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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS – CAMPUS SOROCABA –
FABIANE SANTANA ANNIBALE
CULTIVO DE PLANÁRIAS (GIRARDIA TIGRINA) E ENSAIOS DE SENSIBILIDADE COM DICROMATO DE POTÁSSIO
SOROCABA – SP
2009
CULTIVO DE PLANÁRIAS (GIRARDIA TIGRINA) E ENSAIOS DE SENSIBILIDADE COM DICROMATO DE POTÁSSIO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS – CAMPUS SOROCABA –
FABIANE SANTANA ANNIBALE
CULTIVO DE PLANÁRIAS (GIRARDIA TIGRINA) E ENSAIOS DE SENSIBILIDADE COM DICROMATO DE POTÁSSIO
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à banca como parte dos requisitos a aprovação
na disciplina (TCC) e
formação da discente.
Orientação: Prof. Dr. André Cordeiro Alves dos Santos
SOROCABA – SP 2009
Annibale, Fabiane Santana
Cultivo de Planárias (Girardia tigrina) e Ensaios de Sensibilidade com Dicromato de Potássio/ Fabiane Santana Annibale. – – Sorocaba, 2009
42 f. Trabalho de Conclusão do Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas
- UFSCar, Campus Sorocaba, 2009. Orientador: Prof. Dr. André Cordeiro Alves dos Santos.
1.Ecotoxicologia. 2. planárias. 3. dicromato de potássio. I. Título. II.
Universidade Federal de São Carlos. Campus Sorocaba.
CDD 574
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do Campus de Sorocaba.
Folha de Aprovação
Fabiane Santana Annibale
Cultivo de Planárias (Girardia tigrina) e Ensaios de Sensibilidade com
Dicromato de Potássio
Trabalho de Conclusão de Curso
Universidade Federal de São Carlos – Campus Sorocaba
Sorocaba, 14/12/2009
Orientador ____________________________________________________________
Prof. Dr. André Cordeiro A. dos Santos
Membro 2 __________________________________________________________
Profa. Dra. Mônica Jones Costa
Membro 3___________________________________________________________
Profa. Dra. Iolanda Cristina S. Duarte
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a minha família – meus pais, meu
irmãozinho (meu orgulho e referência maior) e minha avó – por ter sempre
contribuído para a minha formação, não apenas acadêmica, como também
pessoal, e pelo apoio em minhas decisões. Ao meu gigante companheiro,
parceiro de estudos e alegria incondicional, Shiriú. Também sou grata a todos
os meus amigos que, incluo como parte da minha família, tamanha a
importância que eles possuem em minha vida, e que contribuíram
indiretamente, sendo meu apoio, minha segurança e alegrias. Faço questão de
mencionar alguns deles: Léo, Meg, Sil, Tê, Juguema, Grazi, Fafá, Satie, Bru,
Nata, Vi e Makotito, que estão comigo há um bom tempo, além dos meus
primos Mário e Rê, que além do laço de sangue, são amizades essenciais. Em
especial, agradeço três pessoinhas que se tornaram muito família em tão
pouco tempo: Tha, Thaisão e Alê, que além da amizade ainda tiveram a
paciência de me agüentar por esses quatro anos de faculdade e me ajudaram
diretamente neste trabalho.
Também agradeço ao meu orientador pela paciência, ajuda e pela
oportunidade de trabalhar nessa área do conhecimento, com a qual me
identifico por tratar da conservação do meio ambiente. A professora Iolanda,
por aceitar fazer parte deste processo, sempre tentando ajudar, e agradeço
imensamente à professora Mônica, que é para mim um grande exemplo como
profissional e como pessoa, que além do apoio nos estudos e de ter
contribuído com empréstimo de livros, tem um carinho e cuidado muito
especiais, além de ser completamente prestativa e dedicada.
Ao Gilberto, do Laboratório de Ecotoxicologia Aquática e
Limnologia “Prof. Dr. Abílio Lopes de Oliveira Neto”, por ter cedido as planárias
e por me ajudar na confecção desse trabalho, enviando artigos sobre o
assunto, esclarecendo dúvidas e incentivando.
Ao coordenador do curso, o João, digo, Piratelli – o Pira – pela
compreensão (inclusive em relação aos prazos), atenção, pelo carinho que tem
por nossa turma, incentivando e ajudando a melhorar as pessoas humanas que
somos (ou não). E lógico, pela amizade, que é fruto de boas e longas risadas
Agradeço ainda aos técnicos de laboratório: Renato, Heidi, Almir, Sérgio,
Fernando, e Flávio, pela paciência, ajuda no cuidado com as planárias, com as
matemáticas e químicas na realização dos testes, empréstimo de materiais,
troca de conhecimento, e pela amizade que tornou o ambiente do laboratório
mais alegre e o trabalho ainda melhor, e principalmente a Elen, que me ajudou
muito em tudo isso e ainda pelas caronas divertidas.
Aos motoristas e amigos que ajudaram na obtenção de água
usada no cultivo das planárias, e por ajudar a carregar galões pesados de volta
ao laboratório. E a Ju, vizinha, pelas caronas e momentos divertidos.
À colega de trabalho, Aline Bruzon, por ajudar no cultivo das
planárias e contribuir com material para isso.
A toda turma da minha sala, com a qual já dividi muitas alegrias,
trabalhos, conhecimento, tensões e risadas. E a todos, de outras turmas, que
também ajudaram neste trabalho, incentivando, demonstrando interesse, e
também pela amizade e ótimos momentos juntos, que são indispensáveis.
Faço menção aos amigos da Moradia 01 e da república Madruguetes, que
além de tudo que foi mencionado, sempre me acolheram muito bem, como
integrante de suas casas.
RESUMO
Planárias são organismos sensíveis e têm sido apontadas como
possíveis indicadores da qualidade ambiental. Possuem características
importantes para testes de Ecotoxicologia, como a morfologia simples e a
capacidade de se regenerar, além de serem de fácil manutenção em
laboratório, a baixos custos. Neste trabalho, foram testados e aperfeiçoados
métodos de cultivo de planárias da espécie Girardia tigrina (Girard, 1850) em
laboratório, voltados a testes ecotoxicológicos. Os ensaios realizados testaram
a sensibilidade dessa população a diferentes concentrações de dicromato de
potássio, durante o processo de regeneração desses animais. Inicialmente,
foram feitos testes para conhecer o tempo de regeneração sem adição de
poluentes nas amostras. Para tanto, foram feitos cortes na região posterior às
aurículas das planárias, e individualmente, elas foram colocadas em recipientes
contendo amostras de água. Esses indivíduos foram mantidos em estufa, sem
alimentação e observados diariamente. Os testes foram finalizados quando o
processo de regeneração da região da cabeça foi completo (com formação das
aurículas e ocelos). Os resultados deste primeiro teste mostraram que o tempo
médio para a regeneração da região cefálica foi de 06 dias, e assim deu-se
início aos testes com dicromato de potássio. Foram produzidas diferentes
soluções de dicromato de potássio, variando as concentrações dessa
substância e seguiu-se a mesma metodologia quanto à preparação das
planárias. Os animais foram observados diariamente com a finalidade de
acompanhar mudanças morfológicas, comportamentais e sobrevivência até o
fim do processo de regeneração. Os resultados indicam que o dicromato de
potássio provoca imobilidade a baixas concentrações e pode ser letal, quando
em concentrações maiores que 40 mg/L. A CL50 para essa espécie é
27,49mg/L e foi determinada com auxílio de um programa estatístico. Não foi
possível avaliar os efeitos dessa substância sobre o tempo de regeneração dos
organismos, pois os dados obtidos não foram quantificáveis.
Palavras-chave: Ecotoxicologia; planárias; dicromato de potássio.
ABSTRACT
The flatworms are sensitive organisms and have been identified
as good indicators of environmental quality. They have useful characteristics in
Ecotoxicology testing, as the simple morphology and the ability to regenerate,
and they are also easy to maintain in the laboratory at low cost. In this study
were tested cultivation methods of flatworms Girardia tigrina (Girard, 1850) in
laboratory focused on Ecotoxicology tests. It was analyzed the sensitivity of this
specie to different concentrations of potassium dichromate, measured by
regeneration process of these animals. Initially, tests were made with water
from an artesian well, used in the cultivation of organisms, to obtain data in the
time of regeneration without the addition of pollutants in the samples (controls).
For this, sections were made at the posterior region of the flatworms atria, and
they were individually placed in containers of water samples (cultivation). These
individuals were kept in a stove, without food and they were observed daily. The
tests were ended when the process of regeneration of the head was completed
(with formation of the atria and eyespots). The results of this first test
determined the medium (average) time of cephalic regeneration as 6 days and
then the tests with potassium dichromate were performed. For this, different
solutions of potassium dichromate were used with varying concentrations,
following the same methodology used to controls. The animals were observed
daily in order to monitor morphological changes, activity or mortality until the
end of the regeneration process. The results indicate that potassium dichromate
is toxic even at low quantities for these organisms, causing immobility or being
lethal in concentrations above 40 mg/L. The LC50 (27.49 mg /L) was found with
the aid of a statistical program. It was not possible to make statements about
the effects of potassium dichromate on the time of regeneration of this species
of flatworm, because the data were not quantifiable.
Key-words: Ecotoxicology; flatworms; planarians; potassium dichromate.
LISTA DE TABELAS TABELA 1. Número de organismos expostos e mortalidade para as concentrações de dicromato de potássio (mg/L) em 9 dias. TABELA 2. Tempo de regeneração da região cefálica
TABELA 3. CL50, em mg/L, de alguns organismos aquáticos
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. (a) Sistema nervoso, ilustrando o gânglio cerebral, os cordões
nervosos longitudinais e as conexões entre eles; (b) sistema reprodutor,
mostrando a presença de estruturas femininas e masculinas no mesmo
indivíduo (hermafroditismo).
FIGURA 2. Girardia tigrina (Girard, 1850)
FIGURA 3. Esquema do processo de corte para obter a regeneração cefálica
em planárias. a = aurículas, es = ocelos (eyespots), ab = blastema anterior
(Calevro et al., 1998).
FIGURA 4. Indivíduo sem a região da cabeça
FIGURA 5. Esquema da metodologia realizada para o teste de sensibilidade:
os círculos correspondem às soluções preparadas com as concentrações
correspondentes, em mg/L; os quadrados correspondem, cada um, a 1
recipiente contendo 100 mL de solução e 1 organismo-teste sem a região
cefálica.
FIGURA 6. Início do processo de regeneração: desenvolvimento da região da
cabeça FIGURA 7. Desenvolvimento da região da cabeça (2º dia)
FIGURA 8. Desenvolvimento da região da cabeça (4º dia)
FIGURA 9. Regeneração cefálica completa (6º dia).
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
1. CE50 ou CL50 – Concentração Efetiva ou Letal Inicial Mediana:
concentração nominal do agente tóxico, no início do teste que causa efeito
agudo (letalidade ou imobilidade) a metade dos organismos-teste (50%) num
período de tempo determinado de exposição.
2. DDT – Diclorodifeniltricloretano: pesticida contra pragas agrícolas e doenças
transmitidas por insetos.
SUMÁRIO
1. Introdução ................................................................................................. 13
2. Objetivos ................................................................................................... 23
3. Material e Métodos .................................................................................... 23
3.1. Bioensaios ........................................................................................... 23
3.1.1. Organismos-teste ......................................................................... 23
3.1.2. Teste de Sensibilidade ................................................................. 26
4. Resultados e Discussão ............................................................................ 30
5. Conclusão ................................................................................................. 37
6. Referências ............................................................................................... 38
13
1. Introdução
O meio ambiente é composto por componentes bióticos e
abióticos, que embora possam ser distinguidos separadamente, completam-se
de modo que não existem isoladamente. A vida está intimamente ligada ao
ambiente físico, de modo que o afeta e modifica, funcionando dentro dos limites
estabelecidos por ele – ar, solo, água (RICKLEFS, 2003).
A água tem propriedades essenciais à manutenção da vida,
sendo um excelente meio para que ocorram reações químicas, dissolvendo
várias substâncias que ficam acessíveis aos seres vivos e que ainda podem
reagir entre si transformando-se em outros compostos. Além disso, suas
características são responsáveis pela regulação do metabolismo de corpos
hídricos, permitindo à biota o desenvolvimento de muitas adaptações que
proporcionam a produtividade aquática.
Em países do hemisfério norte, os lagos são geralmente formados
por catástrofes naturais, como glaciações, atividade vulcânica ou tectônica.
(WETZEL, 1993). No Brasil, entretanto, a maioria desses ambientes são
formados artificialmente (reservatórios) pelo aprisionamento das águas de rios
para fins de abastecimento público, geração de energia ou ainda pelo
enchimento de lagos de mineração, entre outros (SPERLING; JARIDN;
GRANDCHAMP, 2004).
As propriedades dos sistemas lacustres (produtividade,
substâncias dissolvidas, pH, entre outros) são importantes para a regulação da
fisiologia e comportamento dos organismos aquáticos, os quais exercem
controle importante sobre o meio ambiente. Existem mecanismos pelos quais
os organismos interagem com o ambiente onde vivem, tornando-os
especializados a intervalos estreitos de condições ambientais. Alterações
nessas condições podem significar impactos sobre todo o sistema lacustre,
pois interferem nos fatores que regulam o metabolismo e produtividade dos
14 lagos e, conseqüentemente, dos organismos que o compõem (RICKLEFS,
2003).
Estas alterações nos ambientes lacustres ocorrem natural e
lentamente, através de carreamento de nutrientes originados nos processos de
lixiviação dos solos e de bacias hidrográficas pelas águas das chuvas.
Entretanto, o efeito das atividades antrópicas aumenta os impactos nestes
sistemas, pela descarga de contaminantes e nutrientes na água, através de
despejo de esgoto, efluentes industriais e arraste superficial de solo em áreas
de agricultura, provocando a degradação da qualidade e a redução da
diversidade de espécies nesses ecossistemas.
A construção de usinas hidrelétricas é um grande exemplo de
alteração do ambiente aquático. No Estado de São Paulo, a maioria das
represas encontra-se eutrofizada pelo despejo de esgotos urbanos não
tratados, além de efluentes industriais e agroindustriais, principalmente nas
regiões mais desenvolvidas (ZAGATTO; BERTOLETTI, 2006).
O crescente impacto ambiental que o ser humano provoca, resulta
do aumento da população e do investimento em tecnologias que intervêm na
natureza para satisfazer as próprias necessidades e desejos, surtindo conflitos
quanto a espaço, recursos naturais e geração de resíduos no meio ambiente. A
Revolução Industrial ocorrida há dois séculos moldou a sociedade atual. A
industrialização é também responsável pela disponibilidade de uma diversidade
de produtos químicos potencialmente tóxicos e a geração de resíduos em
quantidades prejudiciais ao meio ambiente. Esses produtos e a falta de
saneamento básico estão relacionados com a disseminação de doenças de
veiculação hídrica, além de causar grandes impactos a todo o ecossistema
aquático (ZAGATTO; BERTOLETTI, 2006).
O reconhecimento do problema da poluição ocorreu
internacionalmente apenas na década de 1960 e desde então, o interesse da
sociedade por essas questões tem aumentado gradativamente devido,
principalmente a ocorrências de acidentes químicos com repercussão mundial.
O uso indiscriminado do DDT contra pragas e doenças na década de 1940 é
15 um exemplo de grande impacto ambiental, tendo sido responsável pelo declínio
em populações de aves nos Estados Unidos e sendo encontrado até hoje em
águas de regiões distantes do planeta por possuir alta persistência no ambiente
(ZAGATTO; BERTOLETTI, 2006). O DDT foi responsável por muitas outras
conseqüências, descritas no livro “Primavera Silenciosa” da autora Rachel
Carson (lançado em 1962) que descreveu diversos danos ao meio ambiente e
aos seres humanos causados pelo uso desse produto (ALVES, 2008).
Muitos outros acontecimentos que culminaram em intoxicações,
doenças e mortes em diversas regiões do mundo levaram vários países a
tomar medidas, dando início ao monitoramento ambiental e pesquisas para
avaliar o nível de contaminação por metais e orgânicos em efluentes de
diversos ramos industriais e em produtos utilizados em lavouras (ZAGATTO;
BERTOLETTI, 2006).
A água não é o único meio de dispersão de poluentes, mas acaba
sendo o receptor final de resíduos emitidos por outras fontes dispersoras. A
atmosfera, por exemplo, é responsável pela dispersão por longas distâncias de
particulados naturais (como os que são gerados por atividades vulcânicas) ou
antrópicos, de origem industrial, e ainda compostos gasosos. Esses compostos
sofrem alterações na atmosfera, principalmente fotoquímicas, e acabam
chegando aos corpos aquáticos, seja pela deposição direta sobre a superfície
da água ou sobre os solos e coberturas vegetais, sendo posteriormente
transportados para os recursos hídricos por ação das águas das chuvas
(ZAGATTO; BERTOLETTI, 2006).
As fontes de poluição pontuais (efluentes líquidos – esgotos
domésticos, industriais) e difusas (lixiviação de terrenos agrícolas, sedimentos
e águas subterrâneas contaminados, acidentes ambientais, águas das chuvas)
contribuem para as alterações que ocorrem no ambiente, reduzindo a
diversidade de espécies autóctones e aumentando desordenadamente a
densidade de determinadas espécies indesejáveis. Algumas das alterações
provocadas pela poluição são a redução da concentração de oxigênio, a
diminuição da qualidade da água, a morte de organismos aquáticos, como
16 peixes, e alterações na composição das comunidades microbiológicas,
algumas vezes com o predomínio de espécies tóxicas.
Os lançamentos de efluentes líquidos domésticos e industriais
sem tratamento estão entre as maiores fontes de poluição do meio aquático. A
combinação desses efluentes e resíduos, que inadvertidamente acabam sendo
misturados, pode apresentar riscos mais sérios e de difícil controle ou manejo
pela presença de compostos persistentes ou recalcitrantes. Muitas vezes a
interação entre compostos ou mesmo o processo natural de degradação
podem intensificar o efeito de substâncias pouco tóxicas ou produzir
subprodutos com toxicidade mais elevada.
Os agentes químicos lançados por esses efluentes possuem
formas complexas de interação e produzem efeitos biológicos que não podem
ser analisados separadamente por métodos tradicionais. Para isso, são
necessários estudos integrados que envolvem análises físicas, químicas e
ecotoxicológicas (ZAGATTO; BERTOLETTI, 2006).
Os primeiros testes de toxicidade com despejos industriais
tiveram início no século XIX, porém apenas na década de 1930 foram
implementados testes de toxicidade aguda em organismos aquáticos a fim de
estabelecer a relação causa/efeito de substâncias químicas e despejos
líquidos. No final do século XX, com o aumento de casos e a geração de
informações sobre a toxicidade ambiental, foram intensificadas pesquisas para
o desenvolvimento de testes bioquímicos, biossensores e biomarcadores, o
controle da poluição hídrica e testes ecotoxicológicos para estabelecer padrões
de qualidade da água e lançamento de efluentes líquidos no monitoramento
dos recursos hídricos. (ZAGATTO; BERTOLETTI, 2006).
A ecotoxicologia é a ciência que estuda os efeitos de uma ou mais
substâncias a uma população ou comunidade de organismos, ou seja, ela
integra a ecologia e a toxicologia, juntando conceitos de diversidade e
representatividade dos organismos em relação a sua importância no meio
ambiente com os efeitos dos agentes poluidores nas comunidades biológicas
(BLAISE, 1984).
17
Os estudos ecotoxicológicos são direcionados de forma a
seguirem três seqüências: estudo das emissões e entradas de poluentes no
ambiente abiótico, distribuição e destino nos diferentes compartimentos; estudo
da entrada e destino dos poluentes nas cadeias biológicas e suas formas de
transferência como alimento via cadeia trófica; e estudo qualitativo e
quantitativo dos efeitos tóxicos dos poluentes no ecossistema (TRUHAUT,
1977). A ecotoxicidade deve ser estudada levando-se em conta a interação e
magnitude de vários agentes presentes num ambiente (e não desses
compostos isoladamente) e o termo é definido como um fator capaz de
perturbar o equilíbrio dos organismos e o seu meio (BLAISE, 1984).
Segundo Zagatto e Bertoletti (2006), as propriedades inerentes
aos agentes químicos, como a transformação que eles podem sofrer no
ambiente, potencialidade para bioacumulação, persistência e concentração
ambiental, os processos metabólicos dos organismos (absorção, distribuição,
excreção e destoxificação) determinam o efeito específico num determinado
alvo, seja ele um órgão, um indivíduo, uma população ou uma comunidade. Os
diversos efeitos dos poluentes sobre os organismos vivos podem ser
quantificados por meio de vários critérios como: número de indivíduos mortos,
taxa de reprodução, comprimento e massa corpórea, alterações morfológicas,
incidência de tumores, alterações fisiológicas, densidade e diversidade de uma
espécie numa comunidade biológica, entre outros meios.
O conhecimento sobre as propriedades físicas e químicas dos
contaminantes sejam eles orgânicos ou inorgânicos, é interessante para muitos
fins, como prever onde a concentração desses compostos será maior e para
conhecer o comportamento desses contaminantes a fim de estimar as
concentrações de uma substância química e sua especiação nos diferentes
compartimentos ambientais. Além disso, com o auxílio de dados
ecotoxicológicos, pode-se compreender melhor o significado das
concentrações que são encontradas em diferentes compartimentos do
ecossistema e o porquê de alguns íons apresentarem maiores riscos
ambientais quando despejados no meio ambiente, entre os tantos outros
milhares que também são.
18
A quantidade e a dose de um toxicante, disponíveis para um
organismo em um compartimento ambiental, dependem da quantidade liberada
no ambiente, da que desapareceu do depósito e de fatores como dispersão,
transporte e bioacumulação (MCKINNEY, 1981).
Para que se possa caracterizar uma substância química é preciso
medir sua concentração em diferentes compartimentos do ambiente (solo,
água, ar e sistemas biológicos), compreender o movimento e o transporte
dentro desses compartimentos e entre eles, e seguir a substância química em
todo o processo de sua transformação, degradação, acumulação e
concentração em cada compartimento. Uma substância química que é liberada
no ambiente está particionada entre cada compartimento ambiental e a biota
que reside nele. Finalmente essa substância atinge um local ativo no
organismo numa concentração suficiente para induzir um efeito (KENDALL et
al., 2001).
Em um ambiente aquático nem todos os materiais dissolvidos e
particulados ficam livres. Existem compostos que se associam aos particulados
suspensos que já existem no ambiente, e posteriormente, tendem a se
decantar, fazendo parte dos sedimentos, que constituem o maior sumidouro
desses materiais. Alguns autores, como Balls (1989), ressaltam que não é
eficiente investir em monitoramento de águas naturais para metais pesados, já
que esses compostos possuem sumidouros nos particulados. Alguns deles
quase não são encontrados na água tamanha a força dos particulados
(ZAGATTO; BERTOLETTI, 2006).
Mesmo que os contaminantes associem-se aos sedimentos, eles
continuam sendo um risco aos organismos de vida aquática, já que muitos
animais ingerem esses particulados devido aos hábitos alimentares, e assim, a
toxicidade a essas espécies pode ser manifestada. Com isso, é importante
avaliar também o potencial de bioconcentração (ingresso dos contaminantes do
meio externo a alimentos) e a biomagnificação nos organismos – aumento da
concentração do contaminante ao longo da cadeia alimentar (KENDALL et al.,
2001), que considera a alimentação como o principal meio de aporte, assim, os
19 organismos que se encontram em níveis tróficos mais altos concentram
maiores quantidades desses poluentes (BUTLER, 1978).
Além da bioconcentração e biomagnificação, os contaminantes
podem sofrer um processo conhecido como degradação (ou transformação),
que consiste no desaparecimento do composto original do ambiente devido a
alguma alteração em sua estrutura química (AZEVEDO; CHASIN, 2004).
Esse fenômeno diz mais respeito a compostos orgânicos, tanto de
origem interna aos ecossistemas aquáticos (oriundos da degradação de outros
mais complexos dentro do próprio ecossistema), como externa (transportados
ao sistema aquático). Quando esse processo de degradação envolve
microrganismos, é chamado de biodegradação e ocorrem por reações em
cadeia, como hidrólises, desalquilação, ruptura de anéis e condensação, por
exemplo (ZAGATTO; BERTOLETTI, 2006).
Nos sistemas aquáticos os organismos podem estar expostos a
muitos ou uma mistura de diferentes substâncias ao mesmo tempo ou quase e
esse deve ser o primeiro aspecto a ser considerado quando são avaliados os
efeitos induzidos por contaminantes químicos à biota, pois as respostas
biológicas podem ser quanti e qualitativamente deferentes das que são
esperadas pela ação dos contaminantes isolados (RAND et al., 1995).
Existem dois tipos de ensaios de toxicidade: os que são
realizados em campo e os realizados em laboratório. Ambos devem ser
utilizados quando os procedimentos de ensaio forem validados e os dados
obtidos por diferentes laboratórios mostrarem que os testes apresentam boa
repitibilidade e reprodutibilidade dos resultados, utilizando espécies
ecologicamente importantes e sensíveis, como sugerem Rand e Petrocelli
(1985).
Muitos trabalhos discutem as vantagens e desvantagens dos dois
tipos de ensaios, comparando os resultados entre eles para saber qual é mais
padronizável, qual é menos oneroso e se há correlação entre os dados, pois
alguns resultados desses testes apresentaram correlação, enquanto outros não
(CLEMENTS; KIFFNEY, 1996).
20
Em condições de laboratório são utilizadas diversas espécies de
organismos nos ensaios de toxicidade, e as condições que requerem são
básicas mesmo para espécies distintas, como condições de pH, temperatura,
fotoperíodo, oxigênio dissolvido, duração do teste, entre outros. São utilizados
organismos-testes, os quais são expostos às amostras a serem testadas em
frascos-teste (sejam cubas de vidro, béqueres, tubos de ensaio ou outros), e os
organismos-controle, que não são expostos às amostras, sendo mantidos em
frascos-controle para que seja feita a avaliação da viabilidade do lote de
organismos expostos. Após o período do teste é verificado se houve efeito das
amostras sobre os organismos expostos com relação a alguns parâmetros
biológicos, que podem ser: mortalidade, crescimento, regeneração,
reprodução, comportamento, diferenças na pigmentação, entre outros
(ZAGATTO; BERTOLETTI, 2006).
O uso de organismos monitores é essencial para a gestão dos
recursos hídricos, pois representa uma forma de vigilância corrente e contínua
na proteção da saúde e no equilíbrio do ecossistema (AZEVEDO; CHASIN,
2004). É importante que eles tenham sensibilidade relativamente constante a
uma diversidade de agentes químicos para obterem-se resultados mais
precisos. Também é necessário haver conhecimentos prévios sobre a biologia
da espécie (como reprodução, hábitos alimentares, fisiologia e comportamento,
tanto para o cultivo como para a realização dos testes). Em laboratório os
animais pequenos e de curto ciclo de vida são os mais recomendáveis para os
testes ecotoxicológicos (ZAGATTO; BERTOLETTI, 2006).
A disponibilidade dos organismos é outro critério de seleção, já
que espécies que estão presentes em épocas restritas ou em pequenos
números não devem ser escolhidas para a realização dos testes. Espécies que
podem ser cultivadas em laboratório atendem a esse critério. Os organismos
testes usados em ensaios ecotoxicológicos possuem papel importante à
estrutura e funcionamento das biocenoses e ainda têm valor comercial
(ZAGATTO; BERTOLETTI, 2006).
É importante buscar espécies com estabilidade genética e que
possibilitem a obtenção de lotes uniformes dos organismos, além disso,
21 espécies com ampla distribuição geográfica também são recomendadas.
Podem ser citados como alguns dos organismos mais usados nos ensaios
ecotoxicológicos as microalgas, os crustáceos, os moluscos, os equinodermos,
as bactérias e os peixes (ZAGATTO; BERTOLETTI, 2006).
As planárias (filo Platyhelminthes) têm sido utilizadas em estudos
para monitorar a qualidade de ambientes aquáticos (NRC, 1991) e são
apontadas como modelos para avaliar contaminantes ambientais (TEHSEEN et
al., 1992), inclusive os persistentes (tais como metais pesados), e
investigações neurofarmacológicas (SEEGAL; HANSEN, 1991; VILLAR;
SCHAEFFER, 1993). São muito úteis para esses estudos por serem
morfologicamente simples e pela capacidade de se regenerar (SÁNCHEZ
ALVARADO; NEWMARK, 1999). Além disso, são organismos de fácil
manutenção e baixo custo em laboratório, podendo ser usadas para testes de
ecotoxicologia, além de outros testes, como carcinogênese e teratogênese
(GUECHEVA, HENRIQUES, ERDTMANN, 2001, PRÁ et al, 2005).
São organismos carnívoros, alimentando-se de corpos de animais
mortos que chegam ao substrato (RUPPERT et al., 2005) ou invertebrados
pequenos, como larvas. Nesse último caso, as planárias nadam ativamente à
procura da presa, liberando muco para imobilizá-las e ingeri-las (MEXER;
LEARNED, 1981). Elas possuem simetria bilateral e são acelomadas, sendo
limitadas pela difusão para obter oxigênio (RUPPERT, op cit). A maioria delas é
hermafrodita, podendo haver reprodução pelo processo de regeneração; por
método clonal – fissão transversal (ou longitudinal em alguns casos) e
brotamento; ou ainda sexuadamente por fertilização cruzada e interna
(HYMAN, 1951), havendo produção de ovos com desenvolvimento direto
freqüentemente (RUPPERT et al., 2005).
Esses animais apresentam cefalização e possuem capacidade de
regeneração completa e funcional do órgão nervoso central (SNC) (REUTER et
al., 1996; UMESONO et al., 1997; CEBRIÀ et al., 2002; INOUE et al., 2004), o
qual corresponde a dois cordões nervosos ventrais que acompanham
longitudinalmente o corpo desses animais (e se conectam em intervalos
regulares por comissuras transversais, e junto aos cordões, dão a impressão
22 de um sistema nervoso segmentado), agregando-se no interior do organismo
para formar um gânglio cefálico, o qual processa informações recebidas de
estruturas sensoriais.
Figura 1. (a) Sistema nervoso, ilustrando o gânglio cerebral, os cordões nervosos longitudinais e as conexões entre eles; (b) sistema reprodutor, mostrando a presença de estruturas femininas e masculinas no mesmo indivíduo (hermafroditismo).
O processo de regeneração consiste em dois grupos de células: o
primeiro formado por células ectodérmicas, derivadas da epiderme, que cobre
a superfície lesionada após a amputação/fissura; e o segundo corresponde a
uma massa de neoblastos em forma de domo, o blastema. Essas células se
proliferam e se acumulam sob a região lesionada da epiderme, diferenciando-
se na parte perdida do corpo do animal. A plasticidade das planárias é
observada na capacidade de aumentar e diminuir o tamanho do corpo
dependendo da disponibilidade de alimento (BAGUÑÀ et al., 1990).
Este trabalho utilizou planárias da espécie Girardia tigrina (Girard,
1850), como organismo modelo para testes ecotoxicológicos por estas serem
cerebral
Poro genital
a
b
Ovário Testículo Oviduto
Pênis
Cordão nervoso
Gânglio
23 organismos sensíveis, de fácil manutenção em laboratório, baixo custo e pela
capacidade de regeneração, apresentando resultados em curtos períodos de
tempo. Assim, os estudos que envolvem animais em testes ecotoxicológicos
têm grande importância para a manutenção dos corpos aquáticos, já que
contribuem com dados importantes sobre as respostas dos organismos aos
compostos que são lançados nos recursos hídricos, servindo como base para a
tomada de medidas que visem melhorar a qualidade ambiental e a
conservação do meio ambiente.
2. Objetivos
Testar e aperfeiçoar o método para cultivo de Planárias Girardia
tigrina (Girard, 1850) em laboratório voltado a testes
ecotoxicológicos.
Testar a sensibilidade desta população à substância de referência
(Dicromato de Potássio - K2Cr2O7).
3. Material e Métodos
3.1. Bioensaios
3.1.1. Organismos-teste
As planárias utilizadas nesse trabalho são da espécie Girardia
tigrina (Girard, 1850) – ordem Tricladida (Figura 1). Elas são amplamente
distribuídas do Atlântico ao Pacífico, nos Estados Unidos, Brasil, Alemanha e
Japão, sendo encontradas em córregos, lagoas e lagos (KENK, 1976), presas
a macrófagas ou sob pedras nas margens dos rios (KENK, 1944). Os
indivíduos dessa espécie variam de 06 a 12 mm nas cores que vão de cinza a
tons de marrom. Embora essa espécie possua um grande potencial de
24 regeneração, alguns fatores como a presença de substâncias químicas na
água (como o cloro), alimentação inadequada ou insuficiente, ação de
predadores e falta de umidade, podem levá-las à morte.
Essa espécie de planária pode ser considerada um importante
controlador de pragas, pois se alimenta de larvas de mosquito, inclusive do
gênero Aedes. Em um estudo realizado por Andrade e Santos (2004), na
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), constatou-se que a espécie
Girardia tigrina foi eficiente no controle da espécie de mosquito A. albopictus,
que coloniza pneus, tendo sido inclusive distribuída em um curso a professores
da rede municipal de Campinas, para que os participantes criassem e
monitorassem essa espécie de planárias (predadora) em armadilhas nas
escolas.
Figura 2. Girardia tigrina jovem (Annibale, F., 2009).
A população utilizada nesse projeto foi cedida pelo Laboratório de
Ecotoxicologia Aquática e Limnologia “Prof. Dr. Abílio Lopes de Oliveira Neto”
do CESET-UNICAMP em Limeira e cultivadas no Laboratório de Microbiologia
Ambiental da UFSCar – Campus Sorocaba.
O cultivo foi feito em recipientes com 1,2L, aproximadamente, de
água de poço artesiano, com aeração. A alimentação foi feita duas vezes por
semana com fígado bovino, colocando-se um cubo de 05g em cada recipiente
e retirando-o, com uso de pinça, após o afastamento dos animais (os pedaços
25 de fígado foram mantidos em congelador no laboratório, mas eram
descongelados antes de serem colocados nos recipientes). Após a
alimentação, as planárias foram transferidas a potes limpos, com auxílio de um
pincel (de cerdas macias), para que os que os recipientes de cultivo fossem
lavados e a água trocada. Por fim os organismos foram devolvidos aos
recipientes de cultivo.
Os ovos dos animais foram retirados dos recipientes de cultivo e
mantidos em recipientes menores, sem troca de água. Quando eclodiram, os
organismos jovens foram transferidos para outro recipiente, recebendo a
mesma alimentação que os adultos. Essa separação aconteceu, porque os
organismos jovens são muito pequenos, de difícil observação e manuseio.
Inicialmente eles eram transferidos aos recipientes onde eram criados os
adultos quando atingiam tamanho de fácil identificação a olho nu, porém, a
partir de junho (2009), os indivíduos jovens foram criados separadamente para
que em futuros estudos possam ser analisadas possíveis diferenças entre os
organismos oriundos de reprodução sexuada dos organismos que se
reproduzem assexuadamente.
Para determinar o tempo de regeneração dos organismos, foram
selecionadas 05 planárias adultas com morfologia semelhante e com tamanho
entre 1,0 e 1,2 cm. Elas passaram por um período de 72h sem alimentação
antes dos experimentos.
Os experimentos foram iniciados com a remoção da cabeça dos
animais, na região posterior às aurículas (Figuras 2 e 3), com auxílio de um
bisturi. Os organismos foram colocados individualmente em recipientes de vidro
contendo 100 ml de água (usada no cultivo) e mantidos em uma estufa, à
temperatura de 23ºC e fotoperíodo de 12h, até o fim do processo de
regeneração – não havendo alimentação dos animais durante esse tempo.
26
Figura 3. Esquema do processo de corte para obter a regeneração cefálica em planárias. a = aurículas, es = ocelos (eyespots), ab = blastema anterior (Calevro et. al., 1998).
Figura 4. Indivíduo sem a região cefálica (Annibale, F., 2009).
Foram feitas observações diárias para acompanhar as mudanças
nos organismos durante o processo de regeneração, com o auxílio de uma
lupa, atentando à regeneração da região da cabeça, aurículas e ocelos.
3.1.2. Teste de Sensibilidade
O controle da sensibilidade dos organismos, com uso de
substâncias de referência, é um procedimento que permite maior precisão e
confiabilidade nos resultados obtidos ao longo do tempo, seja em um
27 laboratório ou entre eles. Com essa finalidade, usou-se o dicromato de potássio
para testar a sensibilidade das planárias neste estudo.
O dicromato de potássio (K2Cr2O7) corresponde a um sal
inorgânico solúvel em água. É um sólido cristalino vermelho-alaranjado, usado
como agente de oxidação analítico na indústria química, na produção de latão,
pirotécnica, explosivos, tecidos, corantes, tratamento de couro e da madeira,
entre outros. Pode ser cancerígeno, além de causar diversos danos à saúde
humana (o pó é irritante para olhos, nariz e garganta e sua inalação pode
implicar dificuldades respiratórias; o sólido pode provocar queimaduras na pele
ou, se ingerido, náuseas, vômitos e perda de consciência), requerendo
cuidados no manuseio. No meio ambiente, pequenas concentrações podem
causar distúrbios a vários organismos, como a paralisação das atividades ou
mesmo levar à morte (CETESB, 2009).
A definição de endpoints é fundamental em estudos de
ecotoxicologia. Eles correspondem aos efeitos biológicos que podem ser
medidos e aceitos como indicadores da toxicidade de uma substância
(indicadores analíticos). Existem alguns critérios para identificar os endpoints
mais adequados, como sensibilidade à dose, magnitude do efeito e se ele é ou
não reversível (USEPA, 1989). No caso deste trabalho o endpoint estabelecido
inicialmente era a morte dos indivíduos (efeito agudo), ou o atraso na formação
da região cefálica (efeito crônico). Além disso, definiu-se que a cefalização
completa desses organismos seria alcançada assim que as aurículas e ocelos
estivessem formados, mesmo não havendo ainda pigmentação da região
cefálica.
No primeiro teste, foram definidas concentrações de dicromato de
potássio próximos a 10mg/L (baseando-se em dados de CE50 para
invertebrados aquáticos, como Daphnia magna: CE50 de 0,16mg/L, em teste
de toxicidade aguda, por 24h).
Foi feita uma solução com concentração estoque de 10 mg/L (500
mL) que foi diluída para a produção das concentrações de 1mg/L, 0,1mg/L,
0,01mg/L e 0,001mg/L.
28
Para o preparo da solução inicial, pesou-se a quantidade de 5 mg
de dicromato de potássio em uma balança de precisão. O produto foi misturado a
500 ml de água de cultivo em um béquer, formando uma solução concentrada. A
partir dela, foram feitas diluições com auxílio de provetas, para obter soluções
menos concentradas de 1mg/L, 0,1mg/L, 0,01mg/L e 0,001mg/L – passando-se
10% do volume das soluções mais concentradas para uma proveta e
completando com água até obter o volume final.
Utilizou-se o cálculo de concentração (C1V1=C2V2) para saber o
volume da solução concentrada que deveria ser retirado para obter soluções
menos concentradas, no caso 10%, pois corresponde a razão entre as
concentrações.
Os testes foram feitos em triplicata, em recipientes contendo 100
mL da solução de dicromato de potássio O controle foi feito também em
triplicata com 100 mL de água de cultivo.
As planárias utilizadas não receberam alimentação por um
período de 72 horas anteriores ao teste. O teste teve início com a retirada da
região da cabeça dos animais e em cada recipiente foi colocado um desses
indivíduos. Os animais foram mantidos em estufa, à temperatura de 23ºC e
fotoperíodo de 12h, até o fim do processo de regeneração – não havendo
alimentação dos animais durante esse tempo.
O processo foi acompanhado com observações diárias com
auxílio de uma lupa quanto à mortalidade, mudanças morfológicas e
comportamentais, e também foram feitas fotografias para o registro do
processo.
Em um segundo teste utilizou-se concentrações maiores de
dicromato de potássio de 100 mg/L e 50 mg/L. Como a razão entre as
concentrações é de 50%, preparou-se uma solução inicial de 50mg de
dicromato de potássio em 500 mL de água de cultivo (correspondendo a 100
mg/L). Dessa solução, retirou-se 150 ml de seu volume para produzir a solução
menos concentrada, completando com 150 mL de água de cultivo (assim,
obteve-se 300mL de solução com concentração duas vezes menor que a
29
10
10%
10%
10%
10%
1
0,1
0,01
0,001
primeira, seguindo a razão de 50%). Com exceção dessa mudança no preparo
das soluções, seguiu-se a mesma metodologia utilizada no teste inicial (100mL
em triplicata).
Em um último teste, com a finalidade de conhecer os efeitos
desse composto químico (CE50 ou CL50) em intervalos mais estreitos entre as
concentrações, utilizou-se a mesma metodologia para os testes, com
concentrações de 40, 30 e 20mg/L. Depois da exposição os organismos-teste
não foram mais utilizados em testes futuros, pois podem apresentar
mutagenicidade ou teratogenicidade. O dicromato de potássio utilizado para a
realização dos testes e o volume que sobra após o fim destes foram separados
para descarte adequado.
A figura 5 corresponde ao esquema de como foi realizada a
metodologia para o teste de sensibilidade. Nela, é ilustrado o primeiro teste,
que partiu de 10 mg/L para as soluções mais diluídas. Os outros testes de
sensibilidade (com concentrações de 20 a 100 mg/L) foram feitos seguindo o
mesmo esquema.
30
Figura 5. Esquema da metodologia realizada para o teste de sensibilidade: os círculos correspondem às soluções preparadas com as concentrações correspondentes, em mg/L; os quadrados correspondem, cada um, a 1 recipiente contendo 100 mL de solução e 1 organismo-teste sem a região cefálica.
4. Resultados e Discussão
Com a realização dos testes, obteve-se o primeiro endpoint
estabelecido, a mortalidade dos organismos. Para as concentrações de 20mg/L
e abaixo desta, não houve efeito letal dessa substância sobre os animais
amostrados, enquanto para valores superiores a 40mg/L, houve 100% de
mortalidade em 04 dias. O valor mais aproximado de CL50 foi para a
concentração de 30mg/L, para a qual houve a morte de dois indivíduos e
sobrevivência de um. Para estabelecer estatisticamente o valor de CL50 para
essa espécie, utilizou-se o programa Trimmed Spearman-Karber (TSK)
Program Version 1.5, que calcula o CL50 e os intervalos de confiança acima e
abaixo desse valor a partir dos dados fornecidos (concentrações, duração dos
testes, nome da espécie, mortalidade, entre outros), além de apresentar os
dados informados de forma relacionada, como mostra a Tabela 1.
Tabela 1. Número de organismos expostos e mortalidade para as concentrações de
dicromato de potássio (mg/L) em 9 dias.
Concentração (mg/L) Número Mortalidade
1 3 0
10 3 0
20 3 0
30 3 2
40 3 3
31
50 3 3
100 3 3
Com essa ferramenta estatística, foi possível estabelecer que o
valor de CL50 para essa espécie de planária é de 27,49 mg/L.
Em relação à regeneração das planárias (Figuras 06 a 09),
observou-se no bioensaio inicial, sem utilização de substâncias tóxicas, que o
tempo médio para a regeneração da região cefálica é de 06 dias (Tabela 2).
Tabela 2. Tempo de regeneração da região cefálica
Indivíduos Tempo (dias)
1 6
2 5
3 6
4 6
5 7
Média 6
Além disso, observou-se que o processo de regeneração
aconteceu em todas as amostras de dicromato de potássio, porém, não é
possível afirmar se essa substância exerce influência sobre o tempo que os
animais levam para completar a regeneração (se provocou atraso), pois não
foram feitas avaliações individuais, nem entre as diferentes concentrações.
Também foram observadas mudanças comportamentais nos
indivíduos submetidos às concentrações acima de 1mg/L em relação ao
controle (os quais tendem a se deslocar rapidamente na direção oposta à luz),
32 apresentando maior imobilidade e respondendo apenas a contatos mecânicos
(com auxílio de um pincel). Quanto maior a concentração de dicromato de
potássio, mais lentas eram as respostas dos animais ao contato (deslocando-
se em velocidades mais baixas em comparação aos organismos-controle).
Figura 6. Início do processo de regeneração: desenvolvimento da região cefálica
(Annibale, F., 2009).
33
Figura 7. Desenvolvimento da região da cefálica (2º dia) (Annibale, F., 2009).
Figura 8. Desenvolvimento da região cefálica (4º dia) (Annibale, F., 2009).
Figura 9. Regeneração cefálica (6º dia) (Annibale, F., 2009).
34
A Tabela 3 mostra os resultados de outros estudos que testaram
o dicromato de potássio como substância de referência para conhecer a
sensibilidade de outros organismos.
Tabela 3. CL50 de alguns organismos aquáticos para dicromato de potássio
ORGANISMOS CL50 (mg/L); 96h
Peixes (CETESB, 1980)
Danio rerio 90
Cheirodon notomelas 96
Microcrustáceos (Buratini et al., 2004)
Daphnia similis 0,239*
Daphnia magna 0,195*
Insetos de água doce (USEPA, 1984)
Chironomus tentans 61
Cnidários (Aguilar et al., 2002)
Hydra attenuata 6,25
Hydra viridissima 3,55
Gastrópode (USEPA,1984)
Physa heterostropha 16,80
* CE50; 24h.
Com esses dados, foi possível fazer comparações com os
resultados obtidos neste trabalho. Em relação a microcrustáceos, essa espécie
de planária possui sensibilidade menor, sofrendo os efeitos do dicromato de
potássio em concentrações mais altas. Entretanto, elas foram mais sensíveis
que algumas espécies de peixes e insetos aquáticos, muito utilizados em
35 ensaios de ecotoxicologia (quando submetidas às mesmas concentrações de
CL50 para peixes e insetos aquáticos, as planárias apresentam 100% de
mortalidade).
A escolha dos estágios de vida dos organismos também produz
resultados interessantes que podem ser comparáveis. Em um trabalho
realizado com organismos jovens de Girardia tigrina, feito por Preza e Smith
(1999), foram selecionados apenas indivíduos com no máximo 10 dias de vida
e 04 mm de comprimento. Os animais foram submetidos a várias
concentrações de dicromato de potássio e o valor de CL50 encontrado para o
tempo de 10 dias foi de 5,1mg/L, cerca de 5 vezes menor que os resultados de
CL50 obtidos neste trabalho para 09 dias (27,49mg/L), mostrando que a
sensibilidade de organismos jovens dessa espécie é menor do que a de
organismos adultos.
A metodologia adotada mostrou-se eficiente, fácil de ser realizada
e de baixo custo, produzindo resultados importantes para a continuação de
estudos nessa área. A espécie utilizada neste trabalho segue os critérios de
seleção, como disponibilidade, baixos custos para o cultivo e para os ensaios,
respostas em tempos curtos aos compostos químicos, são animais pequenos,
sensíveis, com biologia bem conhecida e morfologia simples. Além disso, a
sensibilidade de Girardia tigrina ao dicromato de potássio é intermediária a de
outros organismos que já são utilizados em ensaios ecotoxicológicos, como foi
visto na Tabela 3. Esse resultado é interessante, pois mostra que essa espécie
de planária não é tão sensível como microcrustáceos e cnidários, e nem tão
resistentes como peixes a essa substância, evidenciando seu potencial para
ser usada como bioindicador em testes de ecotoxicologia. Por ser um
organismo encontrado no Brasil, sua importância é ainda maior por
disponibilizar dados sobre as atividades impactantes do país, as quais podem
provocar efeitos negativos para essa espécie e ainda se agravarem ao longo
da cadeia alimentar (efeito de biomagnificação), já que as planárias servem de
alimento para outros animais, como alguns peixes.
As respostas obtidas por esses organismos nos testes são
importantes para demonstrar empiricamente que o dicromato de potássio é
36 prejudicial para a vida aquática, mesmo que em baixas concentrações, além de
ser uma possibilidade para a continuidade de futuros estudos nessa área e
com esses organismos, gerando dados que podem contribuir para tomada de
decisões que visem à proteção dos ambientes naturais e da biodiversidade.
Entretanto ainda são necessários aperfeiçoamentos nas
metodologias que foram desenvolvidas neste trabalho. Primeiramente, quanto
ao cultivo dos organismos, é necessário conhecer o ciclo de vida dessa
espécie, pois assim pode-se definir com mais precisão o estágio ontogenético
dos indivíduos selecionados para os testes.
Propõe-se que para a realização de trabalhos futuros sobre o
processo de regeneração dessa espécie, sejam feitas análises individuais dos
organismos utilizados nos ensaios para a obtenção de dados quantificáveis,
que poderão fornecer resultados mais confiáveis sobre o efeito do dicromato de
potássio sobre o processo de regeneração, sendo analisados estatisticamente.
Por exemplo, podem-se fazer medições do comprimento da região cefálica em
relação ao corpo dos indivíduos, do momento da secção ao fim do processo de
regeneração, observando o indivíduo, com auxílio de uma lupa e de uma régua
ou papel milimetrado sob o recipiente, e definindo-se o momento da medição: o
indivíduo em movimento, quando possui maior alongamento do corpo, ou em
repouso, quando o corpo encontra-se retraído.
Sugere-se também que sejam utilizados mais organismos-teste
nos ensaios, aumentando o número de indivíduos de três para cinco, por
exemplo, para que haja uma amostragem mais significativa da população.
Além disso, as observações dos indivíduos devem ser feitas em intervalos
menores de tempo, como por exemplo, três vezes ao dia, para acompanhar o
processo de regeneração em horas, sendo que esses períodos de observação
devem ser padronizados.
Por fim, é necessária a definição do estágio final do processo de
regeneração. Neste trabalho, estabeleceu-se que a formação de ocelos e
aurículas corresponderia ao término do processo de regeneração. No entanto,
em futuros trabalhos, pode-se usar como parâmetro a semelhança entre os
organismos-teste com organismos que não foram submetidos aos ensaios,
como tamanho e pigmentação similares aos desses organismos mantidos no
37 cultivo, já que para atingir essas características os indivíduos levam mais
tempo. Ou seja, a ausência de padronização quanto ao indicador para o
término do processo de regeneração pode gerar dados (de tempo) diferentes,
porém usados, erroneamente, de forma igual.
Esse estudo, assim como outros na área da Ecotoxicologia, é
necessário para atentar ao fato de que o ambiente aquático não é uma fonte de
diluição de poluentes eterna e que o excesso de crescimento da população
humana, da industrialização e de consumo, assim como o conseqüente
aumento de despejo de resíduos no meio ambiente, são riscos para todos os
organismos que dependem do meio natural para sobreviver. A fragilidade dos
compartimentos ambientais é fato, e fica evidenciada quando são feitas
estimativas de que muitos de seus componentes tendem à escassez ou podem
se extinguir em curtos períodos de tempo se não forem tomadas medidas de
conservação dos recursos naturais, recuperação de ecossistemas e
manutenção da qualidade ambiental.
5. Conclusão
A metodologia de cultivo de Girardia tigrina mostrou-se adequada,
pois os animais se adaptaram às condições do laboratório e de criação e a
manutenção foi fácil e pode ser feita a baixos custos.
Essa espécie de planária mostrou-se eficiente para a realização
de ensaios ecotoxicológicos, por ser sensível ao dicromato de potássio, e por
apresentar ainda, CL50 (27,49 mg/L) intermediário ao de outros organismos já
utilizados como bioindicadores.
Além disso, os dados destes testes mostraram que o dicromato
de potássio é uma substância impactante para esses organismos, provocando
imobilidade e mortalidade, mesmo em concentrações baixas no meio, sendo
um poluente químico de risco para o ecossistema aquático. Entretanto, não
puderam ser feitas avaliações quanto ao tempo levado para o término do
38 processo de regeneração da região cefálica dessa espécie de planária, pois
não foram feitas observações individuais e não há dados quantificáveis sobre o
processo, tendo sido propostas algumas sugestões numa tentativa de melhorar
a obtenção de dados em futuros estudos.
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