiniotildees hipoacuteteses e conclusotildees ou recomendaccedilotildees expressas

neste material satildeo de responsabilidade dos autores e natildeo necessariamente refletem a visatildeo

da Fundaccedilatildeo Pio XII ndash Hospital de Cacircncer de Barretos

Embora o Nuacutecleo de Apoio ao Pesquisador do Hospital de Cacircncer de Barretos tenha

realizado as anaacutelises estatiacutesticas e orientado sua interpretaccedilatildeo a descriccedilatildeo da metodologia

estatiacutestica a apresentaccedilatildeo dos resultados e suas conclusotildees satildeo de inteira responsabilidade

dos pesquisadores envolvido

IacuteNDICE

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma 1

12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer 3

13 Cultura celular 6

2 JUSTIFICATIVA 8

3 OBJETIVOS

31 Objetivos Gerais 9

32 Objetivos Especiacuteficos 9

4 MATERIAL E MEacuteTODOS 10

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias 11

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo 12

42 Tamanho da Amostra 14

43 Metodologia Estatiacutestica 14

44 Avaliaccedilatildeo dos Riscos Benefiacutecios 14

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias 15

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo 15

52 Cultura de Fibroblastos Normais 18

53 Tecido crio-preservado 19

531 Dados Cliacutenicos 19

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo 31

533 Analise dos dados 43

6 DISCUSSAtildeO 46

7 CONCLUSAtildeO 49

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 50

ANEXOS

Anexo 1 52

Anexo 2 53

Anexo 3 55

Anexo 4 56

RESUMO

Pinheiro CA Caracterizaccedilatildeo da Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Condrossarcomas

Dissertaccedilatildeo (Mestrado) Barretos Hospital de Cacircncer de Barretos 2014

INTRODUCcedilAtildeO O condrossarcoma eacute uma neoplasia maligna de origem mesenquimal O

tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico pois este tumor natildeo responde nem a quimioterapia

nem a radioterapia As alteraccedilotildees geneacuteticas envolvidas com a agressividade desse tumor

ainda natildeo estatildeo bem esclarecidas Uma possiacutevel causa da instabilidade cromossocircmica

envolvendo erro da segregaccedilatildeo mitoacutetica seria a anormalidade funcional eou numeacuterica dos

centrossomos A amplificaccedilatildeo dos centrossomos foi detectada em vaacuterios cacircnceres soacutelidos e

hematopoieacuteticos e estaacute implicada com um mecanismo de geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo

do centrossomo estaacute relacionada com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de

pacientes com tumores malignos OBJETIVO Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

amostras de tecidos tumorais crio-preservados de pacientes portadores de condrossarcoma

MATERIAL E MEacuteTODOS Estudo observacional longitudinal coorte histoacuterica Foi realizada a

anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de tumores de trecircs pacientes

operados em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos

histologicamente classificados na escala de I a III e em tecidos tumorais crio-preservados de

10 amostras pacientes portadores de condrossarcoma atendidos no mesmo serviccedilo

utilizando o anticorpo monoclonal anti y-tubulina por meio dos meacutetodos de

imunocitoquiacutemica e imuno-histoquiacutemica Como controle negativo foram usadas culturas de

fibroblastos linhagem CCD 1059 SK pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica para a anaacutelise da

amplificaccedilatildeo do centrossomo RESULTADOS As culturas celulares de condrossarcoma foram

obtidas de trecircs pacientes com quatro amostras no total pois uma segunda amostra foi

coletada de uma recidiva do mesmo paciente Sendo que esta recidiva era de uma paciente

do sexo feminino grau histoloacutegico III com siacutendrome de Ollier Os outros dois casos eram

grau I e grau III A amplificaccedilatildeo do centrossomo nestas ceacutelulas de cultura primaacuteria variou de

15 a 64 das ceacutelulas A cultura de fibroblastos apresentou uma amplificaccedilatildeo de 4 das

ceacutelulas Nos tecidos crio-preservados dois observadores independentes analisaram cada

amostra e contaram as ceacutelulas coradas com a gama-tubulina verificando a porcentagem de

ceacutelulas acometidas O analista A encontrou amplificaccedilotildees em de meacutedia 14 jaacute o analista B

encontrou em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters nestas

ceacutelulas o analista A encontrou de 0 a 3 clusters por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters

jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters em meacutedia 1 cluster Os centrossomos se

apresentaram amplificados em todas as amostras tanto nas amostras de tecido crio-

preservado como nas amostras de cultura primaacuterias Conclusatildeo A amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do condrossarcoma e

em todas as amostras de tecido crio-preservado sendo que culturas primaacuterias apresentaram

as taxas maiores em relaccedilatildeo agraves amostras de tecido crio-preservado As culturas primaacuterias

todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade dos casos) houve a

formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

PALAVRAS CHAVES Condrossarcoma Teacutecnicas de Cultura de Ceacutelulas Centrossomo Imuno-

histoquiacutemica Prognoacutestico Recidiva Local de Neoplasia

ABSTRACT

Pinheiro CA Characterization of centrosome amplification in chondrosarcomas Dissertation

(Masteracutes degree) Barretos Barretos Cancer Hospital 2014

INTRODUCTION Chondrosarcoma is a malignant tumor that originates from the

mesenchyme layer Surgical treatment is the only option for curative treatment because

chondrosarcoma is highly resistant to chemotherapy and radiotherapy The genetic

background involved in the chondrosarcoma aggressiveness is poorly understood One

possible cause of malignant transformation is chromosomal instability which involves an

error in mitotic segregation due to numerical andor functional abnormalities of

centrosomes The centrosomes amplifications were detected in many solid and

hematopoietic tumors and were recognized to be part of the mechanism responsible for

generating multipolar mitosis chromosomal instabilities and aneuploidy Currently

centrosome amplification is associated with chromosomal instability and the prognosis of

patients with malignant tumors OBJECTIVE To evaluate the centrosome amplification in

cryopreserved samples of patients with chondrosarcoma tumor tissues MATERIAL AND

METHODS We analyzed three primary cultures of tumors of patients operated on in 2012 at

the Department of Orthopedics Barretos Cancer Hospital (Barretos Brazil) and histologically

classified the cryopreserved tumor specimens from 10 patients on a scale of I to III The

patients with chondrosarcoma were treated in the same service using the monoclonal

antibody anti-y-tubulin with immunocytochemistry and immunohistochemistry For the

negative control for the analysis of the centrosome amplification for the

immunocytochemistry technique we used fibroblast cultures CCD line SK 1059 RESULTS

Four samples of chondrosarcoma cultured cells were obtained from three patients One case

was a recurrence of a histological grade III tumor in a female patient with Olliers syndrome

The other two cases were grade I and grade III The centrosome amplification of primary

cultures ranged from 15ndash64 of the cells The cultured fibroblasts showed an amplification

of 4 of that of the cells For the cryopreserved specimens two independent observers

analyzed each sample and counted the cells stained with the gamma-tubulin verifying the

percentage of affected cells Analyst A found amplifications of 14 on average and analyst B

found an average amplification of 1352 With respect to the formation of clusters in these

cells analyst A found 0ndash3 clusters per slide (an average of 08 clusters) and analyst B found

values ranging from 0ndash6 clusters (an average of 1 cluster) The centrosome amplification was

found in all samples CONCLUSION The centrosome amplification was detected in all

samples from primary culture of chondrosarcoma in all samples and cryo-preserved tissue

and primary cultures exhibited higher rates for samples cryo-preserved tissue Primary

cultures all showed clustering And in five cases (half the cases) was the formation of clusters

in cryo-preserved tissues

KEY WORDS Chondrosarcoma Cell Culture Techniques Centrosome Immunohistochemistry Prognosis Neoplasm Recurrence Local

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de

carcinogecircnese (Chan 2011) 4

Figura 2

Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo

imunocitoquimica para anticorpo S100 12

Figura 3

Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas

Imagens obtidas em microscoacutepio invertido com contraste de fase

Orange aumento de 10x 17

Figura 4

Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de

Imunocitoquiacutemica A seta (preto) mostra a formaccedilatildeo de um

cluster com quatro centrossomos 17

Figura 5

Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de

Imunofluorescecircncia 18

Figura 6

Radiografia panoracircmica de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica

em siacutenfise puacutebica direita que se estende tanto para o ramo

puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico inferior com rotura

da cortical e halo de esclerose medular 27

Figura 7

Cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise

puacutebica e anel agrave direita pouco captante com baixa probabilidade

de metaacutestase oacutessea 27

Figura 8

Tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo

liacutetica de anel e halo de esclerose com ruptura da cortical B 28

reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

Figura 9

Ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia

ponderada em T2 com saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo

expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise puacutebica

poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

30

Figura 10

Radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da

siacutenfise puacutebica e ramos puacutebicos 31

Figura 11

Lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em

parafina corada com hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com

presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com aumento da

celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X 32

Figura 12

Radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo

diafisaacuteria em terccedilo meacutedio com aspecto em flocos de neve que

invade partes moles com limites indefinidos Este caso era

acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna

(osteocondroma) que sofreu uma transformaccedilatildeo maligna 33

Figura 13

Exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista

na radiografia figura anterior com circulaccedilatildeo colateral 34

Figura 14

Tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo

de aspecto vegetante em diaacutefise de uacutemero 35

Figura 15

Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas agraves vezes binucleadas e com ateacute

3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a 38

uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e

aumento de 200 vezes

Figura 16 Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I histoloacutegico secundaacuterio a

uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X 39

Figura 17

Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2

centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X 40

Figura 18

Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2

centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X 41

Figura 19

Material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I

histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X 42

Figura 20

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 submetida a

protocolo de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina

A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X 43

Figura 21

Material crio-preservado do caso 2 submetido a protocolo de

imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que

6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

44

Figura 22

Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas

com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico

tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X 45

Figura 23

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento

de 1000 X 46

Figura 24

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no

primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X 47

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

49

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

50

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas

primaacuterias de condrossarcomas)

16

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas

primaacuterias de condrossarcomas

16

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de

fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de

imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

18

Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-

preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica

20

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas analisados por dois

observadores independentes

31

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores

independentes

32

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

44

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster

menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45

LISTA DE ABREVIATURAS

CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa

degC Graus Celsius

Ca +2 Iacuteon caacutelcio

cm2 Centiacutemetros quadrados

CO2 Dioacutexido de carbono

CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular

DAB Diamino Benzidina

DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico

F Feminino

g Gramas

H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio

HE Hematoxilina e eosina

M Masculino

ml Mililitros

MMII Membros inferiores

MMSS Membros superiores

PAF para-formaldeiacutedo

PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)

PCM Material pericentriolar

QT Quimioterapia

RT Radioterapia

TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase

LISTA DE SIacuteMBOLOS

ᵞ Gamma

microg Micrograma

Porcentagem

lt Menor

1

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma

O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e

de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes

estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de

suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]

O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida

Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro

mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]

Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no

tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute

de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]

Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e

metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do

tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente

em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor

[1]

Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de

recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em

contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a

recorrecircncia local eacute de 10 [4]

Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A

radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida

paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave

quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando

inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a

expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o

ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)

inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o

inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que

2

este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento

quimioteraacutepico [7]

Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em

modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores

Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente

agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um

citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de

remodelamento oacutesseo [9]

O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do

gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2

pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]

O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da

localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da

malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta

metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos

casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]

A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que

pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10

anos de 20 a 40 [4 2 9]

O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de

diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a

amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como

estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves

terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros

3

12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer

O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do

nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os

rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o

centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo

do fuso mitoacutetico [10]

O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e

a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle

apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo

frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante

a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e

morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente

dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o

agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos

moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute

comeccedilando a emergir [11]

A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do

centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente

agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e

contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]

Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para

a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos

Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo

de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A

presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois

centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do

fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de

sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o

desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]

4

Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]

Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada

com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]

[14] [15]

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e

sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma

maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas

gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos

perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]

Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as

alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens

celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no

gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da

amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees

5

dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos

foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]

Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores

gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos

tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo

do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor

[20]

Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles

analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As

amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees

malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo

encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos

centrossomos [17]

Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como

biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma

melhor estimativa do prognoacutestico [14]

O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA

genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo

cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo

estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a

ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do

centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor

tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou

regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral

que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53

causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo

centrossomo [21]

A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar

que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de

centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos

soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]

6

A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a

instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim

este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica

em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de

condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes

para os pacientes com condrossarcomas

13 Cultura celular

A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um

meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas

que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um

experimento

Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-

fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do

fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a

partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o

campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se

mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo

explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas

de ceacutelulas dispersas

A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam

rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo

de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas

estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas

manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem

ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo

das ceacutelulas em cultura [26]

A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas

foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais

frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram

7

denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas

isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]

As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais

Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito

mais alta em uma placa de cultura [27]

Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as

ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas

proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e

com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou

EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]

Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas

Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver

multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de

tecidos[26]

Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de

culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser

removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria

dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas

ou meses [26]

Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto

pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade

de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]

8

2 JUSTIFICATIVA

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como

uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral

Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo

baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos

extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica

diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do

centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa

maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese

O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre

tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio

eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau

histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau

histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos

Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e

radioterapia permanecem por serem elucidados

Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com

e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

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9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

IacuteNDICE

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma 1

12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer 3

13 Cultura celular 6

2 JUSTIFICATIVA 8

3 OBJETIVOS

31 Objetivos Gerais 9

32 Objetivos Especiacuteficos 9

4 MATERIAL E MEacuteTODOS 10

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias 11

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo 12

42 Tamanho da Amostra 14

43 Metodologia Estatiacutestica 14

44 Avaliaccedilatildeo dos Riscos Benefiacutecios 14

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias 15

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo 15

52 Cultura de Fibroblastos Normais 18

53 Tecido crio-preservado 19

531 Dados Cliacutenicos 19

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo 31

533 Analise dos dados 43

6 DISCUSSAtildeO 46

7 CONCLUSAtildeO 49

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 50

ANEXOS

Anexo 1 52

Anexo 2 53

Anexo 3 55

Anexo 4 56

RESUMO

Pinheiro CA Caracterizaccedilatildeo da Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Condrossarcomas

Dissertaccedilatildeo (Mestrado) Barretos Hospital de Cacircncer de Barretos 2014

INTRODUCcedilAtildeO O condrossarcoma eacute uma neoplasia maligna de origem mesenquimal O

tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico pois este tumor natildeo responde nem a quimioterapia

nem a radioterapia As alteraccedilotildees geneacuteticas envolvidas com a agressividade desse tumor

ainda natildeo estatildeo bem esclarecidas Uma possiacutevel causa da instabilidade cromossocircmica

envolvendo erro da segregaccedilatildeo mitoacutetica seria a anormalidade funcional eou numeacuterica dos

centrossomos A amplificaccedilatildeo dos centrossomos foi detectada em vaacuterios cacircnceres soacutelidos e

hematopoieacuteticos e estaacute implicada com um mecanismo de geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo

do centrossomo estaacute relacionada com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de

pacientes com tumores malignos OBJETIVO Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

amostras de tecidos tumorais crio-preservados de pacientes portadores de condrossarcoma

MATERIAL E MEacuteTODOS Estudo observacional longitudinal coorte histoacuterica Foi realizada a

anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de tumores de trecircs pacientes

operados em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos

histologicamente classificados na escala de I a III e em tecidos tumorais crio-preservados de

10 amostras pacientes portadores de condrossarcoma atendidos no mesmo serviccedilo

utilizando o anticorpo monoclonal anti y-tubulina por meio dos meacutetodos de

imunocitoquiacutemica e imuno-histoquiacutemica Como controle negativo foram usadas culturas de

fibroblastos linhagem CCD 1059 SK pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica para a anaacutelise da

amplificaccedilatildeo do centrossomo RESULTADOS As culturas celulares de condrossarcoma foram

obtidas de trecircs pacientes com quatro amostras no total pois uma segunda amostra foi

coletada de uma recidiva do mesmo paciente Sendo que esta recidiva era de uma paciente

do sexo feminino grau histoloacutegico III com siacutendrome de Ollier Os outros dois casos eram

grau I e grau III A amplificaccedilatildeo do centrossomo nestas ceacutelulas de cultura primaacuteria variou de

15 a 64 das ceacutelulas A cultura de fibroblastos apresentou uma amplificaccedilatildeo de 4 das

ceacutelulas Nos tecidos crio-preservados dois observadores independentes analisaram cada

amostra e contaram as ceacutelulas coradas com a gama-tubulina verificando a porcentagem de

ceacutelulas acometidas O analista A encontrou amplificaccedilotildees em de meacutedia 14 jaacute o analista B

encontrou em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters nestas

ceacutelulas o analista A encontrou de 0 a 3 clusters por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters

jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters em meacutedia 1 cluster Os centrossomos se

apresentaram amplificados em todas as amostras tanto nas amostras de tecido crio-

preservado como nas amostras de cultura primaacuterias Conclusatildeo A amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do condrossarcoma e

em todas as amostras de tecido crio-preservado sendo que culturas primaacuterias apresentaram

as taxas maiores em relaccedilatildeo agraves amostras de tecido crio-preservado As culturas primaacuterias

todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade dos casos) houve a

formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

PALAVRAS CHAVES Condrossarcoma Teacutecnicas de Cultura de Ceacutelulas Centrossomo Imuno-

histoquiacutemica Prognoacutestico Recidiva Local de Neoplasia

ABSTRACT

Pinheiro CA Characterization of centrosome amplification in chondrosarcomas Dissertation

(Masteracutes degree) Barretos Barretos Cancer Hospital 2014

INTRODUCTION Chondrosarcoma is a malignant tumor that originates from the

mesenchyme layer Surgical treatment is the only option for curative treatment because

chondrosarcoma is highly resistant to chemotherapy and radiotherapy The genetic

background involved in the chondrosarcoma aggressiveness is poorly understood One

possible cause of malignant transformation is chromosomal instability which involves an

error in mitotic segregation due to numerical andor functional abnormalities of

centrosomes The centrosomes amplifications were detected in many solid and

hematopoietic tumors and were recognized to be part of the mechanism responsible for

generating multipolar mitosis chromosomal instabilities and aneuploidy Currently

centrosome amplification is associated with chromosomal instability and the prognosis of

patients with malignant tumors OBJECTIVE To evaluate the centrosome amplification in

cryopreserved samples of patients with chondrosarcoma tumor tissues MATERIAL AND

METHODS We analyzed three primary cultures of tumors of patients operated on in 2012 at

the Department of Orthopedics Barretos Cancer Hospital (Barretos Brazil) and histologically

classified the cryopreserved tumor specimens from 10 patients on a scale of I to III The

patients with chondrosarcoma were treated in the same service using the monoclonal

antibody anti-y-tubulin with immunocytochemistry and immunohistochemistry For the

negative control for the analysis of the centrosome amplification for the

immunocytochemistry technique we used fibroblast cultures CCD line SK 1059 RESULTS

Four samples of chondrosarcoma cultured cells were obtained from three patients One case

was a recurrence of a histological grade III tumor in a female patient with Olliers syndrome

The other two cases were grade I and grade III The centrosome amplification of primary

cultures ranged from 15ndash64 of the cells The cultured fibroblasts showed an amplification

of 4 of that of the cells For the cryopreserved specimens two independent observers

analyzed each sample and counted the cells stained with the gamma-tubulin verifying the

percentage of affected cells Analyst A found amplifications of 14 on average and analyst B

found an average amplification of 1352 With respect to the formation of clusters in these

cells analyst A found 0ndash3 clusters per slide (an average of 08 clusters) and analyst B found

values ranging from 0ndash6 clusters (an average of 1 cluster) The centrosome amplification was

found in all samples CONCLUSION The centrosome amplification was detected in all

samples from primary culture of chondrosarcoma in all samples and cryo-preserved tissue

and primary cultures exhibited higher rates for samples cryo-preserved tissue Primary

cultures all showed clustering And in five cases (half the cases) was the formation of clusters

in cryo-preserved tissues

KEY WORDS Chondrosarcoma Cell Culture Techniques Centrosome Immunohistochemistry Prognosis Neoplasm Recurrence Local

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de

carcinogecircnese (Chan 2011) 4

Figura 2

Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo

imunocitoquimica para anticorpo S100 12

Figura 3

Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas

Imagens obtidas em microscoacutepio invertido com contraste de fase

Orange aumento de 10x 17

Figura 4

Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de

Imunocitoquiacutemica A seta (preto) mostra a formaccedilatildeo de um

cluster com quatro centrossomos 17

Figura 5

Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de

Imunofluorescecircncia 18

Figura 6

Radiografia panoracircmica de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica

em siacutenfise puacutebica direita que se estende tanto para o ramo

puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico inferior com rotura

da cortical e halo de esclerose medular 27

Figura 7

Cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise

puacutebica e anel agrave direita pouco captante com baixa probabilidade

de metaacutestase oacutessea 27

Figura 8

Tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo

liacutetica de anel e halo de esclerose com ruptura da cortical B 28

reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

Figura 9

Ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia

ponderada em T2 com saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo

expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise puacutebica

poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

30

Figura 10

Radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da

siacutenfise puacutebica e ramos puacutebicos 31

Figura 11

Lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em

parafina corada com hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com

presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com aumento da

celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X 32

Figura 12

Radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo

diafisaacuteria em terccedilo meacutedio com aspecto em flocos de neve que

invade partes moles com limites indefinidos Este caso era

acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna

(osteocondroma) que sofreu uma transformaccedilatildeo maligna 33

Figura 13

Exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista

na radiografia figura anterior com circulaccedilatildeo colateral 34

Figura 14

Tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo

de aspecto vegetante em diaacutefise de uacutemero 35

Figura 15

Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas agraves vezes binucleadas e com ateacute

3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a 38

uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e

aumento de 200 vezes

Figura 16 Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I histoloacutegico secundaacuterio a

uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X 39

Figura 17

Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2

centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X 40

Figura 18

Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2

centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X 41

Figura 19

Material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I

histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X 42

Figura 20

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 submetida a

protocolo de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina

A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X 43

Figura 21

Material crio-preservado do caso 2 submetido a protocolo de

imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que

6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

44

Figura 22

Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas

com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico

tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X 45

Figura 23

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento

de 1000 X 46

Figura 24

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no

primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X 47

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

49

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

50

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas

primaacuterias de condrossarcomas)

16

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas

primaacuterias de condrossarcomas

16

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de

fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de

imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

18

Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-

preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica

20

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas analisados por dois

observadores independentes

31

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores

independentes

32

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

44

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster

menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45

LISTA DE ABREVIATURAS

CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa

degC Graus Celsius

Ca +2 Iacuteon caacutelcio

cm2 Centiacutemetros quadrados

CO2 Dioacutexido de carbono

CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular

DAB Diamino Benzidina

DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico

F Feminino

g Gramas

H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio

HE Hematoxilina e eosina

M Masculino

ml Mililitros

MMII Membros inferiores

MMSS Membros superiores

PAF para-formaldeiacutedo

PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)

PCM Material pericentriolar

QT Quimioterapia

RT Radioterapia

TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase

LISTA DE SIacuteMBOLOS

ᵞ Gamma

microg Micrograma

Porcentagem

lt Menor

1

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma

O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e

de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes

estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de

suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]

O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida

Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro

mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]

Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no

tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute

de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]

Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e

metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do

tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente

em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor

[1]

Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de

recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em

contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a

recorrecircncia local eacute de 10 [4]

Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A

radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida

paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave

quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando

inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a

expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o

ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)

inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o

inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que

2

este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento

quimioteraacutepico [7]

Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em

modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores

Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente

agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um

citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de

remodelamento oacutesseo [9]

O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do

gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2

pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]

O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da

localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da

malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta

metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos

casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]

A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que

pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10

anos de 20 a 40 [4 2 9]

O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de

diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a

amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como

estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves

terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros

3

12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer

O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do

nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os

rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o

centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo

do fuso mitoacutetico [10]

O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e

a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle

apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo

frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante

a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e

morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente

dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o

agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos

moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute

comeccedilando a emergir [11]

A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do

centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente

agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e

contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]

Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para

a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos

Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo

de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A

presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois

centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do

fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de

sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o

desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]

4

Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]

Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada

com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]

[14] [15]

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e

sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma

maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas

gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos

perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]

Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as

alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens

celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no

gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da

amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees

5

dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos

foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]

Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores

gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos

tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo

do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor

[20]

Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles

analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As

amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees

malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo

encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos

centrossomos [17]

Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como

biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma

melhor estimativa do prognoacutestico [14]

O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA

genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo

cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo

estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a

ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do

centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor

tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou

regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral

que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53

causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo

centrossomo [21]

A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar

que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de

centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos

soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]

6

A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a

instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim

este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica

em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de

condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes

para os pacientes com condrossarcomas

13 Cultura celular

A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um

meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas

que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um

experimento

Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-

fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do

fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a

partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o

campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se

mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo

explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas

de ceacutelulas dispersas

A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam

rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo

de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas

estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas

manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem

ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo

das ceacutelulas em cultura [26]

A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas

foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais

frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram

7

denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas

isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]

As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais

Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito

mais alta em uma placa de cultura [27]

Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as

ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas

proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e

com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou

EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]

Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas

Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver

multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de

tecidos[26]

Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de

culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser

removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria

dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas

ou meses [26]

Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto

pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade

de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]

8

2 JUSTIFICATIVA

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como

uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral

Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo

baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos

extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica

diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do

centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa

maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese

O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre

tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio

eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau

histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau

histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos

Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e

radioterapia permanecem por serem elucidados

Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com

e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

53 Tecido crio-preservado 19

531 Dados Cliacutenicos 19

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo 31

533 Analise dos dados 43

6 DISCUSSAtildeO 46

7 CONCLUSAtildeO 49

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 50

ANEXOS

Anexo 1 52

Anexo 2 53

Anexo 3 55

Anexo 4 56

RESUMO

Pinheiro CA Caracterizaccedilatildeo da Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Condrossarcomas

Dissertaccedilatildeo (Mestrado) Barretos Hospital de Cacircncer de Barretos 2014

INTRODUCcedilAtildeO O condrossarcoma eacute uma neoplasia maligna de origem mesenquimal O

tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico pois este tumor natildeo responde nem a quimioterapia

nem a radioterapia As alteraccedilotildees geneacuteticas envolvidas com a agressividade desse tumor

ainda natildeo estatildeo bem esclarecidas Uma possiacutevel causa da instabilidade cromossocircmica

envolvendo erro da segregaccedilatildeo mitoacutetica seria a anormalidade funcional eou numeacuterica dos

centrossomos A amplificaccedilatildeo dos centrossomos foi detectada em vaacuterios cacircnceres soacutelidos e

hematopoieacuteticos e estaacute implicada com um mecanismo de geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo

do centrossomo estaacute relacionada com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de

pacientes com tumores malignos OBJETIVO Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

amostras de tecidos tumorais crio-preservados de pacientes portadores de condrossarcoma

MATERIAL E MEacuteTODOS Estudo observacional longitudinal coorte histoacuterica Foi realizada a

anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de tumores de trecircs pacientes

operados em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos

histologicamente classificados na escala de I a III e em tecidos tumorais crio-preservados de

10 amostras pacientes portadores de condrossarcoma atendidos no mesmo serviccedilo

utilizando o anticorpo monoclonal anti y-tubulina por meio dos meacutetodos de

imunocitoquiacutemica e imuno-histoquiacutemica Como controle negativo foram usadas culturas de

fibroblastos linhagem CCD 1059 SK pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica para a anaacutelise da

amplificaccedilatildeo do centrossomo RESULTADOS As culturas celulares de condrossarcoma foram

obtidas de trecircs pacientes com quatro amostras no total pois uma segunda amostra foi

coletada de uma recidiva do mesmo paciente Sendo que esta recidiva era de uma paciente

do sexo feminino grau histoloacutegico III com siacutendrome de Ollier Os outros dois casos eram

grau I e grau III A amplificaccedilatildeo do centrossomo nestas ceacutelulas de cultura primaacuteria variou de

15 a 64 das ceacutelulas A cultura de fibroblastos apresentou uma amplificaccedilatildeo de 4 das

ceacutelulas Nos tecidos crio-preservados dois observadores independentes analisaram cada

amostra e contaram as ceacutelulas coradas com a gama-tubulina verificando a porcentagem de

ceacutelulas acometidas O analista A encontrou amplificaccedilotildees em de meacutedia 14 jaacute o analista B

encontrou em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters nestas

ceacutelulas o analista A encontrou de 0 a 3 clusters por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters

jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters em meacutedia 1 cluster Os centrossomos se

apresentaram amplificados em todas as amostras tanto nas amostras de tecido crio-

preservado como nas amostras de cultura primaacuterias Conclusatildeo A amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do condrossarcoma e

em todas as amostras de tecido crio-preservado sendo que culturas primaacuterias apresentaram

as taxas maiores em relaccedilatildeo agraves amostras de tecido crio-preservado As culturas primaacuterias

todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade dos casos) houve a

formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

PALAVRAS CHAVES Condrossarcoma Teacutecnicas de Cultura de Ceacutelulas Centrossomo Imuno-

histoquiacutemica Prognoacutestico Recidiva Local de Neoplasia

ABSTRACT

Pinheiro CA Characterization of centrosome amplification in chondrosarcomas Dissertation

(Masteracutes degree) Barretos Barretos Cancer Hospital 2014

INTRODUCTION Chondrosarcoma is a malignant tumor that originates from the

mesenchyme layer Surgical treatment is the only option for curative treatment because

chondrosarcoma is highly resistant to chemotherapy and radiotherapy The genetic

background involved in the chondrosarcoma aggressiveness is poorly understood One

possible cause of malignant transformation is chromosomal instability which involves an

error in mitotic segregation due to numerical andor functional abnormalities of

centrosomes The centrosomes amplifications were detected in many solid and

hematopoietic tumors and were recognized to be part of the mechanism responsible for

generating multipolar mitosis chromosomal instabilities and aneuploidy Currently

centrosome amplification is associated with chromosomal instability and the prognosis of

patients with malignant tumors OBJECTIVE To evaluate the centrosome amplification in

cryopreserved samples of patients with chondrosarcoma tumor tissues MATERIAL AND

METHODS We analyzed three primary cultures of tumors of patients operated on in 2012 at

the Department of Orthopedics Barretos Cancer Hospital (Barretos Brazil) and histologically

classified the cryopreserved tumor specimens from 10 patients on a scale of I to III The

patients with chondrosarcoma were treated in the same service using the monoclonal

antibody anti-y-tubulin with immunocytochemistry and immunohistochemistry For the

negative control for the analysis of the centrosome amplification for the

immunocytochemistry technique we used fibroblast cultures CCD line SK 1059 RESULTS

Four samples of chondrosarcoma cultured cells were obtained from three patients One case

was a recurrence of a histological grade III tumor in a female patient with Olliers syndrome

The other two cases were grade I and grade III The centrosome amplification of primary

cultures ranged from 15ndash64 of the cells The cultured fibroblasts showed an amplification

of 4 of that of the cells For the cryopreserved specimens two independent observers

analyzed each sample and counted the cells stained with the gamma-tubulin verifying the

percentage of affected cells Analyst A found amplifications of 14 on average and analyst B

found an average amplification of 1352 With respect to the formation of clusters in these

cells analyst A found 0ndash3 clusters per slide (an average of 08 clusters) and analyst B found

values ranging from 0ndash6 clusters (an average of 1 cluster) The centrosome amplification was

found in all samples CONCLUSION The centrosome amplification was detected in all

samples from primary culture of chondrosarcoma in all samples and cryo-preserved tissue

and primary cultures exhibited higher rates for samples cryo-preserved tissue Primary

cultures all showed clustering And in five cases (half the cases) was the formation of clusters

in cryo-preserved tissues

KEY WORDS Chondrosarcoma Cell Culture Techniques Centrosome Immunohistochemistry Prognosis Neoplasm Recurrence Local

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de

carcinogecircnese (Chan 2011) 4

Figura 2

Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo

imunocitoquimica para anticorpo S100 12

Figura 3

Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas

Imagens obtidas em microscoacutepio invertido com contraste de fase

Orange aumento de 10x 17

Figura 4

Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de

Imunocitoquiacutemica A seta (preto) mostra a formaccedilatildeo de um

cluster com quatro centrossomos 17

Figura 5

Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de

Imunofluorescecircncia 18

Figura 6

Radiografia panoracircmica de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica

em siacutenfise puacutebica direita que se estende tanto para o ramo

puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico inferior com rotura

da cortical e halo de esclerose medular 27

Figura 7

Cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise

puacutebica e anel agrave direita pouco captante com baixa probabilidade

de metaacutestase oacutessea 27

Figura 8

Tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo

liacutetica de anel e halo de esclerose com ruptura da cortical B 28

reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

Figura 9

Ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia

ponderada em T2 com saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo

expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise puacutebica

poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

30

Figura 10

Radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da

siacutenfise puacutebica e ramos puacutebicos 31

Figura 11

Lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em

parafina corada com hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com

presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com aumento da

celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X 32

Figura 12

Radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo

diafisaacuteria em terccedilo meacutedio com aspecto em flocos de neve que

invade partes moles com limites indefinidos Este caso era

acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna

(osteocondroma) que sofreu uma transformaccedilatildeo maligna 33

Figura 13

Exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista

na radiografia figura anterior com circulaccedilatildeo colateral 34

Figura 14

Tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo

de aspecto vegetante em diaacutefise de uacutemero 35

Figura 15

Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas agraves vezes binucleadas e com ateacute

3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a 38

uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e

aumento de 200 vezes

Figura 16 Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I histoloacutegico secundaacuterio a

uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X 39

Figura 17

Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2

centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X 40

Figura 18

Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2

centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X 41

Figura 19

Material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I

histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X 42

Figura 20

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 submetida a

protocolo de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina

A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X 43

Figura 21

Material crio-preservado do caso 2 submetido a protocolo de

imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que

6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

44

Figura 22

Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas

com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico

tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X 45

Figura 23

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento

de 1000 X 46

Figura 24

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no

primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X 47

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

49

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

50

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas

primaacuterias de condrossarcomas)

16

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas

primaacuterias de condrossarcomas

16

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de

fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de

imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

18

Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-

preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica

20

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas analisados por dois

observadores independentes

31

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores

independentes

32

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

44

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster

menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45

LISTA DE ABREVIATURAS

CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa

degC Graus Celsius

Ca +2 Iacuteon caacutelcio

cm2 Centiacutemetros quadrados

CO2 Dioacutexido de carbono

CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular

DAB Diamino Benzidina

DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico

F Feminino

g Gramas

H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio

HE Hematoxilina e eosina

M Masculino

ml Mililitros

MMII Membros inferiores

MMSS Membros superiores

PAF para-formaldeiacutedo

PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)

PCM Material pericentriolar

QT Quimioterapia

RT Radioterapia

TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase

LISTA DE SIacuteMBOLOS

ᵞ Gamma

microg Micrograma

Porcentagem

lt Menor

1

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma

O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e

de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes

estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de

suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]

O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida

Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro

mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]

Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no

tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute

de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]

Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e

metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do

tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente

em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor

[1]

Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de

recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em

contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a

recorrecircncia local eacute de 10 [4]

Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A

radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida

paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave

quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando

inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a

expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o

ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)

inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o

inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que

2

este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento

quimioteraacutepico [7]

Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em

modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores

Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente

agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um

citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de

remodelamento oacutesseo [9]

O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do

gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2

pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]

O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da

localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da

malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta

metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos

casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]

A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que

pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10

anos de 20 a 40 [4 2 9]

O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de

diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a

amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como

estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves

terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros

3

12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer

O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do

nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os

rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o

centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo

do fuso mitoacutetico [10]

O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e

a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle

apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo

frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante

a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e

morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente

dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o

agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos

moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute

comeccedilando a emergir [11]

A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do

centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente

agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e

contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]

Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para

a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos

Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo

de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A

presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois

centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do

fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de

sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o

desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]

4

Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]

Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada

com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]

[14] [15]

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e

sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma

maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas

gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos

perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]

Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as

alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens

celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no

gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da

amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees

5

dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos

foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]

Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores

gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos

tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo

do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor

[20]

Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles

analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As

amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees

malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo

encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos

centrossomos [17]

Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como

biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma

melhor estimativa do prognoacutestico [14]

O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA

genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo

cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo

estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a

ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do

centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor

tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou

regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral

que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53

causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo

centrossomo [21]

A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar

que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de

centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos

soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]

6

A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a

instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim

este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica

em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de

condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes

para os pacientes com condrossarcomas

13 Cultura celular

A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um

meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas

que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um

experimento

Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-

fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do

fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a

partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o

campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se

mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo

explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas

de ceacutelulas dispersas

A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam

rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo

de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas

estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas

manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem

ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo

das ceacutelulas em cultura [26]

A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas

foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais

frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram

7

denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas

isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]

As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais

Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito

mais alta em uma placa de cultura [27]

Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as

ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas

proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e

com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou

EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]

Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas

Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver

multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de

tecidos[26]

Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de

culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser

removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria

dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas

ou meses [26]

Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto

pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade

de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]

8

2 JUSTIFICATIVA

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como

uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral

Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo

baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos

extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica

diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do

centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa

maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese

O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre

tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio

eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau

histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau

histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos

Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e

radioterapia permanecem por serem elucidados

Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com

e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

RESUMO

Pinheiro CA Caracterizaccedilatildeo da Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Condrossarcomas

Dissertaccedilatildeo (Mestrado) Barretos Hospital de Cacircncer de Barretos 2014

INTRODUCcedilAtildeO O condrossarcoma eacute uma neoplasia maligna de origem mesenquimal O

tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico pois este tumor natildeo responde nem a quimioterapia

nem a radioterapia As alteraccedilotildees geneacuteticas envolvidas com a agressividade desse tumor

ainda natildeo estatildeo bem esclarecidas Uma possiacutevel causa da instabilidade cromossocircmica

envolvendo erro da segregaccedilatildeo mitoacutetica seria a anormalidade funcional eou numeacuterica dos

centrossomos A amplificaccedilatildeo dos centrossomos foi detectada em vaacuterios cacircnceres soacutelidos e

hematopoieacuteticos e estaacute implicada com um mecanismo de geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo

do centrossomo estaacute relacionada com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de

pacientes com tumores malignos OBJETIVO Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

amostras de tecidos tumorais crio-preservados de pacientes portadores de condrossarcoma

MATERIAL E MEacuteTODOS Estudo observacional longitudinal coorte histoacuterica Foi realizada a

anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de tumores de trecircs pacientes

operados em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos

histologicamente classificados na escala de I a III e em tecidos tumorais crio-preservados de

10 amostras pacientes portadores de condrossarcoma atendidos no mesmo serviccedilo

utilizando o anticorpo monoclonal anti y-tubulina por meio dos meacutetodos de

imunocitoquiacutemica e imuno-histoquiacutemica Como controle negativo foram usadas culturas de

fibroblastos linhagem CCD 1059 SK pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica para a anaacutelise da

amplificaccedilatildeo do centrossomo RESULTADOS As culturas celulares de condrossarcoma foram

obtidas de trecircs pacientes com quatro amostras no total pois uma segunda amostra foi

coletada de uma recidiva do mesmo paciente Sendo que esta recidiva era de uma paciente

do sexo feminino grau histoloacutegico III com siacutendrome de Ollier Os outros dois casos eram

grau I e grau III A amplificaccedilatildeo do centrossomo nestas ceacutelulas de cultura primaacuteria variou de

15 a 64 das ceacutelulas A cultura de fibroblastos apresentou uma amplificaccedilatildeo de 4 das

ceacutelulas Nos tecidos crio-preservados dois observadores independentes analisaram cada

amostra e contaram as ceacutelulas coradas com a gama-tubulina verificando a porcentagem de

ceacutelulas acometidas O analista A encontrou amplificaccedilotildees em de meacutedia 14 jaacute o analista B

encontrou em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters nestas

ceacutelulas o analista A encontrou de 0 a 3 clusters por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters

jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters em meacutedia 1 cluster Os centrossomos se

apresentaram amplificados em todas as amostras tanto nas amostras de tecido crio-

preservado como nas amostras de cultura primaacuterias Conclusatildeo A amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do condrossarcoma e

em todas as amostras de tecido crio-preservado sendo que culturas primaacuterias apresentaram

as taxas maiores em relaccedilatildeo agraves amostras de tecido crio-preservado As culturas primaacuterias

todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade dos casos) houve a

formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

PALAVRAS CHAVES Condrossarcoma Teacutecnicas de Cultura de Ceacutelulas Centrossomo Imuno-

histoquiacutemica Prognoacutestico Recidiva Local de Neoplasia

ABSTRACT

Pinheiro CA Characterization of centrosome amplification in chondrosarcomas Dissertation

(Masteracutes degree) Barretos Barretos Cancer Hospital 2014

INTRODUCTION Chondrosarcoma is a malignant tumor that originates from the

mesenchyme layer Surgical treatment is the only option for curative treatment because

chondrosarcoma is highly resistant to chemotherapy and radiotherapy The genetic

background involved in the chondrosarcoma aggressiveness is poorly understood One

possible cause of malignant transformation is chromosomal instability which involves an

error in mitotic segregation due to numerical andor functional abnormalities of

centrosomes The centrosomes amplifications were detected in many solid and

hematopoietic tumors and were recognized to be part of the mechanism responsible for

generating multipolar mitosis chromosomal instabilities and aneuploidy Currently

centrosome amplification is associated with chromosomal instability and the prognosis of

patients with malignant tumors OBJECTIVE To evaluate the centrosome amplification in

cryopreserved samples of patients with chondrosarcoma tumor tissues MATERIAL AND

METHODS We analyzed three primary cultures of tumors of patients operated on in 2012 at

the Department of Orthopedics Barretos Cancer Hospital (Barretos Brazil) and histologically

classified the cryopreserved tumor specimens from 10 patients on a scale of I to III The

patients with chondrosarcoma were treated in the same service using the monoclonal

antibody anti-y-tubulin with immunocytochemistry and immunohistochemistry For the

negative control for the analysis of the centrosome amplification for the

immunocytochemistry technique we used fibroblast cultures CCD line SK 1059 RESULTS

Four samples of chondrosarcoma cultured cells were obtained from three patients One case

was a recurrence of a histological grade III tumor in a female patient with Olliers syndrome

The other two cases were grade I and grade III The centrosome amplification of primary

cultures ranged from 15ndash64 of the cells The cultured fibroblasts showed an amplification

of 4 of that of the cells For the cryopreserved specimens two independent observers

analyzed each sample and counted the cells stained with the gamma-tubulin verifying the

percentage of affected cells Analyst A found amplifications of 14 on average and analyst B

found an average amplification of 1352 With respect to the formation of clusters in these

cells analyst A found 0ndash3 clusters per slide (an average of 08 clusters) and analyst B found

values ranging from 0ndash6 clusters (an average of 1 cluster) The centrosome amplification was

found in all samples CONCLUSION The centrosome amplification was detected in all

samples from primary culture of chondrosarcoma in all samples and cryo-preserved tissue

and primary cultures exhibited higher rates for samples cryo-preserved tissue Primary

cultures all showed clustering And in five cases (half the cases) was the formation of clusters

in cryo-preserved tissues

KEY WORDS Chondrosarcoma Cell Culture Techniques Centrosome Immunohistochemistry Prognosis Neoplasm Recurrence Local

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de

carcinogecircnese (Chan 2011) 4

Figura 2

Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo

imunocitoquimica para anticorpo S100 12

Figura 3

Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas

Imagens obtidas em microscoacutepio invertido com contraste de fase

Orange aumento de 10x 17

Figura 4

Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de

Imunocitoquiacutemica A seta (preto) mostra a formaccedilatildeo de um

cluster com quatro centrossomos 17

Figura 5

Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de

Imunofluorescecircncia 18

Figura 6

Radiografia panoracircmica de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica

em siacutenfise puacutebica direita que se estende tanto para o ramo

puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico inferior com rotura

da cortical e halo de esclerose medular 27

Figura 7

Cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise

puacutebica e anel agrave direita pouco captante com baixa probabilidade

de metaacutestase oacutessea 27

Figura 8

Tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo

liacutetica de anel e halo de esclerose com ruptura da cortical B 28

reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

Figura 9

Ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia

ponderada em T2 com saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo

expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise puacutebica

poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

30

Figura 10

Radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da

siacutenfise puacutebica e ramos puacutebicos 31

Figura 11

Lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em

parafina corada com hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com

presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com aumento da

celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X 32

Figura 12

Radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo

diafisaacuteria em terccedilo meacutedio com aspecto em flocos de neve que

invade partes moles com limites indefinidos Este caso era

acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna

(osteocondroma) que sofreu uma transformaccedilatildeo maligna 33

Figura 13

Exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista

na radiografia figura anterior com circulaccedilatildeo colateral 34

Figura 14

Tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo

de aspecto vegetante em diaacutefise de uacutemero 35

Figura 15

Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas agraves vezes binucleadas e com ateacute

3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a 38

uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e

aumento de 200 vezes

Figura 16 Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I histoloacutegico secundaacuterio a

uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X 39

Figura 17

Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2

centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X 40

Figura 18

Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2

centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X 41

Figura 19

Material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I

histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X 42

Figura 20

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 submetida a

protocolo de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina

A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X 43

Figura 21

Material crio-preservado do caso 2 submetido a protocolo de

imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que

6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

44

Figura 22

Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas

com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico

tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X 45

Figura 23

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento

de 1000 X 46

Figura 24

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no

primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X 47

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

49

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

50

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas

primaacuterias de condrossarcomas)

16

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas

primaacuterias de condrossarcomas

16

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de

fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de

imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

18

Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-

preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica

20

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas analisados por dois

observadores independentes

31

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores

independentes

32

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

44

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster

menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45

LISTA DE ABREVIATURAS

CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa

degC Graus Celsius

Ca +2 Iacuteon caacutelcio

cm2 Centiacutemetros quadrados

CO2 Dioacutexido de carbono

CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular

DAB Diamino Benzidina

DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico

F Feminino

g Gramas

H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio

HE Hematoxilina e eosina

M Masculino

ml Mililitros

MMII Membros inferiores

MMSS Membros superiores

PAF para-formaldeiacutedo

PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)

PCM Material pericentriolar

QT Quimioterapia

RT Radioterapia

TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase

LISTA DE SIacuteMBOLOS

ᵞ Gamma

microg Micrograma

Porcentagem

lt Menor

1

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma

O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e

de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes

estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de

suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]

O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida

Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro

mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]

Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no

tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute

de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]

Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e

metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do

tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente

em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor

[1]

Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de

recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em

contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a

recorrecircncia local eacute de 10 [4]

Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A

radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida

paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave

quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando

inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a

expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o

ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)

inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o

inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que

2

este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento

quimioteraacutepico [7]

Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em

modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores

Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente

agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um

citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de

remodelamento oacutesseo [9]

O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do

gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2

pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]

O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da

localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da

malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta

metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos

casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]

A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que

pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10

anos de 20 a 40 [4 2 9]

O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de

diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a

amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como

estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves

terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros

3

12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer

O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do

nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os

rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o

centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo

do fuso mitoacutetico [10]

O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e

a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle

apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo

frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante

a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e

morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente

dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o

agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos

moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute

comeccedilando a emergir [11]

A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do

centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente

agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e

contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]

Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para

a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos

Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo

de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A

presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois

centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do

fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de

sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o

desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]

4

Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]

Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada

com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]

[14] [15]

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e

sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma

maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas

gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos

perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]

Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as

alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens

celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no

gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da

amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees

5

dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos

foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]

Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores

gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos

tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo

do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor

[20]

Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles

analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As

amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees

malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo

encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos

centrossomos [17]

Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como

biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma

melhor estimativa do prognoacutestico [14]

O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA

genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo

cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo

estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a

ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do

centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor

tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou

regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral

que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53

causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo

centrossomo [21]

A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar

que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de

centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos

soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]

6

A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a

instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim

este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica

em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de

condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes

para os pacientes com condrossarcomas

13 Cultura celular

A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um

meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas

que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um

experimento

Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-

fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do

fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a

partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o

campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se

mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo

explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas

de ceacutelulas dispersas

A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam

rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo

de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas

estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas

manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem

ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo

das ceacutelulas em cultura [26]

A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas

foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais

frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram

7

denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas

isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]

As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais

Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito

mais alta em uma placa de cultura [27]

Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as

ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas

proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e

com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou

EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]

Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas

Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver

multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de

tecidos[26]

Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de

culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser

removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria

dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas

ou meses [26]

Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto

pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade

de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]

8

2 JUSTIFICATIVA

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como

uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral

Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo

baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos

extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica

diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do

centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa

maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese

O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre

tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio

eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau

histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau

histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos

Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e

radioterapia permanecem por serem elucidados

Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com

e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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51

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22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

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29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

ceacutelulas Nos tecidos crio-preservados dois observadores independentes analisaram cada

amostra e contaram as ceacutelulas coradas com a gama-tubulina verificando a porcentagem de

ceacutelulas acometidas O analista A encontrou amplificaccedilotildees em de meacutedia 14 jaacute o analista B

encontrou em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters nestas

ceacutelulas o analista A encontrou de 0 a 3 clusters por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters

jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters em meacutedia 1 cluster Os centrossomos se

apresentaram amplificados em todas as amostras tanto nas amostras de tecido crio-

preservado como nas amostras de cultura primaacuterias Conclusatildeo A amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do condrossarcoma e

em todas as amostras de tecido crio-preservado sendo que culturas primaacuterias apresentaram

as taxas maiores em relaccedilatildeo agraves amostras de tecido crio-preservado As culturas primaacuterias

todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade dos casos) houve a

formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

PALAVRAS CHAVES Condrossarcoma Teacutecnicas de Cultura de Ceacutelulas Centrossomo Imuno-

histoquiacutemica Prognoacutestico Recidiva Local de Neoplasia

ABSTRACT

Pinheiro CA Characterization of centrosome amplification in chondrosarcomas Dissertation

(Masteracutes degree) Barretos Barretos Cancer Hospital 2014

INTRODUCTION Chondrosarcoma is a malignant tumor that originates from the

mesenchyme layer Surgical treatment is the only option for curative treatment because

chondrosarcoma is highly resistant to chemotherapy and radiotherapy The genetic

background involved in the chondrosarcoma aggressiveness is poorly understood One

possible cause of malignant transformation is chromosomal instability which involves an

error in mitotic segregation due to numerical andor functional abnormalities of

centrosomes The centrosomes amplifications were detected in many solid and

hematopoietic tumors and were recognized to be part of the mechanism responsible for

generating multipolar mitosis chromosomal instabilities and aneuploidy Currently

centrosome amplification is associated with chromosomal instability and the prognosis of

patients with malignant tumors OBJECTIVE To evaluate the centrosome amplification in

cryopreserved samples of patients with chondrosarcoma tumor tissues MATERIAL AND

METHODS We analyzed three primary cultures of tumors of patients operated on in 2012 at

the Department of Orthopedics Barretos Cancer Hospital (Barretos Brazil) and histologically

classified the cryopreserved tumor specimens from 10 patients on a scale of I to III The

patients with chondrosarcoma were treated in the same service using the monoclonal

antibody anti-y-tubulin with immunocytochemistry and immunohistochemistry For the

negative control for the analysis of the centrosome amplification for the

immunocytochemistry technique we used fibroblast cultures CCD line SK 1059 RESULTS

Four samples of chondrosarcoma cultured cells were obtained from three patients One case

was a recurrence of a histological grade III tumor in a female patient with Olliers syndrome

The other two cases were grade I and grade III The centrosome amplification of primary

cultures ranged from 15ndash64 of the cells The cultured fibroblasts showed an amplification

of 4 of that of the cells For the cryopreserved specimens two independent observers

analyzed each sample and counted the cells stained with the gamma-tubulin verifying the

percentage of affected cells Analyst A found amplifications of 14 on average and analyst B

found an average amplification of 1352 With respect to the formation of clusters in these

cells analyst A found 0ndash3 clusters per slide (an average of 08 clusters) and analyst B found

values ranging from 0ndash6 clusters (an average of 1 cluster) The centrosome amplification was

found in all samples CONCLUSION The centrosome amplification was detected in all

samples from primary culture of chondrosarcoma in all samples and cryo-preserved tissue

and primary cultures exhibited higher rates for samples cryo-preserved tissue Primary

cultures all showed clustering And in five cases (half the cases) was the formation of clusters

in cryo-preserved tissues

KEY WORDS Chondrosarcoma Cell Culture Techniques Centrosome Immunohistochemistry Prognosis Neoplasm Recurrence Local

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de

carcinogecircnese (Chan 2011) 4

Figura 2

Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo

imunocitoquimica para anticorpo S100 12

Figura 3

Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas

Imagens obtidas em microscoacutepio invertido com contraste de fase

Orange aumento de 10x 17

Figura 4

Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de

Imunocitoquiacutemica A seta (preto) mostra a formaccedilatildeo de um

cluster com quatro centrossomos 17

Figura 5

Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de

Imunofluorescecircncia 18

Figura 6

Radiografia panoracircmica de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica

em siacutenfise puacutebica direita que se estende tanto para o ramo

puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico inferior com rotura

da cortical e halo de esclerose medular 27

Figura 7

Cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise

puacutebica e anel agrave direita pouco captante com baixa probabilidade

de metaacutestase oacutessea 27

Figura 8

Tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo

liacutetica de anel e halo de esclerose com ruptura da cortical B 28

reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

Figura 9

Ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia

ponderada em T2 com saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo

expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise puacutebica

poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

30

Figura 10

Radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da

siacutenfise puacutebica e ramos puacutebicos 31

Figura 11

Lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em

parafina corada com hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com

presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com aumento da

celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X 32

Figura 12

Radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo

diafisaacuteria em terccedilo meacutedio com aspecto em flocos de neve que

invade partes moles com limites indefinidos Este caso era

acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna

(osteocondroma) que sofreu uma transformaccedilatildeo maligna 33

Figura 13

Exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista

na radiografia figura anterior com circulaccedilatildeo colateral 34

Figura 14

Tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo

de aspecto vegetante em diaacutefise de uacutemero 35

Figura 15

Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas agraves vezes binucleadas e com ateacute

3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a 38

uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e

aumento de 200 vezes

Figura 16 Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I histoloacutegico secundaacuterio a

uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X 39

Figura 17

Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2

centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X 40

Figura 18

Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2

centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X 41

Figura 19

Material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I

histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X 42

Figura 20

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 submetida a

protocolo de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina

A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X 43

Figura 21

Material crio-preservado do caso 2 submetido a protocolo de

imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que

6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

44

Figura 22

Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas

com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico

tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X 45

Figura 23

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento

de 1000 X 46

Figura 24

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no

primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X 47

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

49

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

50

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas

primaacuterias de condrossarcomas)

16

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas

primaacuterias de condrossarcomas

16

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de

fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de

imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

18

Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-

preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica

20

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas analisados por dois

observadores independentes

31

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores

independentes

32

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

44

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster

menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45

LISTA DE ABREVIATURAS

CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa

degC Graus Celsius

Ca +2 Iacuteon caacutelcio

cm2 Centiacutemetros quadrados

CO2 Dioacutexido de carbono

CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular

DAB Diamino Benzidina

DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico

F Feminino

g Gramas

H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio

HE Hematoxilina e eosina

M Masculino

ml Mililitros

MMII Membros inferiores

MMSS Membros superiores

PAF para-formaldeiacutedo

PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)

PCM Material pericentriolar

QT Quimioterapia

RT Radioterapia

TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase

LISTA DE SIacuteMBOLOS

ᵞ Gamma

microg Micrograma

Porcentagem

lt Menor

1

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma

O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e

de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes

estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de

suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]

O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida

Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro

mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]

Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no

tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute

de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]

Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e

metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do

tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente

em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor

[1]

Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de

recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em

contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a

recorrecircncia local eacute de 10 [4]

Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A

radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida

paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave

quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando

inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a

expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o

ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)

inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o

inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que

2

este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento

quimioteraacutepico [7]

Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em

modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores

Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente

agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um

citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de

remodelamento oacutesseo [9]

O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do

gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2

pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]

O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da

localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da

malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta

metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos

casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]

A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que

pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10

anos de 20 a 40 [4 2 9]

O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de

diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a

amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como

estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves

terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros

3

12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer

O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do

nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os

rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o

centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo

do fuso mitoacutetico [10]

O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e

a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle

apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo

frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante

a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e

morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente

dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o

agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos

moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute

comeccedilando a emergir [11]

A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do

centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente

agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e

contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]

Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para

a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos

Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo

de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A

presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois

centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do

fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de

sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o

desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]

4

Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]

Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada

com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]

[14] [15]

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e

sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma

maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas

gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos

perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]

Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as

alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens

celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no

gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da

amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees

5

dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos

foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]

Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores

gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos

tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo

do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor

[20]

Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles

analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As

amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees

malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo

encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos

centrossomos [17]

Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como

biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma

melhor estimativa do prognoacutestico [14]

O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA

genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo

cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo

estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a

ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do

centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor

tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou

regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral

que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53

causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo

centrossomo [21]

A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar

que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de

centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos

soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]

6

A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a

instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim

este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica

em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de

condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes

para os pacientes com condrossarcomas

13 Cultura celular

A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um

meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas

que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um

experimento

Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-

fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do

fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a

partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o

campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se

mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo

explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas

de ceacutelulas dispersas

A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam

rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo

de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas

estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas

manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem

ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo

das ceacutelulas em cultura [26]

A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas

foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais

frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram

7

denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas

isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]

As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais

Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito

mais alta em uma placa de cultura [27]

Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as

ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas

proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e

com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou

EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]

Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas

Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver

multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de

tecidos[26]

Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de

culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser

removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria

dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas

ou meses [26]

Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto

pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade

de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]

8

2 JUSTIFICATIVA

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como

uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral

Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo

baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos

extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica

diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do

centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa

maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese

O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre

tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio

eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau

histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau

histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos

Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e

radioterapia permanecem por serem elucidados

Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com

e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

ABSTRACT

Pinheiro CA Characterization of centrosome amplification in chondrosarcomas Dissertation

(Masteracutes degree) Barretos Barretos Cancer Hospital 2014

INTRODUCTION Chondrosarcoma is a malignant tumor that originates from the

mesenchyme layer Surgical treatment is the only option for curative treatment because

chondrosarcoma is highly resistant to chemotherapy and radiotherapy The genetic

background involved in the chondrosarcoma aggressiveness is poorly understood One

possible cause of malignant transformation is chromosomal instability which involves an

error in mitotic segregation due to numerical andor functional abnormalities of

centrosomes The centrosomes amplifications were detected in many solid and

hematopoietic tumors and were recognized to be part of the mechanism responsible for

generating multipolar mitosis chromosomal instabilities and aneuploidy Currently

centrosome amplification is associated with chromosomal instability and the prognosis of

patients with malignant tumors OBJECTIVE To evaluate the centrosome amplification in

cryopreserved samples of patients with chondrosarcoma tumor tissues MATERIAL AND

METHODS We analyzed three primary cultures of tumors of patients operated on in 2012 at

the Department of Orthopedics Barretos Cancer Hospital (Barretos Brazil) and histologically

classified the cryopreserved tumor specimens from 10 patients on a scale of I to III The

patients with chondrosarcoma were treated in the same service using the monoclonal

antibody anti-y-tubulin with immunocytochemistry and immunohistochemistry For the

negative control for the analysis of the centrosome amplification for the

immunocytochemistry technique we used fibroblast cultures CCD line SK 1059 RESULTS

Four samples of chondrosarcoma cultured cells were obtained from three patients One case

was a recurrence of a histological grade III tumor in a female patient with Olliers syndrome

The other two cases were grade I and grade III The centrosome amplification of primary

cultures ranged from 15ndash64 of the cells The cultured fibroblasts showed an amplification

of 4 of that of the cells For the cryopreserved specimens two independent observers

analyzed each sample and counted the cells stained with the gamma-tubulin verifying the

percentage of affected cells Analyst A found amplifications of 14 on average and analyst B

found an average amplification of 1352 With respect to the formation of clusters in these

cells analyst A found 0ndash3 clusters per slide (an average of 08 clusters) and analyst B found

values ranging from 0ndash6 clusters (an average of 1 cluster) The centrosome amplification was

found in all samples CONCLUSION The centrosome amplification was detected in all

samples from primary culture of chondrosarcoma in all samples and cryo-preserved tissue

and primary cultures exhibited higher rates for samples cryo-preserved tissue Primary

cultures all showed clustering And in five cases (half the cases) was the formation of clusters

in cryo-preserved tissues

KEY WORDS Chondrosarcoma Cell Culture Techniques Centrosome Immunohistochemistry Prognosis Neoplasm Recurrence Local

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de

carcinogecircnese (Chan 2011) 4

Figura 2

Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo

imunocitoquimica para anticorpo S100 12

Figura 3

Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas

Imagens obtidas em microscoacutepio invertido com contraste de fase

Orange aumento de 10x 17

Figura 4

Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de

Imunocitoquiacutemica A seta (preto) mostra a formaccedilatildeo de um

cluster com quatro centrossomos 17

Figura 5

Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de

Imunofluorescecircncia 18

Figura 6

Radiografia panoracircmica de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica

em siacutenfise puacutebica direita que se estende tanto para o ramo

puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico inferior com rotura

da cortical e halo de esclerose medular 27

Figura 7

Cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise

puacutebica e anel agrave direita pouco captante com baixa probabilidade

de metaacutestase oacutessea 27

Figura 8

Tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo

liacutetica de anel e halo de esclerose com ruptura da cortical B 28

reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

Figura 9

Ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia

ponderada em T2 com saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo

expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise puacutebica

poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

30

Figura 10

Radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da

siacutenfise puacutebica e ramos puacutebicos 31

Figura 11

Lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em

parafina corada com hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com

presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com aumento da

celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X 32

Figura 12

Radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo

diafisaacuteria em terccedilo meacutedio com aspecto em flocos de neve que

invade partes moles com limites indefinidos Este caso era

acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna

(osteocondroma) que sofreu uma transformaccedilatildeo maligna 33

Figura 13

Exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista

na radiografia figura anterior com circulaccedilatildeo colateral 34

Figura 14

Tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo

de aspecto vegetante em diaacutefise de uacutemero 35

Figura 15

Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas agraves vezes binucleadas e com ateacute

3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a 38

uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e

aumento de 200 vezes

Figura 16 Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I histoloacutegico secundaacuterio a

uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X 39

Figura 17

Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2

centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X 40

Figura 18

Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2

centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X 41

Figura 19

Material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I

histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X 42

Figura 20

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 submetida a

protocolo de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina

A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X 43

Figura 21

Material crio-preservado do caso 2 submetido a protocolo de

imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que

6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

44

Figura 22

Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas

com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico

tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X 45

Figura 23

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento

de 1000 X 46

Figura 24

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no

primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X 47

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

49

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

50

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas

primaacuterias de condrossarcomas)

16

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas

primaacuterias de condrossarcomas

16

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de

fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de

imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

18

Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-

preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica

20

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas analisados por dois

observadores independentes

31

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores

independentes

32

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

44

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster

menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45

LISTA DE ABREVIATURAS

CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa

degC Graus Celsius

Ca +2 Iacuteon caacutelcio

cm2 Centiacutemetros quadrados

CO2 Dioacutexido de carbono

CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular

DAB Diamino Benzidina

DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico

F Feminino

g Gramas

H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio

HE Hematoxilina e eosina

M Masculino

ml Mililitros

MMII Membros inferiores

MMSS Membros superiores

PAF para-formaldeiacutedo

PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)

PCM Material pericentriolar

QT Quimioterapia

RT Radioterapia

TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase

LISTA DE SIacuteMBOLOS

ᵞ Gamma

microg Micrograma

Porcentagem

lt Menor

1

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma

O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e

de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes

estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de

suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]

O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida

Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro

mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]

Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no

tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute

de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]

Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e

metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do

tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente

em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor

[1]

Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de

recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em

contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a

recorrecircncia local eacute de 10 [4]

Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A

radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida

paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave

quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando

inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a

expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o

ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)

inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o

inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que

2

este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento

quimioteraacutepico [7]

Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em

modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores

Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente

agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um

citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de

remodelamento oacutesseo [9]

O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do

gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2

pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]

O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da

localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da

malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta

metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos

casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]

A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que

pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10

anos de 20 a 40 [4 2 9]

O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de

diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a

amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como

estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves

terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros

3

12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer

O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do

nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os

rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o

centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo

do fuso mitoacutetico [10]

O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e

a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle

apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo

frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante

a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e

morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente

dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o

agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos

moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute

comeccedilando a emergir [11]

A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do

centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente

agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e

contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]

Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para

a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos

Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo

de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A

presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois

centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do

fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de

sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o

desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]

4

Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]

Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada

com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]

[14] [15]

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e

sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma

maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas

gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos

perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]

Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as

alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens

celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no

gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da

amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees

5

dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos

foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]

Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores

gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos

tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo

do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor

[20]

Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles

analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As

amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees

malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo

encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos

centrossomos [17]

Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como

biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma

melhor estimativa do prognoacutestico [14]

O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA

genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo

cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo

estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a

ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do

centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor

tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou

regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral

que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53

causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo

centrossomo [21]

A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar

que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de

centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos

soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]

6

A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a

instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim

este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica

em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de

condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes

para os pacientes com condrossarcomas

13 Cultura celular

A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um

meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas

que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um

experimento

Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-

fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do

fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a

partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o

campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se

mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo

explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas

de ceacutelulas dispersas

A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam

rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo

de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas

estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas

manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem

ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo

das ceacutelulas em cultura [26]

A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas

foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais

frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram

7

denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas

isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]

As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais

Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito

mais alta em uma placa de cultura [27]

Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as

ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas

proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e

com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou

EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]

Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas

Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver

multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de

tecidos[26]

Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de

culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser

removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria

dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas

ou meses [26]

Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto

pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade

de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]

8

2 JUSTIFICATIVA

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como

uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral

Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo

baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos

extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica

diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do

centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa

maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese

O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre

tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio

eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau

histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau

histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos

Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e

radioterapia permanecem por serem elucidados

Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com

e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

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21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

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28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

found an average amplification of 1352 With respect to the formation of clusters in these

cells analyst A found 0ndash3 clusters per slide (an average of 08 clusters) and analyst B found

values ranging from 0ndash6 clusters (an average of 1 cluster) The centrosome amplification was

found in all samples CONCLUSION The centrosome amplification was detected in all

samples from primary culture of chondrosarcoma in all samples and cryo-preserved tissue

and primary cultures exhibited higher rates for samples cryo-preserved tissue Primary

cultures all showed clustering And in five cases (half the cases) was the formation of clusters

in cryo-preserved tissues

KEY WORDS Chondrosarcoma Cell Culture Techniques Centrosome Immunohistochemistry Prognosis Neoplasm Recurrence Local

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de

carcinogecircnese (Chan 2011) 4

Figura 2

Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo

imunocitoquimica para anticorpo S100 12

Figura 3

Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas

Imagens obtidas em microscoacutepio invertido com contraste de fase

Orange aumento de 10x 17

Figura 4

Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de

Imunocitoquiacutemica A seta (preto) mostra a formaccedilatildeo de um

cluster com quatro centrossomos 17

Figura 5

Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de

Imunofluorescecircncia 18

Figura 6

Radiografia panoracircmica de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica

em siacutenfise puacutebica direita que se estende tanto para o ramo

puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico inferior com rotura

da cortical e halo de esclerose medular 27

Figura 7

Cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise

puacutebica e anel agrave direita pouco captante com baixa probabilidade

de metaacutestase oacutessea 27

Figura 8

Tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo

liacutetica de anel e halo de esclerose com ruptura da cortical B 28

reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

Figura 9

Ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia

ponderada em T2 com saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo

expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise puacutebica

poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

30

Figura 10

Radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da

siacutenfise puacutebica e ramos puacutebicos 31

Figura 11

Lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em

parafina corada com hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com

presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com aumento da

celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X 32

Figura 12

Radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo

diafisaacuteria em terccedilo meacutedio com aspecto em flocos de neve que

invade partes moles com limites indefinidos Este caso era

acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna

(osteocondroma) que sofreu uma transformaccedilatildeo maligna 33

Figura 13

Exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista

na radiografia figura anterior com circulaccedilatildeo colateral 34

Figura 14

Tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo

de aspecto vegetante em diaacutefise de uacutemero 35

Figura 15

Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas agraves vezes binucleadas e com ateacute

3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a 38

uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e

aumento de 200 vezes

Figura 16 Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I histoloacutegico secundaacuterio a

uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X 39

Figura 17

Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2

centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X 40

Figura 18

Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2

centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X 41

Figura 19

Material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I

histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X 42

Figura 20

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 submetida a

protocolo de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina

A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X 43

Figura 21

Material crio-preservado do caso 2 submetido a protocolo de

imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que

6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

44

Figura 22

Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas

com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico

tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X 45

Figura 23

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento

de 1000 X 46

Figura 24

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no

primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X 47

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

49

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

50

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas

primaacuterias de condrossarcomas)

16

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas

primaacuterias de condrossarcomas

16

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de

fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de

imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

18

Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-

preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica

20

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas analisados por dois

observadores independentes

31

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores

independentes

32

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

44

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster

menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45

LISTA DE ABREVIATURAS

CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa

degC Graus Celsius

Ca +2 Iacuteon caacutelcio

cm2 Centiacutemetros quadrados

CO2 Dioacutexido de carbono

CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular

DAB Diamino Benzidina

DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico

F Feminino

g Gramas

H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio

HE Hematoxilina e eosina

M Masculino

ml Mililitros

MMII Membros inferiores

MMSS Membros superiores

PAF para-formaldeiacutedo

PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)

PCM Material pericentriolar

QT Quimioterapia

RT Radioterapia

TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase

LISTA DE SIacuteMBOLOS

ᵞ Gamma

microg Micrograma

Porcentagem

lt Menor

1

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma

O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e

de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes

estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de

suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]

O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida

Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro

mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]

Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no

tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute

de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]

Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e

metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do

tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente

em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor

[1]

Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de

recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em

contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a

recorrecircncia local eacute de 10 [4]

Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A

radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida

paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave

quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando

inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a

expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o

ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)

inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o

inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que

2

este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento

quimioteraacutepico [7]

Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em

modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores

Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente

agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um

citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de

remodelamento oacutesseo [9]

O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do

gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2

pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]

O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da

localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da

malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta

metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos

casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]

A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que

pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10

anos de 20 a 40 [4 2 9]

O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de

diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a

amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como

estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves

terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros

3

12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer

O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do

nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os

rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o

centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo

do fuso mitoacutetico [10]

O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e

a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle

apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo

frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante

a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e

morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente

dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o

agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos

moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute

comeccedilando a emergir [11]

A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do

centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente

agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e

contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]

Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para

a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos

Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo

de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A

presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois

centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do

fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de

sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o

desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]

4

Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]

Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada

com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]

[14] [15]

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e

sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma

maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas

gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos

perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]

Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as

alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens

celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no

gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da

amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees

5

dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos

foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]

Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores

gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos

tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo

do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor

[20]

Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles

analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As

amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees

malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo

encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos

centrossomos [17]

Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como

biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma

melhor estimativa do prognoacutestico [14]

O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA

genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo

cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo

estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a

ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do

centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor

tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou

regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral

que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53

causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo

centrossomo [21]

A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar

que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de

centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos

soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]

6

A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a

instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim

este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica

em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de

condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes

para os pacientes com condrossarcomas

13 Cultura celular

A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um

meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas

que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um

experimento

Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-

fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do

fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a

partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o

campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se

mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo

explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas

de ceacutelulas dispersas

A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam

rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo

de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas

estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas

manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem

ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo

das ceacutelulas em cultura [26]

A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas

foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais

frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram

7

denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas

isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]

As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais

Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito

mais alta em uma placa de cultura [27]

Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as

ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas

proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e

com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou

EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]

Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas

Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver

multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de

tecidos[26]

Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de

culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser

removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria

dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas

ou meses [26]

Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto

pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade

de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]

8

2 JUSTIFICATIVA

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como

uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral

Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo

baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos

extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica

diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do

centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa

maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese

O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre

tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio

eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau

histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau

histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos

Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e

radioterapia permanecem por serem elucidados

Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com

e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de

carcinogecircnese (Chan 2011) 4

Figura 2

Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo

imunocitoquimica para anticorpo S100 12

Figura 3

Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas

Imagens obtidas em microscoacutepio invertido com contraste de fase

Orange aumento de 10x 17

Figura 4

Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de

Imunocitoquiacutemica A seta (preto) mostra a formaccedilatildeo de um

cluster com quatro centrossomos 17

Figura 5

Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de

Imunofluorescecircncia 18

Figura 6

Radiografia panoracircmica de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica

em siacutenfise puacutebica direita que se estende tanto para o ramo

puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico inferior com rotura

da cortical e halo de esclerose medular 27

Figura 7

Cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise

puacutebica e anel agrave direita pouco captante com baixa probabilidade

de metaacutestase oacutessea 27

Figura 8

Tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo

liacutetica de anel e halo de esclerose com ruptura da cortical B 28

reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

Figura 9

Ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia

ponderada em T2 com saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo

expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise puacutebica

poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

30

Figura 10

Radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da

siacutenfise puacutebica e ramos puacutebicos 31

Figura 11

Lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em

parafina corada com hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com

presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com aumento da

celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X 32

Figura 12

Radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo

diafisaacuteria em terccedilo meacutedio com aspecto em flocos de neve que

invade partes moles com limites indefinidos Este caso era

acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna

(osteocondroma) que sofreu uma transformaccedilatildeo maligna 33

Figura 13

Exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista

na radiografia figura anterior com circulaccedilatildeo colateral 34

Figura 14

Tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo

de aspecto vegetante em diaacutefise de uacutemero 35

Figura 15

Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas agraves vezes binucleadas e com ateacute

3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a 38

uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e

aumento de 200 vezes

Figura 16 Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I histoloacutegico secundaacuterio a

uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X 39

Figura 17

Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2

centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X 40

Figura 18

Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2

centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X 41

Figura 19

Material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I

histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X 42

Figura 20

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 submetida a

protocolo de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina

A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X 43

Figura 21

Material crio-preservado do caso 2 submetido a protocolo de

imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que

6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

44

Figura 22

Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas

com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico

tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X 45

Figura 23

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento

de 1000 X 46

Figura 24

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no

primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X 47

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

49

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

50

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas

primaacuterias de condrossarcomas)

16

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas

primaacuterias de condrossarcomas

16

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de

fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de

imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

18

Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-

preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica

20

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas analisados por dois

observadores independentes

31

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores

independentes

32

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

44

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster

menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45

LISTA DE ABREVIATURAS

CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa

degC Graus Celsius

Ca +2 Iacuteon caacutelcio

cm2 Centiacutemetros quadrados

CO2 Dioacutexido de carbono

CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular

DAB Diamino Benzidina

DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico

F Feminino

g Gramas

H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio

HE Hematoxilina e eosina

M Masculino

ml Mililitros

MMII Membros inferiores

MMSS Membros superiores

PAF para-formaldeiacutedo

PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)

PCM Material pericentriolar

QT Quimioterapia

RT Radioterapia

TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase

LISTA DE SIacuteMBOLOS

ᵞ Gamma

microg Micrograma

Porcentagem

lt Menor

1

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma

O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e

de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes

estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de

suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]

O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida

Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro

mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]

Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no

tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute

de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]

Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e

metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do

tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente

em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor

[1]

Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de

recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em

contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a

recorrecircncia local eacute de 10 [4]

Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A

radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida

paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave

quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando

inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a

expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o

ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)

inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o

inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que

2

este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento

quimioteraacutepico [7]

Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em

modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores

Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente

agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um

citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de

remodelamento oacutesseo [9]

O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do

gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2

pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]

O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da

localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da

malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta

metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos

casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]

A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que

pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10

anos de 20 a 40 [4 2 9]

O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de

diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a

amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como

estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves

terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros

3

12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer

O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do

nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os

rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o

centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo

do fuso mitoacutetico [10]

O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e

a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle

apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo

frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante

a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e

morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente

dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o

agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos

moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute

comeccedilando a emergir [11]

A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do

centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente

agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e

contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]

Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para

a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos

Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo

de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A

presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois

centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do

fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de

sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o

desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]

4

Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]

Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada

com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]

[14] [15]

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e

sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma

maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas

gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos

perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]

Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as

alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens

celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no

gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da

amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees

5

dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos

foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]

Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores

gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos

tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo

do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor

[20]

Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles

analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As

amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees

malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo

encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos

centrossomos [17]

Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como

biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma

melhor estimativa do prognoacutestico [14]

O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA

genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo

cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo

estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a

ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do

centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor

tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou

regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral

que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53

causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo

centrossomo [21]

A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar

que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de

centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos

soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]

6

A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a

instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim

este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica

em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de

condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes

para os pacientes com condrossarcomas

13 Cultura celular

A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um

meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas

que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um

experimento

Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-

fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do

fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a

partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o

campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se

mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo

explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas

de ceacutelulas dispersas

A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam

rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo

de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas

estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas

manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem

ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo

das ceacutelulas em cultura [26]

A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas

foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais

frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram

7

denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas

isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]

As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais

Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito

mais alta em uma placa de cultura [27]

Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as

ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas

proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e

com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou

EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]

Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas

Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver

multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de

tecidos[26]

Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de

culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser

removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria

dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas

ou meses [26]

Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto

pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade

de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]

8

2 JUSTIFICATIVA

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como

uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral

Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo

baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos

extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica

diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do

centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa

maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese

O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre

tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio

eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau

histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau

histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos

Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e

radioterapia permanecem por serem elucidados

Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com

e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

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11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

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14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

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21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

Figura 9

Ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia

ponderada em T2 com saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo

expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise puacutebica

poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

30

Figura 10

Radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da

siacutenfise puacutebica e ramos puacutebicos 31

Figura 11

Lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em

parafina corada com hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com

presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com aumento da

celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X 32

Figura 12

Radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo

diafisaacuteria em terccedilo meacutedio com aspecto em flocos de neve que

invade partes moles com limites indefinidos Este caso era

acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna

(osteocondroma) que sofreu uma transformaccedilatildeo maligna 33

Figura 13

Exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista

na radiografia figura anterior com circulaccedilatildeo colateral 34

Figura 14

Tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo

de aspecto vegetante em diaacutefise de uacutemero 35

Figura 15

Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas agraves vezes binucleadas e com ateacute

3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a 38

uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e

aumento de 200 vezes

Figura 16 Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I histoloacutegico secundaacuterio a

uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X 39

Figura 17

Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2

centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X 40

Figura 18

Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2

centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X 41

Figura 19

Material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I

histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X 42

Figura 20

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 submetida a

protocolo de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina

A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X 43

Figura 21

Material crio-preservado do caso 2 submetido a protocolo de

imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que

6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

44

Figura 22

Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas

com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico

tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X 45

Figura 23

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento

de 1000 X 46

Figura 24

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no

primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X 47

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

49

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

50

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas

primaacuterias de condrossarcomas)

16

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas

primaacuterias de condrossarcomas

16

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de

fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de

imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

18

Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-

preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica

20

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas analisados por dois

observadores independentes

31

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores

independentes

32

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

44

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster

menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45

LISTA DE ABREVIATURAS

CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa

degC Graus Celsius

Ca +2 Iacuteon caacutelcio

cm2 Centiacutemetros quadrados

CO2 Dioacutexido de carbono

CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular

DAB Diamino Benzidina

DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico

F Feminino

g Gramas

H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio

HE Hematoxilina e eosina

M Masculino

ml Mililitros

MMII Membros inferiores

MMSS Membros superiores

PAF para-formaldeiacutedo

PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)

PCM Material pericentriolar

QT Quimioterapia

RT Radioterapia

TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase

LISTA DE SIacuteMBOLOS

ᵞ Gamma

microg Micrograma

Porcentagem

lt Menor

1

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma

O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e

de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes

estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de

suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]

O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida

Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro

mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]

Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no

tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute

de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]

Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e

metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do

tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente

em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor

[1]

Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de

recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em

contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a

recorrecircncia local eacute de 10 [4]

Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A

radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida

paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave

quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando

inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a

expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o

ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)

inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o

inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que

2

este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento

quimioteraacutepico [7]

Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em

modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores

Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente

agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um

citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de

remodelamento oacutesseo [9]

O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do

gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2

pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]

O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da

localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da

malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta

metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos

casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]

A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que

pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10

anos de 20 a 40 [4 2 9]

O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de

diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a

amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como

estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves

terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros

3

12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer

O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do

nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os

rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o

centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo

do fuso mitoacutetico [10]

O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e

a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle

apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo

frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante

a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e

morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente

dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o

agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos

moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute

comeccedilando a emergir [11]

A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do

centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente

agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e

contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]

Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para

a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos

Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo

de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A

presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois

centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do

fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de

sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o

desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]

4

Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]

Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada

com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]

[14] [15]

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e

sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma

maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas

gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos

perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]

Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as

alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens

celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no

gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da

amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees

5

dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos

foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]

Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores

gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos

tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo

do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor

[20]

Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles

analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As

amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees

malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo

encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos

centrossomos [17]

Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como

biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma

melhor estimativa do prognoacutestico [14]

O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA

genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo

cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo

estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a

ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do

centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor

tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou

regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral

que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53

causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo

centrossomo [21]

A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar

que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de

centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos

soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]

6

A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a

instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim

este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica

em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de

condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes

para os pacientes com condrossarcomas

13 Cultura celular

A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um

meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas

que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um

experimento

Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-

fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do

fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a

partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o

campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se

mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo

explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas

de ceacutelulas dispersas

A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam

rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo

de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas

estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas

manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem

ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo

das ceacutelulas em cultura [26]

A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas

foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais

frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram

7

denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas

isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]

As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais

Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito

mais alta em uma placa de cultura [27]

Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as

ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas

proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e

com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou

EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]

Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas

Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver

multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de

tecidos[26]

Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de

culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser

removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria

dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas

ou meses [26]

Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto

pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade

de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]

8

2 JUSTIFICATIVA

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como

uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral

Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo

baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos

extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica

diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do

centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa

maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese

O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre

tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio

eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau

histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau

histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos

Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e

radioterapia permanecem por serem elucidados

Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com

e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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51

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22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

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29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e

aumento de 200 vezes

Figura 16 Material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I histoloacutegico secundaacuterio a

uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X 39

Figura 17

Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2

centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X 40

Figura 18

Material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 2

centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X 41

Figura 19

Material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina

com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I

histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X 42

Figura 20

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 submetida a

protocolo de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina

A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X 43

Figura 21

Material crio-preservado do caso 2 submetido a protocolo de

imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que

6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

44

Figura 22

Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas

com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico

tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X 45

Figura 23

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento

de 1000 X 46

Figura 24

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no

primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X 47

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

49

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

50

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas

primaacuterias de condrossarcomas)

16

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas

primaacuterias de condrossarcomas

16

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de

fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de

imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

18

Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-

preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica

20

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas analisados por dois

observadores independentes

31

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores

independentes

32

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

44

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster

menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45

LISTA DE ABREVIATURAS

CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa

degC Graus Celsius

Ca +2 Iacuteon caacutelcio

cm2 Centiacutemetros quadrados

CO2 Dioacutexido de carbono

CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular

DAB Diamino Benzidina

DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico

F Feminino

g Gramas

H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio

HE Hematoxilina e eosina

M Masculino

ml Mililitros

MMII Membros inferiores

MMSS Membros superiores

PAF para-formaldeiacutedo

PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)

PCM Material pericentriolar

QT Quimioterapia

RT Radioterapia

TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase

LISTA DE SIacuteMBOLOS

ᵞ Gamma

microg Micrograma

Porcentagem

lt Menor

1

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma

O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e

de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes

estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de

suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]

O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida

Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro

mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]

Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no

tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute

de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]

Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e

metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do

tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente

em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor

[1]

Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de

recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em

contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a

recorrecircncia local eacute de 10 [4]

Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A

radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida

paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave

quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando

inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a

expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o

ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)

inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o

inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que

2

este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento

quimioteraacutepico [7]

Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em

modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores

Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente

agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um

citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de

remodelamento oacutesseo [9]

O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do

gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2

pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]

O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da

localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da

malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta

metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos

casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]

A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que

pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10

anos de 20 a 40 [4 2 9]

O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de

diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a

amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como

estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves

terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros

3

12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer

O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do

nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os

rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o

centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo

do fuso mitoacutetico [10]

O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e

a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle

apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo

frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante

a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e

morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente

dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o

agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos

moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute

comeccedilando a emergir [11]

A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do

centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente

agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e

contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]

Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para

a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos

Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo

de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A

presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois

centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do

fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de

sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o

desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]

4

Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]

Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada

com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]

[14] [15]

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e

sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma

maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas

gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos

perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]

Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as

alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens

celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no

gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da

amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees

5

dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos

foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]

Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores

gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos

tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo

do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor

[20]

Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles

analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As

amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees

malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo

encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos

centrossomos [17]

Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como

biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma

melhor estimativa do prognoacutestico [14]

O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA

genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo

cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo

estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a

ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do

centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor

tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou

regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral

que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53

causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo

centrossomo [21]

A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar

que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de

centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos

soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]

6

A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a

instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim

este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica

em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de

condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes

para os pacientes com condrossarcomas

13 Cultura celular

A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um

meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas

que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um

experimento

Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-

fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do

fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a

partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o

campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se

mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo

explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas

de ceacutelulas dispersas

A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam

rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo

de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas

estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas

manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem

ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo

das ceacutelulas em cultura [26]

A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas

foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais

frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram

7

denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas

isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]

As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais

Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito

mais alta em uma placa de cultura [27]

Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as

ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas

proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e

com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou

EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]

Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas

Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver

multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de

tecidos[26]

Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de

culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser

removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria

dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas

ou meses [26]

Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto

pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade

de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]

8

2 JUSTIFICATIVA

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como

uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral

Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo

baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos

extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica

diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do

centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa

maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese

O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre

tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio

eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau

histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau

histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos

Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e

radioterapia permanecem por serem elucidados

Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com

e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

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52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster menor que

6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

44

Figura 22

Material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e

eosina (HE) mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas

com estroma mixoacuteide e delicada vasculatura grau I histoloacutegico

tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X 45

Figura 23

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos (seta preta) Aumento

de 1000 X 46

Figura 24

Material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo

de imuno-histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem

mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos A-dois vistos no

primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X 47

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

49

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

50

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas

primaacuterias de condrossarcomas)

16

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas

primaacuterias de condrossarcomas

16

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de

fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de

imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

18

Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-

preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica

20

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas analisados por dois

observadores independentes

31

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores

independentes

32

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

44

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster

menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45

LISTA DE ABREVIATURAS

CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa

degC Graus Celsius

Ca +2 Iacuteon caacutelcio

cm2 Centiacutemetros quadrados

CO2 Dioacutexido de carbono

CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular

DAB Diamino Benzidina

DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico

F Feminino

g Gramas

H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio

HE Hematoxilina e eosina

M Masculino

ml Mililitros

MMII Membros inferiores

MMSS Membros superiores

PAF para-formaldeiacutedo

PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)

PCM Material pericentriolar

QT Quimioterapia

RT Radioterapia

TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase

LISTA DE SIacuteMBOLOS

ᵞ Gamma

microg Micrograma

Porcentagem

lt Menor

1

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma

O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e

de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes

estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de

suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]

O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida

Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro

mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]

Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no

tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute

de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]

Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e

metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do

tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente

em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor

[1]

Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de

recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em

contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a

recorrecircncia local eacute de 10 [4]

Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A

radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida

paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave

quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando

inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a

expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o

ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)

inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o

inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que

2

este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento

quimioteraacutepico [7]

Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em

modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores

Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente

agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um

citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de

remodelamento oacutesseo [9]

O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do

gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2

pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]

O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da

localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da

malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta

metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos

casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]

A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que

pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10

anos de 20 a 40 [4 2 9]

O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de

diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a

amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como

estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves

terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros

3

12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer

O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do

nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os

rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o

centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo

do fuso mitoacutetico [10]

O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e

a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle

apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo

frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante

a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e

morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente

dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o

agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos

moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute

comeccedilando a emergir [11]

A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do

centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente

agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e

contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]

Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para

a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos

Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo

de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A

presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois

centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do

fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de

sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o

desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]

4

Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]

Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada

com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]

[14] [15]

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e

sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma

maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas

gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos

perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]

Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as

alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens

celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no

gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da

amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees

5

dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos

foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]

Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores

gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos

tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo

do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor

[20]

Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles

analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As

amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees

malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo

encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos

centrossomos [17]

Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como

biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma

melhor estimativa do prognoacutestico [14]

O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA

genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo

cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo

estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a

ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do

centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor

tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou

regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral

que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53

causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo

centrossomo [21]

A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar

que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de

centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos

soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]

6

A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a

instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim

este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica

em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de

condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes

para os pacientes com condrossarcomas

13 Cultura celular

A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um

meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas

que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um

experimento

Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-

fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do

fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a

partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o

campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se

mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo

explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas

de ceacutelulas dispersas

A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam

rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo

de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas

estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas

manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem

ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo

das ceacutelulas em cultura [26]

A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas

foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais

frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram

7

denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas

isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]

As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais

Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito

mais alta em uma placa de cultura [27]

Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as

ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas

proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e

com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou

EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]

Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas

Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver

multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de

tecidos[26]

Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de

culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser

removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria

dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas

ou meses [26]

Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto

pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade

de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]

8

2 JUSTIFICATIVA

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como

uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral

Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo

baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos

extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica

diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do

centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa

maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese

O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre

tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio

eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau

histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau

histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos

Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e

radioterapia permanecem por serem elucidados

Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com

e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

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7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

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13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

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28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas

primaacuterias de condrossarcomas)

16

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas

primaacuterias de condrossarcomas

16

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de

fibroblastos normais (controle) pela teacutecnica de

imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

18

Tabela 4 Principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-

preservados com avaliaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica

20

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas analisados por dois

observadores independentes

31

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-

preservados de condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores

independentes

32

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

44

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster

menor que seis e seu intervalo de confianccedila 45

LISTA DE ABREVIATURAS

CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa

degC Graus Celsius

Ca +2 Iacuteon caacutelcio

cm2 Centiacutemetros quadrados

CO2 Dioacutexido de carbono

CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular

DAB Diamino Benzidina

DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico

F Feminino

g Gramas

H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio

HE Hematoxilina e eosina

M Masculino

ml Mililitros

MMII Membros inferiores

MMSS Membros superiores

PAF para-formaldeiacutedo

PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)

PCM Material pericentriolar

QT Quimioterapia

RT Radioterapia

TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase

LISTA DE SIacuteMBOLOS

ᵞ Gamma

microg Micrograma

Porcentagem

lt Menor

1

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma

O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e

de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes

estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de

suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]

O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida

Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro

mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]

Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no

tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute

de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]

Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e

metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do

tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente

em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor

[1]

Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de

recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em

contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a

recorrecircncia local eacute de 10 [4]

Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A

radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida

paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave

quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando

inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a

expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o

ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)

inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o

inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que

2

este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento

quimioteraacutepico [7]

Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em

modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores

Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente

agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um

citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de

remodelamento oacutesseo [9]

O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do

gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2

pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]

O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da

localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da

malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta

metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos

casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]

A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que

pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10

anos de 20 a 40 [4 2 9]

O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de

diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a

amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como

estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves

terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros

3

12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer

O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do

nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os

rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o

centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo

do fuso mitoacutetico [10]

O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e

a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle

apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo

frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante

a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e

morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente

dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o

agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos

moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute

comeccedilando a emergir [11]

A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do

centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente

agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e

contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]

Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para

a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos

Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo

de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A

presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois

centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do

fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de

sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o

desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]

4

Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]

Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada

com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]

[14] [15]

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e

sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma

maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas

gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos

perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]

Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as

alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens

celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no

gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da

amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees

5

dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos

foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]

Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores

gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos

tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo

do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor

[20]

Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles

analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As

amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees

malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo

encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos

centrossomos [17]

Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como

biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma

melhor estimativa do prognoacutestico [14]

O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA

genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo

cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo

estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a

ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do

centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor

tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou

regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral

que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53

causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo

centrossomo [21]

A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar

que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de

centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos

soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]

6

A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a

instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim

este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica

em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de

condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes

para os pacientes com condrossarcomas

13 Cultura celular

A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um

meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas

que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um

experimento

Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-

fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do

fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a

partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o

campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se

mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo

explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas

de ceacutelulas dispersas

A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam

rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo

de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas

estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas

manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem

ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo

das ceacutelulas em cultura [26]

A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas

foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais

frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram

7

denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas

isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]

As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais

Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito

mais alta em uma placa de cultura [27]

Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as

ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas

proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e

com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou

EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]

Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas

Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver

multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de

tecidos[26]

Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de

culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser

removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria

dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas

ou meses [26]

Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto

pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade

de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]

8

2 JUSTIFICATIVA

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como

uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral

Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo

baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos

extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica

diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do

centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa

maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese

O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre

tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio

eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau

histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau

histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos

Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e

radioterapia permanecem por serem elucidados

Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com

e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

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14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

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19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

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28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

LISTA DE ABREVIATURAS

CEP Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa

degC Graus Celsius

Ca +2 Iacuteon caacutelcio

cm2 Centiacutemetros quadrados

CO2 Dioacutexido de carbono

CPOM Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular

DAB Diamino Benzidina

DMEM Meio Eagle Modificado por Dulbecco

DNA Aacutecido desoxirribonucleico

EDTA aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico

F Feminino

g Gramas

H2O2 Dioacutexido de hidrogecircnio

HE Hematoxilina e eosina

M Masculino

ml Mililitros

MMII Membros inferiores

MMSS Membros superiores

PAF para-formaldeiacutedo

PBS Phosaphate Buffered Saline (tampatildeo fosfato salino)

PCM Material pericentriolar

QT Quimioterapia

RT Radioterapia

TRAP Amplificaccedilatildeo repetida da telomerase

LISTA DE SIacuteMBOLOS

ᵞ Gamma

microg Micrograma

Porcentagem

lt Menor

1

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma

O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e

de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes

estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de

suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]

O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida

Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro

mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]

Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no

tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute

de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]

Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e

metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do

tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente

em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor

[1]

Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de

recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em

contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a

recorrecircncia local eacute de 10 [4]

Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A

radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida

paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave

quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando

inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a

expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o

ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)

inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o

inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que

2

este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento

quimioteraacutepico [7]

Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em

modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores

Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente

agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um

citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de

remodelamento oacutesseo [9]

O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do

gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2

pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]

O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da

localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da

malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta

metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos

casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]

A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que

pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10

anos de 20 a 40 [4 2 9]

O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de

diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a

amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como

estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves

terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros

3

12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer

O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do

nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os

rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o

centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo

do fuso mitoacutetico [10]

O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e

a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle

apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo

frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante

a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e

morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente

dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o

agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos

moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute

comeccedilando a emergir [11]

A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do

centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente

agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e

contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]

Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para

a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos

Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo

de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A

presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois

centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do

fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de

sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o

desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]

4

Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]

Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada

com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]

[14] [15]

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e

sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma

maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas

gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos

perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]

Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as

alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens

celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no

gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da

amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees

5

dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos

foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]

Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores

gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos

tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo

do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor

[20]

Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles

analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As

amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees

malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo

encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos

centrossomos [17]

Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como

biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma

melhor estimativa do prognoacutestico [14]

O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA

genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo

cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo

estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a

ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do

centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor

tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou

regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral

que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53

causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo

centrossomo [21]

A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar

que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de

centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos

soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]

6

A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a

instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim

este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica

em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de

condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes

para os pacientes com condrossarcomas

13 Cultura celular

A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um

meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas

que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um

experimento

Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-

fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do

fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a

partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o

campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se

mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo

explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas

de ceacutelulas dispersas

A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam

rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo

de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas

estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas

manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem

ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo

das ceacutelulas em cultura [26]

A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas

foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais

frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram

7

denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas

isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]

As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais

Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito

mais alta em uma placa de cultura [27]

Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as

ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas

proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e

com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou

EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]

Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas

Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver

multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de

tecidos[26]

Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de

culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser

removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria

dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas

ou meses [26]

Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto

pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade

de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]

8

2 JUSTIFICATIVA

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como

uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral

Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo

baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos

extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica

diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do

centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa

maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese

O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre

tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio

eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau

histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau

histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos

Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e

radioterapia permanecem por serem elucidados

Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com

e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

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22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

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52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

LISTA DE SIacuteMBOLOS

ᵞ Gamma

microg Micrograma

Porcentagem

lt Menor

1

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma

O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e

de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes

estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de

suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]

O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida

Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro

mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]

Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no

tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute

de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]

Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e

metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do

tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente

em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor

[1]

Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de

recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em

contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a

recorrecircncia local eacute de 10 [4]

Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A

radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida

paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave

quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando

inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a

expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o

ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)

inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o

inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que

2

este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento

quimioteraacutepico [7]

Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em

modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores

Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente

agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um

citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de

remodelamento oacutesseo [9]

O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do

gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2

pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]

O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da

localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da

malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta

metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos

casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]

A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que

pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10

anos de 20 a 40 [4 2 9]

O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de

diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a

amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como

estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves

terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros

3

12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer

O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do

nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os

rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o

centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo

do fuso mitoacutetico [10]

O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e

a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle

apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo

frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante

a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e

morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente

dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o

agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos

moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute

comeccedilando a emergir [11]

A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do

centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente

agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e

contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]

Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para

a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos

Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo

de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A

presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois

centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do

fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de

sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o

desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]

4

Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]

Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada

com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]

[14] [15]

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e

sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma

maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas

gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos

perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]

Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as

alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens

celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no

gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da

amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees

5

dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos

foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]

Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores

gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos

tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo

do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor

[20]

Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles

analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As

amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees

malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo

encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos

centrossomos [17]

Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como

biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma

melhor estimativa do prognoacutestico [14]

O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA

genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo

cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo

estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a

ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do

centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor

tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou

regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral

que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53

causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo

centrossomo [21]

A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar

que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de

centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos

soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]

6

A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a

instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim

este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica

em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de

condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes

para os pacientes com condrossarcomas

13 Cultura celular

A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um

meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas

que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um

experimento

Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-

fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do

fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a

partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o

campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se

mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo

explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas

de ceacutelulas dispersas

A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam

rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo

de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas

estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas

manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem

ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo

das ceacutelulas em cultura [26]

A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas

foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais

frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram

7

denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas

isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]

As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais

Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito

mais alta em uma placa de cultura [27]

Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as

ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas

proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e

com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou

EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]

Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas

Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver

multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de

tecidos[26]

Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de

culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser

removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria

dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas

ou meses [26]

Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto

pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade

de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]

8

2 JUSTIFICATIVA

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como

uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral

Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo

baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos

extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica

diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do

centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa

maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese

O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre

tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio

eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau

histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau

histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos

Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e

radioterapia permanecem por serem elucidados

Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com

e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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51

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52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

1

1 INTRODUCcedilAtildeO

11 Aspectos Cliacutenicos do Condrossarcoma

O condrossarcoma eacute uma neoplasia mesenquimal caracterizada por proliferaccedilatildeo de ceacutelulas e

de substacircncia intersticial que em conjunto assume aspecto cartilaginoso em diferentes

estaacutedios de diferenciaccedilatildeo Caracteriza-se pela variabilidade de aspectos em qualquer de

suas formas[1] Segundo a literatura eacute o segundo sarcoma oacutesseo primaacuterio mais comum [2]

O condrossarcoma ocorre em qualquer idade mas predomina na quarta deacutecada de vida

Representa cerca de 20 dos tumores oacutesseos malignos [1] sendo considerado o terceiro

mais comum tumor oacutesseo maligno primaacuterio apoacutes o mieloma e o osteossarcoma [23]

Histologicamente satildeo classificados em uma escala de I a III baseada principalmente no

tamanho dos nuacutecleos na hipercromia e na celularidade A taxa de sobrevida em cinco anos eacute

de 89 para pacientes com grau I histoloacutegico e com graus II e III a sobrevida eacute de 53 [2]

Vaacuterios paracircmetros histoloacutegicos tecircm sido associados a um risco de recorrecircncia local e

metaacutestase incluindo grau de necrose tumoral contagem mitoacutetica e matriz mixoacuteide do

tumor Tumores recorrentes tecircm um aumento do grau de malignidade e ocasionalmente

em condrossarcomas haacute a coexistecircncia de vaacuterios graus histoloacutegicos em um mesmo tumor

[1]

Seu tratamento eacute exclusivamente ciruacutergico com ressecccedilatildeo ampla do tumor e a taxa de

recorrecircncia local pode ser de ateacute 90 se houver contaminaccedilatildeo intra-operatoacuteria Em

contrapartida em cirurgias com ressecccedilatildeo ampla onde natildeo ocorreu contaminaccedilatildeo a

recorrecircncia local eacute de 10 [4]

Em geral os condrossarcomas apresentam baixa resposta agrave quimioterapia convencional A

radioterapia do mesmo modo tem papel limitado sendo usada somente como medida

paliativa para lesotildees cirurgicamente inacessiacuteveis [2 4 5] Os mecanismos de resistecircncia agrave

quimioterapia e radioterapia estatildeo sendo estudados e estrateacutegias terapecircuticas utilizando

inibidores de telomerase entre outros tem sido testados [6] Parsch et al investigam a

expressatildeo da telomerase em ceacutelulas de condrossarcoma na linhagem SW1353 utilizando o

ensaio TRAP (amplificaccedilatildeo repetida da telomerase) mostrando que o faacutermaco (BIBR1532)

inibe a telomerase em ceacutelulas SW1353 Aleacutem disso foi demonstrado que em longo prazo o

inibidor de telomerase reduz parcialmente a taxa de crescimento das ceacutelulas SW1353 e que

2

este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento

quimioteraacutepico [7]

Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em

modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores

Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente

agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um

citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de

remodelamento oacutesseo [9]

O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do

gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2

pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]

O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da

localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da

malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta

metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos

casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]

A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que

pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10

anos de 20 a 40 [4 2 9]

O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de

diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a

amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como

estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves

terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros

3

12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer

O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do

nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os

rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o

centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo

do fuso mitoacutetico [10]

O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e

a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle

apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo

frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante

a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e

morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente

dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o

agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos

moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute

comeccedilando a emergir [11]

A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do

centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente

agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e

contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]

Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para

a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos

Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo

de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A

presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois

centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do

fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de

sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o

desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]

4

Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]

Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada

com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]

[14] [15]

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e

sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma

maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas

gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos

perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]

Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as

alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens

celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no

gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da

amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees

5

dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos

foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]

Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores

gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos

tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo

do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor

[20]

Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles

analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As

amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees

malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo

encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos

centrossomos [17]

Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como

biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma

melhor estimativa do prognoacutestico [14]

O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA

genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo

cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo

estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a

ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do

centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor

tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou

regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral

que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53

causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo

centrossomo [21]

A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar

que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de

centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos

soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]

6

A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a

instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim

este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica

em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de

condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes

para os pacientes com condrossarcomas

13 Cultura celular

A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um

meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas

que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um

experimento

Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-

fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do

fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a

partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o

campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se

mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo

explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas

de ceacutelulas dispersas

A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam

rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo

de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas

estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas

manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem

ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo

das ceacutelulas em cultura [26]

A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas

foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais

frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram

7

denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas

isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]

As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais

Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito

mais alta em uma placa de cultura [27]

Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as

ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas

proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e

com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou

EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]

Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas

Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver

multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de

tecidos[26]

Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de

culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser

removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria

dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas

ou meses [26]

Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto

pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade

de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]

8

2 JUSTIFICATIVA

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como

uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral

Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo

baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos

extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica

diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do

centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa

maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese

O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre

tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio

eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau

histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau

histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos

Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e

radioterapia permanecem por serem elucidados

Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com

e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

2

este processo eacute causado pela seleccedilatildeo natural de clones induzida pelo tratamento

quimioteraacutepico [7]

Outro quimioteraacutepico o Quaternarium amocircnio-melfalan tem sido testado in vitro e em

modelos in vivo para o tratamento de vaacuterios tumores apresentando resultados promissores

Este quimioteraacutepico utiliza a funccedilatildeo de amocircnio quaternaacuterio para difundir seletivamente

agentes alquilantes de DNA no tumor de origem cartilaginosa [8] A Oncostatina M um

citostaacutetico proacute-apoptotico tem sido usado em aplicaccedilatildeo local com efeitos de

remodelamento oacutesseo [9]

O mecanismo de resistecircncia agrave radioterapia ainda natildeo estaacute bem elucidado [6] A expressatildeo do

gene hif-1α em condrossarcoma em associaccedilatildeo com o aumento dos niacuteveis da proteiacutena Bcl-2

pode contribuir para o aumento da resistecircncia a quimio eou radioterapia [3]

O prognoacutestico depende principalmente do tamanho do tumor do grau histoloacutegico e da

localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau histoloacutegico da

malignidade O grau I demonstra altas taxas de recorrecircncia local e raramente apresenta

metaacutestases os classificados como grau II a taxa de metaacutestases eacute em torno de 10 a 30 dos

casos e em grau III as metaacutestases aparecem na maioria dos casos [4]

A sobrevida para pacientes com lesotildees de baixo grau em 10 anos eacute de 90 Enquanto que

pacientes com condrossarcoma convencional de alto grau tecircm uma taxa de sobrevida de 10

anos de 20 a 40 [4 2 9]

O condrossarcoma eacute um tumor de difiacutecil tratamento Recentes avanccedilos no entendimento de

diferentes mecanismos relacionados agrave instabilidade cromossocircmica como por exemplo a

amplificaccedilatildeo do centrossomo tem possibilitado a investigaccedilatildeo de novos alvos como

estrateacutegias terapecircuticas No entanto os mecanismos de resistecircncia dos condrossarcomas agraves

terapias anticancer ainda natildeo estatildeo claros

3

12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer

O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do

nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os

rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o

centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo

do fuso mitoacutetico [10]

O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e

a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle

apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo

frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante

a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e

morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente

dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o

agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos

moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute

comeccedilando a emergir [11]

A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do

centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente

agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e

contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]

Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para

a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos

Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo

de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A

presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois

centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do

fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de

sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o

desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]

4

Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]

Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada

com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]

[14] [15]

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e

sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma

maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas

gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos

perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]

Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as

alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens

celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no

gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da

amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees

5

dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos

foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]

Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores

gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos

tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo

do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor

[20]

Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles

analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As

amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees

malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo

encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos

centrossomos [17]

Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como

biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma

melhor estimativa do prognoacutestico [14]

O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA

genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo

cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo

estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a

ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do

centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor

tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou

regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral

que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53

causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo

centrossomo [21]

A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar

que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de

centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos

soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]

6

A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a

instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim

este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica

em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de

condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes

para os pacientes com condrossarcomas

13 Cultura celular

A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um

meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas

que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um

experimento

Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-

fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do

fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a

partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o

campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se

mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo

explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas

de ceacutelulas dispersas

A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam

rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo

de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas

estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas

manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem

ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo

das ceacutelulas em cultura [26]

A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas

foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais

frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram

7

denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas

isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]

As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais

Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito

mais alta em uma placa de cultura [27]

Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as

ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas

proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e

com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou

EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]

Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas

Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver

multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de

tecidos[26]

Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de

culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser

removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria

dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas

ou meses [26]

Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto

pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade

de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]

8

2 JUSTIFICATIVA

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como

uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral

Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo

baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos

extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica

diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do

centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa

maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese

O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre

tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio

eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau

histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau

histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos

Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e

radioterapia permanecem por serem elucidados

Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com

e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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51

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52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

3

12 Amplificaccedilatildeo do Centrossomo em Cacircncer

O centrossomo eacute uma organela natildeo membranosa normalmente encontrada na periferia do

nuacutecleo Ele consiste de um par de centriacuteolos e de muitas diferentes proteiacutenas que os

rodeiam que eacute o material pericentriolar (PCM) Durante a divisatildeo celular na interfase o

centrossomo eacute responsaacutevel por organizar a rede de microtuacutebulos direcionando a formaccedilatildeo

do fuso mitoacutetico [10]

O controle preciso do nuacutemero de centrossomos eacute crucial para a montagem bipolar do fuso e

a transmissatildeo precisa do material geneacutetico para as ceacutelulas filhas A falha do controle

apropriado do nuacutemero de centrossomos resulta em centrossomos supranumeraacuterios que satildeo

frequentemente encontrados em ceacutelulas cancerosas Isto representa um paradoxo durante

a mitose as ceacutelulas com mais de dois centrossomos satildeo propensos a mitoses multipolares e

morte celular no entanto as ceacutelulas cancerosas com centrossomos extras frequentemente

dividem-se com sucesso Um mecanismo alternativo utilizado pelas ceacutelulas cancerosas eacute o

agrupamento de centrossomos em matrizes bipolares Uma compreensatildeo dos mecanismos

moleculares pelos quais as ceacutelulas cancerosas podem suprimir mitoses multipolares estaacute

comeccedilando a emergir [11]

A perda dos mecanismos de controle da integridade do centrossomo leva a amplificaccedilatildeo do

centrossomo promovendo a presenccedila de mais de dois centrossomos devido especialmente

agrave duplicaccedilatildeo ou fragmentaccedilatildeo do mesmo resultando em mitoses multipolares e

contribuindo dessa maneira para a instabilidade cromossocircmica [10]

Em tumores soacutelidos e hematoloacutegicos a amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem contribui para

a perda de arquitetura dos tecidos e possivelmente a angiogecircnese em tumores humanos

Centrossomos extranumeraacuterios satildeo capazes de nucleaccedilatildeo microtubular anormal e formaccedilatildeo

de fusos mitoacuteticos desorganizada levando a desagregaccedilatildeo cromossocircmica e aneuploidias A

presenccedila de centrossomos extras natildeo induz necessariamente a erros de divisatildeo pois

centrossomos extras podem permanecer agrupados preservando assim a bipolaridade do

fuso mitoacutetico Assim a ceacutelula com fenoacutetipo mutante pode conferir vantagem de

sobrevivecircncia atraveacutes de um processo de seleccedilatildeo darwiniana promovendo assim o

desenvolvimento e a progressatildeo do cacircncer (Figura-1) [12]

4

Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]

Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada

com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]

[14] [15]

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e

sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma

maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas

gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos

perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]

Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as

alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens

celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no

gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da

amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees

5

dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos

foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]

Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores

gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos

tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo

do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor

[20]

Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles

analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As

amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees

malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo

encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos

centrossomos [17]

Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como

biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma

melhor estimativa do prognoacutestico [14]

O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA

genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo

cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo

estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a

ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do

centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor

tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou

regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral

que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53

causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo

centrossomo [21]

A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar

que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de

centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos

soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]

6

A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a

instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim

este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica

em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de

condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes

para os pacientes com condrossarcomas

13 Cultura celular

A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um

meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas

que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um

experimento

Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-

fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do

fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a

partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o

campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se

mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo

explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas

de ceacutelulas dispersas

A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam

rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo

de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas

estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas

manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem

ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo

das ceacutelulas em cultura [26]

A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas

foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais

frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram

7

denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas

isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]

As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais

Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito

mais alta em uma placa de cultura [27]

Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as

ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas

proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e

com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou

EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]

Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas

Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver

multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de

tecidos[26]

Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de

culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser

removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria

dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas

ou meses [26]

Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto

pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade

de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]

8

2 JUSTIFICATIVA

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como

uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral

Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo

baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos

extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica

diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do

centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa

maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese

O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre

tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio

eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau

histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau

histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos

Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e

radioterapia permanecem por serem elucidados

Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com

e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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51

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52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

4

Figura1 Modelo de amplificaccedilatildeo do centrossomo como causa de carcinogecircnese [12]

Recentes estudos tecircm demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada

com a instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos [13]

[14] [15]

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido detectada em vaacuterios tipos de malignidades e

sarcomas borderleine incluindo osteossarcoma condrossarcoma fibrohistiocitoma

maligno hematopericitoma tumores lipomatosos atiacutepicos lipossarcoma tumor de ceacutelulas

gigantes PNET sinoviossarcoma leiomiossarcoma e tambeacutem os tumores de nervos

perifeacutericos [16] [17] [18] [19] [20]

Um estudo realizado com amostras de osteossarcoma analisou a associaccedilatildeo entre as

alteraccedilotildees do centrossomo e instabilidade cromossocircmica Foram utilizadas quatro linhagens

celulares e sete culturas primaacuterias Nas linhagens celulares estabelecidas a amplificaccedilatildeo do

centrossomo foi encontrada em trecircs delas as quais apresentavam tambeacutem mutaccedilotildees no

gene supressor tumoral TP53 Neste mesmo estudo tambeacutem foram realizadas anaacutelises da

amplificaccedilatildeo do centrossomo tambeacutem em culturas primaacuterias de sete pacientes as alteraccedilotildees

5

dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos

foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]

Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores

gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos

tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo

do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor

[20]

Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles

analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As

amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees

malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo

encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos

centrossomos [17]

Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como

biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma

melhor estimativa do prognoacutestico [14]

O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA

genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo

cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo

estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a

ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do

centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor

tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou

regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral

que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53

causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo

centrossomo [21]

A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar

que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de

centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos

soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]

6

A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a

instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim

este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica

em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de

condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes

para os pacientes com condrossarcomas

13 Cultura celular

A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um

meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas

que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um

experimento

Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-

fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do

fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a

partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o

campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se

mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo

explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas

de ceacutelulas dispersas

A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam

rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo

de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas

estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas

manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem

ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo

das ceacutelulas em cultura [26]

A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas

foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais

frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram

7

denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas

isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]

As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais

Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito

mais alta em uma placa de cultura [27]

Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as

ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas

proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e

com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou

EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]

Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas

Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver

multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de

tecidos[26]

Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de

culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser

removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria

dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas

ou meses [26]

Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto

pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade

de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]

8

2 JUSTIFICATIVA

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como

uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral

Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo

baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos

extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica

diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do

centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa

maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese

O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre

tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio

eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau

histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau

histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos

Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e

radioterapia permanecem por serem elucidados

Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com

e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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51

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22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

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28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

5

dos centrossomos foram encontradas em quatro dos sete casos sendo que em dois casos

foram vistas altas taxas de amplificaccedilatildeo do centrossomo [16]

Moskovsky et al mostraram que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute presente em tumores

gigantocelular oacutesseo benigno o que demonstra que esse fenocircmeno natildeo eacute caracteriacutestica dos

tumores malignos de ceacutelulas gigantes No entanto a correlaccedilatildeo clinica com a amplificaccedilatildeo

do centrossomo pode ser empregada para predizer o comportamento maligno deste tumor

[20]

Gisselsson et al avaliaram 28 amostras de tumores oacutesseos e sarcomas de partes moles

analisando alteraccedilotildees do centrossomos e alteraccedilotildees citogeneacuteticas nestes tumores As

amostras foram coletadas de lesotildees benignas como Lipoma e Schwanoma e de lesotildees

malignas como lipossarcomas condrossarcomas e fibrohistiocitoma maligno Neste estudo

encontraram muitos casos com mitoses multipolares associados a alteraccedilotildees dos

centrossomos [17]

Estudos sugerem que a amplificaccedilatildeo do centrossomo teria um grande potencial como

biomarcador para uma melhor classificaccedilatildeo e diagnoacutestico do carcinoma urotelial e uma

melhor estimativa do prognoacutestico [14]

O ciclo de duplicaccedilatildeo do centrossomo ocorre concomitantemente ao ciclo celular no DNA

genocircmico Vaacuterios estudos tecircm apontado agrave participaccedilatildeo de diferentes proteiacutenas incluindo

cinases e fosfatases que atuam no ciclo celular e que desempenham tambeacutem a regulaccedilatildeo

estrutural e funcional do centrossomo Algumas proteiacutenas e genes alvos de E2F como a

ciclina D1 ciclina E ciclina A CdK2 NeK2 participam na regulaccedilatildeo do ciclo de duplicaccedilatildeo do

centrossomo Outro gene bastante atuante na regulaccedilatildeo do centrossomo eacute TP53 supressor

tumoral que impede a amplificaccedilatildeo do centrossomo se ligando diretamente a ele ou

regulando a via de p21(Waf1CIP1) Outro exemplo eacute o ECRG2 um gene supressor tumoral

que reconhece o centrossomo e que em baixos niacuteveis de expressatildeo desestabiliza o P53

causando o aumento da ciclina ECdk2 e consequentemente favorecendo a amplificaccedilatildeo

centrossomo [21]

A duplicaccedilatildeo do centrossomo bem como a duplicaccedilatildeo do DNA eacute regulada para assegurar

que centrossomos sejam duplicados apenas uma vez por ciclo celular Embora o nuacutemero de

centrossomos seja estritamente regulado eacute bem documentado que tumores malignos

soacutelidos bem como hematoloacutegica podem apresentar centrossomos extranumeraacuterios [22]

6

A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a

instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim

este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica

em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de

condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes

para os pacientes com condrossarcomas

13 Cultura celular

A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um

meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas

que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um

experimento

Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-

fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do

fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a

partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o

campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se

mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo

explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas

de ceacutelulas dispersas

A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam

rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo

de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas

estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas

manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem

ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo

das ceacutelulas em cultura [26]

A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas

foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais

frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram

7

denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas

isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]

As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais

Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito

mais alta em uma placa de cultura [27]

Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as

ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas

proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e

com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou

EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]

Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas

Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver

multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de

tecidos[26]

Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de

culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser

removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria

dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas

ou meses [26]

Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto

pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade

de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]

8

2 JUSTIFICATIVA

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como

uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral

Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo

baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos

extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica

diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do

centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa

maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese

O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre

tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio

eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau

histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau

histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos

Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e

radioterapia permanecem por serem elucidados

Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com

e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

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12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

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16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

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51

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19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

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THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

6

A literatura tem demonstrado que a amplificaccedilatildeo do centrossomo estaacute relacionada com a

instabilidade cromossocircmica e ao prognoacutestico de pacientes com tumores malignos Assim

este projeto objetiva o estudo do centrossomo por imuno-histoquiacutemica e imunocitoquimica

em amostras de tecido crio-preservado e em culturas celulares primaacuterias de

condrossarcomas O presente estudo poderaacute fornecer informaccedilotildees prognoacutesticas relevantes

para os pacientes com condrossarcomas

13 Cultura celular

A cultura de tecidos foi inicialmente concebida no iniacutecio do seacuteculo XX [23 24] como um

meacutetodo para estudar o comportamento de ceacutelulas de animais livres de variaccedilotildees sistecircmicas

que podem surgir in vivo tanto durante a homeostase normal e sob o stress de um

experimento

Como o nome implica a teacutecnica foi elaborada primeiro com fragmentos de tecido natildeo-

fragmentados e o crescimento foi restringido para a migraccedilatildeo de ceacutelulas a partir do

fragmento de tecido com mitoses ocasionais em excrescecircncia Como a cultura de ceacutelulas a

partir de tais explantes (pequenos fragmentos de tecidos) primaacuterios de tecido dominou o

campo por mais de 50 anos [25] natildeo eacute de estranhar que o nome ldquocultura de tecidosrdquo tem-se

mantido em uso como um termo geneacuterico apesar o fato de a maior parte da expansatildeo

explosiva nesta aacuterea na segunda metade do seacuteculo XX foi possiacutevel pela utilizaccedilatildeo de culturas

de ceacutelulas dispersas

A maioria dos procedimentos bioquiacutemicos requer que grandes quantidades de ceacutelulas sejam

rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes Se a amostra eacute um pedaccedilo

de tecido composto por diferentes tipos de ceacutelulas populaccedilotildees de ceacutelulas heterogecircneas

estaratildeo misturadas Dessa forma eacute necessaacuterio separaacute-las de acordo com o tipo Essas

manipulaccedilotildees resultam em uma populaccedilatildeo relativamente homogecircnea de ceacutelulas que podem

ser analisadas-diretamente ou apoacutes seu nuacutemero ser bastante aumentado pela proliferaccedilatildeo

das ceacutelulas em cultura [26]

A desagregaccedilatildeo das ceacutelulas explantadas e plaqueamento subsequente das ceacutelulas dispersas

foi demonstrada pela primeira vez por Rous [27] embora a passagem foi mais

frequentemente pela subdivisatildeo ciruacutergica da cultura para gerar o que em seguida foram

7

denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas

isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]

As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais

Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito

mais alta em uma placa de cultura [27]

Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as

ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas

proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e

com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou

EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]

Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas

Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver

multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de

tecidos[26]

Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de

culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser

removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria

dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas

ou meses [26]

Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto

pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade

de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]

8

2 JUSTIFICATIVA

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como

uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral

Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo

baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos

extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica

diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do

centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa

maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese

O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre

tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio

eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau

histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau

histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos

Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e

radioterapia permanecem por serem elucidados

Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com

e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

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11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

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14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

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16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

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19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

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22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

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28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

7

denominados linhagens celulares L929 foi a primeira linhagem de ceacutelulas clonadas

isoladas por clonagem capilar de ceacutelulas L de camundongo [28]

As linhagens de ceacutelulas cancerosas sao mais facilmente geradas que as das ceacutelulas normais

Elas crescem sem aderir a uma superficie e podem proliferar para uma densidade muito

mais alta em uma placa de cultura [27]

Para o isolamento das ceacutelulas eacute preciso romper a matriz extracelular e as junccedilotildees entre as

ceacutelulas que as mantem unidas Para isso o tecido normalmente eacute tratado com enzimas

proteoliacuteticas (como tripsina e colagenase) para digerir as proteiacutenas da matriz extracelular e

com agentes que se ligam ou quelam o Ca +2 ( como o aacutecido etilenodiaminotetraceacutetico ou

EDTA) A adesatildeo entre as ceacutelulas depende do iacuteon caacutelcio [26]

Ceacutelulas cultivadas em meio de cultura fornecem uma populaccedilatildeo mais homogenea de ceacutelulas

Dadas as condiccedilotildees apropriadas a maioria das ceacutelulas vegetais e animais pode viver

multiplicar e ateacute mesmo expressar propriedades diferenciadas em uma garrafa de cultura de

tecidos[26]

Culturas preparadas diretamente a partir dos tecidos de um organismo satildeo chamadas de

culturas primaacuterias Na maioria dos casos as ceacutelulas em culturas primaacuterias podem ser

removidas da placa de cultura e recultivadas repetidamente em uma cultura secundaacuteria

dessa maneira elas podem ser subcultivadas (passagens) repetidamente durante semanas

ou meses [26]

Existem ateacute o momento poucos estudos sobre linhagem de celulas de condrossarcoma Isto

pode estar relacionado com a baixa taxa de proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a dificuldade

de reproduzir um ambiente propiacutecio para o desenvolvimento do condrossarcoma [29]

8

2 JUSTIFICATIVA

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como

uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral

Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo

baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos

extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica

diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do

centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa

maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese

O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre

tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio

eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau

histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau

histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos

Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e

radioterapia permanecem por serem elucidados

Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com

e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

8

2 JUSTIFICATIVA

A amplificaccedilatildeo do centrossomo tem sido estudada em diferentes tipos de cacircnceres como

uma importante causa da instabilidade cromossocircmica e progressatildeo tumoral

Recentes estudos mostram o processo de clusterizaccedilatildeo do centrossomo como mecanismo

baacutesico de sobrevivecircncia das ceacutelulas cancerosas Isto porque na mitose os centrossomos

extranumeraacuterios formam fusos multipolares contribuindo para instabilidade cromossocircmica

diminuindo a viabilidade celular Nesse sentido as ceacutelulas cancerosas com amplificaccedilatildeo do

centrossomo natildeo passam necessariamente por mitoses multipolares e conferem dessa

maneira vantagens seletivas agrave tumorigecircnese

O condrossarcoma eacute um tumor de crescimento lento o diagnoacutestico muitas vezes ocorre

tardiamente contribuindo para baixa respostas as terapias convencionais como quimio

eou radioterapia Os fatores prognoacutesticos dependem principalmente do tamanho do grau

histoloacutegico e da localizaccedilatildeo da lesatildeo A metaacutestase no condrossarcoma estaacute associada ao grau

histoloacutegico da malignidade e os tumores de grau III estas aparecem na maioria dos casos

Por ser um tumor de difiacutecil tratamento os mecanismos de resistecircncia agrave quimioterapia e

radioterapia permanecem por serem elucidados

Os resultados deste estudo possibilitaratildeo discutir sobre a amplificaccedilatildeo do centrossomo com

e a possibilidade de a amplificaccedilatildeo do centrossomo ser um fator prognoacutestico

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

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16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

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51

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20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

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THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

9

3 OBJETIVOS

31 Objetivo Geral

Avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em amostras de tecidos tumorais crio-

preservados e de condrossarcoma de pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de

Barretos no periacuteodo de 2004 a 2012 e avaliar a amplificaccedilatildeo do centrossomo em

cultura celular primaacuteria de condrossarcoma

31 Objetivos Especiacuteficos

Realizar o levantamento de prontuaacuterios dos casos tratados entre 2004 a 2012

Realizar o levantamento dos casos que possuem tecido armazenado no banco de

tumor

Realizar a coleta das amostras de tecido para realizar a cultura primaacuteria em 2012

Estabelecer as culturas primaacuterias

Realizar a anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias e amostras

tumorais pela marcaccedilatildeo do anticorpo monoclonal anti-y-tubulina por imunocitoquiacutemica e

imuno-histoquiacutemica respectivamente

Reconhecer se haacute correlaccedilatildeo da amplificaccedilatildeo com os dados cliacutenicos

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

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22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

10

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

A pesquisa foi realizada no Hospital de Cacircncer de Barretos Fundaccedilatildeo Pio XII com pacientes

portadores de condrossarcoma tratadosatendidos no serviccedilo de ortopedia no periacuteodo de

2004 a 2012 com material disponiacutevel no banco de tumores Contamos com um nuacutemero

amostral de 48 pacientes tratados no Hospital de Cacircncer de Barretos com o diagnoacutestico de

condrossarcoma Foram usadas apenas 10 amostras de tecidos tumorais de

condrossarcomas crio-preservados destes pacientes pois foram os casos em que a reaccedilatildeo

funcionou

Este trabalho foi aprovado pela comissatildeo de eacutetica e pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de

Cacircncer de Barretos (Comissatildeo de Eacutetica em Pesquisa (CEP) Processo Ndeg182155)

Adicionalmente foi utilizado amostras de culturas de tumores de trecircs pacientes operados

em 2012 no Serviccedilo de Ortopedia do Hospital de Cacircncer de Barretos histologicamente

classificados em graus de I a III O estabelecimento e o cultivo das amostras tumorais faz

parte de outro projeto do grupo de pesquisadores aprovado pela comissatildeo de eacutetica e

pesquisa da Fundaccedilatildeo Pio XII-Hospital de Cacircncer de Barretos (CEP Processo Nordm 5092011)

Criteacuterios de inclusatildeo pacientes de ambos os sexos portadores de condrossarcoma

metastaacuteticos ou natildeo ao diagnoacutestico (tomografia de toacuterax e cintilografia oacutessea) com tecido

crio-preservado arquivado no banco de tumores do Departamento de Patologia do Hospital

de Cacircncer de Barretos E que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica tenha funcionado

Criteacuterios de exclusatildeo portadores de outros tumores oacutesseos que natildeo condrossarcoma e que

a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica natildeo tenha funcionado

Os dados de estadiamento e prognoacutestico foram avaliados atraveacutes dos prontuaacuterios de acordo

com laudos de exames

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

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51

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22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

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28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

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52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

11

411 Estabelecimento de culturas primaacuterias

Apoacutes a cirurgia de ressecccedilatildeo do tumor no paciente uma amostra remanescente (5g) eacute

embebida em PBS (1x) e transferida para um tubo de 50 ml Em seguida o material coletado

eacute encaminhado ao Centro de Pesquisa em Oncologia Molecular (CPOM) A amostra eacute

macerada tripsinizada (Life Tecnologies Denmark USA) e colocada em frasco de cultura

25cm2 e adicionado o meio de cultura DMEM (Life Tecnologies Denmark USA) + 10 Soro

Fetal Bovino (Life Tecnologies Denmark USA) suplementado com

1penicilinaestreptomicina (Life Tecnologies Danmark As culturas satildeo armazenadas em

Incubadora em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC permanecendo por um

periacuteodo aproximado de 7 dias ateacute a fase de confluecircncia das ceacutelulas Apoacutes o crescimento e

confluecircncia das ceacutelulas as mesmas satildeo novamente tripsinizadas e transferidas para novos

frascos para anaacutelise de amplificaccedilatildeo do centrossomo sendo posteriormente realizado o

processo de preservaccedilatildeo em nitrogecircnio liacutequido

Para a confirmaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais foi realizada a teacutecnica de imunocitoquiacutemica com

anticorpo primaacuterio S100 utilizando o sistema de detecccedilatildeo UltraVision Plus (

ThermoScientific - USACalifoacuternia) Previamente as ceacutelulas foram fixadas com

paraformaldeiacutedo 4 (Merck - GermanyDarmstady) permeabilizadas em Triton X-100 (02)

(Sigma Life Science - USACalifoacuternia) Para a etapa de revelaccedilatildeo foi utilizado o cromoacutegeno

DAB (DAKO ndash EUA) posteriormente as lacircminas foram coradas com hematoxilina e eosina e

montadas em glicerol (Sigma Aldrich- USAMissouri) Apoacutes a teacutecnica as lacircminas foram

analisadas em microscoacutepio de luz branca por um patologista do Hospital de Cacircncer de

Barretos para a confirmaccedilatildeo do tumor (figura 2)

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

12

Figura 2 Cultura celular para condrossarcoma com reaccedilatildeo imunocitoquimica para anticorpo

S100

412 Anaacutelise de Amplificaccedilatildeo do Centrossomo

Imuno-histoquiacutemica

Previamente a etapa de imuno-histoquiacutemica secccedilotildees histoloacutegicas das amostras de tecido

crio-preservado satildeo cortadas em criostato na espessura de 3microm sobre lacircminas com carga

positiva sendo imediatamente fixadas por 15 minutos com paraformaldeido (PAF) 4

(Merck Germany Darmstady) e transferidas para PBS (1x)

Detecccedilatildeo As lacircminas satildeo incubadas com o anticorpo monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio

na concentraccedilatildeo de 1-2μgml (Sigma Missouri USA) por 16 horas em cacircmara fria No

segundo dia ao teacutermino da etapa de incubaccedilatildeo com o anticorpo primaacuterio as lacircminas satildeo

lavadas em PBS (1x) e em seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente

(Thermo Scientific Califoacuternia USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo

realizadas por mais duas vezes intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-

peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO

EUA) 10 minutos Apoacutes a contracoloraccedilatildeo com hematoxilina e eosina (HE) as lacircminas satildeo

lavadas em aacutegua ultrapura por 2 minutos finalizando com o processo de desidrataccedilatildeo em

seacuterie de etanol (50 70 e 100) (Merck Darmstadt Germany) e xilol (Merck Darmstadt

Germany) por trecircs vezes por 5 minutos cada Para anaacutelise microscoacutepica as lacircminas satildeo

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

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5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

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12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

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THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

13

montadas com o reagente Entellan (Merck Darmstadt Germany) O nuacutemero de

centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente por dois observadores (a

mestranda Carla Aparecida Pinheiro e o co-orientador Dr Iberecirc Cauduro Soares) contando-

se para cada amostra ateacute 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um

aumento de 1000 vezes (objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Foi considerada marcaccedilatildeo

positiva qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida

se nos casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura [14]

Imunocitoquiacutemica

A suspensatildeo de ceacutelulas estabelecidas em frasco de cultura (25cm2) (TPP Switzerland

EUA) eacute cultivada em placas de 12 poccedilos (Becton Dickinson New Jersey USA) e para isso no

interior de cada poccedilo eacute acrescentada uma lamiacutenula de vidro Em seguida a placa eacute incubada

em atmosfera uacutemida contendo 5 de CO2 a 37degC ateacute a etapa de confluecircncia na lamiacutenula

Posteriormente as ceacutelulas satildeo lavadas em PBS (1x) fixadas por 15 minutos com para-

formaldeiacutedo (PAF) 4 (Merck Germany Darmstady) e permeabilizadas com Triton X-100

(02) (Sigma Missouri USA) durante 4 minutos Em cacircmara uacutemida eacute realizado a inativaccedilatildeo

com peroxidases endoacutegenas com H2O2 a 3 (Merck Darmstadt Germany) diluiacutedo em

metanol (Merck Darmstadt Germany) por 10 minutos As lamiacutenulas satildeo retiradas da placa

e colocadas sobre uma lacircmina sem lavagem das ceacutelulas para incubaccedilatildeo com o anticorpo

monoclonal anti-γ-tubulina primaacuterio (Sigma Missouri USA) por 60 minutos a temperatura

ambiente Ao final dessa etapa as lacircminas satildeo submetidas a trecircs lavagens em PBS (1x) e em

seguida incubadas com o anticorpo secundaacuterio polivalente (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) durante 10 minutos As lavagens com PBS (1x) satildeo realizadas por mais duas vezes

intercaladas com a incubaccedilatildeo com estreptoavidina-peroxidase (Thermo Scientific Califoacuternia

USA) por 10 minutos e revelaccedilatildeo com DAB (DAKO EUA) 10 minutos Apoacutes a contra

coloraccedilatildeo com hematoxilina as lacircminas satildeo montadas em meio de glicerol (Sigma Aldrich

Missouri USA) para fixaccedilatildeo da lamiacutenula

O nuacutemero de centrossomos em cada ceacutelula eacute determinado manualmente contando

para cada amostra 100 nuacutecleos atraveacutes de microscoacutepio de luz transmitida com um aumento

de 1000 vezes (objetiva de 100X em oacuteleo de imersatildeo) Foi considerada marcaccedilatildeo positiva

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

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14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

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17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

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19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

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21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

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THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

14

qualquer estrutura proacutexima ao nuacutecleo A amplificaccedilatildeo do centrossomo seraacute definida se nos

casos ocorrerem mais de 5 das ceacutelulas com trecircs ou mais centrossomos por ceacutelulas

conforme descrito na literatura apenas um examinador avaliou as laminas de

imunocitoquiacutemica Natildeo foi possiacutevel ser vista por dois observadores pois as mesmas natildeo

estatildeo mais disponiacuteveis no laboratoacuterio devido a problemas teacutecnicos [14]

42 Tamanho da Amostra

Atualmente existem 48 pacientes tratados de condrossarcoma convencional no Hospital de

Cacircncer de Barretos considerando o periacuteodo de 2004 a 2012 com material armazenado no

banco de tumores a reaccedilatildeo da imuno-histoquiacutemica funcionou em apenas 10 casos sendo

assim apenas estes foram incluiacutedos no trabalho

43 Metodologia Estatiacutestica

A anaacutelise descritiva da amostra seraacute realizada calculando a meacutedia desvio padratildeo miacutenimo

maacuteximo e quartis para as variaacuteveis quantitativas e tabelas de frequecircncia para as variaacuteveis

qualitativas

Os dados da analise de amplificaccedilatildeo do centrossomo e a formaccedilatildeo de clusters foram

analisados utilizando o coeficiente de concordacircncia de Lin com considerando-se um

intervalo de confianccedila de 95

44 Avaliaccedilotildees dos Riscos Benefiacutecios

Riscos natildeo apresenta riscos

Benefiacutecios o beneficio seraacute para a populaccedilatildeo na tentativa de conhecer melhor a patologia e

melhorar o tratamento do tumor

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

15

5 RESULTADOS

51 Culturas Primaacuterias

Foi realizada a cultura da amostra tumoral de trecircs pacientes submetidos a procedimento

ciruacutergico em 2012 no Hospital de Cacircncer de Barretos e que assinaram o termo de

consentimento Os dados cliacutenicos foram resumidos na tabela 1 Dois pacientes eram do sexo

feminino e um do sexo masculino As idades foram 35 50 e 42 anos Com relaccedilatildeo ao grau

histoloacutegico foram encontrados dois pacientes com grau histoloacutegico III e apenas um com grau

I Apenas um paciente foi submetido agrave quimioterapia e apresentou recidiva tumoral sendo

submetido a novo procedimento ciruacutergico com ressecccedilatildeo tumoral e novamente

encaminhado material para cultura

512 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

Apoacutes a cultura primaacuteria as ceacutelulas foram submetidas agrave padronizaccedilatildeo do processo de

imunocitoquiacutemica (figura 4) em 3 amostras e por imuno-fluorescecircncia (figura 5) em uma

amostra conforme dados da tabela 2

A amplificaccedilatildeo do centrossomo realizada pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica foi vista em 64

das ceacutelulas do condrossarcoma grau III (caso 1) em sua recidiva a amplificaccedilatildeo foi vista em

76 das ceacutelulas No grau I a amplificaccedilatildeo ocorreu em 48 das ceacutelulas O caso 4

condrossarcoma grau III foi amplificado em 15 das ceacutelulas Foram observados nas culturas

a formaccedilatildeo de clusters Um cluster ocorreu em 15 dos nuacutecleos das ceacutelulas do caso 1 sendo

observado 2 clusters em 2 Em sua recidiva caso 2 foram encontrados 16 dos nuacutecleos

com 1 cluster dois clusters em 5 das ceacutelulas e trecircs clusters em 1 das ceacutelulas No

condrossarcoma grau I foram vistos um cluster em 5 dos nuacutecleos e dois clusters em 1

Pela teacutecnica de fluorescecircncia foram vistos no condrossarcoma grau III 8 das ceacutelulas com

um cluster (tabela 2)

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

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29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

16

Tabela 1 Principais dados cliacutenicos dos pacientes (amostras de culturas primaacuterias de

condrossarcomas)

Caso Sexo

idade Local do tumor

QT

RT Anatomopatoloacutegico

Recidiva

tumoral

1 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

2 F35 Uacutemero esquerdo Sim Natildeo Condrossarcoma grau III

siacutendrome de Ollier Sim

3 F50 Fecircmur distal

esquerdo NatildeoNatildeo

Encondroma

Condrossarcoma grau I Natildeo

4 M42 Ombro esquerdo e

regiatildeo subescapular NatildeoNatildeo Condrossarcoma grau III Natildeo

QT quimioterapia

RT radioterapia

Tabela 2 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em culturas primaacuterias de

condrossarcomas

Caso Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal (2) Amplificado 1

Cluster

2

Clusters

3

Clusters

1 Condrossarcoma recidivado

Grau III 36 64 15 2 0

2 Condrossarcoma Recidivado ndash

Grau III (segunda amostra) 24 76 16 5 1

3 Condrossarcoma ndash

Encondroma ndash Grau I 52 48 5 1 0

4 Condrossarcoma ndash Grau III

(teacutecnica com fluorescecircncia) 85 15 8 0 0

Amostra de recidiva do caso 1

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

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17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

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19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

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22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

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52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

17

Figura 3 Estabelecimento da cultura primaacuteria de condrossarcomas Imagens obtidas em

microscoacutepio invertido com contraste de fase Orange aumento de 10x

Figura 4 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunocitoquiacutemica A seta (preto)

mostra a formaccedilatildeo de um cluster com 4 centrossomos

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

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9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

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28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

18

Figura 5 Cultura primaacuteria de condrossarcoma teacutecnica de Imunofluorescecircncia

52 Cultura de Fibroblastos Normais

Foi utilizada uma cultura comercial estabelecida de fibroblastos normais Linhagem CCD 1059

SK que serviram como controles negativos da amplificaccedilatildeo do centrossomos A padronizaccedilatildeo

tambeacutem foi realizada pelas duas teacutecnicas imunocitoquimica e imunofluorescecircncia os dados

satildeo resumidos na tabela 3 A amplificaccedilatildeo foi vista em 3 dos nuacutecleos pela teacutecnica de

fluorescecircncia e em 4 das ceacutelulas pela teacutecnica de imunocitoquiacutemica

Tabela 3 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em cultura de fibroblastos normais

(controle) pela teacutecnica de imunofluorescecircncia e imunocitoquiacutemica

Subtipo

Quanto agrave presenccedila de

centrossomos por nuacutecleo () Clusters por nuacutecleo ()

Normal Amplificado 1 Cluster 2 Clusters 3 Clusters

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com fluorescecircncia) 97 3 2 1 0

Fibroblastos normais Controle

(teacutecnica com

Imunocitoquimica)

96 4 3 1 0

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

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9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

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THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

19

53 Tecido crio-preservado

531 Dados Cliacutenicos

Dos 48 casos com material crio-preservado armazenados no banco de tumores natildeo foram

encontrados seis casos As 42 amostras encontradas foram submetidas agrave imuno-

histoquimica com ᵞ-tubulina e apesar de se usar lacircminas com carga positiva 22 casos

descolaram E em 8 casos a reaccedilatildeo natildeo funcionou Assim restaram apenas 10 casos para

anaacutelise do centrossomo

Os dados cliacutenicos dos casos em que a reaccedilatildeo de imuno-histoquiacutemica funcionou estatildeo

resumidos na tabela 4 Destes trecircs pacientes eram do sexo masculino 8 eram do sexo

feminino a idade do diagnoacutestico variou entre 21 e 65 anos sendo em meacutedia 412 anos O

tempo de seguimento variou entre 105 a 6541 meses em meacutedia 338 meses

Metade dos casos tinha diagnoacutestico anterior agrave chegada ao hospital e consequentemente os

outros cinco natildeo apresentavam o diagnoacutestico de condrossarcoma antes de entrarem no

serviccedilo Dos cinco pacientes com diagnoacutestico anterior dois foram submetidos a

procedimento ciruacutergico e um dos que natildeo apresentava diagnoacutestico haviam sido submetidos

a procedimento ciruacutergico de artroplastia sem o conhecimento da neoplasia pelo meacutedico

Quanto agrave localizaccedilatildeo do tumor trecircs estavam na cintura escapular trecircs na bacia e dois no

membro inferior e um no toacuterax e um no membro superior

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

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6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

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13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

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17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

20

Tabela 4 principais dados cliacutenicos das amostras de tecidos crio-preservados com avaliaccedilatildeo

da imuno-histoquiacutemica

ID Sexoidade Tempo de

seguimento Localizaccedilatildeo

tumoral Anatomopatoloacutegico

Tipo histoloacutegico

Diagnoacutestico anterior

Origem patoloacutegica

1 M65 2931 Bacia Grau I Central Natildeo Primaacuterio

2 F56 6508 Toacuterax Grau I Central Natildeo Primaacuterio

3 F21 966 Bacia Grau II Central Natildeo Primaacuterio

4 F41 3939 MMII Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio 5 F52 6541 Bacia Grau I Mixoacuteide Sim Primaacuterio

6 F46 3844 Cintura

escapular Grau II Central Sim Secundaacuterio

7 M27 4225 MMSS Grau I Central Sim Secundaacuterio

8 F37 3046 MMII Grau II Central Sim Secundaacuterio

9 F25 105 Cintura

escapular Grau I Central Natildeo Secundaacuterio

10 M42 1774 Cintura

escapular Grau III Central Natildeo Primaacuterio

Continuaccedilatildeo da tabela 4

ID Cirurgia

anterior ao diagnoacutestico

Cirurgia anterior com recidiva local ou com

margens comprometidas ao diagnoacutestico

Metaacutestase Tipo de cirurgia

Estado funcional atual do membro

Uacuteltima informaccedilatildeo

1 NA NA Sim poacutes-

diagnoacutestico Ressecccedilatildeo

simples Com

limitaccedilatildeo Oacutebito por

Cacircncer

2 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Natildeo se aplica

Vivo sem doenccedila

3 NA NA Sim ao

diagnoacutestico Natildeo

operado Ignorado

Oacutebito por Cacircncer

4 Sim Sim Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

5 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

6 Natildeo NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

7 Natildeo NA Natildeo Amputaccedilatildeo Amputado Vivo sem doenccedila

8 Sim Sim Natildeo Ressecccedilatildeo +

Proacutetese Com

limitaccedilatildeo Vivo sem doenccedila

9 NA NA Natildeo Ressecccedilatildeo

simples Funcional

Vivo sem doenccedila

10 Sim NA Sim ao

diagnoacutestico Amputaccedilatildeo Amputado

Vivo com doenccedila

ID Identificaccedilatildeo F feminino M masculino NA natildeo se aplica

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

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12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

21

Os casos operados fora do serviccedilo com diagnoacutestico preacutevio foram submetidos agrave revisatildeo de

lacircmina pela patologia e os demais foram submetidos agrave biopsia para o diagnoacutestico seis eram

grau I trecircs eram grau II e apenas um caso era grau III O tipo histoloacutegico Central foi

encontrado em seis casos e o tipo mixoacuteide em dois casos Em dois casos natildeo havia

informaccedilatildeo do tipo histoloacutegico Eram primaacuterios seis casos e secundaacuterios em quatro casos

Com relaccedilatildeo ao tratamento dos pacientes cinco foram submetidos agrave ressecccedilatildeo simples

ressecccedilatildeo e substituiccedilatildeo por endoproacutetese em apenas um caso E trecircs casos foram realizados

a amputaccedilatildeo e um caso apenas natildeo foi operado A quimioterapia foi realizada em trecircs

pacientes e os outros sete natildeo foram submetidos a este tratamento A radioterapia foi

realizada em apenas um paciente e os outros nove natildeo foram submetidos Este caso

submetido agrave radioterapia tambeacutem havia sido submetido agrave quimioterapia e eacute o caso do

paciente que natildeo foi operado

Com relaccedilatildeo ao estado funcional do membro apoacutes o procedimento ciruacutergico trecircs casos eram

funcionais e dois com limitaccedilatildeo Excluindo os trecircs casos que foram amputados o caso que

natildeo foi operado e um caso de acometimento do toacuterax

A metaacutestase estava presente em quatro pacientes trecircs ao diagnoacutestico e apenas um apoacutes o

diagnoacutestico E seis pacientes natildeo apresentaram metaacutestases O local da metaacutestase foi

pulmonar em trecircs pacientes sendo que em um deles estava acometendo parte oacutessea e

apenas em um paciente a metaacutestase era intra-abdominal

Apenas um paciente apresentou recidiva local apoacutes o tratamento no Hospital de Cacircncer de

Barretos as margens ciruacutergicas na primeira cirurgia realizada estavam livres de neoplasia os

outros nove natildeo apresentaram recidiva apoacutes o tratamento no Hospital

O cacircncer foi a causa de oacutebito de dois casos seis estatildeo vivos sem doenccedila e dois estatildeo vivos

com doenccedila

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

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5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

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14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

22

Figura 6 radiografia panoracircmico de bacia do caso 5 mostrando lesatildeo liacutetica em siacutenfise puacutebica

direita que se estende tanto para o ramo puacutebico superior quanto para o ramo puacutebico

inferior com rotura da cortical e halo de esclerose medular

Figura 7 cintilografia oacutessea do caso 5 apresentando lesatildeo em siacutenfise puacutebica e anel agrave direita

pouco captante com baixa probabilidade de metaacutestase oacutessea

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

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9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

23

A

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

24

Figura 8 tomografia computadorizada de bacia do caso 5 observa-se lesatildeo liacutetica de anel e

halo de esclerose com ruptura da cortical B reconstruccedilatildeo tridimensional da bacia

B

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

25

Figura 9 ressonacircncia magneacutetica de bacia do caso 5 a sequecircncia ponderada em T2 com

saturaccedilatildeo de gordura evidencia lesatildeo expansiva que respeita a superfiacutecie articular da siacutenfise

puacutebica poreacutem rompe as corticais e invade as partes moles

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

26

Figura 10 radiografia poacutes-operatoacuteria do caso 5 mostrando a ressecccedilatildeo da siacutenfise puacutebica e

ramos puacutebicos

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

27

Figura 11 lacircmina da peccedila do material fixado em formol e incluiacutedo em parafina corada com

hematoxilina e eosina (HE) do caso 5 com presenccedila de tecido cartilaginoso maligno com

aumento da celularidade e matriz cartilaginosa irregular aumento de 400X

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

28

Figura12 radiografia de uacutemero do caso 7 mostrando lesatildeo em regiatildeo diafisaacuteria em terccedilo

meacutedio com aspecto em flocos de neve que invade partes moles com limites indefinidos

Este caso era acompanhado na origem com tumoraccedilatildeo benigna (osteocondroma) que sofreu

uma transformaccedilatildeo maligna

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

29

Figura 13 exame fiacutesico do caso 7 mostrando o grande volume da lesatildeo vista na radiografia

figura anterior com circulaccedilatildeo colateral

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

30

Figura 14 tomografia computadorizada de braccedilo caso 7 mostrando lesatildeo de aspecto

vegetante em diaacutefise de uacutemero

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

31

532 Amplificaccedilatildeo do centrossomo

A anaacutelise do centrossomo nas lacircminas submetidas a imuno-histoquiacutemica foi realizada atraveacutes

de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 1000 vezes ( objetiva de 100x em imersatildeo a oacuteleo) Em

todos os casos foi confirmada a presenccedila de tumor com a anaacutelise de lamina corada com

hematoxilina e eosina obtida dos mesmos materiais crio-preservados e observada em

microscoacutepio oacuteptico em aumento de 200 vezes

Conforme descrito nos materiais e meacutetodos dois observadores independentes analisaram

cada amostra e contando as ceacutelulas coradas com a ᵞ-tubulina e verificando a porcentagem

de ceacutelulas acometidas

Os resultados estatildeo apresentados na tabela 5 O analista A encontrou amplificaccedilotildees do

centrossomo que variaram entre 400 e 1900 em meacutedia 1400 jaacute o analista B encontrou

690 a 2200 de amplificaccedilatildeo em meacutedia 1352 de amplificaccedilatildeo

No caso 10 houve divergecircncia em relaccedilatildeo agrave quantidade de ceacutelulas amplificadas o analista A

encontrou 4 e o analista B encontrou 1000 das ceacutelulas com amplificaccedilatildeo o caso foi

revisto em conjunto e conclusivo como amplificado Desta forma todos os casos foram

considerados com amplificaccedilatildeo para centrossomo

Tabela 5 Frequecircncias de amplificaccedilatildeo do centrossomo em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas analisados por dois observadores independentes

Frequecircncia percentual de amplificaccedilatildeo do centrossomo

Caso Analista A Analista B

1 1800 2200

2 2100 2000

3 1390 690

4 930 930

5 1900 2000

6 1700 1300

7 1000 1000

8 1600 1300

9 1400 1100

10 400 1000

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

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Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

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6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

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7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

32

Com relaccedilatildeo agrave formaccedilatildeo de clusters de centrossomo o analista A encontrou de 0 a 3 clusters

por lacircmina analisada em meacutedia 08 clusters jaacute o analista B encontrou entre zero e 6 clusters

em meacutedia 1 cluster (tabela 6)

Tabela 6 Frequecircncias de clusters de centrossomos em tecidos crio-preservados de

condrossarcomas anaacutelise de 2 observadores independentes

Nuacutemero de clusters de centrossomos

Caso Analista A Analista B

1 0 0

2 3 6

3 1 1

4 0 0

5 1 1

6 2 1

7 0 0

8 0 0

9 0 0

10 1 1

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

33

Figura 15 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas as vezes

binucleadas e com ateacute 3 ceacutelulas ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico secundaacuterio a uma

lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico e aumento de 200 vezes

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

34

Figura 16 material crio-preservado do caso 9 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas em lacunas grau I

histoloacutegico secundaacuterio a uma lesatildeo benigna Imagem capturada de microscoacutepio oacuteptico

aumento de 200X

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

35

Figura 17 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (seta preta) Aumento de 1000 X

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

36

Figura 18 material crio-preservado do caso 9 secccedilatildeo submetido a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo gama-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com

marcaccedilatildeo em 2 centrossomos (setas pretas) Aumento de 1000 X

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

37

Figura 19 material crio-preservado do caso 2 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando tecido semelhante agrave cartilagem hialina com ceacutelulas atiacutepicas e vaacuterias ceacutelulas

ocupando uma lacuna grau I histoloacutegico central e primaacuterio do osso Imagem capturada de

microscoacutepio oacuteptico aumento de 200X

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

38

Figura 20 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica em lacuna com marcaccedilatildeo em 3

centrossomos Aumento de 1000 X

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

39

Figura 21 material crio-preservado do caso 2 submetida a protocolo de imuno-histoquimica

com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com os centrossomos em cluster

menor que 6 (circulo preto) Aumento de 1000 X

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

40

Figura 22 material crio-preservado do caso 5 corada com hematoxilina e eosina (HE)

mostrando pequenas ceacutelulas atiacutepicas em lacunas com estroma mixoacuteide e delicada

vasculatura grau I histoloacutegico tipo mixoacuteide primaacuterio Imagem capturada de microscoacutepio

oacuteptico aumento de 200X

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

41

Figura 23 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquimica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 3 centrossomos

(seta preta) Aumento de 1000 X

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

42

Figura 24 material crio-preservado do caso 5 secccedilatildeo submetida a protocolo de imuno-

histoquiacutemica com anticorpo ᵞ-tubulina A imagem mostra ceacutelula atiacutepica com 4 centrossomos

A

B

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

43

A-dois centrossomos vistos no primeiro plano focal B-segundo plano focal com os outros 2

centrossomos Aumento de 1000 X

533 Analise dos dados

Para os 10 casos analisados os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com relaccedilatildeo ao percentual de ceacutelulas amplificadas de caso com 95

de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo de 02205 a 09211 O coeficiente

de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07213 Os dados satildeo mostrados na tabela 7 e

representados pela figura 25

Com relaccedilatildeo ao nuacutemero de clusters os dados foram analisados utilizando o coeficiente de

concordacircncia de Lin e com 95 de confianccedila estima-se que o resultado esteja no intervalo

de 04948 a 08861 O coeficiente de relaccedilatildeo de concordacircncia eacute de 07500 (tabela 8 figura

26)

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

44

Figura 25 Coeficiente de concordacircncia de Lin para a anaacutelise de ceacutelulas amplificadas

Tabela 7 Coeficiente de concordacircncia de Lin para as ceacutelulas amplificadas e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07213

Intervalo de confianccedila de 95 02205 a 09211

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

45

Figura 26 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o nuacutemero de clusters

Tabela 8 Coeficiente de concordacircncia de Lin para o numero de cluster menor que seis e seu intervalo de confianccedila

Tamanho da amostra 10

Coeficiente de correlaccedilatildeo de concordacircncia 07500

Intervalo de confianccedila de 95 04948 a 08861

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

46

6 DISCUSSAtildeO

Os dados deste estudo revelaram que o perfil geneacutetico condrossarcoma apresenta vaacuterias

alteraccedilotildees relacionadas com a amplificaccedilatildeo do centrossomo como se supunha

anteriormente O nosso trabalho aqui descrito aponta interessantes argumentos em favor

da premissa de que a amplificaccedilatildeo do centrossomo seja um evento bioloacutegico criacutetico para

este desenvolvimento de malignidade O estudo das alteraccedilotildees do centrossomo eacute

multifacetado e demorado e exige uma especializaccedilatildeo adequada dos profissionais

envolvidos com os testes para avaliar os resultados em conformidade A implementaccedilatildeo de

culturas primaacuterias de cacircncer oferece diferentes graus de dificuldade e de modo que os

resultados nem sempre satildeo satisfatoacuterios Culturas de sarcomas satildeo ainda mais complexo e

difiacutecil de ser efetivamente implementada Assim o estabelecimento de culturas primaacuterias de

condrossarcoma daacute por si soacute um modelo de trabalho muito promissor As culturas

primaacuterias de condrossarcoma foram preparadas usando as amostras de trecircs casos com

classificaccedilatildeo histopatoloacutegica diferente (grau I e grau III) e um grau III caso de recorrecircncia

condrossarcoma

Em geral os resultados demonstraram que nos casos de culturas primaacuterias coradas com a

teacutecnica imunocitoquiacutemica utilizando o desenvolvimento de fluorescecircncia a avaliaccedilatildeo dos

centrossomos era clara sem qualquer imagem duvidosa Os centrossomos amplificados

foram demonstrados positivos em todos os casos quando comparados com os fibroblastos

normais que demonstraram percentagens de centrossomos amplificados variou entre 15 e

64 Curiosamente ateacute mesmo o condrossarcoma grau I mostrou centrosome ampliado

que pode-se inferir que os centrossomos amplificados podem ser um evento precoce na

transformaccedilatildeo da malignidade Uma amostra de tumor recorrente do mesmo paciente

revelou centrossomos amplificados como anteriormente observado na amostra

condrossarcoma primaacuterio mas com um aumento do nuacutemero de ceacutelulas malignas com mais

do que dois centrossomos Um caso teve uma baixa taxa de amplificaccedilatildeo do centrossomo

mostrando apenas 15 de ceacutelulas com amplificaccedilatildeo Esta natildeo eacute uma surpresa pois a

amplificaccedilatildeo do centrossomo encontrando no osso e tumor de tecidos moles foi observado

em tumores classificados como benignos ou com agressividade local como em tumores de

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

47

ceacutelulas gigantes ou mesmo em tumores oacutesseos malignos tais como o osteossarcoma

[71213]

As anaacutelises dos tecidos crio-preservado mostraram os percentuais de amplificaccedilatildeo que

variaram de 4 a 19 em meacutedia 14 que satildeo menores quando comparados com a cultura

primaacuteria Essa diferenccedila pode ser devido agrave qualidade da amostra e ao fato de a cultura

primaacuteria ser o mais semelhante ao tumor in vivo

A presenccedila de centrossomos amplificados tambeacutem pode ser representada pela formaccedilatildeo de

Clusters mas o mecanismo ainda natildeo eacute completamente compreendido Anormalidades na

organizaccedilatildeo centrossomo estaacute sob investigaccedilatildeo em ambiente oncoloacutegico e os resultados tecircm

sido observados em tanto em amostras in vivo bem como em ceacutelulas cultivadas [12] Neste

estudo dois casos de cultura celular primaacuteria de condrossarcoma mostraram a formaccedilatildeo de

clusters em 15 e 16 das ceacutelulas analisadas enquanto que os fibroblastos normais

demonstraram um maacuteximo de 3 das ceacutelulas com formaccedilatildeo de clusters No entanto

tambeacutem foi observada a reduccedilatildeo do nuacutemero de clusters em um caso das culturas primaacuterias

foram encontradas 5 de ceacutelulas com um cluster e 1 com dois clusters O caso

remanescente mostrou que apenas 8 das ceacutelulas malignas com um cluster Ao se comparar

os resultados das culturas primaacuterias com os resultados do tecido crio-preservado notamos

uma variaccedilatildeo importante na formaccedilatildeo dos clusters Os clusters dos tecidos crio-preservados

foram observados em apenas metade dos casos enquanto que nas culturas primaacuterias todos

os casos apresentaram clusters Nos tecidos crio-preservados as porcentagens de clusters

foram menores que as encontradas na cultura variando entre 1 a 6 das ceacutelulas com

clusters Esta variaccedilatildeo pode estar ocorrendo pela caracteriacutestica da amostra a cultura celular

seria a representaccedilatildeo mais proacutexima do tumor in vivo Outro fato encontrado eacute que os

clusters encontrados no tecido crio-preservado satildeo menores que os da cultura celular

Outro estudo que tambeacutem examinou a formaccedilatildeo de cluster separadamente encontrou em

metade dos casos de tumores de ceacutelulas gigantes com formaccedilatildeo de clusters mas tambeacutem

natildeo conseguiu correlacionar com o comportamento agressivo do tumor [13]

Nosso trabalho falha em deixar de avaliar todas as amostras que selecionamos As

dificuldades teacutecnicas do manuseio nos tecidos crio-preservados As amostras de tecido

foram perdidas durante o processo teacutecnico o que limitou a compreensatildeo da maioria dos

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

48

nossos resultados Dez amostras de tecidos crio-preservados foram totalmente analisadas

para a amplificaccedilatildeo do centrossomo

A amplificaccedilatildeo do centrossomo pode prever o comportamento agressivo de tumores e outro

achado da literatura tem associado agrave alteraccedilatildeo do centrossomo com instabilidade

cromossocircmica em outros tumores oacutesseos como osteossarcoma como antecipada [16]

Nossos resultados endossaram essas premissas e ratificou que a amplificaccedilatildeo do

centrossomo tem sido amplamente encontrada em condrossarcomas provavelmente

representando um importante mecanismo subjacente na geraccedilatildeo de mitoses multipolares

instabilidade cromossocircmica e aneuploidia

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

49

7 CONCLUSAtildeO

A amplificaccedilatildeo do centrossomo foi encontrada em todas as amostras de cultura primaacuteria do

condrossarcoma e em todas as amostras de tecido crio-preservado

A amplificaccedilatildeo do centrossomo apresentou taxas maiores nas culturas primaacuterias em relaccedilatildeo

agraves amostras de tecido crio-preservado

As culturas primaacuterias todas apresentaram formaccedilatildeo de clusters E em cinco casos (metade

dos casos) houve a formaccedilatildeo de clusters nos tecidos crio-preservados

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

50

REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

1 Flechter CDM Unni KK Mertens F Pathology and Genetics of Tumors of Soft Tissue and Bone in world Health Classification of Tumors WHO I Press Editor 2002 Lion

2 Proacutepero D Neoplasias Produtoras de Tecido Cartilaginoso in Tumores Oacutesseos 2001 ROCA Satildeo Paulo Brasil p 45-91

3 Jamil N Howie S Salter DM Therapeutic Molecular Target in Human Chondrosarcoma international Journal of Experimental Pathology 2010 91 p 387-393

4 Heck KHJ Tumores Malignos do Osso In_Cirurgia Ortopeacutedica de Campbell 2006 1 p 827-858

5 Chow WA Update on chondrosarcoma Current Opion oncology 2007 19(4) p 371-376

6 Onishi AC Hincker AM Lee FY Surmounting Chemoterapy and Radioresistance in Chondrosarcoma Molecular and Therapeutic Targets Sarcoma 2010 2011

7 Parsh D Parsh U Brassat T Brummendorf H and Fellenberg J Consequences of telomerase inhibiton by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines cancer investigation 2008 26(6) p 590-596

8 Peyrode C Weber V David E et al Quaternary ammonium-melphalan conjugate for anticancer therapy of chondrosarcomain vitro and in vivo preclinical studies invest new drugs 2011

9 David E Guihard P Brounais BE Direct anti-cancer effect of oncostaton M on chondrosarcoma International Journal of Cancer 2011(128) p 1822-1835

10 Fukasawa K Aberrant Activation of Cell Cycle Regulators Centrosome Amplification and Mitotic Defects Horm cancer 2011 2 p 104-112

11 Godinho SA Kwon M Pellman D Centrossome and cancer how cancer cells divide with too many centrossomes Cancer Metatasis Rev 2009 28 p 85-98

12 Chan JY A Clinical Overview of Centrosome Amplification in Human Cancers International Journal of Biological Science 2011 7(9) p 1122-1144

13 Yamamoto Y Matsuyama H Furuya T Centrossome Hyperamplification Predicts Progression and Tumor Recurrence in Bladder Cancer Clin Cancer Res 2004 10 p 6449-6455

14 Yamamoto Y Misumi T Eguchi S Centrossome amplification as a putative prognostic biomarker for the classification of urothelial carcinomas Human Pathology 2011(42) p 1923-1930

15 Ghadimi MB Sackett DL Difilippantonio MJ Schrock e Neumann T Jauho A Auer G Ried T Centrosome Amplification and Instability Occurs Exclusively in Aneuploid But Not inDiploid Colorectal Cancer Cell Lines and Correlates With Numerical Chromosomal Aberrations GenesChromosomes amp Cancer 200027p183-190

16 Al-Romaih K Bayani J Vorobyova J Karaskova J Park P C Zielenska M Squire J A Chromosomal instability in osteosarcoma and its association with centrossome abnormalities cancer genetics and cytogenetics 2003(144) p 91-99

17 Gisselsson D Palsson E Yu C Mertens F Mandahl N Mitotic instability associated with late genomic changes in bone and soft tissue tumors Cancer Letters 2004 206 p 69-76

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

51

18 Perucca-Lostanlen D Rostagno P Grosgeorge J Marcie S Gaudray P Turccarrel C Distinct MDM2 and PI4ARF Expression and Centrossome Amplification in Well-Differentiated Liposarcomas Genes Chrom Canc 2004 39 p 99-109

19 Gong Y Sun Y Mcnutt MA et al Location of TEIF in the centrossome and its functional association with centrossome amplification in DNA damage telomere dysfunction and human cancer Oncogene 2009 28 p 1549-1560

20 Moskovszky L Dezso K Athanasou N Szendroi M Kopper L Kliskey K Picci P Sapi ZCentrossome abnormalities in giant cell tumour of bone possible association with chromosomal instability Modern Pathology 2010(23) p 359-366

21 Harrison M K Adon A Saavedra HI The G1 phase Cdks regulate the centrosome cycle and mediate oncogene-dependent centrosome amplification Cell Division 2011

22 Anderhub SJ et al Centrosome amplification in tumorigenesis Cancer Letters 2012 23 Harrison RG Fuether experiments on the development of peripheral nerves Amer J

Anat 1906 5 p 121-131 24 Carrel A Burrow MT Cultvation of Tissue in Vitro and its Technique Journal of

Experimental Medicine 1911 13 p 387-396 25 Parker RC Methods os Tissue Culture 3 ed 1961 New York Hoeber-Harper 26 Alberts B Jonhnson A Lewis J Raff M Roberts K Walter P Manipuling Proteins

DNA and RNA in Molecular Biology of Cell 2010 Gardland Science New York 27 Rous P Jones FS A METHOD FOR OBTAINING SUSPENSIONS OF LIVING CELLS FROM

THE FIXED TISSUES AND FOR THE PLATING OUT INDIVIDUAL CELLS J Exp Med 1916 23(4) p 549-555

28 Sanford KK Earle WR Likely GD The growth in vitro of single isolated tissue cell J Nat Cancer Inst 1948 9 p 229-246

29 Monderer D LA Bellec A David E Ponsolle S Saiagh S Bercegeay S Piloquet P Denis MG Lodeacute L Reacutedini F Biger M Heymann D Heymann M-F Bot RL Gouin F and Blanchard F New chondrossarcoma cell lines and mouse models to study the link between chondrogenesis and chemoresistence Laboratory Investigation 2013 00 00 2013 p 1-15

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

52

ANEXOS

Anexo1

FICHA DE RESULTADO DE ANALISE DO CENTROSSOMO ndash Projeto Condrossarcoma RH caso______________________________________ Analista______________________________________ Data______ teste________________________

Nuacutemero de ceacutelulas

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Total 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

__ de ceacutelulas normais __ de ceacutelulas amplificadas _______________numero de clusters menor que 6 sinais _______________numero de clusters maior que 6 sinais Resultado __normal __amplificado

53

Anexo2

FICHA DE COLETA DE DADOS ndash Projeto Condrossarcoma

1 Identificaccedilatildeo 1 2 Nome 2 3 Registro hospitalar 3 4 Data de nascimento

DDMMAAAA 4

5 Sexo 1-Masculino 2-Feminino 99-Ignorado

5

6 Data do Diagnostico no HCB DDMMAAAA

6

7 Estado procedecircncia 7 8 Estado Civil

1- Solteiro 2- Casado Uniatildeo estaacutevel 3- Divorciado Separado 4- Viuacutevo 99- Ignorado

8

9 Cor 1- Branca 2- Negra 3- Parda 4- Amarela 99- ignorado

9

10 Escolaridade 1- Analfabeto 2- Fundamental incompleto 3- Fundamental

completo 4- Meacutedio incompleto 5- Meacutedio completo 6- Superior incompleto 7- Superior

completo 99- Ignorado

10

11 Diagnostico anterior ao HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado

11

12 Cirurgia anterior ao diagnostico no HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica

12

13 Cirurgia anterior com recidiva local ao diagnostico no HCB

0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica

13

14 Metaacutestase 0-Natildeo 1-Sim ao diagnostico 2-Sim poacutes diagnostico 99-

Ignorado

14

15 Local Metaacutestase 1-Osso 2-Partes Moles 3-Intra-abdominal 4-Intratoraacutecica

5-Outros _________ 99-Ignorado 88-Natildeo se aplica

15

16 Data de diagnostico da Metaacutestase DDMMAAAA

16

17 Data da Cirurgia no HCB DDMMAAAA

17

18 Tipo de Cirurgia do HCB 1-Ressecccedilatildeo Simples 2-Ressecccedilatildeo+Proacutetese 3-Amputaccedilatildeo 99-

Ignorado

18

19 Quimioterapia

0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado

19

20 Radioterapia 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado

20

21 Recidiva poacutes-tratamento HCB 0-Natildeo 1-Sim 99-Ignorado

21

22 Data de recidiva

DDMMAAAA

22

23 Anatomopatoloacutegico 1-Grau I 2-Grau II 3-Grau III 99-Ignorado

23

24 Tipo Histoloacutegico

1-Central 2-Mesenquimal 3-Desdiferenciado 4-Ceacutelulas Claras 99-Ignorado

24

54

25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado

25

26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado

26

27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-

Ignorado

27

28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila

3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado

28

29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA

29

55

Anexo 3

56

Anexo 4

57

58

54

25 Origem patoloacutegica 1-Primaacuterio 2-Secundaacuterio 99-Ignorado

25

26 Localizaccedilatildeo tumoral 1-MMSS 2-MMII 3-Bacia 4-Cintura Escapular 99-Ignorado

26

27 Estado Funcional atual do Membro 1-Funcional 2-Com Limitaccedilatildeo 3-Natildeo funcional 4-Amputado 99-

Ignorado

27

28 Ultima Informaccedilatildeo 1- Vivo sem doenccedila 2- Vivo com doenccedila

3- Oacutebito por CA 4- Oacutebito por outra causa 99- Ignorado

28

29 Data da Ultima Informaccedilatildeo DDMMAAAA

29

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Anexo 3

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Anexo 4

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55

Anexo 3

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Anexo 4

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Anexo 4

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