Ministério da Ciência, Tecnologia, InovaçCa e Comunicações Instituto Nacional de Pesquisas da Amaz6nia

Coordena@o de Capacitação Divisão Apoio Técnico

PROGRAMA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA DO INPA RELAT~RIO FINAL

GENOTIPAGEM POR MULTI LOCUS SEQUENCE TYPING (MLST) DE

ISOLADOS DE Cryptococcus gattii OBTIDOS DE FONTES AMBIENTAIS NA

ÁREA URBANA E PERI-URBANA DE MANAUS

BOLSISTA: Nicolle Tayná Brandão dos Santos

ORIENTADOR(A): João Vicente Braga de Souza

Relat6rio Final apresentado ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazhnia, como requisito para a conclusão como participante do Programa de Iniciação Científica do INPA.

Manaus - Arnazònas 2017

Apoio Financeiro:

4 3 ~ ~ ~ 9 --I-

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Minisiéno da Ciência, Tecnologia, Inovações e Comunicações Instituto Nacional de Pesquisas da AmaAnia

Coorde- de Capita@o Divisão Anoio Técnico

Titulo Trabalho do Bolsista: Genotipagem por Multi Locus Sequence Typing

(MLST) de isolados de Cryptococcus gattii obtidos de fontes ambientais na área

urbana e peri-urbana de Manaus.

Resumo

Cryptococcus gattii é um agente saprófita que participa da biodegradação dos substratos orgânicos presentes em ocos e troncos de árvores onde podem estabelecer colonização, transformando esses microambientes em fontes de infecção inalatória para indivíduos imunodeprimidos e hígidos nos quais é mais prevalente. Atualmente o método padrão-ouro para genotipagem de Cryptococcus é o Multi Locus Sequence Typing (MLST), por apresentar maior acurácia na determinação dos genótipos do que as técnicas anteriores baseadas apenas em PCR e por ser baseado no sequenciamento e identificação de polimorfismos presentes em sequências de múltiplos genes conservados, além de apresentar uma maior capacidade de discriminação entre cepas de um mesmo genótipo. Desta forma, o objetivo do trabalho foi realizar a genotipagem por MLST de isolados de Cryptococcus gattii obtidos de fontes ambientais na área urbana e peri-urbana de Manaus. Foram incluídos na análise molecular deste estudo, 6 isolados ambientais de Cryptococcus gatti obtidos de fontes ambientais da área urbana e peri- urbana de Manaus. Todos os isolados eram do tipo molecular VGII e conforme o sequenciamento dos múltiplos lócus, os mesmos apresentaram perfil alélico compatível em 100% de similaridade com o ST20, sendo ambos do subtipo molecular VGIIa. Conclui-se que as cepas de C. gattii VGII oriundas da água do Rio Negro pertencem a um subtipo molecular denominado de VGIIa identificado por MLST como ST20. Indivíduos que mantenham contato com a água do Rio Negro expõem-se ao risco de infecção por tal agente que apresenta potencial de causar surtos de Criptococose como relatado na América no Norte. E o ST20 compartilha semelhança genotípica com STs de origem exclusiva do continente americano, incluindo STs identificados apenas no Amazonas.

Palavras Chaves: 1. Cryptococcus gattii 2. Multi Locus Sequence Typing 3. Tipo molecular VGII

Subárea: Saúde

Financiamento

(PIBICICNPq)

Data: -- o$ 1 i b 12u~F

Bolsista

Apoio Financeiro:

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O Cryptococcus gattii é um agente saprófita que participa da biodegradação

dos substratos orgânicos presentes em ocos e troncos de árvores onde podem estabelecer

colonização, transformando esses microambientes em fontes de infecção inalatória para

indivíduos imunodeprimidos e hígidos nos quais é mais prevalente. Esta levedura é

responsável pela Criptococose que é uma micose com potencial invasivo para múltiplos

órgãos, causando lesões de aspecto nodular e tumoral nos pulmões e quadros graves de

meningoencefalite que podem ser de dificil resolução e associados ao desenvolvimento

de sequelas neurológicas (Change et al. 2004; Velagapudi et al. 2009; Ellabib et al.

2016).

Anteriormente considerado raro e restrito a regiões de clima tropical e

subtropical, C. gattii expandiu a sua distribuição geográfica e desde 1999 tem emergido

como um importante patógeno responsável por surtos em indivíduos hígidos e animais

relatados em Vancouver no Canadá e em cidades do Noroeste Pacífico dos EUA,

demonstrando uma mudança nas suas características eco - epidemiológicas (Kidd et al.

2004; Byrnes et al. 2009; Byrnes et al. 201 0).

As ferramentas de caracterização molecular baseadas na PCR foram

desenvolvidas e utilizadas nos últimos anos com o intuito de investigar a diversidade

genética deste patógeno, de mapear sua distribuição geográfica e de investigar as causas

deste surto e permitiram a distinção desta espécie em quatro genótipos: VGI, VGII,

VGIII e VGIV, sendo mais frequente o tipo molecular VGII, principalmente no Brasil

onde é endêmico (Meyer et al. 2003; Trilles et al. 2008; Freire et al. 2012; Da Silva et

al. 2012).

Atualmente o método padrão-ouro para genotipagem de Cryptoco~cus é o I

Multi Locus Sequence Typing (MLST), por apresentar maior acurácia na determinação

dos genótipos do que as técnicas anteriores baseadas apenas em PCR e por ser baseado

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no sequenciamento e identificação de polimorfismos presentes em sequências de

múltiplos genes conservados, além de apresentar uma maior capacidade de

discriminaçiio entre cepas de um mesmo genótipo. O MLST tem sido aplicado para a

vigilância epidemiológica da Criptococose em nível mundial, permitindo a identificação

de novos genótipos, na realização de estudos filogenéticos que tem ajudado a estimar a

origem evolutiva desses patógenos, na avaliação de relações de parentesco genético

entre isolados obtidos de diferentes regiões e na detecção de recombinações que podem

ser refletidas em mudanças fenotípicas e de patogênese (Fraser et al. 2005; Meyer et al.

2009; Hagen et al. 20 13; Khayhan et al. 2013; Souto et al. 2016; Ferreira et al. 201 7).

Tais estudos tem demonstrado que isolados de origem amazônica apresentam

uma intima relação genética com os que foram associados ao surto no norte do

continente americano e cepas com os mesmos genótipos já foram identificadas em

amostras de origem clínica e ambienta1 no Amazonas, no entanto os estudos regionais

ainda são escassos, a diversidade genética dos isolados ambientais foi pouco explorada,

principalmente com amostras de Manaus onde se concentram os casos de Criptococose

e mais evidências são necessárias para confirmar essas hipóteses filogenéticas (Hagen et

al. 2013; Brito et al. 2015; Souto et a1. 2016). Desta forma, o objetivo do trabalho foi

realizar a genotipagem por MLST de isolados de Cryptococm gattii obtidos de fontes

ambientais na área urbana e peri-urbana de Manaus.

Local de estudo

Este estudo @i definido como observacional e descritivo. Foi realizado no

Laboratório de Mitologia do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA, no

período de Fevereiro de 20 17 a Julho de 20 17.

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Amostras

Foram utilizados 6 isolados ambientais de Cryptococcus gattii que foram

obtidos de amostras de água do Rio Negro coletada em três pontos da orla de Manaus,

assim como de amostras de madeira em decomposição e de inseto obtidas na Reserva

Florestal Adolpho Ducke. As cepas encontram-se atualmente depositadas na Coleção de

Micro-organismos de Interesse Médico do INPA (CMIM) e foram caracterizadas apenas

por PCR como sendo do genótipo principal VGII em um estudo anterior realizado por

Bentes (2014).

Quadro 1. Origem e identificação dos isolados analisados.

Identificação da amostra I I

Tipo de amostra

AM 1 -RN2

AM2-PSR20

Local de isolamento

Agua do rio negro I Porto do São Raimundo

I I

I I Ducke I

Agua do rio negro

AM3-PSR22

AM4-RF50

I I

AM5-RF63 I Madeira em decomposição I Reserva Florestal Adolpho

Porto do São Raimundo

Agua do rio negro I Porto do São Raimundo

1 I Ducke I

Madeira em decomposição Reserva Florestal Adolpho

I Ducke I AM6-FORM63

I I I Legenda: AM - Amostra; RN - Rio Negro; PSR - Porto do São Raimundo; RF - Reserva

Florestal; FORM - formiga.

Inseto

Extra* de DNA

Reserva Florestal Adolpho

I

As cepas criopreservadas foram inicialmente reativadas em Ágar Sabouraud e

em seguida repicadas em uma nova placa contendo o meio de cultura Ágar Níger para

obtenção de biomassa fúngica jovem que foi utilizada para a extração de DNA por

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fenol:clorof6rmio:álcool-isoamílico conforme o protocolo de Ferrer et al. (2001). A

concentração de DNA Genômico extraído foi verificada por leitura em

espectrofotômetro (GeneQuant-pro RNADNA Calculator, GE Healthcare) no

comprimento de onda de 260 nrn (unidade de absorbância correspondeu a 50 pg/rnL) e a

razão de pureza determinada pela razão entre as absorbâncias a 260 e 280 nrn.

Amplificação dos Iócus do MLST e purificação dos produtos de PCR

Foi realizada inicialmente a amplificação individual dos genes conservados:

CAP59, LACI, GPDI, SODl, PLBI, UM5 e da região IGSl, que foram padronizados

pela ISHAM para C. gattii. As concentrações dos reagentes utilizados na PCR foram

determinados após modificações no protocolo proposto por Litvintseva et al. (2006). As

temperaturas de amplificação da PCR seguiram a padronização da ISHAM. E os

produtos de PCR foram visualizados por eletroforese em gel de agarose a 1,5 % por 40

min a 100 V. Para a precipitação e remoção de primers e nucleotídeos não incorporados

na reação de PCR, os amplicons foram purificados com Polietilenoglicol(20%, 2.5M de

NaCl conforme protocolo descrito por Dunn & Blattner (1987) com modificações.

Reaç6es de Sequenciamento do DNA

Na reação de sequenciamento foi utilizado o Kit BigDyeB Terminator v3.1

Cycle Sequencing (Applied Biosystems). Os amplicons foram ressuspendidos em água

ultrapura e quantificados em espectrofotômetro para adequação do volume de DNA

conforme as recomendações do fabricante do kit (5-20 ng para fragmentos de DNA com

500 a 1000 pb). Em seguida o DNA foi adicionado na microplaca de 96 poços (Applied

Biosystems) com o primer e água MilliQB, totalizando um volume de 7,5 pL. O

volume final de 10 pL da reação de sequenciamento para cada poço foi comple(do com

a adição de 1 pL de BigDyeB e 1,5 pL de tampão 5X. As microplacas foram colocadas

em termociclador e as temperaturas de amplificação foram programadas conforme

instruções do fabricante (22).

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Após a amplificação e incorporação dos dideoxinucleotídeos (ddNTP's) aos

fragmentos de DNA, esses produtos da reação de sequenciamento foram submetidos a

precipitação com isopropanol75% e álcool 75% para remoção de ddNTP's livres. Após

esta etapa, foi adicionada Formamida Hi-di nos poços para desnaturação do DNA e em

seguida as microplacas foram submetidas a eletroforese capilar no aparelho AI31 3730

DNA Analyser.

Determinação dos sequences types (ST's)

As sequências nucleotidicas foram editadas utilizando o s o h a r e Sequencher

5.3 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI, EUA). As sequências corrigidas foram

submetidas ao site do banco de dados Fungal UCST Database

(http://mlst.mycologylab.org/) para identificação dos alelos presentes em cada um dos

seis genes conservados e da região IGS1 por comparação com alelos de referência já

depositados. A combinação dos números alélicos gerou um código de sete dígitos (perfil

alélico) e o ST (13).

Análise de associação genética entre STs

Foi utilizado o algoritrno goeBURST por meio do software online

PHYLOVIZ (http://www.~yloviz.net/) com o propósito de avaliar o grau de

proximidade genética e a relação geográfica dos STs identificados neste estudo com os

já descritos na literatura e depositados no banco de dados do MLST. Inicialmente foi

realizado consulta e download do perfil alélico de 167 STs de C. gattii VGII disponíveis

no banco de dados Fungal MLST Database e em seguida a busca da origem geográfica

dos mesmos citadas em artigos científicos (Souto et al. 2016; Brito-Santos et al. 2015).

Durante a análise foram utilizados os dados de 124 STs que tinham origem geográfica

conhecida. O algoritmo realizou a comparação do perfil alélico dos diferentes STs e os

agrupou de forma a interligar os STs geneticamente semelhantes, exibindo diferentes

cores para os mesmos conforme a sua origem geográfica. Na análise final foram

mantidos apenas os STs com perfil alélico mais semelhante ao ST caracterizado no

presente estudo (23,24).

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RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram incluídos na análise molecular deste estudo, 6 isolados ambientais de

Crypococcus gatti obtidos de fontes ambientais da área urbana e peri-urbana de

Manaus. Destes, foi realizada a PCR dos sete locos de todos os isolados, porém s6 foi

possível obter dados de sequenciamento de DNA de isolados provenientes de amostras

de água do Rio Negro coletada na orla do Porto do São Raimundo (Tabela I), pois as

sequências não apresentaram qualidade suficiente para gerar resultado. Todos os

isolados eram do tipo molecular VGII e conforme o sequenciamento dos múltiplos

lócus, os mesmos apresentaram perfil alélico compatível em 100% de similaridade com

o ST20 (Tabelal), sendo ambos do subtipo molecular VGIIa, o mesmo identificado em

associação ao surto de Criptococose que teve início em Vancouver no Canadá a partir de

1999, expandindo-se pelo Noroeste Pacífico dos Estados Unidos nos anos seguintes

(Kidd et al. 2004; Byrnes et al. 2009; Byrnes et al. 2010).

Tabela 1. Resultado da genotipagem por MLST de duas cepas isoladas da água do

RioNegro.

Isolados Local de origem

Genótipo CAP59 GPDI IGSI LACI PLBI SOD1 URAS ST

PSR20 Portosão VGIIa 1 1 4 4 1 14 7 20

PSR22 Raimundo VGIIa

Pela análise realizada pelo algoritmo goeBURST, foi observado que o ST20

apresentou associação genética com os nove sequence types seguintes: ST48, ST122,

ST246, ST250, ST251, ST252, ST253, ST266 e ST267, caracterizando um complexo

clonal devido a extrema semelhança no perfil alélico, já que a maioria dos STs (ST122,

ST246, ST25, ST251, ST252, ST253, ST266 e ST267) apresentaram entre si diferenças

de apenas 1 lócus. Em relação a origem geográfica destes STs, foi observado que este

complexo clonal apresenta indícios de predominância no continente Americano, apesar

do ST20 já ter sido identificado na Europa e do ST48 (o que apresentou menor grau de

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semelhança no perfil alélico com o ST20) ter sido identificado exclusivamente na

Oceania (Brito-Santos et al. 20 15; Souto et al. 20 16).

Figura 1. Diagrama radial construído com algoritmo goeBURST apresentando as associações genéticas e geográficas do ST20 identificado neste estudo com outros já descritos na literatura. Os números no interior dos círculos correspondem a identificação dos STs e os números externos indicam a quantidade de lócus distintos entre os mesmos. Cores diferentes foram utilizadas para categorizar os STs de acordo com sua origem geográfica: verde claro (STs identificados no Amazonas), verde escuro (Brasil), azul (América do Norte), vermelho (Europa), roxo (Oceania). As origens geográficas foram obtidas dos estudos de: BRITO-SANTOS et al. (2015) e SOUTO et al. (2016) e colaboradores.

No Amazonas, o uso do MLST para avaliar a diversidade genotipica de

isolados ambientais dos agentes da Criptococose foi aplicado em apenas dois estudos

que analisaram isolados obtidos de poeira domiciliar em municípios do interior do

estado. Na pesquisa de Brito-Santos et al. (2015) conduzida no munícipio de Santa

Isabel do Rio Negro, foi observado que mais de dois STs podem coabitar um mesmo

ambiente, sendo identificado em tais amostras o ST20. No mesmo estudo foram

caracterizados pela primeira vez os ST266 e ST267 e curiosamente os mesmos foram

identificados pela análise de goeBURST no nosso estudo como componentes do

complexo clonal do ST20, demonstrando que isolados de C. gattii presentes no ambiente #

amazônico estão geneticamente associados ao subtipo molecular VGIIa que é de atual

emergência por ter sido gerado através de recombinações genéticas entre STs de cepas

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VGII de origem na América do Sul, surgindo com o risco em potencial de causar surtos

de Criptococose (Fraser et al. 2005).

Resultados distintos foram obtidos por Alves (2016), que obteve isolados de C.

gattii e de C. neoformans a partir de poeira domiciliar coletadas em uma comunidade

rural no munícipio de Iranduba, na zona metropolitana de Manaus e ao analisarem os

isolados de C. gattii por MLST não identificaram o ST20. Tal sequence type também já

foi identificado como agente de Criptococose em casos diagnosticados pela Fundação de

Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD) (Souto et al. 2016). Nossos

resultados apresentaram indícios adicionais que confirmam o estabelecimento do ST20

no ambiente amazônico, no entanto descrevemos pela primeira vez que o ST20 é o

subtipo molecular de cepas VGII carreadas pela água do Rio Negro na orla de Manaus,

já que este foi um achado intdito descrito por Bentes (2014).

Conclui-se que as cepas de C. gattii VGII oriundas da água do Rio Negro

pertencem a um subtipo molecular denominado de VGIIa identificado por MLST como

ST20. Indivíduos que mantenham contato com a água do Rio Negro expõem-se ao risco

de infecção por tal agente que apresenta potencial de causar surtos de Criptococose

como relatado na América no Norte. E o ST20 compartilha semelhança genotípica com

STs de origem exclusiva do continente americano, incluindo STs identificados apenas

no Amazonas.

Apoio Financeiro: 8

Realização:

PROGRAMA DE MICIAÇAO CIENT~FICA DO INPA

Alves, G.S.B. 2016. Genotipgem de Cryptococcus neoformans e C. gattii isolados de poeira

domiciliar e avaliação da susceptibilidade a antzjiíngicos e da presença do antigeno em

moradores de urna comunidade rural do Amazoqas. Dissertação de Mestrado, Universidade

Federal do Amazonas (UFAM)/ Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD / FIOCRUZ,

Manaus, Amazonas. 70p.

Bentes, A.D.S. 2014. Genotipgem de Cryptococcw neoformans e Cryptococcus gattii isolados

de amostras ambientais coletaalas em floresta nativa, rios e igarapés da cidade de Manaus - Brasil. Dissertação de Mestrado, Universidade do Estado do Amazonas (UEA)/ Fundação de

Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), Manaus, Amazonas. 63p.

Biosystems, A. 2009. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Applied Biosystems

Chemistry &de. 3 1 O.

Brito-Santos, F.; Barbosa, G.G.; Trilles, L.; Nishikawa, M.M.; Wanke, B.; Meyer, W.; et al.

2015. Environmental isolation of Cryptococcus gattii VGII from indoor dust from typical

wooden houses in the deep Amazonas of the rio Negro basin. PLoS One, 10(2):1-11.

Byrnes, E.J.; Bildfell, R.J.; Frank, S.A.; Mitchell, T.G.; Marr, K.A.; Heitman, J. 2009.

Molecular evidence that the range of the Vancouver Island outbreak of Cryptococcw gattii

infection has expanded into the Pacific Northwest in the United States.The Journal of Infectious

Diseases, 199(7): 108 1 4 .

Byrnes, E.J.; Li, W.; Lewit, Y.; Ma, H.; Voelz, K.; Ren, P.; et al. 2010. Emergence and

pathogenicity of highly virulent Cryptococcus gattii genotypes in the northwest United States.

PLoS Pathogens, 6(4): 1000-850.

Change, Y.C.; Stins, M.F.; Mccaffery, M.J.; Miller, G.F.; Pare, D.R.; Dam, T.; et al. 2004.

Cryptococcal Yeast Cells Invade the Central Nervous System via Transcellular Penetration of

the Blood-Brain Barrier. Injèction and Immuniíy, 72(9):4985-95.

Da Silva, B.K.; Freire, A.K.; Bentes, A.D.S.; Sampaio, I.D.L.; Santos, L.O.; Dos Santos, M.S.; 8

et al. 2012. Characterization of clinical isolates of the Cryptococcus neoformans-Cryptococcw

gattii species complex from the Amazonas State in Brazil. Revista Iberoamericana de

Micologia, 29(1):40-3.

Apoio Financeiro:

-- CNPq --r- &L..; -

PROGRAMA DE INICIAÇAO CIENTÍFICA DO MPA R E L A T ~ O FINAL

Dunn, I.S.; Blattner, F.R. 1987. Charons 36 to 40: multi enzyme, high capacity, recombination

deficient replacement vectors with polylinkers and polystuffers. Nucleic Acids Research,

15(6):2677-98.

Ellabib, M.S.; Aboshkiwa, M.A.; Husien, W.M.; D'Amicis, R.; Cogliati, M.; et al. 2016.

Isolation, Identification and Molecular Typing of Cryptococcus neoformans from Pigeon

Droppings and Other Environmental Sources in Tripoli, Libya. h@copathologia. Springer

Netherlands.

Ferreira-paim, K.; Andrade-silva, L.; Fonseca, F.M.; Ferreira, B.; Mora, D.J.; Andrade-Silva, J.;

et al. 2017. MLST-Based Population Genetic Analysis in a Global Context Reveals Clonality

amongst Cryptococcus neoformans var. grubii VNI Isolates from HIV Patients in Southeastern.

PLOS Neglected Tropical Diseases, 8 1 : 1-29.

Ferrer, C.; Colom, F.; Frasés, S.; Mulet, E.; Abad, J.L.; Alió, J.L.; et al. 2001. Detection and

identification of fungal pathogens by PCR and by ITS2 and 5.8s ribosomal DNA typing in

ocular infections. Joumal OfClinical Microbiology, 39(8):2873-9.

Fraser, J.A.; Giles, S.S.; Wenink, E.C.; Geunes-boyer, S.G.; Wright, J.R.; Diezrnann, S.; et al.

2005. Same-sex mating and the origin of the Vancouver Island Cryptococcus gattii outbreak.

Nature, 437: 1360-4.

Freire, A.K.L.; Bentes A.S.; Sampaio, I.L.; Matsuura, A.B.J.; Ogusku, M.M.; Salem, J.I.; et al.

2012. Molecular characterisation of the causative agents of Cryptococcosis in patients of a

tertiary healthcare facility in the state of Amazonas-Brazil. Mycoses, 55(3):145-50.

Hagen, F.; Ceresini, P.C.; Polacheck, I.; Ma, H.; Nieuwerburgh, F.V.; Gabaldon, T.; et al. 2013.

Ancient Dispersa1 of the Human Fungal Pathogen Crypococcus gattii from the Amazon

Rainforest. PLoS One, 8(8).

Khayhan, K.; Hagen, F.; Pan, W.; Simwami, S.; Fisher, M.C.; Wahyuningsih, R; et al. 2013.

Geographically Structured Populations of Cryptococcus neoformans Variety grubii in Asia

Correlatekith HIV Status and Show a Clonal Population Structure. PLoS One, 8(9):1-14.

a

Kidd, S.E.; Hagen, F.; Tscharke, R.L.; Huynh, M.; Bartlett, K.H.; Fyfe, M.; et al. 2004. A rare

genotype of Cryptococcus gattii caused the cryptococcosis outbreak on Vancouver Island

(British Columbia, Canada). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United

States of American, 10 l(49): 1 725843.

Apoio Financeiro:

PROGRAMA DE INICLAÇAO C I E N T ~ C A DO INPA RELATÓRIO FINAL

Litvintseva, A.P.; Thakur, R.; Vilgaíys, R; Mitchell, T.G. 2006. Multilocus Sequence Typing

Reveals Three Genetic Subpopulations of Cryptococcus neoformans var. grubii (Serotype A),

Includiig a Unique Population in Botswana. Genetics Society of America, 2238:2223-38.

Meyer, W.; Aanensen, D.M.; Boekhout, T.; Cogliati, M.; Diaz, M.R.; Esposto, M.C.; et al.

2009. Consensus multi-locus sequence typing scheme for Cryptococcus neoformans and

Cryptococcus gattii. Med Mjcol, 47(6):56 1-70.

Meyer, W.; Castafíeda, A.; Jackson, S.; Huynh, M.; Castafleda, E. 2003. Molecular typing of

IberoAmerican Cryptococcus neoformans isolates. Emerging Infectious Disease, 9(2): 18945.

Souto, A.C.P.; Bonfietti, L.X.; Ferreira-paim, K.; Trilles, L. 2016. Population Genetic Analysis

Reveals a High Genetic Diversity in the Brazilian Cryptmoccus gatíii VGII Population and

Shifts the Global Origin fiom the Amazon Rainforest to the Semi-arid Desert in the Northeast of

Brazil. PLOS Neglected Tropical Diseases, 1-19.

Trilles, L.; Lazéra, M.D.S.; Wanke, B.; Oliveira, R.V.; Barbosa, G.G.; Nishikawa, M.M.; et ar.

2008. Regional pattern of the molecular types of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus

gattii in Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz, 103(5):455-62.

Velagapudi, R; Hsueh, Y.P.; Geunes-Boyer, S.; Wright, J.R.; Heitrnan, J. 2009. Spores as

infectious propagules of Cryptococcus neoformans. Infection and Immunity, 77(10):4345-55.

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