UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARABA

CENTRO DE CINCIAS EXATAS E DA NATUREZA

DEPARTAMENTO DE QUMICA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA

DISSERTAO DE MESTRADO

CLASSIFICAO DE LEOS VEGETAIS UTILIZANDO VOLTAMETRIA

DE ONDA QUADRADA E MTODOS QUIMIOMTRICOS

Francisco Fernandes Gambarra Neto

Joo Pessoa PB Brasil

Fevereiro / 2008

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARABA

CENTRO DE CINCIAS EXATAS E DA NATUREZA

DEPARTAMENTO DE QUMICA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA

DISSERTAO DE MESTRADO

CLASSIFICAO DE LEOS VEGETAIS UTILIZANDO VOLTAMETRIA

DE ONDA QUADRADA E MTODOS QUIMIOMTRICOS

Francisco Fernandes Gambarra Neto

Dissertao apresentada como

requisito para a obteno do

ttulo de Mestre em Qumica pela

Universidade Federal da Paraba.

Orientador: Prof. Dr. Mrio Csar Ugulino de Arajo

2 Orientador: Dr. Glimaldo Marino

Bolsista (CAPES)

Joo Pessoa PB Brasil

Fevereiro / 2008

Aos meus pais, Fernando Antnio Casimiro

Gambarra e Ana Maria Fontes Gambarra,

minha av, Maria de Lourdes Casimiro

Fernandes e s minhas irms, Fernanda

Fontes Gambarra e Fabiana Fontes

Gambarra, por todo amor, amizade, apoio,

ajuda e confiana.

minha namorada, Wanessa Porto Tito, por

todo amor, companheirismo e compreenso.

Com muito carinho e gratido,

Eu dedico.

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar agradeo a Deus por me dar disposio, fora de

vontade e sade para realizar este trabalho.

Aos meus grandes amigos Mrcio Jos Coelho de Pontes e Gledson

Emdio Jos, que esto sempre do meu lado acreditando, ajudando,

debatendo, colaborando e sempre prontos para escutarem e

compartilharem os bons e maus momentos.

Ao Professor Dr. Mrio Csar Ugulino de Arajo, pela orientao,

confiana e por ter apostado em mim.

Aos pesquisadores Dr. Glimaldo Marino e Dr. Everaldo Paulo de

Medeiros, pelo aprendizado, ajuda, incentivo e, principalmente, pela

amizade.

Renato Sousa Lima, pela amizade e ajuda em uma parte do

experimental.

A todos do LAQA, que de uma forma ou de outra, ajudaram-me e

fizeram-me sentir bem-vindo ao laboratrio.

Aos demais professores do LAQA e do Departamento de Qumica, que

me forneceram aprofundamentos disciplinares durante o Mestrado.

Aos Professores Germano Veras e Ana Cludia, pelos conselhos,

amizade e confiana desde a graduao pela Universidade Estadual da

Paraba.

A CAPES pelo fornecimento da bolsa.

ii

SUMRIO

NDICE DE FIGURAS ...................................................................... v

NDICE DE TABELAS ...................................................................... x

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ............................................ xii

RESUMO ...................................................................................... xiv

CAPTULO I INTRODUO ............................................................. 1

1.1 leos Vegetais ......................................................................... 2

1.2 Composio dos leos vegetais .................................................. 3

1.3 leos vegetais e a sade humana ............................................... 5

1.4 Tipos de leos vegetais ............................................................. 6 1.4.1 leo de canola .................................................................... 6 1.4.2 leo de girassol .................................................................. 7 1.4.3 leo de milho ..................................................................... 8 1.4.4 leo de soja ....................................................................... 8

1.5 Controle de qualidade de leos vegetais ..................................... 10

1.6 Voltametria de onda quadrada .................................................. 11

1.7 Quimiometria .......................................................................... 13 1.7.1 Pr-processamento dos dados ............................................. 14 1.7.2 Planejamentos experimentais .............................................. 16 1.7.2.1 Planejamento composto central ...................................... 16 1.7.2.2 Parmetro de Taguchi ................................................... 17

1.7.3 Anlise de Componentes Principais (PCA) .............................. 18 1.7.4 SIMCA .............................................................................. 20 1.7.5 Anlise discriminante linear (LDA) ........................................ 22 1.7.6 Seleo de variveis ........................................................... 23 1.7.7 Algoritmo das projees sucessivas (SPA) ............................. 23 1.7.8 SPA no contexto da classificao .......................................... 25 1.7.9 Quimiometria aplicada voltametria ..................................... 26

CAPTULO II OBJETIVOS ............................................................. 32

2.1 Objetivo Geral ......................................................................... 33 2.1.1 Objetivos Especficos: ......................................................... 33

iii

CAPTULO III EXPERIMENTAL ..................................................... 34

3.1 Amostras ................................................................................ 35

3.2 Diviso do conjunto de amostras ............................................... 35

3.3 Materiais e reagentes ............................................................... 36

3.4 Equipamentos ......................................................................... 36

3.5 Procedimento analtico ............................................................. 37 3.5.1 Manipulao das amostras .................................................. 38 3.5.2 Eletrlito suporte, eletrodo de trabalho e sentido da varredura 39 3.5.3 Limpeza do eletrodo de trabalho e parmetros da SWV ........... 39

3.6 Softwares ............................................................................... 42

CAPTULO IV RESULTADOS E DISCUSSO ................................... 43

4.1 Eficincia da extrao alcolica ................................................. 44

4.2 Eletrlito suporte, eletrodo de trabalho e sentido da varredura ...... 45

4.3 Limpeza eletroqumica do eletrodo de trabalho ............................ 46

4.4 Otimizao dos parmetros da SWV ........................................... 49

4.5 Seleo da regio de trabalho no voltamograma ......................... 51

4.6 Perfis dos voltamogramas do etanol e de etanol + leo ................ 52

4.7 Pr-processamento dos voltamogramas ..................................... 53 4.7.1 Pr-processamento aplicado s variveis ............................... 54

4.8 Anlise exploratria dos dados .................................................. 55 4.8.1 Aplicao da PCA................................................................ 55 4.8.1.1 Aplicao da PCA s amostras no vencidas ..................... 56 4.8.1.2 Comparao dos leos em relao composio qumica ... 57 4.8.1.3 Aplicao de PCA s amostras da classe PVE .................... 59

4.9 Modelagem e Classificao SWV-SIMCA...................................... 60 4.9.1 Construo dos modelos SWV-SIMCA ................................... 61 4.9.2 Validao dos modelos SWV-SIMCA ...................................... 64 4.9.2.1 Validao do modelo SWV-SIMCA da classe Canola ........... 64 4.9.2.2 Validao do modelo SWV-SIMCA da classe Girassol ......... 67 4.9.2.3 Validao do modelo SWV-SIMCA da classe Milho ............. 67 4.9.2.4 Validao do modelo SWV-SIMCA da classe Soja .............. 68 4.9.2.5 Validao do modelo SWV-SIMCA da classe PVE ............... 69

4.9.3 Uso dos modelos SWV-SIMCA para o Conjunto de Previso ..... 72

4.10 Construo dos modelos SWV-LDA-SPA .................................... 74

iv

4.10.1 Uso do modelo SWV-LDA-SPA no Conjunto de Previso ......... 76 4.10.2 Uso do SWV-LDA-SPA para a previso de todas as amostras . 76

4.11 Comparao entre os modelos SWV-SIMCA e SWV-LDA-SPA ....... 78

CAPTULO V CONCLUSES ........................................................... 80

5.1 Concluses ............................................................................. 81

5.2 Propostas futuras .................................................................... 82

CAPTULO VI REFERNCIAS ........................................................ 83

v

NDICE DE FIGURAS

Figura 1.1 Estrutura molecular dos principais cidos graxos dos leos

vegetais .......................................................................................... 4

Figura 1.2 Variao de potencial em funo do tempo para a SWV.

Esto representados o potencial inicial, Ei, a amplitude de pulso, EP, o

incremento de potencial, ES, a largura de pulso, tP e os pontos A e B

onde as correntes direta e reversa so medidas, respectivamente. ........ 12

Figura 1.3 Voltamogramas esquemticos de onda quadrada (SOUZA

et al., 2003) para um processo redox de um sistema reversvel (1) e

de um sistema irreversvel (2). ......................................................... 12

Figura 1.4 Representao de uma matriz de dados de natureza

multivariada. .................................................................................. 14

Figura 1.5 Primeira e segunda PCs no espao tridimensional das

variveis. ....................................................................................... 19

Figura 1.6 Previso de uma amostra desconhecida A usando o modelo

SIMCA da classe B construdo com uma PC. A distncia y entre a

amostra A e o eixo da componente corresponde ao resduo da PC1, x

a distncia entre a projeo de A na direo da PC1 e a fronteira da

classe e z a distncia de A at o limite da classe. ........................... 20

Figura 1.7 Grfico de Si x Hi, detalhando os limites de uma

determinada classe 1 e a disposio das demais amostras ao seu

redor. Neste caso, uma das amostras da prpria classe 1 foi mal

classificada como visualizado. ........................................................... 21

Figura 1.8 Representao esquemtica da anlise discriminante

linear. Os centros de gravidade (os asteriscos) dos grupos formados

por crculos e quadrados so inicialmente determinados. Em seguida

traa-se um plano de deciso eqidistante e perpendicular linha que

une os centros de gravidade dos grupos, formando as regies R1 e R2.

vi

Se um ponto qualquer estiver presente na regio R1, o mesmo

classificado como pertencente ao grupo 1. Caso contrrio,

obrigatoriamente pertencer categoria 2.......................................... 22

Figura 1.9 Exemplo do funcionamento do SPA para selecionar

potenciais a partir de cinco variveis voltamtricas: a) Projees no

plano ortogonal a X3; b) Viso espacial dos vetores no plano

horizontal. ...................................................................................... 24

Figura 3.1 Potenciostato/Galvanostato AUTOLAB Type II

esquerda e o mdulo 663 VA Stand da cela eletroqumica direita. ..... 37

Figura 3.2 Esquema da extrao de cidos graxos das amostras de

leo e tomada de alquota para realizao das medidas. ....................... 38

Figura 3.3 Quadrado do voltamograma mdio (a) e perfil da varincia

(b). ................................................................................................ 41

Figura 4.1 Perfil dos voltamogramas aps a subtrao do perfil de

etanol P.A. no sentido de varredura andico para 4 diferentes

propores de uma amostra de leo de soja em etanol. ....................... 44

Figura 4.2 Perfil dos voltamogramas aps a subtrao do perfil de

etanol P. A. nos sentidos de varredura andica (linha preta) e catdico

(linha vermelha), empregando RDE-Au e o eletrlito suporte NaOH (a)

e o CH3COOH (b); RDE-Pt e o eletrlito suporte NaOH (c) e CH3COOH

(d). A concentrao dos eletrlitos de suporte foi 0,1 mol L-1. ............... 45

Figura 4.3 Voltamograma de uma amostra de leo de canola (linha

vermelha), na regio de 0,300 a -0,900 V, aps subtrair a resposta do

branco (NaOH 0,1 mol L-1 linha azul) do voltamograma

originalmente obtido pela SWV (linha verde). ...................................... 51

Figura 4.4 Voltamograma de uma amostra de leo de canola na

regio de trabalho selecionada (-0,046 a -0,900 V). ............................ 52

vii

Figura 4.5 Perfis, aps subtrao do branco, dos voltamogramas do

etanol (linha azul), de um leo de canola em etanol na proporo 1:1

(linha vermelha) e a subtrao destes dois perfis (linha verde). O

detalhe no canto superior esquerdo dessa figura uma ampliao da

rea marcada nos voltamogramas. .................................................... 52

Figura 4.6 Voltamogramas das 114 amostras de leo vegetal na

regio de trabalho, aps a subtrao do branco: Voltamogramas das

66 amostras de leo no vencidas (a) e das 48 amostras vencidas (b). .. 54

Figura 4.7 Grfico dos escores de PC1 versus PC2 das 114 amostras

de leo vegetal. .............................................................................. 55

Figura 4.8 Grfico dos escores de PC1 versus PC2 para as 66

amostras no vencidas de leo vegetal distribudas em quatro classes. .. 56

Figura 4.9 Voltamogramas mdios das classes Canola, Girassol, Milho

e Soja. A seta indica uma ampliao da regio de menor intensidade

de corrente e o crculo destaca a regio de -580 mV a -650 mV onde o

perfil da classe Canola se diferencia das demais. ................................. 57

Figura 4.10 Grfico dos escores de PC1 versus PC2 das 48 amostras

de leo vegetal da classe PVE. .......................................................... 59

Figura 4.11 Perfil voltamtrico das amostras de leo da classe PVE. ..... 60

Figura 4.12 Grficos da varincia residual e explicada versus n de

PCs das classes: a) Canola; b) Girassol; c) Milho; d) Soja; e) PVE. ........ 61

Figura 4.13 Grfico dos escores de PC1 versus PC2 versus PC3 para

as classes: a) Canola; b) Girassol; c) Milho; d) Soja; e) PVE. As

amostras dos conjuntos de treinamento e de teste esto pintadas de

azul e vermelho, respectivamente. .................................................... 63

Figura 4.14 Grfico de Si x Hi (95% de confiana) do modelo da

classe Canola construdo com 6 PCs. A seta indica uma ampliao das

viii

fronteiras deste modelo evidenciando a classificao incorreta da

amostra 11. .................................................................................... 65

Figura 4.15 Teste F aplicado aos resduos das amostras de

treinamento e teste da classe Canola para modelos com 4 (a), 5(b) e 6

(c) PCs. .......................................................................................... 65

Figura 4.16 Grfico de Si x Hi (95% de confiana) do modelo da

classe Canola construdo com 4 PCs aps a etapa de validao. A seta

indica uma ampliao das fronteiras deste modelo evidenciando a

classificao correta de todas as amostras. ......................................... 66

Figura 4.17 Grfico de Si x Hi (95% de confiana) do modelo da

classe Girassol construdo com 4 PCs. A seta indica uma ampliao das

fronteiras deste modelo evidenciando a classificao incorreta de sete

amostras de leo de soja. ................................................................. 67

Figura 4.18 Grfico de Si x Hi (95% de confiana) do modelo da

classe Milho construdo com 3 PCs. A seta indica uma ampliao das

fronteiras deste modelo evidenciando a classificao incorreta de uma

amostra de leo de soja. .................................................................. 68

Figura 4.19 Grfico de Si x Hi (95% de confiana) do modelo da

classe Soja construdo com 4 PCs. A seta indica uma ampliao das

fronteiras deste modelo evidenciando a classificao incorreta de seis

amostras de leo de girassol e de uma amostra de leo de milho. ......... 69

Figura 4.20 Grfico de Si x Hi (95% de confiana) do modelo da

classe PVE construdo com 3 PCs. A seta indica uma ampliao das

fronteiras do modelo evidenciando a classificao incorreta das

amostras 10 e 19. ........................................................................... 70

Figura 4.21 Teste F aplicado aos resduos das amostras de

treinamento e teste da classe PVE para modelos com 1 (a), 2(b), 3 (c)

e 4 (d) PCs. .................................................................................... 70

ix

Figura 4.22 Perfil dos resduos das amostras da classe PVE versus

variveis para modelos com 2 (a) e 4 (b) PCs. .................................... 71

Figura 4.23 Nmero de variveis selecionadas pelo SPA versus os

valores da funo de custo. .............................................................. 75

Figura 4.24 Variveis selecionadas pelo LDA-SPA. .............................. 76

Figura 4.25 Grfico dos escores de FD1 versus FD2 das 114 amostras

de leo vegetal. .............................................................................. 77

Figura 4.26 Grfico dos escores de FD2 versus FD3 para as 66

amostras no vencidas de leo vegetal distribudas em quatro classes. .. 78

x

NDICE DE TABELAS

Tabela 1.1 Principais oleaginosas e seus respectivos contedos em

leo. ............................................................................................... 6

Tabela 1.2 Caractersticas fsico-qumicas e composio em cidos

graxos dos leos refinados de canola, girassol, milho e soja (Fonte:

ANVISA, 2007). ................................................................................ 9

Tabela 3.1 Classes e quantidade de amostras de leos vegetais

analisados. ..................................................................................... 35

Tabela 3.2 Nmero de amostras de treinamento, teste e previso

selecionadas pelo KS para as cinco classes de leos vegetais. ............... 36

Tabela 4.1 Detalhamento dos fatores e nveis utilizados para a

construo do planejamento composto central, em que = 1,5. ........... 47

Tabela 4.2 Planejamento composto central 24 para a otimizao da

etapa de limpeza eletroqumica do eletrodo de trabalho. ...................... 48

Tabela 4.3 Parmetros timos escolhidos para a limpeza

eletroqumica do eletrodo. ................................................................ 49

Tabela 4.4 Detalhamento dos fatores e nveis utilizados para a

construo do planejamento composto central 23, em que = 1,67. ......... 49

Tabela 4.5 Planejamento composto central 23. ................................... 50

Tabela 4.6 Parmetros escolhidos para a SWV. .................................. 50

Tabela 4.7 Matriz da composio qumica dos leos vegetais de

acordo com os dados da RDC 492/99 (ANVISA, 2007). ........................ 58

Tabela 4.8 Correlao entre os diferentes tipos de leo vegetal de

acordo com a composio de qumica................................................. 58

xi

Tabela 4.9 Nmero de PCs e a varincia explicada acumulada dos

modelos SWV-SIMCA. ...................................................................... 62

Tabela 4.10 Nmero de PCs e varincia explicada acumulada para

cada modelo SWV-SIMCA de leo vegetal aps a etapa de validao. .... 72

Tabela 4.11 Classificao SIMCA das amostras de previso das cinco

classes de leo vegetal. O smbolo indica que a amostra foi

classificada no modelo. .................................................................... 73

Tabela 4.12 Erro de classificao dos modelos SWV-SIMCA (com

quatro nveis de significncia) e SWV-LDA-SPA para as amostras de

leo do conjunto de previso. ........................................................... 79

xii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AcG cido Graxo

AcGs cidos Graxos

Ag/AgCl Eletrodo de referncia de prata/cloreto de prata

ALS Mnimos quadrados alternados

ANN Redes neurais artificiais

ANVISA Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria

CLS Mnimos quadrados clssicos

CNNPA Conselho Nacional de Normas e Padres para Alimentos

CO2 Dixido de Carbono

CV Voltametria cclica

CVA Anlise de variveis cannicas

DA Anlise de Discriminante

DI Dimensionalidade inerente

DPP Polarografia de pulso diferencial

DPV Voltametria de pulso diferencial

f Freqncia da onda quadrada

FA Fase alcolica

Fcal Valor calculado para o teste F

Fcrit Valor crtico adotado para o teste F

FT Transformada de Fourier

G Risco mdio de uma classificao incorreta

HCA Anlise de agrupamentos hierrquicos

Hi Influncia

HMDE Eletrodo de gota pendente de mercrio

k Nmero de fatores no planejamento experimental

KF Kalman filter

KNN k-vizinhos mais prximos (k-nearest neighbours)

LDA Anlise discriminante linear

LDL Lipoprotena de baixa densidade (mau colesterol)

xiii

LSV Voltametria de varredura linear

MCR Resoluo de curva multivariada

MIR Espectroscopia no infravermelho mdio

MLR Regresso linear mltipla

nF Nmero de experimentos de um planejamento fatorial

NaOH Hidrxido de sdio

NIR Espectroscopia no infravermelho prximo

NPV Voltametria de pulso normal

PC Componente principal

PCA Anlise de componentes principais

PCR Regresso por componente principal

PLS Mnimos quadrados parciais

PVE Prazo de Validade Expirado

RDC Resoluo da Diretoria Colegiada

RDE-Pt Eletrodo rotatrio de disco de platina

RMSEP Erro quadrtico mdio de previso

Si Raiz quadrada da varincia residual

SIMCA Modelagem Independente Flexvel por Analogia de Classe

SPA Algoritmo das projees sucessivas

SWV Voltametria de onda quadrada

tP Largura ou tempo do pulso na onda quadrada

v Velocidade de varredura da onda quadrada

WT Transformada Wavelet

Xcal Matriz das amostras de calibrao

x Distncia entre a projeo de A na direo da PC e a fronteira

y Distncia entre a amostra desconhecida A e o eixo da PC

z Proximidade de A at a caixa

Z Parmetro de Taguchi

Valor da distncia axial dos pontos no planejamento estrela

EP Amplitude de pulso

ES Incremento de potencial

xiv

RESUMO

A autenticidade de leos vegetais comestveis tem se tornado um assunto

muito importante, tanto do ponto de vista comercial, devido evaso

fiscal, como do prejuzo sade do consumidor. Assim, necessrio o

desenvolvimento de novas metodologias analticas que possibilitem

anlises simples, rpida e de baixo custo. A combinao de mtodos

voltamtricos e quimiomtricos uma boa alternativa para atingir este

objetivo. A quimiometria tem sido muito usada em dados espectroscpicos

para uma variedade de aplicaes no campo de alimentos, medicamentos,

ambiental, etc. Todavia, poucos trabalhos tm explorado as caractersticas

atrativas dos mtodos voltamtricos, principalmente com relao sua

natureza multivariada associada quimiometria. Neste trabalho

proposto um mtodo rpido, simples e barato para fiscalizao de leos

vegetais comestveis que combina a voltametria de onda quadrada com

anlise discriminante linear associada ao algoritmo das projees

sucessivas para a seleo de variveis. Sua eficincia foi avaliada

comparando-o ao mtodo conhecido tradicionalmente como SIMCA. Cinco

classes de leo: Canola, Girassol, Milho, Soja e os com prazo de validade

expirado (PVE) de diferentes fabricantes foram analisadas, utilizando um

eletrodo de disco de platina. Para as 32 amostras do conjunto de previso,

o SIMCA apresentou 6 erros de classificao (81% de classificao

correta), enquanto que o mtodo proposto classificou corretamente todas

as amostras sendo, portanto, uma alternativa promissora para a

classificao de leos vegetais e a fiscalizao quanto ao prazo de

validade.

Palavras chave: leos vegetais, voltametria de onda quadrada, anlise

descriminante linear, algoritmo das projees sucessivas.

xv

ABSTRACT

The authenticity of edible vegetable oils has become a very important

issue, both in trade due to tax evasion, and the damage caused to the

health of the consumer. Thus, it is necessary to develop new analytical

methodologies that allow simple, fast and low cost analysis. The

combination of voltammetric and chemometric methods is a good

alternative to achieve this goal. Chemometrics has been widely used in

spectroscopic data for a variety of applications in the food, medicine, and

environmental areas, etc. However, few studies have investigated the

attractive characteristics of the voltammetric methods, particularly with

respect to its multivariate nature, with chemometrics. This work proposes

a fast, simple and cheap monitoring method for edible vegetable oils that

combines the Square Wave Voltammetry (SWV) with Linear Discriminant

Analysis (LDA) associated with Successive Projection Algorithm (SPA)

employed in the variable selection. Its performance was evaluated by

comparing it to the traditional method known as SIMCA (Soft Independent

Modeling of Class Analogy). Five classes of oil: canola, sunflower, corn,

soybean and the ones with expired shelf-life, from different manufacturers

were analyzed with a platinum disk working electrode. The SWV-SIMCA

method presented 6 errors (81% of correct classification), whereas the

SWV-LDA-SPA method proposed classified correctly all the prediction

samples, showing to be a promising alternative for classification and

inspection of vegetable oils.

Key words: vegetable oil, SWV, LDA, SPA, SIMCA.

CAPTULO I INTRODUO

2 INTRODUO

1.1 leos Vegetais

leos e gorduras so substncias lipoflicas bastante utilizadas pelos

organismos vivos, podendo ser de origem animal, vegetal ou mesmo

bacteriana (MORETTO e FEET, 1998) e formam uma das trs maiores

classes de produtos alimentcios, sendo as outras constitudas por

protenas e carboidratos, e so conhecidos desde os ancestrais do homem

pela facilidade de extrao e pelas diversas fontes e propriedades (WEISS,

1970). A diferena entre leos e gorduras definida pela resoluo n

20/77 do CNNPA (Conselho Nacional de Normas e Padres para

Alimentos) que impe a temperatura de 20 C como limite inferior para o

ponto de fuso das gorduras, ou seja, quando o ponto de fuso se situa

abaixo deste limite, a substncia classificada como leo (lquido a

temperatura ambiente). Contudo, o termo gordura o mais empregado

quando o estado fsico no significante.

O leo vegetal uma gordura obtida de plantas. extrado na

maioria das vezes das sementes ou gros destes vegetais conhecidos

como oleaginosos. Os leos destinados ao consumo humano so

submetidos a um processo de refino cuja finalidade melhorar sua

aparncia, sabor, odor e estabilidade por remoo de alguns componentes

como: cidos graxos livres, protenas, corantes naturais, umidade e

compostos volteis e inorgnicos (MORETTO e FEET, 1998).

A cadeia agroindustrial de oleaginosas abrange um conjunto de

mercados, dos quais os mais importantes so: produo e comrcio de

gros; produo de leos vegetais (leo bruto e refinado) e produo de

raes (COUTINHO et al., 2008). No Brasil, desde 1972 feito um

levantamento anual sobre a safra de gros. No ano de 2003 foi observada

uma produo de 123,6 milhes de toneladas, recorde nacional at ento.

No ano de 2007 um novo recorde foi atingido com uma produo de 133

milhes de toneladas, com soja e milho correspondendo a 82% do total.

Isto ocorreu devido ao elevado preo dos gros no mercado internacional,

fazendo do Brasil um dos maiores produtores mundiais de soja

3 INTRODUO

(BECKSTEIN, 2008). Para 2008, est previsto um aumento de 2,1% na

safra rendendo 135,7 milhes de toneladas. A crescente demanda das

oleaginosas responsvel direto pelo ascendente cultivo de gros (IBGE,

2008).

Alm do setor alimentcio, o Governo Federal brasileiro vem

incentivando o aproveitamento dos leos vegetais como fonte energtica

destinada a diversos segmentos, abrindo oportunidades nos setores social,

econmico e, sobretudo, ambiental. A produo est sendo destinada para

a estruturao do programa de produo e uso do biodiesel em muitos

pases, principalmente no Brasil, j que diversas espcies oleaginosas, tais

como a palma, nabo forrageiro, mamona, soja, girassol e babau, entre

outras so cultivadas e posteriormente utilizadas como matria-prima na

produo de biocombustvel (COUTINHO et al., 2008, BIODIESELBR,

2008).

Com base na expanso do mercado de leos vegetais, seu controle

de qualidade tem se tornado um assunto importante tanto do ponto de

vista comercial como da sade dos consumidores. Portanto, de

fundamental importncia o constante aperfeioamento de tcnicas

analticas simples, rpidas, robustas e de baixo custo.

1.2 Composio dos leos vegetais

Os leos vegetais so constitudos majoritariamente por

triglicerdeos, que so compostos de trs molculas de cido graxo (AcG)

com uma molcula de glicerol. As unidades acilas so os principais

constituintes dos leos vegetais, representando cerca de 95% da massa

molecular dos triglicerdeos. Em pequena quantidade aparecem mono e

diglicerdeos, cidos graxos livres, glicolipdeos, protenas, fosfolipdeos,

esteris entre outras substncias (MORETTO e FEET, 1998, WEISS, 1970,

KRAUSE e MAHAN, 1991).

Os AcGs so cidos monocarboxlicos de cadeia longa e com nmero

par de tomos de carbono (4 a 30 tomos) dispostos em uma cadeia

4 INTRODUO

linear, em virtude da sua produo biolgica, que se inicia a partir de

unidades acetato da acetil coenzima A. Podem ser saturados ou

insaturados, com estes predominando nos leos vegetais. As ligaes

duplas raramente se apresentam conjugadas (-CH=C=CH-), e sim,

separadas por um grupo metilnico (-CH=CH-CH2-CH=CH-). As duplas

ligaes impedem a rotao livre dos tomos gerando os ismeros nas

configuraes cis, que a mais comum entre os AcGs dos leos vegetais,

e trans. AcGs so geralmente representados pelo smbolo Cx:y(z), em que

Cx indica o nmero de tomos de carbono que forma a cadeia linear; y e z

indicam a quantidade de ligao dupla existente na molcula e sua(s)

posio(es), respectivamente. (MORETTO e FEET, 1998, WEISS, 1970,

KRAUSE e MAHAN, 1991).

Nos leos vegetais, os AcGs mais comuns so o palmtico (C16:0) e

o esterico (C18:0), entre os saturados, e olico (C18:1(9)), linolico

(C18:2(9,12)) e linolnico (C18:3(9,12,15)), entre os insaturados (Figura

1.1).

C

O

OH

C

O

OH

C

O

OH

C

O

OH

cido PalmtidoC16:0

cido EstericoC18:0

cido OlicoC18:1(9)

cido LinolicoC18:2(9,12)

C

O

OH

cido LinolnicoC18:3(9,12,15)

Figura 1.1 Estrutura molecular dos principais cidos graxos dos leos vegetais

Nas reas de bioqumica e nutrio, os cidos graxos so agrupados

em famlias conhecidas como mega (). Nestas, o carbono do

grupamento metila terminal reconhecido como posio nmero um,

logo, a posio da primeira ligao dupla caracteriza a famlia. Por

exemplo, o cido olico e o linolico pertencem s famlias 9 e 6,

5 INTRODUO

respectivamente (Figura 1.1). Os AcGs das famlias 6 e 3 no so

produzidos pelo organismo humano e por isso so considerados como

cidos graxos essenciais ao homem, sendo o cido linolico, 6, e o cido

linolnico, 3, os mais importantes (MORETTO e FEET, 1998, KRAUSE e

MAHAN, 1991). Todavia, o cido linolnico encontrado em baixas

concentraes na maioria dos leos vegetais, sendo o leo de linhaa uma

exceo com cerca de 60% (m/m) de 3 (CEOTTO, 2008).

1.3 leos vegetais e a sade humana

Os leos, juntamente com as gorduras, so denominados

geralmente de lipdios e so encontrados no sangue e em diferentes

rgos do homem. Eles desempenham funes cruciais como co-fatores

enzimticos, transportadores de eltrons, pigmentos que absorvem

radiaes luminosas, ncoras hidrofbicas, agentes emulsificantes,

hormnios, mensageiros intracelulares, componentes da estrutura celular

e como reservas de energia (LEHNINGER et al., 1995, KRAUSE e MAHAN,

1991). Esta importante fonte de combustvel para os seres humanos

contribui, em alguns pases, com 30-40% do total de energia consumida

na alimentao. Entretanto, quando ingeridos em excesso e/ou sem levar

em considerao a qualidade e o tipo da gordura, podem causar graves

problemas como a obesidade, o aumento de colesterol no sangue e

cardiopatias. Estas complicaes so atribudas maior proporo de

cidos graxos saturados que aparecem principalmente em gorduras

animais, manteigas e em produtos derivados da hidrogenao de leos

como as margarinas. Por outro lado, as gorduras insaturadas so capazes

de reduzir o ndice de colesterol, diminuindo os problemas

cardiovasculares. Como os leos vegetais so ricos em cidos graxos

insaturados, eles so os mais indicados para uma dieta saudvel

(MORETTO e FEET, 1998, KRAUSE e MAHAN, 1991).

Os cidos graxos linolico (6) e linolnico (3), ambos

poliinsaturados, fazem parte de um grupo especial de cidos graxos, cuja

6 INTRODUO

ingesto muito importante, pois ajudam na reduo dos nveis de

colesterol no sangue e desempenham funes fisiolgicas imprescindveis

nos organismos vivos, sendo, portanto, essenciais vida (LEHNINGER et

al., 1995, KRAUSE e MAHAN, 1991).

1.4 Tipos de leos vegetais

Existe uma grande diversidade de oleaginosas em todo o mundo.

Algumas das mais importantes esto listadas na Tabela 1.1.

Tabela 1.1 Principais oleaginosas e seus respectivos contedos em leo.

Material oleaginoso leo (% em massa)

Copra 66-68

Babau 60-65

Gergelim 50-55

Polpa de palma (dend) 45-50

Caroo de palma 45-50

Amendoim 45-50

Colza (canola) 40-45

Girassol 35-45

Aafro 30-35

Oliva 25-30

Algodo 18-20

Soja 18-20

De acordo com a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria, em sua

resoluo RDC 482/99 (ANVISA, 2007), so comercializados no Brasil os

seguintes leos vegetais:

algodo milho palma amendoim soja palmiste arroz uva oliva canola babau gergelim girassol cco azeite saborizado

A seguir, so apresentadas caractersticas de quatro destes leos, a

saber, canola, girassol, milho e soja.

1.4.1 leo de canola

Este leo conhecido desde os primeiros sculos da Era Crist como

produto de extrao de uma planta chamada colza. No entanto, ela

7 INTRODUO

comeou a participar da alimentao humana somente a partir da dcada

de 1970, quando cientistas conseguiram, atravs de melhoramento

gentico, desenvolver espcies dessa planta (Brassica nabus e Brassica

campestris) com teores aceitveis de cido ercico e glucosilonatos. O

nome canola (Canadian Oil Low Acid) foi oficialmente aceito pela

Canadian Grain Commission, em 1987 (MORETTO e FEET, 1998).

Atualmente a canola cultivada em diversos pases, sendo China,

Canad, ndia, Alemanha, Frana, Austrlia e Polnia os maiores

produtores mundiais (GAZZONI, 2007). No Brasil, os trabalhos de

pesquisa com a cultura de colza nos estados do Rio Grande do Sul e de

Santa Catarina foram iniciados em 1974, em meados dos anos 80 no

Paran (PR) e em 2003 no estado de Gois (GO). Os gros de canola

produzidos no pas possuem cerca de 24 a 27% de protena e de 34 a

40% de leo (EMBRAPA, 2007a).

O leo de canola um dos mais saudveis, pois possui elevada

quantidade de 3, gorduras monoinsaturadas e vitamina E, que ajudam a

diminuir o LDL (low density lipoprotein), mais conhecido como mau

colesterol. Alm disso, possui menor quantidade de gordura saturada

(6%) quando comparados com leos de soja (15%) e de milho (11%)

(MORETTO e FEET, 1998, EMBRAPA, 2007a, EMBRAPA, 2007b).

1.4.2 leo de girassol

O girassol (Helianthus annus L.) uma planta de origem americana,

que foi utilizada como alimento pelos ndios. um dos poucos vegetais

que pode ser cultivado em clima frio (ANVISA, 2007, WEISS, 1970).

Atualmente, os maiores produtores mundiais so a Rssia, Estados

Unidos, Argentina e China. O girassol ocupa o quarto lugar como fonte de

leo comestvel, perdendo para soja, palma e canola. A produo

brasileira ainda pouco expressiva, mas o pas tem importado este gro,

principalmente da Argentina, para atender a demanda comercial deste

produto, uma vez que o leo de girassol vem sendo indicado em dietas

por sua baixa quantidade de cidos graxos saturados, alto teor de cido

8 INTRODUO

linolico e vitaminas, alm de apresentar caractersticas organolpticas

agradveis (ABOISSA, 2007, CAMPESTRE, 2006).

1.4.3 leo de milho

O milho (Zea mays L.) um dos cereais mais cultivados por todo o

mundo. Originou-se nas Amricas e logo foi difundido pela Europa, frica

e sia. Atualmente, os maiores produtores mundiais so os Estados

Unidos, entretanto, outros pases como Canad, China, Pases Blticos,

Brasil, Mxico, Argentina e frica do Sul tm uma produo significativa

deste gro. No Brasil, o milho o cereal mais cultivado depois da soja

(MORETTO e FEET, 1998, IBGE, 2008).

Os principais cidos graxos que compem o leo de milho so o

linolico (at 62%) e olico (at 42%). O cido linolnico (tri-insaturado)

altamente sujeito oxidao e est presente em pequena percentagem

neste leo, quando comparado ao de soja. Geralmente, os triglicerdeos

do leo de milho apresentam a cadeia poliinsaturada na posio central do

glicerol (carbono 2), cercada por duas cadeias saturadas, ou por uma

cadeia saturada e uma insaturada nas extremidades (carbono 1 e 3). Esta

configurao fornece cadeia poliinsaturada uma proteo contra os

processos oxidativos, aumentando a estabilidade, j que as posies 1 e 3

so a mais reativas (MORETTO e FEET, 1998, RODRIGUES et al., 2003,

REGINA e SOLFERINI, 2007).

1.4.4 leo de soja

A soja (Glycine max L.) a oleaginosa mais cultivada no Brasil, que

ocupa a 2 posio do ranking mundial da produo, perdendo apenas

para os Estados Unidos (IBGE, 2008, GAZZONI, 2007). Esta oleaginosa

domina o mercado mundial tanto de protena vegetal como de leo

comestvel (MORETTO e FEET, 1998). O gro de soja possui cerca de 40%

de protenas, 20% de lipdios (leo), 5% de minerais e 34% de

carboidratos, alm de minerais como potssio, clcio, fsforo, ferro,

cobre, magnsio e sdio. Os principais AcGs que compem o leo de soja

9 INTRODUO

so o linolico, olico, palmtico e linolnico. Estas caractersticas fazem

da soja e seus derivados um importante fator para a balana comercial

brasileira. A vantagem do leo de soja em relao a outros se deve ao seu

baixo preo aliado sua boa qualidade. No Brasil, alm de ser utilizado na

alimentao e em diversos outros setores, o leo de soja vem se

destacando na produo de biodiesel, abrindo tambm as possibilidades

para a utilizao dos demais leos vegetais, uma vez que eles se

tornaram o principal insumo para a produo de biodiesel (EMBRAPA,

2007c, CAMPESTRE, 2007).

A Tabela 1.2 abaixo detalha as caractersticas fsico-qumicas e os

cidos graxos presentes nos leos refinados de canola, girassol, milho e

soja de acordo com a RDC 482/99 da ANVISA (2007).

Tabela 1.2 Caractersticas fsico-qumicas e composio em cidos graxos dos leos refinados de canola, girassol, milho e soja (Fonte: ANVISA, 2007).

Canola Girassol Milho Soja

Caractersticas

fsico-qumicas

ndice de Refrao (40C)

1,465-1,467 1,467-1,469 1,465-1,468 1,466-1,470

ndice de Iodo (Wijs) 110-126 110-143 103-128 120-143 ndice de Saponificao 182-193 188-194 187-195 189-195 Matria Insaponificvel (g/100g)

< 2,0 < 1,5 < 2,8 < 1,5

Acidez (g de cido olico/100g)

< 0,3 < 0,3 < 0,3 < 0,3

ndice de Perxido (meq/Kg) < 10,0 < 10,0 < 10,0 < 10,0

Brassicasterol (g/100g) > 5,0

cidos graxos (g/100g)

C < 14 < 0,4 < 0,3 < 0,1 Mirstico - C14:0 < 0,2 < 0,5 < 0,1 < 0,5 Palmtico - C16:0 2,5-6,5 3,0-10,0 9,0-14,0 7,0-14,0 Palmitolico - C16:1 < 0,6 < 1,0 < 0,5 < 0,5 Esterico - C18:0 0,8-3,0 1,0-10,0 0,5-4,0 1,4-5,5 Olico (9) - C18:1 53,0-70,0 14,0-35,0 24,0-42,0 19,0-30,0 Linolico (6) - C18:2 15,0-30,0 55,0-75,0 34,0-62,0 44,0-62,0 Linolnico (3) - C18:3 5,0-13,0 < 0,3 < 2,0 4,0-11,0 Araqudico - C20:0 0,1 - 1,2 < 1,5 < 1,0 < 1,0 Eicosenico - C20:1 0,1 - 4,3 < 0,5 < 0,5 < 1,0 Behnico - C22:0 < 0,6 < 1,0 < 0,5 < 0,5

Lignocrico - C24:0 < 0,2 < 0,5 < 0,5 Ercico- C22:1 < 2,0 < 0,5 Tetracosenico C24:1 < 0,2 < 0,5

10 INTRODUO

1.5 Controle de qualidade de leos vegetais

A comunidade cientfica mundial tem proposto diversos mtodos

para o controle de qualidade de leos vegetais. Critrios de qualidade

qumicos e fsico-qumicos tm sido determinados por espectrometria no

infravermelho prximo (Near Infrared NIR) e no mdio (Mid Infrared

MIR) (HENDL et al., 2001, FRANCO et al., 2006, BARTHUS e POPPI, 2001,

CHRISTY e EGEBERG, 2006, WANG et al., 2006, GUILLN e CABO, 1997).

Tambm so empregadas outras tcnicas como cromatografia (MALAVIA,

2007), fluorescncia (SIKORSKA et al., 2005, POULLI et al., 2005, POULLI

et al., 2006) e quimiluminescncia (STEPANYAN et al., 2005,

PAPADOPOULOS, 2002).

Mtodos quimiomtricos tm sido comumente aplicados a dados

cromatogrficos e espectroscpicos com a finalidade de comparao,

discriminao e classificao na avaliao da autenticidade de leos

vegetais. Neste contexto, as tcnicas estatsticas multivariadas mais

utilizadas so: k-vizinhos mais prximos (k-Nearest Neighbours KNN)

(SIKORSKA, 2005), anlises de discriminante (Discriminant Analysis

DA) (SIKORSKA et al., 2005, LANKMAYR et al., 2004, MARTN et al.,

1999, LAI et al., 1994, BAETEN et al., 1998, VONCINA et al., 2005, NAGY

et al., 2005, LEE et al., 2001, KEMSLEY, 1996), anlise de agrupamentos

hierrquicos (Hierarchical Cluster Analysis HCA) (POULLI et al., 2005),

anlise de componente principal (Principal Component Analysis PCA)

(POULLI et al., 2005, DIAZ et al., 2005, LEE et al., 1998, LANKMAYR et

al., 2004, LAI et al., 1994, LEE et al., 2001, KEMSLEY, 1996), modelagem

flexvel independente por analogia de classe (Soft Independent Modelling

of Class Analogy SIMCA) (DIAZ et al., 2005), anlise de variveis

cannicas (Canonical Variables Analysis CVA) (ALVES et al., 2005),

mnimos quadrados parciais (Partial Least Squares PLS) (CHRISTY et

al., 2004, MARQUEZ et al., 2005, KEMSLEY, 1996), redes neurais

artificiais (Artificial Neural Networks ANN) (VONCINA et al., 2005,

HUSAIN et al., 1996) e algoritmo das projees sucessivas (Successive

Projection Algorithm SPA) (PONTES et al., 2005).

11 INTRODUO

A maioria das tcnicas citadas acima possui como desvantagem o

alto custo dos equipamentos e manuteno, quando comparadas com a

voltametria de onda quadrada (Square Wave Voltammetry SWV) que

utiliza instrumentao simples e de custo relativamente baixo.

1.6 Voltametria de onda quadrada

A SWV foi criada na dcada de 1950 quando Barker aplicou pulsos

de potencial a um eletrodo gotejante de mercrio e chegou polarografia

de onda quadrada (BARD e FAULKNER, 2001, SOUZA et al., 2003).

Ramaley e Krause basearam-se nos trabalhos de Barker para

desenvolver a teoria da voltametria de onda quadrada utilizando eletrodos

estacionrios com o intuito de eliminar os rudos provenientes do capilar

de mercrio. A partir da, a SWV pde ser utilizada para a anlise de

traos com a vantagem da possibilidade de substituio do eletrodo de

mercrio por um eletrodo slido (RAMALEY e KRAUSE, 1969, KRAUSE e

RAMALEY, 1969). Nestes trabalhos, os autores se limitaram a saltos de

pequeno incremento de potencial, resultando em baixas velocidades de

varreduras.

As limitaes da metodologia desenvolvida por RAMALEY e KRAUSE

(1969) foram analisadas por CHRISTIE et al. (1977) e TURNER et al.

(1977), para ento, chegar ao modelo atual da SWV, em que as leituras

de correntes em funo dos pulsos de potenciais aplicados so feitas a

velocidades maiores.

A SWV consiste em aplicar, ao eletrodo de trabalho, dois pulsos de

potenciais simtricos sobre cada degrau de uma escada de potencial. Um

dos pulsos aplicado no sentido da escada de potencial (direto) e o outro,

no sentido reverso. A corrente medida no final de cada pulso, fechando

um ciclo de onda quadrada (SKOOG et al., 2002, WANG, 2006, BARD e

FAULKNER, 2001).

A Figura 1.2 ajuda a definir os principais parmetros da onda

quadrada, que se caracteriza por uma amplitude de pulso, EP, medida

12 INTRODUO

com relao a cada degrau da escada, e uma largura de pulso, tP, dada

em tempo e que tambm pode ser expressa em termos da freqncia da

onda quadrada, f = 1/2tP. A varredura comea num potencial inicial, Ei,

ento, no final de cada ciclo a escada aumenta instantaneamente por um

incremento de potencial, ES. Conseqentemente, a velocidade de

varredura, v = ES/2tP, pode ser dada por v = ES x f. O sinal obtido

como uma intensidade de corrente de forma diferencial entre as correntes

nos sentidos direto e reverso, apresentando excelente sensibilidade e alta

rejeio a correntes capacitivas (BARD e FAULKNER, 2001, SOUZA et

al.,2003, SOUZA et al., 2004).

Figura 1.2 Variao de potencial em funo do tempo para a SWV. Esto representados o potencial inicial, Ei, a amplitude de pulso, EP, o incremento de potencial, ES, a largura de pulso, tP e os pontos A e B onde as correntes direta e reversa so medidas, respectivamente.

O pico voltamtrico resultante apresenta posio, largura e altura

caractersticas do tipo de sistema redox (WANG, 2006, SOUZA et al.,

2004). A Figura 1.3 apresenta os voltamogramas tericos associados a um

sistema reversvel e irreversvel com a separao observada das correntes

direta, reversa e resultante.

Figura 1.3 Voltamogramas esquemticos de onda quadrada (SOUZA et al., 2003) para um processo redox de um sistema reversvel (1) e de um sistema irreversvel (2).

13 INTRODUO

A principal vantagem da SWV a possibilidade de se obter correntes

de pico bem definidas em experimentos executados em alta velocidade de

varredura, resultando em anlises mais rpidas e com alta sensibilidade.

Alm disso, por tratar-se de uma tcnica de pulso, a corrente faradaica

pode ser registrada no final do pulso, instante no qual a contribuio da

corrente capacitiva minimizada (BARD e FAULKNER, 2001).

A voltametria ganhou grande importncia na qumica analtica

medida que os equipamentos e as tcnicas foram se aperfeioando

(SKOOG et al., 2002). Entretanto, estas tcnicas ficaram limitadas,

principalmente, a aplicaes em calibrao univariada. Um perfil

voltamtrico apresentando vrias sobreposies de picos analticos que,

em geral, parece ser um grave problema, na verdade um excesso de

informaes valiosas muito prximas umas das outras, que podem ser

extremamente teis quando mtodos quimiomtricos so empregados

para extrair o mximo de informaes possveis (HERRERO e ORTIZ,

1999).

1.7 Quimiometria

O ascendente avano tecnolgico faz com que a qumica, sobretudo

a qumica analtica moderna, ocupe um lugar de destaque na Cincia.

Atualmente, existem diversas tcnicas analticas que podem gerar grande

quantidade de dados em curto intervalo de tempo. Estes dados

apresentam uma gama de informao de natureza multivariada e, muitas

vezes, complexa, o que torna importante o uso de ferramentas que

permitam extrair, de um modo mais criterioso, o maior nmero possvel

de informaes relevantes. Neste contexto, torna-se extremamente til o

uso da Quimiometria (MASSART et al., 1997, KOWALSKI, 1984, BEEBE et

al., 1998), que pode ser definida como um conjunto de mtodos

matemticos e/ou estatsticos utilizados para planejar ou selecionar

experimentos de forma otimizada e extrair o mximo de informao

qumica dos dados obtidos (FERREIRA et al., 1999).

14 INTRODUO

A quimiometria agrupa vrias ferramentas extremamente teis para

planejamento e otimizao de experimentos (PIMENTEL et al., 1998,

HONORATO et al., 2002), processamento de sinais (GALVO et al., 2004,

GALVO et al. 2001a), seleo de variveis e amostras (PONTES et al.,

2005, DANTAS-FILHO et al., 2004, ARAUJO et al., 2001, GALVO et al.,

2001b), reconhecimento de padres e classificao de amostras (PONTES

et al., 2005, COSTA et al., 2004), calibrao multivariada (DANTAS-FILHO

et al., 2004, ARAUJO et al., 2001, GALVO et al., 2001b), transferncia de

calibrao (HONORATO et al., 2005), entre outros.

Uma Tabela, representada por uma matriz Amxn (Figura 1.4)

utilizada para apresentar os dados de natureza multivariada. Nela,

geralmente as amostras (objetos) esto localizadas nas linhas e as

variveis, que so medidas de alguma propriedade das amostras, so

distribudas nas colunas. No caso de dados voltamtricos, as variveis so

os valores de corrente registrados em cada potencial que compe a janela

de varredura.

Figura 1.4 Representao de uma matriz de dados de natureza multivariada.

1.7.1 Pr-processamento dos dados

Os dados obtidos de uma anlise, tambm conhecidos como dados

brutos, podem apresentar diversas fontes de variao causando

irregularidades sistemticas na linha de base, rudos instrumentais ou

variveis de diferentes unidades e magnitudes. Ento, antes da realizao

da modelagem multivariada propriamente dita, faz-se necessrio um pr-

processamento para remover as fontes indesejveis de variaes que

possam atingir as variveis e/ou amostras do conjunto de dados como um

todo (MASSART et al., 1997, FERREIRA et al., 1999).

15 INTRODUO

Existem basicamente trs tipos de pr-processamento aplicveis s

variveis: a centralizao dos dados na mdia, que consiste na subtrao

dos elementos de cada linha pela mdia da sua respectiva coluna, o

escalonamento, onde cada elemento de uma linha dividido pelo desvio

padro da sua respectiva varivel, fazendo com que todos os eixos da

coordenada sejam conduzidos mesma escala e, conseqentemente,

cada varivel fica com o mesmo peso, e o auto-escalonamento, que

consiste em centralizar os dados na mdia e efetuar o escalonamento.

Desta forma, as variveis tero mdias zero e desvios padres igual a um.

Tanto o escalonamento quanto o auto-escalonamento so utilizados

quando se pretende atribuir a mesma importncia s variveis do sistema

de investigao (MASSART et al., 1997, BEEBE et al., 1998).

Alm do pr-processamento dos dados aplicado s variveis,

devem-se considerar tambm as variaes existentes entre as amostras.

Para contornar tais problemas, mtodos como a normalizao, a

derivao, a filtragem de rudo aleatrio, entre outros so bastante

utilizados. A normalizao aplicada quando se deseja remover variaes

sistemticas presentes na amostra. Ela realizada dividindo cada varivel

por uma constante que escolhida a partir de uma anlise preliminar dos

dados. Os mtodos de derivao so comumente aplicados quando, em

um conjunto de dados, deseja-se corrigir problemas relacionados com a

variao da linha de base. Alm disso, o mtodo da derivao muito til

para permitir uma melhor visualizao de picos existentes nos sinais

originais. Contudo, uma avaliao prvia dos dados deve ser realizada,

pois as respostas instrumentais so compostas de sinais verdadeiros e

rudos aleatrios que podem aparecer com baixa ou alta intensidade.

Portanto, o mtodo derivativo pode, em muitos casos, super-dimensionar

a presena de eventuais rudos presentes nas amostras (MASSART et al.,

1997, BEEBE et al., 1998).

Vale salientar que, o uso de um ou outro mtodo de pr-

processamento, seja ele aplicado s amostras e/ou variveis, deve ser

previamente avaliado procurando sempre tomar as decises mais

16 INTRODUO

coerentes de acordo com a natureza dos dados. Para isto, muito

importante ter conhecimento aprofundado sobre o sistema em estudo.

1.7.2 Planejamentos experimentais

Diversas variveis influenciam a qualidade dos dados e resultados

obtidos por voltametria. Ainda assim, tcnicas quimiomtricas de

planejamento experimental tm sido pouco exploradas na otimizao

dessas variveis.

Planejamentos experimentais tpicos podem ser aplicados no

contexto da qumica eletroanaltica, s vezes, sendo necessrio um ou

mais planejamentos para atingir o objetivo final. Sempre que possvel, os

parmetros destas tcnicas como incremento de potencial e amplitude de

pulso, entre outros no caso da voltametria, devem ser avaliados de modo

a garantir que o mtodo seja sensvel, preciso e exato.

Por conveno, adotam-se as seguintes notaes para o uso de

planejamento experimental:

Fatores: so as variveis controladas

Valor das variveis (Nveis): so valores dos fatores compreendendo a regio de

investigao.

Resposta do experimento: o valor, alvo da otimizao, obtido para cada

experimento.

1.7.2.1 Planejamento composto central

O planejamento composto central uma opo vantajosa ao

planejamento fatorial completo de trs ou mais nveis, por fornecer igual

ou menor nmero de experimentos. Em geral, um planejamento composto

central para k fatores formado por trs partes:

Um planejamento fatorial completo ou fracionrio de dois (2) nveis e k fatores,

contendo nF = 2k experimentos;

Um planejamento axial ou estrela, formado por 2k experimentos e com todos os

fatores nulos, exceto um, que igual a um certo valor ou -;

Um ponto central, que deve ser repetido determinado nmero de vezes.

17 INTRODUO

Desta forma, o total de experimentos distintos ser: nF + 2k + 1.

O valor da distncia axial dos pontos no planejamento estrela, ,

geralmente estabelecido usando-se o conceito de rotabilidade em que 2 . Um planejamento rodvel se a varincia de suas estimativas s depender da distncia em relao ao ponto central, ou seja, se a

preciso da resposta prevista for a mesma em todos os pontos situados

numa hiperesfera com centro no prprio centro do planejamento. Esta

propriedade esfrica um critrio de projeto usado quando o

planejamento fatorial completo. No entanto, no importante ter uma

rotabilidade exata para se ter um bom planejamento. (BARROS-NETO et

al., 2003, CALADO e MONTGOMERY, 2003).

1.7.2.2 Parmetro de Taguchi

Taguchi (MASSART et al., 1997) interessou-se pela problemtica de

como usar planejamento experimental para diminuir a disperso em

torno de um valor desejado e conseqentemente aumentar a robustez de

um produto. Sua idia consiste basicamente de dois elementos: 1)

resposta e 2) planejamento experimental que permite a maximizao da

resposta.

A resposta caracterizada pelo valor e sua disperso quando o

experimento replicado. Neste caso, o valor da resposta e a disperso

so dados pelas Equaes (1.1) e (1.2), respectivamente:

(1.1)

(1.2)

onde a mdia das respostas, chamada de sinal e a varincia, chamada de rudo. A proposta de Taguchi (Equao 1.3) foi maximizar a

relao sinal/rudo.

18 INTRODUO

10 10 10 10 log log log log (1.3) Isto equivalente a minimizar o desvio padro relativo, ou seja, melhorar

a preciso do mtodo utilizado.

Uma vez que um mtodo analtico otimizado atravs de

planejamentos estatisticamente bem estabelecidos, os sinais, por ele

obtidos, tornam-se mais adequados ao emprego de ferramentas

quimiomtricas para a construo de modelos de classificao e/ou

calibrao multivariada.

1.7.3 Anlise de Componentes Principais (PCA)

A PCA uma tcnica quimiomtrica de reconhecimento de padres

no-supervisionado cujo princpio fatorar um conjunto de dados de

natureza multivariada, objetivando a representao das variaes

existentes na forma de componentes principais (PCs) (Figura 1.5). As PCs

so as representaes dos novos eixos formados a partir da combinao

linear das variveis originais e nelas est contida toda a informao dos

dados na forma de varincia. Elas so sempre ortogonais

(perpendiculares) umas as outras, e sucessivas PCs descrevem

quantidades decrescentes da varincia explicada dos dados, de modo que

a informao relevante est contida nas primeiras componentes. Por esta

razo, poucas PCs so necessrias para que toda ou a maior parte da

varincia dos dados seja explicada, permitindo que os dados multivariados

sejam interpretados em dimensionalidades plausveis percepo humana

(MASSART et al., 1997, BEEBE et al., 1998, FERREIRA et. al., 1999).

19 INTRODUO

Figura 1.5 Primeira e segunda PCs no espao tridimensional das variveis.

A contribuio que cada varivel original exerce sobre uma

determinada PC denominada peso, que pode ser definido,

matematicamente, como sendo o cosseno do ngulo entre o eixo da

varivel e o eixo da PC. Da mesma forma que as amostras tm

coordenadas definidas pelas variveis originais, elas tambm as possuem

em relao aos novos eixos (PCs), onde so denominadas escores das

amostras. Um determinado nmero (menor do que o total) de PCs no

consegue descrever toda a varincia dos dados, ento essa parte no

descrita ser representada em uma nova matriz chamada de resduos

(MASSART et al., 1997, BEEBE et al., 1998).

O nmero de PCs suficiente para descrever a informao dos dados

definido como sendo a dimensionalidade inerente (DI) ou posto da

matriz. A DI deve-se s caractersticas fsicas e/ou qumicas encontradas

no conjunto de dados, que esto mascaradas pela presena de correlao

entre as variveis e rudos. Para que a DI seja alcanada, imprescindvel

definir o nmero adequado de PCs que fornecem as informaes de

interesse para o analista, excluindo o mximo de rudo sem comprometer

as informaes pertinentes melhor interpretao dos dados. Por isso,

recorre-se ao uso de ferramentas de diagnstico, que investigam e

exploram trs aspectos do conjunto de dados: o modelo, as amostras e as

variveis. Dentre estas ferramentas, pode-se citar o grfico dos resduos,

o grfico da varincia explicada, grfico dos escores e o grfico dos pesos.

20 INTRODUO

Outro ponto to importante quanto determinao do nmero de

PCs a deteco de amostras anmalas (outliers), que apresentam

caractersticas diferentes e afetam os resultados obtidos. Estas amostras

devem, portanto, ser removidas do conjunto de dados (MASSART et al.,

1997, BEEBE et al., 1998). importante ressaltar que o descarte de uma

ou mais amostras do modelo deve ser efetivamente avaliado utilizando

diversos tipos de ferramentas de diagnstico. Desconsiderar a

variabilidade existente do conjunto de dados como um todo e adotar, com

pouca informao a priori, uma amostra como sendo outlier pode

prejudicar o desempenho dos modelos.

PCA uma tcnica bastante utilizada como base para outras

tcnicas quimiomtricas multivariadas como, por exemplo, o SIMCA, que

uma tcnica de reconhecimento de padro supervisionado.

1.7.4 SIMCA

O SIMCA um mtodo de reconhecimento de padro supervisionado

no qual cada classe individualmente modelada por PCs (KOWALSKI,

1984). Para cada classe ou grupo de amostras previamente estabelecido,

um modelo PCA construdo delimitando estatisticamente uma regio

espacial. Amostras futuras podem ser avaliadas como pertencentes sua

classe verdadeira se possurem caractersticas que possam ser inseridas

no espao multidimensional de um dos agrupamentos (BEEBE et al.,

1998, FLATEN et al., 2004), ou seja, a amostra classificada como

pertencente a uma dada classe se apresentar varincia dentro de um

valor crtico determinado pelo modelo. Obtm-se este valor em funo do

valor de z2 (Figura 1.6) calculado pela Equao (1.4).

Figura 1.6 Previso de uma amostra desconhecida A usando o modelo SIMCA da classe B construdo com uma PC. A distncia y entre a amostra A e o eixo da componente corresponde ao resduo da PC1, x a distncia entre a projeo de A na direo da PC1 e a fronteira da classe e z a distncia de A at o limite da classe.

21 INTRODUO

z2 = x2 + y2 (1.4)

O valor z2 convertido a uma varincia e dividido pela varincia das

amostras da classe B para formar um valor F calculado, Fcal. Utiliza-se,

ento, o teste F, em que um valor crtico, Fcrit, escolhido empiricamente

ou a partir de uma tabela do teste F. Se o Fcal for menor do que o valor

crtico adotado, a amostra desconhecida pode ser classificada como

pertencente classe B (MASSART et al., 1997, BEEBE et al., 1998).

Uma das ferramentas utilizadas pelos pacotes quimiomtricos para

mostrar os resultados da classificao SIMCA uma tabela de asteriscos,

em que a presena dos mesmos representa que a amostra foi classificada

como pertencente ao modelo elaborado. Outra forma o grfico

bidimensional Si x Hi (Figura 1.7). Este grfico detalha os dois limites

usados para a classificao: a distncia da amostra em relao ao modelo

da classe selecionado (raiz quadrada da varincia residual, Si) e a

influncia (Leverage, Hi) que a distncia das amostras projetada ao

centro do modelo. Ento, amostras que se encontrarem dentro de ambos

os limites definidos pelo modelo especfico, pertencero classe em

questo (CAMO, 1998).

Figura 1.7 Grfico de Si x Hi, detalhando os limites de uma determinada classe 1 e a disposio das demais amostras ao seu redor. Neste caso, uma das amostras da prpria classe 1 foi mal classificada como visualizado.

22 INTRODUO

Dois tipos de erros podem ocorrer em um estudo de classificao:

Erro do Tipo I (Falso-Positivo): amostra avaliada no classificada em sua prpria

classe.

Erro do Tipo II (Falso-Negativo): amostra avaliada classificada em uma classe

errada.

Em SIMCA, a mesma amostra pode apresentar erros do Tipo I e do

Tipo II simultaneamente, quando deixar de classificar em sua classe

verdadeira e classificar em uma ou mais classes erradas.

1.7.5 Anlise discriminante linear (LDA)

A anlise discriminante linear (LDA) uma tcnica que consiste em

estimar uma combinao linear de duas ou mais variveis independentes

obtendo uma funo linear, que pode distinguir os pontos relativos aos

dados de dois ou mais grupos. Se essa funo de fato existe, ento

possvel dizer que os pontos pertencentes a esses grupos so linearmente

separveis. A discriminao feita determinando o conjunto timo de

pesos para as variveis independentes de tal maneira que se maximize a

varincia entre os grupos em relao varincia dentro dos grupos. Uma

das maneiras mais simples de se obter uma funo linear discriminante

(MASSART et al., 1997, KOWALSKI et al., 1984, BRUNS e FAIGLE, 1985)

ilustrada na Figura 1.8.

Figura 1.8 Representao esquemtica da anlise discriminante linear. Os centros de gravidade (os asteriscos) dos grupos formados por crculos e quadrados so inicialmente determinados. Em seguida traa-se um plano de deciso eqidistante e perpendicular linha que une os centros de gravidade dos grupos, formando as regies R1 e R2. Se um ponto qualquer estiver presente na regio R1, o mesmo classificado como pertencente ao grupo 1. Caso contrrio, obrigatoriamente pertencer categoria 2.

23 INTRODUO

Vale salientar que em LDA, se a amostra apresentar erro do Tipo I,

conseqentemente ocorrer erro do Tipo II (BRUNS e FAIGLE, 1985).

Diferentemente do SIMCA, mtodo de classificao consolidado para

trabalhar em altas dimenses, a LDA limita-se ao uso de dados com baixa

dimensionalidade. Neste contexto, torna-se necessrio o emprego de

mtodos de seleo de variveis que so teis para aumentar a

capacidade preditiva dos modelos, eliminar variveis no informativas e

reter aquelas que, provavelmente, resultam em uma boa exatido.

1.7.6 Seleo de variveis

As tcnicas quimiomtricas tradicionalmente utilizadas no contexto

da classificao possibilitam trabalhar com todo o conjunto de dados,

reduzindo sua dimensionalidade, por meio de fatorao, para facilitar a

visualizao e interpretao destes dados. Por exemplo, PCA transforma

as variveis e distribui os objetos em novos sistemas de eixos ortogonais

em funo da maior varincia dos dados (MASSART et al., 1997, BEEBE et

al., 1998), permitindo a utilizao destes com bastante eficincia em

tcnicas como SIMCA e LDA (DIAZ et al., 2005, PONTES et al., 2006,

KEMSLEY, 1996). A principal desvantagem deste tipo de compresso de

dados a dificuldade de interpretaes fsicas ou qumicas do sistema,

tendo em vista que trabalha no domnio das variveis transformadas.

Vrios algoritmos tm sido propostos para uma seleo mais conveniente

de variveis (GESTAL et al., 2004, WU e MASSART, 1997, STEEL et al.,

2000), entre eles, pode-se destacar o SPA desenvolvido por ARAJO et al.

(2001) para seleo de variveis, no contexto da calibrao multivariada,

aplicada aos modelos de regresso linear mltipla (Multiple Linear

Regression MLR).

1.7.7 Algoritmo das projees sucessivas (SPA)

A essncia do SPA consiste em buscar um conjunto pequeno e

representativo de variveis com nfase na minimizao de colinearidade

entre elas. Desta maneira, torna-se possvel usar modelos MLR que,

24 INTRODUO

embora relativamente simples e de fcil interpretao, so severamente

afetados por problemas de colinearidade (ARAJO et al., 2001).

Os fundamentos tericos, bem como os detalhes da rotina

operacional do SPA tm sido extensivamente tratados em outros trabalhos

(ARAJO et al., 2001, GALVO et al., 2001b, PONTES et al., 2005,

DANTAS-FILHO et al., 2004, HONORATO et al., 2005). Apesar disto,

importante a apresentao de um exemplo ilustrativo no contexto da

voltametria.

Considere um conjunto J = 5 variveis voltamtricas: X1 = 400 mV;

X2 = 450 mV; X3 = 500 mV; X4 = 550 mV e X5 = 600 mV para a

determinao de dois analitos (A=2) usando trs amostras de calibrao

(Xcal = 3). Ento, a rotina de operaes do algoritmo para a seleo das

variveis realizada na seguinte ordem:

1) Para o clculo das projees, usa-se como vetor (K(0)) de partida aquele que

possuir a maior norma. Contudo, os demais vetores so posteriormente testados e

aqueles mais ortogonais sero incorporados para a formao de cadeias de

variveis candidatas (Figura 1.9).

Figura 1.9 Exemplo do funcionamento do SPA para selecionar potenciais a partir de cinco variveis voltamtricas: a) Projees no plano ortogonal a X3; b) Viso espacial dos vetores no plano horizontal.

2) O programa gera J x [(Xcal - A) + 1] cadeias (K(0), N), onde K(0) pode variar de

1 at J, e N, nmero de variveis em cada cadeia, pode variar de A at Xcal. Para

este exemplo: sero geradas 5 x [(3 2) + 1] = 10 cadeias, ou seja, todas as

possveis combinaes entre K(0) e N:

X1,2 X2,2 X3,2 X4,2 X5,2

X1,3 X2,3 X3,3 X4,3 X5,3

25 INTRODUO

3) A primeira cadeia de variveis a ser formada composta pelo vetor de partida,

neste caso X3 (500 mV), alm das duas variveis mais ortogonais X1 (400 mV) e

X5 (600 mV).

4) Para se determinar qual a melhor cadeia de variveis, faz-se uma regresso por

MLR para cada uma delas, empregando-se como matriz X as intensidades de

corrente da cadeia de variveis e como matriz Y as concentraes dos dois

analitos avaliados. Realiza-se, atravs da Equao (1.5), o clculo do erro

quadrtico mdio de previso (RMSEP) de amostras de um conjunto de teste para

cada um dos modelos MLR construdos.

!"# $ %& '& &( (1.5) Em que & e '& so os valores de referncia e previsto pelo modelo, de um parmetro de interesse. O algoritmo escolhe a cadeia de variveis cujo modelo

MLR resulta no menor RMSEP.

Vale salientar que o nmero de variveis selecionadas em cada

cadeia, N, limitado pela quantidade de amostras do conjunto de

calibrao para evitar problemas com a inverso de matrizes nos modelos

MLR.

1.7.8 SPA no contexto da classificao

Recentemente, PONTES et al. (2005) adaptaram o SPA para o

contexto dos mtodos de reconhecimento de padro. Neste caso, a

informao da modelagem consiste nos dados das respostas instrumentais

(matriz X) e um vetor contendo o ndice de classe para cada amostra.

Como se trata de classificao, os valores de referncia dos y parmetros

no so disponveis para processar a estatstica do RMSEP que a funo

de custo adotada pelo SPA-MLR para a seleo das variveis (DANTAS-

FILHO et al., 2004). Portanto, quando um subconjunto de variveis sob

avaliao empregado, a funo de custo adotada o risco mdio ) de uma classificao incorreta, sendo este um critrio da Anlise

Discriminante Linear.

Esta funo calculada no conjunto de teste como:

26 INTRODUO

) *+%,-*+-( (1.6) Onde *+ o nmero de amostras do conjunto de teste e ,- risco de uma classificao incorreta da *th validao da amostra .-. Logo, ,- definido como:

,- /.-, 2-3452672- /.-, 26 (1.7) Na Equao (1.7), o numerador /.-, 2- o quadrado da distncia

de Mahalanobis entre a amostra .- (de ndice de classe 2-) e a amostra mdia, 2-, de sua classe verdadeira. Esta distncia calculada como:

/.-, 2- .-, 2-% .- 2-89 (1.8) Em que 2- e correspondem amostra mdia e a covarincia, respectivamente, e so calculadas com os dados das amostras do

conjunto de calibrao. O denominador corresponde ao quadrado da

distncia de Mahalanobis entre a amostra .- e o centro da classe incorreta mais prxima. Idealmente, ,- o maior valor possvel, de modo a validar melhor os limites entre as classes. Portanto, ser escolhida a cadeia de

variveis que resultar no menor risco mdio ) de uma classificao incorreta.

1.7.9 Quimiometria aplicada voltametria

HERRERO e ORTIZ (1999) avaliaram os aspectos qualitativos e

quantitativos da aplicao do algoritmo gentico (Genetic Algorithm GA)

no contexto da seleo de variveis em alguns exemplos envolvendo

dados polarogrficos e voltamtricos. Em todos os casos o desempenho

dos modelos PLS com e sem seleo de variveis pelo GA foi avaliada em

funo da mdia do erro absoluto relativo para a previso. No exemplo da

27 INTRODUO

determinao de benzaldedo por DPP, a mdia do erro absoluto relativo

para o modelo PLS foi de 2,10% enquanto para o modelo GA-PLS foi de

1,85%.

BESSANT e SAINI (1999) desenvolveram uma metodologia para

determinao simultnea de glicose, frutose e etanol empregando como

eletrodo de trabalho um eletrodo de platina no modificado, a voltametria

de escada de pulso duplo (Dual Pulse Staircase Voltammetry DPSV) e

ANN para a calibrao multivariada. Os voltamogramas utilizados so

resultados da subtrao da resposta do branco, que o voltamograma do

prprio eletrlito suporte (NaOH 0,1 mol L-1). Posteriormente, os

mesmos autores (BESSANT e SAINI, 2000) testaram estes dados

empregando outras tcnicas de calibrao multivariada, tais como: MLR,

regresso por componentes principais (Principal Component Regression

PCR) e PLS. Ainda assim, os resultados no superaram os obtidos com

ANN em virtude do carter no linear do etanol e de sua interao com

frutose.

PALACIOS-SANTANDER et al. (2003) aliaram a tcnica ANN a

mtodos de reduo de dimensionalidade matricial, tais como:

transformadas de Fourier (Fourier Transform FT) e Wavelet (Wavelet

Transform WT) para resolver problemas de sobreposio de sinais

eletroqumicos obtidos pela voltametria de pulso diferencial (Diferential

Pulse Voltammetry DPV). Neste estudo, utilizou-se um eletrodo de gota

pendente de mercrio (Hanging Mercury Drop Electrode HMDE) para a

determinao simultnea dos ons Tl+ e Pb2+. Este mtodo foi comparado

com as tcnicas PLS e PCR e, baseando-se na raiz do erro mdio

quadrtico (Root Mean Square Error RMSE), estabeleceu-se que o

modelo proposto mais eficiente. Paralelamente, COCCHI et al. (2003)

utilizaram esta mesma metodologia e os mesmos analitos para comparar

os resultados da calibrao multivariada empregando PLS, MLR e ANN aos

coeficientes wavelets gerados aps a compresso dos voltamogramas. Os

melhores resultados foram obtidos por MLR.

28 INTRODUO

A DPV tambm foi utilizada para elaborao de um mtodo capaz de

determinar pesticidas organofosforados, utilizando HMDE e quimiometria.

Devido alta sobreposio dos voltamogramas para estes compostos, a

quantificao foi realizada empregando comparativamente as tcnicas

PCR, PLS, mnimos quadrticos clssicos (Classical Least Square CLS),

Kalman filter (KF) e ANN. Recuperao satisfatria para um conjunto de

amostras sintticas foi obtida por ANN (NI et al., 2004).

NI et al. (2001a) desenvolveram um mtodo utilizando HMDE e DPV

para determinao simultnea de nitrobenzeno, 2-, 3-, 4-nitrofenol e 2,4-

dinitrofenol com PLS, PCR e CLS. Foram alcanados erros relativos de

previso de 10 % para PLS e PCR e 38% para CLS. Posteriormente,

esta metodologia foi utilizada na construo de um modelo de calibrao

multivariada para quatro pesticidas (carbamatos) incluindo, desta vez, o

uso de ANN. Neste caso, o erro relativo de previso foi de 5,6% (NI et al.,

2005). Este mesmo grupo utilizou eletrodo de carbono vtreo e as tcnicas

mais comuns de voltametria e calibrao multivariada para determinao

simultnea dos antioxidantes hidroxianisol butilado, hidroxi-tolueno

butilado, propil galato e tert-butilhidroquinona (NI et al., 2000) e, dos

antipsicticos cloridrato de clorpromazina e cloridrato de prometazina (NI

et al., 2001b).

cido nalidxico (antibacteriano) e seu principal metablico, cido 7-

hidroximetilnalidxico, foram determinados em urina aplicando ANN e PLS

aos voltamogramas obtidos por meio da polarografia de pulso diferencial

(Diferential Pulse Polarography DPP), SWV e mtodos de corrente

contnua (Sampled DC). Modelo PCR foi construdo e os escores obtidos

foram utilizados para o treinamento das redes neurais. Os melhores

resultados foram obtidos com ANN e DPP (GUIBERTEAU et al., 2004).

CUKROWSKA et al. (2001) desenvolveram um mtodo para

determinao simultnea de adenina e citosina utilizando padres destes

analitos para elaborar modelos de calibrao multivariada empregando

ANN. Voltametria de varredura linear (Linear Sweep Voltammetry LSV)

e DPP foram testadas neste trabalho. A tcnica LSV apresentou melhores

29 INTRODUO

resultados, com erros absolutos de 3,7% e 5,2% para adenina e citosina,

respectivamente.

BARTHUS et al. (2005) aplicaram o mtodo PLS aos dados obtidos

por SWV com eletrodo de carbono vtreo para misturas sintticas de cido

ascrbico e b-nicotinamida adenina dinucleotdeo (NADH). Foram obtidos

erros relativos mximos de 1,7% e 2,1% para NADH e cido ascrbico,

respectivamente.

PLS foi utilizado para quantificao de benzaldedo empregando a

DPP com intuito de determinar a capacidade de discriminao. Neste caso,

a calibrao univariada no pde ser aplicada devido ao aumento

caracterstico do pico com a concentrao e as leves oscilaes do pH

(SANZ et al., 2001).

SAURINA et al. (2000) utilizaram um eletrodo de grafite-metacrilato,

voltametria cclica (Ciclic Voltammetry CV) e as tcnicas quimiomtricas

PCR e PLS para a determinao simultnea de aminocidos oxidveis

(cistena, tirosina e triptofano). Desvios-padro relativos de 10% foram

obtidos para as previses de cistena e triptofano e 18% para tirosina.

Posteriormente, este mesmo grupo (SAURINA et al., 2004) desenvolveu

uma nova metodologia utilizando DPV e um eletrodo de platina para a

quantificao dos mesmos aminocidos. Esta estratgia apresentou um

bom compromisso entre sensibilidade, seletividade e reprodutibilidade

para estes analitos.

Vinhos, cervejas, cafs, leites e sucos de fruta foram analisados por

SWV com eletrodo de platina, que passou por um procedimento de

limpeza por ultra-som antes de cada amostra. PCA e HCA foram utilizadas

como tcnicas de reconhecimento de padro. Para o emprego de

calibrao multivariada por PCR e PLS, uma amostra de suco de laranja foi

diluda sucessivas vezes para construir os conjuntos de amostras

necessrios. Os resultados em termos de RMSEP foram de 4,0% e 5,4%

para PCR e PLS, respectivamente (SCHREYER e MIKKELSEN, 2000).

Um arranjo de microeletrodos de carbono vtreo reticulado foi

desenvolvido para a quantificao e classificao de bactrias utilizando

30 INTRODUO

voltametria de pulso normal (Normal Pulse Voltammetry NPV), SIMCA e

PLS. Resultados aceitveis foram obtidos em calibrao multivariada

transformando a varivel dependente em escala logartmica (log(1+yi)) e

auto-escalonando todas as variveis independentes. (Berrettoni et al.,

2004a, Berrettoni et al., 2004b).

Um algoritmo para resoluo de curva multivariada (Multivariate

Curve Resolution MCR) por mnimos quadrados alternados (Alternating

Least Square ALS) tem sido utilizado com bastante eficincia para

resoluo de sobreposio de picos em sinais eletroanalticos, inclusive,

servindo como ferramenta para investigar o processo eletroqumico

envolvido (ESTEBAN et al., 2000, CRUZ et al., 2000, DAZ-CRUZ et al.,

2000, DAZ-CRUZ et al., 20001, FERNNDEZ et al., 2001, DAZ-CRUZ et

al., 2002, ANTUNES et al., 2002, CRUZ et al., 2002).

DIAZ et al. (2004) avaliaram as tcnicas DPV, SWV e DC com intuito

de desenvolver uma metodologia para a determinao de tocoferol

(vitamina E) em amostras de leos vegetais (canola, milho, soja e oliva)

usando PLS. Utilizou-se um eletrodo de carbono vtreo e o voltamograma

do branco (eletrlito de suporte) foi registrado antes de cada medida. Os

melhores resultados foram alcanados pelo PLS-DPV, quando comparados

com os obtidos por cromatografia.

ESTEBAN et al. (2006a e b) publicaram duas revises reunindo o

uso de dados voltamtricos com diferentes aplicaes quimiomtricas:

otimizao e planejamento experimental, preparao e transformao de

dados para tratamentos posteriores, explorao de dados, classificao de

amostras e calibrao multivariada.

Recentemente, JAKUBOWSKA (2007) desenvolveu uma nova funo

wavelet me dedicada ao pr-processamento de voltamogramas levando

em considerao seu perfil, bem como as necessidades bsicas para a

anlise desse tipo de sinal como: reduo de rudo experimental, correo

da linha de base e sobreposio de picos.

A reviso literria at aqui realizada permitiu observar que poucos

trabalhos tm sido desenvolvidos explorando a unio de tcnicas

31 INTRODUO

voltamtricas com a anlise multivariada, sobretudo no contexto dos

mtodos de classificao de amostras. Diante disto, a SWV, tcnica

voltamtrica caracterizada por apresentar uma boa sensibilidade em alta

velocidade de varredura, combinada com mtodos de reconhecimento de

padro e seleo de variveis pode ser uma alternativa promissora para

classificao de diferentes tipos de leos vegetais refinados.

CAPTULO II OBJETIVOS

33 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Neste trabalho proposto um mtodo rpido, simples e barato para

a classificao e fiscalizao de leos vegetais comestveis quanto ao

prazo de validade, que combina a voltametria de onda quadrada (SWV)

com anlise discriminante linear (LDA) associada ao algoritmo das

projees sucessivas (SPA) para a seleo de variveis.

2.1.1 Objetivos Especficos:

i) Utilizar tcnicas de planejamento experimental para otimizar as condies de

analise em SWV.

ii) Utilizar a combinao da SWV, cuja instrumentao e manuteno no so

dispendiosas quando comparadas s demais tcnicas freqentemente

adotadas (cromatografia e espectroscopia), com mtodos de reconhecimento

de padro supervisionado (SIMCA e LDA) e seleo de variveis.

iii) Aplicar PCA a partir dos voltamogramas visando discriminao de amostras

de leos vegetais refinados no vencidos e vencidos.

iv) Elaborar e validar modelos SWV-SIMCA para classificao de leos vegetais

no vencidos e vencidos.

v) Utilizar a LDA com seleo prvia de variveis (potenciais voltamtricos) pelo

SPA para a classificao de leos vegetais refinados.

vi) Comparar o desempenho dos modelos SWV-SIMCA e SWV-LDA-SPA em

termos do nmero de erros de classificao.

CAPTULO III EXPERIMENTAL

35 EXPERIMENTAL

3.1 Amostras

Cento e quatorze amostras de leos vegetais refinados, de

diferentes lotes e fabricantes, foram adquiridas em estabelecimentos

comerciais da cidade de Joo Pessoa, Paraba. Dessas amostras, 66 so

aqui denominadas no vencidas, pois foram adquiridas no perodo de

agosto a setembro de 2006 e estavam dentro do prazo de validade, e 48

so amostras com o prazo de validade expirado (PVE), que foram

adquiridas em 2004. As classes e a quantidade de amostras analisadas

so detalhadas na Tabela 3.1.

Tabela 3.1 Classes e quantidade de amostras de leos vegetais analisados.

Classes de leo Nmero de Amostras

Canola 15

Girassol 16

Milho 17

Soja 18

PVE 48

3.2 Diviso do conjunto de amostras

Antes da construo dos modelos quimiomtricos, as amostras de

cada uma das classes de leos delineadas na Tabela 3.1 foram divididas

em trs conjuntos (treinamento, teste e previso) utilizando o algoritmo

KS (KENNARD e STONE, 1969), que usado para extrair um conjunto

representativo de amostras de um determinado conjunto de dados.

Inicialmente, o KS foi aplicado de modo a gerar o conjunto de treinamento

de cada classe. Em seguida, o KS foi aplicado s amostras remanescente

de cada classe de modo a gerar o conjunto de teste. As amostras

restantes foram ento usadas como amostras do conjunto de previso. O

nmero de amostras de cada classe e de cada conjunto mostrado na

Tabela 3.2.

36 EXPERIMENTAL

Tabela 3.2 Nmero de amostras de treinamento, teste e previso selecionadas pelo KS para as cinco classes de leos vegetais.

Classes Conjuntos

Treinamento Teste Previso

Canola 9 3 3

Girassol 10 3 3

Milho 10 3 4

Soja 10 4 4

PVE 20 10 18

3.3 Materiais e reagentes

Todos os reagentes utilizados foram de grau analtico P.A. e so

listados abaixo juntamente com os materiais:

lcool etlico absoluto (ISOFAR);

Hidrxido de sdio (MERCK KGaA);

cido actico (MERCK KGaA);

gua deionizada Milli-Q (Millipore Inc);

Pipetas automticas de 2-20 e 20-200 L (Eppendorf) e de 1,00-10,0 mL (VOLAC

John Poulten Ltd);

Ponteiras (Eppendorf) descartveis de polietileno;

Vidraria;

Tubos de polipropileno de 1,5 mL (Eppendorf).

3.4 Equipamentos

A parte experimental foi realizada empregando a SWV em um

estudo eletroanaltico que possibilitasse a elaborao e avaliao de

modelos quimiomtricos de classificao de leos vegetais refinados. As

medidas foram realizadas em um potenciostato/galvanostato AutoLab

Type II da Eco Chemie acoplado ao mdulo polarogrfico 663 VA Stand

da Metrohm (Figura 3.1), equipado com um eletrodo de referncia de

Ag/AgCl KCl (3.0 mol L-1) e um fio de platina como contra eletrodo. O

eletrodo de trabalho foi escolhido entre os eletrodos de disco de platina e

de ouro e, todos

planejamentos experimentais.

Figura 3.1 Potenciostato/Galvanostato AUTOLABVA Stand da cela eletroqumica

3.5 Procedimento a

Os parmetros da voltametria de onda quadrada

os estudos preliminares foram os seguintes:

Potencial - tempo de condicionamento: 0,7 V

Potencial - tempo de deposio:

Tempo de equilbrio:

Freqncia: 20 Hz;

Janela de varredura de potencial:

platina VS. Ag/AgCl);

Incremento de potencial: 5 mV;

Amplitude de pulso: 25 mV.

Voltamogramas registrados em triplicata.

Os dois primeiros

no trabalho realizado por

um mtodo para determinao eletroqumica multivariada de

alifticos com eletrodo de disco de platina, NaOH como eletrlito de

suporte e adaptaram

trabalho.

de ouro e, todos os parmetros foram otimizados com base em

planejamentos experimentais.

Potenciostato/Galvanostato AUTOLAB Type II esquerda e o mdulo da cela eletroqumica direita.

a