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CRISTIANO CHAVES

Volumetria cerebral de pacientes com esquizofrenia de início recente após tratamento adjuvante com minociclina ou placebo

Ribeirão Preto 2014

CRISTIANO CHAVES

Volumetria cerebral de pacientes com esquizofrenia de início

recente após tratamento adjuvante com minociclina ou placebo

Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Doutor em Saúde Mental. Área de concentração: Saúde Mental Orientador: Prof. Dr. Jaime E. C. Hallak

Ribeirão Preto 2014

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.

Ficha catalográfica

Chaves, Cristiano.

Volumetria cerebral de pacientes com esquizofrenia de início

recente após tratamento adjuvante com minociclina ou placebo / Cristiano Chaves; orientador: Prof. Dr. Jaime E. C. Hallak – Ribeirão Preto, 2014.

119 f. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo, 2014. 1. Esquizofrenia. 2. Minociclina. 3. Tratamento adjuvante 4. Ressonância magnética.

Dedico esta tese a meu pai que, com olhar

resplandecente e sereno, narrava-me episódios históricos

e literários, imbuindo-me de curiosidade pelo

conhecimento.

AGRADECIMENTOS

Expresso, em primeiro lugar, minha gratidão a meus familiares, fonte de apoio

incondicional em minhas decisões e projetos, tanto pessoais como profissionais.

Agradeço-lhes pelo amor e presença em minha vida. Destarte, rendo graças a minha

mãe Marilene, meu pai Públio, meus irmãos Isabela e Públio Júnior, assim como a

minha avó Juraci e demais familiares.

Agradeço sobretudo ao Prof. Jaime que, diligente e espirituoso, orientou-me

neste trabalho. Esse convívio permitiu conversas que variavam desde pequenas

coisas do dia-a-dia a discussões mais profundas e reflexivas, tanto na ciência como

na vida. Assim, além do amadurecimento acadêmico, os anos de convívio também

deram lugar à amizade e ao aperfeiçoamento pessoal.

Ao longo dos anos percorridos na pós-graduação, tive a oportunidade de contar

com a ajuda e apoio de vários professores e colegas, que contribuíram para essa

realização. Rendo graças ao Prof. Zuardi, ao Prof. Crippa, ao Prof. Lauro e ao Prof.

Carlos, assim como agradeço aos colegas e amigos da pós-graduação, a saber:

Tati, Jú, Cris, João Paulo I, João Paulo II, Thiago, Carlos, entre outros.

Também expresso meu reconhecimento aos amigos além das fronteiras da

pós-graduação. Assim, sou grato a toda turma de amigos que me auxiliam a ter um

caminho mais alegre e cheio de vida, assim como ao apoio nos percalços da vida.

Por fim, agradeço aos pacientes e familiares que, prestativos e bem-dispostos,

participaram desse estudo.

“Ser como um rio que flui

Silencioso no meio da noite.

Não temer as trevas da noite.

Se há estrelas no céu, refleti-las.

E se o céu se enche de nuvens,

Como o rio, as nuvens são água;

Refleti-las também sem mágoa

Nas profundidades tranquilas”.

Manuel Bandeira

RESUMO CHAVES, C. Volumetria cerebral de pacientes com esquizofrenia de início recente após tratamento adjuvante com minociclina ou placebo. 119 f. Tese (doutorado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014. Apesar da grande variedade de antipsicóticos disponíveis atualmente, os mesmos são limitados à melhora somente em sintomas positivos, ademais de estudos coortes longitudinais com pacientes em primeiro episódio psicótico que mostram agravamento em diferentes domínios psicopatológicos e perda progressiva de substância cinzenta cerebral. Além de alterações em sistemas de neurotransmissores, mais notadamente nos sistemas dopaminérgico e glutamatérgico, há evidências crescentes de um componente imunológico e inflamatório na fisiopatologia da esquizofrenia, indicando aumento de citocinas (e.g. interleucina 1β, interleucina 6 e TNF-α) e ativação microglial em pacientes com esse transtorno. Esses achados corroboram a necessidade de tratamentos adjuvantes que possam potencializar o tratamento antipsicótico e prevenir alterações progressivas de morfologia e funcionalidade cerebral nos estágios iniciais da doença. A minociclina é uma tetraciclina com ampla atividade anti-inflamatória e com evidências de ação neuroproterora, existindo diversos estudos que apontam que esse fármaco é um tratamento em potencial da esquizofrenia. Todavia, os efeitos da minociclina no SNC ainda não são conhecidos e não foram sistematicamente investigados através de técnicas de neuroimagem. O objetivo desse estudo foi pesquisar os efeitos do tratamento com minociclina na sintomatologia e na morfologia cerebral de pacientes com esquizofrenia de início recente após doze meses de um ensaio duplo-cego, randomizado, controlado por placebo. Esse estudo incluiu 24 pacientes com esquizofrenia de início recente randomizados para 12 meses de tratamento adjuvante com minociclina (200 mg/d) ou placebo. Os pacientes estavam em dose estável do antipsicótico há pelo menos 4 semanas, tinham idade entre 18 e 65 anos e não apresentavam comorbidades clínicas relevantes. Exames de ressonância magnética (RM) de 1.5 Tesla foram realizados ao final do ensaio clínico. A comparação entre grupos das imagens de RM foram feitas por meio de morfometria voxel-a-voxel (VBM), através do pacote SPM2. A análise de variância de medidas repetidas (RANOVA) mostrou que pacientes do grupo minociclina obtiveram melhora significativa na Escala das Síndromes Positiva e Negativa (PANSS) e em suas subescalas positiva, negativa e de psicopatologia geral. Não houve diferenças significativas no grupo placebo. A análise por VBM das imagens de RM indicou que pacientes do grupo placebo apresentavam volumes de substância cinzenta significativamente menor na porção médio-posterior do cíngulo esquerdo e em giro pré-central esquerdo, em comparação ao grupo minociclina. Esses resultados sugerem que o tratamento adjuvante com minociclina pode melhorar sintomas positivos e negativos da esquizofrenia, assim como prevenir algumas alterações cerebrais observadas nos estágios iniciais dessa doença. Esses efeitos da minociclina podem ter sido mediados por sua ampla ação anti-inflamatória, além de modulação indireta dos sistemas dopaminérgico e glutamatérgico. Novos estudos longitudinais com amostras maiores e com medidas de marcadores inflamatórios são necessários para avaliar o potencial da minociclina como tratamento adjuvante na esquizofrenia. Palavras-chaves: Esquizofrenia. Minociclina. Tratamento adjuvante. Ressonância magnética.

ABSTRACT CHAVES, C. Brain volumetry of patients with recent-onset schizophrenia after adjuvant treatment with minocycline or placebo. 119 f. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2014. Despite the wide variety of currently available antipsychotics, their efficacy is limited only to the improvement in positive symptoms, apart from longitudinal cohort studies of patients with first episode psychosis that show worsening in different psychopathological domains and progressive loss of brain gray matter. In addition to changes in neurotransmitter systems, most notably in the dopaminergic and glutamatergic systems, there is growing evidence of an immune and inflammatory component in the pathophysiology of schizophrenia, indicating an increase of cytokines (e.g., interleukin 1β, interleukin 6 and TNF-α) and microglial activation in patients with this disorder. These findings support the need for concomitant treatments that might enhance the antipsychotic treatment and prevent progressive changes in brain morphology and function in the early stages of the disease. Minocycline is a tetracycline with broad anti-inflammatory activity and with evidence of neuroprotective action, and there are several studies that show that this drug is a potential treatment for schizophrenia. However, the effects of minocycline on CNS are not known and have not been systematically investigated using neuroimaging techniques. The aim of this study was to investigate the effects of treatment with minocycline in symptomatology and brain morphology in patients with recent-onset schizophrenia after twelve months of a double-blind, randomized, placebo-controlled trial. This study included 24 patients with recent-onset schizophrenia randomized to 12 months of adjuvant treatment with minocycline (200 mg/d) or placebo. Patients were on stable dose of antipsychotics for at least 4 weeks, they were aged between 18 and 65 years and had no clinically relevant comorbidities. Magnetic resonance imaging (MRI) of 1.5 Tesla were performed at the end of the trial. Comparison between groups of MR images were performed by voxel based morphometry (VBM), using the SPM2 package. The analysis of variance for repeated measures (RANOVA) showed that patients in the minocycline group had significant improvement in the Positive and Negative Syndrome Scale (PANSS) and in its positive, negative and general psychopathology subscales. There were no significant differences in the placebo group. The VBM analysis of MR images indicated that patients in the placebo group had significantly smaller volumes of gray matter in the medial posterior portion of the left cingulate gyrus and in left precentral gyrus, in comparison to the minocycline group. These results suggest that adjuvant treatment with minocycline may improve both positive and negative symptoms of schizophrenia and may prevent some brain changes observed in the early stages of this disease. Its broad anti-inflammatory effects, in addition to indirect modulation of dopaminergic and glutamatergic systems, may have mediated the effects of minocycline. New longitudinal studies with larger samples and measurements of inflammatory markers are needed to evaluate the potential of minocycline as adjunctive treatment in schizophrenia. Key words: Schizophrenia. Minocycline. Add-on treatment. Magnetic ressonance.

LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Critérios diagnósticos de esquizofrenia de acordo com o DSM-V........... 15

Tabela 2 – Risco de desenvolvimento de esquizofrenia ao longo da vida em diferentes classes de familiares .......................................................................... 16

Tabela 3 – Genes candidatos para a esquizofrenia .................................................. 17

Tabela 4 – Fatores de risco ambientais para a esquizofrenia ................................... 17

Tabela 5 – Mecanismos de neuroproteção da minociclina ....................................... 26

Tabela 6 – Características demográficas e clínicas dos sujeitos .............................. 40

Tabela 7 – Diferenças de volumes de substância cinzenta regional entre os pacientes dos grupos minociclina e placebo ....................................................... 43

LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Fluxograma de pacientes incluídos no estudo ........................................ 36

Figura 2 – Pontuação nas escalas PANSS e CGI .................................................... 42

Figura 3 – Morfometria voxel-a-voxel de volumes cerebrais .................................... 43

LISTA DE ABREVIATURAS AIF Fator indutor de apoptose

AIMS Abnormal Involuntary Movement Scale (Escala de Movimentos

Involuntários Anormais)

AREP Ambulatório de Reabilitação Psicossocial

BA Broadman area (Área de Broadman)

BNF British National Formulary

CGI Clinical Global Impression (Escala de Impressão Clínica Global)

CID-10 Classificação Internacional de Doenças, 10a edição

DP Desvio Padrão

DSM-IV Diagnostic and Statistical Manual (Manual Diagnóstico e Estatístico da

Associação Psiquiátrica Americana, 4a edição)

EPM Erro Padrão da Média

g.l. Grau de Liberdade

HCRP Hospital das Clínicas da Faculdade Medicina de Ribeirão Preto

ICV Volume intracraniano total

IL-1β Interleucina-1β

IL-6 Interleucina-6

iNOS Óxido nítrico sintetase indutível

ISRS Inibidores seletivos da recaptação de serotonina

MAPK Proteínas quinases ativadas por mitógeno

MHC Major Histocompability Complex (Complexo Principal de

Histocompaibilidade)

MMPs Metaloproteínas de matriz

N Número de Sujeitos

NMDA N-metil-D-aspartato

PANSS Positive and Negative Syndrome Scale (Escala das Síndromes Positiva

e Negativa para esquizofrenia)

PET Positron Emission Tomography (Tomografia por Emissão de Pósitrons)

PI3-k Proteína quinase fosfotidilinositol-3

RM Ressonância magnética

ROI Region of interest (Região de interesse)

SNC Sistema Nervoso Central

TNF-α Fator de necrose tumoral α

USP Universidade de São Paulo

VBM Voxel based morphometry (morfometria voxel-a-voxel)

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 13 1.1 Um breve histórico do conceito de esquizofrenia ............................................... 13 1.2 Avanços neurocientíficos do estudo da esquizofrenia ....................................... 15 1.3 Neuroimagem estrutural na esquizofrenia ........................................................... 19 1.4 Inflamação e esquizofrenia ................................................................................... 22 1.5 Efeitos neuroprotetores da minociclina ............................................................... 25 1.6 Hipótese do estudo ............................................................................................... 27

2 OBJETIVOS DO ESTUDO .................................................................................. 28 3 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 29

3.1 Contexto geral do estudo ...................................................................................... 29 3.2 Sujeitos .................................................................................................................. 29

3.2.1 Critérios de Inclusão ........................................................................................... 29 3.2.2 Critérios de Exclusão .......................................................................................... 30

3.3 Instrumentos de avaliação ................................................................................... 31 3.3.1 Escalas de avaliação clínica ............................................................................... 31

3.4 Drogas .................................................................................................................... 32 3.5 Procedimento ......................................................................................................... 33

3.5.1 Recrutamento ..................................................................................................... 33 3.5.2 Primeira avaliação .............................................................................................. 33 3.5.3 Randomização ................................................................................................... 34 3.5.4 Seguimento ........................................................................................................ 34 3.5.5 Análise Estatística das Variáveis Clínicas e Demográficas ................................. 36

3.6 Estudo dos volumes de substância cinzenta em áreas cerebrais por meio de ressonância magnética .................................................................................................. 37

3.6.1 Aquisição de imagens de RM estrutural ............................................................. 37 3.6.2 Processamento das imagens .............................................................................. 37

3.7 Padrões éticos e regulatórios ............................................................................... 39 3.7.1 Comitê de Ética em Pesquisa Local ................................................................... 39 3.7.2 Declaração de Helsinque e Resolução 196/96 ................................................... 39

4 RESULTADOS .................................................................................................... 40 4.1 Características clínicas e demográficas .............................................................. 40 4.2 Desfecho clínico .................................................................................................... 41 4.3 Morfometria voxel-a-voxel de volumes cerebrais ............................................... 42

5 DISCUSSÃO ....................................................................................................... 44 6 CONCLUSÃO...................................................................................................... 50 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 51 ANEXOS ................................................................................................................... 60

ANEXO A – Termo de consentimento livre e esclarecido ............................................ 60 ANEXO B – Carta de aprovação do comitê de ética em pesquisa do HCRP .............. 68 ANEXO C – Carta de aprovação da comissão nacional de ética em pesquisa (CONEP) .......................................................................................................................... 69

APÊNDICES – Artigos relacionados à tese e escritos pelo autor ....................... 70 APÊNDICE A – Artigo de revisão ................................................................................... 71 APÊNDICE B – Relato de caso....................................................................................... 84 APÊNDICE C – Carta ao editor....................................................................................... 87 APÊNDICE D – Artigo submetido .................................................................................. 89

Introdução | 13

1 INTRODUÇÃO 1.1 Um breve histórico do conceito de esquizofrenia

A esquizofrenia é um dos mais graves transtornos psiquiátricos. Com uma

prevalência em torno de 1 % da população, geralmente se inicia em indivíduos

jovens e tende a ser crônico, levando a um prejuízo funcional importante. Essa

redução do funcionamento global do indivíduo se deve principalmente a sintomas

negativos e déficits cognitivos, os quais geram maior comprometimento em longo

prazo em relação aos sintomas típicos da fase aguda, que é geralmente

caracterizada por delírios, alucinações e desorganização tanto do discurso como do

comportamento (ANDREASEN, 2000).

O quadro de psicose é mencionado em textos antigos, incluindo o Hindu Ayur

Veda, assim como o Antigo e Novo Testamento. Todavia, as primeiras descrições

sistematizadas de sintomas psicóticos sugestivos de esquizofrenia foram feitas por

Haslam e Pinel em 1809 (NAQVI, 2008; SHENTON; WHITFORD; KUBICKI, 2010).

Em 1856, Morel utilizou o termo “dementia praecox” para descrever um adolescente

que era inteligente e ativo, mas evoluiu para um quadro progressivo de isolamento

social (NAQVI, 2008). Posteriormente, Hecker (em 1971) e Kahlbaum (1874)

também descreveram pessoas com episódios psicóticos que evoluíam com prejuízo

cognitivo e perda de funcionamento global (SHENTON; WHITFORD; KUBICKI,

2010).

Não obstante esses relatos iniciais, em 1896, o psiquiatra alemão Emil

Kraepelin foi o primeiro a realizar uma descrição clínica detalhada desse quadro,

separando dois tipos de psicose segundo o desfecho clínico (SHENTON;

WHITFORD; KUBICKI, 2010). Dessa forma, ele definiu um grupo de pacientes que

apresentavam sintomas psicóticos conjuntamente com sintomas afetivos

proeminentes, com recuperação funcional relativamente completa entre os episódios

agudos de doença. Deu-lhe o nome de “insanidade maníaco-depressiva”, que

atualmente é denominado como transtorno bipolar. Em contraste a esse grupo,

relatou outro que apresentava sintomas psicóticos floridos e evoluíam com um curso

crônico, além de acentuados prejuízos funcional e social. Nomeou-o de “dementia

praecox” (demência precoce), descrevendo-o como “...uma série de quadros

Introdução | 14

mórbidos, cuja característica comum consiste na sua terminação em um estado de

enfraquecimento especial” (KRAEPELIN, 1896; 1987).

O psiquiatra suíço Eugen Bleuler, publicou em 1911 seu livro sobre o grupo das

esquizofrenias. O termo esquizofrenia, que significa mente dividida, ganhou rápida

aceitação geral. Com esse término, ele queria salientar a perda de associações

entre diferentes funções da mente (BLEULER, 1911; BLEULER; BRILL, 1924).

Entretanto, Bleuler descreveu um quadro clínico muito heterogêneo, levando à falta

de confiabilidade diagnóstica da esquizofrenia entre diferentes lugares. Diante dessa

dificuldade, em 1959, Kurt Schneider elaborou uma lista de sintomas “...cuja

compreensão conceitual e reconhecimento clínico não ofereçam dificuldades”

(SCHNEIDER, 1957; 1959). Assim, elegeu sintomas que pudessem ser facilmente

observáveis e que guiariam ao diagnóstico de esquizofrenia, denominando-os de

sintomas de primeira ordem (sonorização do pensamento; vozes dialogando entre si

ou que comentem depreciativamente; delírios de difusão ou roubo do pensamento;

delírios de influência externa dos sentimentos, da vontade ou do corpo).

Os sintomas descritos por Kraepelin, Bleuler e Schneider formam a base dos

critérios operacionais modernos para o diagnóstico da esquizofrenia. A fim de

facilitar a pesquisa e o tratamento desse transtorno, utilizam-se atualmente dois tipos

de classificação: 1) Manual Diagnóstico e Estatístico da Associação Psiquiátrica

Americana (DIAGNOSTIC AND STATISTICAL MANUAL - DSM), que já está em sua

quinta edição; 2) Classificação Internacional das Doenças (CID), que está em sua

décima edição. O diagnóstico de esquizofrenia pelo DSM-V é mostrado na tabela 1.

Introdução | 15

Tabela 1 – Critérios diagnósticos de esquizofrenia de acordo com o DSM-V

A) No mínimo dois dos seguintes sintomas, cada qual presente por uma porção

significativa de tempo durante o período de 1 mês (ou menos se tratado com sucesso).

Deve haver pelo menos um dos itens (1), (2) ou (3):

1) delírios

2) alucinações

3) discurso desorganizado ou incoerente

4) comportamento desorganizado ou catatônico

5) sintomas negativos: embotamento afetivo, alogia ou abulia

B) Disfunção social/ocupacional: presença de comprometimento de uma ou mais

áreas de dimensão social ou ocupacional (tais como trabalho, relações interpessoais ou

cuidados pessoais) por uma porção significativa do tempo desde o início do transtorno.

C) Duração: sinais contínuos pelo período de 6 meses, que deve incluir um dos

sintomas do critério A, podendo incluir sintomas prodrômicos ou residuais. Sintomas

prodrômicos ou residuais podem incluir sintomas negativos ou sintomas “a” atenuados

(p. ex, crenças estranhas, experiências perceptuais incomuns).

D) Nenhum episódio depressivo maior, maníaco ou misto ocorreu durante a fase

ativa (“A”); ou se os episódios de humor ocorreram durante a fase ativa (sintomas “A”),

sua duração foi breve com relação à duração dos períodos ativo e residual.

E) Exclusão de substância ou condição medica geral

F) Relação com transtorno global do desenvolvimento: nesses casos o

diagnóstico adicional de esquizofrenia é feito apenas se delírios ou alucinações

proeminentes também estão presentes ao menos por um mês.

1.2 Avanços neurocientíficos do estudo da esquizofrenia

Kraepelin e Bleuler, anteriormente citados, julgavam que a esquizofrenia

estava ligada a alterações orgânicas do cérebro. Nessa mesma época, diversas

doenças neurodegenerativas foram descritas (e.g., doença de Pick e doença de

Alzheimer), relatando-se achados neuropatológicos típicos. Vale citar que Alzheimer

foi um dos primeiros pesquisadores a realizar estudos post mortem com cérebros de

indivíduos com esquizofrenia. Não obstante a perspectiva inicial de encontrar

alterações neuropatológicas típicas, os resultados desses estudos não levaram a um

Introdução | 16

maior esclarecimento desse transtorno. Por isso, a esquizofrenia foi cunhada como

“o cemitério dos patologistas” (PLUM, 1972; SHENTON; WHITFORD; KUBICKI,

2010).

Isso possivelmente se deve à heterogeneidade da esquizofrenia, englobando

processos fisiopatológicos diversos. Todavia, nas últimas décadas, ocorreu um

enorme avanço técnico neurocientífico, permitindo revelações importantes sobre

esse transtorno. Dessa forma, estudos em diversas áreas (e.g., genética,

psicofarmacologia e neuroimagem) trouxeram descobertas e maior conhecimento

sobre a esquizofrenia.

Será aqui esboçada uma síntese de alguns aspectos dos estudos em

genética, pois uma descrição mais ampla e detalhada foge ao escopo do presente

trabalho. Vale destacar que a esquizofrenia possui um forte componente genético,

com uma hereditariedade importante, como pode ser visto na tabela 2.

Tabela 2 – Risco de desenvolvimento de esquizofrenia ao longo da vida em diferentes classes de familiares

Classe de familiar Risco de desenvolvimento de esquizofrenia População geral 1% Primos em primeiro grau 2% Tio em primeiro grau 2% Sobrinho 4% Neto 5% Meio-irmão 6% Um dos pais 6% Irmão 9% Filho 13% Irmão 17% Gêmeo idêntico 48%

Adaptado de Gottesman (1991)

Ressalta-se que provavelmente o indivíduo herde a susceptibilidade para

desenvolver o quadro da esquizofrenia, e não a doença em si. Dessa forma, um

indivíduo que possua genes relacionados à esquizofrenia pode não expressá-los

(MIYAMOTO et al., 2003). Por conseguinte, considera-se que a esquizofrenia seja o

resultado final de diversas combinações de genes e fatores ambientais. Essa

perspectiva é reforçada pelos diversos estudos epidemiológicos que têm observado

a associação tanto de fatores genéticos como de fatores ambientais no

Introdução | 17

desenvolvimento da esquizofrenia. As tabelas 3 e 4 mostram alguns desses

achados.

Tabela 3 – Genes candidatos para a esquizofrenia Gene Função

Neuroregulina1 Migração neuronal e sinalização glutamatérgica Disbindina Liberação de glutamato DISC1 Migração neuronal RGS4 Sinalização sinaptiica AKT1 Sinalização sináptica COMT Catabolismo da dopamina Prolina desidrogenase Sinalização glutamatérgica GRM3 Sinalização glutamatérgica DAOA/G72 Sinalização glutamatérgica

Adaptado de Morrison e Murray (2005)

Tabela 4 – Fatores de risco ambientais para a esquizofrenia Fase do

desenvolvimento Fator de risco Tamanho de efeito a

Precoce Complicações obstétricas 2 Infecções maternas 2 Nascimento em zona urbana 1.4

Tardio

Imigração 4 Abuso crônico de cannabis 2 Eventos de vida adversos 1.5 Estresse 1.5

a Odds ratio. Adaptado de McDonald e Murray (2000)

Ao longo dos últimos 50 anos, também vieram à tona evidências de que a

esquizofrenia abarca alterações em diversos sistemas de neurotransmissores. A

primeira hipótese foi aventada por Arvid Carlsson, em 1963. Ele sugeriu que a

eficácia dos antipsicóticos no tratamento da psicose era em decorrência de efeitos

antagonistas em receptores monoaminérgicos (CARLSSON; LINDQVIST, 1963).

Posteriormente, Farde et al. (1988) realizaram um estudo com Tomografia por

Emissão de Pósitron (PET – Positron Emission Tomography) que mostrou que a

eficácia e efeitos colaterais dos antipsicóticos convencionais era proporcional ao

grau de bloqueio de receptores D2 no cérebro. Posteriormente, um estudo seminal

Introdução | 18

de Laruelle et al. (1996) observou que o uso de anfetamina levava a uma maior

liberação de dopamina no córtex estriado de pacientes em episódio psicótico agudo.

Em 2003, Kapur publicou um artigo de revisão que propunha uma visão heurística,

ligando fatores psicológicos e a biologia da psicose. Destacou que a dopamina é

mediadora da ˜saliência˜ e significação de estímulos do ambiente e que um estado

hiperdopaminérgico produziria uma atribuição aberrante de eventos ambientais e

representações internas, levando a delírios e alucinações (KAPUR, 2003).

Todavia, atualmente considera-se que o estado hiperdopaminérgico está mais

associado aos sintomas positivos da esquizofrenia, correspondendo a uma etapa

final do surgimento do quadro de psicose (HALLAK; CHAVES; ZUARDI, 2011). Vale

destacar que a hipótese de hipofunção dos receptores glutamatérgicos N-metil –D-

aspartato (NMDA) é objeto de ampla investigação atual, pois a administração de

antagonistas NMDA pode provocar sintomas psicóticos em indivíduos saudáveis

(KRYSTAL et al., 1994) e piorar o quadro psicótico de pacientes com esquizofrenia

(LAHTI, HOLCOMB; et al., 1995; LAHTI, KOFFEL; et al., 1995). Considera-se que

esse modelo possa ser mais próximo à esquizofrenia, haja vista que a administração

de antagonistas NMDA também produz sintomas que se assemelham aos sintomas

negativos e cognitivos da esquizofrenia. Adicionalmente, outros sistemas de

neurotransmissores (e.g. serotoninérgico, colinérgico, GABAérgico e

endocanabinóide) também estão alterados na esquizofrenia (HALLAK; CHAVES;

ZUARDI, 2011). Entretanto, há múltiplas interações entre esses sistemas, ocorrendo

mecanismos compensatórios e influências do ambiente, sendo difícil definir o papel

exato de cada sistema de neurotransmissores na esquizofrenia (HALLAK; CHAVES;

ZUARDI, 2011).

Além dos relevantes progressos na compreensão de alterações em sistemas

de neurotransmissores na esquizofrenia, outras abordagens trouxeram novas

perspectivas sobre a fisiopatologia desse transtorno. Para o embasamento do

presente trabalho, destacam-se as descobertas realizadas por meio de técnicas de

neuroimagem estrutural e a presença de alterações inflamatórias. Dessa forma, dar-

se-á destaque ao papel da neuroimagem estrutural na esquizofrenia e à hipótese

inflamatória da esquizofrenia, detalhados nos subcapítulos seguintes.

Introdução | 19

1.3 Neuroimagem estrutural na esquizofrenia

Apesar de que Kraepelin e Bleuler tivessem especulado sobre a possibilidade

de dano ao córtex cerebral, particularmente em regiões frontais e temporais,

somente após mais de um século surgiram ferramentas capazes de testar essa

hipótese. Após o relato de alargamento de ventrículos laterais por Johnstone et al.

(1976) por meio de exames de Tomografia Computadorizada, o advento de exames

por ressonância magnética (RM) trouxe importantes avanços na compreensão in

vivo de anormalidades biológicas na esquizofrenia. Aproximadamente 80% dos

estudos com RM relatam alargamento dos ventrículos laterais (SHENTON et al.,

2001; SHENTON; WHITFORD; KUBICKI, 2010). Todavia, não existem achados

patognômicos na esquizofrenia. Em relação ao alargamento ventricular, este

também é encontrado em outras doenças, como hidrocefalia, doença de Alzheimer e

em outras doenças neurodegenerativas. Embora o alargamento ventricular lateral

seja o achado anatômico mais reproduzido em estudos com pacientes com

esquizofrenia (SHENTON et al., 1992; PEARLSON; MARSH, 1999; KEMPTON et

al., 2010), exames de RM permitiram melhor diferenciação entre substancia cinzenta

e branca, com avaliações mais detalhadas de pequenas estruturas cerebrais.

Por conseguinte, estudos com RM têm observados alterações em diversas

estruturas, a saber: alargamento de terceiro ventrículo, envolvimento de estruturas

do lobo temporal medial (incluindo amígdala, hipocampo, giro parahipocampal e giro

temporal superior) e do lobo frontal, principalmente, córtices pré-frontal e órbito-

frontal (SHENTON et al., 2001; SHENTON; WHITFORD; KUBICKI, 2010). Também

são observadas alterações em todo o giro do cíngulo (KOO et al., 2008) e em

regiões subcorticais, incluindo o cavum septum pellucidum, núcleos da base, corpo

caloso, tálamo e cerebelo (PANTELIS et al., 2005; SHENTON; WHITFORD;

KUBICKI, 2010; ANDREASEN et al., 2011; TRZESNIAK et al., 2011).

Dessa forma, estudos com RM demonstraram redução de volumes de

substância cinzenta em diversas áreas, principalmente em regiões frontais e

temporais. Vale destacar, entretanto, que diferentes padrões de anormalidade de

volume de substância cinzenta sugerem que todo o córtex cerebral esteja afetado na

esquizofrenia (PEARLSON; MARSH, 1999; PANTELIS et al., 2005; ANDREASEN et

al., 2011; TRZESNIAK et al., 2011). Assim, esses achados realçam a existência de

anormalidades em múltiplas regiões cerebrais focais na esquizofrenia,

Introdução | 20

provavelmente envolvendo diversos circuitos cerebrais. Todavia, a base molecular e

patológica para essas alterações ainda permanece desconhecida (PEARLSON;

MARSH, 1999; PANTELIS et al., 2005; SHENTON; WHITFORD; KUBICKI, 2010).

Ademais, apesar de alterações sutis ao longo do córtex cerebral, nem todos os

pacientes apresentam os mesmos achados neuroanatômicos (PEARLSON; MARSH,

1999). Isso ocorre provavelmente em decorrência da natureza heterogênea da

esquizofrenia, com variações na expressão de sua fisiopatologia (SHENTON;

WHITFORD; KUBICKI, 2010).

Apesar de o curso natural dessas anormalidades ainda não estar claro,

evidências crescentes apontam que essas alterações ocorram ao longo do tempo,

precedendo o surgimento dos sintomas psicóticos e continuando após o início do

quadro psicótico (PEARLSON; MARSH, 1999; PANTELIS et al., 2005; PEREZ-NERI

et al., 2006; ANDREASEN, 2010; SHENTON; WHITFORD; KUBICKI, 2010;

ANDREASEN et al., 2011). Destarte, há múltiplas evidências que apontam a

existência de alterações cerebrais em diversos períodos da esquizofrenia, com

anormalidades que se iniciam no neurodesenvolvimento, perpassam o período

prodrômico e a fase ativa de psicose, com progressão após o primeiro episódio

psicótico (HONEA et al., 2005; PANTELIS et al., 2005; DELISI, 2008b; a; FUSAR-

POLI; ALLEN; MCGUIRE, 2008; JINDAL; KESHAVAN, 2008; FUSAR-POLI et al.,

2009; ANDREASEN et al., 2011; TENYI, 2011; VITA et al., 2012; ROIZ-SANTIANEZ

et al., 2013).

Diversas evidências sugerem que alterações do neurodesenvolvimento

exercem um papel central na esquizofrenia (KESHAVAN et al., 2008). Essa hipótese

sugere que anomalias sutis do neurodesenvolvimento ocorrem nos períodos pré- e

perinatais, estendendo-se à infância e à adolescência. Estudos de diferentes

abordagens dão sustentação a essa hipótese. Em primeiro lugar, dados

epidemiológicos indicam que fatores ambientais precoces (e.g. complicações

obstétricas e infecções maternas) estão associados a pequeno aumento no risco

relativo para a esquizofrenia, como observado anteriormente na tabela 4.

Complicações obstétricas podem levar a dano isquêmico cerebral e a hemorragias

intra e periventricular, produzindo a posteriori alargamento ventricular, redução do

volume hipocampal e anormalidades do corpo caloso (MIYAMOTO et al., 2003;

HALLAK; CHAVES; ZUARDI, 2011). Outros fatores ambientais tardios, tais como

crescimento em zonas altamente urbanizadas e uso de cannabis também estão

Introdução | 21

associados a maior risco de desenvolvimento de psicose (MURRAY; LAPPIN; DI

FORTI, 2008). Vale destacar ainda que alterações cerebrais típicas do

neurodesenvolvimento também são mais frequentes na esquizofrenia (e.g.,

persistência e alargamento do cavum septum pellucidum, agenesia de corpo caloso

e heterotopias de substância cinzenta) (HALLAK et al., 2007; TRZESNIAK et al.,

2011). Adicionalmente, há evidência de déficits comportamentais, cognitivos, sociais

e neuromotores em crianças que posteriormente desenvolvem esquizofrenia

(DEMJAHA; MACCABE; MURRAY, 2012; ARANGO; FRAGUAS; PARELLADA,

2013; SEIDMAN et al., 2013). Ressalta-se ainda a ausência de gliose ou perda

neuronal em cérebros de indivíduos com esquizofrenia, haja vista que essas

alterações são consideradas como características chaves de doenças

neurodegenerativas clássicas (PANTELIS et al., 2005). Ademais, estudos com

indivíduos de muito alto risco de desenvolvimento de esquizofrenia e em primeiro

episódio psicótico também indicam a presença de anormalidades cerebrais que

precedem o surgimento da psicose, com alterações principalmente em regiões

frontais e temporais (PANTELIS et al., 2007; FORNITO et al., 2008; WITTHAUS et

al., 2009; TAKAHASHI et al., 2010; GOGTAY et al., 2011; ALLEN et al., 2012;

BOHNER et al., 2012; JUNG et al., 2012).

Ao mesmo tempo em que surgiram amplas evidências de anomalias

neuroanatômicas que precedem o quadro psicótico, diversos estudos com pacientes

em primeiro episódio psicótico demonstraram que essas alterações não são

estáticas, ocorrendo progressão de anormalidades cerebrais após o início da

esquizofrenia. Dessa forma, estudos de neuroimagem que compararam indivíduos

em primeiro episódio psicótico com pacientes crônicos e estudos longitudinais de

primeiro episódio psicótico dão suporte à noção de que há perda progressiva de

volume de substância cinzenta após o início da psicose (PANTELIS et al., 2005;

VAN HAREN, CAHN; et al., 2008; VAN HAREN, HULSHOFF POL; et al., 2008;

MANE et al., 2009; ANDREASEN et al., 2011; VITA et al., 2012). Em 1991, DeLisi et

al. (1991) já indicavam redução do volume cerebral e alargamento ventricular após o

quadro inicial de psicose. Posteriormente, surgiram evidências de redução tanto de

lobo frontal (GUR et al., 1998; HO et al., 2003) como de lobo temporal em pacientes

em primeiro episódio psicótico (KASAI et al., 2003), que já ocorriam em seguimento

longitudinal de um ano e meio. Em um artigo de revisão, Delisi et al. (2006) avaliou

estudos longitudinais com pacientes crônicos e em primeiro episódio psicótico,

Introdução | 22

observando que, embora haja progressão em pacientes crônicos, isso acontece de

forma muito mais lenta do que observado em pacientes em primeiro episódio

psicótico. Destarte, esses achados corroboraram a concepção de que a perda de

volume cerebral é mais pronunciada nos estágios iniciais da esquizofrenia do que

em seu curso tardio, em consonância com a existência prévia de estudos que

indicavam que a deterioração clínica é mais acentuada nos estágios iniciais da

esquizofrenia (LIEBERMAN, 1999). Hulshoff et al. (2008) publicou uma revisão que

indicava maior redução de volume de substância cinzenta em lobos frontais e

temporais no curso inicial da esquizofrenia. Adicionalmente, Whitford et al. (2006)

também observaram perda de volume de substância cinzenta globalmente após um

seguimento longitudinal de 2 anos, incluindo os lobos frontal, temporal, parietal e

occipital. Vale destacar que Vita et al. (2012) publicaram uma metanálise de estudos

longitudinais com pacientes em primeiro episódio psicótico, indicando a ocorrência

de redução progressiva de substância cinzenta cortical, particularmente em lobos

frontal e temporal, mais acentuada nos estágios iniciais da doença.

Em resumo, estudos de neuroimagem estrutural indicam a existência de

múltiplas alterações focais de regiões cerebrais. Apesar de que muitas

anormalidades sejam anteriores ao início da psicose, estudos longitudinais sugerem

perda progressiva que ocorre particularmente no curso inicial da esquizofrenia, o

qual pode ser um período crítico para o desenvolvimento de tratamentos que

impeçam a progressão da doença.

1.4 Inflamação e esquizofrenia

Ao longo dos últimos anos houve um retorno à hipótese de que fatores

imunológicos estejam associados à esquizofrenia, ao mesmo tempo em que estudos

neurocientíficos indicam um importante papel do sistema imunológico no

neurodesenvolvimento, desde a plasticidade cerebral até a regulação de

neurotransmissores (MONDELLI; HOWES, 2014). Evidências crescentes indicam a

existência de uma desregulação do sistema imunológico na esquizofrenia,

destacando-se que diversos estudos mostram uma associação entre diferentes

anormalidades inflamatórias com a psicose (MULLER; SCHWARZ, 2006; MULLER,

2008; POTVIN et al., 2008; BENROS et al., 2011; KUNZ et al., 2011; MULLER;

MYINT; SCHWARZ, 2012; FINEBERG; ELLMAN, 2013; KELLER et al., 2013;

Introdução | 23

KIRKPATRICK; MILLER, 2013; SONG et al., 2013; TOURJMAN et al., 2013;

BERGINK; GIBNEY; DREXHAGE, 2014; FRODL; AMICO, 2014; GIRGIS; KUMAR;

BROWN, 2014).

As primeiras observações do envolvimento do sistema imunológico na

esquizofrenia incluíam relatos de associação entre infecção e quadro de psicose,

apontando um aumento do risco de desenvolvimento de psicose após internações

hospitalares para tratamento de quadros infecciosos (YOLKEN; TORREY, 2008).

Esses achados podem ser explicados por um efeito direto de agentes infecciosos

(e.g., vírus da imunodeficiência adquirida – HIV) e através de fatores neurotóxicos

associados a citocinas pró-inflamatórias (BERGINK; GIBNEY; DREXHAGE, 2014).

Adicionalmente, diversas doenças autoimunes cursam com maior incidência de

quadros psicóticos, incluindo lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla e

síndrome de Guillain-Barré (YOLKEN; TORREY, 2008; BERGINK; GIBNEY;

DREXHAGE, 2014). Um interessante e recente estudo coorte nacional realizado na

Dinamarca (BENROS et al., 2011) mostrou uma significativa relação dose-resposta

entre doença autoimune, número de infecções graves e risco de esquizofrenia. Esse

estudo indicou um efeito sinérgico entre doenças autoimunes e infecções graves,

apontando maior risco de desenvolvimento de psicose quando a infecção ocorria

temporalmente mais próxima ao início da esquizofrenia.

Ressalta-se que estudos epidemiológicos também indicam que infecções no

período pré-natal estão associadas a maior risco relativo de esquizofrenia, incluindo

estudos coortes prospectivos desde o nascimento (BROWN; DERKITS, 2010;

BROWN, 2012). Essa associação foi encontrada com diferentes agentes infecciosos,

abarcando os vírus influenza, Toxoplasma gondii e Herpes simplex tipo 2 (BUKA et

al., 2001; BABULAS et al., 2006; BROWN, 2006; AMMINGER et al., 2007;

MORTENSEN et al., 2007; BUKA et al., 2008; NIEBUHR et al., 2008; BROWN;

DERKITS, 2010; PEDERSEN et al., 2011; BROWN, 2012).

Para a explicação desses achados, o modelo mais parcimonioso sugere que

esse processo seja mediado pela ativação da micróglia e pela liberação de citocinas

pró-inflamatórias (KIRKPATRICK; MILLER, 2013; MONDELLI; HOWES, 2014). As

células da micróglia são macrófagos que residem no cérebro, com diferentes

funções: mediação de respostas imunes, neurodesenvolvimento e funcionamento

sináptico (KETTENMANN et al., 2011). A ativação da micróglia leva à produção de

citocinas pró-inflamatórias e radicais livres. Em relação ao neurodesenvolvimento, a

Introdução | 24

micróglia produz fatores neurotróficos que regulam a formação de sinapses e o

processo de poda neuronal (MONJI et al., 2013). As citocinas são proteínas que

atuam como mediadores da resposta inflamatória a infecção e a insultos não-

infecciosos, contribuindo para o desenvolvimento e funcionamento normal do

sistema nervoso cerebral (BROWN; DERKITS, 2010). Citocinas pró-inflamatórias,

como a interleucina-6 (IL-6) e o fator de necrose tumoral α (TNF-α) exercem papéis

centrais no processo de citotoxicidade e estão implicados na fisiopatologia da

esquizofrenia (BERGINK; GIBNEY; DREXHAGE, 2014). As citocinas também estão

associadas ao estresse oxidativo e à ativação do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal

(CHEN; HUANG; LIN, 1998). Destaca-se que as citocinas produzidas pela mãe

podem cruzar a placenta e a barreira hematoencefálica (BANKS; KASTIN;

GUTIERREZ, 1994; LI et al., 1995).

Diversos estudos indicam um aumento do nível sanguíneo de citocinas em

pacientes com esquizofrenia. Uma recente metanálise (MILLER et al., 2011) mostrou

níveis plasmáticos aumentados de IL-6 em pacientes em primeiro episódio psicótico,

com redução significativa após remissão do episódio psicótico. O mesmo estudo

relatou aumento significativo dos níveis plasmáticos de TNF-α tanto em indivíduos

em primeiro episódio psicótico como na fase de remissão da doença. Esses achados

são corroborados por um recente estudo de Song X et al. (2013), que indicou altos

níveis de interleucina (IL) 1β, IL6 e TNF-α em pacientes com esquizofrenia em

primeiro episódio e virgens de tratamento, em comparação a indivíduos saudáveis

pareados para idade, gênero, tabagismo e índice de massa corporal. Outros

recentes trabalhos de revisão e de metanálise também apontaram maiores níveis

sanguíneos de IL1β, IL6 e TNF-α em primeiro episódio de psicose (MILLER et al.,

2011; DI NICOLA et al., 2013; MONDELLI; HOWES, 2014).

Outro interessante ponto é que a ativação da micróglia pode ser visualizada in

vivo através de exames de PET com o radioisótopo PK11195. Recentemente, dois

estudos encontraram maior ligação desse ligante nos cérebros de pacientes com

esquizofrenia de início recente, sugerindo que as células da micróglia também estão

mais ativadas nesses pacientes (VAN BERCKEL et al., 2008; DOORDUIN et al.,

2009).

Estudos que avaliaram os efeitos de medicações com efeitos anti-

inflamatórios também dão suporte à ideia de um componente imunológico na

esquizofrenia. Estudos com tratamento adjuvante com inibidores da ciclooxigenase-2

Introdução | 25

(COX-2) e com aspirina observaram redução de sintomas nas escalas PANSS e CGI

(MULLER et al., 2002; RAPAPORT et al., 2005; AKHONDZADEH et al., 2007; LAAN

et al., 2010; MULLER et al., 2010). Dessa forma, o uso de medicações que possuem

efeitos moduladores do sistema imunológico pode ser uma importante estratégia de

potenciação do tratamento antipsicótico.

1.5 Efeitos neuroprotetores da minociclina

A minociclina é uma tetraciclina semissintética introduzida em 1967, com

eficácia contra bactérias gram-positivas e gram-negativas (ARONSON, 1980). Além

de seu efeito antibiótico, estudos laboratoriais e clínicos evidenciam uma ampla

propriedade anti-inflamatória desse fármaco (ARONSON, 1980; KIM; SUH, 2009),

principalmente através da modulação da atividade microglial e da subsequente

liberação de citocinas pró-inflamatórias, tais como IL1β, IL6 e TNF-α (HE; APPEL;

LE, 2001; DOMMERGUES et al., 2003; SAPADIN; FLEISCHMAJER, 2006). Devido

a seus efeitos anti-inflamatórios, também é utilizada para o tratamento de artrite

reumatoide, sarcoidose cutânea, acne comum, dermatite perioral e asma de difícil

controle (DOMERCQ; MATUTE, 2004; KIM; SUH, 2009). Também vale destacar que

a minociclina possui efeitos antiapoptóticos, com evidência de redução de morte de

células neuronais em diversos modelos experimentais de neurodegeneração

(DOMERCQ; MATUTE, 2004; KIM; SUH, 2009). Adicionalmente, esse fármaco

interfere em vias de sinalização neuronal envolvidas na excitoxicidade

glutamatérgica, através da inibição da proteína quinase ativada por mitógeno

(MAPK) p38 e da manutenção da ativação da proteína quinase fosfotidilinositol-3 (PI-

3)/Akt, os quais são apontados como os dois mecanismos centrais da ação da

minociclina contra o efeito neurotóxico do glutamato (PI et al., 2004). A minociclina é

constituída por uma molécula altamente lipofílica, atravessando facilmente a barreira

hematoencefálica (DOMERCQ; MATUTE, 2004; KIM; SUH, 2009). Vale destacar

que dados científicos translacionais apontam que esse agente possui efeitos

neuroprotetores em diversos modelos animais e em humanos com doenças

neurodegenerativas, incluindo isquemia cerebral, lesão cerebral traumática, doença

de Alzheimer e doença de Huntington (DOMERCQ; MATUTE, 2004; KIM; SUH,

2009). Apesar de o mecanismo preciso de sua ação neuroproterora ser

desconhecido, essa ação tem sido geralmente conferida a seus efeitos anti-

Introdução | 26

inflamatórios, antiapoptóticos e ao envolvimento em cascatas de sinalização. Um

resumo dos principais mecanismos de neuroproteção da minociclina é apresentado

na tabela 5.

Tabela 5 – Mecanismos de neuroproteção da minociclina 1) Ação anti-inflamatória Modulação da micróglia Reduz a proliferação e a ativação das células microgliais, subsequentemente diminuindo a liberação de citocinas, MMPs e mediadores inflamatórios lipídicos

Alteração da ativação de células imunológicas Inibição da transmigração de linfócitos T

2) Ação anti-apoptótica Ações antiapoptóticas dependentes da caspase

Inibição da liberação de citocromo c Inibição da expressão da caspases-1 e -3.

Ações antiapoptóticas independentes da caspase Aumento da expressão de proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 Inibição da liberação de AIF pela mitocôndria

3) Envolvimento em cascatas de sinalização Inibição da ativação de MAPK p38 Manutenção da ativação da via de sinalização PI3-k/AkT

MMPs=metaloproteinases de matriz; AIF=fator indutor de apoptose; MAPK=proteínas quinases ativadas por mitógeno; PI3-k= proteína quinase fosfatidilinositol-3

Crescentes evidências indicam que a minociclina é um tratamento em

potencial da esquizofrenia. Em três estudos com modelos animais de psicose, o

tratamento com minociclina preveniu e reverteu os efeitos comportamentais da

administração de antagonistas NMDA (LEVKOVITZ et al., 2007; ZHANG et al., 2007;

FUJITA et al., 2008). Subsequentemente, um relato de caso e um estudo aberto com

a adição de minociclina ao tratamento antipsicótico habitual de pacientes com

esquizofrenia mostrou melhora significativa em sintomas positivos, negativos e

cognitivos (MIYAOKA et al., 2007; 2008). A adição de minociclina à clozapina

também foi efetiva no tratamento de sintomas positivos e negativos de dois

pacientes super-refratários (KELLY et al., 2011). Adicionalmente, um estudo

randomizado, duplo-cego e controlado por placebo, de tratamento adjuvante com

minociclina demonstrou melhora de sintomas negativos e cognitivos em pacientes

com esquizofrenia de início recente (LEVKOVITZ et al., 2010). Recentemente, outro

ensaio clínico randomizado, duplo-cego e controlado por placebo observou melhora

Introdução | 27

principalmente em sintomas negativos de indivíduos com esquizofrenia de início

recente (CHAUDHRY et al., 2012).

1.6 Hipótese do estudo

Os efeitos da minociclina no sistema nervoso central ainda não são

conhecidos e não foram sistematicamente investigados através de técnicas de

neuroimagem. A hipótese deste estudo é que a adição de minociclina ao tratamento

antipsicótico pode melhorar diversos domínios psicopatológicos da esquizofrenia,

assim como prevenir alterações cerebrais que geralmente ocorrem no curso inicial

da esquizofrenia.

Objetivos do Estudo | 28

2 OBJETIVOS DO ESTUDO

O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do tratamento adjuvante com

minociclina na sintomatologia e na morfologia cerebral de pacientes com

esquizofrenia de início recente, através de exames de RM após um ensaio clínico

randomizado, duplo-cego e controlado por placebo.

Material e Métodos | 29

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Contexto geral do estudo

Este estudo está vinculado ao projeto de pesquisa “Estudo piloto duplo-cego

randomizado da adição de minociclina ou placebo ao tratamento usual de

esquizofrenia de início recente”, que foi realizado com um maior número de

pacientes. Dessa forma, a descrição da metodologia também estará associada a do

projeto supracitado.

3.2 Sujeitos

O presente trabalho incluiu 24 pacientes diagnosticados como portadores de

esquizofrenia pelos critérios diagnósticos do Manual Diagnóstico e Estatístico da

Associação Psiquiátrica Americana – 4a edição (Diagnostic and Statistical Manual –

DSM IV). Estes foram selecionados durante o seguimento no Serviço de Psiquiatria

do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, considerando-

se aqueles que tivessem até cinco anos de doença e que estivessem em tratamento

com dose estável de medicação por pelo menos quatro semanas antes da primeira

avaliação do estudo.

3.2.1 Critérios de Inclusão

Somente foram aceitos para este estudo os pacientes que completaram sua

participação no “Estudo piloto duplo-cego randomizado da adição de minociclina ou

placebo ao tratamento usual de esquizofrenia de início recente”, que utilizou os

seguintes critérios para inclusão e exclusão:

• Idade de 18 a 65 anos.

• Diagnóstico pelo DSM-IV de esquizofrenia

• Início recente (dentro dos primeiros 5 anos de diagnóstico)

• Em tratamento com dose estável de medicação por pelo menos 4 semanas

antes da primeira avaliação do estudo


• Usuário de medicações orais e concordando completar as avaliações

necessárias solicitadas.

• Participantes do sexo feminino, em idade fértil, deveriam estar em uso de

método anticoncepcional adequado durante o período do estudo e aceitar a

realização de um teste de gravidez pré-tratamento e a intervalos de 10

semanas enquanto tomassem a medicação do estudo. Contracepção

adequada é definida como o uso de um sistema de barreira dupla

contraceptiva (e.g., preservativo e espermicida) ou implante contraceptivo,

contraceptivo oral ou contraceptivo injetável de depósito mais outra forma de

contracepção (e.g., preservativo). As participantes do sexo feminino foram

consideradas incapazes de engravidar se estivessem há 1 ano na

menopausa ou se tivessem sido cirurgicamente esterilizadas de maneira

irreversível.

3.2.2 Critérios de Exclusão

• Condição médica relevante (doenças graves renais, hepáticas, cardíacas,

dermatológicas tais como dermatite esfoliativa e lupus eritematoso sistêmico)

segundo opinião dos investigadores. Condição médica relevante foi

determinada, em primeira instância, perguntando à equipe de saúde mental

do paciente se este apresentava algum problema médico. Após

consentimento obtido, o médico pesquisador tinha acesso ao prontuário do

paciente, avaliando então a elegibilidade deste para participar do experimento

clínico através do exame cuidadoso de sua história médica, assim como

resultados dos exames de sangue mais recentes, eletrocardiogramas e

quaisquer testes físicos que tivessem sido realizados.

• História prévia de intolerância a qualquer uma das tetraciclinas.

• Terapia concomitante com penicilina.

• Terapia anticoagulante concomitante

• Presença de desordem convulsiva, não incluindo crises induzidas por

clozapina.

• Qualquer mudança nas medicações psicotrópicas nas últimas quatro

semanas.


• Diagnóstico de abuso de substância (exceto nicotina e cafeína) ou

dependência dentro dos últimos três meses de acordo com os critérios do

DSM-IV.

• Gravidez ou amamentação.

3.3 Instrumentos de avaliação 3.3.1 Escalas de avaliação clínica

• Escala de Avaliação das Síndromes Positiva e Negativa para Esquizofrenia

(Positive and Negative Syndrome Scale – PANSS) (KAY; FISZBEIN; OPLER,

1987), traduzida e adaptada para o português por Vessoni (1993); A PANSS

possui 30 itens divididos em três subescalas, a saber: subescala positiva (7

itens), subescala negativa (7 itens) e subescala de psicopatologia geral (16

itens). Cada item possui um grau de gravidade colocado de forma progressiva

com valores de 1 a 7, sendo 1 a ausência do sintoma e 7 a presença de

forma extremamente grave. A pontuação total mínima da PANSS é 30 e a

pontuação máxima é 210;

• Escala de Impressão Clínica Global (CGI) (GUY, 1976). Esta escala

compreende 7 itens em ordem crescente de gravidade clínica, pontuados de

forma ordinal de 1 a 7, sendo 1 a ausência de sintomas e 7 a presença de

sintomatologia extremamente grave;

• Escala de efeitos colaterais para drogas psicoterapêuticas UKU (UKU Side

Effect Rating Scale for psychotherapeutic drugs) (LINGJAERDE et al., 1987);

• Escala de Movimentos Involuntários Anormais (Abnormal Involuntary

Movement Scale – AIMS) (GUY, 1976) para avaliação de efeitos colaterais

motores e discinesia tardia; esta escala tem pontuação entre 0 e 4 conforme

gravidade das alterações motoras em sete tipos de movimentos. Avalia-se se

a AIMS é positiva ou negativa em vez de gravidade (ou pontuação total), de

forma que um exame positivo para AIMS ocorre quando se pontua 2 em dois

ou mais movimentos ou se foi pontuado 3 ou 4 em um único movimento.


3.4 Drogas

A minociclina é um antibiótico amplamente utilizado, usualmente administrado

em doses de 100 mg duas vezes ao dia, sendo muito bem tolerada (DENOVAN-

WRIGHT et al., 2002). Trata-se de uma tetraciclina de segunda geração, com

comprovada segurança, inclusive em doses altas em humanos. É rotineiramente

utilizada no tratamento da acne comum e da artrite reumatoide, demonstrando que,

além de antibiótico, atua como anti-inflamatório não esteroide. A minociclina é

rapidamente e quase completamente absorvida pelo trato gastrointestinal após a

ingestão oral e é excretada principalmente na bile, possuindo meia-vida sérica media

de 16 horas. A minociclina não possui interação medicamentosa com antipsicóticos.

Diferente das tetraciclinas em geral, a minociclina cruza a barreira hemato-

encefálica. É um agente amplamente disponível no Brasil, sendo utilizada em doses

que variam de 50 mg duas vezes ao dia a 200 mg diários, divididos em doses de

100 mg duas vezes ao dia (British National Formulary - BNF). Os pacientes foram

informados quanto aos possíveis efeitos-colaterais, que embora pouco frequentes,

incluem náusea, vômitos, diarreia, disfagia, irritação esofágica, anorexia, zumbidos,

tontura, vertigem, reações de hipersensibilidade (rash, dermatite esfoliativa, urticária,

angioedema, anafilaxia, pericardite), cefaleia, distúrbios visuais, hepatoxicidade,

pancreatite, colite associada com antibióticos, discrasias sanguíneas, exacerbação

de lúpus eritematoso sistêmico e miastenia gravis, fotossensibilidade, descoloração

de pele ou conjuntiva. Também foi informado o possível efeito teratogênico em

grávidas, ressaltando a necessidade de contracepção adequada em mulheres e a

necessidade da realização de testes para gravidez antes e durante o estudo.

A minociclina foi iniciada em 100 mg diários e aumentada após 4 semanas para

200 mg/dia, dividindo-se a dose total em duas tomadas ao dia. O placebo tinha a

forma de um tablete de lactose, com aspecto organoléptico e embalagens idênticos

aos comprimidos de minociclina, com prescrição de duas tomadas ao dia. A

minociclina e o placebo foram fornecidos pela indústria farmacêutica “Stiefel

Laboratories Inc.”.


3.5 Procedimento

3.5.1 Recrutamento

Os psiquiatras responsáveis pelos pacientes de diferentes serviços de

psiquiatria do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto –

USP (Enfermarias de Psiquiatria, Ambulatório de Esquizofrenia de Difícil Controle,

Serviço de Emergência Psiquiátrica, Ambulatório de Reabilitação Psicossocial),

foram informados a respeito do estudo e, após aprovação dos setores de chefia dos

diferentes serviços, permitiram aos pesquisadores convidar seus pacientes a

participarem do estudo. As sessões de avaliação para recrutamento de pacientes

foram realizadas no Laboratório de Psicofarmacologia ou nas dependências do

Ambulatório de Reabilitação Psicossocial (AREP) do Hospital das Clínicas da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP.

Com a concordância do paciente, o médico pesquisador explicou a pesquisa

verbalmente e lhe deu um “Termo de Consentimento Livre e Esclarecido” (ANEXO

A). Após o paciente ter tido tempo para ler e entender a folha de informação e

aceitar participar, um encontro (primeira visita) era marcado entre o paciente, um

familiar responsável (ou responsável legal) e o médico pesquisador, com o objetivo

de obter o consentimento para a pesquisa e também consentimento para que a

equipe de pesquisa pudesse ter acesso ao prontuário médico do paciente. Conforme

determinação da resolução CNS 196/96, o paciente e seu responsável legal

assinaram o “Termo de Consentimento Livre e Esclarecido” para que o paciente

iniciasse sua participação na pesquisa.

3.5.2 Primeira avaliação

Após consentimento para participação no estudo, avaliaram-se os sintomas

clínicos, cognitivos, neurológicos e nível geral de funcionamento. Checou-se também

os critérios de inclusão/exclusão, confirmado o diagnóstico e foi realizado o teste de

gravidez, se apropriado. Após completar avaliação, o paciente foi randomizado para

um dos dois tratamentos, recebendo um único número de identificação antes de

começar o estudo. Foi dado ao paciente um cartão de informação do estudo,

explicando que ele estava participando de um estudo clínico e incluía as drogas que


ele poderia estar usando (minociclina ou placebo), assim como o número de telefone

da equipe de pesquisa, do consultório de triagem clínica e o nome do investigador

principal.

3.5.3 Randomização

Os pacientes foram randomizados para um dos 2 grupos do tratamento:

minociclina ou placebo. Os pacientes, a equipe de saúde mental, médicos e

enfermeiras pesquisadores e outros co-investigadores que realizaram as avaliações

clínicas (os avaliadores) não estavam avisados sobre qual droga que o paciente

avaliado estava em uso. Um médico, não envolvido com as avaliações, tinha

conhecimento da droga que o paciente utilizava e estava disponível para intervir no

caso do paciente desenvolver efeitos colaterais. A segurança e o bem-estar do

pacientes foram prioridades em todos os momentos.

3.5.4 Seguimento

A medicação selecionada foi administrada por 1 ano. Durante o período do

estudo, o paciente foi cuidado por médicos e psicólogos da equipe de pesquisa e

pela sua equipe de saúde mental. Se necessário, membros da equipe de pesquisa

estavam disponíveis 24 horas por dia, 7 dias por semana.

Devido à natureza do período de escalonamento da medicação, foi necessário

que uma nova prescrição da droga fosse realizada a cada duas semanas nas

primeiras quatro semanas. Após as primeiras quatro semanas, as drogas do estudo

foram renovadas mensalmente e entregues para o paciente pelo médico

pesquisador, assegurando contínuo contato com a equipe de pesquisa.

A aderência do paciente ao tratamento foi monitorada de duas maneiras.

Primeiro, os pacientes foram solicitados a retornar com as cartelas de medicação

para a próxima prescrição, ocasião em que era conferida a quantidade de

medicação utilizada. Segundo, os familiares foram envolvidos para ajudar a

monitorar a aderência, acompanhando os pacientes na avaliação.

Os pacientes foram incorporados para seguimento no Ambulatório de

Reabilitação Psicossocial (AREP) e continuaram em seguimento pela mesma equipe

de saúde mental após o término do estudo. A avaliação laboratorial, com


hemograma e testes de função hepática e renal, faz parte dos cuidados normais

desta população de pacientes, sendo usualmente realizada a intervalos de 6 meses.

Assim sendo, não foi necessária a realização de coleta de amostras sanguíneas

adicionais. Além disso, é da rotina do Serviço de Psiquiatria do Hospital das Clínicas

da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da USP, onde estes pacientes são

acompanhados, a realização periódica de exames de imagem cerebral, incluindo

ressonância magnética de encéfalo. Caso alguma preocupação ocorresse com

respeito à pesquisa, a equipe de pesquisa poderia ser contatada para a discussão

destas preocupações 24 horas por dia, todos os dias da semana. Os pacientes

tinham seu cartão do estudo com os números de telefone dos pesquisadores no

caso de terem dúvidas ou perguntas. Um dos co-investigadores e/ou médico do

estudo estava disponível 24 h, sete dias por semana e fazia contato com o paciente

ou familiar do paciente se necessário.

Pacientes do sexo feminino com capacidade reprodutiva fizeram teste de

gravidez a cada 10 semanas. Não ocorreu nenhuma gravidez durante o período de

estudo.

Os pacientes podiam ser retirados do estudo pelas seguintes razões: a seu

próprio pedido; a critério do investigador (ex., um evento adverso, baixa aderência);

ou se a paciente engravidasse.

As avaliações clínicas foram realizadas na entrada e a cada mês por

pesquisador cego quanto aos grupos experimentais, em entrevistas com duração

aproximada de 50 minutos. Se o paciente permitisse, as avaliações clínicas eram

realizadas tão perto quanto possível do tempo da última dose da medicação em

estudo.

A equipe de pesquisa manteve os pacientes continuamente informados do

progresso e de quaisquer problemas através do contato direto ou indireto com a

equipe clínica. Após 1 ano, a medicação foi retirada no prazo de duas semanas, o

que permitia que a minociclina pudesse ser diminuída gradualmente, seguindo as

instruções do BNF.

O fluxo de pacientes que participaram do estudo é mostrado na figura 4. Seis

pacientes não completaram o estudo devido a abandono. Observa-se que houve

mais pacientes que não completaram o estudo no grupo placebo (n=4) do que no

grupo minociclina (n=2).


3.5.5 Análise Estatística das Variáveis Clínicas e Demográficas

A análise estatística deste estudo foi feita utilizando-se o “Statistical Package

for the Social Sciences” (SPSS), versão 17.0.

Os escores totais da PANSS, bem como o de suas subescalas (POSITIVA,

NEGATIVA E GERAL) foram submetidos à análise de variância de medidas

repetidas (RANOVA) com os fatores tempo, droga e interação entre os dois fatores.

Nos casos em que as condições de esfericidade não foram alcançadas, os graus de

liberdade foram corrigidos pelo épsilon de Huynh-Feldt. Quando ocorreu uma

interação significativa entre os fatores tempo e grupo, os dados de cada grupo

individualmente (minociclina e placebo) foram submetidos a uma RANOVA,

analisando-se o fator tempo e o contraste simples da medida inicial com cada uma

das 14 avaliações posteriores.

Por ser uma escala ordinal, os escores da CGI foram analisados para cada

grupo independentemente (minociclina e placebo) pelo teste de Friedman, que é um

teste estatístico não paramétrico utilizado para detectar diferenças no tratamento ao

longo de medidas repetidas.

Pacientes incluídos no estudo (n=30)

Alocados para minociclina (n=16) Alocados para placebo (n=14)

Completaram o estudo (n=14) Completaram o estudo (n=10)

abandono (n=4)

abandono (n=2)

Pacientes triados para o estudo (n=236)

Excluídos (206):

Não tinham esquizofrenia (n= 145)

Mais que 5 anos de doença (n=42)

Comorbidade com abuso de substâncias(n=19)

Pacientes incluídos no estudo (n=30)

Alocados para minociclina (n=16) Alocados para placebo (n=14)

Completaram o estudo (n=14) Completaram o estudo (n=10)

abandono (n=4)

abandono (n=2)

Pacientes triados para o estudo (n=236)

Excluídos (206):

Não tinham esquizofrenia (n= 145)

Mais que 5 anos de doença (n=42)

Comorbidade com abuso de substâncias(n=19)

Figura 1 – Fluxograma dos pacientes incluídos no estudo.


Como as avaliações cognitivas só foram realizadas no início e no fim do

estudo, utilizou-se o teste t pareado para cada grupo independentemente.

As características clínicas e demográficas também foram comparadas através

de análise não-paramétrica para os dados categoriais (teste do X2) e paramétrica

para os dados nominais com distribuição normal (teste t para amostras

independentes).

Foram considerados significativos valores de p≤0,05.

3.6 Estudo dos volumes de substância cinzenta em áreas cerebrais por meio

de ressonância magnética

3.6.1 Aquisição de imagens de RM estrutural

Os pacientes realizaram o exame de RM de encéfalo após terem finalizado a

participação no estudo da adição de minociclina ou placebo ao tratamento

antipsicótico habitual. As imagens foram feitas por meio de um equipamento de

ressonância magnética da marca SIEMENS com campo magnético principal de 1.5

Tesla. Foram adquiridos cortes ao longo do cérebro inteiro, utilizando sempre o

mesmo protocolo padronizado, otimizado para permitir boa diferenciação do sinal

entre áreas de substância cinzenta e substância branca. O protocolo consistiu numa

sequência SPGR (TR = 9.7 ms, TE = 4 ms, Flip Angle = 12º, FOV = 35 mm2, Matriz

de 265 X 265) em cortes sagitais com resolução de 1 mm3 por voxel.

Como parte da equipe responsável pela aquisição das imagens, havia sempre

um psiquiatra envolvido no projeto, um radiologista e um técnico para o manuseio do

equipamento de ressonância magnética.

3.6.2 Processamento das imagens

A morfometria voxel-a-voxel (VBM – voxel based morphometry) foi feita com

o pacote SPM7 (Statistical Paremetric Mapping, desenvolvido pelo Wellcome

Department of Imaging Neuroscience, London, UK) rodando no software MATLAB

versão 7.0 (Mathworks, Natick, MA, USA). As imagens adquiridas originalmente no

formato DICOM foram transformadas para o formato ANALYZE, compatível com o

SPM2, utilizando para isso o software MRIcro (http://www.sph.sc.edu/comd/rorden/


mricro.html) e o processamento seguiu o protocolo otimizado para VBM descrito por

Good et al. (2001).

Inicialmente foi feita a demarcação da comissura anterior e a reorientação

para o padrão neurológico, que consistiu na única etapa manual do processamento.

A partir disso, assim como descrito em Good et al. (2001), foi criada uma template a

priori T1 específica para este estudo e templates específicas de substância cinzenta.

As imagens originais foram então normalizadas, com base na template T1 criada

anteriormente, utilizando transformações lineares e não lineares, sendo esta última

feita com funções de base 7 x 8 x 7 e 12 iterações. As imagens normalizadas foram

então segmentadas e, dos componentes resultantes, foi utilizada a substância

cinzenta e sua template específica, criada anteriormente, para obter parâmetros de

normalização que foram aplicados nas imagens originais. Estas imagens, agora

normalizadas de maneira otimizada, foram segmentadas e depois moduladas pelo

determinante Jacobiano extraído dos parâmetros de normalização obtidos

anteriormente, sendo então suavizadas por meio de um filtro gaussiano isotrópico de

12 mm (FWHM – full-width at half maximum isotropic Gaussian kernel).

Com o intuito de avaliar diferenças locais de substância cinzenta, a

comparação de volumes cerebrais entre os grupos foi feita por meio da função

“single subject: conditions and covariates”, utilizando-se o volume intercraniano total

(ICV) como variável confusional. Os resultados estatísticos em cada voxel foram

transformados em z-scores, com limiar de Z = 3.09 (correspondente a p < 0.001, não

corrigido para múltiplas comparações; monocaudal) e apenas agrupamentos com

mais de 25 voxels foram considerados, sendo visualmente apresentados em mapas

paramétricos estatísticos (SPM) tridimensionais. As coordenadas obtidas no espaço

estereotáxico MNI (Montrel Neurological Institute, Canada) foram convertidas para o

espaço Talairach (TALAIRACH; TOURNOUX, 1988), utilizando a transformação

sugerida on-line (NEUROVIA, University of Minnesota, Minneapolis VA Medical

Center, http://www.neurovia.umn.edu/cgi-bin/tal_atlas). Após a conversão, foi

utilizado o software Talairach Deamon (LANCASTER et al., 2000) para finalmente

obter-se a descrição da localização.


3.7 Padrões éticos e regulatórios

3.7.1 Comitê de Ética em Pesquisa Local

A aprovação ética foi obtida com processo HCRP 687/2005 (ANEXO B) e

registro CONEP 11726 (ANEXO C).

3.7.2 Declaração de Helsinque e Resolução 196/96

O estudo em questão foi realizado de acordo com a “Declaração de Helsinque”

(1974), revisada em Tóquio (1975), Veneza (1983), Hong Kong (1989), África do Sul

(1996) e Escócia (2000) e com a Resolução CNS 196/96.

Todos os membros do time de pesquisa seguiram a “International Conference

on Harmonisation / Good Clinical Practice” (ICHGCP) Guidelines (1996) que são

consistentes com os princípios de origem da Declaração de Helsinque e da

Resolução 196/96.

Resultados | 40

4 RESULTADOS

4.1 Características clínicas e demográficas

As características clínicas e demográficas dos pacientes são apresentadas na

tabela 6. Observa-se que estão pareados todos os parâmetros de confusão, tais

como idade, tempo de educação, tempo de doença, tempo de psicose sem

tratamento, gênero, subtipo diagnóstico e tipos de antipsicótico em uso.

Tabela 6 – Características demográficas e clínicas dos sujeitos Grupos Minociclina (n=16) Placebo (n=14) Estatística . Média DP Média DP t GL p Idade 24 5,02 25 6,37 0,45 28 0,65 Educação (em anos) 11 1,54 10,5 1,6 0,74 28 0,46 Tempo de doença (em meses) 31,8 21,98 29,1 17,9 0,36 28 0,72 Tempo de psicose sem tratamento (em meses) 8 5,17 8,8 6,82 0,36 28 0,72 Internações psiquiátricas prévias (mediana; amplitude interquartis) 1 1 1 1 0,67 28 0,5

N % N % X2 GL p Gênero 0,03 1 0,85

Masculino 13 81,3% 11 78,6% Feminino 3 18,8% 3 21,4%

Estado civil 0,23 1 0,63 Solteiros 14 87,5% 13 92,9% Casados 2 12,5% 1 7,1%

Nível sócio-econômico NA NA NA Baixo 7 43,8% 4 28,6% Médio-baixo 7 43,8% 7 50,0% Médio 2 12,5% 3 21,4%

Ocupação NA NA NA Desempregados 10 62,5% 8 57,1% Aposentados 2 12,5% 3 21,4% Estudantes 2 12,5% 0 0,0% Empregados 2 12,5% 3 21,4%

Etnia 2,85 3 0,41 Brancos 10 62,5% 5 35,7% Pardos 4 25,0% 5 35,7% Negros 2 12,5% 3 21,4% Asiáticos 0 1 7,1%

Diagnóstico pelo DSM-IV 1,74 2 0,42 Esquizofrenia paranóide 14 87,5% 10 71,4% Esquizofrenia desorganizada 2 12,5% 3 21,4% Esquizofrenia indiferenciada 0 0,0% 1 7,1%

Tratamento (medicações) 0,05 1 0,82 Antipsicótico típico 4 25,0% 3 21,4% Antipsicótico de 2ª geração 9 56,3% 9 64,3% Antipsicótico típico + 2ª geração 1 6,3% 0 0,0% clozapina 2 12,5% 2 14,3%

DP=desvio padrão; N=número de sujeitos; %=porcentagem; t=teste t para amostras independentes; X2=teste do qui-quadrado; GL= grau de liberdade; p=significância estatística; DSM-IV=Manual de Diagnóstico e Estatística, 4ª edição; NA=não se aplica.

Resultados | 41

Não houve efeitos colaterais significativos e nem diferença entre os dois

grupos, conforme análise de teste t para medidas independentes para a pontuação

da escala de efeitos colaterais UKU (t=0,899; g.l.=28; p=0,431). Somente um

paciente de cada grupo apresentava exame positivo para a Escala de Movimentos

Involuntários Anormais (AIMS) na avaliação inicial. Na avaliação final, somente um

paciente (grupo minociclina) permaneceu com exame positivo para a AIMS.

Houve a necessidade de modificação da prescrição (aumento da dose ou troca

do antipsicótico) devido à reagudização ou à piora de sintomas positivos em oito

pacientes, sendo que cinco pertenciam ao grupo placebo e três pertenciam ao grupo

minociclina.

4.2 Desfecho clínico

Em relação à pontuação na CGI, a realização do teste de Friedman

individualmente para os grupos placebo e minociclina evidenciou melhora

significativa no grupo minociclina (X2=57,871; g.l.=14; p<0,001), mas não no grupo

placebo (X2=8,293; g.l.=14; p=0,873), como observado no figura 2.

A análise de variância de medidas repetidas (RANOVA) da PANSS mostrou

efeito significativo na interação entre fator tempo e fator droga (F=3,241; g.l.=4,1-

91,0; p=0,015), sem efeito significativo do fator tempo (F=1,56; g.l.=4,1-91,0; p=0,19)

ou droga (F=3,3; g.l.=1-22; p=0,015). A RANOVA para cada grupo individualmente

evidenciou que os pacientes em uso de minociclina apresentaram redução

significativa dos escores ao longo do tempo, tanto na pontuação total da PANSS

(F=4,7; g.l.=4,1-52,8; p=0,002) como nas subescalas positiva (F=3,74; g.l.=3,5-45,7;

p=0,013), negativa (F=2,85; g.l.=4,3-56,3; p=0,029) e de psicopatologia geral

(F=4,65; g.l.=5,4-70,6; p=0,001). A análise de constraste mostrou diferença

significativa em relação à medida inicial a partir de 15 dias de uso de minociclina. No

grupo placebo, não houve diferença significativa ao longo do tempo, incluindo a

pontuação total da PANSS (F=0,9; g.l.=3,0-26,9; p=0,53) e das subescalas positiva

(F=0,95; g.l.=2,4-21,41; p=0,419), negativa (F=3,74; g.l.=7,2-64,58; p=0,555) e de

psicopatologia geral (F=1,06; g.l.=2,8-24,9; p=0,398). Esses resultados são

mostrados na figura 2.

Resultados | 42

7

9

11

13

15

17

19

21

23

0 0,5 1 1,5 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Me se s

PA

NS

S -

sint

omas

neg

ativ

os

P lacebo Minoc ic lina

*

161820

22242628

303234

0 0,5 1 1,5 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Me se sP

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SS

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al


*

789

1011121314151617

0 0,5 1 1,5 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Me se s

PA

NS

S -

sint

omas

pos

itivo

s

P lacebo Minocic lina

*1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 0,5 1 1,5 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Me se s

CG

IP lacebo Minoc ic lina

*

303540

45505560

657075

0 0,5 1 1,5 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Me ses

PA

NS

S -

pont

uaçã

o to

tal


*

Figura 2 – O gráfico mostra a pontuação nas escalas de impressão clínica global (CGI), assim como na escala PANSS e suas subescalas positiva, negativa e de psicopatologia geral. As avaliações foram realizadas ao longo de doze meses, sendo que os primeiros dois meses foram medidos quinzenalmente. Os ícones representam as médias e as barras de erro representam o erro padrão da média (EPM). O asterisco (*) representa diferença significativa com p ≤ 0,05.

4.3 Morfometria voxel-a-voxel de volumes cerebrais

A análise por VBM das imagens de RM indicou dois agrupamentos de menor

volume de substância cinzenta regional em pacientes tratados com placebo em

relação aos pacientes tratados com minociclina: giro pré-central esquerdo, referente

à área de Broadman (BA – Broadman area) 6 e porção médio-posterior do giro do

cíngulo esquerdo (BA 24) (Figura 2 e Tabela 2).

Resultados | 43

Figura 3 – Análise por meio de morfometria voxel-a-voxel (Voxel-based morphometry – VBM) de imagens de ressonância magnética. Em comparação ao grupo que fez uso de minocicilna, observa-se que os pacientes do grupo placebo apresentaram volumes de substância cinzenta regional significativamente menores em giro pré-central esquerdo (BA6) e em porção médio-posterior do giro do cíngulo esquerdo (BA24).

Tabela 7 – Diferenças de volumes de substância cinzenta regional entre os pacientes dos grupos minociclina e placebo

Região cerebral a Direção da diferença

Coordenadas TalairachbPico Z-score c Número de

voxels d X Y Z Porção médio-

posterior do cíngulo esquerdo

(BA24)

Menor no grupo placebo -13 -5 43 4.08 44

Giro pré-central esquerdo (BA26)

Menor no grupo placebo -32 -3 37 3.76 97

a Os números são referentes às áreas de Broadman (Broadman area - BA) b Coordenadas do voxel de significância estatística máxima dentro de cada região, de acordo com o atlas de Talairach and Tournoux (1988) c Z-score para o voxel de significância máxima dentro do agrupamento d Número total de voxels dentro do agrupamento

Discussão | 44

5 DISCUSSÃO

O presente estudo observou que a adição de minociclina ao tratamento

antipsicótico usual pode melhorar os sintomas positivos e negativos de pacientes

com esquizofrenia de início recente. Além disso, este é o primeiro estudo de

neuroimagem estrutural que avaliou a ação da minociclina no SNC, indicando que o

tratamento adjuvante com minociclina tem o potencial de prevenir algumas

alterações cerebrais observadas nos estágios iniciais da esquizofrenia.

A melhora de sintomas positivos e negativos, como observado neste estudo

através de redução da pontuação nas escalas PANSS e CGI, está de acordo com

outros ensaios clínicos recentes que avaliaram a eficácia do tratamento adjuvante

com minociclina na esquizofrenia (MIYAOKA et al., 2007; 2008; LEVKOVITZ et al.,

2010; CHAUDHRY et al., 2012). O presente estudo mostra dados clínicos

longitudinais ao longo de 12 meses, com melhora nas subescalas da PANSS

(positiva, negativa e de psicopatologia geral) e da CGI. Vale notar que essa melhora

foi mais pronunciada nas primeiras 6 semanas de tratamento, apesar de que houve

discreta redução de sintomas nos meses subsequentes. Miyaoka et al. (2007)

publicaram o primeiro relato de caso que indicou importante melhora de sintomas

positivos, negativos e cognitivos da esquizofrenia em dois pacientes com

esquizofrenia após tratamento adjuvante com minociclina 150 mg/d. Houve

recrudescência de sintomas após a suspensão dessa medicação, com posterior

melhora depois que foi reintroduzida. Os mesmos autores realizaram então um

estudo aberto com a adição de minociclina ao tratamento com antipsicóticos

atípicos, observando redução significativa nas três subescalas da PANSS (positiva,

negativa e de psicopatologia geral). Posteriormente, Levkovitz et al. (2010)

investigaram os efeitos da adição da minociclina em sintomas negativos e cognitivos

da esquizofrenia, através de um estudo duplo-cego, randomizado, controlado por

placebo, durante um período de seis meses. Os autores observaram melhora tanto

de sintomas negativos e cognitivos. Recentemente Kelly et al. (2011) avaliaram a

adição de minociclina em dois pacientes com esquizofrenia super-refratária,

observando melhora de sintomas, sobretudo de sintomas negativos. A limitação dos

antipsicóticos atuais sobre os sintomas negativos é um dado particularmente

relevante, levando à busca de tratamentos adjuvantes que possam ter eficácia em

outros domínios psicopatológicos além dos sintomas positivos.

Discussão | 45

Neste estudo, a análise por VBM das imagens de ressonância magnética indica

que o tratamento com minociclina pode ter protegido contra a redução de substância

cinzenta na região médio-posterior do cíngulo e do giro pré-central em pacientes

com esquizofrenia de início recente. Crescentes evidências sugerem que

anormalidades da estrutura cerebral já estão presentes no primeiro episódio

psicótico ou até mesmo antes do início da psicose, com perda progressiva de

substância cinzenta após o início da doença, particularmente nos estágios iniciais da

esquizofrenia (CAHN et al., 2002; BACHMANN et al., 2004; ZHOU et al., 2005;

WHITFORD et al., 2006; BRANS et al., 2008; VAN HAREN, HULSHOFF POL; et al.,

2008). Em consonância com esses achados, Asami et al. (2012) avaliaram pacientes

com esquizofrenia em primeiro episódio e observaram, após um ano e meio,

redução de volume de substancia cinzenta em giro temporal superior, assim como

em regiões frontal, parietal e límbica, incluindo o giro do cíngulo. Adicionalmente,

Mitelman et al. (2005) investigaram o volume do córtex cingulado por meio de

análise por região de interesse (ROI – region of interest) e encontraram redução

significativa de substância cinzenta em todo o giro do cíngulo, particularmente em

BA 24 (a mesma área observada no presente estudo). Ademais, Koo et al. (2008)

também avaliaram longitudinalmente, através de exames de RM e análise por ROI,

pacientes com esquizofrenia em primeiro episódio. Foi observada uma redução

significativa de substancia cinzenta de todas as sub-regiôes do cíngulo após um ano

e meio de seguimento. Wang et al. (2007) também observaram redução significativa

de volume e espessura de substância cinzenta em todo o giro do cíngulo de

pacientes com esquizofrenia em comparação a controles pareados. Dessa forma,

esses resultados indicam um papel relevante do giro do cíngulo na fisiopatologia da

esquizofrenia, sugerindo que a perda de substância cinzenta dessa região cerebral

está envolvida no curso da esquizofrenia. Adicionalmente, Zhou et al. (2005)

realizaram a análise volumétrica do giro pré-central, giro do cíngulo e região pré-

frontal de 59 pacientes com esquizofrenia, comparando-os com controles saudáveis.

Foi observado que os pacientes portadores de esquizofrenia apresentaram uma

redução significativa de volume de substância cinzenta em todas as áreas

segmentadas. Vale destacar que o giro pré-central está implicado no processamento

de tarefas cognitivas motoras e possivelmente está envolvido na fisiopatologia da

esquizofrenia (GEORGOPOULOS, 2000). Em conformidade, um estudo post-

mortem prévio indicou que há redução da densidade neuronal dessa região cerebral

Discussão | 46

em pacientes com esquizofrenia (BENES; DAVIDSON; BIRD, 1986).

Adicionalmente, outros estudos sugerem que anormalidades da área motora

cerebral podem estar associadas à psicopatologia da esquizofrenia (ANDREASEN;

PARADISO; O'LEARY, 1998; KIRCHER et al., 2001; WALTHER; STRIK, 2012). No

estudo aqui relatado, observou-se que os pacientes do grupo placebo apresentaram

volumes de substância cinzenta significativamente menores em giro do cíngulo e em

giro pré-central, em comparação ao grupo minociclina. Esse resultado, somado a

dados da literatura científica, permite sugerir que essas duas áreas cerebrais são

possíveis substratos neurais dos efeitos da minociclina no tratamento da

esquizofrenia.

Os mecanismos precisos de ação da minociclina no SNC ainda são

desconhecidos. Todavia, há diversos aspectos que podem ser abordados,

fornecendo hipóteses racionais para a compreensão de como a minociclina pode

melhorar os sintomas e modular a estrutura e função cerebrais na esquizofrenia.

Vale ressaltar que a minociclina não exerce efeitos diretos significativos sobre

diferentes neuroreceptores, incluindo receptores monoaminérgicos e receptores

NMDA (CHAVES et al., 2009). Todavia, a minociclina pode regular vários processos

associados à plasticidade neural. Essa substância age sobre a cascata de

sinalização dos receptores NMDA, exibindo efeitos opostos sobre a ativação da p38

MAPK e sobre a supressão de PO3/Akt quinase, que são vias de sinalização

subjacentes aos efeitos neurotóxicos do glutamato (PI et al., 2004). Esses efeitos

estão alinhados com a hipótese de hipofunção dos receptors NMDA na

esquizofrenia, já que essa hipofunção pode estar relacionada a uma liberação

excessiva de glutamato em receptores não-NMDA, levando a uma deterioração

clínica e neurodegeneração na esquizofrenia (MOGHADDAM, 2003; DEAKIN et al.,

2008). Adicionalmente, Moghaddam et al. (2003) sugeriram que a disfunção do

receptor NMDA na esquizofrenia é possivelmente devido a alterações nas cascatas

de sinalização associadas aos receptores NMDA, em vez de alterações

macroscópicas nos níveis de receptor NMDA.

Outro ponto relevante é que a minociclina tem amplos efeitos anti-inflamatórios,

reduz a ativação da micróglia e pode inibir uma ampla gama de citocinas

(DOMERCQ; MATUTE, 2004; KIM; SUH, 2009). Esses efeitos podem corroborar a

ação da minociclina no SNC, uma vez que evidências crescentes indicam que um

processo de neuroinflamação pode influenciar o neurodesenvolvimento e a

Discussão | 47

plasticidade neural, exercendo um papel importante tanto no desenvolvimento como

na progressão da esquizofrenia (DEBNATH; CANNON; VENKATASUBRAMANIAN,

2012). Além disso, há diversas evidências de que pacientes em primeiro episódio

psicótico apresentam maiores níveis de citocinas (MILLER et al., 2011;

KIRKPATRICK; MILLER, 2013), mesmo em pacientes virgens de tratamento

antipsicótico (SONG et al., 2013). Também vale mencionar que um estudo com RM

observou uma associação entre maior expressão do gene da IL6 em leucócitos do

sangue com redução de volume de substancia cinzenta do hipocampo esquerdo em

pacientes com esquizofrenia (MONDELLI; HOWES, 2014). Também há evidências

que sugerem interações entre citocinas e a função dopaminérgica (GIRGIS; KUMAR;

BROWN, 2014). A administração de IL6 em ratos levou à ativação comportamental e

ao aumento locomotor, que são alterações semelhantes ao observado em modelos

animais de psicose através da administração de agonistas dopaminérgicos

(ZALCMAN et al., 1998). Outro estudo também indicou que a administração repetida

de IL6 em ratos produziu uma sensibilização aos efeitos de aumento locomotor

induzido por anfetaminas (ZALCMAN; SAVINA; WISE, 1999), reforçando a hipótese

de que haja uma interação entre IL6 e o sistema dopaminérgico. Destaca-se ainda

que o pré-tratamento com minociclina em camundongos diminuiu significativamente

o aumento extracelular de dopamina no estriado após administração repetida de

metanfetaminas (ZHANG et al., 2006). O pré-tratamento com minociclina também

reduziu significativamente o aumento de dopamina tanto em estriado como no córtex

frontal de camundongos que receberam dizolcipina, que é um antagonista NMDA

(ZHANG et al., 2007). O processo de neuroinflamação também pode modular a

função glutamatérgica através da via quinurênica (que é ativada por citocinas) do

metabolismo do triptofano, já que níveis elevados de ácido quinurênico podem inibir

os receptores NMDA (CHAVES et al., 2010; ANDERSON; MAES, 2012; NA; JUNG;

KIM, 2012).

Ressalta-se que uma das principais descobertas recentes da pesquisa genética

na esquizofrenia indica que genes relacionados à imunidade do Complexo Principal

de Histocompatibilidade (MHC - Major Histocompatibility Complex) estão associados

com a esquizofrenia (SHI et al., 2009; STEFANSSON et al., 2009; LI et al., 2010;

BERGEN et al., 2012; DEBNATH; CANNON; VENKATASUBRAMANIAN, 2012;

IRISH SCHIZOPHRENIA GENOMICS; THE WELLCOME TRUST CASE CONTROL,

2012; JIA et al., 2012). Outro interessante estudo observou correlações significativas

Discussão | 48

entre variantes genéticas na região do MHC e tamanho do ventrículo cerebral na

esquizofrenia (AGARTZ et al., 2011). Adicionalmente, Fillman et al. (2012)

observaram um aumento de marcadores inflamatórios (incluindo diferentes citocinas

e expressão do RNA inflamatório) no córtex pré-frontal dorsolateral de pacientes

com esquizofrenia. Também vale destacar que a neuroinflamação pode influenciar a

neurogênese e a plasticidade neural (NA; JUNG; KIM, 2012). Por conseguinte, Das

et al. (2011) observaram que a minociclina pode inibir a neuroinflamação e restaurar

a neurogênese em um modelo murino de encefalite japonesa, enquanto Rueger et

al. (2012) sugeriram um efeito positivo da minociclina sobre a neurogênese

independentemente de neuroinflamação.

A potente inibição da ativação da micróglia pela minociclina também pode

desempenhar um papel fundamental nos efeitos deste agente na esquizofrenia.

Destaca-se que a ativação da micróglia pode ser quantitivamente avaliada in vivo

por meio de imagens de PET que utilizam o radioisótopo (R)-[11C]PK11195. Um

estudo recente de van Berckel et al. (2008) avaliou, através dessa metodologia, a

ativação da micróglia na esquizofrenia de início recente (dentro de 5 anos do início

da doença) e em sujeitos saudáveis pareados para a idade. Foi observado um

aumento de atividade da micróglia em pacientes com esquizofrenia de início recente,

sugerindo que pode ocorrer lesão neuronal nesse período da doença e que danos

neuronais possivelmente estão envolvidos no processo de redução do volume de

substância cinzenta na fase inicial da esquizofrenia. Esse achado foi replicado por

Doorduin et al. (2009), indicando que a ativação de micróglia é um alvo potencial

para a prevenção da redução da substância cinzenta na esquizofrenia. Por

conseguinte, a potente inibição da ativação da micróglia pela minociclina pode estar

subjacente ao efeito protetor desse agente contra a redução de volume de

substância cinzenta na esquizofrenia de início recente. Essa observação é

reforçada por um estudo quantitativo de neuroimagem com (R)-[11C]PK11195 PET,

que avaliou os efeitos da minociclina sobre a ativação microglial no cérebro de ratos

tratados com zimosano (CONVERSE et al., 2011). Essa substância é um

polissacarídeo utilizado para a indução experimental de inflamação, sendo injetada

no cérebro de ratos para a indução de inflamação e de ativação da micróglia. Nesse

estudo, foi observado que o tratamento com minociclina reduziu em 46% a ativação

microglial induzida pelo zimosano.

Discussão | 49

Algumas limitações dos resultados aqui relatados merecem ser abordadas. Em

primeiro lugar, a dose ideal de minociclina para neuroproteção em humanos ainda é

desconhecida e delineamentos experimentais com diferentes dosagens devem ser

avaliados em grupos de tamanho amostral maior (CHAVES et al., 2009). Outro ponto

relevante é que os exames de RM foram realizados somente após o ensaio clínico,

sendo que o delineamento ideal incluiria os exames antes e após a intervenção. Por

outro lado, o emparelhamento cuidadoso entre os dois grupos fortalece os

resultados observados nesse estudo, pois não havia diferenças entre variáveis

confusionais que podem influenciar o volume do cérebro, tais como idade, sexo,

tempo de doença e duração da psicose não tratada. Algumas limitações intrínsecas

do método VBM para análise de dados de ressonância magnética também devem

ser considerados, que inclui a influência de artefatos de movimento na normalização

espacial, as dificuldades na detecção de alterações em áreas cerebrais pequenas ou

altamente variáveis e a influência do processo de suavização das imagens na

localização precisa de pontos de diferença máxima (GOOD et al., 2002; SALMOND

et al., 2002). Adicionalmente, cotejando o amplo efeito anti-inflamatório da

minociclina com recentes evidências sobre a importância da neuroinflamação na

esquizofrenia, faz-se mister realizar estudos que avaliem diretamente os efeitos

dessa medicação sobre marcadores inflamatórios (e.g., níveis sanguíneos de

citocinas e avaliação da ativação da micróglia do cérebro por meio de (R)-

[11C]PK11195 PET. Outro ponto latente para melhor elucidação é se o processo de

neuroinflamação exerce um papel mais amplo em um subgrupo de pacientes, mas

não em outro. É possível que pacientes com evidências de inflamação (através de

dosagens de marcadores inflamatórios no plasma), respondam melhor ao tratamento

com minociclina, em comparação a um subgrupo sem aumento de marcadores

inflamatórios.

Conclusão | 50

6 CONCLUSÃO

O presente estudo indica que o tratamento adjuvante com minociclina tem o

potencial de interferir no curso natural da esquizofrenia de início recente, levando à

melhora de sintomas positivos e negativos, e protegendo contra a perda de

substância cinzenta cerebral. Os antipsicóticos, até o momento, são insuficientes

para melhorar todos os domínios de sintomas da esquizofrenia e não podem evitar a

deterioração clínica e as alterações cerebrais progressivas observadas

particularmente nos primeiros anos após o início da doença. Destarte, a terapêutica

adjuvante com minociclina pode ser útil para otimizar o tratamento durante esse

período crítico. Novos estudos longitudinais com amostras maiores e com medidas

de marcadores inflamatórios são necessários para testar o potencial da minociclina

como tratamento adjuvante na esquizofrenia.

Referências Bibliográficas | 51

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Anexos | 60

ANEXOS ANEXO A – Termo de consentimento livre e esclarecido

HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DE

RIBEIRÃO PRETO DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO CAMPUS UNIVERSITÁRIO - MONTE ALEGRE - FONE: 602-1000

CEP. 14048 - RIBEIRÃO PRETO - S.P.

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO:

Nome da Pesquisa: Estudo piloto duplo-cego randomizado da adição de minociclina ou placebo ao tratamento usual de esquizofrenia de início recente. Pesquisador Responsável: Dr. JAIME EDUARDO CECILIO HALLAK. CRM - 71.498. Descrever abaixo as informações dadas aos pacientes sobre: 01 - A justificativa e objetivo da pesquisa; 02 - os procedimentos que serão utilizados e seu propósito, bem como a identificação dos procedimentos que são experimentais; 03 - os desconfortos e riscos esperados; 04 - os benefícios que se pode obter:

Você está sendo convidado a participar de um estudo de pesquisa. Antes que você decida é importante que você entenda o porquê esta pesquisa está sendo feita e o que significa participar dela. Por favor, leia atentamente as informações a seguir e discuta as mesmas com outras pessoas que você considere importantes e que possam lhe ajudar a decidir, se assim o desejar. Caso você tenha alguma dúvida durante a leitura, não se acanhe em perguntar para que eu possa esclarecê-lo. Leve o tempo que for necessário para tomar sua decisão se irá participar ou não deste estudo.

1 – Qual é o objetivo deste estudo? Esta pesquisa busca encontrar melhores maneiras de tratar doenças psicóticas

como a esquizofrenia. O objetivo é reduzir a necessidade de medicações tranqüilizantes, prevenir sintomas como a perda de motivação e auxiliar que as pessoas portadoras destas doenças consigam conduzir sua vida com o mínimo de dificuldade possível. Essa pesquisa é financiada por uma organização de caridade mundial que incentiva o desenvolvimento de pesquisas ao redor do mundo, denominada Stanley Medical Research Institute e está sendo conduzida em dois países que apresentam características semelhantes na maneira de acompanhar

Anexos | 61

portadores destas doenças (Brasil e Paquistão). Empresas farmacêuticas não estão envolvidas nesta pesquisa.

Os motivos pelos quais a esquizofrenia e outras doenças psicóticas relacionadas ocorrem tão freqüentemente e porque elas se iniciam geralmente no início da vida adulta ainda não é bem compreendido. Algumas vezes, assim que começam a se tratar, os pacientes melhoram rapidamente, para logo em seguida perder a motivação e a capacidade de socialização, assim como podem persistir com outros sintomas chamados de residuais. Isto parece ocorrer devido à própria doença e não como efeito colateral das medicações disponíveis para o tratamento. Existem evidências atuais que mesmo em tratamento algumas funções do cérebro, como a memória, podem continuar apresentando um pequeno e lento declínio após a doença começar. Estudos modernos de imagem cerebral sugerem que algumas regiões específicas do cérebro podem estar diminuídas e continuar diminuindo ao longo do tempo, o que poderia ser responsável pela dificuldade que alguns pacientes apresentam em conseguir uma recuperação completa para uma vida normal. Nós acreditamos que seja possível parar essa progressão da doença agindo rapidamente através da introdução de uma medicação que protege as células cerebrais de serem lesionadas.

Uma das drogas do estudo é a minociclina, um antibiótico comum, utilizado para o tratamento da acne, que também apresenta propriedades de proteção das células cerebrais em estudos laboratoriais. Se você concordar em participar desta pesquisa, você poderá tomar ou uma dessas duas medicações ou uma medicação que não apresenta efeito chamada placebo durante um ano. Essas medicações serão adicionadas ao seu tratamento habitual, o qual você deverá continuar fazendo regularmente.

2 – Porque eu fui escolhido? Você foi escolhido para participar deste estudo porque você foi diagnosticado

como portador de uma das condições que estão sendo estudadas e as pessoas que estão lhe acompanhando acreditam que você preencha os critérios necessários para participar. Se você concordar em participar, você será adicionalmente acompanhado pelo período de um ano. Sessenta pessoas serão convidadas a participar deste estudo.

3 – Eu tenho que participar? Você é quem decidirá se participará ou não. Se você concordar em participar,

lhe será entregue uma cópia destas informações e você e um familiar terão que assinar o consentimento. Você poderá deixar a pesquisa em qualquer momento que você deseje, sem a necessidade de dar nenhuma explicação. Se você desistir da pesquisa, ou decidir não participar da mesma, o seu acompanhamento não será afetado de maneira alguma.

4 – O que irá acontecer comigo, se eu participar? Inicialmente lhe será explicado o estudo e lhe será dada uma cópia deste

consentimento, a qual você poderá levar para casa para ler, bem como discutir com seus familiares e seu médico. Será-lhe dado um número de telefone para contato com os pesquisadores. Na primeira visita, você e um familiar deverão assinar o consentimento no qual você diz ter sido explicado os detalhes da pesquisa, que você

Anexos | 62

os entendeu e que concorda em participar. Você será então entrevistado para confirmar que você preenche os critérios de participação, através de perguntas a respeito de sua história médica atual e passada, bem como a respeito dos sintomas que você está apresentando atualmente e que apresentou no passado.

Caso você preencha os requisitos necessários, será realizada então uma

avaliação para medir sua memória e sua concentração, através de testes em que você terá, por exemplo, que reconhecer figuras, fotografias, números, faces, etc. Esses testes são bem simples e fáceis de completar, sendo que a maior parte das pessoas acha bem interessante realizá-los. Alguns serão realizados utilizando-se a tela de um computador, que você terá que tocar para indicar sua resposta. O tempo total para esses testes é de cerca três a três horas e meia. Esses testes poderão ser divididos em uma ou duas visitas a mais, se assim você desejar. Eles serão realizados aqui no Hospital das Clínicas.

Após os testes, você será triado para receber uma das duas medicações

(minociclina ou placebo). O placebo é uma pílula de farinha, que não contém nenhuma medicação ativa. Essa divisão nesses dois grupos é importante para poder comparar o efeito entre as medicações e saber qual é a melhor. Pacientes dos dois grupos serão comparados entre si. A escolha de qual grupo você participará será feita através de um programa de computador sem informações individuais suas, somente para ter certeza que os grupos serão divididos de maneira igual, aumentando a precisão das comparações.

O pesquisador lhe entregará então a sua medicação. Durante as primeiras oito

semanas você receberá a medicação a cada duas semanas. Depois, receberá uma vez por mês. Quando você vier receber sua medicação, você deverá trazer as embalagens que lhe foram entregues previamente, junto com as medicações que não foram utilizadas.

Após a primeira visita, você tomará a nova medicação duas vezes ao dia

durante um ano, juntamente com sua medicação regular. É muito importante que você continue tomando seus remédios normalmente durante o período da pesquisa. É possível que no começo você apresente um pouco de tontura ou visão embaçada, portanto lhe serão explicados os possíveis efeitos colaterais das medicações e que você se adapte a elas antes de dirigir ou operar máquinas. Você poderá ligar para os números de telefone que lhe serão fornecidos a qualquer momento, caso você tenha alguma dúvida ou preocupação em respeito a esta pesquisa.

Um cartão será fornecido a você, indicando que você está participando desta

pesquisa e contendo o número de telefone para contato. Após tomar a medicação por um ano, os testes de memória e concentração

serão repetidos pela segunda vez. Após essa avaliação sua medicação será gradualmente reduzida, até ser retirada, em um período de duas semanas.

5 – O que eu tenho que fazer? Você deverá continuar tomando sua medicação prescrita pelo seu medico

normalmente e também tomar a medicação do estudo uma vez ao dia. O

Anexos | 63

pesquisador responsável irá fornecer a sua medicação e, a cada visita, você deverá trazer as embalagens e os comprimidos que você não utilizou. Se você desenvolver alguma lesão de pele ou sintomas parecidos com os da gripe, você deverá informar aos pesquisadores imediatamente.

É muito importante que você complete todos os testes de memória e

concentração no começo e no final da pesquisa. Esses testes podem ser um pouco cansativos, mas são extremamente importantes para os resultados da pesquisa. Se você acha que não conseguirá completá-los, pense bem antes de concordar em participar.

Se você for do sexo feminino, em idade de engravidar, lhe será solicitado um

exame de urina no começo do estudo e a intervalos de 10 semanas. 6 – Quais são as medicações que estão sendo testadas? Minociclina é um antibiótico utilizado rotineiramente para o tratamento da acne

(espinhas). Essa medicação é tomada em doses médias de 200 mg por dia. A minociclina será fornecida a cada duas semanas até a oitava semana,

quando você deverá ter atingido a dose de 200 mg. As medicações do estudo serão tomadas em duas tomadas.

O placebo será fornecido em cápsulas para serem tomadas duas vezes ao dia. 7 – Quais são os possíveis efeitos colaterais das medicações pesquisadas? Assim como qualquer medicação, a minociclina pode causar efeitos colaterais

indesejados. A minociclina pode causar: - diarréia, mal estar, náuseas e vômitos, dificuldade

de deglutição, reações alérgicas, pancreatite, sensibilidade dermatológica, dores de cabeça, distúrbios visuais, e muito raramente alterações de funções hepáticas, pericardite, zumbidos e piora dos sintomas do lupus eritematoso sistêmico, descoloração dos dentes e da conjuntiva.

8 - Quais são os riscos envolvidos na participação nesta pesquisa e quais as

precauções que são necessárias? Para minimizar a chance de quaisquer problemas, nós perguntaremos a

respeito de sua história médica antes de você iniciar no estudo. A dosagem das medicações será aumentada lenta e progressivamente até a

dose indicada, o que minimiza o risco de efeitos adversos. É importante que você compreenda que alguns participantes apresentarão uma

resposta muito boa a essas medicações, enquanto outros poderão apresentar respostas mais discretas ou mesmo resposta alguma durante o tratamento.

Anexos | 64

Você sempre poderá contar com alguém qualificado do ponto de vista médico, caso você precise ou queira esclarecer alguma dúvida quanto aos tratamentos empregados nesta pesquisa.

É possível que as medicações se forem administradas a alguma mulher

grávida, possam prejudicar o bebê. Portanto, mulheres grávidas não podem participar desta pesquisa. Mulheres que estejam em idade fértil serão solicitadas a fornecer amostras de urina periodicamente (antes do estudo começar e a cada 10 semanas) para se afastar gravidez.

Mulheres que possam vir a engravidar deverão utilizar métodos contraceptivos

eficazes como, por exemplo, métodos de barreira dupla (preservativos com espermicida – ambos juntos e não isoladamente). Contraceptivos orais, implantes ou de depósito são considerados efetivos individualmente. No entanto, como uma das medicações é um antibiótico, e sabidamente antibióticos podem diminuir a eficácia de contraceptivos orais, é importante o uso de meios adicionais de controle (por exemplo, preservativos) durante o período da pesquisa. Nesse caso, será assegurado às voluntárias que desejem participar do estudo o acesso aos métodos contraceptivos adequados.

Em caso de gravidez durante o estudo, a voluntária será excluída da pesquisa,

com os pesquisadores assegurando o acompanhamento da gestante até o termo e da criança se for o caso.

9 - Quais são os possíveis benefícios em se participar desta pesquisa? É esperado que ambos os tratamentos ativos ajudem você, embora isso não

possa ser garantido. A informação que este estudo irá gerar poderá ajudar no desenvolvimento de tratamentos mais efetivos para portadores de doença psicótica no futuro.

10 – O que acontecerá quando o estudo acabar? Ao final do estudo, você não receberá mais a medicação pesquisada, mas

deverá continuar tomando sua medicação normalmente prescrita pelos seus médicos. No entanto, se os resultados dessa pesquisa forem positivos, elas já se encontram disponíveis no mercado, podendo ser continuadas através de prescrição, caso você e seu médico concordem.

Algumas vezes, durante o decorrer de uma pesquisa, novas informações a

respeito das medicações se tornam disponíveis. Se isso acontecer, você será informado a respeito, uma vez que isto pode vir a mudar seu desejo de continuar participando da mesma.

Sua participação no estudo poderá ser encerrada pelos pesquisadores, após

análise das razões da descontinuidade pelo Comitê de Ética em Pesquisa que aprovou o estudo. As seguintes situações podem levar à sua descontinuação do estudo;

Se você não seguir as recomendações médicas dos pesquisadores.

Anexos | 65

Se alguma coisa séria acontecer com você que precise tratamento, mesmo não relacionado diretamente com as medicações pesquisadas.

O medico decidir que é do interesse de sua saúde e seu bem-estar descontinuar a medicação.

Não se conseguir o número suficiente de pacientes para o estudo. 11 – E se alguma coisa der errado durante a pesquisa? O pesquisador e a instituição devem assumir a responsabilidade de dar

assistência integral às complicações e danos decorrentes dos riscos previstos. Assim, os participantes da pesquisa que vierem a sofrer qualquer tipo de dano previsto ou não no termo de consentimento e resultante de sua participação, além do direito à assistência integral, têm direito à indenização.

Se você for diretamente prejudicado pela pesquisa, lhe é garantido o acesso ao tratamento necessário para qualquer situação provocada pela medicação pesquisada.

12 - Quando eu tenho que dar uma resposta se participarei e o que acontece se

eu disser que quero participar e depois mudar de idéia? Você pode levar o tempo que for necessário para você tomar sua decisão em

participar ou não do estudo. Se você decidir deixar a pesquisa, mesmo durante os testes, você pode, sem prejuízo ao seu acompanhamento regular.

13 - O que eu ganho se eu participar do estudo? Nós lhe forneceremos a medicação da pesquisa. 14 – E se eu precisar entrar em contato com os pesquisadores? Alguém estará disponível 24 h por dia para essa pesquisa. O número do

Laboratório de Psicofarmacologia é 16-3602 2703. O número para contato do investigador principal (Prof. Dr. Jaime E. C. Hallak) é 16-3602-2853 ou 16-9705 5400.

15 – Minha participação no estudo será mantida confidencial? Se você concordar em participar na pesquisa as suas informações serão

mantidas estritamente confidenciais. Qualquer informação que deixe o Hospital terá seu nome e endereço removidos, para que você não possa ser identificado. Membros da equipe de pesquisa ou autoridades de vigilância sanitária podem ter que checar se a pesquisa está sendo conduzida adequadamente e acessar seus prontuários médicos.

Seu médico será informado que você está participando do estudo. 16 – O que acontecerá com os resultados deste estudo? Ao final do estudo, os dados serão computados de maneira anônima em um

programa de computador e serão analisados. Os resultados serão publicados em

Anexos | 66

uma revista médica ainda não definida. Lembre, no entanto que este trabalho tem a duração de dois anos e somente a partir daí que os dados serão analisados.

17 – O que eu faço agora? Você pode nos contactar através do número de telefone que você recebeu ou

então pessoalmente nos próximos dias. Quaisquer dúvidas que você tiver serão esclarecidas e você poderá nos informar se concordou ou não em participar desta pesquisa.

Muito obrigado por considerar participar de nossa pesquisa.

Prof. Dr. Jaime E C Hallak Pesquisador Responsável.

Laboratório de Psicofarmacologia - Hospital das Clínicas Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP

Anexos | 67

Eu _____________________________________________________________ R.G.________________________, abaixo assinado, tendo recebido as informações acima e contidas no Folheto de Informação ao Paciente, e ciente dos meus direitos abaixo relacionados, concordo em participar.

1- A garantia de receber a resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento a qualquer dúvida acerca dos procedimentos, riscos, benefícios e outros assuntos relacionados com a pesquisa e o trabalho a que serei submetido;

2- A liberdade de retirar meu consentimento a qualquer momento e deixar de participar no estudo sem que isso traga prejuízo à continuidade do meu cuidado e tratamento;

3- A segurança de que não serei identificado e que será mantido o caráter confidencial da informação relacionada com a minha privacidade;

4- O compromisso de me proporcionar informação atualizada contida durante o estudo, ainda que esta possa afetar minha vontade de continuar participando;

5- A disponibilidade de tratamento médico e a indenização que legalmente teria direito, por parte da Instituição à Saúde, em caso de danos que justifiquem, diretamente causadas pela pesquisa e;

6- Que se existirem gastos adicionais estes serão absorvidos pelo orçamento da pesquisa.

Tenho ciência do exposto acima e desejo utilizar o produto como método terapêutico recomendado pelo médico que subscreve este documento.

Ribeirão Preto,__________,_______________,______________ dia mês ano

_______________________________________________ assinatura do paciente e do familiar (ou responsável legal)

Anexos | 68

ANEXO B – Carta de aprovação do comitê de ética em pesquisa do HCRP

Anexos | 69

ANEXO C – Carta de aprovação da comissão nacional de ética em pesquisa (CONEP)

Apêndices | 70

APÊNDICES – Artigos relacionados à tese e escritos pelo autor

Apêndices | 71

APÊNDICE A – Artigo de revisão

Apêndices | 72

Apêndices | 73

Apêndices | 74

Apêndices | 75

Apêndices | 76

Apêndices | 77

Apêndices | 78

Apêndices | 79

Apêndices | 80

Apêndices | 81

Apêndices | 82

Apêndices | 83

Apêndices | 84

APÊNDICE B – Relato de caso

Apêndices | 85

Apêndices | 86

Apêndices | 87

APÊNDICE C – Carta ao editor

Apêndices | 88

Apêndices | 89

APÊNDICE D – Artigo submetido

Elsevier Editorial System(tm) for Schizophrenia Research Manuscript Draft Manuscript Number: Title: Effects of minocycline add-on treatment on brain morphometry and cerebral perfusion in recent-onset schizophrenia Article Type: Full Length Article Keywords: schizophrenia; minocycline; neuroimaging; SPECT; MRI; VBM Corresponding Author: Dr. Cristiano Chaves, Corresponding Author's Institution: 1-Department of Neuroscience and Behavior, Division of Psychiatry, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, Brazil;2-National Science and Technology Institute for Translational Medicine (INCT-TM) First Author: Cristiano Chaves Order of Authors: Cristiano Chaves; Cristiane R Marque; João P Maia-de-Oliveira; Lauro Wichert-Ana; Thiago B Ferrari; Antonio C Santos; David Araujo; João P Machado-de-Sousa; Rodrigo A Bressan; Helio Elkis; José A Crippa; Francisco S Guimarães; Antonio W Zuardi; Glen B Baker; Serdar M Dursun; Jaime E Hallak Abstract: Increasing evidence suggests that the tetracycline antibiotic minocycline has neuroprotective effects and is a potential treatment for schizophrenia. However, the mechanisms of action of minocycline in the CNS remain elusive. The aim of this study was to investigate the effects of minocycline on brain morphology and cerebral perfusion in patients with recent-onset schizophrenia after twelve months of a randomized double-blind, placebo-controlled clinical trial of minocycline add-on treatment. This study included 24 outpatients with recent-onset schizophrenia randomized for 12 months of adjuvant treatment with minocycline (200 mg/d) or placebo. MRI (1.5 tesla) and [99mTc]-ECD SPECT brain scans were performed at the end of the 12 months trial. Between-condition comparisons of SPECT and MRI brain images were performed using statistical parametric mapping and analyzed by voxel-based morphometry (VBM). Minocycline adjuvant treatment significantly reduced positive and negative symptoms when compared to placebo. The VBM analysis of MRI scans showed that patients in the placebo group had significant lower gray matter volumes in the midposterior cingulate cortex and in the precentral gyrus in comparison to the patients in the minocycline group. In addition, decreased ECD uptake in the minocycline condition was observed in fronto-temporal areas. These results suggest that minocycline may protect against gray matter loss and modulate fronto-temporal areas involved in the pathophysiology of schizophrenia. Furthermore, minocycline add-on treatment may be a potential treatment in the early stages of schizophrenia and may ameliorate clinical deterioration and brain alterations observed in this period. Suggested Reviewers:

Apêndices | 90

Apêndices | 91

Apêndices | 92

2

Abstract

Increasing evidence suggests that the tetracycline antibiotic minocycline has

neuroprotective effects and is a potential treatment for schizophrenia. However, the

mechanisms of action of minocycline in the CNS remain elusive. The aim of this study

was to investigate the effects of minocycline on brain morphology and cerebral

perfusion in patients with recent-onset schizophrenia after twelve months of a

randomized double-blind, placebo-controlled clinical trial of minocycline add-on

treatment. This study included 24 outpatients with recent-onset schizophrenia

randomized for 12 months of adjuvant treatment with minocycline (200 mg/d) or

placebo. MRI (1.5 tesla) and [99mTc]-ECD SPECT brain scans were performed at the

end of the 12 months trial. Between-condition comparisons of SPECT and MRI brain

images were performed using statistical parametric mapping and analyzed by voxel-

based morphometry (VBM). Minocycline adjuvant treatment significantly reduced

positive and negative symptoms when compared to placebo. The VBM analysis of MRI

scans showed that patients in the placebo group had significant lower gray matter

volumes in the midposterior cingulate cortex and in the precentral gyrus in comparison

to the patients in the minocycline group. In addition, decreased ECD uptake in the

minocycline condition was observed in fronto-temporal areas. These results suggest that

minocycline may protect against gray matter loss and modulate fronto-temporal areas

involved in the pathophysiology of schizophrenia. Furthermore, minocycline add-on

treatment may be a potential treatment in the early stages of schizophrenia and may

ameliorate clinical deterioration and brain alterations observed in this period.

Key words: schizophrenia; minocycline; neuroimaging; SPECT; MRI; VBM

Apêndices | 93

3

Introduction

The progressive clinical deterioration that occurs in the early stages of

schizophrenia is a challenging key point of schizophrenia treatment. This finding led to

the hypothesis that there is a critical period of schizophrenia involving the first five

years after the onset of psychotic symptoms, which represents a window of opportunity

that can influence the long-term outcome (Birchwood and Fiorillo, 2000; Lieberman,

1999; Melau et al., 2011). However, despite the great variety of antipsychotics currently

available, the course of schizophrenia remains highly variable and a progressive

functional deterioration is usually observed (Lieberman, 1999; McGlashan, 1998; Stahl

and Buckley, 2007). In addition, several longitudinal cohort studies with patients in

their first episode of psychosis have shown aggravation in several psychopathological

domains (Hoff et al., 1999; Lieberman, 1999; McGlashan, 1998; Stirling et al., 2003),

as well as progressive gray matter loss and altered brain function, particularly in

frontotemporal areas (Bachmann et al., 2004; Cahn et al., 2002; Koo et al., 2008;

Lieberman, 1999; Mane et al., 2009; Perez-Neri et al., 2006; Smieskova et al., 2009;

van Haren et al., 2008; Whitford et al., 2006). These findings have led to the search for

adjuvant treatments that can potentiate the antipsychotic treatment and prevent the

progressive changes in brain morphology and function that occur in the early stages of

schizophrenia.

Increasing evidence points out that minocycline, a broad-spectrum tetracycline

antibiotic, has neuroprotective effects in different neurological conditions (e.g., brain

ischemia) (Domercq and Matute, 2004; Kim and Suh, 2009). Translational neuroscience

data from both animal and human studies have shown that minocycline is a potential

treatment for schizophrenia. In three studies with animal models of psychosis, treatment

with minocycline prevented or reversed the behavioral effects of administration of

Apêndices | 94

4

NMDA antagonists (Fujita et al., 2008; Levkovitz et al., 2007; Zhang et al., 2007).

Subsequently, a case report and an open study with the addition of minocycline to the

usual antipsychotic treatment of patients with schizophrenia showed significant

improvement in positive, negative and cognitive symptoms (Miyaoka et al., 2007,

2008). Adjunctive minocycline to clozapine was also effective in improving positive

and negative symptoms of two super-refractory patients (Kelly et al., 2011).

Additionally, a randomized double-blind placebo-controlled clinical trial of minocycline

add-on treatment showed improvement in negative and cognitive symptoms in patients

with schizophrenia (Levkovitz et al., 2010), and a recently published randomized

double-blind placebo-controlled clinical trial demonstrated improvement mainly in

negative symptoms (Chaudhry et al., 2012).

In spite of these findings, the effects of minocycline in the central nervous

system remain elusive and have not been systematically investigated with neuroimaging

techniques. The hypothesis of this study is that minocycline add-on treatment may

improve diverse psychopathological domains of schizophrenia and prevent brain

alterations (especially in frontotemporal areas) that usually occur in the early course of

schizophrenia. Hence, the aim of this study was to investigate the effects of minocycline

on brain morphology and cerebral perfusion in patients with recent-onset schizophrenia

after twelve months of a randomized double-blind, placebo-controlled clinical trial of

minocycline added to treatment as usual.

Methods and Materials

General context of the study

This research focused on the neuroimaging findings of a randomized double-

blinded placebo-controlled study of minocycline add-on treatment. The clinical data of

Apêndices | 95

5

this study have already been published as part of a multi-site clinical trial that included

patients from Brazil and Pakistan (Chaudhry et al., 2012). Hence, the aim of this study

was to investigate the effects of minocycline on brain morphology and cerebral

perfusion using MRI and 99mTc-ECD SPECT scans of the patients followed at the

Brazil site after 12 months of the addition of minocycline or placebo to regular

antipsychotic treatment. The trial was registered at ClinicalTrials.gov (Identifier:

NCT00916461).

Procedures

This study included 30 patients with DSM-IV diagnosis of schizophrenia with

up to five years of illness and with stable antipsychotic dose for at least four weeks

before the first study evaluation. Subjects were selected from among patients followed

up in the Hospital of Ribeirão Preto Medical School (University of São Paulo). Patients

and relatives signed an informed consent. This study obtained ethical approval at the

local research ethics committee. Patients were randomized to take minocycline (200

mg/d) or placebo in a follow-up of 12 months. Clinical ratings were evaluated by the

Clinical Global Improvement (CGI) and the Positive and Negative Syndrome Scale

(PANSS) and its subscales. Side effects were assessed by the UKU side effects scale

and the Abnormal Involuntary Movements Scale (AIMS). The procedures of the clinical

trial have been previously fully described in Chaudhry et al. (2012). The patients

underwent both MRI and SPECT brain scans after twelve months of minocycline or

placebo add-on treatment. For reasons of space, the detailed methods of both MRI and

SPECT acquisition, processing and analysis are available as supplementary material

(S1).

Apêndices | 96

6

Results

Characteristics of the sample

Patient flow in the study is shown in the CONSORT Diagram available as e-

supplement (S2). Six patients did not complete the study due to noncompliance,

observing that there were more patients that did not complete the trial in the placebo

group (n=4) than in the minocycline group (n=2).

The clinical and demographic characteristics of the patients are presented in

Table 1. All confounding parameters are matched, including age, years of education,

illness duration, duration of untreated psychosis, gender, diagnostic subtype and type of

antipsychotic in use.

Insert Table 1

Clinical outcomes

Patients taking minocycline showed significant improvement in CGI score,

PANSS total score and in the PANSS subscales (positive, negative and general

psychopathology) scores (Figure 1).

Insert Figure 1

VBM analysis of brain volumes in MRI imaging

The VBM analysis of MRI scans indicated two clusters of regional lower gray

matter volumes in placebo-treated patients relative to minocycline-treated patients

≤ -tailed, uncorrected for multiple comparisons): left precentral gyrus (BA6)

and left mid-posterior cingulate (BA24) (Figure 2 and Table 2).

Apêndices | 97

7

Insert Figure 2

Insert Table 2

Comparison of brain perfusion in minocycline and placebo groups

Comparisons of regional tracer uptake between the minocycline and placebo

conditions revealed that, relative to placebo, minocycline patients had lower uptake of

99mTc-ECD in a group of frontotemporal areas, as showed in figure 3 and table 3.

Insert Figure 3

Insert Table 3

Discussion

The present study observed that minocycline add-on treatment can improve

positive and negative symptoms of patients with recent-onset schizophrenia.

Furthermore, this is the first morphometric and functional neuroimaging study that

evaluated minocycline’s action in the CNS, indicating that minocycline adjuvant

treatment in recent-onset schizophrenia may prevent some brain alterations observed in

the early stages of this disorder. In addition, the effects of minocycline are associated

with modulation of fronto-temporal brain areas involved in the pathophysiology of

schizophrenia.

The improvement in positive and negative symptoms observed in this study is in

agreement with other recent published trials of minocycline adjuvant treatment in

Apêndices | 98

8

schizophrenia (Chaudhry et al., 2012; Levkovitz et al., 2010; Miyaoka et al., 2007,

2008). The present study shows longitudinal clinical data of the research conducted in

the Brazil site of the multi-site clinical trial recently published by Chaudhry et al.

(2012), which showed similar results in both sites, observing a more significant

reduction of symptoms in the Brazil site.

In the present study, the VBM analysis of MRI data indicates that minocycline

may have protected against gray matter reduction in the mid-posterior cingulate and in

the precentral gyrus in patients with recent-onset schizophrenia. Increasing evidence

suggest that structural brain abnormalities are already present in first episode or even

before the onset of psychosis, with further progressive gray matter loss after the disease

onset, particularly in the early stages of schizophrenia (Bachmann et al., 2004; Brans et

al., 2008; Cahn et al., 2002; van Haren et al., 2008; Whitford et al., 2006; Zhou et al.,

2005). In accordance, Asami et al. (2012) evaluated first-episode schizophrenia patients

and observed, after 1.5 years, gray matter volume reduction of superior temporal gyrus,

frontal, parietal and limbic regions, including the cingulate gyrus. In addition, Mitelman

et al. (2005) investigated the volume of cingulate cortex through region of interest

(ROI) analysis and found significant gray matter reductions in the whole cingulate

gyrus, particularly in the BA 24 (the same area observed in the present study).

Moreover, Koo et al. (2008) longitudinally evaluated first-episode schizophrenia

patients through ROI analysis and observed significant reductions of all cingulate gyrus

gray matter subregions at 1.5 year follow-up. Wang et al. (2007) also observed

significant reduced gray matter volume and thickness in both anterior and posterior

cingulate of patients with schizophrenia in comparison to matched controls. Hence,

these findings point out a relevant role of the cingulate gyrus in the pathophysiology of

schizophrenia and indicate that gray matter loss in this brain area is implicated in the

Apêndices | 99

9

course of schizophrenia. In addition, Zhou et al. (2005) performed a volumetric analysis

of precentral gyrus, cingulate gyrus and prefrontal region of 59 patients with

schizophrenia in comparison to healthy controls, observing gray matter volume

reduction in all the segmented areas in schizophrenics. The precentral gyrus is involved

in the processing of motor-related cognitive tasks and is possibly implicated in

schizophrenia (Georgopoulos, 2000). One previous post-mortem study indicated a

reduction of the neuronal density of this brain region in patients with schizophrenia

(Benes et al., 1986), and abnormalities of the motor area may be associated with the

psychopathology of schizophrenia (Andreasen et al., 1998; Kircher et al., 2001; Walther

and Strik, 2012). Hence, the significant lower gray matter volume observed in the

placebo group in comparison to the minocycline group suggest that the cingulate gyrus

and the precentral gyrus are possible neural substrates of minocycline effects in the

treatment of schizophrenia.

In agreement with the observed effects on schizophrenia symptoms, minocycline

may have significantly modulated the activity in cortical limbic areas that are usually

involved in the pathophysiology of psychosis (Meyer-Lindenberg, 2010). Accordingly,

differences in activity between minocycline and placebo groups were observed in

frontotemporal areas. In line with these findings, Kanahara et al. (2009) have studied

changes in cerebral perfusion in schizophrenia and reinforced the idea that multiple

cortical regions, including several frontal and temporal cortical regions, are involved in

the pathophysiology of the disorder. A decrease in frontal activity in schizophrenia

(hypofrontality) has been previously observed, particularly in patients with prominent

negative symptoms and in cognitive tasks that require frontal activation (Brown and

Thompson, 2010; Liemburg et al., 2012). However, recent studies have shown that

schizophrenia symptoms are associated with distinct alterations in cerebral perfusion

Apêndices | 100

10

that may change over time and psychopathological conditions (Kanahara et al., 2009;

Wake et al., 2010). Moreover, positive symptoms have been associated with

hyperactivity of temporal limbic areas and of prefrontal and orbitofrontal regions

(Silbersweig et al., 1995). Accordingly, Glenthoj et al. (2006) performed a study with

SPECT using the D2/3-receptor ligand [123I]epidepride and observed a significant

positive correlation between frontal D2/3 binding potentials and positive symptoms of

schizophrenia. It is noteworthy that previous evidence from animal studies show that

minocycline can reduce the secondary increase of dopamine in striatum and in frontal

cortex after the administration of NMDA antagonists (Zhang et al., 2007). In addition,

temporal cortex activation has also been associated with positive symptoms (Shergill et

al., 2000; Silbersweig et al., 1995) and the administration of NMDA antagonists in

healthy volunteers can lead to augmented activation of the temporal lobe (Deakin et al.,

2008). These findings may be subjacent to the reduction of brain perfusion in some

temporal areas observed in the minocycline group, in light of previous evidence of

improvement of positive symptoms after minocycline treatment in schizophrenia

patients (Chaves et al., 2010a; Kelly et al., 2011; Miyaoka et al., 2007, 2008) and the

counteracting effects of minocycline against NMDA antagonists in animal models

(Fujita et al., 2008; Levkovitz et al., 2007; Zhang et al., 2007).

The precise mechanisms of minocycline’s action in the SNC are still elusive, but

several points can be addressed, providing rational hypotheses for understanding how

minocycline can improve symptoms and modulate brain structure and function in

schizophrenia. It is noteworthy that minocycline does not exert significant direct effects

on different neuroreceptors, including monoaminergic and NMDA receptors (Chaves et

al., 2009). However, minocycline can regulate several processes associated with neural

plasticity. This drug affects the downstream signaling of NMDA receptors and has

Apêndices | 101

11

opposing effects on p38 MAPK activation and PO3/Akt kinase pathway suppression,

these signaling pathways being subject to the neurotoxic effects of glutamate (Pi et al.,

2004). These effects are in line with the NMDA hypofunction hypothesis of

schizophrenia, since NMDA hypofunction might be related to an excessive release of

glutamate at non-NMDA receptors, underlying clinical deterioration and

neurodegeneration in schizophrenia (Deakin et al., 2008; Moghaddam, 2003).

Moreover, Moghaddam et al. (2003) suggested that NMDA receptor dysfunction in

schizophrenia is possibly due to changes in downstream signaling pathways of NMDA

receptors, rather than gross alterations in the NMDA receptor levels.

Another relevant point is that minocycline has broad anti-inflammatory effects,

reduces microglia activation and can inhibit a wide range of cytokines (Domercq and

Matute, 2004; Kim and Suh, 2009). These effects may corroborate the action of

minocycline in the CNS, since increasing evidence points out that neuroinflammation is

involved in neurodevelopment and in neural plasticity, playing an important role in the

development and progression of schizophrenia (Debnath et al., 2012). A major finding

in recent schizophrenia genetics research is that immune-related genes of the Major

Histocompatibility Complex (MHC) are associated with schizophrenia (Bergen et al.,

2012; Debnath et al., 2012; Irish Schizophrenia Genomics and the Wellcome Trust Case

Control, 2012; Jia et al., 2012; Li et al., 2010; Shi et al., 2009; Stefansson et al., 2009).

Further evidence indicates significant correlations between gene variants in the MHC

region and cerebral ventricular size in schizophrenia (Agartz et al., 2011). In addition,

Fillman et al. (2012) observed increased inflammatory markers (including different

cytokines and inflammatory RNA expression) in the dorsolateral prefrontal cortex of

schizophrenia patients. Moreover, neuroinflammation can modulate glutamatergic

function through the cytokine-induced activation of the kynurenine pathway of

Apêndices | 102

12

tryptophan metabolism, since elevated levels of kynurenic acid can inhibit NMDA

receptors (Anderson and Maes, 2012; Chaves et al., 2010b; Na et al., 2012). It is also

noteworthy that neuroinflammation can impact neurogenesis and thereby neural

plasticity in schizophrenia (Na et al., 2012). Accordingly, Das et al. (2011) observed

that minocycline can inhibit neuroinflammation and restore neurogenesis in a murine

model of Japanese encephalitis, although Rueger et al. (2012) suggested a positive

effect of minocycline in neurogenesis independently of neuroinflammation.

Furthermore, the potent inhibition of microglia activation by minocycline may

play a key role in the effects of this agent in schizophrenia. A recent study by van

Berckel et al. (2008) evaluated microglia activation in recent-onset schizophrenia

through a quantitative (R)-[11C]PK11195 PET study. The authors observed increased

microglia activation in patients with recent-onset schizophrenia (within 5 years of

illness onset), suggesting that neuronal injury occurs and may be implicated in the

reduction of gray matter volume in the initial phase of schizophrenia. This finding

replicates similar results observed by Doorduin et al. (2009) indicating that microglia

activation is a potential target for preventing gray matter reduction and clinical

deterioration in schizophrenia. Thus, the potent inhibition of microglia activation by

minocycline may be involved in the protective effect of minocycline against gray matter

volume reduction in recent-onset schizophrenia, as observed in the present study. In

accordance, a previous (R)-[11C]PK11195 PET neuroimaging study of microglial

activation in zymosan-treated rats observed that minocycline treatment reduced

zymosan-induced microglial activation in brain by 46% (Converse et al., 2011).

Some limitations of the findings herein reported should be addressed. First, the

optimal dose of minocycline for neuroprotection in humans is still unknown and

experimental designs with different dosages should be evaluated in larger sample size

Apêndices | 103

13

groups (Chaves et al., 2009). Brain structural and functional evaluations were performed

only after the clinical trial and the ideal study design would scan patients before and

after the intervention. However, the careful matching between groups indicate that the

results observed in this study may be due to the treatment intervention and not to other

confounding variables that can influence brain volume, such as age, gender, illness

length and duration of untreated psychosis. Some intrinsic limitations of the VBM

method for analyzing MRI data should also be considered, including the influence of

motion artifacts in the spatial normalization, the difficulties in detecting changes in

small or highly variable brain areas and the influence of smoothing in the accurate

localization of points of maximal difference (Good et al., 2002; Salmond et al., 2002).

Moreover, given the broad anti-inflammatory effects of minocycline and in light of

previous evidence of the importance of neuroinflammation in schizophrenia, further

studies with minocycline treatment that directly assess inflammatory markers (e.g.,

blood levels of cytokines and evaluation of brain microglia activation through (R)-

[11C]PK11195 PET neuroimaging) will be of great value for understanding the

mechanism of action of this drug in schizophrenia.

In conclusion, the present study observed that minocycline add-on treatment

may interfere with the natural course of recent-onset schizophrenia, improving positive

and negative symptoms and protecting against gray matter loss. The antipsychotics to

date are insufficient to improve all psychopathology domains and may not prevent

clinical deterioration and progressive brain alterations observed particularly in the first

years after illness onset. Thus, minocycline adjunctive treatment may be helpful to

optimize the treatment in this critical period and may prevent brain alterations observed

in the early stages of schizophrenia. Further studies with larger samples and with

Apêndices | 104

14

measures of inflammatory markers are needed to test the potential of minocycline as an

adjunctive treatment in schizophrenia.

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Magnusdottir, B.B., Sigmundsson, T., Olason, P., Masson, G., Gulcher, J.R., Haraldsson, M., Fossdal, R., Thorgeirsson, T.E., Thorsteinsdottir, U., Ruggeri, M., Tosato, S., Franke, B., Strengman, E., Kiemeney, L.A., Melle, I., Djurovic, S., Abramova, L., Kaleda, V., Sanjuan, J., de Frutos, R., Bramon, E., Vassos, E., Fraser, G., Ettinger, U., Picchioni, M., Walker, N., Toulopoulou, T., Need, A.C., Ge, D., Yoon, J.L., Shianna, K.V., Freimer, N.B., Cantor, R.M., Murray, R., Kong, A., Golimbet, V., Carracedo, A., Arango, C., Costas, J., Jonsson, E.G., Terenius, L., Agartz, I., Petursson, H., Nothen, M.M., Rietschel, M., Matthews, P.M., Muglia, P., Peltonen, L., St Clair, D., Goldstein, D.B., Stefansson, K., Collier, D.A., 2009. Common variants conferring risk of schizophrenia. Nature 460(7256), 744-747. Stirling, J., White, C., Lewis, S., Hopkins, R., Tantam, D., Huddy, A., Montague, L., 2003. Neurocognitive function and outcome in first-episode schizophrenia: a 10-year follow-up of an epidemiological cohort. Schizophr Res 65(2-3), 75-86. van Berckel, B.N., Bossong, M.G., Boellaard, R., Kloet, R., Schuitemaker, A., Caspers, E., Luurtsema, G., Windhorst, A.D., Cahn, W., Lammertsma, A.A., Kahn, R.S., 2008. Microglia activation in recent-onset schizophrenia: a quantitative (R)-[11C]PK11195 positron emission tomography study. Biol Psychiatry 64(9), 820-822. van Haren, N.E., Hulshoff Pol, H.E., Schnack, H.G., Cahn, W., Brans, R., Carati, I., Rais, M., Kahn, R.S., 2008. Progressive brain volume loss in schizophrenia over the course of the illness: evidence of maturational abnormalities in early adulthood. Biol Psychiatry 63(1), 106-113. Wake, R., Miyaoka, T., Kawakami, K., Tsuchie, K., Inagaki, T., Horiguchi, J., Yamamoto, Y., Hayashi, T., Kitagaki, H., 2010. Characteristic brain hypoperfusion by 99mTc-ECD single photon emission computed tomography (SPECT) in patients with the first-episode schizophrenia. Eur Psychiatry 25(6), 361-365. Walther, S., Strik, W., 2012. Motor symptoms and schizophrenia. Neuropsychobiology 66(2), 77-92. Wang, L., Hosakere, M., Trein, J.C., Miller, A., Ratnanather, J.T., Barch, D.M., Thompson, P.A., Qiu, A., Gado, M.H., Miller, M.I., Csernansky, J.G., 2007. Abnormalities of cingulate gyrus neuroanatomy in schizophrenia. Schizophr Res 93(1-3), 66-78. Whitford, T.J., Grieve, S.M., Farrow, T.F., Gomes, L., Brennan, J., Harris, A.W., Gordon, E., Williams, L.M., 2006. Progressive grey matter atrophy over the first 2-3 years of illness in first-episode schizophrenia: a tensor-based morphometry study. Neuroimage 32(2), 511-519. Zhang, L., Shirayama, Y., Iyo, M., Hashimoto, K., 2007. Minocycline attenuates hyperlocomotion and prepulse inhibition deficits in mice after administration of the NMDA receptor antagonist dizocilpine. Neuropsychopharmacology 32(9), 2004-2010. Zhou, S.Y., Suzuki, M., Hagino, H., Takahashi, T., Kawasaki, Y., Matsui, M., Seto, H., Kurachi, M., 2005. Volumetric analysis of sulci/gyri-defined in vivo frontal lobe regions in schizophrenia: Precentral gyrus, cingulate gyrus, and prefrontal region. Psychiatry Res 139(2), 127-139.

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Legend to the figures

Figure 1. CGI scale, PANSS scale and subscales (positive, negative and general psychopathology) scores of the two groups (minocycline and placebo) assessed over twelve months. For the first two weeks, measurements were made biweekly. The icons represent averages and error bars represent the standard error of the mean (SEM). The asterisk (*) represents significant difference at p ≤ 0.05. Figure 2. VBM analysis of MRI scans showed that patients in the placebo group had significant reduction of gray matter volume in precentral gyrus (BA6) and in cingulate gyrus (BA24) in comparison to patients in the minocycline group. Figure 3. Brain areas with significantly decreased radiotracer uptake in the minocycline group in comparison to the placebo group: a) frontal view, (b) right side view, (c) dorsal view, (d) caudal view, (e) left side view, (f) ventral view. LFOG Left Frontal Orbital Gyrus; LITG Left Inferior Temporal Gyrus; RITG Right Inferior Temporal Gyrus; RPG Right Parahippocampal Gyrus; RIFG Right Inferior Frontal Gyrus; RSFG Right Superior Frontal Gyrus.

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Table 1. Demographic and clinical characteristcs of the sample

Minocycline (n=16) Placebo (n=14) StatisticsMean SD Mean SD t DF p

Age 24 5,02 25 6,37 0,5 28 0,65Education (years) 11 1,54 10,5 1,6 0,7 28 0,46Illness duration (months) 31,8 21,98 29,1 17,9 0,4 28 0,72Duration of untreated psychosis (months) 8 5,17 8,8 6,82 0,4 28 0,72Previous hospitalizations (median) 1 1 1 1 0,7 28 0,5

N % N % X DF pGender 0 1 0,85

Masculine 13 81,3% 11 78,6%Feminine 3 18,8% 3 21,4%

Marital status 0,2 1 0,63Single 14 87,5% 13 92,9%Married 2 12,5% 1 7,1%

Socio-economic status NA NA NALow 7 43,8% 4 28,6%Medium-low 7 43,8% 7 50,0%Medium 2 12,5% 3 21,4%

Occupation NA NA NAUnemployed 10 62,5% 8 57,1%Retired 2 12,5% 3 21,4%Students 2 12,5% 0 0,0%Employed 2 12,5% 3 21,4%

Ethnic group 2,9 3 0,41White 10 62,5% 5 35,7%Multiracial (pardo) 4 25,0% 5 35,7%Afro-descendent 2 12,5% 3 21,4%East Asian 0 1 7,1%

DSM-IV diagnosis 1,7 2 0,42Paranoid schizophrenia 14 87,5% 10 71,4%Disorganized schizophrenia 2 12,5% 3 21,4%Undifferentiated schizophrenia 0 0,0% 1 7,1%

Treatment 0,1 1 0,821st generation antipsychotics 4 25,0% 3 21,4%2nd generation antipsychotics 9 56,3% 9 64,3%1st + 2nd generation antipsychotics 1 6,3% 0 0,0%clozapine 2 12,5% 2 14,3%

Groups

SD=standard deviation; N=number of subjects; t=independent samples t-test;X =Chi-squared test; DF= Degrees of freedom; p=statistical significance; DSM-IV=Diagnostic and Statistical Manual, 4th edition; NA=not applied.

Table 1

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