CARINA CALIXTO JANK

Papel de células com função reguladora da resposta imune na endometriose

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção de Título de Mestre em Ciências.

São Paulo 2014

Carina Calixto Jank

Papel de células com função reguladora da resposta imune na endometriose

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção de Título de Mestre em Ciências.

Área de concentração: Imunologia Orientador: Dr. Luiz Vicente Rizzo Versão original

São Paulo 2014

DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP) Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do

Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo

© reprodução total

Jank, Carina Calixto. Papel de células com função reguladora da resposta imune na endometriose / Carina Calixto Jank. -- São Paulo, 2014. Orientador: Prof. Dr. Luiz Vicente Rizzo. Dissertação (Mestrado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Departamento de Imunologia. Área de concentração: Imunologia. Linha de pesquisa: Imunologia da endometriose. Versão do título para o inglês: Role of cells with regulatory function of the immune response in endometriosis. 1. Endometriose 2. Resposta imune 3. Célula T reguladora 4. Célula natural killer 5. Célula supressora mielóide 6. Célula dendrítica I. Rizzo, Prof. Dr. Luiz Vicente II. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomedicas III. Título.

ICB/SBIB054/2014

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS

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Candidato(a): Carina Calixto Jank.

Título da Dissertação: Papel de células com função reguladora da resposta imune na endometriose.

Orientador(a): Prof. Dr. Luiz Vicente Rizzo.

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertação de Mestrado,

em sessão pública realizada a .............../................./................., considerou

( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)

Examinador(a): Assinatura: ............................................................................................ Nome: ................................................................................................... Instituição: .............................................................................................

Examinador(a): Assinatura: ............................................................................................ Nome: ................................................................................................... Instituição: .............................................................................................

Presidente: Assinatura: ............................................................................................ Nome: .................................................................................................. Instituição: .............................................................................................

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

À minha família, de sangue e de escolha. 

  

AGRADECIMENTOS 

 

"Quem caminha  sozinho pode até chegar mais  rápido, mas aquele que vai acompanhado, com certeza vai mais longe." 

Gostaria  de  agradecer  primeiramente  a meus  pais,  por  terem  sempre me  incentivado  a seguir meus  sonhos,  e  aos meus  irmãos,  a melhor  família  que  eu  poderia  pedir.  Amor incondicional,  apoio  inquestionável.  Tudo  em  minha  vida  é  reflexo  do  que  vocês  me ensinaram. Agradeço também à minha avó, a Dona Dolly, que permitiu que eu invadisse sua vida ao longo desses anos, e facilitou todo o processo o máximo possível.  

 Ao meu  noivo, Danillo. Não  é  qualquer  um  que  estaria  disposto  a morar  a mais  de mil quilômetros de distância da namorada por três anos. Colocar o sonho de outra pessoa acima de  sua  própria  felicidade  é  algo  que  só  quem  ama  de  verdade  sabe  fazer.  Sem  o  seu incentivo, nada disso seria possível. Só você sabe realmente o quanto esse período foi difícil. Era  para  você  que  eu  ligava  quando  nada mais  fazia  sentido.  Longe  da minha  zona  de conforto,  o  crescimento  pessoal  e  profissional  é  inegável. Mas,  com  toda  escolha,  temos renúncias. Jamais achei que seria tão difícil, mas estou extremamente feliz por ter passado por  tudo  que  passei.  E mais  feliz  ainda  por  ter  tido  seu  apoio  incondicional  ao  longo  do caminho. 

Aos queridos amigos, os de longe e os de perto, os antigos e os novos. 

Ao  Professor  Luiz Vicente Rizzo, meu  orientador, muito  obrigada  pelo  voto  de  confiança. Quando me apaixonei pela Imunologia, ainda na faculdade em Campo Grande, pesquisei os principais orientadores e  linhas de pesquisa que eu gostaria de trabalhar. O senhor  foi um dos únicos a me responder, e com certeza o mais simpático. Admiro muito a sua inteligência e ética profissional e sou extremamente grata pela oportunidade de ter trabalhado contigo.  

À querida amiga, Eliana Marengo, um anjo em minha vida. Sua ajuda foi imprescindível para a execução desse trabalho. Você é extremamente eficiente e competente, e aprendi  lições que  levarei para  sempre. Te  admiro muito!   Espero que  se  algum dia eu  tiver  alunos, eu possa ser como você, sempre tão dedicada e disposta a ajudar. 

Ao “grupo do Rizzo”, amigos que tive o privilégio de conhecer. Andressa, Pedro, Karina, Luiz e agora Ana Eduarda, com certeza o melhor grupo de pesquisa que já trabalhei. Mais do que colegas, verdadeiros amigos, que respeito e tenho um carinho muito grande. Obrigada pelas discussões  imunológicas  e  não‐imunológicas.  O  mestrado  foi  muito  mais  divertido  com vocês. Sentirei falta do contato diário!  

Um obrigada especial à Dra Karina Salmazi, um exemplo de profissional e uma pessoa muito querida. Adorei a oportunidade de  ter  trabalhado com você. Muito obrigada por  todas as dúvidas tiradas e as risadas diárias. Para mim, você é um exemplo de como cientistas devem ser;  sempre  ansiosa  a  aprender  coisas  novas,  independente  do  título  ou  posição. Mais 

  importante ainda, sempre disposta a ensinar e compartilhar o que aprendeu. Apenas assim a ciência evolui. 

Aos  demais  colegas  do  Instituto  de  Ensino  e  Pesquisa  do Hospital  Albert  Einstein. Muito obrigada  por  terem  alegrado  o meu  dia‐a‐dia  durante  todo  esse  tempo.  Obrigada  pelos cafezinhos no meio da  tarde, os bolos e  lanches diários, as risadas e palavras de conforto. Vocês são demais! 

Muito obrigada aos professores do Departamento de  Imunologia pelos ensinamentos. Ser professor é um verdadeiro dom. São pessoas como vocês, que dedicam a vida para ensinar jovens  alunos  a  acreditarem  em  si mesmos  e  superarem  suas  dificuldades,  que  instigam curiosidade e vontade de buscar sempre mais. Só assim o avanço da humanidade torna‐se possível. 

Agradeço  também  aos  novos  amigos  do  Instituto  de  Ciências  Biomédicas  que  tive  a oportunidade de conhecer. Um obrigada especial à Bianca e à Karina, amizades verdadeiras que levarei por toda a vida. Nem consigo começar a descrever o carinho que sinto por vocês. Muito obrigada por tudo.  

Muito obrigada aos membros da banca de qualificação pelas  sugestões para o  trabalho e para os membros da banca de defesa por terem aceitado o convite. 

Obrigada  à  Fundação de Apoio  à Pesquisa do  Estado de  São Paulo,  a  Fapesp, pelo  apoio financeiro. 

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

“Estamos  na  situação  de  uma  criancinha  que  entra  em  uma  imensa biblioteca,  repleta  de  livros  em muitas  línguas.  A  criança  sabe  que alguém  deve  ter  escrito  aqueles  livros,  mas  não  sabe  como.  Não compreende  as  línguas  em  que  foram  escritos.  Tem  uma  pálida suspeita  de  que  a  disposição  dos  livros  obedece  a  uma  ordem misteriosa, mas não sabe qual ela é.”  

Albert Einstein 

  

RESUMO 

 Jank  CC.  Papel  de  células  com  função  reguladora  da  resposta  imune  na  endometriose. [dissertação  (Mestrado  em  Imunologia)].  São  Paulo:  Instituto  de  Ciências  Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2014.  

A  endometriose  (EDT)  é  uma  doença  crônica  que  afeta mulheres  em  idade  reprodutiva, caracterizada  pela  presença  de  tecido  endometrial  ectópico  (fora  da  cavidade  uterina). A origem da doença é desconhecida, entretanto, presume‐se que a EDT é multifatorial. Várias alterações  na  função  do  sistema  imune  foram  reportadas  em  pacientes  com  EDT. Postulamos que alterações na frequência de células T reguladoras (Treg), natural killer (NK), supressoras mieloides  (MDSC)  e  dendríticas  (DC)  no  peritônio  justificariam  a  redução  na capacidade  do  sistema  imune  de  reagir  contra  as  células  endometriais,  permitindo  sua implantação e permanência em  locais ectópicos. O objetivo deste estudo  foi quantificar as células Treg, NK, MDSC e DC no fluido peritoneal (FP) e sangue de mulheres com EDT (n=19) e controles  (CTRL,  n=8),  a  fim  de  associa‐las  ao  desenvolvimento  da  doença.  Os  níveis  de citocinas pró e anti‐inflamatórias também foram avaliados. Os resultados mostram aumento na frequência de Treg, MDSC e DC no sangue e aparente redução destas no FP de pacientes com EDT, comparadas com CTRL. No FP, a população de DC CD11b+ está aumentada, e há tendência  à  diminuição  de  DC  CD11b‐  dessas  pacientes.  Quanto  à  analise  de  citocinas, observou‐se apenas diferença entre os grupos para a citocina IL‐12, a qual está reduzida no sangue de pacientes do grupo EDT comparadas com CTRL. Não foram observadas diferenças quanto  às  células NK e  as outras  citocinas  analisadas. Os  resultados  indicam  aumento da frequência de populações reguladoras em amostras de sangue de pacientes EDT, entretanto esses resultados não são refletidos no FP.   

Palavras‐chave: Endometriose. Resposta imune. Células T reguladoras. Células natural killer. Células supressoras mieloides. Células dendríticas. 

  

ABSTRACT  

Jank  CC.  Role  of  cells with  regulatory  function  of  the  immune  system  in  endometriosis. [Masters thesis (Immunology)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 2014. 

Endometriosis (EDT) is a gynecological disease characterized by the presence of endometrial cells out of  the uterine  cavity.  Its  origin  is unknown,  although  it  is  thought  that  EDT  is  a multifactorial disease. Functional alterations in immune cells in patients with EDT have been described.  In  this  study, we postulated  that  alterations  in  the  frequencies of  regulatory T cells  (Treg), natural killer  cells  (NK), myeloid‐derived  suppressor  cells  (MDSC) and dendritic cells  (DC)  in  the peritoneum  could  justify  the  reduced  capacity of  the  immune  system  to react  to  these ectopic endometrial cells, allowing  them  to  invade distant  tissues. Our aim was to quantify Treg, NK, MDSC and DC populations in the peritoneal fluid (PF) and peripheral blood  (PB)  in women with endometriosis  (EDT, n=19) and  control  (CTRL, n=8),  in order  to associate  these  cellular  population  to  the  development  of  the  disease.  Pro  and  anti‐inflammatory cytokine  levels were also assessed. The results  indicate higher frequencies of Treg, MDSC and DC in the PB and an apparent reduction in the frequency of these cells in the PF of patients with EDT, compared to CTRL. In the PF, the CD11b+ DC population is increased, and there seems to be a tendency to reduction of the CD11b‐ portion of DC in these patients. The cytokine analysis  indicated a  reduction  in  the concentration of  IL‐12  in PB of patients with EDT. No differences were  found comparing the results of NK cell populations and the other cytokines evaluated between EDT and CTRL groups. The results indicate an increase in the  frequency  of  regulatory  cell  populations  in  PB  samples  from  EDT  patients;  however, these results are not reflected in PF samples. 

Keywords: Endometriosis. Immune response. Regulatory T cells. Natural killer cells. Myeloid‐derived suppressor cells. Dendritic cells. 

  

LISTA DE FIGURAS 

 

Figura 1 ‐ Estratégia de análise de células T reguladoras (Treg)............................................... 39  

Figura 2 ‐ Frequência de células T CD4+ ativadas em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes com endometriose e controles .................................................................. 41 

Figura 3  ‐ Frequência de células T CD4+CD25high em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes com endometriose e controles .................................................................. 42 

Figura  4  ‐  Frequência  de  células  T  reguladoras  (Treg)  em  amostras  de  sangue  e  fluido peritoneal (FP) de pacientes com endometriose e controles ................................................ 43 

Figura  5  ‐  Frequência  de  células  T  reguladoras  (Treg)  em  amostras  de  sangue  e  fluido peritoneal (FP) de pacientes com endometriose e controles ................................................ 44 

Figura 6 ‐ Razão entre a frequência de células T reguladoras (Treg) em amostras de sangue e a frequência  dessas  em  fluido  peritoneal  (FP)  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com endometriose (EDT, n=19), divididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12 )..............................44 

Figura 7 ‐ Intensidade de fluorescência média (MFI) do fator de transcrição Foxp3 em células Treg  de  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  e controles ................................................................................................................................ 45 

Figura 8 ‐ Estratégia de análise de populações de células natural killer (NK)..........................46 

Figura  9  ‐  Frequência  de  células  Natural  killer  (NK)  CD56brightCD16‐,  CD56brightCD16+  e CD56lowCD16+  em  amostras  de  sangue  (A)  e  fluido  peritoneal  (B)  de  pacientes  com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) ............................................................... 48  

Figura  10  ‐  Comparação  da  frequência  de  células  Natural  killer  (NK)  CD56brightCD16‐  (A), CD56brightCD16+ (B) ou CD56lowCD16+ (C) entre amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) .......................................49 

Figura  11  ‐  Frequência  de  células  Natural  killer  (NK)  CD56brightCD16‐,  CD56brightCD16+  e CD56lowCD16+ positivas para os marcadores CD57 e CD161 em amostras de sangue (A e B) e fluido  peritoneal  (C  e D)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL, n=8)......................................................................................................................................... 50 

Figura 12 ‐ Comparação da frequência de células Natural killer (NK) CD56brightCD16‐ (A e B), CD56brightCD16+ (C e D) e CD56lowCD16+ (E e F) positivas para os marcadores CD57 e CD161 entre  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) ................................................................................................ 51 

Figura 13 – Estratégia de análise de células supressoras mieloides (MDSC) ......................... 53 

  Figura  14  ‐  Frequência  de  células  supressoras  mieloides  (MDSC)  CD11b+CD33+  (A)  e CD11b+CD33+CD34+    (B)  em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  de  pacientes  com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) ............................................................... 54 

Figura  15  ‐  Frequência  de  células  supressoras  mieloides  (MDSC)  CD11b+CD33+  e CD11b+CD33+CD34+  em amostras de sangue (A e B) e fluido peritoneal (C e D) de pacientes com  endometriose  subagrupados  em  estágio  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12)  e  controles  (CTRL, n=8)......................................................................................................................................... 55 

Figura  16  ‐  Comparação  da  frequência  de  células  supressoras  mieloides  (MDSC) CD11b+CD33+ (A) e CD11b+CD33+CD34+ (B) entre amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes com endometriose (EDT, n=19), divididas em estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12), e controles (CTRL, n=8) ............................................................................................................. 56 

Figura 17 ‐ Estratégia de análise para avaliação de células dendríticas (DC) ........................ 57 

Figura 18 ‐ Frequência de células dendríticas (DC) em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes com endometriose (EDT, n=19), subagrupadas em estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12), comparadas com controles (CTRL, n=8) .................................................................... 59 

Figura 19 ‐ Frequência de células dendríticas CD33+ (mDC) em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes com endometriose (EDT, n=19), subagrupadas em estágios  I/II (n=7) e III/IV (n=12), comparadas com controles (CTRL, n=8) ................................................ 60 

Figura 20 ‐ Distribuição de células CD11b+ e CD11b‐ em células dendríticas CD33+ do sangue e fluido peritoneal (FP) das pacientes incluídas nesse estudo .................................................. 61 

Figura 21  ‐ Frequência de células dendríticas (DC) CD33+ CD11b+ e CD11b‐ em amostras de sangue e  fluido peritoneal  (FP) de pacientes com endometriose  (EDT, n=19), subagrupadas em estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12), comparadas com controles (CTRL, n=8) ...................... 62 

Figura  22  ‐  Concentração  de  IL‐6,  TGF‐b  e  IL‐12  no  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de pacientes  com  endometriose  (EDT),  subagrupadas  em  estágios  I/II  e  III/IV,  e  controles (CTRL)...................................................................................................................................... 65 

Figura  23  ‐  Comparação  entre  a  concentração  de  TGF‐β  (A)  e  IL‐12  (B)  em  amostras  de sangue  e  fluido peritoneal  (FP) de  controles  (CTRL)  e pacientes  com endometriose  (EDT), subagrupadas em estágios I/II e III/IV .................................................................................... 66 

Figura A1 ‐ Frequência de células CD45+ em amostras de sangue (A) e fluido peritoneal (FP) (B) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) ............................. 88 

Figura  A2  –  Comparação  entre  a  frequência  de  células  CD45+  em  amostras  de  sangue  e fluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL, n=8)......................................................................................................................................... 89  

  Figura A3 ‐ Frequência de células CD3+ em amostras de sangue (A) e fluido peritoneal (FP) (B) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) ............................. 89 

Figura A4 ‐ Comparação entre a frequência de células CD3+ em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes com endometriose (EDT, n=18/19) e controles (CTRL, n=7)......89 

Figura A5 ‐ Frequência de células CD4+ em amostras de sangue (A) e fluido peritoneal (FP) (B) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) ............................. 90 

Figura A6 ‐ Comparação entre a frequência de células CD4+ em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) .......... 90 

Figura A7 ‐ Frequência de células CD4+ em LT de amostras de sangue (A) e fluido peritoneal (FP) (B) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8) ...................... 90 

Figura A8 ‐ Comparação entre a frequência de células CD4+ em LT de amostras de sangue e fluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL, n=8)......................................................................................................................................... 91 

Figura A9 ‐ Frequência de populações de células Natural killer (NK) em amostras de sangue e fluido peritoneal  (FP) de controles  (CTRL, n=8) e pacientes com endometriose  (EDT, n=19), subdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12) ................................................................... 93 

Figura A10 ‐ Frequência de populações de células Natural killer (NK) positivas para CD57 em amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com endometriose (EDT, n=19), subdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12) ....................... 94 

Figura A11  ‐ Frequência de populações de células Natural killer  (NK) positivas para CD161 em amostras de  sangue e  fluido peritoneal  (FP) de controles  (CTRL, n=8) e pacientes com endometriose (EDT, n=19), subdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12) ....................... 95 

Figura  A12  –  Razão  entre  a  frequência  de  células  Natural  killer  (NK)  CD56brightCD16‐  (A), CD56brightCD16+  (B) e CD56lowCD16+  (C) no  fluido peritoneal  (FP) e  frequência de células no sangue de controles (CTRL, n=8) e pacientes com endometriose (EDT, n=19), subdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12) .............................................................................................. 97 

Figura A13 ‐ Razão entre a frequência de células Natural killer (NK) CD56brightCD16‐CD57+ (A), CD56brightCD16+ CD57+ (B) e CD56lowCD16+ CD57+ (C) no fluido peritoneal (FP) e frequência de células  no  sangue  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19), subdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12) ................................................................... 98 

Figura A14  ‐ Razão entre a  frequência de células Natural killer  (NK) CD56brightCD16‐CD161+ 

(A),  CD56brightCD16+  CD161+  (B)  e  CD56lowCD16+  CD161+  (C)  no  fluido  peritoneal  (FP)  e frequência  de  células  no  sangue  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose (EDT, n=19), subdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12) ............................................... 99 

  

LISTA DE TABELAS 

 Tabela 1 – Painel de anticorpos utilizados para caracterização das populações celulares de interesse Treg, NK e MDSC e DC .............................................................................................. 34 

Tabela  2  ‐  Comparação  entre  as  frequências  das  populações  de  linfócitos  estudadas  no sangue de pacientes com endometriose e controles ............................................................. 40 

Tabela  3  ‐  Comparação  entre  as  frequências  das  populações  de  linfócitos  estudadas  no fluido peritoneal de pacientes com endometriose e controles ............................................. 40 

Tabela  4  ‐  Comparação  entre  as  frequências  das  populações  de  células NK  estudadas  no sangue de pacientes com endometriose e controles ............................................................. 47 

Tabela  5  ‐  Comparação  entre  as  frequências  das  populações  de  células NK  estudadas  no fluido peritoneal de pacientes com endometriose e controles ............................................. 47 

Tabela 6  ‐  Frequências de  células  supressoras mieloides no  sangue e  fluido peritoneal de pacientes com endometriose e controles .............................................................................. 54 

Tabela 7 ‐ Comparação da frequência de células dendríticas no sangue e fluido peritoneal de pacientes com endometriose e controles .............................................................................. 58 

Tabela  8  ‐  Avaliação  de  citocinas  no  sangue  e  fluido  peritoneal  de  pacientes  com endometriose, divididas em estágios I/II e III/IV, e controles ................................................ 63 

Tabela  A1  –  Características  clínicas  das  pacientes  com  endometriose  incluídas  no estudo..................................................................................................................................... 86 

Tabela A2 – Local das lesões nas pacientes com endometriose incluídas nesse estudo........ 87 

Tabela A3 ‐ Frequências de populações de linfócitos estudadas no sangue de pacientes com endometriose estágios I/II e III/IV .......................................................................................... 88 

Tabela  A4  ‐  Frequência  de  populações  de  linfócitos  estudadas  no  fluido  peritoneal  de pacientes  com  endometriose  estágios  I/II  e III/IV......................................................................................................................................... 88 

Tabela A5  ‐ Comparação entre  a  razão de  células  Treg encontradas no  FP pela  frequência destas no sangue de pacientes com endometriose e controles..............................................91 

  Tabela A6 – Razão entre a  frequência de  linfócitos T  reguladores em amostras de FP pela frequência de células no sangue de pacientes com endometriose estágios I/II e III/IV .........91 

Tabela  A7  ‐  Frequências  de  populações  de  células  NK  no  sangue  de  pacientes  com endometriose I/II e III/IV ........................................................................................................ 92 

Tabela A8 ‐ Frequências de populações de células NK no fluido peritoneal de pacientes com endometriose I/II e III/IV ........................................................................................................ 92 

Tabela A9  ‐  Comparação  entre  a  razão  de  células NK  encontradas  no  FP  pela  frequência destas no sangue de pacientes com endometriose e controles ............................................ 96 

Tabela A10 ‐ Razão entre a frequência de populações de células NK em amostras de FP pela frequência de células no sangue de pacientes com endometriose estágios I/II e III/IV......... 96 

Tabela A11 ‐ Frequências de células supressoras mieloides no sangue e fluido peritoneal de pacientes com endometriose I/II e III/IV ................................................................................ 99 

Tabela A12  ‐ Frequências de células dendríticas no sangue e fluido peritoneal de pacientes com endometriose estágios I/II e III/IV ................................................................................ 100 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS 

 

Ang‐2 – angiopoietina 2 

APC – aloficocianina 

APC – célula apresentadora de antígeno 

APC‐H7 ‐ aloficocianina H7 

ARG1 – arginase 1 

ASRM – Sociedade Americana para Medicina Reprodutiva 

BD – Becton Dickison 

CA‐125 – antígeno associado ao câncer 125 

CAAE – certificado de apresentação para apreciação ética 

CAPPesq ‐ Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa  

CBA – cytometric bead array 

CCR7 – receptor de quimiocina do tipo C‐C 

CD – cluster of differentiation  ‐ agrupamento de diferenciação 

CTLA‐4 – antígeno 4 de linfócito T citotóxico 

CTRL – controle 

DC‐ célula dendrítica 

dNK – natural killer decidual 

DP – desvio padrão 

EDT – endometriose 

ELISA – ensaio imunossorvente ligado à enzima 

FACS – citometria de fluxo 

FITC ‐ isotiocianato de fluoresceína 

FMUSP – Faculdade de Medicina da USP 

Foxp3 ‐ forkhead box factor p3 

FP – fluido peritoneal 

G‐CSF – fator estimulador de colônia de granulócitos 

HLA‐DR – antígeno leucocitário humano 

HRP – horseradish peroxidase 

IFN‐γ – interferon gamma 

IL – interleucina 

iNOS – óxido nítrico sintase induzido 

  IQR – intervalo interquartil 

LB – linfócito B 

LC – célula de Langerhans 

LT – linfócito T 

mDC – célula dendrítica mieloide 

MDSC – célula supressora mieloide 

MFI – intensidade de fluorescência média 

µg/mL – microgramas por mililitro 

MMP – metaloproteinase de matriz 

mRNA – ácido ribonucleico mensageiro 

N ‐ número 

NK – natural killer 

NKT – natural killer T 

NO – óxido nítrico 

PBS – tampão fosfato‐salina 

pDC – célula dendrítica plasmocitoide 

PE – ficoeritrina 

PE –Cy7 ‐ ficoeritrina conjugado com cianina 7 

PE‐CF594 ‐ ficoeritrina conjugada com CF594 

PerCP‐ Cy 5.5 ‐ peridinina de clorofila combinada com cianina 

pg/mL – picogramas por mililitro 

PlGF – fator de crescimento plaquetário 

ROS – espécie reativa de oxigênio 

RT‐PCR – PCR em tempo real 

TGF‐β – Fator transformador de crescimento β 

Th – linfócito T auxiliar 

TMB – tetrametilbenzidina 

TNF‐α – fator de necrose tumoral α 

Tr1 – célula reguladora do tipo 1 

Treg – célula T reguladora 

uNK – natural killer uterina 

USTV – ultrassonografia transvaginal 

VEGF – fator de crescimento vascular endotelial  

  

SUMÁRIO  

1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 22 1.1 Patogênese ...................................................................................................................... 22 1.2 Endometriose e o Sistema Imunológico ......................................................................... 23 1.2.1 Células T reguladoras ................................................................................................ 25 1.2.2 Células Natural Killer (NK) ......................................................................................... 26 1.2.3 Células supressoras mieloides ................................................................................... 28 1.2.4 Células denríticas ....................................................................................................... 29 2 OBJETIVOS ........................................................................................................................... 31  3 PACIENTES, MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 32 3.1  Pacientes ......................................................................................................................... 32 3.2  Obtenção e separação de células ................................................................................... 33 3.3  Análise dos marcadores de superfície celular por citometria de fluxo.......................... 33 3.4  Marcação intracelular de Foxp3 de células T reguladoras............................................. 343.5  Quantificação de citocinas no plasma e fluido peritoneal............................................. 35 3.6  Análises comparativas entre os grupos.......................................................................... 364 RESULTAOS ......................................................................................................................... 374.1  Dados das Pacientes ....................................................................................................... 37 4.2  Avaliação de células T reguladoras ................................................................................ 38 4.2.1 Análise descritiva das células CD45+, CD3+ e CD4+ no sangue e FP ............................. 40 4.2.2 Análise da população de Treg dentre os LT totais e LT auxiliares no sangue e FP ....... 42 4.3  Células Natural Killer ...................................................................................................... 45 4.4  Células Supressoras Mieloides (MDSC) .......................................................................... 524.5  Análise do perfil de células dendríticas .......................................................................... 56 4.6  Quantificação de citocinas pró e anti‐inflamatórias ...................................................... 635 DISCUSSÃO .......................................................................................................................... 67 6 CONCLUSÕES ....................................................................................................................... 79  REFERÊNCIAS ......................................................................................................................... 80 APÊNDICE – Tabelas e figuras suplementares ....................................................................... 86  

 

22  

1 INTRODUÇÃO 

 

O termo endometriose (EDT) refere‐se à doença crônica estabelecida pela presença 

de células endometriais fora da cavidade uterina. As células endometriais podem implantar‐

se em órgãos peritoneais (caracterizando a forma superficial/peritoneal da doença), ovários 

(definida  como endometriose ovariana) ou  infiltrarem a área  retrocervical, parede vaginal 

posterior,  ureter,  região  retossigmóide  e  bexiga  (endometriose  profunda)  (1,  2).  É  uma 

doença ginecológica benigna, estrógeno‐dependente, associada à dor pélvica e infertilidade. 

Diferentes  sintomas  são  indicativos  de  endometriose,  porém  nenhum  deles  é 

exclusivo  da  doença.  Os  pacientes  podem  ser  assintomáticos  (2,6%)  ou  apresentarem 

sintomas  como  dismenorréia  (62,2%),  dor  pélvica  crônica  (13,3%),  infertilidade  (14%)  e 

dispareunia  profunda  (2,1%),  além  de  outros  relacionados  à  localização  das  lesões,  como 

disfunções  urinárias  e  intestinais,  incluindo  dor  e  sangramento  (3). Outros  sinais  clínicos 

sugestivos de endometriose incluem sensibilidade pélvica, útero retrovertido fixo, frouxidão 

dos ligamentos uterossacrais, espessamento dos ligamentos e presença de nódulos (4). 

Além disso, existem diferentes estágios de endometriose, e não há correlação desses 

com a gravidade dos sintomas ou a evolução da doença; assim, acredita‐se que existem tipos 

diferentes de endometriose, cada qual com sua etiologia e consequências variadas. Ainda, 

há diversidade de quadros clínicos em indivíduos com mesmo estágio de doença. 

Diversas análises são utilizadas para auxiliar no diagnóstico de endometriose, entre elas 

ultrassonografia  transvaginal  (USTV),  ressonância  magnética,  testes  sanguíneos  para 

quantificação  de  CA‐125,  laparoscopia  e  exames  histológicos  das  lesões  (4).  Porém,  a 

laparoscopia  ou  laparotomia  é  considerada  “padrão  ouro”  para  o  diagnóstico  de 

endometriose, onde os possíveis focos de endometriose são retirados e avaliados por exame 

anátomo‐patológico (4).  

 

1.1 Patogênese 

 Dentre as teorias propostas para a etiopatologia da endometriose, a mais explorada é a 

da menstruação retrógrada. De acordo com essa hipótese, durante a menstruação, células 

endometriais regridem pelas tubas uterinas e implantam‐se na cavidade peritoneal e ovários 

(5). Curiosamente, a menstruação retrógrada é extremamente  frequente em mulheres em 

23  

idade  reprodutiva  (cerca de 90%)  (6), entretanto, a doença estabelece‐se em apenas 10% 

destas (7). Conclui‐se, portanto, que além da ocorrência de menstruação retrógrada, outros 

fatores  que  permitem  a  adesão  e  proliferação  dessas  células  fora  da  cavidade  uterina 

contribuam  para  a  patogênese  da  endometriose.  Entre  tais  fatores,  alterações  genéticas, 

ambientais,  hormonais  e  do  sistema  imune  podem  estar  relacionados  com  o 

desenvolvimento da doença (8). 

É  sugerido  que  o  efluente  menstrual  contenha  fatores  que  induzem  alterações  no 

mesotélio  peritoneal,  e  consequentemente,  proporcionam  sítios  de  aderência  para  as 

células  endometriais  (9)  (10).  Após  a  adesão,  há  proliferação  e  invasão  das  células  no 

peritônio, o que causa lesões e adesões entre os órgãos, resultando em distorção anatômica, 

e, consequentemente, dor. Uma das principais consequências relacionadas à endometriose 

é a infertilidade, decorrente principalmente de efeitos tóxicos da reação inflamatória (11). 

 

1.2   Endometriose e o Sistema Imunológico  

 A  endometriose  apresenta‐se  como  uma  reação  inflamatória,  com  infiltração  de 

neutrófilos,  eosinófilos, mastócitos, macrófagos,  células  dendríticas,  células  natural  killer 

(NK), linfócitos T CD4+ e CD8+ (12‐14). 

Na endometriose, são observados diversos níveis de comprometimento das moléculas 

que participam do sistema  imunológico, variando de alterações quantitativas e qualitativas 

das  células,  citocinas  e  quimiocinas  no  microambiente  intraperitoneal.  Entre  essas 

alterações,  as  células  NK  e  linfócitos  T  CD8+,  que  exercem  papel  fundamental  na 

imunovigilância  e  clearance  de  células,  apresentam  sua  capacidade  citotóxica  bastante 

reduzida  em  pacientes  com  endometriose  comparativamente  às mulheres  sem  a  doença 

(14). 

Adicionalmente, níveis aumentados de TGF‐β foram observados no fluido peritoneal de 

mulheres com endometriose e estão associados, ao menos parcialmente, à angiogênese (9). 

Essa citocina pode também contribuir para redução da atividade citotóxica de células NK e a 

diminuição  da  retirada  de  células  endometriais  ectópicas,  além  da  geração  de  células  T 

reguladoras (Treg).  

Quanto às células dendríticas (dendritic cells ‐ DC), observa‐se decréscimo acentuado no 

número  de  DC  maduras  durante  a  fase  proliferativa  do  ciclo  menstrual,  e  acréscimo 

24  

significativo de DC  imaturas durante  todas as  fases do ciclo  (13) no endométrio eutópico. 

Além  disso,  há  aumento  da  freqüência  de DC  imaturas  no  peritônio,  que  é  indicativo  de 

recrutamento de células  imaturas pelo endométrio ectópico ou pelo ambiente (13), e pode 

resultar na menor frequência de apresentação de antígenos a linfócitos T ou na indução de 

tolerância  imunológica nessas células;  isso poderia  justificar parcialmente a baixa  resposta 

das células do sistema imune contra células endometriais ectópicas.  

Ainda, foram observados números aumentados de macrófagos no endométrio eutópico 

em pacientes  com endometriose durante  todas as  fases do  ciclo menstrual  (15),  fato que 

colabora  com  a  natureza  inflamatória  da  endometriose.  Apesar  do  número  elevado  de 

macrófagos  nessas  pacientes,  estes  apresentam‐se  com  capacidade  fagocítica  reduzida, 

prejudicando a remoção de células endometriais ectópicas (16). 

Na literatura, os resultados obtidos quanto ao padrão predominante de resposta imune 

em  mulheres  com  endometriose  são  bastante  contraditórios.  Foram  observados  níveis 

elevados de IL‐4 e IL‐10 na circulação sistêmica (17) e no fluido peritoneal de mulheres com 

endometriose  (18). Apesar de altas concentrações de  IFN‐γ  também  terem sido  relatas no 

fluido peritoneal  (18), sugere‐se prevalência de resposta Th2 nessas pacientes. Entretanto, 

quando  aspectos  clínicos  da  doença  são  relacionados  com  a  produção  de  citocinas,  há 

associação  da  resposta  Th1  com  a  forma  infiltrativa  da  doença,  refletida  pela  maior 

produção de TNF‐α e IL‐2 em mulheres com sintomas relacionados à endometriose profunda 

(19). 

Citocinas  inflamatórias  produzidas  por  células  endometriais  podem  contribuir  para  a 

adesão  destas  ao  peritônio.  Macrófagos  peritoneais  estimulam  a  produção  de 

metaloproteinases de matriz (MMP), a partir da síntese de IL‐1α, IL‐1β e IL‐8 e proporcionam 

a invasão de células ectópicas na matriz extracelular (20). IL‐8 e TNF‐α em combinação com 

TGF‐β  e  fator  de  crescimento  vascular  endotelial  (VEGF)  produzidos  por  macrófagos 

estimulam a angiogênese, permitindo que as células endometriais proliferem e permaneçam 

em local ectópico (21). 

Apesar  de  diversas  alterações  funcionais  em  células  do  sistema  imune  terem  sido 

relatadas  em  pacientes  com  endometriose,  não  está  claro  ainda  quais  fatores  são 

responsáveis  por  essas  alterações. O  quadro  geral  da  imunidade  na  endometriose  ainda 

expõe diversas lacunas, e devido à heterogeneidade da doença, resultados contrastantes são 

relatados na literatura. 

25  

Esse estudo enfoca no estudo das populações de linfócitos T reguladores, células natural 

killer,  células  supressoras mieloides  e  células  dendríticas,  a  fim  de  avaliar  o  papel  dessas 

populações celulares no desenvolvimento da endometriose. 

 

1.2.1 Células T reguladoras 

 As  células  T  reguladoras  (Treg)  (22)  são  essenciais  para  a  indução  de  tolerância  de 

linfócitos autorreativos a antígenos próprios e manutenção da homeostase (23). Compõem 2 

a 5% das células CD4+ em humanos e são desenvolvidas continuamente como uma linhagem 

T comum no timo, constituindo uma subpopulação distinta de outras células T ou timócito 

(24). São descritos dois  subgrupos de  células T  reguladoras  (Treg) que diferem entre  si em 

termos de especificidade e de mecanismo de ação: i) as Treg naturais que se desenvolvem e 

emergem do timo com função reguladora, e atuam na periferia regulando possíveis reações 

autoimunes potencialmente patológicas, e  ii)  as  Treg  induzidas  (Treg do  tipo 1  ‐  Tr1,  Th3 e 

outras) que  se desenvolvem  como  consequência da  ativação de  linfócitos T maduros, em 

condições específicas de exposição antigênica e sob influência de diferentes citocinas.  

Os mecanismos reguladores das células Treg incluem a supressão por contato célula a 

célula,  que  envolve  o  receptor  inibitório  CTLA‐4  e  a  secreção  de  TGF‐β1,  levando  à 

diminuição da expressão da cadeia α do receptor da IL‐2 nas células T alvo. Sua atividade in 

vivo parece estar associada com a presença de citocinas como IL‐4, IL‐10 e TGF‐β (25). 

Apesar da  importância das  células T  reguladoras na manutenção da homeostase e 

prevenção  de  doenças  autoimunes,  a  presença  deste  tipo  celular  em  algumas  condições 

pode representar um problema. É sugerido que a presença de Treg em infecções parasitárias 

e câncer, esteja relacionada à diminuição da resposta imune protetora (26). 

Os  estudos  até  hoje  publicados  sobre  os mecanismos  imunológicos  associados  ao 

aparecimento de endometriose indicam que o microambiente gerado pela implantação das 

células  endometriais  gere  uma  diminuição  da  resposta  imune  efetora  (13).  Esta  condição 

pode  estar  associada  à  presença  de  células  reguladoras  no  peritônio;  nosso  grupo  de 

pesquisa observou aumento da frequência de células CD4+CD25+FoxP3+ no fluido peritoneal 

de  pacientes  com  endometriose,  em  comparação  com mulheres  sem  endometriose  (27), 

corroborando estudos que  reportaram  recrutamento de células Treg para o endométrio de 

mulheres que desenvolvem endometriose (28). 

26  

O fator de transcrição Foxp3 (Forkhead box p3) é um fator de transcrição altamente 

relacionado  à  células  Treg  e  sua  expressão  está  relacionada  à  função  supressora  dessas 

células. A descoberta da relação desse fator com as células Treg, no entanto, só ocorreu em 

2003 (29). Antes disso, era comum utilizar a co‐expressão de CD4 e CD25 para caracterização 

de uma subpopulação de  linfócitos T com potencial ação supressora. O marcador CD25, no 

entanto, não é específico de células Treg: ele compreende a cadeia α do receptor de IL‐2, que 

é composto ainda pelas cadeias β (CD122) e γ (CD132). A expressão da cadeia α na superfície 

da célula é induzida pelo fator de transcrição Foxp3 e garante maior afinidade à IL‐2. Sendo 

assim, células Treg possuem maior expressão do CD25 em  sua  superfície  (CD25high) do que 

células T convencionais  (CD25+) e utilizam  isso como mecanismo de supressão da resposta 

imune  efetora,  visto  que  na  ausência  de  IL‐2  os  linfócitos  T  ativados  não  proliferam. Um 

linfócito T ativado também tem expressão de CD25 em sua superfície, portanto, há de se ter 

cautela ao utilizar a expressão de CD25  como marcador de Treg, buscando  conciliar a alta 

expressão  de  CD25  com  outros marcadores,  como  o  Foxp3.  Vários  grupos  sugerem  que 

células Treg possuem alta expressão de CD25 e baixa expressão de CD127, e que o conjunto 

desses marcadores diferem as populações de células Treg das T convencionais. Essa  ideia é 

reforçada pelo achado de que cerca de 90% das células CD25highCD127low são Foxp3+ (30, 31). 

O  fator  de  transcrição  Foxp3 mostra‐se  como o marcador mais  específico  de  células  Treg, 

entretanto,  a  expressão  transiente  de  Foxp3  é  comum  em  células  T  convencionais 

recentemente  ativadas  (32).  Dessa  forma,  sugerimos  que  o  conjunto  de  marcadores 

CD3+CD4+CD25highCD127lowFoxP3+ seja o mais apropriado para a caracterização fenotípica de 

células Treg. 

 

1.2.2 Células Natural Killer (NK) 

 As células Natural Killer  (NK) estão entre as principais células do  sistema  imune de 

vertebrados. Essas células fornecem respostas rápidas para as células infectadas por vírus e 

respondem à formação de tumores, começando a atuar cerca de três dias após a  infecção. 

Sendo assim, desempenham  importante papel na resposta  inata podendo distinguir células 

infectadas  por  vírus  e  células  neoplásicas  das  células  normais. As  células NK  reconhecem 

células  infectadas  ou  estressadas  através  de  um  balanço  de  sinais  obtidos  de  receptores 

ativadores e inibidores, o que culmina na liberação de grânulos e lise da célula‐alvo. Após o 

27  

surgimento do conceito de  imunovigilância, diversos grupos  tem dado atenção especial às 

células  NK.  Conforme  citado  anteriormente,  as  células  NK  apresentam  sua  capacidade 

citotóxica  bastante  reduzida  em  pacientes  com  endometriose  comparativamente  às 

mulheres sem a doença (14). 

As  células  NK  podem  ser  subdivididas  em  diferentes  populações  baseado  na 

expressão diferencial de marcadores clássicos de NK, CD56 e CD16. No sangue, mais de 90% 

das células NK são CD56dimCD16+, as chamadas NK convencionais, porém observa‐se também 

outras células com fenótipo CD56brightCD16+ e CD56brightCD16‐ (33). As células CD56brightCD16‐ 

compõem apenas 10% das células NK encontradas no sangue, entretanto em alguns tecidos, 

como no útero, compreendem 70% das NK, sendo portanto muitas vezes chamadas de NK 

uterinas (uNK) ou NK deciduais (dNK) (34). 

Como  as  células NK  CD56dimCD16+  constituem  a  grande maioria  de  células NK  no 

sangue, as outras populações de células NK  são pouco estudadas. Sugerimos, no entanto, 

que estas outras populações de células NK tenham funções  importantes no sistema  imune. 

Dado o acúmulo preferencial de células CD56brightCD16‐  no endométrio, é possível que estas 

células tenham funções não apenas na manutenção da gravidez, mas também em diversas 

doenças  ginecológicas.  Essa  sugestão  é  baseada  na  observação  de  que  a  frequência  de 

células CD56brightCD16‐   encontra‐se aumentada no endométrio de mulheres grávidas e não 

grávidas  (35). No endométrio de mulheres não  grávidas, o número de NK CD56brightCD16‐ 

varia durante as fases do ciclo menstrual, apresentando‐se em menor frequência no início da 

fase proliferativa;   após a ovulação essas células proliferam, atingindo um pico no  final da 

fase secretora (36). 

É sugerido que células CD56bright e células CD56dim apresentem funções imunológicas 

distintas; as primeiras estão envolvidas com a regulação da resposta  imune pela produção 

de  citocinas  pró‐inflamatórias  e  as  últimas,  pela  função  citotóxica.  Isso  é  sustentado  por 

experimentos  que mostram maior  capacidade  de  produção  de  TNF‐α  e  IFN‐γ  por  células 

CD56bright  associada  à  diminuição  de  grânulos  citolíticos,  como  perforina  A  e  granzimas, 

quando comparadas com células CD56dim (37). 

As células NK CD56brightCD16‐ são células produtoras de várias citocinas e fatores de 

crescimento  que modulam  a  resposta  imune,  entre  eles  TNF‐α,  IL‐10, G‐CSF,  IL‐1  e  IFN‐γ 

(38). Expressam, também, altos níveis de mRNA de fatores angiogênicos (VEGF, Ang‐2, PlGF) 

na fase secretória do ciclo menstrual (35). 

28  

Pouco se sabe a respeito das diferentes populações de células NK nas pacientes com 

endometriose. Visto a importante função de células NK na imunovigilância e alta capacidade 

de  produção  de  citocinas  reguladoras,  mostra‐se  importante  a  investigação  dessas 

populações em pacientes com endometriose. 

 

1.2.3 Células supressoras mieloides 

 As  células  supressoras  mieloides  (myeloid‐derived  suppressor  cells  ‐  MDSC) 

compreendem um grupo heterogêneo de células definidas por sua origem mieloide, estado 

imaturo e capacidade supressora. O principal mecanismo de supressão das MDSC acredita‐

se  ser  por  produção  de  arginase  e  espécies  reativas  de  oxigênio  e  nitrogênio,  os  quais 

impedem  a  proliferação  de  linfócitos  T  (39).  As  MDSC  são  amplamente  descritas  em 

pacientes com câncer (40). 

Em resposta a estímulo antigênico excessivo, a medula óssea é estimulada a produzir 

células  mieloides  imaturas,  que,  em  indivíduos  sadios,  rapidamente  se  diferenciam  em 

granulócitos maduros, macrófagos  ou  DC.  Em  contrapartida,  em  condições  inflamatórias 

patológicas  (como doenças  infecciosas,  câncer,  trauma e doenças autoimunes) ocorre um 

bloqueio  na  sua  diferenciação  em  células mieloides maduras,  o  que  resulta  na  regulação 

positiva  de  fatores  imunossupressores  como  arginase‐1  (ARG1)  e  óxido‐nítrico  sintase 

induzido  (iNOS), com consequente aumento na produção de óxido nítrico  (NO) e espécies 

reativas de oxigênio (ROS); este processo culmina na expansão dessas células em seu estado 

imaturo, as chamadas MDSC (41).  

Por  tratar‐se  de  um  grupo  heterogêneo  de  células,  os  marcadores  fenotípicos 

descritos na  literatura para  caracterizar  as MDSC  são bastante divergentes. De um modo 

geral, as MDSC podem ser definidas fenotipicamente por expressarem marcadores comuns a 

progenitores  mieloides  (CD33),  ausência  de  marcadores  linhagem‐específicos  e  que 

caracterizam células diferenciadas (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56), pela expressão da 

molécula de adesão CD11b, além de pouca ou nenhuma apresentação de antígenos  (baixa 

ou nenhuma expressão de HLA‐DR) (39). Sendo assim, de um modo geral, as MDSCs podem 

ser definidas pelo fenótipo Lin1‐HLA‐DR‐CD33+CD11b+, além da avaliação de sua capacidade 

supressora. Ainda, por apresentar  fenótipo variável, observa‐se  também  tanto a presença 

quanto a ausência de expressão de CD15, CD34 e outros marcadores. 

29  

Sua  importância, em  termos de  função no sistema  imune, vem ganhando destaque 

mais recentemente. Foi demonstrado que MDSC suprimem a atividade citotóxica de células 

NK  in vitro e  in vivo, por  inibição de perforinas e de modo dependente de contato celular 

(42). 

Até o momento, não existem na  literatura estudos avaliando a presença de células 

supressoras mieloides em amostras de sangue, fluido peritoneal ou  lesões endometrióticas 

de pacientes com endometriose.  

 

1.2.4 Células Dendríticas (DC) 

 

As  células  dendríticas  (DC)  constituem  uma  ponte  entre  a  imunidade  inata  e  a 

imunidade adaptativa; isso porque são consideradas as principais células apresentadoras de 

antígenos  (APC).  As  DC  possuem  longas  projeções,  alta  capacidade  fagocítica  e  estão 

situadas  nas  principais  portas  de  entrada  de  microrganismos  (pele  e  mucosas  do  trato 

respiratório e gastrointestinal); por tal razão, são consideradas sentinelas  imunológicas. As 

DC captam antígenos protéicos com suas longas projeções e os apresentam aos linfócitos T 

(LT)  nos  linfonodos.  Isso  ocorre,  pois  assim  que  fagocita  um  antígeno,  as  DC  passam  a 

expressar o CCR7, receptor para quimiocinas produzidas nos linfonodos, o que permite que 

elas migrem  para  o  linfonodo mais  próximo  e  entrem  em  contato  com  os  linfócitos. No 

processo de migração até o linfonodo regional, as DC amadurecem e adquirem a expressão 

de moléculas co‐estimuladoras  (como CD80 e CD86),  tornando‐se aptas a apresentarem o 

antígeno aos LT. Na ausência desses sinais co‐estimuladores, o LT não é capaz de ser ativado, 

tornando‐se  muitas  vezes  anérgico.  A  apresentação  de  antígenos  com  poucos  sinais 

estimuladores também pode fazer com que o LT se torne uma célula Treg (43, 44). 

As DC  são  células  com alta expressão de moléculas MHC de  classe  II, por  isso  são 

comumente caracterizadas pela expressão de HLA‐DR. O fenótipo geral para seleção dessas 

células por citometria de fluxo consiste na expressão de HLA‐DR e ausência de expressão de 

marcadores linhagem específicos (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 e CD56).  

A subdivisão de DC em humanos nas diversas subpopulações como as descritas em 

camundongos ainda não está clara na  literatura. De um modo geral, as DC do sangue são 

classificadas como DC mieloides (mDC), Lin‐HLA‐DR+CD11c+, e plasmocitoides (pDC), Lin‐HLA‐

DR+CD11c‐,  devido  a  diferenças  na  origem,  expressão  de  marcadores  e  funções  dessas 

30  

células. As mDC são a maioria das DC no sangue e tecidos linfoides e não linfoides e podem 

ser subdivididas, ainda, em diversas subpopulações (45). Um método simples de distinguir a 

população  mieloide  da  plasmocitóide  é  pela  utilização  do  CD33,  marcador  encontrado 

apenas em populações de origem mieloide (46‐48).  

A redução na frequência de DC ou na capacidade dessas de apresentar antígenos a LT 

pode  ser  um  fator  contribuinte  para  o  desenvolvimento  da  endometriose. Nesse  estudo, 

tentaremos  estabelecer  uma  relação  entre  a  frequência  de  DC  e  o  desenvolvimento  da 

endometriose. 

Três fenótipos foram escolhidos para a caracterização de DC nesse estudo: i) Lin‐HLA‐

DR+, fenótipo mais geral de DC;    ii) Lin‐HLA‐DR+CD33+, fenótipo que seleciona DC mieloides 

(mDC); e  iii) Lin‐HLA‐DR+CD33+CD11b+ e Lin‐HLA‐DR+CD33+CD11b‐,    fenótipo que  investiga a 

expressão de CD11b nas mDC, porém pouco utilizado. 

O marcador  Lin1‐  (BD Biosciences), aqui utilizado na  caracterização de MDSC e DC 

consiste  em  um  conjunto  de marcadores  linhagem‐específicos  (CD3,  CD14,  CD16,  CD19, 

CD20  e  CD56),  todos  conjugados  a  um mesmo  fluorocromo.  Ao  utilizar  esse marcador, 

podemos  excluir  populações  de  LT,  LB,  monócitos  e  células  NK  utilizando  apenas  um 

marcador (ou seja, ocupando apenas um canal de leitura no citômetro).  

Baseado nos diversos relatos do desequilíbrio quantitativo e funcional de células imunes 

no microambiente endometrial como  fator contribuinte da progressão da endometriose, a 

hipótese  aqui  aventada  é  de  que  o  ambiente  peritoneal  de  pacientes  susceptíveis  esteja 

imunorregulado  e  proporcione  a  implantação  e/ou  desenvolvimento  da  endometriose; 

nesse  sentido,  essa  imunorregulação  pode  ser  parcialmente  sustentada  por  populações 

celulares de Treg, NK, MDSC e DC. Nesse estudo,  foi  investigada a avaliação da  frequência 

dessas  populações  em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  de  pacientes  com 

endometriose,  além  da  análise  do  microambiente  peritoneal  no  qual  essas  células  se 

encontram, a partir da produção de citocinas.  

31  

 

2 OBJETIVOS 

 

O  principal  objetivo  deste  trabalho  foi  caracterizar  e  quantificar  as  células  T 

reguladoras  (Treg),  populações  de  células  natural  killer  (NK),  células  supressoras mieloides 

(MDSC)  e  células  dendríticas  (DC)  no  sangue  e  no  fluido  peritoneal  de  mulheres  com 

endometriose, na tentativa de esclarecer seus papéis na patogênese dessa doença.  

Além disso, foi avaliado o microambiente peritoneal no qual essas células se encontram 

a partir da produção de citocinas IL‐2, IL‐4, IL‐ 6, IL‐10, IL‐12(p70), IL‐17A, TNF‐α, IFN‐γ e TGF‐

β1, em amostras de sangue e fluido peritoneal das pacientes com endometriose. 

 

32  

 

3 PACIENTES, MATERIAIS E MÉTODOS 

 

3.1       Pacientes 

 

As  pacientes  incluídas  neste  estudo  estão  em  acompanhamento  no  Setor  de 

Endometriose da Clínica Ginecológica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da 

Universidade de São Paulo (FMUSP) ou no Hospital Sírio‐Libanês. A seleção das pacientes foi 

realizada  sob  a  responsabilidade  dos médicos Maurício  Simões  Abrão  e  Sérgio  Podgaec. 

Foram  incluídas  no  estudo  mulheres  entre  26  e  51  anos,  com  endometriose  profunda 

confirmada  por  análise  histopatológica,  ausência  de  doença  autoimune,  inflamatória  ou 

condição  neoplásica  (confirmado  por  exames  médicos  ou  testes  laboratoriais  quando 

necessário) e sem uso de terapia hormonal por três meses prévios à cirurgia laparoscópica.  

No  grupo  controle,  foram  incluídas  mulheres  entre  32  e  46  anos  submetidas  à 

videolaparoscopia  principalmente  para  realização  de  laqueadura,  mas  também  para 

realização  de  outros  procedimentos  ginecológicos  (histerectomia,  ooforectomia  ou 

miomectomia) ou para diagnóstico de endometriose. Todas as pacientes incluídas no grupo 

controle  preencheram  os  mesmos  critérios  de  inclusão  e  exclusão  das  pacientes  com 

endometriose, e tiveram diagnóstico de endometriose descartado durante a laparoscopia. 

Foram  coletadas  amostras do  sangue  e do  fluido peritoneal  (FP) de  cada paciente 

com  endometriose  após  o  preenchimento  do  consentimento  informativo  por  escrito. Na 

admissão,  as  pacientes  com  endometriose  responderam  a  um  questionário  padrão  onde 

constam  os  antecedentes  pessoais,  enfocando  principalmente  os  sintomas  comuns 

relacionados  à  endometriose  e  a  doenças  ginecológicas,  além  de  informações  sobre 

antecedentes familiares.  

Com  base  nos  achados  cirúrgicos,  as  pacientes  foram  classificadas  em  estágios  de 

gravidade da doença de  acordo  com  as diretrizes da  Sociedade Americana para Medicina 

Reprodutiva (ASRM) (49) onde o estágio I corresponde à endometriose mínima, o estágio II 

relativo à endometriose leve, o III, à endometriose moderada e o IV, à endometriose grave. 

Nesse  estudo,  as  pacientes  foram  divididas  em  grupos:  a)  pacientes  com  endometriose 

estágios  I  e  II  (I/II)  (n=7),  representando  as mulheres  com  doença mínima  e  leve;  e  b) 

pacientes  com  endometriose  estágios  III  e  IV  (III/IV)  (n=12),  grupo  que  compreende  as 

mulheres com doença moderada e grave. 

33  

O  projeto  foi  aprovado  pelo Comitê  de  Ética  em  Pesquisa  do Hospital  Israelita Albert 

Einstein  nº  11/1711  (CAAE  –  0205.0.028.015‐11),  pelo  Comitê  de  Ética  em  Pesquisa  do 

Instituto  de  Ciências  Biomédicas  da Universidade  de  São  Paulo  (registrado  na  Plataforma 

Brasil sob CAAE 01461012.2.1001.5467) e pela Comissão de Ética para Análise de Projetos de 

Pesquisa do Hospital das Clínicas da FMUSP (CAPPesq nº 0386/11). 

 

3.2 Obtenção e separação das células  

 As amostras de sangue e  fluido peritoneal  foram centrifugadas a 500 x g por cinco 

minutos  em  temperatura  ambiente;  o  sobrenadante  individual  foi  congelado  a  ‐80ºC  em 

alíquotas para a análise de citocinas. O pellet celular do fluido peritoneal foi ressuspendido 

em 1 mL de  tampão de  lise 1X  (BD FACS Lysing Solution) enquanto que para o sangue  foi 

utilizada a proporção 3:1  (v:v). As amostras  foram  incubadas no escuro por dez minutos a 

37°C ou até que a lise total das hemácias fosse observada. Em paralelo, parte das amostras 

foi reservada para avaliação da viabilidade, com azul de Trypan, e contagem em câmara de 

Neubauer  e  contador  automático  Countess  (Invitrogen);  para  essa  análise,  as  hemácias 

foram  lisadas,  conforme  descritas  acima,  utilizando‐se  tampão  de  lise  de  hemácias  sem 

paraformaldeído (BD Pharm Lyse Lysing Solution). 

A  seguir, as amostras  foram centrifugadas a 500 x g por  cinco minutos a  temperatura 

ambiente, e ao pellet  celular  foi adicionado 500 µL de Tampão de  FACS  (tampão  fosfato‐

salina (PBS) suplementado com 1% albumina sérica humana e 0,1% azida). As células foram 

novamente centrifugadas  (500 x g, cinco minutos,  temperatura ambiente),  ressuspendidas 

em PBS e utilizadas para as análises descritas a seguir.  

 

3.3 Análise dos marcadores de superfície celular por citometria de fluxo 

 As células obtidas do sangue e do fluido peritoneal de mulheres com endometriose e 

controles foram marcadas com três diferentes painéis de anticorpos, como mostra a Tabela 

1. Para cada um dos painéis, 1 x 106 células por poço foram transferidas para placas fundo V 

para marcação  com  anticorpos  contra os marcadores de  superfície  celular. Às  células,  foi 

adicionada  a  solução  contendo  os  anticorpos  dos  respectivos  painéis  (Tabela  1).  Foram 

utilizados, para tanto, anticorpos monoclonais anti‐CD45, CD33, CD34, CD11b, HLA‐DR, Lin1, 

34  

CD15,  CD3,  CD4,  CD25,  CD127,  LAP,  CD16,  CD56,  CD57,  CD161  e  CD14  conjugados  com 

fluorocromo  isotiocianato  de  fluoresceína  [FITC],  ficoeritrina  [PE],  aloficocianina  [APC], 

ficoeritrina conjugado com cianina 7 [PE‐Cy7], peridinina de clorofila combinada com cianina 

[PerCP‐Cy5.5], aloficocianina H7  [APC‐H7] ou  ficoeritrina conjugada com CF594  [PE‐CF594] 

na  concentração  0,5‐1,0  μg/106  células,  por  30 minutos  em  temperatura  ambiente,  e  ao 

abrigo da luz. Após incubação, as amostras foram lavadas, ressuspendidas 300 µL de tampão 

de FACS e analisadas em citômetro de fluxo BD LSRFortessa (BD Biosciences). As células do 

painel Treg foram então marcadas com o FoxP3, como descrito a seguir. 

 

Tabela  1  ‐  Painel  de  anticorpos  utilizados  para  caracterização  das  populações  celulares  de interesse Treg, NK e MDSC e DC. 

Populações celulares 

  

Fluorescências 

FITC  PE  APC  PE‐Cy7 PE‐CF594  APC‐H7  PerCP‐Cy5.5

Treg anticorpo  ‐  FoxP3  CD25  CD3  CD4  CD45  CD127 

clone  259D/C7  M‐A251  SK7  RPA‐T4  2D1  HIL‐7R‐M21

NK anticorpo  CD3  CD56  CD161  CD16  CD57  CD45  CD14 

clone  HIT3a  B159  DX12  B73.1  NK‐1  2D1  M5E2 

MDSC e DC 

anticorpo  Lin1  CD11b  CD34  CD33  CD15  CD45  HLA‐DR 

clone 

NCAM16.2, MφP9, L27, 

SJ25C1, 3G8, SK7 

ICRF44  8G12  P67.6  W6D3  2D1  L243 

Treg = linfócito T regulador; NK = célula natural killer; MDSC = célula supressora mieloide; DC = célula dendrítica.  3.4 Marcação intracelular de Foxp3 de células T reguladoras 

 Para a marcação de FoxP3, e após as marcações de superfície celular, as células  foram 

fixadas e permeabilizadas  com  tampões  apropriados para marcação  intracelular de  FoxP3 

(Human FoxP3 Staining Kit, BD), conforme  instrução do  fabricante. Resumidamente,  foram 

adicionados  200  μL  de  Tampão  A  para  fixar  as  células,  e  incubados  por  dez minutos,  a 

temperatura ambiente, ao abrigo da  luz, e então, as células  foram centrifugadas por cinco 

minutos a 500 x g. Em seguida, as células foram permeabilizadas com 200 μL de Tampão C 

(Tampão A + Tampão B – 1:200 v/v) e incubadas por 30 minutos, à temperatura ambiente e 

protegidas da  luz. Após nova centrifugação  (cinco minutos, 500 x g), o anticorpo Foxp3  foi 

adicionado ao pellet (0,5‐1,0 μg/106 células) e as células foram novamente incubadas por 30 

35  

minutos, no escuro. Após  incubação, as amostras foram  lavadas com 200 μL de tampão de 

FACS e analisadas em citômetro de  fluxo BD LSRFortessa  (BD Biosciences). Um mínimo de 

500 000 eventos foram adquiridos para cada amostra. 

 

3.5 Quantificação de citocinas no plasma e fluido peritoneal 

 Amostras  de  plasma  e  do  sobrenadante  obtidas  do  fluido  peritoneal  de mulheres 

com  endometriose  foram  aliquotadas  e  armazenadas  a  –80ºC  para  quantificação  de  IL‐

12(p70)  (BD  OptEIA),  TGF‐β1  (BD  OptEIA)  e  IL‐17A  (BioLegend)  pelo  método  de  ELISA 

sandwich.  Resumidamente,  placas  de  96  poços  com  alta  propriedade  de  ligação  (Nunc 

Maxisorp)  foram  sensibilizadas  com  100  μL  de  anticorpo  de  captura  diluído  em  tampão 

carbonato de sódio 0,1 M, pH 9,5 numa concentração de 1:250 para IL‐12(p70) e TGF‐ β1 e 

1:200 para a IL‐17A. As placas foram mantidas a 4°C por 16‐18h. Após o tempo de incubação, 

as placas  foram  lavadas  três  vezes  com  tampão de  lavagem  (PBS e 0,05% Tween 20) e o 

bloqueio de áreas não cobertas pelo anticorpo  foi  feito  com 200  μL por poço de Tampão 

Diluente (PBS com 10% soro fetal bovino) por uma hora em temperatura ambiente. Após a 

adição das amostras e padrões recombinantes nas concentrações  indicadas pelos kits  (100 

μL /poço), as placas  foram  incubadas por duas horas em temperatura ambiente. As placas 

foram então  lavadas  três vezes  com  tampão de  lavagem e 100  μL  /poço do anticorpo de 

detecção (1:250 para o TGF‐ β1 e 1:500 para a  IL‐12 (p70) conjugado com estreptavidina e 

peroxidase  HRP  (horseradish  peroxidase)  (1:250)  foi  adicionado  por  mais  uma  hora  a 

temperatura  ambiente;  para  a  quantificação  de  IL‐17A,  foi  adicionado  100  μL  /poço  do 

anticorpo secundário (1:200) e incubado por 1 hora, e posterior incubação de 100 μL /poço 

de avidina‐HRP (1:1000) por 30 minutos. As placas foram novamente lavadas três vezes com 

tampão  de  lavagem  e  foi  adicionado  a  cada  poço  100  μL  de  uma  solução  contendo  o 

substrato H2O2 3% (v/v) e tetrametilbenzidina (TMB). Após o aparecimento de cor, a reação 

foi interrompida com adição de 50 μL de ácido sulfúrico 2N. A leitura da densidade óptica foi 

feita  a 450nm utilizando‐se o equipamento  ELISA DTX 880 Multimode Detector  (Beckman 

Coulter) e os resultados foram apresentados em pg/mL.  

O kit de CBA (cytometric bead array) Th1/Th2 (BD Biosciences) foi utilizado para avaliar 

as citocinas  IL‐2,  IL‐4,  IL‐6,  IL‐10, TNF‐α e  IFN‐γ em alíquotas de plasma e sobrenadante de 

fluido  peritoneal  congeladas.  Brevemente,  as  amostras/curvas  foram  incubadas  com  as 

36  

beads de captura e reagente de detecção por 3 horas, em temperatura ambiente e ao abrigo 

da  luz.  Após  o  período  de  incubação,  a  placa  foi  lavada  e  as  amostras  foram  lidas  em 

citômetro de  fluxo BD LSRFortessa  (BD Biosciences). A análise dos  resultados  foi  realizada 

utilizando o software FCAP Array versão 3.0. Os resultados foram apresentados em pg/mL. 

 

3.6 Análises comparativas entre os grupos 

 Testes de normalidade (Kolmogorov‐Smirnov, D’Agostino e Pearson omnibus ou Shapiro‐

Wilk),  além da  análise de  coeficientes de  assimetria e  achatamento  (skewness e  kurtosis) 

foram  utilizados  para  avaliar  a  distribuição  das  populações  estudadas.  Para  comparações 

entre  grupos,  foi  utilizado  o  teste  t  de  Student  não  pareado,  onde  a  distribuição  foi 

considerada  normal,  ou  teste  U  de  Mann‐Whitney,  para  dados  com  distribuição  não 

considerada normal. Para comparações entre amostras de sangue e fluido peritoneal dentro 

de um mesmo grupo,  foi utilizado o  teste  t pareado ou  teste de Wilcoxon, para amostras 

com distribuição normal  e não normal,  respectivamente. As possíveis  interações  entre  as 

amostras  foram  verificadas  pela  análise  de  variância  simples  (ANOVA  unilateral/Kruskal‐

Wallis). O nível de significância estabelecido foi de p<0,05, para todos os testes. As análises 

estatísticas foram realizadas pelo software GraphPad Prism 5.0. Os dados são apresentados 

como mediana e intervalo interquartil.  

 

37  

4 RESULTADOS 

 4.1        Dados das Pacientes   

Foram  incluídas nesse estudo 21 pacientes com endometriose, cujo diagnóstico  foi 

confirmado  por  análises  histopatológicas  das  lesões  endometrióticas  após 

videolaparoscopia. Doze  indivíduos  controle,  com  ausência  de  endometriose  comprovada 

durante  a  videolaparoscopia,  foram  inicialmente  incluídos;  desses,  dois  indivíduos  foram 

excluídos do estudo devido ao uso de contraceptivo oral e duas pacientes com endometriose 

foram excluídas devido à presença de neoplasia. Outros dois  indivíduos do grupo controle 

foram excluídos por número  insuficiente de células no fluido peritoneal para marcação por 

citometria  de  fluxo.  Ao  todo,  19  pacientes  com  endometriose  (grupo  EDT)  e  8  controles 

(grupo  CTRL)  preencheram  os  critérios  de  inclusão  do  estudo.  Os  dados  clínicos  das 

pacientes com endometriose  incluídas nesse estudo estão resumidos no apêndice (Tabelas 

A1 e A2). 

A principal queixa relatada pelas pacientes foi dismenorréia, presente em 16 das 19 

pacientes com endometriose aqui estudadas. Dispareunia de profundidade foi reportada em 

11/19  das  pacientes  e  dor  pélvica  acíclica  em  9/19  pacientes.  Alterações  intestinais  e 

urinárias  cíclicas  também  foram  reportadas  em  8/19  e  2/19  pacientes,  respectivamente. 

Oito  pacientes  com  endometriose  apresentaram‐se  inférteis.  Segundo  informações 

laboratoriais, sete pacientes estavam na fase proliferativa do ciclo menstrual, enquanto nove 

estavam na  fase  secretora. Ressalta‐se que nenhuma paciente com endometriose  incluída 

nesse  estudo  fazia  uso  de  terapia  hormonal  por  pelo  menos  três  meses  prévios  à 

laparoscopia. 

As  lesões de endometriose  foram predominantes nas  regiões  retrocervical  (13/19), 

peritoneal  (14/19)  e  ovários  (11/19).  Também  foram  observadas  lesões  na  porção 

retossigmóide  (8/19),  nas  tubas  uterinas  (7/19),  fundo  de  saco  de Douglas  (5/19),  ureter 

(3/19), vagina (3/19), reto (4/19), bexiga (2/19) e no apêndice (2/19) (apêndice – Tabela A2). 

Todas as lesões foram confirmadas histologicamente para a presença de estroma e glândula 

endometrial.  

  

38  

  4.2 Avaliação de células T reguladoras  

 

A caracterização das células Treg foi realizada pela análise dos marcadores CD3, CD4, CD25 

e CD127 expressos na superfície celular, além da análise intracelular do fator de transcrição 

FoxP3. A estratégia utilizada para essa caracterização  leva em consideração populações de 

células na região dos linfócitos, identificadas por tamanho e granulosidade, e marcação com 

o marcador de células hematopoiéticas CD45, seguidas da expressão da molécula de CD3, 

que  está presente  apenas  em  receptores de  linfócitos  T.  Em  seguida,  a  expressão do  co‐

receptor de linfócitos T auxiliares, CD4, e a alta expressão da cadeia α do receptor de IL‐2, a 

molécula de CD25, foram observadas dentre os linfócitos T CD3+. A seguir, a baixa expressão 

da cadeia α do receptor da IL‐7, o CD127, foi verificado dentre as células CD3+CD4+CD25high . 

Por  fim,  a  presença  de  marcação  intracelular  para  o  fator  de  transcrição  Foxp3  foi 

identificada dentre as células CD3+CD4+CD25highCD127low. Essa estratégia foi utilizada para a 

caracterização de T reguladoras oriundas do sangue e do fluido peritoneal de pacientes com 

endometriose e está ilustrada na Figura 1.  

39  

                                   

                                 

 Figura  1‐  Estratégia  de  análise  de  células  T  reguladoras  (Treg).  Inicialmente,  foram  selecionadas  células  na região dos  linfócitos, separadas por  tamanho, granulosidade e expressão de CD45+  (A). Os  linfócitos T  foram selecionados pela expressão de CD3 (B). Em seguida, foram selecionadas as células T CD4 com alta expressão de CD25 (CD4+CD25high) (C), e nesta população foram selecionadas apenas as células com baixa expressão de CD127 (D). Por fim, foi avaliada a expressão de Foxp3 nessa última população (E).              

As  Tabelas  2  e  3  resumem  os  principais  resultados  da  comparação  das  diferentes 

populações analisadas por essa estratégia de análise nas amostras de sangue e FP, entre os 

grupos  EDT  e  CTRL.  Comparações  entre  os  estágios  de  EDT  podem  ser  encontradas  no 

apêndice (Tabelas A3 e A4). 

 

 

 

 

A  B 

C  D 

E 

40  

 

Tabela 2 – Comparação entre as frequências das populações de linfócitos estudadas no sangue de pacientes com endometriose e controles. 

Sangue   CTRL  EDT População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR)  p 

LT   2,83 ± 3,37  1,72 (0,17 ‐ 5,59)  5,8 ± 7,5  3,98 (0,73 ‐ 7,43)  p=0,32 LT CD4+  1,43 ± 2,09  0,67 (0,11 ‐ 1,43)  3,4 ± 4,9  1,43 (0,41 ‐ 4,2)  p=0,31 

CD4+ em CD3  55,3 ± 20,7  62,4 (47,4 ‐ 65,4)  54,2 ± 14  55,5 (48,8 ‐ 65,6)  p=0,87 CD4+CD25+  20,8 ± 13,07  17,6 (16,7 ‐ 18,9)  19,7 ± 17,9  15,2 (7,4 ‐ 22,8)  p=0,88 CD4+CD25high  2,32 ± 1,18  2,11 (1,27 ‐ 3,62)  3,45 ± 4,24  2,14 (1,07 ‐ 3,96)  p=0,81 Treg em CD3  0,51 ± 0,85  0,22 (0,009 ‐ 0,42) 0,85 ± 1,1  0,37 (0,19 ‐ 1,4)  p=0,33 Treg em CD4  0,79 ± 1,29  0,35 (0,08 ‐ 0,68)  1,47 ± 1,56  0,66 (0,49 ‐ 2,24)  p=0,32 Valores apresentados como frequência de células (%). CTRL= controle, EDT= endometriose, DP = desvio padrão, IQR =  intervalo  interquartil,  LT =  linfócito T, Treg =  linfócito T  regulador. Valor de p  calculado pelo  teste  t de Student não pareado/Mann Whitney, quando apropriado.   Tabela  3  ‐  Comparação  entre  as  frequências  das  populações  linfoides  estudadas  no  fluido peritoneal de pacientes com endometriose e controles. 

Fluido Peritoneal   CTRL  EDT População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR)  p 

LT   1,91 ± 2,56  0,74 (0,27 ‐ 2,98)  5,04 ± 8,44  1,46 (0,28 ‐ 6,63)  p=0,31 LT CD4+  0,62 ± 1,12  0,23 (0,07‐0,59)  1,17 ± 1,76  0,46 (0,11 ‐ 1,36  p=0,38 

CD4+ em CD3  27,7 ±  10,6  26,5 (16,7 ‐ 37,6)  29,5 ± 10,7  28,4 (24,1 ‐ 34,6)  p=0,70 CD4+CD25+  6,33 ± 4,58  6,2 (1,79 ‐ 11,3)  5,82 ± 3,85  5,08 (3,04 ‐ 8,19)  p=0,76 CD4+CD25high  1,86 ± 1,57  1,42 (0,7 ‐ 2,55)  1,03 ± 0,87  0,96 (0,24 ‐ 1,38)  p=0,10 Treg em CD3  0,12 ± 0,13  0,058 (0,03 ‐ 0,19) 0,07 ± 0,08  0,06 (0,0007 ‐ 0,1)  p=0,20 Treg em CD4  0,44 ± 0,38  0,335 (0,11 ‐ 0,76) 0,19 ± 0,19  0,19 (0,002 ‐ 0,35)  p=0,04 

Valores apresentados como frequência de células (%). CTRL= controle, EDT= endometriose, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, LT = linfócito, Treg = linfócito T regulador. Valor de p calculado pelo teste t de Student não pareado/Mann Whitney, quando apropriado.  4.2.1 Análise descritiva das células CD45+, CD3+ e CD4+no sangue e FP: 

 

Não  foram  encontradas  diferenças  entre  a  frequência  de  células  hematopoiéticas 

(CD45+),  linfócitos  T  (CD3+)  e  LT  auxiliares  (CD3+CD4+),  tanto  no  sangue  quanto  no  FP  de 

pacientes  com  endometriose  e  controles.  Conforme  esperado,  amostras  de  sangue 

apresentaram maior  frequência  de  todas  as  populações  citadas  do  que  amostras  de  FP, 

tanto  no  grupo  de  pacientes  com  endometriose,  quanto  no  grupo  controle  (apêndice  – 

Figuras A1‐A8).  

A seguir, analisamos a proporção de células T CD4+ que expressavam o marcador de 

ativação CD25. Mais uma vez, não foram observadas diferenças entre os grupos analisados 

(Figura 2A, B e C). A frequência de LT CD4+ ativados está aumentada no sangue comparado 

41  

com amostras de FP de pacientes com endometriose (p=0,0066, Figura D) e CTRL (p=0,0179, 

Figura  D);  perfil  semelhante  foi  observado  quando  as  pacientes  do  grupo  EDT  foram 

subdivididas em estágios de doença (Figura 2D).  

 

CTRL EDT CTRL EDT0

20

40

60

80 n.s. n.s.

Sangue FP

% C

D4+ C

D25

+

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80n.s.

n.s.

n.s.

% C

D4+ C

D25

+

CTRL EDT I/II III/IV0

5

10

15

20 n.s.n.s.

n.s.

% C

D4+ C

D25

+

CTRL EDT I/II III/IV0

10

20

30

4040

60

80 **sangue

FP

* *n.s.

% C

D4+ C

D25

+

 Figura 2 – Frequência de células T CD4+ ativadas em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes com endometriose e controles. (A) Comparação da frequência das células entre pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles  (CTRL, n=8) no sangue e FP; (B) Frequência de células no sangue de controles  (CTRL, n=8)  e  pacientes  com  endometriose  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12);  (C)  Frequência  de  células  no  FP  de controles e pacientes com endometriose estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12); (D) Comparação entre amostras de sangue e FP de cada grupo. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. *p<0,05, ** p<0,01 e n.s. = não significativa, pelo teste t não‐pareado (A), ANOVA (B e C) e teste t de Student pareado (D).  

A elevada expressão do CD25 na  superfície de  LT CD4+ está altamente  relacionada 

com  as  células  Treg.  Nas  amostras  aqui  avaliadas,  não  foram  encontradas  diferenças  na 

frequência de  células CD4+CD25high  entre pacientes  com endometriose e  controles  (Figura 

3A‐C). Novamente, as amostras de sangue apresentaram maior frequência dessas células do 

que amostras do FP em pacientes do grupo EDT  (p=0,0138)  (Figura 3D). Esse  resultado  se 

estendeu apenas para pacientes do grupo III/IV (p=0,0049). Os grupos CTRL e I/II mostraram 

frequências semelhantes dessas células entre amostras de sangue e FP.  

A  B 

C  D 

42  

CTRL EDT CTRL EDT0

5

10

15

20

25 n.s. n.s.

Sangue FP

% C

D4+ C

D25

high

CTRL EDT I/II III/IV0

2

4

6

815

20n.s.

n.s.

n.s.

% C

D4+ C

D25

high

CTRL EDT I/II III/IV0

1

2

3

4

5

6n.s.

n.s.

% C

D4+ C

D25

high

n.s.

CTRL EDT I/II III/IV0

2

4

6

815

20sangue

PF

*n.s. **n.s.

% C

D4+ C

D25

high

 Figura 3 ‐ Frequência de células T CD4+CD25high em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes com endometriose e controles. (A) Comparação da frequência das células entre pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles  (CTRL, n=8) no sangue e FP; (B) Frequência de células no sangue de controles  (CTRL, n=8)  e  pacientes  com  endometriose  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12);  (C)  Frequência  de  células  no  FP  de controles e pacientes com endometriose estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12); (D) Comparação entre amostras de sangue e FP de cada grupo. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. *p<0,05, ** p<0,01 e n.s. = não significativa, pelo teste de Mann Whitney/ t não‐pareado (A), Kruskal – Wallis (B), ANOVA (C) e Wilcoxon/ teste t de Student pareado (D), conforme a distribuição das amostras.  4.2.2 Análise da população de Treg dentre os LT totais e LT auxiliares no sangue e FP 

 

Visto que praticamente 100% das células T CD4+CD25hiCD127low são positivas para o 

fator  de  transcrição  Foxp3,  normatizamos  os  valores  encontrados  de  células  Foxp3+  pela 

frequência de células CD3+ e também de CD4+ para encontrarmos o valor mais fidedigno de 

células Treg dentre os linfócitos T totais (LT) e dentre os LT auxiliares das amostras analisadas.  

Dentre os  LT,  as medianas da  frequência de  células Treg em  amostras de  sangue e 

fluido peritoneal são semelhantes entre pacientes com endometriose (em todos os estágios) 

e controles (Figura 4A‐C). Embora não haja diferença estatística, nota‐se que a mediana de 

Treg no sangue do grupo EDT é superior ao grupo CTRL. Para o FP, as  frequências são mais 

similares (Figura 4A). Em todos os grupos estudados, a frequência de células Treg é maior no 

sangue do que no FP  (Figura 4D). Vale  ressaltar que, ao  se  comparar a  frequência dessas 

A  B 

C  D 

43  

células no sangue e a frequência destas no FP, significância estatística só foi atingida para o 

grupo EDT (p=0,0009), mesmo quando dividido em estágios (I/II – p=0,031; III/IV – p=0,013) 

(Figura 4D). 

 

CTRL EDT CTRL EDT0.0

0.2

0.4

0.612345

Sangue FP

n.s. n.s.

% T

reg

em L

T C

D3+

CTRL EDT I/II III/IV0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.52.5

5.0n.s.

n.s.

% T

reg

em L

T C

D3+

n.s.

CTRL EDT I/II III/IV0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5 n.s.n.s.

% T

reg

em L

T C

D3+ n.s.

CTRL EDT I/II III/IV0

1

2

3

4

5sangue

PF

*** *n.s. *

% T

reg

em L

T C

D3+

 Figura  4  ‐  Frequência  de  células  T  reguladoras  (Treg)  em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de pacientes  com  endometriose  e  controles.  (A)  Comparação  da  frequência  das  células  entre  pacientes  com endometriose  (EDT, n=19) e  controles  (CTRL, n=8) no  sangue e  FP;  (B)  Frequência de  células no  sangue de controles (CTRL, n=8) e pacientes com endometriose estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12); (C) Frequência de células no  FP de  controles  e pacientes  com  endometriose  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12);  (D) Comparação  entre amostras de sangue e FP de cada grupo. As células Treg são mostradas como porcentagem de células dentre os linfócitos T CD3+. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. *p<0,05,  *** p<0,001 e n.s. = não significativa, pelo teste de Mann Whitney (A), ANOVA (B e C) e Wilcoxon (D).  

Ao  analisarmos  a  frequência  das  células  Treg  na  população  de  células  CD4+, 

observamos  uma  redução  destas  em  amostras  de  FP  de  pacientes  com  endometriose 

quando comparadas aos controles (p=0,0415) (Figura 5A). Como para a análise da frequência 

de  Treg  na  população  de  linfócitos  CD3+,  há  tendência  ao  aumento  de  Treg  no  sangue  de 

pacientes do grupo EDT, embora  sem  significância estatística. Mais uma vez, o grupo EDT 

mostrou  maior  frequência  de  Treg  no  sangue  que  no  FP  (p=0,0009),  mesmo  quando 

subdividido em estágios I/II e III/IV (p=0,031 e p=0,013, respectivamente) (Figura 5D). 

A  B 

C  D 

44  

CTRL EDT CTRL EDT0.00.30.60.91.21.5

3.5

5.5

7.5

Sangue FP

n.s. *

% T

reg

em L

T C

D4+

CTRL EDT I/II III/IV0

1

2

3

4

5

6

7n.s.

n.s.

% T

reg

em L

T C

D4+

n.s.

CTRL EDT I/II III/IV0.0

0.3

0.6

0.9

1.2n.s.

n.s.

n.s.

% T

reg

em L

T C

D4+

CTRL EDT I/II III/IV0.0

0.4

0.8

1.21.5

4.0

6.5sangue

FP

** *n.s. *

% T

reg

em L

T C

D4+

 Figura  5  ‐  Frequência  de  células  T  reguladoras  (Treg)  em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de pacientes  com  endometriose  e  controles.  (A)  Comparação  da  frequência  das  células  entre  pacientes  com endometriose  (EDT, n=19) e  controles  (CTRL, n=8) no  sangue e  FP;  (B)  Frequência de  células no  sangue de controles (CTRL, n=8) e pacientes com endometriose estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12); (C) Frequência de células no  FP de  controles  e pacientes  com  endometriose  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12);  (D) Comparação  entre amostras de sangue e FP de cada grupo. As células Treg são mostradas como porcentagem de células dentre os linfócitos  T CD4+. Dados mostrados  como mediana  e  intervalo  interquartil.  *p<0,05,  ** p<0,01  e n.s.  = não significativa, pelo teste t não pareado (A), ANOVA (B e C) e t de Student pareado (D).  

A razão FP:sangue pode ser indicativo de migração de células do sangue para o fluido 

peritoneal. Nessas amostras, a razão mostrou‐se diminuída nas pacientes com endometriose 

em todos os estágios, comparadas ao controle (Figura 6 e Tabelas A5 e A6 no apêndice).  

CTRL EDT I/II III/IV0.0

0.4

0.8

1.210

15

20*

**

Raz

ão F

P:sa

ngue

CTRL EDT I/II III/IV0.00.51.01.52.02.5

8

9

10**

**

Raz

ão F

P:sa

ngue

 Figura 6  ‐ Razão entre a  frequência de  células T  reguladoras  (Treg) em amostras de  sangue e a  frequência dessas  em  fluido  peritoneal  (FP)  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19), divididos em estáios  I/II  (n=7) e  III/IV  (n=12) e. As células Treg são mostradas como porcentagem de células dentre as os linfócitos T CD3+ (A) e CD4+ (B). Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. *p<0,05, ** p<0,01e n.s. = não significativa, pelo teste de Mann Whitney. 

A  B 

C  D 

A  B 

45  

Quanto à média de intensidade de fluorescência (MFI) do Foxp3, nenhuma diferença 

foi encontrada intragrupos e intergrupos (Figura 7). 

 

CTRL EDT CTRL EDT0

1000

2000

3000

4000 n. s.n. s.

Sangue FP

MFI

Fox

p3

CTRL EDT I/II III/IV0

500

1000

1500

2000n.s.

n.s.

n.s.

MFI

Fox

p3

CTRL EDT I/II III/IV0

1000

2000

3000

4000n.s.

n.s.

n.s.

MFI

Fox

p3

CTRL EDT I/II III/IV0

1000

2000

3000

4000

sangue

PF

n.s. n.s. n.s. n.s.

MFI

Fox

p3

 Figura 7 – Intensidade de fluorescência média (MFI) do fator de transcrição Foxp3 em células Treg de amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes com endometriose e controles. (A) Comparação do MFI entre pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8)  no  sangue  e  FP;  (B) MFI  no  sangue  de controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12);  (C) MFI  no  FP  de controles e pacientes com endometriose estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12); (D) Comparação entre amostras de sangue e FP de cada grupo. Dados mostrados como mediana e  intervalo  interquartil. n.s. = não significativa, pelo teste t não pareado (A), ANOVA (B e C) e t de Student pareado (D).  

4.3       Células Natural Killer  

 

Para  a  caracterização das diversas populações de  células NK  aqui  avaliadas,  foram 

selecionadas as células na região dos  linfócitos,  identificadas por tamanho e granulosidade, 

seguidas da marcação  com CD45.  Inicialmente,  foi  feita a exclusão de  linfócitos T,  células 

NKT e monócitos  selecionando‐se  células negativas para  a expressão de CD3 e CD14.  Em 

seguida,  células  CD45+CD3‐CD14‐  foram  investigadas  para  a  expressão  de  CD16  e  CD56. 

Foram  analisadas  células  NK  CD56brightCD16‐,  NK  CD56brightCD16+  e  NK  CD56lowCD16+. 

Adicionalmente, a expressão de dois marcadores de maturação/ativação de células NK, as 

A  B 

C  D 

46  

moléculas CD57 e CD161, também foi abordada. A estratégia realizada para a caracterização 

das populações de células NK está ilustrada na Figura 8. 

 

                             

                             

 

Figura 8 – Estratégia de análise de populações de células natural killer (NK). Inicialmente, foram selecionadas células  CD45+  (A).  Dentro  das  células  CD45+,  na  região  dos  linfócitos,  foram  excluídas  as  células  T,  NKT  e monócitos pela seleção de células CD3‐CD14‐ (B). Em seguida, foram selecionadas as populações de células NK pela expressão de CD16 e CD56  (C). Em cada população de célula NK foi avaliada a expressão de CD57  (D) e CD161 (E).              

As Tabelas 4 e 5 resumem os principais resultados encontrados da comparação das 

diferentes populações de células NK analisadas em amostras de sangue e FP dos grupos EDT 

e CTRL. Comparações entre os estágios de EDT podem ser encontradas no apêndice (Tabelas 

A7 e A8). 

C  D 

E 

A  B 

47  

Tabela  4  ‐  Comparação  entre  as  frequências  das  populações  de  células NK  estudadas  no  sangue  de pacientes com endometriose e controles. 

Sangue   CTRL  EDT População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR)  p 

CD56brightCD16‐  1,4 ± 0,9  1,4 (0,8 ‐ 1,7)  2,2 ± 1,4  2,1 (1 ‐ 3)  p=0,13 

CD56brightCD16+  6, 7 ± 13,8   0,88 (0,29 ‐ 7,8)  1,1 ± 1,2  0,8 (0,6 ‐ 1)  p=0,91 

CD56lowCD16+  22,7 ± 15,7   27,3 (4,4 ‐ 36,8)  26,1 ± 17,1   19,9 (12,6 ‐ 42,5)  p=0,63 

CD56brightCD16‐CD57+  20,6 ± 21,1  17,5 (0,22 ‐ 43,3)  29,5 ± 25,2  30,7 (4,5 ‐ 49,4)  p=0,38 

CD56brightCD16+CD57+  19,5 ± 13,6  16,4 (10,6 ‐ 31,8)  47,6 ± 19,07  48 (32,1 ‐ 60)  p=0,0009

CD56lowCD16+CD57+  33,6 ± 23,5   36,1 (8,3 ‐ 52,8)  52,9 ± 20,2  54,5 (43,5 ‐ 68,4)  p=0,03 

CD56brightCD16‐CD161+ 49 ± 26,2  48,4 (43,3 ‐ 59,2)  54,8 ± 27,2  54,4 (31,9 ‐ 82,1)  p=0,61 

CD56brightCD16+CD161+ 47,2 ± 35,4  56 (10,7 ‐ 74,4)  70,9 ± 25,6  78,4 (51,1 ‐ 94,2)  p=‐0,06 

CD56lowCD16+CD161+  43,7 ± 35,3  59,9 (2,4 ‐ 67,2)  64,8 ± 32,6  68,8 (45,7 ‐ 93,8)  p=0,14 Valores apresentados como frequência de células (%). CTRL= controle, EDT= endometriose, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil. Valor de p calculado pelo teste t pareado/Mann Whitney, conforme apropriado.   Tabela  5  ‐  Comparação  entre  as  frequências  das  populações  de  células  NK  estudadas  no  fluido peritoneal de pacientes com endometriose e controles. 

Fluido Peritoneal  CTRL  EDT População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR)  p 

CD56brightCD16‐  11,4 ± 14,5  4,5 (1,9 ‐ 19,9)  9,9 ± 13,4  4,4 (1,5 ‐ 12,3)  p=0,7982

CD56brightCD16+  0,32 ± 0,27  0,27 (0,08 ‐ 0,56)  0,54 ± 0,93  0,19 (0,09 ‐ 0,5)  p=0,8316

CD56lowCD16+  10,2 ± 6,8   8,8 (6,4 ‐ 11,9)  10,3 ± 10,4   5,3 (2,4 ‐ 15,9)  p=0,9754

CD56brightCD16‐CD57+  18,9 ± 17,5  14,5 (2,5 ‐ 36,5)  24,9 ± 25,4  15,8 (4,4 ‐ 49,9)  p=0,5423

CD56brightCD16+CD57+  25,7 ± 24,6  29,3 (0 ‐ 41,3)  45,9 ± 34,8  50 (13,2 ‐ 77,8)  p=0,1501

CD56lowCD16+CD57+  33,6 ± 21,7  34,8 (17,9 ‐ 48,7)  49 ± 25,6  57,6 (24,2 ‐ 65,9)  p=0,1513

CD56brightCD16‐CD161+ 69,9 ± 8,84  71,7 (62,7 ‐ 74,5)  62,9 ± 28,8  71,4 (42,8 ‐ 85,3)  p=0,2096

CD56brightCD16+CD161+ 55 ± 39,6  56,9 (11,1 ‐ 95,5)  58 ± 40,4  73,4 (0 ‐ 97,2)  p=0,8629

CD56lowCD16+CD161+  57,6 ± 27,7   66,1 (43 ‐ 78)  65,4 ± 31,7  82,4 (36,9 ‐ 88,2)  p=0,5480Valores apresentados como frequência de células (%). CTRL= controle, EDT= endometriose, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil. Valor de p calculado pelo teste t pareado/Mann Whitney, conforme apropriado.   

A  análise  das  populações  de  NK  CD56brightCD16‐,  NK  CD56brightCD16+  e  NK 

CD56lowCD16+ não mostrou diferenças  entre os  grupos de pacientes  com  endometriose  e 

controles nessa coorte de pacientes (Figura 9).  

48  

CD56bright CD16- CD56bright CD16+ CD56lowCD16+

0123455

254565

n.s. n.s. n.s.%

de

célu

las

CD56bright CD16- CD56bright CD16+ CD56lowCD16+

0123455

254565

EDT

CTRL

n.s. n.s. n.s.

% d

e cé

lula

s

 Figura  9  ‐  Frequência  de  células  Natural  Killer  (NK)  CD56brightCD16‐,  CD56brightCD16+  e  CD56lowCD16+  em amostras de sangue (A) e fluido peritoneal (B) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8). As células NK são mostradas como porcentagem de células dentre as células CD3‐CD14‐. Dados mostrados como mediana e  intervalo  interquartil. n.s. = não significativa, pelo teste t de Student não pareado/ teste de Mann Whitney, quando apropriado.  

Quando comparamos a frequência das populações estudadas em amostras de sangue 

e FP dentro dos grupos, é possível observar uma maior frequência de células CD56brightCD16‐ 

no FP que no sangue de controles (p=0,023) e de pacientes com endometriose (p=0,0058), 

que  se mantém   em pacientes do estágio  I/II  (p=0,046). O grupo de EDT  III/IV não atingiu 

significância  estatística  para  esse  parâmetro  (p=0,052),  embora mostrasse,  também,  uma 

tendência à maior frequência dessas células no FP do que no sangue (Figura 10A).  

As  outras  duas  populações  de  células  NK  estudadas,  células  CD56brightCD16+  e 

CD56lowCD16+, entretanto, estão presentes em maior frequência no sangue do que no FP em 

todos  os  grupos  analisados.  A  frequência  de  células  NK  CD56brightCD16+  mostrou‐se 

significantemente  aumentada  apenas  no  sangue  de  pacientes  com  EDT  I/II  (p=0,034) 

comparado  ao  FP.  Não  foram  encontradas  diferenças  significativas  quanto  à  frequência 

dessas  células  nas  pacientes  dos  grupos  EDT  (p=0,055),  EDT  III/IV  (p=0,4238)  e  CTRL 

(p=0,0781)  (Figura  10B).  A  análise  das  células  NK  CD56lowCD16+  mostrou  diferenças 

significativas  entre  a  frequência  dessas  células  no  sangue  e  FP  de  todos  os  grupos  (EDT: 

p=0,003; EDT I/II: p=0,005; EDT III/IV: p=0,021; e CTRL: p=0,039) (Figura 10C). 

 

A  B 

49  

CTRL EDT I/II III/IV02468

1010305070 *** * n.s.

% C

D56

brig

htC

D16

-

CTRL EDT I/II III/IV0

2

4

610203040

n.s.n.s.n.s. *

% C

D56

brig

htC

D16

+

CTRL EDT I/II III/IV0

10

20

30

40

50

60

70

FPSangue

**** ** *

% C

D56

low

CD

16+

 Figura 10 – Comparação da frequência de células Natural Killer (NK) CD56brightCD16‐ (A), CD56brightCD16+ (B) ou CD56lowCD16+  (C) entre amostras de  sangue e  fluido peritoneal  (FP) de pacientes  com endometriose  (EDT, n=19) e controles  (CTRL, n=8). As células NK são mostradas como porcentagem de células dentre as células CD3‐CD14‐.  Dados mostrados  como mediana  e  intervalo  interquartil.  I/II  (n=7),  endometriose mínima/leve; III/IV  (n=12), endometriose moderada/grave; *p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 e n.s. = não significativa, pelo teste t de Student pareado (A e C) ou pelo teste de Mann Whitney (B).  

A  análise  da  expressão  do  marcador  CD57  nas  células  NK  estudadas  revelou 

diferenças na frequência de células CD57+ entre o grupo de pacientes com endometriose e 

controles (Figura 11A e C). A frequência de células NK CD56brightCD16+ que expressam  CD57 

mostrou‐se  elevada  no  sangue  de  pacientes  com  endometriose,  comparadas  com  as 

pacientes  do  grupo  CTRL  (p=0,0009),  inclusive  quando  as  pacientes  do  grupo  EDT  foram 

subdivididas  em  estágios  de  doença  (p=0,0045).  Um  aumento  na  frequência  de  células 

CD57+ nas células NK CD56lowCD16+ também foi constatado no sangue de pacientes com EDT 

(p=0,039). Não foram observadas diferenças entre a frequência de células CD57+ em células 

NK CD56brightCD16‐ presentes no sangue de pacientes com EDT e CTRL, ou na frequência de 

células NK CD56brightCD16‐, CD56brightCD16+ e CD56lowCD16+ no FP. 

A análise da frequência de células positivas para o marcador CD161 nas populações 

de células NK estudadas não mostrou diferenças em amostras de sangue e FP comparando‐

se o grupo de pacientes com endometriose e controles (Figura 11 B e D). 

A  B 

C 

50  

CD56bright CD16- CD56brightCD16+ CD56lowCD16+

0

20

40

60

80

100 n.s. *** *%

CD

57+

CD56brightCD16- CD56bright CD16+ CD56lowCD16+

0

20

40

60

80

100

n.s. n.s. n.s.

EDT

CTRL

% C

D16

1+

 

CD56brightCD16- CD56brightCD16+ CD56lowCD16+

0

20

40

60

80

100

n.s. n.s. n.s.

% C

D57

+

CD56bright CD16- CD56bright CD16+ CD56lowCD16+

0

20

40

60

80

100

n.s. n.s. n.s.

% C

D16

1+

 Figura 11 ‐ Frequência de células Natural Killer (NK) CD56brightCD16‐, CD56brightCD16+ e CD56lowCD16+ positivas para os marcadores CD57 e CD161 em amostras de sangue (A e B) e fluido peritoneal (C e D) de pacientes com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8).  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo interquartil. *p<0,05, *** p<0,001 e n.s. = não significativa, pelo teste t de Student não pareado.  

Não  foram encontradas diferenças quanto à expressão do marcador CD57 entre as 

amostras  de  sangue  e  FP  de  cada  grupo  em  nenhuma  população  de  célula NK  estudada 

(Figura 12 A, C e E).  

As células CD56brightCD16‐CD161+ apresentaram‐se em maior frequência no FP que no 

sangue de pacientes do grupo controle (p=0,036). Embora fosse observada maior frequência 

de células CD161+ no FP comparado com o sangue dos grupos EDT e III/IV, a diferença não 

foi significativa  (Figura 12B). Curiosamente, a situação parece estar  invertida em pacientes 

do grupo  I/II, nas quais as células CD161+ encontram‐se mais frequentes no sangue que no 

FP. Um quadro contrário é visto nas células CD56brightCD16+, as quais apresentaram maior 

frequência de células CD161+ no sangue que no FP; dado significante apenas para o grupo de 

pacientes  I/II  (p=0,0487)  (Figura  12D).  Não  foram  encontradas  diferenças  significativas 

quanto à frequência de células CD56brightCD16+CD161+  nas pacientes dos grupos EDT, III/IV e 

CTRL. Diferentemente do padrão observado no restante dos grupos, as pacientes do grupo 

III/IV aparentam ter mais células CD56brightCD16+CD161+ no FP, comparado ao sangue (Figura 

A  B 

C  D 

51  

12F). A expressão de CD161 nas células CD56lowCD16+ também não mostrou diferenças entre 

as amostras e entre os grupos.  

 

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80n.s. n.s. n.s. n.s.

% C

D57

+

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100sangue

PF

n.s. n.s. n.s.*

% C

D16

1+

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100n.s.n.s.n.s.n.s.

% C

D57

+

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100n.s.*n.s.n.s.

sangue

FP

% C

D16

1+

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100 n.s.n.s.n.s.n.s.

% C

D57

+

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100n.s.n.s.n.s.n.s.

sangue

FP

% C

D16

1+

 Figura 12 ‐ Comparação da frequência de células Natural killer (NK) CD56brightCD16‐ (A e B), CD56brightCD16+ (C e D) e CD56lowCD16+ (E e F) positivas para os marcadores CD57 e CD161 entre amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8). Dados mostrados como mediana  e  intervalo  interquartil.  I/II  (n=7),  endometriose  mínima/leve;  III/IV  (n=12),  endometriose moderada/grave; *p<0,05 e n.s. = não significativa, pelo teste t de Student pareado.  

Não foram encontradas diferenças entre a razão de células presentes no FP e células 

no sangue de nenhuma das populações estudadas  (apêndice – Tabelas A9 e A10 e Figuras 

A12‐A14). 

 

 

A  B 

C  D 

E  F 

52  

4.4       Células Supressoras Mieloides (MDSC)  

A estratégia para a caracterização de MDSC a partir dos marcadores de superfície foi 

realizada  como  segue:  foi  selecionada  a  população  celular  positiva  para  CD45,  que 

corresponde às células hematopoiéticas,  seguida da exclusão de populações com  fenótipo 

de  linfócitos T e B, células NK e NKT, monócitos e células apresentadoras de antígenos, a 

partir da seleção de células Lin1‐HLA‐DR‐. Em seguida, dentre as células CD45+Lin1‐HLA‐DR‐, 

foram selecionadas as células que expressam as moléculas CD11b e CD33. Essas células são 

aqui referidas como MDSC. Na sequência, foi avaliada a expressão dos marcadores CD15 e 

de CD34 na superfície das células MDSC. A estratégia realizada para a caracterização dessas 

células está ilustrada na Figura 13. 

Como  a  presença  de  células  MDSC  ainda  não  foi  avaliada  em  pacientes  com 

endometriose,  e  para  comprovação  de  que  a  estratégia  de  caracterização  dessas  células 

pode também ser aplicada para as amostras de fluido peritoneal e sangue dessas pacientes, 

iniciamos a identificação e caracterização de células com fenótipo Lin1‐HLA‐DR‐CD11b+CD33+ 

em amostras de medula óssea de pacientes com mieloma múltiplo  (n=2); esses pacientes, 

sabidamente,  possuem  altas  frequências  dessas  células  no  sangue  comparados  com 

indivíduos  saudáveis  (50).  Após  a  comprovação  da  identificação  de MDSC  (Lin1‐HLA‐DR‐

CD11b+CD33+) em pacientes com mieloma múltiplo, utilizou‐se a mesma estratégia para a 

identificação destas células em pacientes com endometriose.  

 

53  

                          

                          

Figura 13  ‐ Estratégia de análise de células supressoras mieloides  (MDSC).  Inicialmente,  foram selecionadas células CD45+ (A). Dentro das células CD45+, foram selecionadas as células HLA‐DR‐Lin1‐ (B). Em seguida, foram selecionadas as células CD11b+CD33+ (C) e nesta população, foi avaliada a expressão de CD15 e CD34 (D).              

Devido  à  heterogeneidade  de  populações  de  MDSC,  analisamos  as  células 

supressoras  mieloides  de  quatro  fenótipos  distintos:  CD11b+CD33+,  CD11b+CD33+CD34+, 

CD11b+CD33+C15+ e CD11b+CD33+CD34+CD15+. A frequência de células CD11b+CD33+C15+ e 

CD11b+CD33+CD34+CD15+  foi  extremamente  baixa  nas  amostras  das  pacientes  incluídas 

nesse estudo e não foram comprovadas diferenças entre os grupos (EDT versus CTRL ou I/II e 

III/IV versus CTRL), ou entre amostras estudadas  (sangue versus FP em cada grupo)  (dados 

não  mostrados).  Por  esta  razão,  estas  populações  não  serão  abordadas  nesse  texto.  A 

comparação  entre  média  e  mediana  das  frequências  de  MDSC  CD11b+CD33+e 

CD11b+CD33+CD34+  no  sangue  e  FP  de  pacientes  com  endometriose  e  controles  está 

resumida na Tabela 6. Comparações entre os estágios de EDT podem  ser encontradas no 

apêndice (Tabela A11). 

 

 

 

 

A  B 

C  D 

54  

 

Tabela 6 ‐ Frequências de células supressoras mieloides no sangue e fluido peritoneal de pacientes com endometriose e controles. 

CTRL  EDT   

População  Média ± DP  Mediana (IQR) Média ± DP  Mediana (IQR)  p CD11b+CD33+ 

(sangue) 0,09 ± 0,09  0,7 (0 ‐ 0,18)  0,24 ± 0,19  0,19 (0,11 ‐ 0,4)  p=0,0624

CD11b+CD33+CD34+ 

(sangue) 0,037 ± 0,054  0,02 (0‐ 0,06)  0,142 ± 0,137  0,11 (0,05 ‐ 0,22)  p=0,0417

CD11b+CD33+   

(FP) 0,4 ± 0,74  0,13 (0,04 ‐ 0,26) 0,1 ± 0,1  0,07 (0,02 ‐ 0,16)  p=0,3693

CD11b+CD33+CD34+  

(FP) 0,146 ± 0,325  0,01 (0,01 ‐ 0,08) 0,055 ± 0,063  0,03 (0‐ 0,09)  p=0,7049

Valores apresentados como  frequência de células  (%). CTL=controle, EDT= endometriose, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, FP = Fluido Peritoneal. Valor de p calculado pelo teste de Mann Whitney.  

Os  resultados  encontrados  quanto  às  células  MDSC  CD11b+CD33+e 

CD11b+CD33+CD34+ foram bastante semelhantes. Ambas as populações estudadas parecem 

estar mais  frequentes em amostras de sangue de pacientes com endometriose do que de 

controles. No entanto, esse dado  só  foi  confirmado para a população CD11b+CD33+CD34+ 

(p=0,04). No  FP,  há  tendência  a menor  frequência  de  células  CD11b+CD33+  em  pacientes 

com EDT, embora a diferença não seja  significante  (p=0,36)  (Figura 14). Quanto às células 

CD11b+CD33+CD34+, a frequência de células é extremamente baixa no FP, com mediana de 

0% para o grupo CTRL (Tabela 6).  

CTRL EDT CTRL EDT0.00

0.25

0.50

0.751.52.02.5 n.s. n.s.

Sangue FP

% C

D11

b+ CD

33+

CTRL EDT CTRL EDT0.00.10.20.30.40.50.8

1.0 * n.s.

Sangue FP

% C

D11

b+ CD

33+ C

D34

+

 Figura 14  ‐ Frequência de células supressoras mieloides  (MDSC) CD11b+CD33+  (A) e CD11b+CD33+CD34+  (B) em amostras de sangue e  fluido peritoneal de pacientes com endometriose  (EDT, n=19) e controles  (CTRL, n=8). As células MDSC são mostradas como porcentagem de células dentre os leucócitos totais (CD45+). Dados mostrados  como mediana  e  intervalo  interquartil.  *p<0,05,  e  n.s.  =  não  significativa,  pelo  teste  de Mann Whitney. 

 

Ao dividirmos o grupo EDT de acordo com o estagiamento da doença, observamos 

em  ambas  as  populações  de MDSC  um  aumento  na  frequência  de  células  no  sangue  de 

A  B 

55  

pacientes  com  EDT  I/II,  comparadas  com  controles  (Figura  15).  Não  há  diferenças 

comparando‐se amostras de sangue de pacientes do grupo III/IV com controles, ou entre a 

frequência das populações de MDSC em amostras de FP de pacientes dos grupos I/II e III/IV, 

comparados com controles. Entretanto, é possível constatar uma diferença na frequência de 

células CD11b+CD33+ entre os pacientes do grupo  I/II e  III/IV; o grupo  III/IV tem frequência 

muito menor (p=0,009) de células do que o I/II, cuja frequência é semelhante ao grupo CTRL. 

Para a população CD11b+CD33+CD34+, a frequência do grupo I/II permanece maior do que os 

outros grupos, entretanto, o grupo CTRL  tem  frequência  reduzida, mais próxima ao grupo 

III/IV (Figura 15). 

CTRL I/II III/IV0.0

0.2

0.4

0.6

0.8 n.s.*

n.s.

% C

D11

b+ CD

33+

CTRL I/II III/IV0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6n.s.

n.s.*%

CD

11b+ C

D33

+ CD

34+

CTRL I/II III/IV0.0

0.1

0.2

0.3

0.41.52.02.5 **

n.s.n.s.

% C

D11

b+ CD

33+

CTRL I/II III/IV0.00.10.20.30.40.50.8

1.0n.s.

n.s.n.s.

% C

D11

b+ CD

33+ C

D34

+

 Figura  15  ‐  Frequência  de  células  supressoras mieloides  (MDSC)  CD11b+CD33+  e  CD11b+CD33+CD34+  em amostras de sangue  (A e B) e  fluido peritoneal  (C e D) de pacientes com endometriose  subagrupados em estágios I/II (n=7) e III/IV (n=12), e controles (CTRL, n=8). As células MDSC são mostradas como porcentagem de  células  dentre  os  leucócitos  totais  (CD45+).  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo  interquartil. *p<0,05, ** p<0,01,  e n.s. = não significativa, pelo teste de Mann Whitney.  

A comparação de amostras de sangue e FP entre os grupos mostrou maior frequência 

de MDSC CD11b+CD33+ e CD11b+CD33+CD34+ no sangue do que no FP dos grupos EDT e III/IV 

(p=0,0038  e  p=0,0033  para  o  grupo  EDT,  respectivamente,  e  p=0,024  e  p=0,0007  para  o 

grupo  III/IV,  respectivamente). O  grupo  I/II  não  apresentou diferenças  significativas  entre 

amostras  de  sangue  e  FP,  apesar  de  haver  uma  tendência  na  observação  de  maior 

C 

A  B 

D 

56  

frequência  células  no  sangue,  principalmente  para  a  população  CD11b+CD33+(p=0,07).  O 

grupo CTRL também não mostrou diferenças entre as amostras, entretanto, há tendência a 

maior frequência de células CD11b+CD33+ no FP que no sangue (p=0,09) (Figura 16). 

CTRL EDT I/II III/IV0.0

0.2

0.4

0.6

1.5

2.0

2.5 **n.s. * n.s.

sangue

FP%

CD

11b+ C

D33

+

CTRL EDT I/II III/IV0.00.10.20.30.40.5

0.8

1.0

sangue

FP

n.s. ** ** n.s.

% C

D11

b+ CD

33+ C

D34

+

 Figura  16  ‐  Comparação  da  frequência  de  células  supressoras  mieloides  (MDSC)  CD11b+CD33+  (A)  e CD11b+CD33+CD34+  (B) entre amostras de  sangue e  fluido peritoneal  (FP) de pacientes  com endometriose (EDT, n=19), divididas  em  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV  (n=12),  e  controles  (CTRL, n=8). As  células MDSC  são mostradas como porcentagem de células dentre os leucócitos totais (CD45+). Dados mostrados como mediana e  intervalo  interquartil.  I/II  (n=7),  endometriose mínima/leve;  III/IV  (n=12),  endometriose moderada/grave; *p<0,05, ** p<0,01e n.s. = não significativa, pelo teste de Wilcoxon.  

Não foi possível calcular a razão de células no FP pela razão de células no sangue das 

pacientes devido ao grande número de pacientes com 0% de MDSC no sangue. 

 

4.5       Análise do perfil de células dendríticas  

Utilizando o mesmo painel de  caracterização de MDSC,  as  células dendríticas  (DC) 

HLA‐DR+Lin1‐ foram selecionadas. Foi avaliada também a frequência de DC que expressam os 

marcadores CD11b e CD33 (Figura 17).  

 

A 

B 

57  

 Figura 17 ‐ Estratégia de análise para avaliação de células dendríticas (DC). Inicialmente, foram selecionadas células CD45+ (A). Dentro das células CD45+, foram selecionadas as células HLA‐DR+Lin1‐, que correspondem às células dendríticas (B) e nesta população, foi avaliada a expressão de CD11b e CD33 (C).         

 

Foram analisados o  fenótipo geral de células dendríticas  (Lin‐HLA‐DR‐), a  frequência 

de  DC  mieloides  (CD33+)  e  a  frequência  de  DC  mieloides  positivas  e  negativas  para  o 

marcador CD11b. A comparação entre média e mediana das frequências de populações de 

DC no sangue e FP de pacientes com endometriose e controles está resumida na Tabela 7. As 

comparações entre a  frequência das populações de DC entre pacientes EDT de diferentes 

estágios podem ser encontradas no apêndice (Tabela A12).  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

A  B 

C 

58  

Tabela 7 – Comparação da frequência de células dendríticas no sangue e fluido peritoneal de pacientes com endometriose e controles. 

CTRL  EDT   

População  Média ± DP  Mediana (IQR) Média ± DP  Mediana (IQR)  p DC  

(sangue) 0,14 ± 0,07  0,14 (0,09 ‐ 0,22) 0,6 ± 1,16  0,39 (0,19 ‐ 0,44)  p=0,016

DC  (FP) 

7,22 ± 5,44  6,1 (1,7 ‐ 14)  4,95 ± 5,4  1,08 (0,08 ‐ 9,9)  p=0,148

DC CD33+   

(sangue) 34,6 ± 22,3  37,6 (13,1 ‐ 49,9) 43,7 ± 34,5  29,4 (10,1 ‐ 75,6)  p=0,5 

DC CD33+   (FP) 

73,9 ± 35,6  91,3 (49,8 ‐ 94,8) 58,6 ± 37,4  71,5 (16,9 ‐ 87,7)  p=0,334

DC CD33+CD11b+  

(sangue) 1,47 ± 1,85  1,08 (0 ‐ 2,12)  1,74 ± 2,3  1 (0,39 ‐ 2,35  p=0,785

DC CD33+CD11b+  

(FP) 79,8 ± 24,7   89 (83,4 ‐ 90,7)  42,7 ± 34,7  51,4 (0,05 ‐ 72,5)  p=0,01 

DC CD33+CD11b‐  

(sangue) 37,9 ± 19,4  38,9 (25,2 ‐ 53,1) 42,1 ± 34  29,4 (10,1 ‐ 74,5)  p=0,778

DC CD33+CD11b‐  

(FP) 4,6 ± 3,9  3,6 (2,9 ‐ 4,3)  19,1 ± 21,4  10,9 (1,4 ‐ 30,7)  p=0,092

Valores apresentados como  frequência de células  (%). CTL=controle, EDT= endometriose, DC = célula dendrítica, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, FP = Fluido Peritoneal. Valor de p calculado pelo teste t de Student não pareado/Mann Whitney, quando apropriado.  

A  frequência  de  DC  (Lin‐HLA‐DR‐)  está  aumentada  no  sangue  de  pacientes  com 

endometriose, comparadas com controles (p= 0,01). Quando as pacientes do grupo EDT são 

subdivididas em estágios de doença  I/II e  III/IV, essa diferença é mantida apenas no grupo 

III/IV  (Figura 18A). Não  foram encontradas diferenças entre  a  frequência de DC no  FP de 

pacientes com endometriose (em todos os estágios) e controles (Figura 18B). 

Comparando‐se a frequência de Lin‐HLA‐DR‐ em amostras de sangue e FP dentro dos 

grupos,  observamos  maior  frequência  em  amostras  de  FP  de  pacientes  do  grupo  EDT 

(p=0,03)  e  em  controles  (p=0,01)  (Figura  18C).  Apesar  de  haver  uma  tendência  à maior 

frequência de DC no FP que no sangue de pacientes dos grupos I/II e III/IV, a diferença não 

foi significativa (p=0,57 e p=0,05, respectivamente). 

A razão existente entre a frequência de DC no FP pela frequência destas no sangue 

de  cada  paciente  é menor  em  pacientes  com  endometriose  que  em  controles  (p=0,01). 

Comparando‐se  os  grupos  de  endometriose  com  controles,  o  grupo  I/II mostrou  redução 

significante da razão FP:sangue (p=0,03) (Figura 18D). 

 

59  

CTRL EDT I/II III/IV0.00.20.40.60.81.0

4

5

6 *n.s. *

% D

C

CTRL EDT I/II III/IV0

5

10

15 n.s.n.s.

n.s.

% D

C

CTRL EDT I/II III/IV

0

3

6

9

12

15sangue

PF

** n.s. n.s.

% D

C

CTRL EDT I/II III/IV0

50

100

150 **

n.s.

Raz

ão F

P:sa

ngue

 Figura  18  ‐  Frequência  de  células  dendríticas  (DC)  em  amostras  de  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de pacientes com endometriose  (EDT, n=19), subagrupadas em estágios  I/II  (n=7) e  III/IV  (n=12), comparadas com controles (CTRL, n=8). Mostradas estão a frequência de DC no sangue (A) e FP (B) dos grupos estudados, a comparação entre as  frequências em amostras de sangue e FP  (C) e a razão existente entre a  frequência de células no FP pela frequência de células no sangue de cada  indivíduo (D). As células DC são mostradas como porcentagem  de  células  dentre  os  leucócitos  totais  (CD45+).  Dados mostrados  como mediana  e  intervalo interquartil. I/II (n=7), endometriose mínima/leve; III/IV (n=12), endometriose moderada/grave; *p<0,05 e n.s. = não significativa, pelos testes de Mann Whitney (A, B e D) e Wilcoxon (C).  

Não  foram  encontradas  diferenças  na  frequência  de  mDC  entre  pacientes  com 

endometriose (todos os estágios) e controles em amostras de sangue ou FP (Figura 19A e B). 

Assim como o que ocorre para DC, a frequência de mDC é maior no FP do que no sangue dos 

vários  grupos  (Figura  19C).  Essa  diferença  foi  significante  apenas  para  o  grupo  CTRL 

(p=0,006)  (Figura  19D).  A  avaliação  da  razão  entre  a  frequência  de  mDC  no  FP  pela 

frequência  de  células  no  sangue  não  mostrou  diferenças  entre  os  grupos  (dados  não 

mostrados). 

A  B 

C  D 

60  

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100n.s.

n.s.n.s.

% D

C C

D33

+

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100n.s.

n.s.n.s.

% D

C C

D33

+

CTRL EDT I/II III/IV

0

20

40

60

80

100sangue

PF

n.s.** n.s. n.s.

% D

C C

D33

+

CTRL EDT I/II III/IV012348

12162024

n.s.n.s.

n.s.

Raz

ão F

P:sa

ngue

 

Figura 19 ‐ Frequência de células dendríticas CD33+ (mDC) em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes com endometriose  (EDT, n=19), subagrupadas em estágios  I/II  (n=7) e  III/IV  (n=12), comparadas com controles (CTRL, n=8). Mostradas estão a frequência de DC no sangue (A) e FP (B) dos grupos estudados, a comparação entre as  frequências em amostras de sangue e FP  (C) e a razão existente entre a  frequência de células no FP pela frequência de células no sangue de cada  indivíduo (D). As células DC CD33+ são mostradas como  porcentagem  de  células  dentre  as  DC  (Lin‐HLA‐DR‐).  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo interquartil.  I/II  (n=7), endometriose mínima/leve;  III/IV  (n=12), endometriose moderada/grave; ** p<0,01 e n.s. = não significativa, pelos testes t de Student não pareado (A, B e D) e (C).  

A seguir, analisamos a frequência de DC CD33+CD11b+ e CD33+CD11b‐. Ao investigar a 

distribuição  de  DC  CD33+  CD11b+  e  CD11b‐,  percebemos  que  o  padrão  de  distribuição  é 

diferente em  amostras de  sangue e  FP; enquanto no  sangue  a  grande maioria de mDC é 

CD11b‐, no FP, a maioria torna‐se CD11b+ (Figura 20A). 

A  B 

C  D 

61  

sangue FP0

20

40

60

80

100

CD11b+CD11b-

%

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100

CD11b+CD11b-

%CTRL EDT I/II III/IV

0

20

40

60

80

100

CD11b+CD11b-

%

 

Figura  20  ‐  Distribuição  de  células  CD11b+  e  CD11b‐  em  células  dendríticas  CD33+  do  sangue  e  fluido peritoneal (FP) das pacientes com endometriose e controle. Estão mostradas a média da frequência de células de cada população de todos os grupos estudados, calculadas dentro do total de células dendríticas CD33+(A), além da distribuição das populações em amostras de sangue (B) e FP (C) dentro de cada grupo de pacientes. CTRL=controle  (n=8),  EDT  =  endometriose  (n=12),  I/II  =  endometriose  leve/moderada  (n=7),  III/IV  = endometriose moderada/grave (n=12).  

A análise da Figura 20 já indica que não há grande diferenças entre os grupos quanto 

às populações CD11b+ e CD11b‐ no sangue, mesmo quando o grupo EDT é dividido de acordo 

com  o  estagiamento.  A  frequência  de  células  CD33+CD11b+  no  FP,  no  entanto,  foi 

significativamente  menor  em  pacientes  com  EDT,  comparadas  com  controles  (p=0,01) 

(Figura 21D). A subdivisão das pacientes de acordo com o estagiamento da doença também 

revelou menor  frequência de DC no FP, comparadas com controles  (p=0,02 e p=0,04 para 

estágios I/II e III/IV, respectivamente). Quanto à população CD33+CD11b‐, apesar de não ter 

sido  comprovada  significância  estatística,  há  um  visível  aumento  na  frequência  dessas 

células no FP de pacientes com endometriose, comparadas com controles (EDT: p=0,09, I/II: 

p=0,05, III/IV: p=0,16) (Figura 21D). 

A comparação entre a frequência dessas células em amostras de sangue e FP  indica 

que as DC CD33+CD11b+ estão muito mais frequentes em amostras de FP do que de sangue, 

em  todos os grupos  (EDT: p=0,0001,  I/II: p=0,01,  III/IV: p=0,004 e CTRL: p=0,0001)  (Figura 

21E). Conforme  já mostrado na  Figura  20, o  oposto  é  visto para  as  células CD33+CD11b‐, 

muito mais  frequentes em amostras de sangue do que FP  (EDT: p=0,01,  I/II: p=0,37,  III/IV: 

p=0,03 e CTRL: p=0,008) (Figura 21F). 

A  B 

C 

62  

Não foram encontradas diferenças entre os grupos quanto à razão dessas células no 

FP e no sangue (dados não mostrados). 

CTRL EDT I/II III/IV0

2

4

6

8

10n.s.

n.s.n.s.

% D

C C

D33

+ CD

11b+

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100n.s.

n.s.n.s.

% D

C C

D33

+ CD

11b-

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100**

**

% D

C C

D33

+ CD

11b+

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80n.s.

n.s.n.s.

% D

C C

D33

+ CD

11b-

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100sangue

PF

*** ***** *

% D

C C

D33

+ CD

11b+

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100sangue

PF

* *** n.s.

% D

C C

D33

+ CD

11b-

 

Figura 21  ‐ Frequência de células dendríticas  (DC) CD33+ CD11b+ e CD11b‐ em amostras de sangue e  fluido peritoneal  (FP)  de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19),  subagrupadas  em  estágios  I/II  (n=7)  e  III/IV (n=12), comparadas com controles (CTRL, n=8). Mostradas estão a frequência de DC no sangue (A e B) e FP (C e D) dos grupos estudados e a comparação entre as frequências em amostras de sangue e FP (E e F). Os dados são mostrados como frequência de DC CD11b+ e CD11b‐ é mostrada como frequência de células dendríticas Lin‐

HLA‐DR‐. Dados mostrados como mediana e  intervalo  interquartil. I/II (n=7), endometriose mínima/leve; III/IV (n=12), endometriose moderada/grave; *p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 e n.s. = não significativa, pelos testes t de Student não pareado (A, B e D) e pareado (C).  

 

 

 

A  B 

C  D 

E  F 

63  

4.6 Quantificação de citocinas pró e anti‐inflamatórias   

A quantificação das citocinas  IL‐2,  IL‐4.  IL‐6,  IL‐10,  IL‐12,  IL‐17, TNF‐α,  IFN‐γ e TGF‐β 

foi  investigada  em  amostras  de  sangue  e  FP  de  pacientes  com  e  sem  endometriose. Os 

resultados estão resumidos na Tabela 8. 

Tabela 8 – Avaliação de citocinas no sangue e fluido peritoneal de pacientes com endometriose, divididas em estágios I/II e III/IV, e controles.       CTRL  EDT  I/II  III/IV 

Citocina (pg/mL)  Amostra  N  Mediana (IQR)  N  Mediana 

(IQR)  N  Mediana (IQR)  N  Mediana (IQR) 

IL‐2 FP  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15 sg  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15 

IL‐4 FP  ‐  < 15  1  18,59  ‐  < 15  1  18,59 sg  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15 

TNF‐α FP  ‐  < 15  1  22  ‐  < 15  1  22 sg  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15 

IFN‐γ FP  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15 

sg  2  18 (15‐22)  ‐  < 15  ‐  < 15  ‐  < 15 

IL‐10  FP  2  22 (20‐25)  6  30(21‐158)  3  24 (23‐264)  3  37(18‐123) sg  ‐  < 17  ‐  < 17  ‐  < 17  ‐  < 17 

IL‐6 FP  7  43(40‐117)  15  52(43‐138)  5  94 (44‐573)  10  52(41‐ 136) sg  1  20  ‐  < 16  ‐  < 16  ‐  < 16 

IL‐17 FP  2  13 (9‐17)  2  70 (9‐131)  2  70 (9‐131)  ‐  < 4 sg  4  14 (8,5‐25)  3  15 (10‐24)  1  15  2  17 (10‐24) 

TGF‐β FP  6  815 (450‐2947)  15  849 (652‐

1561)  6  1097 (684‐1753)  9  800 (522‐1832) 

sg  8  1425 (565‐2358)  16  1529 (895‐4655)  4  3165 (1005‐

5931)  12  1529 (804‐2533) 

IL‐12 FP  6  185 (105‐551)  17  201 (58‐368)  6  148 (37‐295)  11  201 (66‐466) 

sg  8  3924 (684‐8286)  19  987 (491‐1833)  7  856 (645‐

1050)  12  1172 (468‐4119) 

CTRL  =  controle,  EDT  =  endometriose;  I/II  =  endometriose mínima/leve,  III/IV=  endometriose moderada/grave,  N  = número amostral, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, FP = Fluido Peritoneal.  

Os  níveis  das  citocinas  anti‐inflamatórias  IL‐4  e  IL‐10,  além  da  citocina  pró‐

inflamatória  TNF‐α,  estavam  abaixo  do  limite  de  detecção  do método  em  amostras  de 

sangue das pacientes estudadas. Não foi possível quantificar a IL‐2 em nenhuma amostra de 

sangue ou FP estudadas, pois todas as quantificações estavam abaixo dos níveis de detecção 

do kit. 

Foi  possível  quantificar  TNF‐α  e  IL‐4  no  FP  de  apenas  uma  paciente  com 

endometriose  (uma paciente com EDT estágio  IV), pois  todas as quantificações dos outros 

pacientes estavam abaixo do limite de detecção do kit. 

64  

A quantificação de  IL‐10  foi possível apenas no FP de 8 pacientes: 3 pacientes com 

endometriose  I/II, 3 com EDT  III/IV e 2 controles, visto que as demais estavam abaixo dos 

níveis de detecção do  kit. Apenas duas pacientes  com endometriose  I/II e duas  controles 

apresentaram  níveis  de  IL‐17A  no  FP.  No  sangue,  essa  citocina  foi  detectada  em  quatro 

mulheres do grupo EDT, duas do grupo III/IV e uma com EDT I/II. A citocina pró‐inflamatória 

IFN‐γ foi detectada apenas em amostras de sangue de duas pacientes do grupo CTRL. Para o 

restante das amostras, as citocinas supracitadas estavam abaixo dos níveis de detecção do 

método utilizado. 

A citocina  IL‐6 foi detectada no FP de quase todas as pacientes  incluídas no estudo. 

Não  foram  encontradas  diferenças  significativas  na  quantificação  dessa  citocina  entre  os 

diferentes grupos (Figura 22A). Todas as amostras de sangue estavam abaixo dos níveis de 

detecção de IL‐6 do kit. 

A  concentração  de  TGF‐β  foi  similar  entre  os  grupos  estudados.  No  sangue,  a 

mediana foi de 1425 pg/mL (565 – 2358) para o grupo CTRL e 1529 pg/mL (895 – 4655) para 

o grupo EDT. A mediana do grupo I/II foi um pouco mais alta do que os outros grupos (3165 

pg/mL), entretanto, devido ao reduzido n e variação entre as amostras  (IQR: 1005 – 5931, 

n=4), não pode ser considerado. No FP, as medianas  também  foram próximas: 815 pg/mL 

(450 – 2947) para o grupo CTRL e 849 pg/mL (652 – 1561) para o grupo EDT. Mais uma vez, a 

mediana  do  grupo  I/II mostrou‐se mais  elevada:  1097  pg/mL  (684  –  1753),  porém  sem 

diferença estatística (Figura 22B e C). 

A avaliação da citocina IL‐12 mostrou diferenças apenas comparando‐se amostras de 

sangue  de  pacientes  com  endometriose  I/II  com  controles  (p=0,03)  (Figura  22D).  Embora 

esta  citocina esteja presente em menor  concentração no  sangue de pacientes dos grupos 

EDT e  III/IV do que em controles, esta diferença não  foi estatisticamente significante. Não 

foram  encontradas  diferenças  na  concentração  de  IL‐12  entre  amostras  de  FP  entre  os 

diversos grupos (Figura 22E). 

65  

CTRL EDT I/II III/IV0

50

100

150

200200600

1000n.s.

n.s.n.s.

IL- 6

(pg/

mL)

 

CTRL EDT I/II III/IV0

1000

2000

30003000

6000

9000 n.s.n.s.

n.s.

TGF-β

(pg/

mL)

CTRL EDT I/II III/IV0

500

1000

1500

2000

25003500

5500 n.s.n.s.

n.s.

TGF-β

(pg/

mL)

CTRL EDT I/II III/IV0

1000

200020007000

12000

15000

30000n.s.

*n.s.

IL-1

2 (p

g/m

L)

CTRL EDT I/II III/IV0

200

400

600

800

1000 n.s.n.s.

n.s.

IL-1

2 (p

g/m

L)

 

Figura  22  ‐  Concentração  de  IL‐6,  TGF‐β  e  IL‐12  no  sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  pacientes  com endometriose  (EDT),  subagrupadas  em  estágios  I/II  e  III/IV,  e  controles  (CTRL).  Mostradas  estão  as concentrações de IL‐6 no FP (A), TGF‐β no sangue e no FP (B e C) e IL‐12 no sangue no FP (D e E) das pacientes incluídas no estudo. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. I/II, endometriose mínima/leve; III/IV, endometriose moderada/grave; *p<0,05 e n.s. = não significativa, pelo teste de Mann Whitney.  

Quando comparamos a concentração de TGF‐β e  IL‐12 entre amostras de sangue e 

FP, é possível notar uma tendência a maior concentração dessas citocinas no sangue do que 

no FP de  todos os grupos. Para TGF‐β, essa diferença é  significativa apenas no grupo EDT 

(p=0,0081) (Figura 23A). Já para  IL‐12, a diferença mostra‐se significativa para o grupo EDT 

(p=0,0003),  I/II  (p=0,03) e  III/IV  (p=0,001). No grupo controle, apesar de haver uma maior 

A 

B  C 

D  E 

66  

concentração dessas  citocinas no  sangue do que no  FP, essa diferença não é  significativa 

(TGF‐β p=0,8 e IL‐12 p=0,09) (Figura 23B). 

 

CTRL EDT I/II III/IV0

2000

4000

6000

8000sangue

PF

**n.s. n.s. n.s.TG

F-β

(pg/

mL)

 

CTRL EDT I/II III/IV0

200

400

600600

16001600

116002160031600

sanguePF

*** ***n.s. *

IL-1

2 (p

g/m

L)

 

Figura  23  ‐  Comparação  entre  a  concentração  de  TGF‐β  (A)  e  IL‐12  (B)  em  amostras  de  sangue  e  fluido peritoneal  (FP) de  controles  (CTRL) e pacientes  com endometriose  (EDT),  subagrupadas em estágios  I/II e III/IV.  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo  interquartil.  I/II,  endometriose  mínima/leve;  III/IV, endometriose moderada/grave;  *p<0,05,  **  p<0,01,  ***  p<0,001  e  n.s.  =  não  significativa,  pelo  teste  de Wilcoxon. 

A 

B 

67  

5           DISCUSSÃO  

Diversos relatos mostram que a função de várias células do sistema imune encontra‐

se alterada em mulheres com endometriose (13). Visto que a endometriose é uma doença 

ginecológica que acomete aproximadamente 10 a 15% das mulheres em idade reprodutiva, 

e que as limita em diversas dimensões, há grande interesse no estudo da doença e, assim, na 

busca  de  tratamentos  menos  invasivos  para  essas  pacientes.  Nesse  estudo,  a  hipótese 

aventada  é  de  que  a  presença  de  células  com  propriedades  imunorreguladoras  no 

microambiente  peritoneal  seja,  pelo  menos  parcialmente,  responsável  pela  redução  da 

capacidade  das  células  imunes  de  reagir  contra  as  células  endometriais,  permitindo  sua 

implantação e permanência em  locais ectópico. Assim, aqui  foi  investigada a presença e a 

quantificação  das  células  Treg, NK, MDSC  e DC  no microambiente  peritoneal  e  sangue  de 

mulheres  com  endometriose  profunda,  além  da  avaliação  de  citocinas  pró  e  anti‐

inflamatórias.  

Foram  incluídas  nesse  estudo  mulheres  entre  26  e  51  anos  com  endometriose 

profunda, ausência de doença autoimune, inflamatória ou condição neoplásica (confirmado 

por  exames médicos  e/ou  testes  laboratoriais,  quando  necessário)  e  sem  uso  de  terapia 

hormonal por pelo menos três meses prévios ao estudo.  

Esse estudo contou com amostras de 19 pacientes, com diagnóstico de endometriose 

profunda confirmada por videolaparoscopia e análise histológica das  lesões, e 8 controles. 

Das 19 pacientes, sete foram classificadas com endometriose mínima/leve (estágio I/II) e 12 

foram classificadas como tendo a forma moderada/grave da doença (estágios III e IV).  

Como o volume de FP e a contagem de células difere entre pacientes,  iniciamos o 

estudo com uma avaliação geral das populações de leucócitos (CD45+), linfócitos T (CD3+), LT 

CD4+  e  LT  CD4+  ativados  (CD25+),  para  confirmar  se  a  distribuição  dessas  células  seria 

diferente entre as pacientes com endometriose e em comparação com controles. Não foram 

encontradas diferenças entre amostras de sangue e FP de pacientes com endometriose (em 

diversos  estágios)  e  controles.  Conforme  esperado,  as  populações  citadas  foram  mais 

frequentes em amostras de sangue do que de FP. 

No  presente  estudo,  foi  analisada  a  frequência  de  células  Treg 

CD45+CD3+CD4+CD25highCD127lowFoxP3+  comparadas  ao  quadro  geral  de  LT  (frequência 

dentre as células CD3+) e comparadas aos LT CD4+ em amostras de sangue e FP de pacientes 

68  

com endometriose e controles. O único resultado que mostrou diferença entre a frequência 

destas células nas pacientes do grupo EDT e do grupo CTRL foi ao se comparar a frequência 

destas no  conjunto de  LT CD4+ no  FP;  as pacientes  com EDT mostraram uma  redução na 

frequência  dessas  células  no  FP,  quando  comparadas  às  controles  (Figura  5A).  Até  o 

momento, poucos grupos de pesquisa investigaram células T reguladoras em pacientes com 

endometriose por meio de  técnicas com alta eficácia para  identificação e quantificação de 

populações celulares como a citometria de fluxo multiparamétrica, e, dentre esses, poucos 

avaliaram essas células em amostras de fluido peritoneal. Entre esses relatos, foi observado 

aumento  de  células  Foxp3+  no  endométrio  eutópico  de  mulheres  com  endometriose 

peritoneal  e  ovariana  durante  a  fase  secretora  do  ciclo  menstrual,  comparadas  com 

controles; essas análises foram feitas por imunohistoquímica (51). Ainda, foi mostrado que o 

número  de  células  CD4+CD25+Foxp3+  está  aumentado  no  endométrio  ectópico 

(endometrioma ovariano) quando comparadas com controles (52). Os relatos quantitativos 

de  células  Treg  já  realizadas  em  amostras  de  fluido  peritoneal  (27),  incluindo  um  estudo 

anterior do nosso grupo de pesquisa, mostraram que há maior frequência dessas células no 

FP  de  pacientes  com  EDT  do  que  em  amostras  de  controles.  O  estudo  de  Podgaec  e 

colaboradores  (2012)  (27) analisou a expressão de Foxp3 por PCR em tempo real  (RT‐PCR) 

dentre as células CD4+CD25high previamente separadas por citômetro de fluxo, além de não 

utilizarem o marcador CD127. A RT‐ PCR reflete o quanto um determinado gene está sendo 

expresso  em  uma  célula  (ou  conjunto  de  células).  Desse  modo,  o  estudo  citado 

anteriormente afirma maior expressão do fator de transcrição Foxp3 dentre um conjunto de 

células potencialmente Treg (CD4+CD25high), entretanto, não quantifica quantas células desse 

conjunto  expressam  esse  fator.  Portanto,  não  se  pode  afirmar  se  houve  aumento  na 

frequência  de  células  Treg  ou  se  as  células  Treg  que  existem  no  FP  das  pacientes  com 

endometriose estão expressando mais Foxp3, o que poderia estar  relacionado  com maior 

função supressora dessas células; esse pode ser um dos motivos da não concordância dos 

dados  obtidos  nesse  estudo  com  os  anteriormente  observados  por  nosso  grupo. O  único 

estudo publicado até o momento que investiga concomitantemente a frequência de células 

Treg  no  fluido  peritoneal  e  no  sangue  de  pacientes  com  endometriose  utilizando  uma 

abordagem  bastante  similar  para  caracterização  fenotípica  ao  presente  estudo,  foi  o  de 

Olkowska – Truchanowicz et al. (2013) (53). Apesar de não analisarem a expressão de CD127 

e de sua coorte consistir de pacientes com cistos ovarianos, foi encontrada maior frequência 

69  

de  células  Treg  no  FP  de  pacientes  com  EDT,  comparadas  com  controles,  corroborando  o 

estudo de Podgaec et al. (2012) (27). Além disso, os autores encontraram uma redução na 

frequência  dessas  células  no  sangue  de  pacientes  com  endometriose,  comparadas  com 

controles. Apesar de não ter sido comprovada a significância estatística no presente estudo, 

os dados apontam para uma tendência ao aumento na frequência de células Treg no sangue 

de  pacientes  com  endometriose,  comparadas  com  as  controles. O  estudo  de Olkowska  – 

Truchanowicz et al. (2013) (53) mostra, também, um aumento na frequência de células Treg 

dentre os LT auxiliares CD4+ em amostras de FP de pacientes com endometriose. Em nosso 

estudo,  a  frequência  de  células  Treg  dentre  as  células  CD4+ mostra‐se  reduzida  no  FP  de 

pacientes com EDT (p=0,04, Figura 5A). O número amostral do referido estudo é semelhante 

ao nosso, com apenas alguns controles a mais (EDT=17 e CTRL=15), portanto não podemos 

atribuir  as  diferenças  encontradas  ao  pequeno  número  amostral.  É  possível  que  haja 

diferença  na  distribuição  de  células  imunes  entre  pacientes  com  tipos  distintos  de 

endometriose;  enquanto  o  trabalho  de Olkowska  –  Truchanowicz  e  colaboradores  (2013) 

(53) foca em estudar a frequência das células Treg em pacientes com cistos endometrióticos 

ovarianos,  o  presente  trabalho  estuda  a  frequência  dessas  células  em  pacientes  com 

endometriose profunda, um tipo geralmente mais agressivo de doença.  

O  fato  dos  dados  obtidos  no  presente  estudo  discordarem  dos  previamente 

observados  pode  estar  relacionado  com  a  origem  da  amostra,  o  tipo  de  endometriose 

estudada  (ovariana,  e  não  profunda),  com  o  pequeno  número  amostral  aqui  incluído,  as 

características  individuais das pacientes, além das diferentes estratégias de  caracterização 

da população.  

Sabendo que  LT  ativados  também expressam CD25 e  tem expressão  transiente de 

Foxp3, acreditamos que o  conjunto de marcadores utilizados aqui  seja o mais apropriado 

para detecção de células Treg.  

A menor  frequência de Treg no FP de pacientes com endometriose observada nesse 

estudo, particularmente em estágios mais leves de doença, é um dado bastante intrigante e 

diverge  de  nossa  hipótese  inicial,  de  que  células  com  propriedades  imunorreguladoras 

estariam  presentes  no microambiente  peritoneal  e  que  esse  quadro  seria  prejudicial  às 

pacientes,  levando‐as  a  desenvolverem  a  doença.  Se  esta  hipótese  estivesse  correta, 

esperaríamos  encontrar  maior  frequência  de  células  Treg  no  FP  de  pacientes  com 

endometriose, principalmente de estágios III/IV, do que controles. O que observamos nessa 

70  

coorte,  entretanto,  é  uma  redução  na  frequência  dessas  células  no  FP  de  pacientes  com 

endometriose. Essa redução é ainda mais aparente em pacientes com EDT I/II. Esses dados 

sugerem então que essas células estejam no microambiente peritoneal para proteger contra 

possíveis  danos  causados  por  células  endometrióticas,  e  que  na  ausência  ou  redução  da 

frequência  dessas  células,  a  doença  pode  se  desenvolver.  Células  endometriais  ectópicas 

liberam  vários  fatores  que  permitem  o  desenvolvimento  da  endometriose.  Um  quadro 

oposto é observado no  sangue; uma maior  frequência de Treg em pacientes do grupo  I/II, 

seguida por III/IV e controles. O fato dos dados obtidos nesse estudo mostrarem tendência à 

maior  frequência de  células  Treg no  sangue de pacientes  com  EDT,  indica que, por  algum 

motivo, mais células estão sendo produzidas. Os dados de FP mostram que essas não estão 

se acumulando no FP. É possível,  também, que as células estejam  infiltrando as  lesões de 

endometriose, e por isso apresentem‐se em frequências menores no FP que no sangue. De 

fato, de acordo com Berbic e Fraser (2011) (54), muitas populações de células imunes, entre 

elas  células NK, DC e  células Treg  são  recrutadas para o  centro de  lesões endometrióticas. 

Assim, seu número é reduzido significantemente no peritônio adjacente e distante (54). 

A  razão  entre  a  frequência  de  Treg  no  FP  pela  frequência  de  células  no  sangue 

também é reduzida em pacientes com EDT. 

Outra população de células com propriedade imunoreguladora que poderia participar 

no  desenvolvimento  e  progressão  da  endometriose  são  as  células  NK  CD56brightCD16‐.  A 

população  CD56brightCD16‐  compõe  10%  do  repertório  de  células  NK  e  secreta  citocinas 

(como  IFN‐γ, GM‐CSF,  IL‐10 e  IL‐13) que  regulam as células do sistema  imune  (55), sendo, 

por isso, chamada de NK imunoreguladora. Como são predominantes no útero, essas células 

são  também  chamadas  de  NK  uterinas,  NK  deciduais  ou  NK  endometriais.  As  NK 

CD56lowCD16+ representam a maioria (90%) das células NK na periferia e tem como principal 

mecanismo de ação a citotoxicidade celular, sendo, portanto, chamadas de NK citotóxicas ou 

NK  convencionais.  Já  as  células NK  CD56brightCD16+  são  as  células NK menos  estudadas  e 

estão presentes em pequena frequência no sangue e menor ainda no FP (Figura 9). 

Não  foram  encontradas  diferenças  na  frequência  de  nenhuma  população  de  NK 

citada  acima  entre  pacientes  com  EDT  e  CTRL,  em  amostras  de  FP  e  sangue,  mesmo 

dividindo os pacientes com EDT em estágios I/II e III/IV. A maioria dos relatos existentes na 

literatura  até  o  momento  tem  como  objeto  de  estudo  as  células  NK  convencionais, 

CD56lowCD16+, e esses dados mostram‐se  contrastantes. Um estudo  recente,  liderado por 

71  

Dias  Jr.  (56),  encontrou maior  frequência  de  células  NK  CD3‐CD56+CD16+  no  sangue  de 

pacientes  com  endometriose,  quando  comparadas  com  controles  (média  15,3%  versus 

10,6%). Essa diferença foi ainda maior comparando‐se pacientes com endometriose estágios 

III/IV  com  controles  (19,8%  versus  10,6%),  razão  pela  qual  os  autores  sugerem  utilizar  a 

frequência  de  NK  no  sangue  como  marcador  diagnóstico  de  endometriose  severa.  No 

presente  estudo,  a  porcentagem  média  de  células  NK  CD56lowCD16+  foi  maior    que  a 

encontrada por Dias Jr. et al. (2012) (56) (26,11%), entretanto as pacientes do grupo EDT I/II 

apresentaram médias semelhantes às do grupo III/IV (28,7% versus 24,6%). As pacientes do 

grupo controle também mostraram frequência de células NK elevada (22,7%), comparando 

com  controles  de  Dias  Jr.  et  al.  (2012)  (56),  o  que  pode  explicar  por  que  não  houve 

diferenças  significativas  entre  o  grupo  EDT  e  CTRL  (médias  26,11%  versus  22,7%).  Vale 

lembrar que o número de pacientes  incluídas nesse estudo é consideravelmente menor do 

que o de Dias Jr. et al. (2012) (56). 

Em outros estudos, no entanto,  foi observado um quadro divergente do  reportado 

por  Dias  Jr.  et  al.  (2012)  (56).  Em  um  estudo  multicêntrico  canadense,  não  foram 

encontradas  diferenças  entre  a  frequência  de  células  CD3‐CD56+,  CD56+CD16+  ou 

CD56+CD16‐ em pacientes com endometriose e controles (57). Comparando‐se pacientes de 

estágio I/II e III/IV com controles, Provinciali et al. (1995) (58) mostrou não haver diferenças 

na  frequência e número  absoluto de  células NK CD16+ ou CD56+ em  amostras de  sangue 

entre  os  grupos.  Um  estudo mais  antigo  (59)  utilizou  os marcadores  CD16  e  CD56  para 

identificar  células  NK  no  FP  de  pacientes  com  EDT  e  também  observou  frequências 

semelhantes entre amostras de pacientes com e sem a doença. Recentemente, o estudo de 

Funamizu e colaboradores (2014) (60) investigou a frequência de células NK CD56+CD16+, NK 

CD56brightCD16+ e NK CD56dimCD16+ no  FP de pacientes  com endometriose e  também não 

encontrou  diferenças  significativas  entre  as  amostras  de  pacientes  com  endometriose  e 

controles.  

Até  o  momento,  não  existem  na  literatura  relatos  do  estudo  de  células  NK 

CD56brightCD16‐ em pacientes com endometriose. 

Sabendo  que  as  células  CD56lowCD16+  são  a  maioria  no  sangue,  e  que  as  NK 

CD56brightCD16‐  são  minoria  no  sangue,  porém  maioria  no  FP,  esperávamos  encontrar 

diferenças  entre  a  frequência  das  populações  entre  amostras  de  sangue  e  FP.  Conforme 

esperado, a frequência de células CD56lowCD16+ e CD56brightCD16+ foi maior em amostras de 

72  

sangue que de FP (Figura 10), enquanto a frequência de células CD56brightCD16‐ foi maior em 

amostras de FP do que de sangue. 

A seguir, decidimos avaliar a expressão de CD57 e CD161, marcadores relacionados à 

maturação e ativação de células NK, em cada população de células. Existem três hipóteses 

que  relacionam a origem das subpopulações de células NK e o surgimento de marcadores 

clássicos  como  CD56,  CD16  e  CD57.  A  primeira  hipótese  sugere  que  as  subpopulações 

possuem  fenótipos  e  funções  distintas  devido  a  suas  origens  partirem  de  precursores 

diferentes; a segunda sugere que as células partem de um mesmo precursor, porém exposto 

a  estímulos  distintos  e  por  tal  razão  são  tão  diferentes  (61).  De  acordo  com  a  terceira 

hipótese,  as  células  CD56brightCD16‐  seriam  células  imaturas  que,  conforme  vão 

amadurecendo,  ganham  a  expressão  do  CD16  e  consequente  função  citotóxica  (62). Um 

ponto interessante dessa teoria é que o auge de maturação da célula NK seria atingido com 

a  expressão  do  marcador  CD57.  Portanto,  durante  a  maturação,  células  CD56brightCD16‐ 

passariam por  fases  intermediárias  (CD56brightCD16+ e CD56lowCD16+) até o estágio  final de 

maturação (células CD56+CD16+CD57+) (63).  

Assim,  de  acordo  com  a  terceira  hipótese,  o  esperado  seria  que  células  imaturas 

CD56brightCD16‐  tivessem menor  expressão  de marcadores  de maturação  como  CD57  que 

células mais maduras, CD56brightCD16+ e CD56lowCD16+. Realmente, foi possível observar um 

aumento na  frequência de  células positivas para o CD57 de acordo  com a maturação das 

células, de células CD56brightCD16‐ a células CD56brightCD16+ e CD56lowCD16+, o qual mostrou‐

se significante apenas comparando as pacientes com EDT (dados não apresentados). 

A  frequência  de  células  NK  maduras  (CD57+)  está  aumentada  nas  células  NK 

CD56brightCD16+ e CD56lowCD16+ do sangue de pacientes com endometriose comparadas com 

controles.  

É verdade que a expressão de CD57 é crescente da população CD56brightCD16‐ para a 

CD56brightCD16+ e mais ainda para a CD56lowCD16+, observação que vem de acordo  com a 

teoria da maturação. O CD57 em células NK parece estar mais associado a estágios finais de 

maturação das células e não ao quadro não‐funcional da senescência propriamente dita. Em 

células NK, o CD57 é um marcador de células mais maduras, e podem ter sido submetidas a 

mais divisões, resultante de respostas a patógenos e citocinas  (63). Tendo  isso em vista, é 

possível que o aumento da expressão de CD57 observado em pacientes com endometriose 

73  

seja resultante da estimulação constante de células NK por células endometriais ectópicas e 

os produtos liberados por elas.  

De acordo com Lopez – Vergès et al. (2010), as células NK CD57+ parecem proliferar 

menos  e  apresentam maior  eficiência  na  citólise  induzida por CD16.  Para  eles,  as  células 

CD57+  seriam  células mais especializadas,  com menor produção de  citocinas, porém mais 

eficientes  na  lise  de  células  alvo  (63).  É  curioso  termos  encontrado  um  aumento  na 

frequência  de  células NK  CD57+  no  sangue  de  pacientes  com  endometriose,  visto  que  é 

descrita menor  capacidade  citotóxica de  células NK nessas pacientes  (64). A hipótese que 

sugerimos então, é que apesar de estar tendo estimulação antigênica excessiva pelas células 

endometriais  ectópicas,  o  que  faz  as  células  se  dividirem  mais  e  expressarem  CD57,  é 

possível que, por  algum motivo,  o  reconhecimento dessas  células pelas  células NK  esteja 

deficiente. A investigação de receptores inibitórios e seus ligantes em células NK e no tecido 

endometrial  poderia  esclarecer  se  a  capacidade  de  reconhecimento  está  reduzida  nas 

pacientes  com  endometriose.  Ainda,  é  possível  que  o  microambiente  peritoneal  esteja 

contribuindo para a redução no reconhecimento de células NK. 

As diversas populações de células NK aqui estudadas parecem ter níveis de ativação 

semelhantes, indicados aqui pela expressão de CD161.  

A  presença  de  células  supressoras  mieloides  (MDSC),  até  o  momento,  não  foi 

investigada em pacientes com endometriose. As MDSC compõem um grupo heterogêneo de 

células,  e  por  tal  razão,  sua  caracterização  baseada  em  marcadores  expressos  em  sua 

superfície se torna bastante complexa. Por isso, iniciamos a investigação de MDSC de quatro 

fenótipos:  Lin1‐HLA‐DR‐CD11b+CD33+,  Lin1‐HLA‐DR‐CD11b+CD33+CD34+,  Lin1‐HLA‐DR‐

CD11b+CD33+C15+  e  Lin1‐HLA‐DR‐CD11b+CD33+CD34+CD15+.  A  frequência  de  células 

CD11b+CD33+C15+  e  CD11b+CD33+CD34+CD15+  foi  extremamente  baixa  nas  amostras  das 

pacientes incluídas nesse estudo e não foram comprovadas diferenças entre os grupos (EDT 

versus CTRL ou I/II e III/IV versus CTRL), ou entre amostras estudadas (sangue versus FP em 

cada  grupo).  Por  esta  razão,  focamos  na  avaliação  de  MDSC  CD11b+CD33+e 

CD11b+CD33+CD34+.  

Os dados mostram que ambas as populações são mais  frequentes em amostras de 

sangue  de  pacientes  com  endometriose  do  que  de  controles  (Figura  14)  e  que, 

principalmente para as MDSC CD11b+CD33+ há tendência a menor frequência de células no 

FP  de  pacientes  com  endometriose  que  controles.  Conforme  citado  anteriormente,  em 

74  

pacientes com diversos tipos de tumores, há um aumento de frequência de MDSC no sangue 

e também no ambiente tumoral. A maior frequência de MDSC no sangue de pacientes com 

endometriose (particularmente da população CD11b+CD33+CD34+) indica maior produção de 

células  imaturas  pela  medula  óssea.  No  entanto,  esperávamos  encontrar  um  aumento, 

também no FP dessas pacientes, e não uma tendência à diminuição na frequência de células. 

Uma  hipótese  a  ser  levantada  a  partir  das  observações  do  FP  é  que,  assim  como 

ocorre  em  tumores  sólidos,  e  assim  como  o  que  foi  sugerido  para  Treg,  as  células MDSC 

podem ter sido recrutadas para o local da lesão e terem infiltrado o(s) tecido(s). Assim, sua 

frequência  não  estaria  aumentada  no microambiente  (FP).  Entretanto,  para  chegar  a  tal 

conclusão, há necessidade de  investigação das populações celulares  infiltrantes nas  lesões 

endometriais, em paralelo às amostras de fluido peritoneal e de sangue das pacientes. 

Assim como o que ocorre com as células Treg, as MDSC parecem ser mais frequentes 

em  amostras  de  sangue  de  pacientes  do  grupo  I/II  do  que  de  III/IV  e  CTRL.  Em  tumores 

sólidos, a  frequência de MDSC  tende a aumentar conforme o estágio da doença,  tanto no 

sangue quanto no próprio tumor. Vale ressaltar, no entanto, que os estágios I, II, III e IV de 

endometriose  não  são  progressivos,  ou  seja,  uma  paciente  com  endometriose  I  não 

necessariamente  evolui  para  o  estágio  II,  e  assim  por  diante.  Apesar  dos  estágios  III/IV 

estarem geralmente associados com quadros mais graves de doença, existem pacientes com 

endometriose  severa  que  sequer  sentem  dor  ou  apresentam  sintomas,  infertilidade  ou 

qualquer manifestação.  Com  isso,  surge  a  hipótese  que  estes  sejam  tipos  diferentes  de 

endometriose, com manifestações clínicas, cirúrgicas e até mesmo imunológicas distintas. É 

possível  que  a  endometriose  I/II  seja  um  tipo  mais  inflamatório,  e  por  este  ou  outros 

motivos, induza maior produção de MDSC. 

Ainda,  considerando  a  hipótese  de  que  as  MDSC  estejam  infiltrando  nas  lesões 

endometrióticas e por  isso não tem frequência aumentada no FP, podemos considerar que 

se as pacientes do grupo III/IV apresentam menor frequência de células no FP, é possível que 

nestas  pacientes,  as  células  poderiam  estar  infiltrando mais  nas  lesões. Neste  cenário,  a 

endometriose  estaria  induzindo  a  produção  de MDSC  na medula  óssea,  o  que  faria  sua 

frequência  aumentar  no  sangue,  e  estas  células  seriam  recrutadas  para  o microambiente 

peritoneal.  Nesse  local,  as  MDSC  de  pacientes  com  endometriose  moderada/grave 

infiltrariam a  lesão com mais facilidade, possivelmente atraídas por mais estímulos que em 

pacientes  com  endometriose  mínima/leve,  o  que  poderia  explicar  a  menor  frequência 

75  

dessas no FP. A maior frequência de MDSC no FP de pacientes do grupo I/II poderia indicar 

que estas células foram atraídas para o local, porém ainda não infiltraram a lesão. 

Ainda, a frequência de células dendríticas (DC) foi avaliada nessa coorte de pacientes. 

Três  fenótipos  foram escolhidos para a caracterização de DC: um  fenótipo mais geral, Lin‐

HLA‐DR+, um fenótipo que seleciona DC mieloides (mDC), Lin‐HLA‐DR+CD33+, e um fenótipo 

pouco  utilizado  para  DC,  que  investiga  a  expressão  de  CD11b  nas  mDC,  o  Lin‐HLA‐

DR+CD33+CD11b+ e Lin‐HLA‐DR+CD33+CD11b‐. 

A subdivisão de DC em humanos nas diversas subpopulações ainda não está clara na 

literatura. De um modo geral, as DC do sangue são classificadas como DC mieloides (mDC), 

Lin‐HLA‐DR+CD11c+,  e  plasmocitóides  (pDC),  Lin‐HLA‐DR+CD11c‐,  devido  a  diferenças  na 

origem, expressão de marcadores e funções dessas células. As mDC são a maioria das DC no 

sangue  e  tecidos  linfoides  e  não  linfoides  e  podem  ser  subdivididas,  ainda,  em  diversas 

subpopulações (45).  

Embora não  seja usual na caracterização de DC,  seria  lógico  supor que mDC  tem a 

expressão  de  marcadores  que  indiquem  sua  origem  mieloide,  como  o  CD33.  Inclusive, 

diversos relatos indicam que as DC CD11c+HLA‐DR+ comumente utilizadas em experimentos, 

sejam estas DC isoladas do sangue ou derivadas de monócitos, são de fato CD33+ (46‐48).  

Dessa  forma,  analisamos  a  frequência  geral  de  DC  e  a  frequência  de  mDC  em 

pacientes com endometriose. Em nosso estudo, a frequência de DC mostrou‐se aumentada 

no sangue de pacientes com endometriose, comparadas às controles (Figura 18). Em todos 

os grupos, a frequência de DC foi maior no FP do que no sangue. Em concordância com esses 

dados,  a  razão  entre  a  frequência de  células no  FP pela  frequência de  células no  sangue 

também foi menor em pacientes com endometriose. 

Apesar  de  não  termos  encontrado  diferenças  significativas  na  frequência  dessas 

células  no  FP  entre  os  grupos,  há  uma  tendência  à  redução  na  frequência  de  DC  em 

pacientes com EDT (comparadas com controles), principalmente no grupo I/II (Figura 18B).  

Ao analisarmos a porção de DC CD33+, também não vemos diferenças entre amostras 

de pacientes com endometriose e controles. Assim como o que ocorre para as DC gerais, a 

frequência de mDC parece  ser maior em amostras de  FP do que em amostras de  sangue 

(Figura 19). 

Dentre as mDC, foi possível observar uma população CD11b+ e uma CD11b‐. É comum 

a exclusão do CD11b das análises de DC, principalmente a fim de excluir contaminações por 

76  

monócitos da população de DC. No entanto,  já  foi mostrado que o CD11b é expresso em 

diversas  populações  de  DC  (65).  Patterson  et  al.  (2005) mostra  que  até  50%  das  DC  do 

sangue  (Lin‐DR+CD1c+CD11c+)  são CD11b+, e esse número aumenta em  cultura  com  IL‐4 e 

GM‐CSF  (66).  Esse  grupo  isolou,  a  partir  de  DC  CD1c+  do  sangue,  duas  populações 

fenotipicamente  semelhantes,  uma  CD11b+  e  outra  CD11b‐.  Após  cultura  com  estímulos 

inespecíficos (IL‐4 e GM‐CSF), a população CD11b‐ passou a expressar altos níveis de MHC II 

e moléculas  co‐estimuladoras  (CD80, CD83 e CD86),  sendo portanto  chamadas de  células 

maduras.  As  células  CD11b+,  no  entanto,  passaram  a  expressar  CD1a  e  DC‐SIGN, 

permaneceram negativas para CD80 e CD83, tem baixa expressão de CD86 e eram negativas 

para CCR7, indicando que não estão maduras para migrar para linfonodos. As células CD11b+ 

apresentaram níveis de endocitose superiores ao das células CD11b‐, outro indicativo de que 

estas células são de fato  imaturas. Trata‐se de uma população de DC  imaturas, distintas de 

monócitos ou precursores de células de Langerhans e DC dérmicas (66).  

Apesar de não utilizarmos marcadores mais específicos de DC nesse trabalho, como 

CD11c  e  CD1c,  é  possível  que  as  DC  CD33+CD11b+  aqui  encontradas  sejam  a  população 

imatura citada por Patterson e colaboradores (2005) (66). 

Em nossas amostras, uma média de 95% das DC CD33+ do sangue são CD11b‐. No FP, 

essa frequência cai para menos de 30%, sendo mais de 70% das células CD11b+ (Figura 20). 

Considerando a hipótese de que as DC CD11b+ seriam células  imaturas, é possível   propor 

que  no  FP  há  um  acúmulo  de  DC  imaturas,  enquanto  no  sangue,  predominem  as  DC 

maduras.  Comparando‐se  amostras  de  pacientes  com  endometriose  com  amostras  de 

controles, no entanto, vemos menor frequência de células CD11b+ no FP de pacientes com 

endometriose. Além disso, apesar de não haver diferenças significantes, há uma tendência a 

maior  frequência  de  CD11b‐  no  FP  de  pacientes  com  endometriose,  comparadas  com 

controles (Figura 21). Em outras palavras, no FP de pacientes com endometriose, há menos 

DC imaturas (CD11b+) e mais DC maduras (CD11b‐), quando comparadas com controles. 

Há apenas um  relato na  literatura que  investiga a presença de DC em amostras de 

pacientes com endometriose (13). Nesse estudo, os autores avaliam o estado de maturação 

de DC no endométrio tópico e ectópico de pacientes com endometriose, através da análise 

dos marcadores CD1a e CD83 por  imunohistoquímica. Os dados mostram que há mais DC 

imaturas (CD1a+) e menos células maduras (CD83+) nas lesões endometrióticas e endométrio 

eutópico de pacientes  com  endometriose. Apesar da  aparente  contradição dos presentes 

77  

achados, vale citar que, assim como citado para células Treg e MDSC, a frequência de células 

no  FP  não  necessariamente  reflete  a  frequência  de  células  nas  lesões.  Desse  modo,  é 

possível que mais DC imaturas (CD1a+) estejam infiltrando as lesões, o que poderia significar 

redução de sua frequência no FP. Ainda, vale lembrar que o CD1a é um marcador presente 

em  DC  dérmicas  e  LC.  Dessa  forma,  é  possível  que  as  DC  descritas  por  (13)  sejam  DC 

teciduais.  

Estudos  recentes  abordaram  a  importância  de  DC  na  endometriose  por meio  da 

depleção  destas  em  um modelo murino  da  doença.  Os  trabalhos,  no  entanto, mostram 

resultados contrastantes. De acordo com Pencovich et al. (2013) a depleção de DC CD11c+ 

levou a  lesões endometrióticas menores, o que  indica que o desenvolvimento das  lesões é 

dependente  de DC  (67).  Para  eles,  as DC  promoveriam  vascularização  e  crescimento  das 

lesões. Já o trabalho de Stanic et al.  (2014)  (68) mostra que ao depletar DC, utilizando um 

modelo  semelhante  ao  de  Pencovich  et  al.  (2013)  (67),  as  lesões  endometrióticas  são 

maiores. O grupo mostra, ainda, que sem DC, a expressão de CD69 diminui nos LT, e conclui 

que  as DC  seriam  responsáveis  por  ativar  LT  e  impedir  a  formação,  ou  crescimento,  das 

lesões. 

Seja qual for o papel das DC na endometriose, é  indiscutível que sua participação é 

essencial  para  o  resultado  final  da  doença.  Estudos  posteriores  focando  as  diferentes 

subpopulações de DC e moléculas  co‐estimuladoras deverão  ser  feitos em pacientes  com 

endometriose para estabelecer a função destas no desenvolvimento da doença. 

Além  da  avaliação  das  populações  celulares,  a  análise  das  citocinas  presentes  no 

microambiente é um  indicativo do  seu perfil anti e pró‐inflamatório, e  reflexo das  células 

presentes  nesse  local. Uma  condição  com  perfil  direcionado  para  citocinas  inflamatórias, 

com  a presença de  IL‐12,  IFN‐γ,  IL‐2 e TNF‐α, por exemplo, poderia  indicar uma  resposta 

imune  efetora  aguda,  com  recrutamento  e  ativação  de  células  da  circulação  e  tecidos 

adjacentes, além da tentativa de eliminação do agente agressor. Se a eliminação do agente 

agressor  não  for  efetiva,  as  células  recrutadas  e  ativadas  no  ambiente  podem  ser 

responsáveis  por  causar  danos  teciduais.  Já  em  uma  condição  onde  a  concentração  de 

citocinas  anti‐inflamatórias,  como  TGF‐β  e  IL‐10,  está  aumentada  em  relação  às  citocinas 

pró‐inflamatórias, poderia indicar que está ocorrendo supressão da resposta imune efetora.  

Nesse estudo, foi possível dosar efetivamente apenas a concentração de  IL‐12(p70), 

TGF‐β1 e  IL‐6; o  restante das citocinas estavam abaixo dos níveis de detecção do método 

78  

utilizado.  Foi  possível  quantificar  os  níveis  de  IL‐2,  IL‐4,  TNF‐α,  IFN‐γ  e  IL‐10  apenas  em 

alguns  indivíduos  (tabela  7);  no  restante  das  amostras,  a  concentração  dessas  citocinas 

estava abaixo dos limites mínimos de detecção do CBA.    

No presente estudo, as frequências de IL‐6, TGF‐β1 e IL‐12 foram semelhantes entre 

as  amostras  analisadas.  A  concentração  de  IL‐12,  no  entanto,  parece  estar  diminuída  no 

sangue de pacientes  com endometriose  I/II,  comparadas  com o  grupo CTRL  (Figura 17D). 

Esse mesmo padrão é observado nos grupos EDT e  III/IV, apesar do  resultado não atingir 

significância  estatística.  A  IL‐12  é  uma  citocina  liberada  por  principalmente  por  DC  e 

macrófagos  e  ativa  células NK  e  LT  do  tipo  Th1. A  redução  na  concentração  de  IL‐12  no 

sangue  de  pacientes  com  endometriose  poderia  indicar  defeitos  na  ativação  de  células 

imunes  efetoras,  como  macrófagos,  células  NK  e  LT,  por  sua  vez  contribuindo  para  a 

permanência de lesões endometrióticas em locais ectópicos. 

Em uma doença onde antígenos endometriais viáveis escapam a  imunovigilância, é 

provável que alterações em populações de células  imunorreguladoras, como as populações 

aqui estudadas, estejam  ligadas à patogênese e progressão da doença. Os  resultados aqui 

mostrados sugerem que populações  imunorreguladoras estão alteradas em pacientes com 

endometriose. A maior frequência de células Treg, MDSC e DC no sangue de pacientes com 

endometriose  (comparadas com controles)  indica que o quadro gerado pela endometriose 

esteja induzindo maior produção dessas células em pacientes com a doença que  indivíduos 

controle. Ainda, a regulação aqui sugerida parece ser a nível sistêmico e não local, visto que 

os  níveis  dessas  populações  não  estão  aumentados  no  FP  das  pacientes.  A  investigação 

dessas  populações  celulares  nas  lesões  de  endometriose  é  extremamente  importante  na 

tentativa  de  entender  se  a  reduzida  frequência  dessas  células  em  amostras  de  FP  é 

mascarada pela infiltração das células nas lesões ou se estas células simplesmente não estão 

sendo recrutadas para o microambiente. 

79  

6          CONCLUSÕES 

 

Em uma doença onde antígenos endometriais viáveis escapam a  imunovigilância, é 

provável que alterações em populações de células  imunorreguladoras, como as populações 

aqui estudadas, estejam ligadas à patogênese e progressão da doença. 

Nossos  dados  sustentam  a  hipótese inicial  de  que antígenos  endometriais  viáveis 

escapam  a  imunovigilância   em  parte  devido  a  alterações  em  populações  de  células 

imunorreguladoras,  como  as  populações  de  Treg, MDSC  e DC aqui  estudadas,  e  que  estas 

estejam ligadas à patogênese e progressão da doença.  Entre os achados, destacam‐se: 

 

‐  Há maior  frequência  de  Treg, MDSC  e  DC  no  sangue  de  pacientes  com  endometriose, 

comparadas com controles; 

  

‐ No FP, há uma tendência à redução da frequência de Treg, MDSC e DC em pacientes com 

endometriose; 

  

‐  Não  foram  encontradas  diferenças  na  frequência  das  populações  de  células  NK  entre 

pacientes com endometriose e controles, tanto no sangue quanto no FP; 

 

‐  As  células  NK  de  amostras  de  sangue  de  pacientes  com  endometriose  possuem maior 

expressão  do  antígeno  CD57  em  sua  superfície  do  que  controles,  o  que  pode  estar 

relacionado a células em estágio final de maturação; 

    

‐  A  concentração de  IL‐12  foi  reduzida no  sangue de pacientes  com endometriose  versus 

controles;  não  foram  encontradas  diferenças  na  frequência  de  IL‐6  e  TGF‐β  entre  as 

amostras de pacientes com EDT e controles; 

  

‐ Não  foi possível quantificar as  citocinas  IL‐2,  IL‐4,  IL‐10,  IFN‐γ, TNF‐α no  sangue e FP de 

pacientes  com  EDT  e  controles,  devido  aos  níveis  destas  estarem  abaixo  dos  níveis 

detectáveis pelo kit. 

80  

REFERÊNCIAS* 

 

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APÊNDICE – Tabelas e figuras suplementares 

 

Tabela A1 – Características clínicas das pacientes com endometriose incluídas no estudo. 

Paciente  Idade  IMC  Fase do ciclo  EADDPA 

Disp. profunda 

EAD AIC 

EAD AUC 

EAD Dismeno.  Infert.  Estágio 

ASRM 

1  43  21  Secretora  4  4  6  0  8  não  I 

2  26  19  Secretora  4  7  4  0  8  ST  II 

3  35  24  ND  6  6  7  2  9  ST  IV 

4  38  27  Secretora  0  4  4  0  8  2ª  IV 

5  41  21  Secretora  0  0  0  0  0  ST  II 

6  29  31  Secretora  6  7  7  0  9  1ª  III 

7  51  27  Proliferativa 0  0  0  0  5  ST  I 

8  37  27   Secretora  3  3  0  0  5  não  III 

9  43  23  ND  7  ?  7  0  8  ST  IV 

10  29  22  Proliferativa 0  8  9  3  10  1ª  IV 

11  40  22  Proliferativa 8  7  0  0  9  não   IV 

12  36  21  Secretora  7  0  0  0  10  1ª  II 

13  37  30  Proliferativa 6  5  5  0  8  1ª   II 

14  37  27  Secretora  0  0  0  0  9  ST  I 

15  44  24  Proliferativa 0  7  0  0  0  1ª  IV 

16  32  ND  IV 

17  36  22  Secretora  0  0  0  0  7  1ª  III 

18  38  21  Proliferativa  0  8  0  0  4  1ª  III 

19  40  23  Proliferativa  0  0  0  0  3  ST  IV IMC =  Índice de Massa Corpórea, Fase  secretora: 1º ao 13 dia do ciclo, Fase Proliferativa: 15° ao 30º. EAD: Escala Analógica  de  Dor  (leve=0‐2;  moderada=3‐7;  intensa=8‐10),  DPA:  dor  pélvia  acíclica,  disp.  profunda:  dispareunia profunda, AIC: alterações  intestinais  cíclicas, AUC: alterações urinárias  cíclicas,  Infert:  infertilidade, 1ª:  infertilidade primária,  2ª:  infertilidade  secundária,  ST:  sem  tentativa  de  engravidar,  ND:  não  disponível,  ASRM:  Sociedade Americana para Medicina Reprodutiva. 

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Tabela A2 – Local das lesões nas pacientes com endometriose incluídas nesse estudo. 

Paciente 

Local da Doença 

Peritônio  Ovário  Trompa  Bexiga  Ureter  Retossig.  Retrocervical  Vagina  Apêndice Fundo de saco Reto 

1  X  X  X  2  X  X  X  X 3  X  X  X 4  X  X  X  X 5  X  X 6  X  X  X  X  X 7  X  X 8  X 9  X  X   X  X  X 10  X   X   X  X   X 11  X  X   X   x  X  X 12  X   X   X  X 13  X  X 14  X 15  X  X   X   X  X 16  X  X   X   X  X  X 17  X  X  18  X  X   X  X  X 19  X   X   X  X  X  X  X  

Retossig=retossigmóide. 

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Tabela A3 ‐ Frequências de populações de linfócitos estudadas no sangue de pacientes com endometriose estágios I/II e III/IV. 

Sangue   I/II  III/IV População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP  Mediana (IQR) 

LT   10 ± 11  7,34 (2 ‐ 20)  3,4 ± 3  3 (0,63 ‐ 5,76) LT CD4+  6,36 ± 7,17  4,2 (1,26 ‐ 12,2)  1,7 ± 1,64  0,82 (0,39 ‐ 3,19) 

CD4+ em CD3  59 ± 9,7  60 (55 ‐ 65)  51 ± 15,7  51 (47 ‐ 63) CD4+CD25+  25 ± 10  18 (6 ‐ 22)  22 ± 21  14 (9 ‐ 23) 

CD4+CD25high  2,8 ± 2,7  1,9 (0,9 ‐ 4,5)  3,8 ± 5  2,6 (1 ‐ 3,7) Treg em CD3  1,4 ± 1,6  0,87 (0,37 ‐ 2,29)  0,56 ± 0,65  0,31 (0,18 ‐ 0,92) Treg em CD4  2,16 ± 2,21  1,36 (0,6 ‐ 3,65)  1,16 ± 1,07  0,65 (0,31 ‐ 1,95) 

Valores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  I/II  =  endometriose  mínima/leve,  III/IV=  endometriose moderada/grave, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, LT = linfócito T, Treg = linfócito T regulador.    Tabela A4 ‐ Frequência de populações de linfócitos estudadas no fluido peritoneal de pacientes com endometriose estágios I/II e III/IV. 

Fluido peritoneal  I/II  III/IV População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR) 

LT   8 ± 12,4  1,5 (0,28 ‐ 16,52)  3,1 ± 4,2  1,38 (0,28 ‐ 6,17) LT CD4+  1,94 ± 2,58  0,43 (0,13 ‐ 5,62)  0,67 ± 0,75  0,5 (0,07 ‐ 1,3) 

CD4+ em CD3  32 ± 13  29 (24 ‐ 34)  27 ± 9  26 (22 ‐ 32) CD4+CD25+  5,9 ± 4,7  4,8 (3,2 ‐ 7,8)  5,7 ± 3,4  5,1 (2,4 ‐ 9,3) 

CD4+CD25high  1 ± 0,92  0,97 (0,07 ‐ 1,68)  1 ± 0,8  0,96 (0,3 ‐ 1,3) Treg em CD3  0,06 ± 0,08  0,04 (0,002 ‐ 0,11)  0,07 ± 0,08  0,06 (0 ‐ 0,11) Treg em CD4  0,16 ± 0,15  0,14 (0,009 ‐ 0,32)  0,22 ± 0,22  0,26 (0 ‐ 0,36) 

Valores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  I/II  =  endometriose  mínima/leve,  III/IV=  endometriose moderada/grave, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, LT = linfócito T, Treg = linfócito T regulador.  

 

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100n.s.

n.s.n.s.

% C

D45

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100n.s.

n.s.n.s.

% C

D45

 Figura A1 ‐ Frequência de células CD45+ em amostras de sangue (A) e fluido peritoneal (FP) (B) de pacientes com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8).  Dados  mostrados  como  mediana  e  intervalo interquartil.  I/II – endometriose mínima/leve  (n=7);  III/IV = endometriose moderada/grave  (n=12);   n.s. = não significativa, pelo teste t de Student não‐pareado.  

A  B 

89  

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100sangue

FP

n.s. n.s.* *

% C

D45

 Figura A2 – Comparação entre a frequência de células CD45+ em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8).  Dados mostrados  como mediana  e intervalo  interquartil.  I/II  –  endometriose mínima/leve  (n=7);  III/IV  =  endometriose moderada/grave  (n=12); *p<0,05 e n.s. = não significativa, pelo teste t  de Student pareado.  

 

CTRL EDT I/II III/IV0

5

10

15

20

25

30

35 n.s.n.s.

n.s.

% C

D3+

CTRL EDT I/II III/IV0

5

10

15

20

25

30

35 n.s.n.s.

n.s.%

CD

3+

 Figura A3 ‐ Frequência de células CD3+ em amostras de sangue (A) e fluido peritoneal (FP) (B) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8). As células CD3+ foram calculadas como porcentagem de células dentre as células CD45+. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. I/II – endometriose mínima/leve  (n=7);  III/IV  =  endometriose moderada/grave  (n=12);  n.s.  =  não  significativa,  pelo  teste  t  de Student não‐pareado. 

CTRL EDT I/II III/IV0

5

10

15

20

25

30

35sangue

FP

n.s. n.s.n.s.n.s.

% C

D3+

 Figura A4 ‐ Comparação entre a frequência de células CD3+ em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8).  As  células  CD3+  foram  calculadas  como porcentagem de células dentre as células CD45+. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. I/II – endometriose mínima/leve  (n=7);  III/IV = endometriose moderada/grave  (n=12); n.s. = não  significativa, pelo teste t de Student pareado.  

 

A  B 

90  

CTRL EDT I/II III/IV0

5

10

15

20n.s.

n.s.n.s.

% C

D4+

CTRL EDT I/II III/IV0

1

2

3

4

5

6 n.s.n.s.

n.s.

% C

D4+

 Figura A5 ‐ Frequência de células CD4+ em amostras de sangue (A) e fluido peritoneal (FP) (B) de pacientes com endometriose (EDT, n=19) e controles (CTRL, n=8). As células CD4+ foram calculadas como porcentagem de células dentre as células CD45+. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. I/II – endometriose mínima/leve  (n=7);  III/IV  =  endometriose moderada/grave  (n=12);  n.s.  =  não  significativa,  pelo  teste  t  de Student não‐pareado ou teste de Mann‐Whitney, quando apropriado.   

CTRL EDT I/II III/IV0

2

4

6

8101520

sangue

FP

n.s. n.s.* *

% C

D4+

 Figura A6 ‐ Comparação entre a frequência de células CD4+ em amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8).  As  células  CD4+  foram  calculadas  como porcentagem de células dentre as células CD45+. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. I/II – endometriose  mínima/leve  (n=7);  III/IV  =  endometriose  moderada/grave  (n=12);  *p<0,05  e  n.s.  =  não significativa, pelo teste t de Student pareado ou teste de Wilcoxon, quando apropriado.  

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80 n.s.n.s.

n.s.

% C

D4+

em C

D3+

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60n.s.

n.s.n.s.

% C

D4+

em C

D3+

 Figura A7  ‐  Frequência  de  células  CD4+  em  LT  de  amostras  de  sangue  (A)  e  fluido  peritoneal  (FP)  (B)  de pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19)  e  controles  (CTRL,  n=8).  As  células  CD4+  foram  calculadas  como porcentagem de células dentre as células CD3+. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. I/II – endometriose mínima/leve  (n=7);  III/IV = endometriose moderada/grave  (n=12); n.s. = não  significativa, pelo teste t de Student não‐pareado. 

A  B 

A  B 

91  

 

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80sangue

FP

** *** ***

% C

D4+

em C

D3+

 Figura A8 ‐ Comparação entre a frequência de células CD4+ em LT de amostras de sangue e fluido peritoneal (FP) de pacientes com endometriose  (EDT, n=19) e controles  (CTRL, n=8). As células CD4+  foram calculadas como porcentagem de células dentre as células CD3+. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. I/II – endometriose mínima/leve (n=7); III/IV = endometriose moderada/grave (n=12); *p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 e n.s. = não significativa, pelo teste t de Student pareado.   Tabela A5 ‐ Comparação entre a razão de células Treg encontradas no FP pela frequência destas no sangue de pacientes com endometriose e controles. 

Razão FP:sangue  CTRL  EDT População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR)  p Treg (CD3+)  2,99 ± 6,17  0,6 (0,14 ‐ 4,62)  0,15 ± 0,27  0,01 (0 ‐ 0,18)  p=0,0171 Treg (CD4+)  2,42 ± 3,25  1,25 (0,61 ‐ 3,94)  0,21 ± 0,35  0,017 (0 ‐ 0,35)  p=0,0053 

Valores apresentados como frequência de células (%). CTRL= controle, EDT= endometriose, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, LT = linfócito T, Treg = linfócito T regulador.   Tabela A6 – Razão entre a frequência de linfócitos T reguladores em amostras de FP pela frequência de células no sangue de pacientes com endometriose estágios I/II e III/IV. 

Razão FP: sangue  I/II  III/IV População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP  Mediana (IQR) Treg em CD3  0,08 ± 0,09  0,07 (0,003 ‐ 0,18)  0,17 ± 0,32  0,01 (0 ‐ 0,27) Treg em CD4  0,13 ± 0,18  0,016 (0,005 ‐ 0,31)  0,2 ± 0,4  0,009 (0 ‐ 0,44) 

Valores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  FP  =  fluido  peritoneal,  I/II  =  endometriose mínima/leve,  III/IV= endometriose moderada/grave, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, Treg = linfócito T regulador.                

92  

Tabela A7 ‐ Frequências de populações de células NK no sangue de pacientes com endometriose I/II e III/IV. 

Sangue   I/II  III/IV População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR) 

CD56brightCD16‐  2,06 ± 0,66  2,11 (1,57 ‐ 2,47)  2,34 ± 1,74  1,98 (0,75 ‐ 3,4) 

CD56brightCD16+  1,06 ± 0,37  0,88 (0,76 ‐ 1,56)  1,13 ± 1,49  0,68 (0,55 ‐ 0,86) 

CD56lowCD16+  28,8 ± 13,6  32,8 (19,5 ‐ 42,5)  24,5 ± 19,3  16,5 (9,6 ‐ 43,5) 

CD56brightCD16‐CD57+  33,5 ± 30,5  39,3 (1,4 ‐ 22,9)  27,1 ± 22,6  29,2 (4,9 ‐ 47,6) 

CD56brightCD16+CD57+  47,9 ± 17,9  48 (37,6 ‐ 63,6)  47,5 ± 20,5  49,9 (32 ‐ 57,9) 

CD56lowCD16+CD57+  47,4 ± 16,8  49 (31 ‐ 63)  56 ± 21,9  60 (45 ‐ 73) 

CD56brightCD16‐CD161+  59,5 ± 33,4  63,3 (33,4 ‐ 91,3)  52 ± 24  49,5 (31,4 ‐ 75) 

CD56brightCD16+CD161+  78 ± 19  78 (57 ‐ 100)  66 ± 28  71 (50 ‐ 92) 

CD56lowCD16+CD161+  74,6 ± 28,2  89,6 (45,7 ‐ 96,3)  59 ± 34,7  65,5 (26,4 ‐ 91,3) Valores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  I/II  =  endometriose mínima/leve,  III/IV=  endometriose moderada/grave, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil.    Tabela A8 ‐ Frequências de populações de células NK no fluido peritoneal de pacientes com endometriose I/II e III/IV. 

Fluido Peritoneal   I/II  III/IV População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR) 

CD56brightCD16‐  7 ± 6,2  4,8 (2,3 ‐ 12,3)  11,6 ± 16,3  4,2 (1,1 ‐ 19,5) 

CD56brightCD16+  0,32 ± 0,36  0,19 (0,04 ‐ 0,49)  0,67 ± 1,13  0,18 (0,09 ‐ 1,04) 

CD56lowCD16+  7 ± 5,9  5,3 (0,86 ‐ 10,86)  12,2 ± 12,1  8,6 (2,3 ‐ 22,7) 

CD56brightCD16‐CD57+  27,8 ± 23,6  20 (6,4 ‐ 55,5)  23,3 ± 27,3  11,5 (1,6 ‐ 46,5) 

CD56brightCD16+CD57+  59,8 ± 36,1  55,5 (35,3 ‐ 100)  37,8 ± 32,7  32,2 (3 ‐60) 

CD56lowCD16+CD57+  50,9 ± 26,7  62,6 (16,4 ‐ 66)  47,8 ± 26,1  51,5 (25,5 ‐ 65,7) 

CD56brightCD16‐CD161+  54,3 ± 33,3  42,8 (36,7 ‐ 84,2)  67,9 ± 26,1  74,3 (55,5 ‐ 89) 

CD56brightCD16+CD161+  42 ± 43  44 (0 ‐ 87)  66 ± 37  81 (38 ‐ 99) 

CD56lowCD16+CD161+  64,3 ± 34,8  86,9 (31,9 ‐ 91)  66,1 ± 31,3  81,9 (40,1 ‐ 86,1) Valores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  I/II  =  endometriose mínima/leve,  III/IV=  endometriose moderada/grave, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil.      

93  

CTRL EDT I/II III/IV0

1

2

3

4

5

6

7 n.s.n.s.

n.s.

% C

D56

brig

htC

D16

-

CTRL EDT I/II III/IV05

101520253040

50

60 n.s.n.s.

n.s.

% C

D56

brig

htC

D16

-

CTRL EDT I/II III/IV0

2

4

6

8

1035

40n.s.

n.s.n.s.

% C

D56

brig

htC

D16

+

CTRL EDT I/II III/IV0.0

0.5

1.0

1.5

2.03.03.54.0

n.s.n.s.

n.s.

% C

D56

brig

htC

D16

+

CTRL EDT I/II III/IV0

10

20

30

40

50

60

70 n.s.n.s.

n.s.

% C

D56

low

CD

16+

CTRL EDT I/II III/IV0

10

20

30

40 n.s.n.s.

n.s.

% C

D56

low

CD

16+

 Figura  A9  ‐  Frequência  de  populações  de  células  Natural  killer  (NK)  em  amostras  de  sangue  e  fluido peritoneal (FP) de controles (CTRL, n=8) e pacientes com endometriose (EDT, n=19), subdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12). (A) Comparação da frequência de células NK CD56brightCD16‐ em amostras de sangue dos diferentes grupos;  (B) Comparação da  frequência de células NK   CD56brightCD16‐ em amostras de FP dos diferentes grupos;  (C) Comparação da  frequência de  células NK CD56brightCD16+ em amostras de  sangue dos diferentes  grupos;  (D)  Comparação  da  frequência  de  células  NK  CD56brightCD16+  em  amostras  de  FP  dos diferentes  grupos;  (E)  Comparação  da  frequência  de  células NK  CD56lowCD16+  em  amostras  de  sangue  dos diferentes grupos; (F) Comparação da frequência de células NK CD56lowCD16+ em amostras de FP dos diferentes grupos. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. n.s. = não significativa, pelo teste t de Student não pareado. 

 

A  B 

C  D 

E  F 

94  

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100 n.s.n.s.

n.s.

% C

D57

+

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100 n.s.n.s.

n.s.

% C

D57

+

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100 ****

**

% C

D57

+

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100n.s.

n.s.n.s.

% C

D57

+

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100n.s.

n.s.n.s.

% C

D57

+

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100 n.s.n.s.

n.s.

% C

D57

+

 Figura A10  ‐ Frequência de populações de células Natural killer  (NK) positivas para CD57 em amostras de sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19), subdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12). (A) Comparação da frequência de células NK CD56brightCD16‐

CD57+  em  amostras  de  sangue  dos  diferentes  grupos;  (B)  Comparação  da  frequência  de  células  NK  CD56brightCD16‐ CD57+ em amostras de FP dos diferentes grupos; (C) Comparação da frequência de células NK CD56brightCD16+ CD57+ em amostras de sangue dos diferentes grupos; (D) Comparação da frequência de células NK CD56brightCD16+ CD57+ em amostras de FP dos diferentes grupos; (E) Comparação da frequência de células NK  CD56lowCD16+  CD57+  em  amostras  de  sangue  dos  diferentes  grupos;  (F)  Comparação  da  frequência  de células NK CD56lowCD16+ CD57+ em amostras de FP dos diferentes grupos. Dados mostrados como mediana e intervalo  interquartil. *p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 e n.s. = não significativa, pelo teste t de Student   não pareado. 

A  B 

C  D 

E  F 

95  

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100n.s.

n.s.n.s.

% C

D16

1+

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100 n.s.n.s.

n.s.

% C

D16

1+

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100 n.s.n.s.

n.s.

% C

D16

1+

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100n.s.

n.s.n.s.

% C

D16

1+

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100n.s.

n.s.n.s.

% C

D16

1+

CTRL EDT I/II III/IV0

20

40

60

80

100n.s.

n.s.n.s.

% C

D16

1+

 Figura A11  ‐ Frequência de populações de células Natural killer (NK) positivas para CD161 em amostras de sangue  e  fluido  peritoneal  (FP)  de  controles  (CTRL,  n=8)  e  pacientes  com  endometriose  (EDT,  n=19), subdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12). (A) Comparação da frequência de células NK CD56brightCD16‐

CD161+  em  amostras  de  sangue  dos  diferentes  grupos;  (B)  Comparação  da  frequência  de  células  NK  CD56brightCD16‐ CD161+ em amostras de FP dos diferentes grupos; (C) Comparação da frequência de células NK CD56brightCD16+  CD161+  em  amostras  de  sangue  dos  diferentes  grupos;  (D)  Comparação  da  frequência  de células NK CD56brightCD16+ CD161+ em amostras de FP dos diferentes grupos; (E) Comparação da frequência de células NK CD56lowCD16+ CD161+ em amostras de sangue dos diferentes grupos; (F) Comparação da frequência de células NK CD56lowCD16+ CD161+ em amostras de FP dos diferentes grupos. Dados mostrados como mediana e intervalo interquartil. n.s. = não significativa, pelo teste t de Student não pareado.       

A  B 

C  D 

E  F 

96  

Tabela A9 ‐ Comparação entre a razão de células NK encontradas no FP pela frequência destas no sangue de pacientes com endometriose e controles. 

Razão FP:sangue  CTRL  EDT População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR)  p 

CD56brightCD16‐  10,3 ± 12,6   4,39 (1,65 ‐ 16,6)  6,1 ± 9,5   2,57 (1,05 ‐ 7,35)  p=0,2536

CD56brightCD16+  0,89 ± 1,57   0,31 (0,03 ‐ 0,97)  0,91 ± 1,61   0,22 (0,04 ‐ 0,71)  p=0,9834

CD56lowCD16+  5,3 ± 12,1   0,51 (0,26 ‐ 3,71)  4,2 ± 16,4   0,31 (0,05 ‐ 0,7)  p=0,2536

CD56brightCD16‐CD57+  8,1 ± 26,7   0,38 (0,02 ‐ 3,07)  2,7 ± 6,3   0,52 (0,09 ‐ 1,06)  p=8101 

CD56brightCD16+CD57+  1,26 ± 1,57   0,71 (0 ‐ 2,35)  1,07 ± 0,77   1,17 (0,31 ‐ 1,67)  p=0,6660

CD56lowCD16+CD57+  126 ± 355   0,78 (0,51 ‐ 1,02)  5,3 ± 19,1   0,93 (0,51 ‐ 1,25)  p=0,4257

CD56brightCD16‐CD161+ 1,16 ± 0,54   1,2 (0,95 ‐ 1,59)  2,08 ± 3,28   1,08 (0,97 ‐ 1,78)  p=0,6515

CD56brightCD16+CD161+ 2,3 ± 3, 4  0,89 (0 ‐ 5,38)  1,13 ± 1,43  0,91 (0 ‐ 1)  p=0,2164

CD56lowCD16+CD161+  185 ± 519   1 (0,85 ‐ 5,35)  8,4 ± 24,2  0,96 (0,54 ‐ 1,36)  p=0,5239Valores apresentados como frequência de células (%). CTRL= controle, EDT= endometriose, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil. Valor de p calculado pelo teste t de Student não pareado/Mann Whitney.  Tabela A10 ‐ Razão entre a frequência de populações de células NK em amostras de FP pela frequência de células no sangue de pacientes com endometriose estágios I/II e III/IV. 

Razão FP:sangue   I/II  III/IV População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP Mediana (IQR) 

CD56brightCD16‐  3,37 ± 2,53  3,08 (1,05 ‐ 5,81)  7,7 ± 11,6  2,43 (0,81 ‐ 11,34) 

CD56brightCD16+  0,37 ± 0,49  0,2 (0,04 ‐ 0,55)  1,2 ± 1,9  0,28 (0,03 ‐ 2,12) 

CD56lowCD16+  0,36 ± 0,49  0,22 (0,04 ‐ 0,39)  6,5 ± 20,7  0,56 (0,08 ‐ 0,73) 

CD56brightCD16‐CD57+  1,64 ± 2,33  0,74 (0,16 ‐ 3)  11,8 ± 33,5  0,3 (0,005 ‐ 4,47) 

CD56brightCD16+CD57+  1,4 ± 0,78  1,47 (1,04 ‐ 2,24)  0,87 ± 0,72  0,86 0,07 ‐ 1,43) 

CD56lowCD16+CD57+  1,26 ± 0,93  1,15 (0,51 ‐ 1,89)  7,77 ± 24  0,9 (0,49 ‐ 1,08) 

CD56brightCD16‐CD161+  2,75 ± 5,3  0,97 (0,44 ‐ 1,27)  1,69 ± 1,37  1,11 (1,06 ‐ 2,12) 

CD56brightCD16+CD161+  0,52 ± 0,49  0,87 (0 ‐ 0,91)  1,48 ± 1,68  0,96 (0,6 ‐ 1,76) 

CD56lowCD16+CD161+  1,19 ± 1,08  0,9 (0,54 ‐ 1,2)  12,7 ± 30  1 (0,62 ‐ 4,37) Valores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  I/II  =  endometriose mínima/leve,  III/IV=  endometriose moderada/grave, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil.   

97  

CTRL EDT I/II III/IV

0.02.55.07.5

10.010

30

50 n.s.n.s.

n.s.

Raz

ão F

P:sa

ngue

CTRL EDT I/II III/IV0

2

4

6 n.s.n.s.

n.s.

Raz

ão F

P:sa

ngue

CTRL EDT I/II III/IV012345

305070

n.s.n.s.

n.s.

Raz

ão F

P:sa

ngue

 Figura A12 – Razão entre a frequência de células Natural killer (NK) CD56brightCD16‐ (A), CD56brightCD16+ (B) e CD56lowCD16+  (C)  no  fluido  peritoneal  (FP)  e  frequência  de  células  no  sangue  de  controles  (CTRL,  n=8)  e pacientes com endometriose (EDT, n=19), subdivididos em estágio I/II (n=7) e III/IV (n=12). Dados mostrados como  mediana  e  intervalo  interquartil.  I/II  (n=7),  endometriose  mínima/leve;  III/IV  (n=12),  endometriose moderada/grave; n.s. = não significativa, pelo teste t de Student pareado.  

A  B 

C 

98  

CTRL EDT I/II III/IV02468

101520

100110120

n.s.n.s.

n.s.

Raz

ão F

P:sa

ngue

CTRL EDT I/II III/IV0

1

2

3

4

5n.s.

n.s.n.s.

Raz

ão F

P:sa

ngue

CTRL EDT I/II III/IV0

20406080

1001000

1005

1010 n.s.n.s.

n.s.

Raz

ão F

P:sa

ngue

 Figura A13 ‐ Razão entre a frequência de células Natural killer (NK) CD56brightCD16‐CD57+ (A), CD56brightCD16+ CD57+ (B) e CD56lowCD16+ CD57+ (C) no fluido peritoneal (FP) e frequência de células no sangue de controles (CTRL, n=8) e pacientes  com endometriose  (EDT, n=19),  subdivididos em estágio  I/II  (n=7) e  III/IV  (n=12). Dados mostrados  como mediana e  intervalo  interquartil.  I/II  (n=7), endometriose mínima/leve;  III/IV  (n=12), endometriose moderada/grave; n.s. = não significativa, pelo teste t de Student pareado. 

 

A  B 

C 

99  

CTRL EDT I/II III/IV0

1

2

3

45

10

15n.s.

n.s.n.s.

Raz

ão F

P:sa

ngue

CTRL EDT I/II III/IV0

2

4

6

8

10 n.s.n.s.

n.s.

Raz

ão F

P:sa

ngue

CTRL EDT I/II III/IV

0

50

100

1501000

1500n.s.

n.s.n.s.

Raz

ão F

P:sa

ngue

 Figura A14 ‐ Razão entre a frequência de células Natural killer (NK) CD56brightCD16‐CD161+ (A), CD56brightCD16+ CD161+ (B) e CD56lowCD16+CD161+ (C) no fluido peritoneal (FP) e frequência de células no sangue de controles (CTRL, n=8) e pacientes  com endometriose  (EDT, n=19),  subdivididos em estágio  I/II  (n=7) e  III/IV  (n=12). Dados mostrados  como mediana e  intervalo  interquartil.  I/II  (n=7), endometriose mínima/leve;  III/IV  (n=12), endometriose moderada/grave; n.s. = não significativa, pelo teste t de Student pareado.    Tabela A11 ‐ Frequências de células supressoras mieloides no sangue e fluido peritoneal de pacientes com endometriose I/II e III/IV. 

I/II  III/IV 

População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP  Mediana (IQR) 

CD11b+CD33+ (sangue)  0,29 ± 0,17  0,24 (0,18 ‐ 0,52) 0,2 ± 0,2  0,17 (0,01 ‐ 0,36)

CD11b+CD33+CD34+ (sangue)  0,17 ± 0,11  0,17 (0,11 ‐ 0,22) 0,12 ± 0,15  0,07 (0,01 ‐ 0,17)

CD11b+CD33+  (FP)  0,18 ± 0,13  0,16 (0,06 ‐ 0,31) 0,06 ± 0,05  0,03 (0,02 ‐ 0,1) 

CD11b+CD33+CD34+  (FP)  0,1 ± 0,08  0,09 (0,04 ‐ 0,18) 0,02 ± 0,03  0,02 (0 ‐ 0,04) Valores apresentados como frequência de células (%). I/II = endometriose mínima/leve, III/IV= endometriose moderada/grave, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, FP = Fluido Peritoneal.          

A  B 

C 

100  

Tabela A12 ‐ Frequências de células dendríticas no sangue e fluido peritoneal de pacientes com endometriose estágios I/II e III/IV. 

I/II  III/IV População  Média ± DP  Mediana (IQR)  Média ± DP  Mediana (IQR) 

DC  (sangue) 

0,34 ± 0,27  0,21 (0,12 ‐ 0,44)  0,77 ± 1,45  0,39 (0,22 ‐ 0,44) 

DC  (FP) 

3,6 ± 5,8  0,18 (0,06 ‐ 9,94)  5,7 ± 5,2  6,8 (0,12 ‐ 10,2) 

DC CD33+   

(sangue) 36,8 ± 47,8  23,3 (10,1 ‐ 64,6)  27,7 ± 38,5  39,4 (8,5 ‐ 91,6) 

DC CD33+   (FP) 

63 ± 30,2  68,8 (28 ‐ 93,6)  56 ± 42  79,9 (0 ‐ 87,2) 

DC CD33+CD11b+  

(sangue) 1,35 ± 1,41  1,07 (0 ‐ 2,75)  1,93 ± 2,78  0,93 (0,51 ‐ 1,3) 

DC CD33+CD11b+  

(FP) 39,7 ± 31,2  37,6 (15 ‐ 63,9)  44,6 ± 38,2  54,9 (0 ‐ 73,8) 

DC CD33+CD11b‐  

(sangue) 35,5 ± 26,8  21,1 (10,1 ‐ 61,9)  45,9 ± 38,2  36,3 (7,8 ‐ 90,6) 

DC CD33+CD11b‐  

(FP) 23,4 ± 23,2 

11,9 (7,59 ‐ 33,9) 16,4 ± 20,9  9,3 (0 ‐ 26,4) 

Valores  apresentados  como  frequência  de  células  (%).  I/II  =  endometriose  mínima/leve,  III/IV=  endometriose moderada/grave, DC = célula dendrítica, DP = desvio padrão, IQR = intervalo interquartil, FP = Fluido Peritoneal.