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Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California
Doctorado en Ciencias en Física de Materiales
Preparación y estudio de soportes porosos de TiO2 con recubrimiento de fosfato de calcio para el crecimiento de
células óseas
Tesis para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado de
Doctor en Ciencias
Presenta:
Duilio Valdespino Padilla
Ensenada, Baja California, México 2019
Tesis defendida por
Duilio Valdespino Padilla
y aprobada por el siguiente Comité
Duilio Valdespino Padilla © 2019 Queda prohibida la reproducción parcial o total de esta obra sin el permiso formal y explícito del autor y director de la tesis.
Dra. Ma. de la Paz Cruz Jáuregui Director de tesis
Miembros del comité Dr. Manuel Herrera Zaldívar
Dr. Mario Humberto Farías Sánchez
Dr. Luis Javier Villegas Vicencio
Dr. Josué David Mota Morales
Dr. Sergio Fuentes Moyado
Coordinador del Posgrado en Física de Materiales
Dra. Rufina Hernández Martínez
Directora de Estudios de Posgrado
ii
Resumen de la tesis que presenta Duilio Valdespino Padilla como requisito parcial para la obtención del grado de Doctor en Ciencias en el posgrado de física de materiales. Preparación y estudio de soportes de TiO2 con recubrimiento de fosfato de calcio para el crecimiento
de células óseas
Resumen aprobado por:
_________________________ Dra. Ma. de Paz Cruz Jáuregui
Director de tesis
Combinado la técnica de sol-gel y la sinterizacion rápida en fase liquida (RLPS) se elaboraron pastillas microporosas de TiO2 con interconectividad, adecuadas para la implantación celular. El polvo de TiO2 obtenido por sol-gel, se combinó con polietilenglicol (PEG) 3350 y 8000, y se prensó a 624.7 MPa para formar las pastillas. Estas pastillas fueron calcinadas a 450 oC durante 2 min y sinterizadas a 1100 oC
durante 2 min. Las muestras presentaron la fase pura de rutilo. Se obtuvieron poros de 76.8 ± 34.2 m y
173.0 ± 68.0 m con PEG3350 y PEG8000, respectivamente. Sobre las pastillas de TiO2 se depositaron
partículas aisladas de diametros de 0.25 m o recubrimientos continuos de 45 nm de espesor, de hidroxiapatita y Ca3(PO4)2, mediante erosión iónica y usando un blanco de hidroxiapatita. Todas las muestras fueron hemocompatibles de acuerdo al protocolo de hemólisis y el ISO 10993-4. Se determinó la proliferación de osteoblastos (línea celular MC3T3-E1), después de 24, 48 y 72 h, obteniendo que la
muestra con poros de 76.8 ± 34.2 m sin recubrimiento mostró un crecimiento de casi 3.5 veces más alta respecto al control; concluyendo que el tamaño de poro tiene una mayor influencia en la proliferación celular de andamios de TiO2, que el recubrimiento de fosfato.
Palabras clave: TiO2, cerámicas microporosas, implantación de células óseas.
iii
Abstract of the thesis presented by Duilio Valdespino Padilla as a partial requirement to obtain the Doctor of Science degree in material physics
Preparation and study of TiO2 scaffolds with calcium phosphate coating for bone cell growth
Abstract approved by:
_________________________ Dra. Ma. de Paz Cruz Jáuregui
Thesis Director Micro-porous TiO2 pellets with pores interconnectivity, suitable for bone cell implantation, were achieved by combining sol-gel technique and rapid liquid phase sintering (RLFS) methods. The TiO2 powder obtained by sol-gel was mixed with polyethylene glycol (PEG) 3350 and 8000 and pressed at 624.7 MPa into pellets. These pellets were calcined at 450oC for 2 min and sintered at 1100oC for 2 min. Samples showed a pure
rutile phase. Porous of 76.8 ± 34.2 m and 173.0 ± 68.0 m were obtained with PEG3350 and PEG8000,
respectively. Insulated particles of 0.25 m indiameter or continuous films 45 nm thick of hydroxyapatite and Ca3(PO4)2, were deposited on the TiO2 pellets by means of sputtering technique and a hydroxyapatite target. All samples were hemocompatible according to hemolysis protocol and ISO 10993-4. Tracking of osteoblast proliferation (cell line MC3T3-E1), after 24, 48 and 72 h, in the sample with pores of 76.8 ± 34.2
m without coating, showed almost 3.5 times more cells compared to the control; concluding that the porous size has a higher influence in the cell proliferacion of TiO2 scaffolds, than the phosphate coating. Keywords: TiO2, microporous ceramics, bone cell implantation.
iv
Dedicatoria A todas las personas que se atreven a dar un paso hacia adelante sin importar que tan difícil parece el camino, pero jamás olvidan donde
empezaron, ni el camino que han recorrido...
v
Agradecimientos
A mi madre Ma. Magdalena Padilla que, aunque ya no se encuentre con nosotros, ella siempre me
apoyó y alentó para llegar a este punto, te quiero mucho mamá.
A mi padre Duilio Valdespino García por todo el apoyo y cariño que siempre me ha tenido, además
de mi agradecimiento infinito por todos los sacrificios que ha hecho para llevar a nuestra familia
hacia delante.
A mi hermana Zaira Vanessa Valdespino Padilla por ser mi ejemplo a seguir y por el gran cariño
que me proporciona, ella es la persona más trabajadora y dedicada que conozco.
A mi sobrino Nahim Valdespino Padilla porque siempre me ha recibido con un fuerte abrazo y una
gran sonrisa que me hacen olvidar mis preocupaciones.
A la Dra. Nayeli Girón que me ha demostrado que sin importar qué suceda, uno debe seguir
adelante, también gracias por los incontables buenos momentos y sonrisas que pasamos juntos
además de todo el cariño que me ha demostrado.
A mi gran amigo Francisco Bayón por todas esas veces que me escucho y me ayudo a resolver
varios problemas.
A mi gran y estimada amiga Noemí Abundiz presente todo el tiempo, sobre todo en los momentos
más difíciles de mi vida.
Un grato agradecimiento a mi compañero Jonathan Saviñon por su compañía y enseñanzas
durante tantas horas que pasamos trabajando juntos en el laboratorio.
A mi gran amiga la Dra. Ana Isabel H. la que me dio su apoyo y disposición incondicional además
de animarme a seguir a delante, aunque ella se encontrase muy lejos.
A mi compañero y amigo Carlos Belman por acompañarme incluso cuando nos tocaba que nos
llamaran la atención.
Un agradecimiento muy especial a la Dra. Ma. de la Paz Cruz Jáuregui por todas sus enseñanzas,
la dirección de mi formación desde el 2006, la paciencia que siempre ha demostrado y sobre todo
que jamás dejó de creer en mí.
A los doctores Mario H. Farías, Dr. Josué D. Mota, Dr. Javier Villegas y al Dr. Manuel Herrera por
su continua asesoría, apoyo y orientación durante la realización de este trabajo de investigación.
Un agradecimiento especial a la Dra. Karla U. Juárez por la asesoría, capacitación, contribución y
colaboración en la presente investigación particularmente por la realización de los ensayos
biológicos.
vi
Un agradecimiento especial al Dr. Gabriel Rojas por sus enseñanzas, y por la adquisición de los
difractogramas de rayos X.
Le agradezco al Dr. Mario Farías por el asesorameinto, instrucción y análisis de los espectros de
XPS.
Al Dr. Leonel Cota por su ayuda y orientación en el proceso de ingreso al programa de posgrado,
así como por compartir conmigo su amplio conocimiento.
Un agradecimiento al Dr. Alejandro Durán por su orientación y la discusión sobre algunas técnicas
utilizadas en este trabajo.
Al Dr. Juan Muñoz y la Dra. Bárbara Moreno por su colaboración en la realización de las mediciones
de las propiedades mecánicas.
A el M.C. Pedro Casillas, Israel Gradilla, Eloísa Aparicio y David Domínguez por el apoyo técnico, al
primero en el laboratorio, y a los demás en las diversas técnicas de caracterización.
Al Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California (CICESE)
por permitirme realizar mis estudios de doctorado, y por el apoyo para la participación en diversos
congresos.
A todos los investigadores, estudiantes y personal del Centro de Nanociencias y Nanotecnología
(CNyN)-UNAM por sus enseñanzas y compañerismo, y a la institución por abrirme sus puertas.
A todos los jóvenes que les he impartido cursos, porque he aprendido mucho más de ellos que lo
que yo pude haberles enseñado.
Al proyecto proj. PAPIIT-UNAM IN109016 por la financiación del presente trabajo.
A CONACyT por la beca #240223 para la realización de los estudios de doctorado.
vii
Tabla de contenido
Página
Resumen en español………………………………………………………………………………………………………………………....ii
Resumen en inglés ..…………………………………………………………………………………........…………………………..... iii
Dedicatorias …………..…………………………………………………………………………………………………………............... iv
Agradecimientos ………………………………………………………………………………………………………………………......... v
Lista de figuras ………………………………………………………………………………………………………………….....…….... ix
Lista de tablas …………………………………………………………………………………………………………………….............. xii
Capítulo 1. Introducción
1.1 Antecedentes .......................................................................................................................... 1
1.1.1 Andamios porosos de Ti................................................................................................... 6
1.1.2 Andamios porosos de TiO2 recubiertos con apatita ........................................................ 7
1.1.3 Andamios porosos de TiO2 con hidroxiapatita y alcohol de polivinilo ............................. 8
1.1.4 Andamios porosos de Ti/TiO2 con hidroxiapatita .......................................................... 10
1.2 Justificación ........................................................................................................................... 12
1.3 Hipótesis ................................................................................................................................ 13
1.4 Objetivos ............................................................................................................................... 14
1.4.1 Objetivo general ............................................................................................................ 14
1.4.2 Objetivo particulares ..................................................................................................... 14
Capítulo 2. Metodología
2.1 Síntesis de polvos de TiO2 ..................................................................................................... 15
2.1.1 Método de sol-gel .......................................................................................................... 16
2.1.2 Síntesis del polvo de TiO2 por sol-gel ............................................................................. 17
2.2 Pastillas de TiO2 ..................................................................................................................... 18
2.2.1 Sinterización rápida en fase líquida (RLPS) .................................................................... 18
2.2.1.1 Pastillas preparadas por RLPS .............................................................................. 20
2.2.1.2 Pastillas preparadas con tiempos largos de sinterizado ...................................... 21
2.2.2 Pastillas porosas de TiO2 ................................................................................................ 21
2.3 Recubrimientos de fosfatos de calcio ................................................................................... 21
2.3.1 Polvo de hidroxiapatita .................................................................................................. 21
viii
2.3.1.1 Polvo de hidroxiapatita preparado por sol-gel .................................................... 22
2.3.1.2 Método de Combustión ....................................................................................... 23
2.3.1.3 Condiciones de preparación del polvo de hidroxiapatita por combustión .......... 24
2.3.2 Blanco de hidroxiapatita ................................................................................................ 25
2.3.3 Recubrimientos de fosfatos de calcio ............................................................................ 26
2.3.3.1 Crecimiento de películas ...................................................................................... 26
2.3.3.2 Técnica de erosión iónica ..................................................................................... 27
2.3.3.3 Condiciones utilizadas para el depósito de hidroxiapatita .................................. 28
2.4 Pruebas de respuesta biológica: hemólisis y proliferación celular ....................................... 28
2.4.1 Hemólisis ........................................................................................................................ 28
2.4.2 Proliferación celular ....................................................................................................... 29
Capítulo 3. Resultados y discusión
3.1 Polvo de TiO2 ......................................................................................................................... 31
3.2 Pastillas densas de TiO2 ......................................................................................................... 32
3.2.1 Pastillas densas de TiO2 preparadas por RLPS ............................................................... 32
3.2.2 Pastillas densas de TiO2 preparadas con LTS ................................................................. 36
3.2.3 Pastillas porosas de TiO2 ................................................................................................ 37
3.3 Recubrimientos de fosfatos de calcio ................................................................................... 42
3.3.1 Polvos de hidroxiapatita preparados por sol-gel ........................................................... 42
3.3.2 Polvos de hidroxiapatita preparados por combustión .................................................. 44
3.3.3 Blanco de hidroxiapatita ................................................................................................ 47
3.3.4 Recubrimientos de fosfato de calcio ............................................................................. 47
3.4 Pruebas biológicas ................................................................................................................ 52
3.4.1 Hemólisis. ....................................................................................................................... 52
3.4.2 Proliferación celular. ...................................................................................................... 53
Capítulo 4. Conclusiones ............................................................................................................. 54
Literatura citada ......................................................................................................................... 56
ix
Lista de figuras
Figura
Página
1 a) Micrografía del andamio de Ti con poros de 400 m. b) Módulo de Young y c) límite
elástico de muestras de Ti con poros de 200, 300 y 400 m, respectivamente llamadas Plantilla 1, 2 y 3 (Wu et al., 2014).................................................................................. 7
2 a) Micrografía de SEM y b) difractograma de rayos X de andamios de TiO2 (Loca et al., 2015)................................................................................................................................. 8
3 Micrografías de andamios de a) TiO2, b) TiO2+ alcohol de polivinilo y c) TiO2+ alcohol de polivinilo +hidroxiapatita (Stipniece et al., 2016) ............................................................. 9
4 a) Resistencia a la compresión en andamios de dióxido de titanio, alcohol de polivinilo (PVA) y/o hidroxiapatita (HAp). Micrografías de SEM del andamio b) antes y c) después de ser sumergido en la solución del fluido corporal simulado (Stipniece et al., 2016) ...... 10
5 a) Pastilla y c) superficie de las esferas de titanio, b) pastilla y c) superficie del andamio después de ser oxidado, e) ejemplo de las pastillas con recubrimiento de hidroxiapatita (H. Chen et al., 2017) ...................................................................................................... 11
6 a) Actividad de la fosfatasa alcalina y b) secreción de osteocalcina en los cultivos celulares de MC3T3-E1 en andamios de TiO2,Ti recubiertos o no con hidroxiapatita (H. Chen et al., 2017) ............................................................................................................. 12
7 Principales etapas del desarrollo experimental ................................................................ 15
8 Esquema general del proceso de síntesis por sol-gel y posibles productos (Hench y West, 1990; Hernández Sánchez, M. 2013) ............................................................ 17
9 Esquema de la síntesis del polvo de TiO2 por sol-gel......................................................... 18
10 Proceso de sinterización en fase líquida (German et al., 2009) ......................................... 19
11 Esquema de la síntesis de las pastillas de TiO2 densas y porosas ....................................... 20
12 Síntesis por sol-gel del polvo de hidroxia........................................................................... 23
13 Esquema de la síntesis de hidroxiapatita por el método de combustión .......................... 25
14 Esquema del proceso de difusión de una molécula adsorbida sobre una superficie (Valdespino Padilla, D. 2013; Smith, 1995) ....................................................................... 26
15 Esquema del proceso de erosión iónica (Smith, 1995) ..................................................... 27
16 Diagrama del ensayo de proliferación celular realizado a los soportes de TiO2 ................ 30
x
17 a) TGA y DSC de los polvos obtenidos por sol-gel y b) XRD de tales polvos calcinados a diferentes temperaturas .................................................................................................. 32
18 XRD de una pastilla de TiO2 preparada por RLPS a 1100 oC por 2 min ................................ 33
19 a) Micrografía de SEM, b) tamaño de grano y c) densidad de la pastilla en verde y las sinterizadas a 900, 1000 y 1100 oC por 2 min .................................................................... 34
20 a) Micrografía de SEM, b) tamaño de grano y c) densidad de muestras sinterizadas a 1100 oC por 2, 5, 7 y 10 min ............................................................................................... 35
21 a) Micrografía de SEM, b) tamaño de grano y c) densidad de las muestras sinterizadas a 1100 oC por 1, 12 y 24 h ................................................................................................. 36
22 Proceso de formación de poros: a) pastilla sin tratamiento térmico con aglomerados de PEG dentro de una matriz de TiO2, b) tratamiento térmico a 450 oC por 2min y c) formación de pequeñas cavidades y canales; d) la sinterización a 1100 oC por 2 min sublima el PEG nuevamente incrementando la presión, la cual forma cavidades más grandes, canales más anchos y mayor interconectividad ................................................. 38
23 Micrografías de SEM (superficial y sección transversal) e histogramas del tamaño de poro de las pastillas de TiO2 preparadas con a) PEG3350 y b) PEG8000 después del tratamiento térmico a 450 oC por 2 min ........................................................................... 39
24 Micrografía de SEM (superficial y sección transversal) y los histogramas correspondientes del tamaño de poro de las pastillas de TiO2 preparadas con a) PEG3350 y PEG8000 después del tratamiento térmico a 1100 oC por 2 min ................... 40
25 Curvas de esfuerzo vs. deformación de las pastillas de TiO2 sin-PEG, con PEG3350 y con PEG8000 ........................................................................................................................... 41
26 TGA y DSC del polvo precursor de hidroxiapatita obtenido por el método de sol-gel ....... 43
27 XRD de las variantes del método de sol-gel usado para la obtención de polvo de hidroxiapatita ................................................................................................................... 44
28 XRD de los polvos sintetizados por el método de combustión usando dos combustibles: glicina y carbohidrazida .................................................................................................... 45
29 XRD del polvo obtenido por combustión utilizando como combustible glicina, con tratamientos térmicos a 700 y 800 oC por 1 y 2 h ............................................................. 46
30 XRD de polvos elaborados por los métodos de sol-gel y combustión, tratados a 700oC por 2h ............................................................................................................................... 47
31 a) Espectro de EDS y b) XRD de recubrimientos elaborados por erosión iónica a 100 W, 2 sccm de Ar, 4 sccm de O2, 2 h de depósito, y tratados térmicamente a 700°C y 800°C por 1h ............................................................................................................................... 48
32 XPS de los depósitos elaborados por erosión iónica, a 100 W, 2 sccm de Ar, 4 sccm de O, 2 h de depósito y tratados a 800 oC por 1 o 3 h ............................................................ 49
xi
33 XRD de los depósitos elaborados por erosión iónica, a 100 W, 2 sccm de Ar, 4 sccm de O2, 2 h de depósito y tratados a 800 oC por 1 h .................................................................. 50
34 SEM de los depósitos de hidroxiapatita y Ca3(PO4)2 sobre las pastillas de TiO2 a) sin depósito, con depósito de b) 5min y c) 30min, d) amplificación de la imagen en c) .......... 51
35 Hemólisis de pastillas de TiO2 con y sin recubrimiento de hidroxiapatita-Ca3(PO4)2 ......... 52
36 Proliferación celular (línea celular MC3T3-E1) en las pastillas de TiO2 con y sin recubrimiento de hidroxiapatita-Ca3(PO4)2, después de 24, 48 y 72 h ............................ 53
xii
Lista de tablas
Tabla Página
1 Clasificación de los biomateriales (HA: Hidroxiapatita, PLGA: Ácido Poliláctico, PE: Polietileno) (Ramakrishna, et al., 2010)............................................................................ 2
2 Características generales de un andamio celular (Ramakrishna et al., 2010).................... 3
3 Condiciones de depósito de los recubrimientos hidroxiapatita, elaborados por la técnica de erosión iónica ................................................................................................. 28
4 Nombre, tamaño de poro y tiempo de recubrimiento de pastillas de TiO2, agrupadas en diferentes colores dependiendo de su tiempo de recubrimiento ............................... 51
1
Capítulo 1. Introducción
1.1 Antecedentes
Un biomaterial se diseña para llevar a cabo una función específica en un sistema biológico. La ciencia de
los biomateriales se encarga del estudio de estos materiales y de las interacciones que presentan en el
ambiente biológico donde se apliquen (Ratner, B. et al., 1996, 2013). Esta ciencia es un campo de
investigación muy antiguo, el cual ha adquirido gran relevancia en los últimos años debido a sus
potenciales aplicaciones, por lo que se ha desarrollado simultáneamente con la ingeniería biomédica,
disciplina encargada de aplicar los conocimientos de la ingeniería en la rama de la medicina.
Las primeras evidencias del uso de materiales en la medicina datan de aproximadamente 32,000 años,
cuando se usaban con dos propósitos principales: cauterizar y suturar. Así, por ejemplo, para la sutura, los
egipcios utilizaban fibras de lino, mientras que en Europa se utilizaban tripas de gato; o bien, los mayas
usaban conchas marinas como implantes dentales, ello aproximadamente en el año 600 d. C. (Ratner, B.
et al., 1996). Los procedimientos médicos en la antigüedad, en particular aquellos donde se ponían
implantes de materiales, presentaban grandes riesgos debido a la falta de conocimientos sobre
esterilización, toxicología, reacción inmunológica y biodegradación. Afortunadamente, con el paso del
tiempo se ha estado adquiriendo el conocimiento para identificar la biocompatibilidad, esto es, la
habilidad de un material para llevar a cabo una función específica sin generar grandes alteraciones en el
sistema biológico. Solo pocos materiales son biocompatibles, éstos se clasifican en cinco grupos: metálicos
y aleaciones, cerámicos, poliméricos, compositos y nanobiomateriales, como se muestra en la tabla 1.
2
Tabla 1. Clasificación de los biomateriales (HA: Hidroxiapatita, PLGA: Ácido Poliláctico, PE: Polietileno) (Ramakrishna, et al., 2010).
Biomaterial Ventajas Desventajas Aplicaciones Ejemplos
Metales y aleaciones
Duro y dúctil. Denso, puede corroerse y es difícil de elaborar.
Clavos, tornillos, placas de hueso, correctivos dentales.
Titanio, acero inoxidable, CoCr y Ti6Al4V
Cerámicas Bioinerte. Poca dureza, quebradiza, no resistente a esfuerzos mecánicos
Articulaciones de cadera, para llenar defectos en huesos, implante orbital, etc.
Alúmina, zirconia
Polímeros Bioactivo, bioabsorbible, alta resistencia al desgaste, flexible, resistente.
Poca rigidez, puede degradarse.
Andamio de tejido, tornillos de huesos, base de dentadura, articulaciones de cadera, etc.
Colágeno, silicón, ácido poli (láctico-co-glicólico) (PLGA) y polietileno (PE).
Compositos Fuertes, diseño flexible
Las propiedades pueden cambiar dependiendo de la metodología de fabricación.
Injerto de hueso, articulación de cadera, placa de hueso, restauración dental, etc.
Hidroxiapatita(HA)/Colágeno, HA/PLGA y HA/PE
Nanobiomateriales (nueva generación de biomateriales)
Gran área de superficie, alta reactividad superficial, fuerte implantación celular interfacial, mejor adhesión celular, resistencia mecánica.
Pobre control sobre la uniformidad de tamaño.
Ortopedia, restauración dental, ingeniería de tejidos y administración de fármacos
Nano-HA, nano-alúmina, nanofibras de colágeno.
Los biomateriales mejoran la calidad de vida y la supervivencia de un gran número de personas cada año
debido al amplio rango de aplicaciones, que van desde el remplazo de cadera y miembros hasta implantes
de piel, lo cual ha abierto diversas posibilidades para el desarrollo de estos materiales, así como su
industrialización y comercialización (Ramakrishna et al., 2010). En el año 2000 el mercado mundial de los
biomateriales se valuó en cerca de $ 30,000 millones de dólares, con un crecimiento del 12% por año,
donde el 55% de la producción se centra en implantes ortopédicos y dentales. Una predicción realizada
en el 2011 para el año 2015, es que dicho mercado valdría $64.7 mil millones de dólares (“Research Report
on Global Biomaterials Market”, 2011). En los Estados Unidos en el año 2000 tal mercado representó una
inversión cercana a $ 13,000 millones de dólares, con una tasa de crecimiento del 20% anual. En particular
3
en el 2002 los injertos de hueso representaron una inversión de $1,160 millones de dólares (Ramakrishna
et al., 2010).
Los biomateriales pueden utilizarse, al menos, de tres maneras: en soportes, en andamios o como
portadores de medicamentos.
La diferencia entre los soportes y los andamios es que los últimos funcionan como un soporte temporal
para el crecimiento de células o tejidos. Ambos deben cumplir las características generales mostradas en
la Tabla 2.
Tabla 2. Características generales de un andamio celular (Ramakrishna et al., 2010).
Característica Descripción
Biocompatible Debe ser biológicamente compatible con el tejido que se desea soportar, es decir que
no provoque ningún rechazo, inflamación o respuesta inmunológica del organismo.
Biodegradable La tasa de degradación debe ajustarse con la tasa de crecimiento de las células, y los
productos de degradación no deben herir los tejidos vivos.
Soporte Vascular Debe proveer conductos para el suministro de la sangre para la regeneración del tejido.
No tóxico No debe generar toxicidad en los tejidos.
Inmunogénico No debe provocar respuesta inmunológica.
Anticorrosivo No debe corroerse por el pH fisiológico y la temperatura del cuerpo.
Porosidad con poros
interconectados
Para maximizar el espacio para la adhesión celular, el crecimiento, la revascularización,
la nutrición adecuada y la oxigenación, sin comprometer la resistencia mecánica.
Estructura 3D Para el crecimiento de las células además de facilitar el transporte de nutrientes y
oxígeno.
Alta razón de área
superficial contra
volumen
Para tener una mayor área donde crezcan las células.
Superficie modificable Para ser funcionalizada con el objetivo de mejorar la adhesión del tejido.
Adecuada resistencia
mecánica
Para resistir la hemodinámica y otras fuerzas biológicas, como la locomoción.
Esterilizable Para evitar contaminación.
Es conocido que las características de los soportes influyen en el crecimiento de las células y posterior
desarrollo de tejido (Ramakrishna et al., 2010; Li et al., 2013; Wu, et al., 2014). La rugosidad, la porosidad
y la interconectividad de los poros son en general, los factores determinantes para el crecimiento celular
(Ramakrishna et al., 2010). La rugosidad y porosidad son requeridas por las células para anclarse, mientras
que la interconectividad de los poros es necesaria para transportar alimento a las células. En el caso
particular de tejido óseo, las propiedades mecánicas también son importantes puesto que la diferencia de
4
estas propiedades puede causar fracturas que dañan tanto el soporte como el hueso que le rodea (Ratner
et al., 1996), haciendo que con el tiempo deba reemplazarse el soporte, lo que afecta fuertemente al
paciente.
La evolución de los soportes para la regeneración de tejido óseo comenzó con la utilización de
injertos de hueso tomados del propio paciente, siendo esta la mayor limitante puesto que las regiones de
donde se podía obtener se reducían generalmente a la cresta ilíaca o la fíbula, además de que existían
altos riesgos de infección, dolor crónico e hipersensibilidad. También se realizaron trasplantes entre
individuos de la misma especie, pero se encontró que había riesgos de transmisión de virus, infecciones
por bacterias, rechazo del sistema inmune y osteo-conductividad deficiente asociada a la diferencia de
tamaño tanto de los poros como de los canales de interconexión (Wu et al., 2014). Debido a las
problemáticas que presentaban los soportes basados en trasplantes se optó por implantes artificiales
metálicos, los cuales fueron utilizados desde 1920, pero existen dificultades inherentes a su fabricación y
a su degradación. Con el objetivo de resolverlas se han utilizado diversas estrategias. Una de las mejores
es la utilización de compositos, ya que la combinación de materiales podría generar las propiedades
requeridas. Por ejemplo, el Dr. Lian y colaboradores (Lian et al., 2013) utilizaron ácido poliláctico, el cual
posteriormente se recubrió de colágeno e hidroxiapatita; mientras que el Dr. Maghdouri y su grupo
utilizaron fibras de seda recubiertas con colágeno (Maghdouri-White, et al., 2014). Sin embargo, aunque
se ha tenido éxito en algunos parámetros, como en la resistencia mecánica, aún fallan en otros, como la
biocompatibilidad.
Las dificultades para imitar el tejido óseo se debe a la complejidad y continuos cambios que
presenta este sistema, conformado por estructuras de tejido llamadas hueso, cuyas funciones son las de
proteger órganos vitales, permitir la locomoción, ser una estructura de soporte para el cuerpo y como
almacen de compusestos necesarias para el organismo (Montalvo, 2010).
La composición porcentual del hueso normal es de 25% de agua, 45% de minerales como fosfatos
y carbonatos de calcio (los que representan un 70% del peso final del hueso), y 30% de materia orgánica
como colágeno.
El proceso de formación y cambios en el tejido óseo se puede dividir en tres etapas: la ontogénesis,
que es la formación del hueso; la resorción, referida a la destrucción ósea; y la remodelación, donde
sucede la restructuración de los huesos. Ésta última se encuentra íntimamente relacionada con la ley de
Wolff que dice: “todo cambio en la forma o función del hueso va acompañado de modificaciones evidentes
5
en su arquitectura interna” (Montalvo, 2010; Peyroteo, et al., 2018). Las células encargas de la formación
y cambios de matriz ósea son:
i) Las osteoprogenitoras: células de origen mesenquimático que darán lugar a los osteoblastos.
ii) Osteoblastos: células con forma cúbica que constituyen los huesos, sintetizan los componentes de la
matriz ósea e inician el proceso de calcificación. El proceso de la formación de la matriz ósea consiste
en la secreción de mucopolisácaridos, sintetizados en el aparato del Golgi del osteoblasto. Éstos se
acumulan alrededor del osteoblasto. Posteriormente, fibras de colágeno (formadas en el retículo
endoplásmico de la célula) se embeben dentro de los mucopolisácaridos y, finalmente gránulos de
polifosfato almacenados en las mitocondrias de los osteoblastos se adhieren a las fibras de colágeno
para la calcificación de la matriz ósea.
iii) Osteocitos: células maduras, componente principal del tejido óseo, derivados de los osteoblastos que
quedan atrapados en la matriz ósea calcificada. Son usiformes (forma alargada, elipsoide y las
extremidades más estrechas que el centro) con prolongaciones muy finas a lo largo de la matriz que
les permiten interaccionar con los osteocitos vecinos además de intercambian nutrientes con la
sangre. Los osteocitos ya no sintetizan matriz ósea, pero la conservan.
iv) Osteoclastos: son células grandes y multinucleadas, sujetas a las lagunas de Howship, que son zonas
de reabsorción del hueso. Los osteoclastos se encargan de la destrucción de hueso por medio de
secreción de colagenasas y ácidos que acidifican el medio e inducen la osteólisis enzimática para
permitir el desarrollo, crecimiento, mantenimiento y reparación del hueso.
Entre los materiales más usados como soportes de tejido óseo destaca el titanio por sus propiedades de
ligereza, alta resistencia a esfuerzos mecánicos y biocompatibilidad.(Haugen et al., 2013)
La biocompatibilidad del Ti (Crawford, et al., 2007; Kasemo, 1983), se debe al TiO2 formado en la superficie
del Ti cuando entra en contacto con la sangre, lo que se debe a que dicho óxido queda fuertemente
enlazado, a diferencia de otros metales donde la formación de su óxido crea un enlace débil que se rompe
liberando iones al torrente sanguíneo y provocando el consecuente rechazo del sistema inmune (Haugen
et al., 2013; Ramakrishna et al., 2010).
En las piezas mencionadas, no sólo de titanio sino también sus aleaciones o incluso en otros materiales
como acero inoxidable, se han usado recubrimientos de hidroxiapatita y, en general, de fosfatos de calcio
llamados apatitas, ya que éstos presentan una respuesta bioactiva, i.e. promueve el crecimiento del hueso
(Kim et al., 2016; Stipniece et al., 2016). La hidroxiapatita es un compuesto con fórmula Ca10(PO4)6(OH)2
6
(HA), principal componente mineral de los huesos, que pertenece a la familia de las apatitas, presenta una
estructura cristalina hexagonal y es el fosfato de calcio más estable bajo las condiciones fisiológicas
(pH=7.4). La principal problemática para la aplicación de la hidroxiapatita sintetizada artificialmente es
que tiende a presentar pobre resistencia mecánica, a disolverse fácilmente, y el paciente puede presentar
inflamación y reacciones del sistema inmune (García-Garduño, M. & Reyes-Gasga, 2006; Wei et al., 2016).
Esta problemática aún no se resuelve y tema actual de estudio.
A pesar de ser el Ti en conjunto con su óxido son ampliamente usados en los reemplazos de tejido duro,
en placas para huesos y en implantes dentales, hay pocos estudios sobre ellos y el efecto de la porosidad
y recubrimiento de apatita en la proliferación de células óseas. Los resultados de los trabajos más
representativos al respecto se presentan a continuación.
1.1.1 Andamios porosos de Ti
En el trabajo del doctor Wu y colaboradores (2014) se construyeron soportes de titanio con
diferentes tamaños de poro (200, 300 y 400 m) para determinar su influencia en las propiedades
mecánicas. Sus resultados se muestran en la Figura 1: la micrografía del microscopio electrónico de barrido
(SEM por sus siglas en inglés Scanning Electron Microscope) del andamio con poros de 400 m se observa
en la Figura 1a. El módulo de Young, tanto axial como transversal, además del límite elástico de los
andamios con diferente tamaño de poro, se muestran en las Figura 1b y 1c, de las que se concluye que a
mayor tamaño de poro, mayor fragilidad.
7
Figura 1. a) Micrografía del andamio de Ti con poros de 400 m. b) Módulo de Young y c) límite elástico de muestras
de Ti con poros de 200, 300 y 400 m, respectivamente llamadas Plantilla 1, 2 y 3 (Wu et al., 2014).
1.1.2 Andamios porosos de TiO2 recubiertos con apatita
El Dr. Loca y colaboradores (2015) estudiaron andamios de TiO2 con poros entre 300 y 700 m para ello
usaron la técnica de réplica de espuma de polímero, y también realizaron recubrimientos de apatita. La
morfología de sus muestras, después de haber sido sumergidos en fluido corporal simulado (SBF por sus
siglas en inglés Simulated Body Fluid) durante 21 días, se observa en la Figura 2a; su patrón de difracción
se presenta en la Figura 2b; en él se aprecia la fase de anatasa y rutilo del TiO2, y la formación de apatita.
8
Figura 2. a) Micrografía de SEM y b) difractograma de rayos X de andamios de TiO2 (Loca et al., 2015).
Aunque tales andamios no presentaron bioactividad, posiblemente debido a un tamaño de poro muy
grande, que evita que las células puedan anclarse, aunque este trabajo es un cimiento para otras
investigaciones, como la que se presenta a continuación.
1.1.3 Andamios porosos de TiO2 con hidroxiapatita y alcohol de polivinilo
Dr. Stipniece y colaboradores (2016) trabajaron con andamios de dióxido de titanio con tamaño de poro
entre 50 y 100 m, recubiertos con hidroxiapatita y adicionando alcohol de polivinilo para rellenar el
espacio entre granos y mejorar así la resistencia a esfuerzos mecánicos. En la Figura 3 se observa la
morfología de sus muestras.
9
Figura 3. Micrografías de andamios de a) TiO2, b) TiO2+ alcohol de polivinilo y c) TiO2+ alcohol de polivinilo +hidroxiapatita (Stipniece et al., 2016).
Los andamios se sometieron a una fuerza de compresión antes y después de ser sumergidos por periodos
de 7, 14 y 28 días, en una solución Tris-HCl (tris(hidroximetil) aminometano-ácido clorhídrico) que simula
la acidez del medio biológico, obteniendo que los recubiertos de polivinilo soportaban mayor compresión,
como se muestra en la Figura 4a. Posteriormente se sumergieron en una solución simulada de fluido
corporal durante un periodo de 7 días, encontrando que existe un aumento de porosidad, lo que se
observa al comparar las Figura 4 b y c. Este cambio se debe a la formación de una apatita similar a la que
se presenta en los huesos naturalmente, con lo cual se determina que los andamios presentan
bioactividad, i.e. promueven el crecimiento de hueso.
10
Figura 4. a) Resistencia a la compresión en andamios de dióxido de titanio, alcohol de polivinilo (PVA) y/o hidroxiapatita (HAp). Micrografías de SEM del andamio b) antes y c) después de ser sumergido en la solución del fluido corporal simulado (Stipniece et al., 2016).
1.1.4 Andamios porosos de Ti/TiO2 con hidroxiapatita
Por otro lado, el Dr. Chen y colaboradores (2017), construyeron andamios porosos de titanio
comprimiendo esferas de ~900 m de diámetro, que fueron sinterizadas a 1300 oC en vacío (1X10-3 Pa).
Luego, formaron una capa de TiO2 mediante tratamientos ácido-alcalinos y, finalmente, se recubrió la
superficie con hidroxiapatita mediante la técnica de depósito electroquímico, y se realizaron los análisis
de absorción de suero protéico y evaluación de la actividad de osteoblastos (MC3T3-E1). En la Figura 5 se
muestran la micrografías de SEM de dichos andamios.
11
Figura 5. a) Pastilla y c) superficie de las esferas de titanio, b) pastilla y c) superficie del andamio después de ser oxidado, e) ejemplo de las pastillas con recubrimiento de hidroxiapatita (H. Chen et al., 2017).
Se evaluó además de la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP, por su abreviatura del inglés de alkaline
phosphatase, enzima que ayuda a obtener el calcio del medio) y la secreción de la osteocalcina (OCN, por
su abreviatura del inglés de osteocalcin, proteína que ayuda a determinar la fijación del calcio) al implantar
osteoblastos sobre los andamios de titanio durante 1, 4 y 7 días, obteniendo los resultados mostrados en
la Figura 6. Como se puede observar, los andamios de TiO2/Ti-900/54 recubiertos con hidroxiapatita tienen
mayor actividad de fosfatasa alcalina, debido a que obtuvieron de la hidroxiapatita el calcio necesario para
la formación de hueso; mientras que en el estudio de osteocalcina ambos andamios tienen una secreción
12
similar, lo que significa una velocidad de formación de hueso similar, de lo que se concluye que el
recubrimiento de hidroxiapatita no promueve que se fije más calcio.
Figura 6. a) Actividad de la fosfatasa alcalina y b) secreción de osteocalcina en los cultivos celulares de MC3T3-E1 en andamios de TiO2,Ti recubiertos o no con hidroxiapatita (H. Chen et al., 2017).
Los trabajos anteriores sobre andamios de Ti o TiO2 con recubrimientos de apatita, pueden favorecer la
bioactividad (H. Chen et al., 2017), pero el papel del tamaño de poro en el crecimiento celular óseo solo
se ha evaluado para poros que resultan demasiado grandes, entre 200 y 400 m, (Wu et al., 2014),
mientras que poros más pequeños no se han investigado. Más aún, los andamios estudiados no muestran
una interconectividad de los poros, necesaria para la alimentación de las células. Puntos en los que se
centra este trabajo de tesis.
1.2 Justificación
El Ti es ampliamente usado para elaborar soportes de hueso. Ello se debe a sus propiedades de ligereza,
alta resistencia a esfuerzos mecánicos y biocompatibilidad. Esta última propiedad se debe a la formación
de TiO2 superficial. Sin embargo, la diferencia de propiedades causa con el tiempo la degradación del tejido
circundante al soporte, haciendo que la pieza deba cambiarse por intervención quirúrgica, disminuyendo,
por consecuencia, la calidad de vida del paciente. El problema podría disminuirse e, incluso, evitarse si el
13
soporte o la interface, tuvieran características similares a las del hueso, que incluso pudieran favorecer el
crecimiento de células óseas.
La interface de TiO2 ques se forma sobre el Ti, o los soportes de piezas completas de TiO2, deberían poseer
un módulo elástico parecido al del hueso, entre 0.05 a 60 GPa (Werner, et al., 2007), además de poros que
fomenten el crecimiento celular óseo. Pero hay pocos estudios al respecto y los más representativos se
enfocaron en soportes de Ti con poros demasiado grandes (entre 200 y 400 m) que no favorecían el
crecimiento de las células (Wu et al., 2014); o bien, consideron que la hidroxiapatita y en general los
fosfatos de calcio tipo apatita pueden favorecer la adherencia de células óseas (Loca et al., 2015). Se
elaboraron muestras de Ti/TiO2 con recubrimientos de apatitas, encontrando que los recubiertos
presentaban más rapidez en la formación de hueso (H. Chen et al., 2017).
Los estudios arriba mencionados, se centraron en el tamaño de poro y la presencia de fosfatos de calcio,
pero no consideraron el aspecto de la interconexión de los poros, lo que pudo deberse a la dificultad
experimental de inducir al mismo tiempo, poros de un tamaño determinado y su interconexión.
De acuerdo a lo anterior sería importante, por un lado, elaborar muestras de TiO2 con tamaños de poro
menores que 200 μm (ya que mayores no favorecen la implantación celular), con poros interconectados
(para que las células se alimenten), con recubrimientos de fosfatos de calcio (que también podrían
favorecer la implantación y proliferación de células óseas) y con un módulo elástico similar al del hueso
(para disminuir el desgaste debido a las fracturas mecánicas); por otro lado, habría que estudiar la
influencia de las características mencionadas en la implantación y proliferación de células óseas. Cabe
mencionar qe Incluyendo un agente que se evapore durante la síntesis, como polietilenglicol (PEG), y si la
síntesis es lo suficiente rápida y a una temperatura adecuada, como en el método de sinterización rápida
en fase líquida, podrían formarse tanto los poros como los canales de interconexión, como se demuestra
en este trabajo de tesis.
1.3 Hipótesis
Por el método de sinterizacion rápida en fase líquida se pueden obtener soportes de TiO2 con poros
menores a 200 m e interconectados si, durante la síntesis, se agrega polietilenglicol, cuya evaporación
14
dejará poros y creará canales que los interconecten. Tales tamaños de poro y los recubrimientos de los
soportes con fosfatos de calcio, favorecerán la proliferación de células óseas.
1.4 Objetivos
1.4.1 Objetivo general
Elaborar soportes de TiO2 con poros interconectados, menores a 200 m, recubrimientos de fosfatos de
calcio, para estudiar su influencia en la proliferación de células óseas.
1.4.2 Objetivo particulares
1. Optimizar los parámetros de síntesis para obtener pastillas densas de TiO2 mediante el método de
sinterización rápida en fase líquida (RLPS).
2. Elaborar pastillas de TiO2 con poros interconectados, menores a 200 m, por la técnica de
sinterizado rápido en fase líquida, adicionando polietilenglicol (PEG).
3. Optimizar las condiciones de depósito para elaborar recubrimientos de fosfatos de calcio, por la
técnica de erosión iónica, en las pastillas de TiO2 porosas.
4. Determinar la influencia del tamaño de poro y recubrimiento de fosfato de calcio, en la
implantación y proliferación de células óseas, de las pastillas de TiO2.
15
Capítulo 2. Metodología
La metodología usada en este trabajo se puede dividir en cuatro etapas, como lo ilustra la Figura 7: 1) la
síntesis de los polvos de TiO2 mediante sol-gel; 2) la síntesis de las pastillas densas y porosas de TiO2, con
el método de sinterización rápida en fase líquida; 3) el depósito de los recubrimientos de fosfatos de calcio
por medio de la técnica de erosión iónica; y 4) la evaluación de la respuesta biológica de las pastillas,
específicamente la hemólisis y la proliferación celular. Los detalles sobre cada una de ellas se proporcionan
a continuación.
Figura 7. Principales etapas del desarrollo experimental.
2.1 Síntesis de polvos de TiO2
El polvo de TiO2 utilizado para la formación de las pastillas se sintetizó por medio de sol-gel.
16
2.1.1 Método de sol-gel
El método de sol-gel se inventó a mediados del siglo XIX (Hench y West, 1990), pero desde los años setenta
ha sufrido un mayor desarrollo debido a su utilización en el ámbito de la nanotecnología (Enríquez Pérez,
E. 2013). Actualmente es ampliamente utilizado por su versatilidad para sintetizar diversos materiales,
tales como cerámicos, vidrios, polímeros y sólidos porosos, además de que se puede usar para elaborar
diferentes formas de productos como fibras y películas (Hernández Sánchez, M. 2013).
El proceso de síntesis por sol-gel tiene dos rutas: a) la síntesis por soluciones coloidales, que se basa en la
dispersión de partículas coloidales aisladas o mezcladas con iones alcalinos o alcalinotérreos en un medio
líquido; y b) la síntesis a partir de los alcóxidos, que en presencia de agua producen las reacciones de
hidrólisis y condensación (Enríquez Pérez, E. 2013).
Aunque existen diversas variantes de la síntesis por sol-gel, la más general se puede reducir a los
siguientes cuatro pasos (Hernández Sánchez, M. 2013):
1. Formación de una dispersión estable (sol) de partículas con diámetros menores a 0.1 m,
suspendidas en un líquido.
2. Cambios en la concentración (evaporación de una porción del líquido), envejecimiento, e
inducción de la polimerización (que consiste en la formación de enlaces tridimensionales que
posteriormente, se expanden para formar el gel).
3. Evaporación de los solventes remanentes y deshidratación del gel.
4. Procesos de sinterizado.
La diversidad de materiales que puede sintetizarse por la técnica de sol-gel depende de la ruta que se
utilice y, dependiendo del proceso, serán las propiedades del producto. Por ejemplo, si se desea obtener
un polvo, puede generarse desde la fase del sol o a partir del gel mediante el secado. El polvo obtenido
del gel será más fino que el obtenido del gel, generalmente, por lo cual si se desea un polvo fino del gel es
necesario realizar una molienda. En la Figura 8 se presenta un esquema general de las posibles rutas de
síntesis por sol-gel.
17
Figura 8. Esquema general del proceso de síntesis por sol-gel y posibles productos (Hench y West, 1990; Hernández Sánchez, M. 2013).
2.1.2 Síntesis del polvo de TiO2 por sol-gel
Para sintetizar el polvo de TiO2 se utilizaron dos soluciones: una de ellas con 8 ml de etanol (99.5 %),
mezclado con 0.4 ml de agua y 0.25 ml de ácido nítrico (64%); y la otra solución con 8 ml de etanol
mezclado con 2.3 ml de isopropóxido de titanio (97%). Ambas soluciones se mantuvieron en agitación
durante 2 min y luego se mezclaron rápidamente agregando la solución con el isopropóxido de titanio a la
solución del ácido nítrico y continuando con la agitación por 20 min. Posteriormente, se dejó secar la
mezcla durante 2 h a 150 OC y, finalmente, el polvo resultante se calcinó por 1 h a 450 OC en un horno
Thermolyne 47900 (Valdespino et al., 2019). En la Figura 9 se esquematiza el proceso utilizado para la
síntesis del polvo de TiO2. Los polvos obtenidos se caracterizaron por difracción de rayos X (XRD, X-ray
Difracction) en un equipo Phillips X’Pert MRD, en el SEM (sistema JEOL JIB-4500). Además, se realizó un
análisis de Termogavimetría (TGA) y calorimetría diferencial de barrido (DSC, Differential Scanning
Calorimetry) en un aparato SDT Q600 TA usando una razón de 10 oC por min.
18
Figura 9. Esquema de la síntesis del polvo de TiO2 por sol-gel.
2.2 Pastillas de TiO2
Con el polvo de TiO2 obtenido por la síntesis de sol-gel se hicieron dos conjuntos de pastillas, unas densas
y otras porosas. Las primeras, sinterizadas por el método de sinterización rápida en fase líquida, que se
compararon con otras preparadas con largos tiempos de sinterización. Las pastillas porosas se
sinterizaron, exclusivamente, por la sinterización rápida en fase líquida. El proceso seguido en cada caso
se describe a continuación.
2.2.1 Sinterización rápida en fase líquida (RLPS)
La sinterización rápida en fase líquida (RLPS, por sus siglas en inglés de Rapid Liquid Phase Sintering) es
una variante de la técnica de sinterización en fase líquida (LPS, por sus siglas en inglés de Liquid Phase
Sintering) ampliamente utilizada para la elaboración de aleaciones o cerámicas (German et al., 2009). En
ella las temperaturas son seleccionadas para que durante el proceso del tratamiento térmico se origine
una fase líquida que mejora la difusión atómica haciendo que el proceso sea más rápido y aumente la
densificación de las muestras (Figueroa Martínez, 2017). En la Figura 10 se esquematiza la técnica LPS. En
ella se observa que, inicialmente, coexisten dos materiales con diferentes puntos de fusión. Al aumentar
la temperatura, el material que presenta la menor temperatura de fusión comienza a tornarse líquido.
19
Dicha fase se redistribuye para, posteriormente, precipitarse y llenar los poros en el material, aumentando
la densidad final de la muestra (German et al., 2009).
Figura 10. Proceso de sinterización en fase líquida (German et al., 2009).
Para el proceso de LPS es necesario tomar en cuenta los siguientes requisitos: i) debe formarse una fase
líquida a la temperatura de sinterización; ii) la fase líquida debe mojar la superficie del sólido, i.e., que el
ángulo de contacto ha de ser pequeño; y iii) la solubilidad del sólido en la fase líquida tiene que ser alta.
La diferencia de la técnica de RLPS con respecto a la LPS, es que, en la primera, la muestra debe llevarse
lo más rápido posible a la temperatura deseada, donde estará por un corto tiempo (George Rojas, 2015).
Para la síntesis del polvo de TiO2 de este trabajo se utilizó el polvo de TiO2 amorfo elaborado por la técnica
de sol-gel. Aunque no hay dos materiales con diferente temperatura de fusión, en la muestra existen
partículas de diferentes tamaños (incluyendo tamaños nanométricos), resultado propio del método de
20
sol-gel. Las partículas más pequeñas tienen una relación alta de energía superficial a volumen, y funcionan,
entonces, como el material de baja temperatura de fusión.
2.2.1.1 Pastillas preparadas por RLPS
Para obtener las pastillas con la mayor densidad posible y con el módulo elástico más grande (ya que al
introducir los poros ambas características disminuirían, lo que se demuestra en el siguiente capítulo), se
optimizaron los parámetros de preparación de las mismas. Específicamente, se varió la presión de
empastillado del polvo de TiO2 y la temperatura y tiempo de sinterización de las pastillas.
Se elaboraron pastillas en verde (i. e. sin tratamiento térmico) a dos presiones, 624.7 y 832.5 MPa, en una
prensa axial Across International MP40, usando un troquel de 6 mm de diámetro. Las pastillas se
sometieron a un tratamiento térmico a 450 oC por 2 min (que se justificará más adelante), y con intensión
de obtener la fase rutilo que tiene el mayor módulo elástico, respecto a la anatasa, se sintetizaron las
pastillas a 900, 1000 y 1100 oC; en un horno tubular Thermolyne 79300 con tiempos de 2, 5, 7 y 10 minutos.
Se calculó la densidad de las pastillas y se caracterizaron por DRX y SEM. Además, se calculó el módulo de
elasticidad de las muestras mediante un texturímetro TA XT plus de Stable Micro System.
En la Figura 11 se esquematiza la rutas para obtener muestras porosas y densas de TiO2 por el método de
sinterización rápida en fase líquida.
Figura 11. Esquema de la síntesis de las pastillas de TiO2 densas y porosas.
21
2.2.1.2 Pastillas preparadas con tiempos largos de sinterizado
En el caso de sinterizado preparado con tiempos largos se usó el mismo polvo obtenido por sol-gel, con
las presiones de 624.7 y 835 MPa, que fueron las mismas condiciones descritas en 2.2.1.1, pero esta vez
los tiempos se alargaron a 1, 12 y 24 horas en un horno 48000 de Thermolyne.
2.2.2 Pastillas porosas de TiO2
Para obtener las pastillas porosas de TiO2 se siguió la misma ruta que para las pastillas densas, solo que el
polvo de TiO2 se mezcló con polietilenglicol (PEG) en un mortero de ágata (ver Figura 11) hasta tener una
mezcla uniforme. El PEG utilizado fue de la compañía Sigma-Aldrich con un peso molecular medio de 3350
(PEG3350) y 8000 (PEG8000). Las relaciones en peso PEG:TiO2 que se usaron fueron 1:2, 1:3 y 1:4. Las
pastillas se sinterizaron por el método de sinterización rápida en fase líquida a 1100 oC por 2 minutos.
2.3 Recubrimientos de fosfatos de calcio
Los recubrimientos de fosfatos de calcio se llevaron a cabo por la técnica de erosión iónica usando un
blanco de hidroxiapatita, que se preparó a partir de polvos sintetizados por sol-gel. Los métodos llevados
a cabo para elaborar el blanco y depositar los recubrimientos, se describen en esta subsección.
2.3.1 Polvo de hidroxiapatita
El polvo de hidroxiapatita se preparó por dos métodos: el de sol-gel y el de combustión.
22
2.3.1.1 Polvo de hidroxiapatita preparado por sol-gel
Con la finalidad de mejorar la disolución de los iones de calcio y fósforo de los precursores para facilitar
su reacción, así como para evitar la formación de fases secundarias, se utilizaron tres variantes del método
de sol-gel, esquematizadas en la Figura 12.
En la primera variante (disuelto simple) los precursores se disolvieron en 2 ml de alcohol etílico (etanol,
99.5%) con agitación de 200 rpm a 65 oC durante 12 h. En la segunda variante (disuelto por separado) los
precursores se disolvieron por separado cada uno en 1 ml de etanol durante 15 min con agitación de 200
rpm; posteriormente, se mezclaron y dejaron secar durante 12 h a 65 oC con agitación. En la última
variante (molido-disuelto) los precursores fueron molidos por separado en un mortero de ágata para
formar polvos finos que se disolvieron por separado en 1 ml de etanol en agitación a 200 rpm durante 15
min; luego, las disoluciones se mezclaron y finalmente se dejaron secar a 65 oC con agitación durante 12
h.
En cada una de las variantes se realizaron los cálculos para obtener 0.20 gramos de hidroxiapatita pura,
para lo cual se utilizaron 0.4702 g de nitrato de calcio tetrahidratado (Ca(NO3)24H2O, 99.99%) y 0.1578 g
de fosfato diamónico ((NH4)HPO4, 99.9%). Los polvos obtenidos se caracterizaron por DRX y SEM. Además,
se realizó un análisis de termogavimetría y calorimetría diferencial de barrido usando una velocidad de 10
oC por min.
23
Figura 12. Síntesis por sol-gel del polvo de hidroxiapatita.
2.3.1.2 Método de Combustión
El de combustión es un método de síntesis de polvos con energía de reacción suministrada a través del
calentamiento generado por un combustible. Puede realizarse de dos maneras: húmeda o seca. La forma
más común es vía húmeda, que consiste en poner los reactivos precursores y el combustible en una
solución acuosa. Posteriormente, se eleva la temperatura de la solución hasta llegar al punto de ignición
del combustible, obteniendo así una combustión autosostenida donde tiene lugar la conversión de los
precursores en el material deseado. En la vía de combustión seca, antes del calentamiento y hasta la
24
temperatura de ignición del combustible, se evapora el agua utilizada para la disolución. La principal
desventaja que tiene este tratamiento es una distribución no uniforme de la temperatura durante la
ignición (K. Patil, Aruna, & Ekambaram, 1997; S. Specchia, E. Finocchio & G. Busca, 2010).
En general, los combustibles que se utilizan en la síntesis por combustión son compuestos orgánicos
derivados del nitrógeno o nitrógeno-oxígeno, aunque también puede utilizarse sacarosa (C12H22O11),
nitrato de amonio (NH4NO3) o ácido cítrico (C6H8O7), para que, durante la combustión, se genere dióxido
de carbono (CO2) y agua (H2O), entre otros compuestos que no dejan residuos y así obtener una
combustión limpia y controlada, además de una alta temperatura. El combustible proporciona la energía
necesaria para la formación del compuesto. Basado en observaciones empíricas, se ha encontrado que la
temperatura más alta se obtiene cuando la relación de equivalencia entre oxidante y combustible es de
uno. Se define la relación molar equivalente óxido/combustible (ox/comb) en términos del coeficiente
estequiométrico de cada elemento en la fórmula:
ox/comb=∑ 𝑆𝑝𝑟𝑒𝑐𝑝𝑟𝑒𝑐 ∑ 𝑣𝑜𝑥∙𝑞𝑜𝑥𝑜𝑥
−∑ ∑ 𝑣𝑟𝑒𝑑∙𝑞𝑟𝑒𝑑𝑟𝑒𝑑𝑐𝑜𝑚𝑏=
𝑚𝑜𝑙𝑜𝑥
𝑚𝑜𝑙𝑐𝑜𝑚𝑏= 1 (1)
donde 𝑣𝑟𝑒𝑑, 𝑣𝑜𝑥 son los coeficientes de oxidante y combustible respectivamente en sus fórmulas
condensadas, 𝑞𝑜𝑥 y 𝑞𝑟𝑒𝑑 son las valencias ponderadas para el oxidante y el combustible. Finalmente, 𝑆 es
el coeficiente del catión en la ecuación balanceada (coeficiente que toma mayor importancia cuando se
utilizan dos o más cationes). La suma de la ecuación 1 se hace sobre todos los oxidantes y combustibles
considerados en la reacción, con lo cual se puede determinar la cantidad óptima de combustible (K. C.
Patil et al., 2008).
2.3.1.3 Condiciones de preparación del polvo de hidroxiapatita por combustión
Se preparararon dos soluciones para sintetizar 0.1 g de hidroxiapatita por el método de combustión en
una de ellas se disolvió nitrato de calcio tetrahidratado (Ca(NO3)4H2O) en 10 ml de agua desionizada y se
ajustó el pH de la solución a 0 agregando 0.5 ml de HNO3. En la segunda solución se disolvió fosfato
diamónico ((NH4)2HPO4) en la misma cantidad de agua y se agregó 2.0 ml de HNO3 para obtener el mismo
pH. Estas soluciones se mantuvieron a 200 rpm por 10 min y luego se agregó la solución con calcio a la
solución con fósforo. Durante este paso, además, se agregó el combustible y la solución resultante se agitó
a 200 rpm durante 10 min. Basados en la literatura se experimentó con dos combustibles: la
25
carbohidrazida (CH6N4O) y la glicina (C2H5NO2) en cantidades calculadas por medio de la relación molar
equivalente oxidante/combustible (S. Specchia, E. Finocchio, G. Busca, 2010), determinando una masa de
0.235 g para ambos combustibles. Después, se evaporó el agua a una temperatura entre 90-95 oC. Cuando
la solución se redujo hasta ~10 ml se introdujo a un crisol y se dejó en un horno a 150 oC por 4h.
Posteriormente, el crisol se extrajo del horno y se subió la temperatura del mismo hasta 550 oC. Una vez
alcanzada dicha temperatura, el crisol se reintrodujo al horno ocurriendo la combustión después de unos
minutos. Se mantiene la temperatura durante 30 min y, finalmente, se deja enfriar la muestra hasta
temperatura ambiente a 5 oC por min. El proceso descrito se esquematiza en la Figura 13. Los polvos
obtenidos se caracterizaron por DRX y SEM.
Figura 13. Esquema de la síntesis de hidroxiapatita por el método de combustión.
2.3.2 Blanco de hidroxiapatita
El blanco de hidroxiapatita para la elaboración de los recubrimientos de fosfato de calcio se elaboró en
forma de pastilla de 2 pulgadas de diámetro prensando los polvos obtenidos por la técnica de sol-gel con
174.06 MPa y, posteriormente, se realizó un tratamiento térmico a 700 oC por 2 horas.
26
2.3.3 Recubrimientos de fosfatos de calcio
En los siguientes apartados se presentan los conceptos básicos sobre el crecimiento de recubrimientos y
sobre la técnica de erosión iónica [descritos con detalle en la tesis de maestría de Duilio Valdespino
(Valdespino Padilla, D. 2013), usada para los recubrimientos de fosfatos de calcio.
2.3.3.1 Crecimiento de películas
El proceso de crecimiento de un recubrimiento puede dividirse en cuatro etapas: adsorción, difusión,
nucleación y el aumento del espesor del recubrimiento.
Cuando una molécula se acerca a la superficie de un substrato es adsorbida, ya sea por fisisorción o
quimisorción. En la primera se establecen enlaces débiles, del tipo de Van der Waals, mientras que en la
segunda se llevan a cabo enlaces químicos. Si la molécula absorbida adquiere suficiente energía térmica,
puede romper el enlace y ser desorbida; o bien, puede moverse sobre la superficie del substrato, proceso
conocido como difusión (ver Figura 14). La difusión permite a las moléculas encontrar sitios de nucleación
donde se forman pequeños agregados de partículas que crecen y se extienden, dando lugar al
recubrimiento.
Figura 14. Esquema del proceso de difusión de una molécula adsorbida sobre una superficie (Valdespino Padilla, D. 2013; Smith, 1995).
27
2.3.3.2 Técnica de erosión iónica
Esta técnica consiste en bombardear con iones al blanco del material deseado. Los iones transfieren su
momento a las moléculas de la superficie del blanco, haciendo que sean expulsadas y puedan depositarse,
después, en otro material llamado substrato, dando lugar al recubrimiento (ver Figura 15).
Figura 15. Esquema del proceso de erosión iónica (Smith, 1995).
La técnica se lleva a cabo en una cámara de alto vacío (~10-6 Torr). Dentro de ella se encuentran dos
electrodos a los que se les aplica una diferencia de potencial que acelera los electrones en la cámara,
proporcionándoles energía suficiente para chocar con los átomos de un cierto gas (normalmente uno
inerte como argón), ionizándolo. Los electrones que chocaron, los generados en el proceso de ionización
y los desprendidos por el bombardeo del blanco, son nuevamente acelerados, dando lugar a un efecto en
cascada autosostenible.
Los sistemas de erosión iónica pueden utilizar una fuente de corriente directa si el blanco es conductor, o
una de radiofrecuencia, en caso de materiales aislantes; además pueden tener un arreglo de imanes,
llamado magnetrón, que afecta la trayectoria de los electrones obligándolos a permanecer cerca del
blanco, aumentando así la eficiencia de erosión.
28
2.3.3.3 Condiciones utilizadas para el depósito de hidroxiapatita
Las condiciones de depósito por erosión iónica, para los recubrimientos de hidroxiapatita se muestran en
la Tabla 3. Los sustratos utilizados fueron Si (100) y Pt/TiO2/Si (100) solo como soportes del recubrimiento.
Posteriormente al depósito se realizaron tratamientos térmicos, en un horno 48000 de Thermolyne, a 500,
600, 700 y 800 oC durante 1 y 3 h. Las muestras fueron caracterizadas por XRD y por espectroscopía de
fotoelectrones emitidos por rayos-X (XPS, X-Ray Photoelectron Spectroscopy), en un equipo SPECS con un
analizador Phoibos 150WAL, una fuente microfoco XRC1000 con ánodo de aluminio.
Tabla 3. Condiciones de depósito de los recubrimientos hidroxiapatita, elaborados por la técnica de erosión iónica.
Parámetro de depósito Variables
Tipo de erosión iónica: Radio frecuencia
Potencia: 100, 110 y 120 W
Flujo de argón: 2 sccm
Flujo de oxígeno: 0, 4 y 8 sccm
Tiempo: 2 h
Sustrato: Si (100), Pt/TiO2/Si(100)
Tratamiento térmico ex situ: 0, 1 y 3 h
2.4 Pruebas de respuesta biológica: hemólisis y proliferación celular
Enseguida se describen las pruebas de hemólisis y de proliferación, que se realizaron por triplicado para
cada muestra.
2.4.1 Hemólisis
Es una prueba para determinar la toxicidad en sangre (o, equivalentemente, para evaluar la compatibilidad
del material en sangre). La hemólisis se realiza en una solución salina de eritrocitos (glóbulos rojos) de
conejo o humanos. Específicamente, se evalúa si el material o alguno de sus componentes son capaces de
romper la membrana de los glóbulos rojos, causando que la hemoglobina sea liberada. Por lo tanto, lo que
se mide es el porcentaje de la hemoglobina liberada por la acción del material. El porcentaje de hemólisis
inducida por el material se obtiene midiendo por espectrofotometría la absorbancia de la solución de
eritrocitos después de estar en contacto con el material, en una incubadora a 37 oC durante 60 min, y se
29
lleva a cabo la comparación con los controles negativos y positivos. El control negativo es un material no
tóxico para las células y que no altera su funcionamiento normal. En particular, se utilizó solución salina
amortiguada por fosfatos (PBS, por sus siglas en inglés Phosphate-Buffered Saline). El control positivo es
un material que rompe la membrana celular provocando la liberación total de la hemoglobina, es decir un
100% de hemólisis, para lo cual se utilizó Tritón X100.
Para el ensayo de hemólisis se sigue la norma con el ISO 10993-4, la cual permite un máximo del 5% de
hemólisis. Si el material supera este valor es considerado como tóxico.
2.4.2 Proliferación celular
El ensayo de proliferación celular consistió en cultivar, osteoblastos de línea celular MC3T3-E1 en un suero
nutritivo. Justo antes de iniciar el ensayo, las muestras se sometieron a esterilización por calentamiento y
radiación ultravioleta. Posteriormente se cuentan y se separan 10 000 células que se transportan a un
pozo de cultivo donde previamente se colocó la muestra a caracterizar con un volumen fijo de suero
nutritivo. Las muestras se dejan en contacto con las células durante 24 h en una incubadora de CO2 a 37
oC. Después de este periodo, la muestra con células implantadas se retira del pozo y se transporta a un
nuevo pozo con medio nutritivo, donde se deja durante 24, 48 y 72 h. Este paso se lleva a cabo para
asegurar que la proliferación celular determinada por el ensayo es exclusivamente de las células que se
implantaron sobre la muestra y no sobre las paredes y fondo del pozo de cultivo. Una vez trascurrido el
tiempo de proliferación se realizó una tinción con resazurina al 10%. La resazurina (también llamada azul
de alamar) es útil para detectar la actividad reductiva en las células y ha sido ampliamente utilizada para
medir la proliferación y la actividad metabólica mitocondrial. Tal compuesto por sí solo no es fluorescente
hasta que es reducido a resorufina y altamente fluorescente, la que tiene una longitud de excitación de
563 nm y longitud de onda de emisión de 587 nm. La transformación de la resazurina a resorufina se lleva
a cabo por medio de encimas mitocondriales. Dicha trasformación es utilizada para determinar el número
de células en el pozo de cultivo mediante una curva de calibración previamente calculada. La medición se
realiza excitando con una longitud de onda 570 nm y 600 nm. El proceso del ensayo de proliferación celular
se esquematiza en la Figura 16.
30
Figura 16. Diagrama del ensayo de proliferación celular realizado a los soportes de TiO2.
31
Capítulo 3. Resultados y discusión
El capítulo, al igual que la metodología, se divide en cuatro secciones sobre los resultados y discusión de:
1) el polvo de TiO2, 2) las pastillas densas y porosas de TiO2, 3) los recubrimientos fosfatos de calcio, y 4)
las pruebas biológicas de hemólisis y proliferación de células óseas.
3.1 Polvo de TiO2
Al polvo sintetizado por sol-gel se le realizaron análisis de termogravimetría y calorimetría diferencial de
barrido, así como de DRX; los resultados obtenidos se muestran en la Figura 17. El análisis por TGA y DSC
puede dividirse en cuatro zonas principales, ilustradas en la Figura 17a:
Zona I (temperatura ambiente hasta 400 oC). La pérdida de peso en esta zona, de acuerdocon el
análisis de TGA, se atribuye a la evaporación de agua y oxidación de compuestos orgánicos que resulta
de la síntesis por el método de sol-gel. Además, en la curva de de DSC (curva roja de la Figura 17a) se
puede observar una señal endotérmica debida al cambio de una fase del TiO2 amorfo a la fase
anatasa. La Figura 17b confirma el cambio de la fase amorfa, presente en el difractograma de 150 oC
y el comienzo de la formación de la anatasa, en el difractograma de 400 oC.
En la Zona II (400-600 oC) el TGA muestra que se continúa con la oxidación de las sustancias orgánicas
remanentes (Tang et al., 2012; Wang et al., 2016). La alta pérdida de peso asociada al cambio de la
pendiente del TGA en conjunto con el máximo de la curva del DSC (Figura 17a), se debe al aumento
de la cristalinidad de la anatasa (Koch, et al., 2007; Marinescu, et al., 2011), lo que se corrobora en el
difractograma de la Figura 17b por la reducción del ancho y mejor definición de los picos.
La trasformación de la fase anatasa en rutilo ocurre en la Zona III (600-850 oC, Figura 17a). La
coexistencia de las dos fases se confirma con el difractograma de 700 oC mostrado en la Figura 17b.
Tal trasformación es asociada al cambio de la pendiente de la curva del TGA y a la respuesta
endotérmica en el DSC cerca de los 700 oC.
La fase del rutilo puro se encuentra en la zona IV (por encima de los 850 oC), corroborada por el la
respuesta exotérmica que muestra el DSC (Figura 17a) (Marinescu et al., 2011), la ausencia de pérdida
en peso en el TGA (Figura 17a) y el difractograma de la Figura 17b.
32
Figura 17. a) TGA y DSC de los polvos obtenidos por sol-gel y b) XRD de tales polvos calcinados a diferentes temperaturas.
La fase de rutilo tiene un módulo elástico de 217 GPa, mientas que el de la anatasa es de 192
GPa. Puesto que uno de los objetivos principales de este trabajo era hacer pastillas porosas de TiO2, y
dado que la presencia de poros en las mismas disminuiría su módulo elástico, era necesario partir de una
fase con el mayor módulo elástico: la de rutilo. Sinterizando a temperaturas mayores a 850°C, y de
acuerdo a los resultados de la Figura 19, esta fase se obtendría con seguridad. Por ello, en la siguiente
sección se describe la elaboración de pastillas a temperaturas de 900, 1000 y 1100 oC.
3.2 Pastillas densas de TiO2
3.2.1 Pastillas densas de TiO2 preparadas por RLPS
Con el polvo preparado por sol-gel se elaboraron pastillas de TiO2, y se sinterizaron por la técnica de RLPS
(rapid liquid phases sintering) a temperaturas de 900, 1000 y 1100 oC, por 2, 5, 7 y 10 minutos. Para
formar las pastillas en verde se usaron dos presiones, de 624.7 y 832.5 MPa.
Las pastillas presentaron la fase pura de rutilo (de hecho, todas las pastillas reportadas en esta
tesis presentaron la misma fase), la cual fue comprobada por XRD. En la Figura 18 se observa un ejemplo
representativo de los difractogramas obtenidos.
33
Figura 18. XRD de una pastilla de TiO2 preparada por RLPS a 1100oC por 2 min.
El efecto de la temperatura en la morfología se muestra en la Figura 19a. Antes del sinterizado las
muestras no presentaron granos, pero sí grietas. El tratamiento térmico a 900 oC empieza a formar
granos, pero ellos no están bien definidos, posiblemente debido a que la temperatura no fue lo
suficientemente alta para inducir la fase líquida característica de la técnica RLPS. Con 1000 y 1100 oC se
formaron granos bien definidos y aumentó la densidad (Figura 19b), siendo la más alta obtenida de 2.78
g/cm3, en la muestra sinterizada a 1100 oC por dos minutos (Figura 19c).
(110)
(101)
(200) (1
11)
(211)
(220)
(002)
(310)
(301)
(112)
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
I/I 0
(u
. a
.)
2q (º)
2 min, 1100 ºC
TiO2 Rutilo ICDD 01-087-0920
34
Figura 19. a) Micrografía de SEM, b) tamaño de grano y c) densidad de la pastilla en verde y las sinterizadas a 900, 1000 y 1100 oC por 2 min.
Puesto que la mayor densidad era requerida porque al inducir poros en las pastillas se disminuiría, 1100
oC fue la temperatura escogida para la sinterización de las pastillas de TiO2 en el resto de este trabajo.
Fijando la temperatura de sinterizado en 1100 oC, se analizó el efecto del tiempo de sinterizado, que se
varío de 2 a 5, 7 y 10 min. La morfología de las pastillas se muestra en la Figura 20a. Los tiempos usados
no tienen un gran efecto en el tamaño de grano, que, de acuerdo a la gráfica de la Figura 20b, es similar
900 1000 11000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
900 oC
1000 oC
1100 oC
b) 2 min
Ta
ma
ño
de g
ra
no
(
m)
Temperatura (oC)0 900 1000 1100
56
58
60
62
64
66
2.36 g/cm3
2.65 g/cm3
2.71 g/cm3
2.78 g/cm3
c)
Den
sifi
ca
ció
n (
%)
Temperatura (oC)
2 min
35
en todas las muestras; pero sí reduce la densidad, como se ve en la Figura 20c, lo que puede atribuirse
al incremento en la presencia de grietas en la Figura 22a.
Figura 20. a) Micrografía de SEM, b) tamaño de grano y c) densidad de muestras sinterizadas a 1100 oC por 2, 5, 7 y 10 min.
Los resultados presentados en la Figura 19a y en la Figura 20b son de las muestras compactadas con
cargas de 624.7 MPa, mientras que las elaboradas con 832.5 MPa presentaron una morfología similar.
Su tamaño de grano y densificación también fue similar, por lo que la diferencia se encuentra
considerada dentro de las barras de error mostradas en las Figura 19b,c y Figura 20b,c.
2 4 6 8 100.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
2 min5 min
7 min10 min
b) 1100 oC
Ta
ma
ño
de g
ra
no
(
m)
Tiempo (min)2 4 6 8 10
54
56
58
60
62
64
66 2.78 g/cm3
2.6 g/cm3
2.68 g/cm3
2.43 g/cm3
c) 1100 oC
Den
sifi
ca
ció
n (
%)
Tiempo (min)
36
La densidad más alta, entonces, fue la obtenida con 1100 oC y 2 min de sinterización. Estas condiciones
fueron las que más adelante se usaron para sinterizar las pastillas porosas de TiO2. Además, dado que la
presión de empastillado no influye mucho en la densidad, se escogió la menor de las presiones para
elaborar las pastillas, la de 624.7 MPa.
3.2.2 Pastillas densas de TiO2 preparadas con LTS
Por comparación, se elaboraron pastillas en las mismas condiciones anteriores, sólo que usando largos
tiempos de sinterizado (LTS): de 1, 12 y 24 h. La morfología adquirida se muestra en la Figura 21a. El
tamaño de grano y la densidad aumentaron con el tiempo de sinterizado hasta las 12 h (Figura 21b-c),
pero disminuyeron para tiempos mayores (de 24h), lo que puede deberse a fenómenos de
recristalización (Burke y Turnbull, 1952). Las imágenes de la Figura 21 corresponden a muestras
empastilladas con una presión de 624.7 MPa, mientras que las elaboradas con 832.5 MPa no presentaron
cambios en la morfología, y la densidad y el tamaño de grano se encuentran considerados dentro de las
barras de error de las gráficas en la Figura 21b-c.
Figura 21. a) Micrografía de SEM, b) tamaño de grano y c) densidad de las muestras sinterizadas a 1100 oC por 1, 12 y 24 h.
37
Así, entonces, con solo 2 min de sinterizado en el método de RLPS se alcanza una densidad de 2.78 g/cm3,
mientras que con el método de LTS es necesario usar un tiempo mayor a 3 h para obtener un valor similar
(ver Figura 23). Esta ventaja, de obtener altas densidades usando tiempos cortos para en el método de
RLPS, es el resultado de una mejor coalescencia de los granos promovida por la fase líquida que se forma
en la superficie de los mismos, debido al rápido cambio de la temperatura (German et al., 2009). Si la
fase líquida no se forma, tal coalescencia sólo se logrará usando tiempos de síntesis largos (Rahimian, et
al., 2009), lo que efectivamente se comprobó aquí.
Cabe mencionar que la reducción del tiempo de sinterizado en la técnica de RLPS, tiene la ventaja
adicional de disminuir el gasto de la energía eléctrica, ya que el tiempo de uso de la misma es alrededor
de dos órdenes de magnitud menor, con respecto a otros métodos de síntesis, en particular el de LTS.
3.2.3 Pastillas porosas de TiO2
Las pastillas porosas se prepararon por RLPS, en las condiciones optimizadas para las pastillas densas:
1100 oC por 2 min, usando una presión de empastillado de 624.7 MPa; con la diferencia de que se agregó
polietilenglicol (PEG) al polvo sintetizado por sol-gel, antes del empastillado. Se utilizaron dos tipos de
PEG (PEG3350 y PEG8000), en relaciones en peso PEG:TiO2 de 1:2, 1:3 y 1:4.
La sinterización a 1100 oC por 2 min hacía fragmentar las muestras o causaba su fractura al manipularlas
para sacarlas del horno, debido a la alta presión causada por el PEG sublimado. Por esta razón se
introdujo un tratamiento térmico previo a una temperatura menor, de 450 oC por 2 min, para ayudar a
liberar parte del gas y disminuir, con ello, la presión en la posterior sinterización a 1100 oC por 2min.
Aunque las pastillas con mayor contenido de PEG (PEG:TiO2 de 1:2 y 1:3) seguían fracturándose, las de
relación PEG:TiO2 de 1:4 ya no, de tal manera que dicha relación fue la usada en lo que prosiguió de
investigación.
La descripción del proceso que tiene lugar durante la síntesis de las pastillas y que produce los poros y
canales de interconexión observados experimentalmente (mostrados más adelante) se ilustra en la
Figura 22 y se describe a continuación:
38
a) Al prensar el PEG+ polvo de TiO2, el resultado son pastillas en verde conformadas por cúmulos
de PEG embebidos en una matriz de TiO2.
b) El tratamiento térmico a 450 oC por 2 min provoca la sublimación del PEG.
c) La presión generada por el gas sublimado hace que parte del gas se libere de la matriz de TiO2
creando pequeñas cavidades y canales finos.
d) La muestra se lleva a temperatura ambiente y después se somete al tratamiento térmico a 1100
oC por 2 min, lo que sublima el PEG nuevamente, pero la presión del gas es mayor (debido a la
mayor temperatura), con lo que se incrementa el volumen de las cavidades, se ensanchan los
canales y se produce una mayor interconectividad.
Figura 22. Proceso de formación de poros: a) pastilla sin tratamiento térmico con aglomerados de PEG dentro de una matriz de TiO2, b) tratamiento térmico a 450 oC por 2min y c) formación de pequeñas cavidades y canales; d) la sinterización a 1100 oC por 2 min sublima el PEG nuevamente incrementando la presión, la cual forma cavidades más grandes, canales más anchos y mayor interconectividad.
La morfología y el tamaño de poro de las pastillas, después del tratamiento térmico a 450 oC por 2 min,
se observa en la Figura 23. Las muestras preparadas con PEG3350 y PEG8000 tienen un tamaño de poro
de 38.5 ±27.5 µm y 49.0 ±32.3 µm, respectivamente; y correspondientes densidades de 2.12 ±0.02 g/cm3
(PEG3350) y de 2.19 ±0.02 g/cm3 (PEG8000). Debe notarse que, en general, los llamados poros están
definidos, indicativo de que el PEG no fue completamente liberado de muchos de ellos, se aprecia mejor
39
en la sección transversal de la Figura 23b, lo que resulta en un éxito del proceso propuesto ya que el
posterior aumento de la temperatura terminaría liberando el resto del PEG de una manera más
controlada, a través de los pequeños canales que se crean.
Figura 23. Micrografías de SEM (superficial y sección transversal) e histogramas del tamaño de poro de las pastillas de TiO2 preparadas con a) PEG3350 y b) PEG8000 después del tratamiento térmico a 450 oC por 2 min.
Después del tratamiento térmico a 450 oC por 2min, las pastillas se sometieron a una sinterización a 1100
oC por 2 min. La morfología causada, junto con el tamaño de poro y la densidad, se muestran en la Figura
24. El tamaño de poro y densidad fueron de 76.8 ±34.2 µm y 1.87 ±0.02 g/cm3 para el PEG3350, mientras
que para el PEG8000 fueron de 173.0 ±68.0 µm y 1.68 ±0.02 g/cm3. En consecuencia, un incremento en
la porosidad disminuye la densidad de las pastillas.
40
También, se prepararon muestras con una presión de 832.5 MPa, pero no se apreciaron
diferencias significativas en morfología, densidad o tamaño de poro.
Figura 24. Micrografía de SEM (superficial y sección transversal) y los histogramas correspondientes del tamaño de poro de las pastillas de TiO2 preparadas con a) PEG3350 y PEG8000 después del tratamiento térmico a 1100 oC por 2 min.
Así, entonces, el tamaño de poro y la interconectividad dependen de la presión interna ejercida por el
PEG sublimado y la rápida liberación del gas, lo que es consecuencia directa de la temperatura y tiempo
de sinterizado, además de la concentración y el peso molecular del PEG agregado.
41
Las curvas de esfuerzo-deformación de las muestras elaboradas con PEG3350 y PEG8000, y por
comparación de una elaborada sin PEG, se observan en la Figura 25, después de ajustarse a una recta
de cuya pendiente se obtiene el módulo elástico (Valdespino et al., 2019). Para la muestra sin PEG el
módulo elástico fue de 84.3 ±0.02 GPa, se reduce a 39.2 ±0.16 GPa para PEG3350 y aumenta a 121.3
±0.32 GPa para PEG8000, valores se explican de la siguiente manera:
Los poros son elementos de concentración de esfuerzos y, por lo tanto, son generadores de grietas
(William D. Calister, 2007), lo que explica la disminución del módulo elástico de la muestra con PEG3350
(con poros), con respecto a la preparada sin PEG. Sin embargo, cuando los poros son muy grandes, evitan
que las grietas se propaguen, lo que aumentaría el módulo elástico, que es precisamente lo observado
en la muestra de PEG8000, que presenta poros más grandes pero una densidad similar a la muestra de
PEG3350, indicativo de que posee una menor cantidad de poros. Es decir, la muestra con PEG8000 tiene
menos poros (menos centros de concentración de esfuerzos) más grandes (que evitan la propagación de
grietas).
Los módulos elásticos obtenidos son similares a los encontrados en la literatura para el TiO2 poroso (J.
Chen et al., 2013; Soares et al., 2007), pero particularmente para el caso de la muestra con PEG3350, el
valor se encuentra en el intervalo del módulo elástico reportado para los huesos, es decir, entre 0.05 a
60 GPa (Werner et al., 2007).
Figura 25. Curvas de esfuerzo vs. deformación de las pastillas de TiO2 sin-PEG, con PEG3350 y con PEG8000.
42
3.3 Recubrimientos de fosfatos de calcio
Aquí se proporcionan los resultados sobre los recubrimientos de fosfatos de calcio depositados por
erosión iónica, con el blanco de hidroxiapatita utilizado y los polvos de hidroxiapatita, necesarios para
elaborar el blanco, sintetizados por sol-gel y también, por combustión.
3.3.1 Polvos de hidroxiapatita preparados por sol-gel
La temperatura de sinterización para este método se definió mediante los análisis de TGA-DSC que se
muestran en la Figura 26. Los resultados se pueden dividir en 3 zonas principales:
A. Zona I (de temperatura ambiente hasta 100 oC): la pérdida de peso de la curva del TGA y el
cambio en la curva de DSC son atribuidas a la evaporación de agua y del etilenglicol, que son los
agentes utilizados para disolver los precursores de nitrato de calcio tetrahidratado Ca(NO3)24H2O y fosfato diamónico ((NH4)HPO4).
B. Zona II (de 100 oC a 450 oC): la pérdida en peso de la curva del TGA se asocia a la oxidación y
descomposición de compuestos orgánicos presentes en la disolución. Además, en la curva de
DSC se muestra un cambio en la pendiente, relacionada a un comportamiento exotérmico
asociado al inicio de la formación de fosfatos de calcio (Waheed et al., 2015).
C. Zona III (450 oC a 1000 oC): a temperaturas mayores de los 400 oC, la pérdida de peso se reduce
significativamente, lo que se puede deber a la evaporación de los pocos compuestos orgánicos
remanentes en la solución. Respecto a la curva de DSC, se observan una respuesta exotérmica
debido a la formación de fosfatos de calcio.
Estos resultados en conjunto con los obtenidos por el Dr. Guzmán y colaboradores (2005), quienes
encontraron que debajo de los 800 oC se tiene hidroxiapatita y Ca3(PO4)2 y por encima de esta
temperatura se forman, además, otros compuestos de calcio, como nitrato de calcio (Ca(NO3)2) o
carbonato de calcio (CaCO3), permitieron tomst la decisión de realizar el futuro tratamiento térmico de
los polvos a 700 oC por 2 horas, para que éstos tuvieran la fase de hidroxiapatita.
43
Figura 26. TGA y DSC del polvo precursor de hidroxiapatita obtenido por el método de sol-gel.
Después del tratamiento térmico a 700 oC por 2 h, las tres variantes de sol-gel de disuelto simple, disuelto
por separado y molido-disuelto (descritas en la sección 2.3.1.1) produjeron polvos, cuyos difractogramas
de rayos-x se muestran en la Figura 27. Todas las muestras presentan la fase de apatita, específicamente
de hidroxiapatita, fosfato de calcio [Ca3(PO4)2] y un óxido de Ca. Como la variante 2 posee la mayor razón
de intensidades hidroxiapatita/Ca3(PO4)2, fue la escogida para los estudios subsecuentes.
100 200 300 400 500 600 700 800 900 100076
80
84
88
92
96
100
18.5%
Temperatura (oC)
TG
A (
%)
5%
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
Zona IIIZona IIZona I
DS
C (
mW
/g)
Zona I
44
Figura 27. XRD de las variantes del método de sol-gel usado para la obtención de polvo de hidroxiapatita.
3.3.2 Polvos de hidroxiapatita preparados por combustión
Para la síntesis del polvo de hidroxiapatita por el método de combustión se probaron dos combustibles:
la glicina y la carbohidrazida. El difractograma de rayos X de la Figura 28 muestra que, para ambos, se
obtiene hidroxiapatita, pero con la carbohidrazida se generan otros fosfatos de calcio, lo que puede
deberse a las temperaturas más altas que se alcanzan con ese combustible, por arriba de los 800 oC,
puesto que a tales temperaturas se promueve la formación de diversas fases de fosfatos de calcio
(Guzmán et al., 2005). Así, entonces, se escoge la glicina como combustible para elaborar polvos por
método de combustión, con una mayor presencia de hidroxiapatita.
45
Figura 28. XRD de los polvos sintetizados por el método de combustión usando dos combustibles: glicina y carbohidrazida.
Los polvos obtenidos por combustión, utilizando como combustible la glicina, se trataron térmicamente
a 700 oC por 2 h para comprar los resultados con lo obtenidos por sol-gel, pero también se realizaron
otros tratamientos térmicos a temperaturas mayores (800 oC) y tiempos menores (1h). Los
difractogramas asociados se encuentran en la Figura 29. Todas las muestras presentaron las fases de
hidroxiapatita y fosfato de calcio (Ca3(PO4)2). El incremento del tiempo a 2h mejora la cristalinidad de
todas las fases, lo que se deduce de la reducción del ancho de los picos y su mejor definición. El aumento
en la temperatura también genera una mayor cristalinidad, y también, aumenta la presencia de fosfato
de calcio. Así, para obtener la mayor presencia y mejor cristalinidad de la hidroxiapatita, habría que
sinterizar a 700 oC por 2 h.
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
(00
2)
(21
0)
(21
1)
(11
2)
(30
0)
(20
2)
(13
0)
(22
2)
(21
3)
(32
1)
DD
*
****
**
*
*
*
Carbohidrazida
I/I 0
(u
. a
.)
2q (o)
Hidroxiapatita (*)
PDF [01-074-0566]
Fosfato de calcio (D)
PDF [01-070-2065]
Glicina
D
46
Figura 29. XRD del polvo obtenido por combustión utilizando como combustible glicina, con tratamientos térmicos a 700 y 800 oC por 1 y 2 h.
Los difractogramas de los mejores polvos tratados térmicamente, obtenidos por sol-gel (variante 2, 700
oC por 2 h) y combustión (glicina, 700 oC por 2 h), se presentan en la Figura 30. De ellos, el
correspondiente a los polvos obtenidos por sol-gel, indica la mejor cristalinidad de la fase de
hidroxiapatita y la mayor razón hidroxiapatita/Ca3(PO4)2. Por otro lado, los polvos obtenidos por sol-gel
poseen partículas (i. e aglomerados de critales) mas pequeños, efecto amplieamente conocido en el
método de sol-gel efecto ampliamente conocido del método de sol-gel (Enríquez Pérez, E. 2013; Y.
Hernández Sánchez, M. 2013), importante para la coalescencia de granos y mayor densidad del blanco
(Kramer, 2003). Además, en el método de sol-gel se tiene el control de la temperatura, mientras que, en
el de combustión, eso no es posible (Hench y West, 1990; S. Specchia, E. Finocchio, G. Busca, 2010). Por
estas razones, los polvos usados para elaborar el blanco empleado en la técnica de erosión iónica, fueron
elaborados por sol-gel.
47
Figura 30. XRD de polvos elaborados por los métodos de sol-gel y combustión, tratados a 700 o C por 2 h.
3.3.3 Blanco de hidroxiapatita
Los polvos elaborados según la sección anterior, por sol-gel, en la variante 2, se prensaron con 174.06
MPa para formar una pastilla con una densidad de 1.90 ± 0.04 gr/cm3, necesaria como blanco para
elaborar depósitos por erosión iónica.
3.3.4 Recubrimientos de fosfato de calcio
Los parámetros de depósito de los recubrimientos con el blanco sintetizado anteriormente, utilizando la
técnica de erosión iónica, para optimizar, se variaron de acuerdo a la Tabla 3 de la sección 2.3.3.3. Todos
los recubrimientos depositados a potencias de 100, 110 y 120 W; flujo de O2 de 0, 2, 4 sccm; y flujo de
Ar de 2 sccm; con tratamiento térmico ex situ a 500, 600, 700 y 800 oC, durante 1 y 3 h; mostraron los
elementos característicos de las apatitas: Ca y P, como se observa en el espectro de EDS de la Figura 31a.
48
Sin embargo, ninguno de ellos fue cristalino, y solo los depósitos tratados térmicamente a 700 y 800 oC
por 1 h presentaron un pequeño pico que podría asociarse a fosfato de calcio, solo que el de 800 oC por
1 h fue ligeramente más cristalino, como se observa en el difractograma en la Figura 31b. Por ello, se
elaboraron nuevos recubrimientos tratados térmicamente a 800 oC por 3 h para incrementar la
cristalinidad, pero no hubo diferencia apreciable en su difractograma con respecto al de 800 oC por 1 h
ya mostrado en la Figura 31a.
Figura 31. a) Espectro de EDS y b) XRD de recubrimientos elaborados por erosión iónica a 100 W, 2 sccm de Ar, 4 sccm de O2, 2 h de depósito, y tratados térmicamente a 700°C y 800°C por 1h.
Para identficar el tipo de apatita se obtuvieron espectros de XPS de los depósitos con tratamientos
térmicos de 800oC por 1 y 3h, que se presentan en la Figura 32. En tales estudios se compararon con la
base de datos del NIST (National Institute of Standards and Technology), que proporciona la energía de
enlace de los iones de calcio y fósforo en la hidroxiapatita, de 347.00 eV y 133.80 eV, respectivamente;
mientras que en el Ca3(PO4)2 es de 347.70 eV para el calcio y 132.90 eV para el fósforo. Las energías de
enlace del depósito con tratamiento térmico de 800 oC por 1 h fueron de 346.40 eV para el calcio y 132.3
eV para el fósforo, i.e. que el Ca tiende a formar un enlace de energía similar a la hidroxiapatita, mientras
que en el fósforo la energía de enlace es similar a la de Ca3(PO4)2. El depósito con tratamiento térmico
de 800 oC por 3 h presenta energías de enlace del Ca de 348.05 eV y 133.76 eV para el fósforo, lo que
invierte el comportamiento con respecto al depósito de 800 oC por 1 h, ya que el calcio forma un enlace
49
de energía similar al Ca3(PO4)2, mientras que el del fósforo es parecido al de hidroxiapatita. En
consecuencia, aunque no es posible determinar el porcentaje de cada compuesto, se confirma la
presencia de ambos en los depósitos. Puesto que tanto la hidroxiapatita como el Ca3(PO4)2 promueven
el crecimiento celular óseo (H. Chen et al., 2017), se usa, en lo que sigue del trabajo, el tratamiento
térmico de menor tiempo, de 800 oC por 1 h.
Figura 32. XPS de los depósitos elaborados por erosión iónica, a 100 W, 2 sccm de Ar, 4 sccm de O, 2 h de depósito y tratados a 800 oC por 1 o 3 h.
Nota: mientras se realizaba el resto de la investigación descrita abajo, éstas muestras se le mandaron al
Dr. Gabriel Rojas George para su caracterización en el difractómetro de rayos X PANalytical XPert PRO
del CIMAV en Chihuahua. Los difractogramas para ambas muestras, de 800 oC por 1 y 3 h, fueron
idénticos. El correspondiente a la muestra de 800 oC por 1 h se presenta en la Figura 33. Se observa la
50
presencia de hidroxiapatita y Ca3(PO4)2. En consecuencia, sí se encontraban presentes ambas fases
cristalinas en los recubrimientos realizados, pero en el difractómetro Panalitycal X’pert Pro MRD de la
UNaC del CNyN-UNAM no se detectaron. Las razones posibles fueron fallas en el equipo, mismas que
hicieron que este dejara de funcionar, o que los difractogramas no fueron bien tomados, tales
suposiciones podrán corroborarse una vez que el equipo entré nuevamente en funciones. Actualmente
también se han enviado el resto de los recubrimientos para su caracterización por XRD.
Figura 33. XRD de los depósitos elaborados por erosión iónica, a 100 W, 2 sccm de Ar, 4 sccm de O2, 2 h de depósito y tratados a 800 o C por 1 h.
El espesor de las muestras tratadas térmicamente a 800 oC por 1 y 3 h, poseen un espesor aproximado,
obtenido por elipsometría, de 176 nm.
En las condiciones optimizadas para los depósitos de hidroxiapatita-Ca3(PO4)2 (100 W, 2 sccm de Ar y 4
sccm de O), se recubrieron por erosión iónica los andamios de TiO2 (elaborados en la sección 3.2.3) sin
poros inducidos, y con poros de 76.8 y de 173.0 µm. Estos últimos obtenidos al usar PEG3350 y PEG8000,
respectivamente. Se utilizaron tiempos de depósito de 5 y 30 min, y un tratamiento térmico posterior
de 800 oC por 1 h. La morfología de ellos se presenta en la Figura 34. En la muestra de 5 min se observan
pequeños granos aislados de aproximadamente 0.3 m, mientras que en la de 30 min se aprecian
aglomeraciones de granos que cubren el substrato.
20 30 40 50 60 70 80 90
D*
D
D
D
Hidroxiapatita (*)
PDF(01-074-0566)
Ca3(PO4)2 (D)
PDF(00-002-0786)
I/I o
(u
. a
.)
2q (o)
800 oC/1 h
*
D
51
Figura 34. SEM de los depósitos de hidroxiapatita y Ca3(PO4)2 sobre las pastillas de TiO2 a) sin depósito, con depósito de b) 5min y c) 30min, d) amplificación de la imagen en c).
Hasta aquí se han descrito pastillas de TiO2 con diferente tamaño de poro (usando PEG3350 o PEG 8000),
y recubrimiento de hidroxiapatita-Ca3(PO4)2. En la Tabla 4 se enlista el nombre de dichas pastillas y se
especifica su tamaño de poro y tiempo de recubrimiento.
Tabla 4. Nombre, tamaño de poro y tiempo de recubrimiento de pastillas de TiO2, agrupadas en diferentes colores dependiendo de su tiempo de recubrimiento.
Nombre de la muestra
Tamaño de
poro (m) Tiempo de
recubrimiento (min) Grupo
TiO2 Sin poros
Sin recubrimiento I 76.8 m 76.8 ± 34.2
173.0 m 173.0 ± 68.0
TiO2 -5 min Sin poros
5 II 76.8 m -5 min 76.8 ± 34.2
173.0 m -5 min 173.0 ± 68.0
TiO2 -30 min Sin poros
30 III 76.8 m -30 min 76.8 ± 34.2
173.0 m -30 min 173.0 ± 68.0
52
3.4 Pruebas biológicas
Siendo uno de los objetivos principales de este trabajo el de conocer la influencia del tamaño de poro y
recubrimiento de hidroxiapatita-Ca3(PO4)2 en la proliferación de células óseas, se llevó a cabo esta
prueba en las pastillas de la Tabla 4. Adicionalmente se realizaron pruebas de hemólisis para determinar
la toxicidad de las muestras. Ambos estudios se hicieron por triplicado, i.e. se llevaron a cabo en tres
muestras diferentes de cada una de las especificadas en la Tabla 4.
3.4.1 Hemólisis.
Los resultados de las pruebas de hemólisis en las pastillas de TiO2 se muestran en la Figura 35. En ella se
observa que el porcentaje de hemólisis máximo fue de 3.46%, menor incluso que el obtenido en el
control negativo (Control -), que fue de 3.50%. Puesto que todas las pastillas presentan una hemólisis
menor al 5%, se consideran, de acuerdo al ISO10993-4, hemocompatibles, i.e., las pastillas son no tóxicas
para las células.
Figura 35. Hemólisis de pastillas de TiO2 con y sin recubrimiento de hidroxiapatita-Ca3(PO4)2.
53
3.4.2 Proliferación celular
La proliferación celular (línea celular MC3T3-E1) que presentaron las pastillas de TiO2 con y sin
recubrimiento de hidroxiapatita-Ca3(PO4)2, después de 24 h de implantación y 24, 42 y 72 h de
incubación, se muestra en la Figura 36. El recubrimiento de hidroxiapatita-Ca3(PO4)2 no mejora la
proliferación celular en ninguna de las pastillas de TiO2, mientras que el tamaño de poro tampoco si
éste es de 173.0 µm. En cambio, en las pastillas con poros de 76.8 m, la proliferación es la mayor
no importando el grupo (ver recuadros punteados de la Figura 37), siendo 3.39 ± 0.05 veces mayor
que el control. Así entonces, aunque aún es necesario llevar a cabo estudios de diferenciación
celular, los que indicarían que quizá las células con menor proliferación han empezado su
diferenciación a osteocitos. En conclusión, de estos análisis es que los recubrimientos de
hidroxiapatita-Ca3(PO4)2 son innecesarios y que la proliferación se maximiza cuando el tamaño de
poro en las pastillas de TiO2 es de 76.8 m.
Figura 36. Proliferación celular (línea celular MC3T3-E1) en las pastillas de TiO2 con y sin recubrimiento de hidroxiapatita-Ca3(PO4)2, después de 24, 48 y 72 h.
54
Capítulo 4. Conclusiones
Esta sección presenta las conclusiones sobre la elaboración de pastillas porosas de TiO2 con
recubrimientos de hidroxiapatita-Ca3(PO4)2, y del estudio de relación del tamaño de poro y recubrimiento
en la implantación celular. Además, se sugiere el trabajo a desarrollarse en el futuro.
• Los polvos sintetizados por el método de sol-gel, a partir de isopropóxido de titanio y etanol,
adquieren la fase de anatasa del TiO2 a partir de los 400oC. A 700 oC se forma también rutilo y por
encima de los 850oC se obtiene solo rutilo.
• La densidad de las pastillas de TiO2 preparadas por el método de sinterización rápida en fase
líquida (RLPS), usando polvos obtenidos por sol-gel, aumenta con la temperatura de sinterizado
(900, 1000 y 1100 oC), disminuye con el aumento en el tiempo de sinterización (2, 5, 7 y 10 min),
y se mantiene similar con la presión de empastillado (624.7, 832.5 MPa). La máxima densidad, de
2.78 g/cm3, se obtiene en pastillas preparadas con 624.7 MPa y sinterizadas a 1100oC por 2min.
• Las pastillas de TiO2 preparadas con polvos obtenidos por sol-gel y polietilenglicol (PEG),
sinterizadas por RLPS a 1100 oC por 2 min con un tratamiento térmico previo de 450 oC por 2 min,
adquieren un tamaño de poro de 76.8 ± 34.2 m si se usa PEG3350, y 173.0 ± 68.0 m utilizando
PEG8000.
• El tamaño de poro obtenido y su interconectividad, dependen de la presión ejercida por la
sublimación del PEG y la rápida liberación del gas, como consecuencia de la temperatura y tiempo
de sinterizado, además de la concentración y el peso molecular del PEG agregado.
• El módulo elástico de las pastillas de TiO2 con poros de 76.8 m y de 173.0 m, es de 39.2 ±0.16
GPa y 121.3 ±0.32 GPa, respectivamente; el primero en el intervalo reportado para los huesos.
• Los polvos elaborados por sol-gel, a partir de nitrato de calcio tetrahidratado (Ca(NO3)24H2O) y
Fosfato diamónico ((NH4)HPO4), y sinterizados a 700oC por 2 h, presentan las fases de
hidroxiapatita y Ca3(PO4)2; éstas presentan una mejor cristalinidad que la obtenida por el método
de combustión.
• Los depósitos crecidos por la técnica de erosión iónica, usando un blanco de hidroxiapatita-
Ca3(PO4)2, 2 sccm de argón, 4 sccm de oxígeno, 100 W de potencia de RF y con tratamiento térmico
ex situ de 800oC por 1 h, tienen las fases cristalinas de hidroxiapatita y Ca3(PO4)2.
• Todas las pastillas de TiO2 preparadas por la técnica de RLPS a 1100 oC por 2min, sin poros
inducidos o con poros de 76.8 m y de 173.0 m, sin o con recubrimiento de hidroxiapatita-
Ca3(PO4)2, son hemocompatibles.
55
• El recubrimiento de hidroxiapatita-Ca3(PO4)2 no mejora la proliferación celular en ninguna de las
pastillas de TiO2.
• La proliferación celular se maximiza en pastillas de TiO2 con poros de 76.8 ±34.2 m, siendo tal
proliferación de 3.39 veces mayor que el control, y es menor en pastillas sin poros inducidos (2.33
veces el control) o con poros de 173.0 m (2.19 veces el control).
Trabajo a futuro
Realizar los ensayos de diferenciación celular para todas las muestras y comprobar el efecto del
recubrimiento de hidroxiapatita-Ca3(PO4)2.
Puesto que con un tamaño de poro de 76.8 ± 34.2 m se obtuvo la mayor proliferación celular en
las pastillas de TiO2, es necesario obtener poros alrededor de ese valor y llevar a cabo las pruebas
de proliferación para determinar el tamaño de poro óptimo que maximice dicha proliferación.
Después de lo anterior se podrían hacer los ensayos biológicos para el implante in vivo de soportes
de TiO2 con las características optimizadas.
Igualmente, se pudieran elaborar recubrimientos de TiO2 con las características optimizadas, en
soportes de Ti, y llevar a cabo los ensayos in vivo.
56
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