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Ministerio da Ciencia, Tecnologia, Inovaçdw e ComunicaçaeS Instituto Nacional de Pesquisas da AmazBnia
Coordenação de Capacitação Divisáo Apoio Técnico
PROGRAMA DE INICIAÇAO CIENTÍFICA DO INPA RELAT~RIO FINAL
ESTUDO CITOGENOTOXICO DO BIOMARCADOR ÉTER PROPIL
DILAPIOL EM Aedes (STEGOMYIA) Aegypti (DIPTERA: CULICIDAE DE
MANAUS AMAZONAS
BOLSISTA: LUANA JAQUELLINE SOUZA DA SILVA
ORIENTADOR (A): MIRIAM SILVA RAFAEL
Relatório Final apresentado ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, wmo requisito para a wnclusão como participante do Programa de Iniciação Científica do INPA.
Manaus - Amazonas 2017
Apoio Financeiro:
de!! -IC
Ministkrio da Ciência, Tecnologia, Inovaq3es e ComunicaçBes instituto Nacional de Pesquisas da AmaAnia
CoordenaçHo de CapaQta@o Di*o Apoio Técnico
Estudo citogenotóxico do biomarcador éter propil dilapiol em Aedes (Steg
Aegypti (Diptera: Culicidae) Manaus, Amazonas.
Resumo (250 a 400 palavras)
O Aedes aegypti é um mosquito de grande importância para saúde pública, devido ao seu papel vetor das enfermidades conhecidas como dengue, febre amarela, febre chikungunya e zika I
Para o controle de mosquitos de importância médica, como o A. aegypti, são utiliz principalmente inseticidas sintéticos, das classes piretróides e organofosforados. Entretanto, e classes de inseticidas vêm provocando resistência a diversas espécies de mosquitos veto, Compostos naturais à base de plantas como o dilapiol e seus derivados semissintéticos como o é propil dilapiol têm sido úteis como novas alternativas ao controle de insetos vetores. O objetivo des estudo foi analisar os efeitos genotóxicos e mutagênicos do composto éter propil dilapiol em núclec interfásicos e metafásicos de neuroblastos e ovócitos de A. aegypti por duas geraees consecutiva @?I e F2). Foram capturados larvas e ovos de A. aegypti no bairro São José 3, Manaus, AM (5 03°08'33.5" W 060°01'13.5"). Os mosquitos foram submetidos a bioensaio com o semissintético fiter propil dilapiol, para avaliar seu potencial genotóxico sobre larvas e adultos (gerações F1 e F2). As larvas de A. aegypti foram expostas a diferentes concentrações de Éter propil dilapiol20 pglmL e 40 pglmL(ensaio genotóxico), durante 4 horas. A genotoxicidade do Éter propil dilapiol foi analisada em preparações citológicas de cérebros de larvas e de ovários de fêmeas adultas, após exposição machos e fêmeas cruzaram, para formação das gerações (F1 e F2). No controle foi utilizado DMSO 0,05% em água potável. As análises das preparações citológicas apresentaram efeitos genotóxicos em núcleos interfásicos de neuroblastos e ovócitos (formação de micronúcleo, brotamentos, células poli nucleadas e outras más-formações), e em células metafásicas (quebras cromossômicas), essas anomalias mostraram resultados significativos quando comparado aos indivíduos, conforme o teste estatístico Tukey (One-way ANOVA). O aumento significativo na frequência de anomalias nucleares de A. aegypti mostrou, que o composto Éter propii dilapiol causou efeitos genotóxicos no genoma desse mosquito. Novos estudos são essenciais para esclarecer os mecanismos específicos de ação desse composto, visando a sua aplicação diretamente no campo, para o combate a esse principal vetor da Dengue no Brasil e no mundo.
Amio Financeiro:
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Ministério da Cikncia, Tecnologia, Inovaçóes e ComunicaçoeS instituto Nacional de Pesquisas da AmazBnia
CoordenaçHo de CapacitaçHo Divisão Apoio Técnico
Palavras Chave: A. aegvpti, Semissintético, Éter propil dilapiol e Bioensaio.
Subhrea
Genética
Financiamento
(PIBIC/CNPq ou PAIC/FAPEAM)
Data: / 1
PSBU- da % a ,. Bolsista
Apoio Financeiro: Realim@o: -
bcnrps --i u.rC
PROGRAMA DE INICIAÇÁO CIENT~FICA DO INPA RELAT~RIO FINAL
(1994). Os mosquitos identificados foram transferidos em casais para gaiolas, para cruzamento e obtenção da geração F1, submetidas a bioensaio com o semissintético éter propil dilapiol.
2. Obtençiio da Colônia Fi
Após identificação, as formas imaturas capturadas em campo foram colocadas em vasilhas
esmaltadas preenchida com 113 de seu volume com água potável. A alimentação das larvas foi
realizada com ração comercial para peixe, dosada de acordo com padronização do laboratório de
malária e dengue no INPA. As larvas ao atingirem o estágio de pupas foram separadas em bandejas
plásticas apenas com água e cobertas com tela. Os mosquitos adultos (machos e fêmeas) que
emergiram foram transferidos para gaiolas para cruzamento, onde os machos foram alimentados com
solução açucarada (10%) e a as fêmeas com sangue de hamster (Mesocricetus aureatus),
previamente. As fêmeas depositaram seus ovos em copos plásticos revestidos internamente com
papel filtro e preenchidos com água em 113 de seu volume. Desses ovos (geração FI) eclodiram
larvas, que ao atingirem o 3O estádio foram submetidas a bioensaio com a substância éter propil
dilapiol.
Bioensaio
No bioensaio com a colônia Fi foram utilizadas duas concentrações do semissintético éter
propil dilapiol em A. aegypti, previamente padronizadas (Santos, 2016). Um total de 160 larvas (3O
estádio) de A. aegypti com cinco réplicas, contendo dez larvas em cada uma foram expostas nas
concentrações de éter propil dilapiol(20 pg/mL e 40 pg/mL) em DMSO, além das amostras controle
negativo em água potável e DMSO (5%), por quatro horas. Após o bioensaio, cérebros de 20 larvas
de 3O estádio de cada concentração e de 20 larvas de cada amostra controle foram utilizados nas
preparações de cromossomos mitóticos. As demais larvas sobreviventes foram transferidas para
vasilhas esmaltadas com água potável e alimento.
O restante das larvas completou o seu desenvolvimento em água potável até a fase adulta, que
foram utilizadas pas confecçóes de lâminas (cromossomos meióticos).
Apoio F i n a n d
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PROGRAMA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA DO INPA RELAT~RIO FINAL
2.4 Preparaçaes citológicas da geraçiio F1
Foram realizadas as preparações de cromossomos mitóticos, a partir de cérebros de larvas de
3" estádio (n=10) e fêmeas adultas (n=10) de cada bioensaio, e dos indivíduos controle, segundo
Imai et al. (1988).
Para os cromossomos meióticos, um total de 10 fêmeas adultas (do bioensaio) e 10 fêmeas
(controle) tiveram abdômen dissecado, para a preparação de lâminas de ovário.
2.5 Obtençiio da colônia Fz
Após as preparações citológicas, com os adultos que restaram do bioensaio (3.3) formaram
casais e foram transferidos para gaiolas, para cruzamento e oviposição. Os adultos (machos) foram
alimentados com solução açucarada (10%) e as fêmeas, com sangue de hamster (Mesocricetus
aureatus). Copos plásticos foram preenchidos com água em 113 de seu volume e revestidos
internamente com papel filtro, para deposição dos ovos pelas fêmeas. Os resultados dos cruzamentos
geraram ovos, que foram depositados em papel filtro originando a geração 2 (F2). A partir desses
indivíduos foi realizado o bioensaio éter propil dilapiol, conforme o item 2.3 (acima citado).
2.6 Avaliaçilo da genotoxicidade
A avaliação da genotoxicidade foi feita a partir das frequências de anomalias nucleares
(interfásicos e metafásicos) encontradas em núcleos de neuroblastos e de ovócitos. A observação dos
núcleos foi realizada em microscópio de luz Axioplan Zeizz, por meio de objetiva de imersão de
100X, e as microf~togr~as serão realizadas pela AxioCam MRc.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Apoio Financeiro: 5
Realização:
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Em neuroblastos de larvas em 3O estádio e ovócitos de fêmeas adultas expostos ao Éter propil dilapiol
nas concentrações 20pglmL e 40pg/mL foi detectada a presença de núcleos interfásicos normais,
brotamento celular, células com formação de micronúcleo, núcleos segmentados e células
polinucleadas (Figura: 2).
Figura 2: Preparações cito16gicas de neuroblastos (B e C) e de ovócito (A e D) corados com Giemsa (pH 5,8) e orceína- lacto-acética (2%). A - Núcleos segmentados (seta); B - micronúcleo; C - célula com má-formação; D - brotamento (seta). Aumento: 1000 e 1600~.
Nos núcleos em divisão de neuroblastos e ovócitos, foi registrado a presenq de núcleos metafásicos normais nos indivíduos controle. Em contrapartida, os indivíduos expostos ao Éter propil dilapiol nas concentrações 20 pg/mL e 40 pg/mL foi observado quebras cromossômicas e pontes anafásicas. (Figura: 3).
Apoio Financeiro..
PROGRAMA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA DO INPA RELAT~RIO FINAL
Figura 5: Núcleos em divisão celular de neuroblastos (A, B e C) de Aedes aeaypi corados com Giemsa (pH 5,8) e orceina-lacto-acética (2%). A - núcleo metafásicos (normais); B e C - quebra cromossômica (seta). Aumento: 1000 e 1600x.
O gráfico (A- neuroblastos e B- ovócitos) mostra a frequência de anormalidades nucleares (%)
para os núcleos analisados por lâmina (n=1000). As letras diferentes a, b e c mostram variação
significativa dos tratamentos 20pgImL e 40pgImL do Eter propil dilapiol + DMSO em relação ao
controle negativo (água + DMSO). As letras que se repetem (letras iguais), indicam variação não
significativa segundo ANOVA e teste de Tukey @ > 0,05). A frequência média de anomalias variou
significativamente quando comparada ao controle negativo e entre os indivíduos tratados e as geraç6es.
7 Apoio F i n a n h . Reaiizaçâo:
PROGRAMA DE INICIAÇÃO cIENT~J?IcA DO iNPA RELAT~RIO FINAL
Estudos específicos acerca dos mecanismos de ação desse composto fazem-se necessários
para compreensão diretamente no campo considerando a importância de combate do A. aeavpti,
principal transmissor de dengue, febres amarelas e chikungunya e zika vírus.
REFERÊNCIAS
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Apoio Fmceiro: