Universidade Estadual de Campinas Instituto de Qumica Departamento de Qumica Analtica LAQQA LABORATRIO DE QUIMIOMETRIA EM QUMICA ANALTICA

Desenvolvimento de metodologias analticas multivariadas empregando espectroscopia Raman de baixa resoluo amplificada por superfcie

Tese de Doutorado

Aluno: Dirginis Bueno Montrazi Ribeiro Orientador: Prof. Dr. Ronei Jesus Poppi Co-orientador: Prof. Dr. Cesar Mello

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Campinas SP, Set/2009

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DEDICATRIA

Dedico este trabalho aos meus tios Paulo Henrique e Tuca, minha noiva Samanta e a minha mezinha Esmerinda

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AGRADECIMENTOS Agradeo a Deus por mais esta oportunidade e mais uma vitria conquistada. Agradeo a Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo pela concesso da bolsa para realizao deste trabalho. UNICAMP e UNIFRAN por fornecer toda a estrutura fsica e tecnolgica para realizao deste trabalho Agradeo ao meu orientador professor doutor Ronei Jesus Poppi pela pacincia e tambm pela excelente orientao ao longo deste trabalho. Agradeo tambm ao meu co-orientador professor doutor Cesar Mello pela brilhante participao neste trabalho. Agradeo aos alunos e ex alunos (Danilo, Guilherme, Werickson, Lus, Laura, Jlio, Trevisan, Patrcia, Paulo Henrique, Jez, Waldomiro, Renato, Gilmare, Alessandra) do grupo LAQQA pelo incentivo. Agradeo ao Biomdico, da Universidade de Franca (UNIFRAN), Marcos Aurlio Stoppa pelo fornecimento das amostras de plasma humano utilizadas neste trabalho. Agradeo aos meus familiares por todo apoio e incentivo ao longo desta caminhada. Agradeo tambm as pessoas que no foram citadas, mas que contriburam de alguma forma para realizao deste trabalho.

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RESUMO Nesta tese metodologias analticas foram desenvolvidas empregando espectroscopia Raman de baixa resoluo amplificada por superfcie (SERS) e calibrao multivariada baseada no mtodo dos mnimos quadrados parciais (PLS) para determinao dos pesticidas endosulfan e metamidofs (e misturas deles) em gua, e do hormnio tireoestimulante (TSH) em plasma. Para a construo dos modelos de calibrao dos pesticidas, um total de 70 e 30 amostras compuseram os conjuntos de calibrao e validao, respectivamente, sendo a diviso realizada pelo algoritmo de Kennard-Stone. J na construo dos modelos de calibrao para a determinao quantitativa dos pesticidas nas misturas, um total de 38 e 11 amostras foram utilizadas na calibrao e validao respectivamente. Para construo dos modelos de calibrao para quantificao de TSH, um total de 39 mostras foram utilizadas na calibrao e 14 amostras de plasma foram utilizadas na validao. As amostras tambm foram divididas pelo algoritmo de Kennard-Stone. Os modelos foram desenvolvidos utilizando diferentes tipos de pr-processamentos de sinais e comparados atravs dos erros de previso (RMSEP). Foram utilizados como pr-processamento, o filtro de transformada de Fourier, a correo de espalhamento multiplicativa, a

transformao padro normal de variao, a ortogonalizao de espectros pelo mtodo de Gram-Schmidt, a centralizao e autoescalamento dos dados. Os melhores modelos foram validados atravs da determinao de figuras de mrito. Foram avaliados a exatido, sensibilidade, sensibilidade analtica, seletividade, ajuste, razo sinal/rudo, limites de deteco e quantificao. A metodologia proposta mostrou-se rpida, de baixo custo e apresentou erros abaixo de 10 g/L para os pesticidas e abaixo de 0,8 UI/mL para TSH, podendo facilmente ser adaptada para o monitoramento de pesticidas em guas e tambm em anlises laboratoriais de rotina para determinao de TSH.

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ABSTRACT In this thesis analytical methodologies were developed employing low resolution surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) and multivariate calibration based on partial least squares method (PLS) for determination of the pesticides endosulfan and methamidophos (and mixtures of them) in water and the thyroid stimulating hormone (TSH) in plasma. For the pesticides calibration model development, a total of 70 and 30 samples composed the calibration and validation sets, respectively, using the Kennard-Stone algorithm for samples separation. In the model development for the mixture of pesticides, a total of 38 and 11 samples were used in the calibration and validation sets, respectively. For the model development in the TSH determination, 39 samples were used in the calibration set and 14 in the validation set. Also the Kennard-Stone algorithm was used to split the samples into the two data sets. The models were developed using different preprocessing methods and compared by using the prediction errors (RMSEP). The following pre-processing were tested: Fourier transform filter, multiplicative scatter correction, standard normal variate, spectra orthogonalization by Gram-Schmidt method, mean center and autoscaling. The best models were validated by figures of merit determination. It was assessed the accuracy, sensibility, analytical sensibility, selectivity, fit, signal/noise ratio, detection and quantification limits. The proposed methodology is fast, has low cost and presented prediction errors below to 10 g/L for the pesticides and below to 0.8 UI/mL for TSH. It may easily be adapted for the pesticides monitoring in waters and also for routine laboratory analysis in TSH determination.

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Sumrio Lista de Figuras ............................................................................................... xxvii Lista de Tabelas .................................................................................................. xxiii Prefcio ................................................................................................................... 1 Captulo 1 - A espectroscopia Raman e o Efeito da Amplificao por Superfcie (SERS) .................................................................................................. 7 1.1. Introduo ........................................................................................................ 9 1.2. Modelo ondulatrio do espalhamento Raman ................................................. 9 1.2.1. Origem do espectro Raman ....................................................................... 12 1.3. Espectroscopia Raman amplificada por superfcie ........................................ 14 1.3.1. O Mecanismo de amplificao eletromagntico ......................................... 15 1.3.1.1. A superfcie plana do metal ...................................................................... 16 1.3.2. O mecanismo qumico de intensificao .................................................... 20 1.3.2.1. Transferncia de carga............................................................................. 20 Captulo 2 Mtodos Quimiomtricos .............................................................. 23 2.1. Introduo ...................................................................................................... 25 2.2. Calibrao cultivariada ................................................................................... 25 2.3. Pr-processamento dos sinais analticos ....................................................... 27 2.3.1. Remoo do rudo experimental: O Filtro de transformada de Fourier ...... 28 2.3.2. Correo do espalhamento multiplicativo .................................................... 29 2.3.3. Transformao padro normal de variao ................................................. 30 2.3.4. Ortogonalizao dos espectros: o mtodo de Gram-Schmidt .................... 31 2.3.5. Dados centrados na mdia.......................................................................... 32 2.3.6. Normalizao dos espectros ....................................................................... 33 2.3.7. Compresso de dados: anlise de componentes principais........................ 34 2.4. Validao: figuras de mrito ........................................................................... 36 2.4.1. Exatido ...................................................................................................... 37 2.4.2. Preciso ...................................................................................................... 38 2.4.3. Sensibilidade ............................................................................................... 38 xiii

2.4.4. Sensibilidade Analtica ................................................................................ 39 2.4.5. Linearidade.................................................................................................. 40 2.4.6. Sinal analtico lquido................................................................................... 40 2.4.7. Razo sinal/rudo ........................................................................................ 42 2.4.8. Robustez ..................................................................................................... 43 2.4.9. Limite de deteco e quantificao ............................................................. 43 2.4.10. Seletividade ............................................................................................... 44 Captulo 3 Obteno do Efeito SERS ............................................................. 45 3.1. Instrumentao ............................................................................................... 47 3.2. Preparao da suspenso de nanopartculas de ouro ................................... 47 3.3. Caracterizao da suspenso de nanopartculas de ouro.............................. 48 Captulo 4 Determinao de Pesticidas em guas Utilizando o Efeito SERS .................................................................................................................... 57 4.1. Introduo ...................................................................................................... 59 4.1.1. Classificao dos pesticidas quanto toxidade .......................................... 61 4.2. Pesticida metamidofs ................................................................................... 62 4.3. Pesticida endosulfan ...................................................................................... 63 4.4. Mtodos convencionais de anlise ................................................................. 64 4.5. Atribuies das bandas vibracionais do espectro Raman do pesticida metamidofs .......................................................................................................... 64 4.6. Atribuies das bandas do espectro Raman do pesticida endosulfan .......... 66 4.7. Obteno dos espectros SERS dos pesticidas em soluo aquosa ............. 69 4.8. Modelos de calibrao multivariada para o pesticida metamidofs ............... 70 4.8.1. Modelo de calibrao utilizando a transformada de Fourier como prprocessamento ...................................................................................................... 73 4.8.2. Modelo de calibrao utilizando a correo de espalhamento xiv

multiplicativa como pr-processamento ................................................................ 75 4.8.3. Modelo de calibrao utilizando o mtodo de ortogonalizao de GramSchmidt como pr-processamento ............................................................................................... 77 4.8.4. Comparao dos modelos para o pesticida metamidofs ........................... 79 4.9. Modelos de Calibrao para o pesticida endosulfan ...................................... 80 4.9.1. Modelo de calibrao utilizando transformada de Fourier como prprocessamento ...................................................................................................... 82 4.9.2. Modelo de Calibrao utilizando a transformada padro normal de variao como pr-processamento ....................................................................... 84 4.9.3. Modelo de Calibrao utilizando correo de espalhamento multiplicativa como pr-processamento ................................................................ 85 4.9.4. Modelo de Calibrao utilizao ortogonalizao de Gram-Schmidt como pr-processamento ...................................................................................... 87 4.9.5. Comparao dos Modelos para o pesticida endosulfan .............................. 88 4.10. Modelos de calibrao multivariada para misturas dos pesticidas metamidofs e endosulfan .................................................................................... 89 4.11. Validao dos melhores modelos de Calibrao .......................................... 93 Captulo 5 Determinao de TSH em plasma sanguneo utilizando SERS .................................................................................................................. 103 5.1. Introduo .................................................................................................... 105 5.1.1. Hormnio Tireoestimulante (TSH) ............................................................. 106 5.2. Parte experimental ....................................................................................... 107 5.3. Resultados e discusso................................................................................ 110 Concluses.......................................................................................................... 117 Referncias Blibliogrficas .................................................................................. 121 xv

Lista de Figuras Figura 1.1. Esquema das transies vibracionais dos espalhamentos: Raman Stockes, Rayleigh e Raman Anti-Stockes................................................. 13 Figura 1.2. Vetores campo eltrico e magntico da luz incidente e refletida para s-polarizao e p-polarizao na superfcie do metal..................... 16 Figura 1.3. O processo de transferncia de carga ................................................ 21 Figura 2.1. Representao esquemtica da seqncia de operaes utilizada na aplicao do filtro de transformada de Fourier ................................... 29 Figura 2.2. Ortogonalizao de vetores para remoo da fluorescncia usando o mtodo de Gram-Schmidt .................................................................................. 32 Figura 2.3. Representao geomtrica da propriedade de ortogonalidade do sinal analtico lquido ........................................................................................ 41 Figura 3.1. Espectro de absoro no ultravioleta-visvel da suspenso de nanopartculas de ouro .................................................................................... 49 Figura 3.2. Espectro de absoro no ultravioleta-visvel da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 1 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L ...................................................................................................... 50 Figura 3.3. Espectro de absoro da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 2 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L ............................. 50 Figura 3.4. Espectro de absoro da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 3 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L ............................. 51 Figura 3.5. Espectro de absoro da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 4 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L ............................. 51 Figura 3.6. Espectro de absoro da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 5 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L ............................. 52 xvii

Figura 3.7. Microscopia eletrnica de varredura da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 5 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L ........................ 53 Figura 3.8. Microscopia eletrnica de varredura da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 5 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L ........................ 53 Figura 3.9. Espectros Raman do cristal violeta ..................................................... 54 Figura 3.10. Espectros Raman dos cristais de violeta na presena de ouro coloidal .................................................................................................................. 55 Figura 4.1. Frmula estrutural do pesticida metamidofs ...................................... 62 Figura 4.2. Frmula estrutural do endosulfan ........................................................ 63 Figura 4.3. Espectro Raman do pesticida metamidofs puro ................................ 65 Figura 4.4. Estrutura molecular do pesticida metamidofs .................................... 66 Figura 4.5. Espectro Raman do pesticida puro endosulfan. .................................. 67 Figura 4.6. Estrutura molecular do pesticida endosulfan ....................................... 68 Figura 4.7. Espectros Raman SERS do metamidofs no prprocessados .......................................................................................................... 71 Figura 4.8. Modelo de calibrao para determinao de metamidofs ................. 73 Figura 4.9. Espectros SERS do pesticida metamidofs aps utilizao do filtro com transformada de Fourier ................................................................... 74 Figura 4.10. Modelo de calibrao para determinao de metamidofs com pr-processamento por filtro com transformada de Fourier .......................... 75 Figura 4.11. Espectros SERS do pesticida metamidofs com pr- processamento por MSC. ............................................................................................................... 76 Figura 4.12. Modelo de calibrao para determinao de metamidofs com pr-processamento por MSC......................................................................... 77 Figura 4.13. Espectros SERS de metamidofs pr-processado com ortogonalizao ..................................................................................................... 78 xviii

Figura 4.14. Modelo de calibrao para determinao de metamidofs com pr- processamento por ortogonalizao ...................................................... 79 Figura 4.15. Espectros Raman SERS de endosulfan no prprocessados .......................................................................................................... 81 Figura 4.16. Modelo de calibrao para determinao de endosulfan. () calibrao; () validao ...................................................................................... 82 Figura 4.17. Espectros SERS do pesticida endosulfan aps utilizao do filtro de transformada de Fourier ........................................................................................ 83 Figura 4.18. Modelo de calibrao para determinao do endosulfan com transformada de Fourier como pr-processamento. () calibrao; () validao ............................................................................................................... 84 Figura 4.19. Modelo de calibrao para determinao de endosulfan utilizando SNV como pr-processamento. () calibrao; () validao.............................. 85 Figura 4.20. Espectros Raman SERS de endosulfan pr-processados com MSC ...................................................................................................................... 86 Figura 4.21. Modelo de calibrao para determinao de endosulfan com prprocessamento por MSC. () calibrao; () validao ....................................... 86 Figura 4.22. Espectros Raman SERS de endosulfan pr-processados com ortogonalizao ..................................................................................................... 87 Figura 4.23. Modelo de calibrao para determinao de endosulfan com prprocessamento por ortogonalizao. () calibrao; () validao ...................... 88 Figura 4.24. Espectros Raman SERS das misturas de pesticidas endosulfan e metamidofs .......................................................................................................... 90 Figura 4.25. Valores de referncia contra os previstos pelo modelo para a quantificao do pesticida endosulfan na mistura. () calibrao; () validao ............................................................................................................... 91

xix

Figura 4.26. Valores de referncia contra os previstos pelo modelo para a quantificao do pesticida metamidofs na mistura. () calibrao; () validao ............................................................................................................... 92 Figura 4.27. Valores de referncia versus valores estimados pelo modelo PLS para o pesticida endosulfan. () amostras de calibrao, (*) amostras de validao ............................................................................................................... 95 Figura 4.28. Valores de referncia versus valores estimados pelo modelo PLS para o pesticida metamidofs. () amostras de calibrao, (*) amostras de validao ............................................................................................................... 95 Figura 4.29. Valores de referncia versus valores estimados pelo modelo PLS para o pesticida endosulfan na mistura. () amostras de calibrao, (*) amostras de validao .......................................................................................................... 96 Figura 4.30. Valores de referncia versus valores estimados pelo modelo PLS para o pesticida metamidofs na mistura. () amostras de calibrao, (*) amostras de validao .......................................................................................... 96 Figura 4.31. Escalar NAS contra as concentraes de referncia para o endosulfan ............................................................................................................. 97 Figura 4.32. Escalar NAS contra as concentraes de referncia para o metamidofs .......................................................................................................... 97 Figura 4.33. Escalar NAS contra as concentraes de referncia para o endosulfan na mistura ........................................................................................... 98 Figura 4.34. Escalar NAS contra as concentraes de referncia para o metamidofs na mistura ........................................................................................ 98 Figura 4.35. Grfico de erros absolutos contra os valores de referncia do modelo de calibrao para determinao do pesticida endosulfan ....................... 99 Figura 4.36. Grfico de erros absolutos contra os valores de referncia do modelo de calibrao para determinao do pesticida metamidofs .................. 100 xx

Figura 4.37. Grfico de erros absolutos contra os valores de referncia do modelo de calibrao para determinao do pesticida endosulfan na mistura ... 100 Figura 4.38. Grfico de erros absolutos contra os valores de referncia do modelo de calibrao para determinao do pesticida metamidofs na mistura 101 Figura 5.1. Espectros SERS de plasma sanguneo sem pr-processamento ..... 110 Figura 5.2. Espectros SERS de plasma sanguneo aps pr-processamento .... 111 Figura 5.3. Grfico usado para a escolha no nmero de variveis Latentes ....... 112 Figura 5.4. Valores de referncia contra previstos pelo modelo para determinao de TSH. () calibrao; () validao................................................................. 114 Figura 5.5. Escalar NAS contra as concentraes de Referncia, () amostras de calibrao, (*) amostras de validao ................................................................. 115 Figura 5.6. Grfico de erros absolutos contra as concentraes de referncia... 116

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Lista de Tabelas Tabela 4.1. Classificao toxicolgica de pesticidas ............................................. 61 Tabela 4.2. Atribuio das bandas Raman para o pesticida metamidofs ............ 66 Tabela 4.3. Atribuio das bandas Raman para o pesticida endosulfan ............... 68 Tabela 4.4. Solues preparadas das diferentes concentraes das misturas de pesticidas .............................................................................................................. 70 Tabela 4.5. Valores dos erros calculados pelos modelos de calibrao para quantificao de metamidofs ............................................................................... 79 Tabela 4.6. Valores de teste F para os diferentes modelos Desenvolvidos .......... 80 Tabela 4.7. Valores dos erros calculados pelos modelos de calibrao para quantificao de endosulfan .................................................................................. 89 Tabela 4.8. Valores dos erros calculados pelos modelos de calibrao para quantificao de endosulfan nas misturas ............................................................ 92 Tabela 4.9. Valores dos erros calculados pelos modelos de calibrao para quantificao de metamidofs nas misturas.......................................................... 93 Tabela 4.10. Figuras de Mrito para os modelos desenvolvidos........................... 93 Tabela 5.1. Concentraes obtidas pelo mtodo quimioluminescente ................ 109 Tabela 5.2. Resultados de figuras de mrito estimadas para o modelo PLS ......................................................................................................... 113

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PREFCIO

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Os equipamentos utilizados para obteno dos espectros Raman podem ser divididos entre dispersivos e baseados em transformada de Fourier. Os equipamentos com transformada de Fourier utilizam lasers operando a 1064 nm que fazem com que pouca ou nenhuma fluorescncia seja observada nas medidas, porm a intensidade Raman pequena, o que compensada com a utilizao da vantagem das medidas multiplexadas. Esses equipamentos tm custos elevados, mas conseguem tima resoluo e relao sinal/rudo. Porm recentemente com o desenvolvimento dos lasers de diodo e detectores de matriz de diodo de carga acoplada (CCD), equipamentos portteis e de baixo custo tem surgido no mercado, o que pode tornar possvel o desenvolvimento de aplicaes com espectroscopia Raman mais simples e a um custo acessvel. A desvantagem desses equipamentos mais simples que normalmente lasers no visvel so utilizados, gerando espectros com fluorescncia e pouco resolvidos. Com a possibilidade do tratamento dos dados por mtodos

quimiomtricos, tem sido demonstrado, principalmente com a espectroscopia no infravermelho prximo, que a ausncia de resoluo e a presena de fortes interferncias espectrais no so fatores limitantes para o desenvolvimento de metodologias de anlise para determinaes quantitativas. Assim pode-se pensar em metodologias analticas com a unio da espectroscopia Raman de baixa resoluo e mtodos quimiomtricos. A espectroscopia Raman amplificada por superfcies (SERS do ingls, Surface Enhanced Raman Spectroscopy), desenvolvida na dcada de 70, realizada pela adsoro do analito em superfcies coloidais metlicas, propiciando a amplificao no efeito Raman. Dessa forma, pode-se com essa tcnica espectroscpica vibracional alcanar nveis de concentrao extremamente baixos, podendo assim ser utilizada em metodologias analticas para anlise de traos. Esta tese teve como objetivo utilizar tcnicas quimiomtricas de calibrao multivariada baseada em mnimos quadrados parciais (PLS do ingls, Partial Least Squares) para determinao de pesticidas em guas e tambm de 3

hormnio tireoestimulante (TSH do ingls, Thyroid Stimulating Hormone) em plasma utilizando a espectroscopia Raman de baixa resoluo amplificada por superfcie (SERS) como resposta instrumental. O recurso de amplificao do sinal Raman foi utilizado para que se possam fazer determinaes trao tanto para pesticidas (g/mL) quanto para TSH (UI/mL). O procedimento SERS para o monitoramento de guas superficiais prximas s indstrias e lavouras extremamente atraente, dada a simplicidade experimental dos mtodos envolvidos, a possibilidade de determinaes simultneas de pesticidas de um modo extremamente rpido, alm de ter a vantagem de fazer anlises in situ, vantagem que a tcnica cromatogrfica ainda no possui. Para a determinao de TSH, o procedimento SERS tambm extremamente atraente dada a simplicidade experimental dos mtodos envolvidos, os baixos limites de deteco possveis de serem alcanados, a rapidez do mtodo para se obter o resultado e, principalmente, a iseno de reagentes radioativos e no-radioativos nesta determinao. A presente tese foi divida em cinco captulos, sendo que o primeiro intitulado A Espectroscopia Raman e o Efeito da Amplificao por Superfcie apresenta a teoria da tcnica empregada para determinao dos pesticidas em guas e tambm do TSH em plasma. O segundo captulo intitulado Mtodos Quimiomtricos reporta a parte terica sobre os mtodos quimiomtricos (pr-processamento de sinais, mtodos de quantificao e validao) utilizados no desenvolvimento dos modelos de calibrao multivariada. O terceiro captulo intitulado Obteno do Efeito SERS explica como foram produzidos e otimizados os colides de ouro utilizados na amplificao do espalhamento Raman. O quarto captulo intitulado Determinao de Pesticidas em gua utilizando o Efeito SERS apresenta os modelos de calibrao multivariada e prprocessamentos de dados utilizados para quantificao dos pesticidas

Metamidofs e Endosulfan, assim como a mistura deles. A validao dos modelos 4

de calibrao multivariada proposta com base na determinao de figuras de mrito. O quinto captulo intitulado Determinao de TSH em Plasma Sanguneo utilizando SERS, aborda a metodologia desenvolvida, utilizando a espectroscopia Raman de Baixa Resoluo Amplificada por Superfcie para quantificao do hormnio tireoideano (TSH). Tambm nesse caso foi realizada a validao do modelo pela determinao das figuras de mrito. Finalmente a tese se encerra pelas Concluses e apresentao das Referncias Bibliogrficas utilizadas.

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CAPTULO 1A ESPECTROSCOPIA RAMAN E O EFEITO DA AMPLIFICAO POR SUPERFCIE

7

1.1. Introduo A espectroscopia Raman [1-4] ocupa hoje uma posio destacada dentre as tcnicas usadas na investigao da estrutura microscpica da matria. sabido que as tcnicas espectroscpicas de uma maneira geral, fornecem informaes detalhadas sobre os nveis de energia das espcies em estudo; particularmente no caso da espectroscopia vibracional, a grande vantagem reside na maior riqueza de detalhes proporcionada pelos nveis de energia vibracionais, frente aos nveis de energia eletrnicos: enquanto os espectros eletrnicos so constitudos por bandas largas usualmente sem estrutura, os vibracionais representam a impresso digital da molcula. Sem dvida, a espectroscopia Raman detm uma srie de vantagens sobre a espectroscopia de absoro no infravermelho (IV) sendo que as principais so a possibilidade de obteno de espectros de substncias em meio aquoso e a utilizao de recursos especiais, como o efeito Raman ressonante e o efeito de amplificao por superfcie, que aumentam sua sensibilidade. Mais ainda, trata-se de uma tcnica de investigao qualitativa e quantitativa, que combinada com o uso de fibras ticas, permite a monitorao remota de amostras; essa possibilidade vem sendo explorada, por exemplo, no estudo de matrizes biolgicas [5] na determinao de pesticidas [6] e em pesquisas biomdicas por permitir o estudo de tecidos [7] in vivo.

1.2. Modelo ondulatrio do espalhamento Raman

Os espectros Raman so obtidos irradiando-se uma amostra com uma fonte de laser potente de radiao monocromtica no visvel ou no infravermelho prximo. Durante a irradiao, o espectro da radiao espalhada medido em certo ngulo (geralmente 90 graus) com um espectrmetro apropriado. As intensidades das linhas Raman so, quando muito, 0,001% da intensidade da fonte; como conseqncia, sua deteco e medida so mais difceis do que em um espectro no infravermelho. 9

A causa bsica do espalhamento Raman a polarizao induzida na molcula pelo campo eltrico oscilante da radiao eletromagntica incidente. Este dipolo induzido espalha a radiao com ou sem alterao da energia vibracional da molcula. A polarizao P induzida na molcula depende da polarizabilidade desta molcula e do campo eltrico da radiao eletromagntica

incidente E, como apresentado na equao 1.1, abaixo.

P

E

(1.1)

A polarizabilidade dos eltrons de uma molcula depender da freqncia de vibrao molecular e, portanto podemos considerar como uma aproximao bastante razovel que o potencial que governa esta variao na polarizabilidade o mesmo que governa as vibraes moleculares, isto , o potencial do oscilador harmnico. Assim sendo, um feixe de radiao com freqncia ex incidindo sobre uma soluo de um analito tem o campo eltrico E dessa radiao descrito pela equao:

E

E 0 cos( 2ext t )

(1.2)

onde E0 a amplitude da onda. Quando o campo eltrico da radiao interage com uma nuvem eletrnica de uma ligao do analito induz-se um momento dipolar P na ligao que dado por:

P

E

E0 cos 2ext t

(1.3)

Para ser ativa no Raman, a polarizabilidade de uma ligao precisa variar em funo da distncia entre os ncleos, de acordo com a equao:

10

0

(r

req )

r

(1.4)

onde 0 a polarizabilidade da ligao na distncia internuclear de equilbrio req e a separao internuclear em qualquer instante r. A variao na separao internuclear se altera com a freqncia de vibrao e dada por:

r

req

rm cos( 2 t )

(1.5)

Onde rm a separao internuclear mxima relativa posio de equilbrio. Substituindo a equao 1.5 na 1.4 temos: r mcos(2 t ) r

0

(1.6)

Podemos, ento, obter uma expresso para o momento dipolar induzido P substituindo a equao 1.6 na equao 1.3. Assim, cos(2 t ) cos(2ext ) r

P

0E0 cos(2ext t ) E0 rm

(1.7)

A equao 1.7 pode ser rearranjada para: cos 2 ext r cos 2 ext r

P

0 E0 cos(2ext t )

E0 rm 2

t

E0 rm 2

t

(1.8)

O primeiro termo da equao 1.8 contm somente o termo de freqncia de excitao ext e corresponde ao espalhamento inelstico, sem troca de energia com a molcula, tambm chamado de espalhamento Rayleigh e ocorre na mesma freqncia da radiao incidente e, portanto, no apresenta nenhuma informao sobre os nveis vibracionais da molcula em questo. J no segundo termo, aparecem as radiaes espalhadas com freqncia (ext 11 )

, chamado de

espalhamento Raman Stokes e (ext

) chamado de espalhamento Raman anti-

Stokes. Aqui a freqncia de excitao foi modulada pela freqncia vibracional da ligao. importante notar que o espalhamento Raman exige que a polarizabilidade de uma ligao varie em funo da distncia, isto ,

/ r na

equao 1.8 precisa ser maior que zero para que as linhas Raman apaream.

1.2.1. Origem do espectro Raman

Na espectroscopia Raman, a excitao espectral normalmente realizada por radiao de comprimento de onda resultante dos picos de absoro do analito. O diagrama de energia da Figura 1.1 mostra um quadro qualitativo das fontes de espalhamentos Rayleigh e Stokes [8]. A figura mostra a variao de energia na molcula quando ela interage com um fton da fonte. O processo mostrado no quantizado, assim, dependendo da freqncia da radiao da fonte, a energia de uma molcula pode assumir um nmero infinito de estados virtuais, entre o estado fundamental e o primeiro estado eletrnico excitado. Na transio mostrada esquerda tem-se a passagem do estado fundamental para um estado virtual, cuja energia dada por E=h0. Esse processo gera uma emisso Raman quando a molcula perde a energia decaindo para o primeiro nvel vibracional excitado (E=hv). Isso gera bandas Raman Stokes. Na transio do centro da figura, tem-se a variao de energia, pela absoro do fton, entre o estado fundamental e o estado virtual. Nesse caso, aps o decaimento, volta-se ao estado fundamental. Tem-se o espalhamento Rayleigh, sem perda de energia, e como conseqncia as colises so denominadas elsticas. Finalmente, a transio mostrada direita apresenta a passagem entre um primeiro nvel excitado vibracional e um estado virtual de maior energia. Aps o decaimento, tem-se a volta para o estado fundamental, com variao na energia. Isso gera as bandas Raman anti-Stokes

12

Estados Virtuais Virtuais E=h0E=hv E=h0

Estado Fundamental

ib

Banda Rayleigh Banda Stockes Banda anti-Stockes

0 - v

0

0 + v

Figura 1.1. Esquema das transies vibracionais dos espalhamentos: Raman Stockes, Rayleigh e Raman Anti-Stockes.

Na espectroscopia Raman, tanto molculas diatmicas heteronucleares como molculas diatmicas homonucleares apresentam atividade, pois em ambos os casos ocorre variao na polarizabilidade durante a vibrao. Por exemplo, a polarizabilidade da ligao dupla carbono-carbono varia significativamente durante a vibrao molecular e, portanto seu espalhamento Raman forte, j na ligao dupla carbono-oxignio a variao da polarizabilidade no to intensa, pois esta ligao j possui um momento de dipolo permanente intenso. No infravermelho ocorre justamente o contrrio, a absoro da ligao dupla carbono-carbono fraca e a absoro da ligao dupla carbono-oxignio forte. Fatos como este levaram a generalizao equivocada de espcies ativas no infravermelho so inativas na espectroscopia Raman. No espectro Raman, h simetria em relao linha Rayleigh, uma banda do lado de freqncias mais baixas, as Stokes, e uma do lado das freqncias 13

mais altas, as anti-Stokes. Como a populao dos estados excitados segue a distribuio de Boltzmann, deve-se esperar que as bandas anti-Stokes tenham menor intensidade do que as linhas Stokes.

1.3. Espectroscopia Raman amplificada por superfcie

A espectroscopia Raman amplificada por superfcie (SERS - do ingls Surface Enhanced Raman Spectroscopy) desenvolvida na dcada de 70 [9] realizada pela adsoro do analito em superfcies coloidais metlicas ou em superfcies speras desse metal, propiciando a amplificao no efeito Raman [10]. No descobrimento do feito por Fleischmann, reportou-se um espectro muito intenso da piridina em uma superfcie spera de um eletrodo de prata. A intensidade do espectro foi inicialmente atribuda ao aumento no empacotamento molecular na superfcie do eletrodo. Pesquisas posteriores mostraram que este aumento isolado na densidade de empacotamento no poderia provocar o enorme aumento na intensidade do espectro Raman e em 1977 duas teorias independentes foram formuladas para descrever o fenmeno. Superfcie spera essencial para a obteno do efeito SERS. Neste contexto, aspereza significa que a superfcie deve ter regies com certa curvatura. Por exemplo, prata coloidal com um dimetro mdio de partculas de 40 nm considerada spera, embora cada partcula coloidal seja essencialmente lisa (microscopicamente spera). O efeito SERS tem sido assim explicado por duas teorias: A teoria eletromagntica, em que o campo eletromagntico do metal-superfcie amplificado pelo campo incidente devido gerao de plasmons superficiais; e a teoria qumica, que prope a interao qumica entre analito e substrato, atravs do arranjo das ligaes ou transferncia de carga, resultando no aumento da polarizabilidade das molculas do analito. A amplificao do espalhamento normalmente muito alta, da ordem de 10 6 ou mais, permitindo a obteno dos espectros Raman de substncias qumicas em um curto tempo de integrao e/ou sem a subtrao de backgrouds [11]. 14

No desenvolvimento da metodologia SERS, alguns fatores importantes devem ser levados em considerao na obteno do substrato ativo, como por exemplo: a efetividade na amplificao, a durabilidade e reprodutibilidade. Dentre os materiais, incluindo metais e semicondutores, os metais prata (Ag), ouro (Au) e cobre (Cu) so os mais usados para induzir a amplificao do espectro Raman por superfcie de amostras qumicas. A superfcie metal-substrato para ativar o SERS pode geralmente incluir as seguintes formas: sis-coloidais, eletrodos porosos e filmes metlicos. Uma vantagem dos sis coloidais metlicos est na sua simples preparao e manipulao. Porm, a variao da intensidade SERS com o tempo de vida do sol o maior fator limitante na aplicao do substrato em anlises. Eletrodos porosos podem ser usados para amplificar sinais Raman de uma ampla gama de analitos, mas a incluso do aparelho eletroqumico complica as medidas do sistema. A aplicao de filmes via sol-gel, possui o potencial para contornar estas desvantagens [12], porm ainda existem problemas prticos nessa implementao que dependem da estrutura e formao do sol-gel.

1.3.1. O mecanismo de amplificao eletromagntico (EM)

No mecanismo EM, h vrias propriedades que so de extrema importncia no efeito SERS. Estas propriedades, na superfcie, incluem a forma e tamanho (por exemplo, uma pequena irregularidade na forma das partculas metlicas, uniformidade no tamanho das nano partculas, partculas metlicas coloidais ou agregados fractais, etc.) e tambm a freqncia dependente da funo dieltrica na superfcie dos materiais [13]. A intensificao do campo eletromagntico na superfcie do metal primariamente causada pelo campo eltrico local na superfcie, campo este que responsvel pela excitao da radiao Raman e tambm pelo momento de dipolo induzido em molculas adsorvidas sobre a superfcie irregular do metal.

15

1.3.1.1. A superfcie plana do metal

Para entender facilmente a interao da luz incidente com uma superfcie, devemos analisar o esquema desta interao conforme mostrado na figura 1.2.

s-polarizao

p-polarizao

Figura 1.2. Vetores campo eltrico e magntico da luz incidente e refletida para spolarizao e p-polarizao na superfcie do metal.

Os vetores campo eltrico e campo magntico correspondem as denotaes Ki, Ei, Bi e Kr, Er, Br respectivamente. Os vetores obedecem independentemente a regra da mo direita para a luz incidente e refletida. Para uma superfcie plana tem-se [14-16]:

surf Essurf E p,y

i Es 1 rsi E p,y 1 rp cos

(1.9) (1.10) (1.11)

surf E p,z

surf E p,z 1 rp sen

onde os ndices s e p indicam as direes de p- e s-polarizao, y e z denotam as componentes do campo (E) paralelo aos eixos y, z (ver figura 1.2). O sobrescrito surf simboliza as componentes primrias do campo na superfcie, rs e rp 16

correspondem aos coeficientes de Fresnel na reflexo da luz. O sinal positivo ou negativo que compe os coeficientes de Fresnel uma conseqncia no deslocamento da fase pelo 0 () para a onda refletida. O comportamento da refletividade facilmente descrito usando as expresses para os coeficientes de Fresnel rp e rs para irradiao da luz numa superfcie metlica da soluo em anlise em funo da funo dieltrica da superfcie metlica [14] dada por:

rs

cos cos cos cos

sen

2

1 2

sen2 sen2 sen2

1 2

(1.12)

1 2 1 2

rp

(1.13)

em que representa o ngulo incidente. Note que a funo dieltrica,

(,K)

depende da freqncia e do vetor onda K da luz incidente. Porm nos negligenciamos a correlao de (,K) com K. As componentes de espalhamento do campo ptico na superfcie do metal so dadas, de acordo com a polarizao conforme equao 1.14,

E s'' Ep

1 rs' px'

1 rp' py cos

1 rp' pz sen

'

(1.14)

Em que os primeiros representam a luz espalhada. As quantias polarizadas p x , p y e pz so dadas por:

px py pz

xx E xy yx E x zxE x

xy E y YY E y zy E y17

xzEz yzEz zzEz(1.15)

onde representa a polarizabilidade. Substituindo a equao 1.15 em 1.13, obtemos as intensidades Raman para superfcie[14-16], conforme as equaes 1.16, 1.17, 1.18 e 1.19.

Is

4 csc xx 1 rs 1 rs'

2

(1.16)

I ps

4 csc xy 1 r p 1 rs' cos

yz 1 r p 1 rs' sen

2

(1.17)

I ps

4 csc yx 1 rs 1 rp' cos

'

zx 1 rs 1 rp' sen

2

(1.18)

I ps

4 csc

yy 1 rp cos zy 1 r p cos

yz 1 r p sen

1 r p' cos'

'

2

zz 1 r p 1 rp' sen

(1.19)

Atravs das equaes descritas acima, certos aspectos da intensidade do espalhamento Raman, podem ser deduzidos para molculas adsorvidas na superfcie. Se ignorarmos o efeito do tensor polarizabilidade, a intensidade do espalhamento Raman pode ser determinada por dois fatores: pelos ngulos da radiao incidente e espalhada, e pela funo dieltrica da freqncia dependente . ngulos incidentes entre 60 e 65 [17] so sugeridos para intensificar o

campo ptico local da superfcie, sendo assim um dos principais processos na intensificao mxima do espalhamento Raman. A dependncia da funo dieltrica na freqncia da radiao incidente () ser discutida detalhadamente no pargrafo seguinte. Assumindo o modelo do oscilador harmnico e omitindo a interao do eltron com o campo magntico do campo ptico, a funo dieltrica da freqncia dependente pode ser escrita da seguinte forma [18-20]:

18

2 p 1 2 i

(1.20)

em que o coeficiente amortecimento introduzido para permitir a perda de energia eletromagntica no interior do metal, e p a freqncia do plasmon, que depende do nmero e propriedades de eltrons livres em qualquer sistema.

2 p

4Ne 2 m0

(1.21)

Na equao 1.21, N, e e m representam respectivamente a densidade numrica, a carga e a massa dos eltrons livres do sistema. Esta formulao pode ser usada para discutir o campo eltrico local da superfcie e tambm o espalhamento Raman atravs de uma superfcie. Mudando-se o comprimento de onda da radiao incidente para o vermelho, a funo dieltrica pode ter um sinal negativo dando um extenso valor absoluto. Neste caso, rs tende a -1, enquanto r p aproxima-se de 1. Como resultado, a componente tangencial do campo na superfcie aproximadamente zero. Este valor da componente relativo ao cancelamento do campo incidente e do campo refletido [15]. Por essa razo, para espectroscopia de absoro no infravermelho, somente o dipolo induzido normal na superfcie contribui na intensidade. Quando a freqncia da radiao incidente est prxima freqncia do plasmon p, ocorre a ressonncia entre as freqncias do plasmon e da radiao incidente. Neste caso, se omitirmos a parte imaginria da funo dieltrica, o ser muito pequeno, por exemplo, rs tende a 1, enquanto r p tende a -1. Como resultado, h um aumento na componente campo s-polarizao e a componente p-polarizao ao longo da direo y. Em contraste, a componente p do campo normal da superfcie maciamente atenuada. 19

Para espectroscopia Raman, as radiaes nas regies do visvel e ultravioleta prximo so freqentemente usadas como fonte de excitao. Portanto, a funo dieltrica no muito pequena e assim, a componente tangencial do campo local da superfcie no ser zero. Por essa razo, baseado na teoria EM, a intensificao mxima do campo local numa superfcie plana no mais do que dois, conduzindo para um fator mxima intensificao de 16 na intensidade do espalhamento Raman [13].

1.3.2. O Mecanismo Qumico de Intensificao

Esse modelo baseado no princpio que uma molcula adsorvida pode, sob condies especficas, interagir com a superfcie do metal de maneira que provoque um enorme aumento na polarizabilidade molecular, [21]. H alguns fatores que influenciam e contribuem no mecanismo qumico. Dentre eles podemos citar a interao da ligao qumica entre molculas adsorvidas e tomos que constituem a superfcie metlica, a orientao e cobertura das molculas e a estrutura da superfcie metlica. Porm, estes fatores que influenciam a intensidade SERS dependem do mecanismo de transferncia de carga envolvido.

1.3.2.1. Transferncia de Carga

No modelo de transferncia de carga, os ftons incidentes excitam um eltron da superfcie metlica para a molcula adsorvida, gerando uma molcula excitada negativamente carregada. A geometria molecular dessa molcula excitada diferente das espcies neutras. Esta transferncia de carga induz uma relaxao nuclear dentro da molcula excitada, que resulta no retorno do eltron para a superfcie do metal, o aparecimento de uma molcula neutra excitada e a emisso de um fton numa freqncia deslocada (Raman).

20

No espalhamento Raman, transferncia de carga um processo de excitao virtual em que o estado de transferncia de carga pode estar parcialmente em ressonncia com a radiao de excitao. Este processo gera uma grande contribuio na seo cruzada do espalhamento Raman do complexo molcula-metal. Este assumido e provavelmente o caso de vrios sistemas experimentais, que normalmente uma fraca interao envolvida no sistema substrato-molcula. Neste nvel de energia molecular ocorre um entrelaamento com a banda de conduo do metal [22]. Geralmente, o processo de transferncia de carga envolve os quatro passos seguintes [23] (1) um fton aniquilado, ento um eltron excitado de um doador (2) O eltron excitado transferido para uma molcula adsorvida ou para o prprio substrato metlico; (3) o eltron excitado volta para o doador a partir do recebedor e ao mesmo tempo um fton Raman emitido (4), o complexo metal e molcula adsorvente esto localizados em nveis vibracionais excitados como mostrado na Figura 1.3.

Figura 1.3. (a) O eltron excitado no interior do metal. (b) O eltron intramolecular excitado pela luz incidente. (c) O eltron da superfcie do metal excitado para a molcula adsorvida. (d) O eltron intramolecular excitado para um orbital vazio do metal da superfcie.

21

CAPTULO 2MTODOS QUIMIOMTRICOS

23

2.1. Introduo

A quimiometria [24] pode ser definida como uma rea da qumica que usa mtodos matemticos, estatsticos e de lgica formal para planejar ou selecionar procedimentos timos de medidas e experimentos e extrai o mximo da informao qumica relevante, com a anlise dos dados. O termo quimiometria foi utilizado pela primeira vez por qumicos, nos anos setenta, formalizando uma rea de estudo de aplicao de mtodos matemticos s cincias qumicas. O primeiro qumico a utilizar esta expresso talvez tenha sido S. Wold (Umea University Sucia), que trabalhava em mtodos de reconhecimento de padres. A quimiometria divide-se em algumas reas principais, muito pesquisadas e aplicadas atualmente como: processamento de sinais analticos, planejamento e otimizao de experimentos, reconhecimento de padres e classificao de dados [25] calibrao multivariada [26], monitoramento e modelagem de processos multivariados [27] e mtodos de inteligncia artificial [28]. A construo de modelos de regresso a partir de dados de primeira ordem, ou seja, dados que podem ser representados atravs de um vetor para cada amostra, tem sido a principal linha de pesquisa da quimiometria aplicada qumica analtica. A construo desses modelos denominada de calibrao multivariada.

2.2. Calibrao multivariada

A calibrao multivariada [29] pode ser definida como uma srie de operaes que estabelecem, sob condies especficas, uma relao entre medidas instrumentais e valores para uma propriedade de interesse

correspondente. Um modelo de calibrao, na verdade, uma funo matemtica (f) que relaciona dois grupos de variveis, uma delas denominada independente (X) e a outra denominada dependente (Y): 25

Y f (X) Xb

(2.1)

Esta etapa representa a calibrao e por isso o conjunto de dados empregado para essa finalidade chamado conjunto de calibrao. Os parmetros do modelo so denominados de coeficiente de regresso (b) determinados matematicamente a partir de dados experimentais. Aps construo do modelo, este deve ser validado. Nesta etapa, as variveis independentes obtidas para outro conjunto de amostras, so utilizadas em conjunto com os coeficientes de regresso para que sejam calculados os valores previstos para a varivel dependente. No conjunto de validao utilizam-se amostras cujas variveis dependentes sejam conhecidas para que seja possvel estabelecer uma comparao entre os valores previstos, calculados na etapa de validao, e os valores conhecidos previamente atravs de metodologia padro, o que permitir a avaliao sobre o desempenho do modelo de calibrao proposto. O mtodo de calibrao multivariada mais utilizado e considerado como padro dentro da rea, o mtodo dos mnimos quadrados parciais (PLS, do ingls Partial Least Squares) [30]. A base do PLS decompor a matriz (X) das variveis independentes e a matriz (Y) das variveis dependentes, em um produto de duas matrizes menores mais uma matriz de erro, como segue:

X

TP E

(2.2) (2.3)

Y

UQ F

em que as matrizes T e U so chamadas de matrizes dos escores; P e Q matrizes dos loadings; E e F as matrizes de erro de X e Y respectivamente. Esta decomposio muito til nos casos em que a matriz X mal condicionada, ou ainda, quando o nmero de amostras menor que o nmero de variveis 26

independentes visto que podemos utilizar uma matriz T de dimenso inferior a da matriz X sem perda de informao til, eliminando rudo e colinearidade dos dados. Efetuando a decomposio anterior, o prximo passo ajustar uma relao linear, quando possvel, entre U eT, como segue:

U

bT

e

(2.4)

em que b o coeficiente do ajuste, usualmente obtido com algoritmo NIPALS. Finalmente, podemos substituir U na equao 2.3, e obter:

Y

bTQ

F

(2.5)

e portanto, podemos obter os escores da matriz Y a partir dos escores da matriz X e vice-versa. Terminada e etapa de calibrao pode-se fazer previses para amostras desconhecidas. Para tanto basta obter os escores da matriz X, o qual pode ser transformado em concentrao, atravs da equao 2.5.

2.3. Pr-processamento dos sinais analticos

Outra etapa importante no desenvolvimento de um modelo de calibrao a etapa de pr-processamento. Muitas vezes os dados a serem modelados so expressos em grandezas diferentes, apresentam muitos rudos, interferentes fsicos que possam prejudicar o desempenho do modelo. Assim tratamentos so realizados nos dados antes do desenvolvimento do modelo de calibrao.

27

2.3.1. Remoo do rudo experimental: o filtro de transformada de Fourier

A idia bsica deste tipo de filtro aplicar-se a transformada de Fourier direta, dada pela Equao 2.6, para que se obtenha o sinal analtico representado no domnio das freqncias w , ou melhor, aplicamos a transformada de Fourier direta para obter o espectro de freqncias F(w), do sinal analtico[31].

Fw

1 2

f

ei

w

d

(2.6)

Na Equao 2.6,

representa o domnio original do sinal analtico e f representa os comprimentos de onda, para

o sinal analtico. Para espectros, cromatogramas, ou fiagramas,

representa a varivel tempo e assim por diante.

Uma vez obtido o espectro de freqncias do sinal analtico, devemos cortar as freqncias altas, visto serem estas freqncias, na grande maioria dos casos, relacionadas ao rudo instrumental. Finalmente aplicamos a transformada de Fourier inversa, dada pela Equao 2.7 e recuperamos o sinal analtico inicial, livre de rudo.

f

1 2

Fwe

i w

dw

(2.7)

A seqncia de operaes utilizada no processo de remoo de rudo, atravs da transformada de Fourier, pode ser facilmente entendida se observarmos a Figura 2.1.

28

Sinal Analtico com rudo

Transformada de Fourier direta

F w

1 2

f

ei w d

Espectro de frequncias do sinal analtico, com as frequncias do rudo

Corte das frequncias relativas ao rudo instrumental

fSinal Analtico sem rudo

1 2

F we

i w

dw

Transformada de Fourier inversa

Espectro de frequncias do sinal analtico, sem as frequncias do rudo

Figura 2.1. Representao esquemtica da seqncia de operaes utilizada na aplicao do filtro de transformada de Fourier.

2.3.2. Correo do espalhamento multiplicativo

O mtodo de correo de espalhamento multiplicativo (MSC - do ingls, Multiple Scatering Correction) [32] comumente aplicado em espectroscopia para a correo de linha base, proveniente principalmente da no homogeneidade da distribuio de partculas na matriz. Este mtodo assume que os comprimentos de onda da luz espalhada possuem uma dependncia distinta entre a luz espalhada e a absorvida pelos constituintes da amostra. Portanto teoricamente, possvel separar estes dois sinais. Este mtodo tenta remover o efeito do espalhamento pela linearizao de cada espectro por um espectro ideal. Para efeito de clculo, considera-se que o espectro ideal o espectro mdio do conjunto de dados para o qual deseja realizar a correo da linha base. Em seguida, utiliza-se uma regresso linear para calcular o coeficiente angular e linear do grfico entre o espectro ideal e o espectro que vai ser corrigido. O espectro corrigido calculado subtraindo cada 29

ponto do espectro pelo valor do coeficiente linear e dividindo este valor pelo coeficiente angular. A tcnica muito simples e pode ser facilmente entendida se acompanharmos a seqncia de operaes abaixo [33]. Matematicamente, e resumindo, a correo feita da seguinte forma:

1. A partir do conjunto total de espectros , calcula-se o espectro mdio x ; 2. Faz-se a regresso linear para cada um dos k espectros ( x ik ) do conjunto total de espectros, contra o espectro mdio, sobre todos os i comprimentos de onda:

xik3. Correo final:

uk

k

xi

(2.8)

x

corrigido ik

no x ik

corrigido

uk(2.9)

k

2.3.3. Transformao padro normal de variao

Normalmente, os espectros Raman apresentam problemas de linha base, inclinaes e algumas vezes curvaturas, devido principalmente ao espalhamento de luz. O espalhamento fortemente dependente do comprimento de onda da luz, do tamanho das partculas, do ndice de refrao etc. Para minimizar este efeito, necessrio o uso de tcnicas como a transformao padro de variao (SNV do ingls Standard Normal Variate) [34]. Esta tcnica aplicada para corrigir os efeitos do espalhamento multiplicativo e o tamanho da partcula, de maneira anloga correo de espalhamento multiplicativo (MSC). 30

Apesar do MSC e SNV terem a mesma finalidade, ou seja, corrigir a linha base espectral, estas duas tcnicas so bem diferentes. O SNV no necessita de um espectro ideal, ou seja, de um espectro mdio para fazer a correo dos espectros. A correo realizada pela normalizao de cada espectro para o seu prprio desvio padro, conforme ilustrado pelas equaes 2.10 e 2.11a seguir:

p

Mdia do espectro

xij

xi 1 p

(2.10)

Espectro corrigido

X i SVN

Xip

xi xi2

(2.11)

Xij 1

p 1

em que X representa uma matriz com n espectros e p comprimentos de onda,x i a mdia do vetor contendo o espectro i da matriz X .

2.3.4. Ortogonalizao dos espectros: o mtodo de Gram-Schmidt

Dados dois vetores linearmente independentes no espao n-dimensional

R n pode-se obter um vetor ortogonal a qualquer um deles. Por exemplo, suponhaque um espectro qualquer (obtido em qualquer regio do espectro eletromagntico) seja um dos vetores, aqui chamado de u, e o outro vetor o espectro dos interferentes, isto , aquilo se deseja eliminar do espectro u, por exemplo, espectro do solvente e cubeta, fluorescncia da matriz, rudo do branco, ou seja, tudo que no for correlacionado a medida de interesse, aqui chamado de v. Sabendo-se o que se deseja eliminar (v) o prximo passo projetar o espectro 31

u na direo do espectro v. Assim, dentro de certo limite numrico computacional, a contribuio de v em u, como representado na Figura 2.2 [35].

10 y 8 u

6

b.u

4 Vetor ortogonal que procuramos 2 u' 0 x -2 -b.u -4 v

-6

-8

-10 -10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

Figura 2.2. Ortogonalizao de vetores para remoo da fluorescncia usando o mtodo de Gram-Schmidt.

Subtraindo o vetor u (espectro u) do espectro u, tem-se o espectro u sem a contribuio do espectro v dos interferentes. Isto o que realizado pelo mtodo de Gram-Schmidt.

2.3.5. Dados centrados na mdia

A centralizao na mdia [36] consiste em fazer com que para cada varivel seus valores tenham mdia zero. Para centrar os dados na mdia, obtmse para cada coluna o valor mdio e, em seguida, subtrai-se este valor de cada varivel dessa mesma coluna. Desta forma, ocorre a mudana do sistema de

32

coordenadas para o centro dos dados. A equao 2.12 utilizada para centrar os dados na mdia.

x i , j cm

xi , j

xj

(2.12)

em que, x i , j cm corresponde ao valor centrado na mdia para a varivel j na amostra i ; x i , j o valor da varivel j na amostra i e x j a mdia das amostras na coluna calculada pela equao 2.13 .

xj

1 n

n

xi , ji 1

(2.13)

onde n representa o nmero de amostras.

2.3.6. Normalizao dos espectros

A normalizao [37] usada principalmente para remover variao sistemtica, geralmente associada com tamanho da amostra. Na normalizao, dividem-se cada uma das variveis de uma dada amostra i por um fator de normalizao, ou seja, pela norma da amostra i, representada por resultado que todas as amostras estaro numa mesma escala.

xi . O

xij ( norm )As normais utilizadas so:

xij xi

,

j

1 2,..., J ,

(2.14)

xi

max x ij1 j J

norma sup, ou l

J

xi

1 j 1

x ij33

norma l1

J

xi

2 j 1

2 x ij

norma Euclidiana ou norma l 2

Normalizao pela norma sup: a resposta mxima de cada uma das amostras se torna igual a 1. Normalizao pela norma l1: a rea sob cada um dos espectros unitria. Normalizao pela norma l2: cada espectro ter comprimento igual a 1. 2.3.7. Compresso de dados: anlise de componentes principais Os instrumentos analticos nos permitem medir simultaneamente, de modo rpido e eficiente uma enorme quantidade de dados de um sistema qumico. Com o avano e a chegada de computadores em laboratrios, e com o interfaceamento entre instrumentos e computadores, aliados a poderosas ferramentas matemticas deram ao qumico analtico uma grande habilidade em transformar dados em informaes teis, pois nem sempre o aumento no nmero de dados aumenta as informaes sobre o sistema de interesse, uma vez que nem todos os dados possuem informaes relevantes sobre o sistema. Assim, necessria a utilizao de mtodos matemticos que nos permitem a compresso deste conjunto de dados obtidos do sistema em questo, em um conjunto de dados ainda muito menor, mas que possua as mesmas informaes realmente teis, para a anlise e modelamento do sistema. Existe uma srie de mtodos destinados compresso de dados, entretanto, o mais usado o mtodo fundamentado na anlise dos componentes principais (PCA do ingls, Principal Component Analysis) [38]. A idia bsica da anlise de componentes principais achar combinaes lineares entre as variveis independentes, de modo a reduzir a sua dimenso em um conjunto muito menor de dados, que ainda contenha as principais informaes sobre o sistema em questo. Na anlise de componentes principais, a matriz das variveis independentes (os espectros) decomposta em uma soma de matrizes 34

menores, que no podem mais ser reduzidas, mais uma matriz de erros, como se segue:

X

t1pT 1

t 2pT 2

t kpT k

E

(2.15)

em que E uma matriz de erros t i e p iT so os escores e loadings, respectivamente, da matriz das variveis independentes [39]. Um conjunto de espectros pode ser matematicamente interpretado na forma de matrizes. Estes espectros, isto , a matriz chamada de espao vetorial

R m . Para que esta matriz seja comprimida, devemos achar o subespao vetorialR n , em que nm . Este subespao, ou seja, esta nova base, onde a matriz ser

projetada so os autovetores ou componentes principais. Para se obter os autovalores, devem-se achar primeiramente os autovetores da matriz, pois para cada autovalor obtido h um autovetor correspondente. O maior autovalor corresponde ao maior autovetor, o qual captura a maior parte da varincia na matriz, o segundo maior autovalor, corresponde ao segundo maior autovetor, que captura o resduo da varincia a qual no faz parte da varincia do primeiro autovetor. Esta varincia capturada acumulativa, no entanto vale lembrar que devemos pegar os autovetores responsveis por 95% da varincia na matriz dos espectros, sendo que devemos levar em considerao 5% para erros aleatrios [40]. Quando se projeta a matriz dos espectros nessa nova base, ou seja, nos autovetores, (esta projeo nada mais que uma multiplicao) obtm-se a matriz reduzida chamada escores e os loadings que significam as regies de maior importncia (de maior peso) dos escores.

35

2.4. Validao: figuras de mrito

O bom desempenho de qualquer tcnica analtica depende crucialmente de dois parmetros: a qualidade das medidas instrumentais e a confiabilidade estatstica dos clculos envolvidos no seu processamento. Uma forma de assegurar a aplicabilidade e o alcance de um mtodo durante as operaes de rotina de um laboratrio estabelecendo os limites destes parmetros por meio da estimativa das figuras de mrito, numa etapa conhecida como validao [41]. A validao um processo de averiguao da performance de um mtodo, com o intuito de avaliar se este apresenta uma performance adequada para as condies nas quais ser aplicado. O processo de validao deve ser realizado sempre que um procedimento analtico proposto ou desenvolvido. A validao de um mtodo estabelece, por estudos sistemticos realizados em laboratrio, que o mtodo atende ao seu propsito e s normas impostas por rgos de fiscalizao nacionais e internacionais [42]. A validao pode ser atestada atravs da determinao de parmetros conhecidos como figuras de mrito, que, dependendo de onde o mtodo ser aplicado, do seu propsito e ou do rgo de fiscalizao a que estar sujeito, o nmero de figuras de mrito ou nvel que deve ser atingido em cada uma delas, pode variar [43]. As figuras de mrito so, portanto, os indicadores quantitativos do escopo e do bom desempenho das tcnicas, e so descritas na literatura especializada como [44]: - Exatido - Preciso - Sensibilidade - Seletividade - Linearidade - Razo sinal/rudo - Limite de deteco - Limite de quantificao 36

- Robustez A maneira pelas quais essas figuras de mrito devem ser determinadas estabelecida pelos rgos de fiscalizao e encontra-se descrita em normas especficas, guias de validao e trabalhos cientficos. Entretanto, a maioria dos guias, normas e trabalhos cientficos, ainda so referentes calibrao univariada e so poucos os trabalhos cientficos que realizam a determinao de figuras de mrito para validao de modelos de calibrao multivariada [45]. No Brasil, os dois rgos que regulamentam a validao de mtodos analticos so a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA) [46] e o Instituto Nacional de Metrologia, Normalizao e Qualidade Instrumental (INMETRO).

2.4.1. Exatido

Este parmetro se reflete proximidade entre os valores de referncia e os valores encontrados pelo modelo de calibrao, e relaciona-se com o erro absoluto de uma medida [47]. Em quimiometria este parmetro geralmente expressado como a raiz quadrada do erro quadrtico mdio de previso (RMSEP do ingls root mean square error of prediction) [48] conforme descrito na equao 2.16:

RMSEP

(yi

y i )2 N

(2.16)

em que N representa o nmero de amostras utilizadas na previso, y i e yi representam os valores de referncia e os valores preditos pelo modelo de calibrao.

37

2.4.2. Preciso

O termo preciso fornece a disperso dos valores medidos em torno de um valor mdio [49], e seu valor numrico estimado pelo desvio padro relativo, ou DPR, para anlises de amostras contendo a mesma quantidade das espcies de interesse. O DPR ainda conhecido como CV (coeficiente de variao), ou ainda pela sigla RSD proveniente do ingls Relative Standard Deviation e seu clculo realizado como descrito na equao 2.17, em que s o desvio padro descrito na equao 2.18 e x o valor mdio do nmero total de medidas N descrito na equao 2.19:

RSDN

100 s x

(2.17)

( xi si 1

x )2

N 1N

(2.18)

xi xi 1

N

(2.19)

Em que xi representa cada uma das medidas individuais. 2.4.3. Sensibilidade

Este parmetro a frao do sinal analtico que devido ao aumento da concentrao de um analito em particular em unidade de concentrao. A sensibilidade definida como o inverso da norma do vetor coeficientes de regresso (bk) do modelo de calibrao [50].

SEN

1 bk38

(2.20)

em que bk o vetor dos coeficientes de regresso estimados pelo PLS. Quando o NAS [51] determinado, o vetor de sensibilidade lquida s nas para k cada amostra do conjunto de calibrao pode ser determinado a partir do vetor A,k x nas como:

snas k

x nas A,k y

(2.21)

Em que, o vetor de sensibilidades s nas deve ser igual para todas as amostras de k A,k calibrao, x nas o vetor de sinal analtico lquido para a espcie k, y o vetor

que contm os valores de referncia. O escalar SN, pode ser determinado por:

SEN

snas k

(2.22)

2.4.4. Sensibilidade Analtica A sensibilidade analtica () no abordada em normas ou guias de validao. No entanto, esse parmetro apresenta a sensibilidade do mtodo em termos da unidade de concentrao que utilizada, sendo definida como a razo entre a sensibilidade e o desvio padro do sinal de referncia (x) [52] :

SEN x

(2.23)

em que, SN obtido atravs das equaes (88) ou (90) e x o desvio padro do sinal de referncia estimado atravs do desvio padro do valor de NAS para os espectros do sinal de referncia. 39

O inverso desse parmetro, ou seja, (-1), permite estabelecer a menor diferena de concentrao entre amostras, que pode ser distinguida pelo mtodo.

2.4.5. Linearidade

Em modelos de calibrao multivariada uma medida quantitativa da linearidade no corresponde a uma tarefa simples, ou mesmo possvel. Qualitativamente, grficos de resduos e dos escores contra a concentrao, os quais devem ter comportamento aleatrio e linear, respectivamente, podem indicar se os dados seguem ou no o comportamento linear [53].

2.4.6. Sinal analtico lquido

A validao de modelos de calibrao multivariada pode ser feita com base no clculo de parmetros que assegurem que o modelo apresenta performance adequada e dentro dos objetivos desejados. Em calibrao multivariada o conceito de Sinal Analtico Lquido [54] (NAS - do ingls Net Analyte Signal), exerce uma importante funo na determinao de figuras de mrito. O mtodo para o clculo do NAS para modelos multivariados de calibrao inversa foi proposto por Lorber [55]. O NAS definido, para uma propriedade de interesse k, como sendo a parte do sinal analtico que ortogonal s contribuies de possveis interferentes presentes na amostra. Sua propriedade de ortogonalidade pode ser observada pela representao geomtrica da Figura 2.3:

40

Figura 2.3. Representao geomtrica da propriedade de ortogonalidade do NAS.

No clculo do NAS, primeiramente a matriz X reconstruda com A variveis latentes gerando a matriz X A (decomposta em escores e loadings), em

seguida determinada a matriz X A, k , que a matriz que contm a informao detodas as espcies presentes na amostra exceto da espcie de interesse k, descrito na equao 2.24:

X A,

k

[I y A,k y A,k ]X A

(2.24)

em que y A o vetor de concentraes da espcie de interesse k estimado com A variveis latentes, X A o vetor de respostas instrumentais de uma amostra

estimado com A variveis latentes e

o ndice + sobrescrito indica ak

pseudoinversa da matriz em questo. Isso faz com que a matriz X A,

fique livre

de qualquer contribuio da espcie k. O vetor NAS ento obtido como:

X nas A,k

[I XT , k ( XT k ) ]X A A A,

(2.25)

Uma vez que X nas livre de interferentes, possvel substitu-lo por uma A,k

representao escalar sem perda de informao. Assim temos:

41

nas

X nas A,k

(2.26)

em que || || representa a norma Euclidiana do vetor X nas . A,k

Com a possibilidade de calcular um valor escalar livre de interferentes, a partir de um vetor contendo contribuies de constituintes desconhecidos, torna-se possvel a construo de uma nova forma de calibrao multivariada, em que o modelo pode ser representado em uma forma univariada. Primeiro o clculo do NAS feito para as i amostras de calibrao, em seguida o coeficiente de

regresso determinado por mnimos quadrados entre o vetor nas e o vetor deconcentraes y:

bnas

(nasTnas) 1nasT y

(2.27)

E o modelo de regresso pode, ento, ser representado por:

y

bnas nas

(2.28)

Se os dados foram centrados na mdia, antes da determinao do coeficiente de

regresso bnas , o vetor nas precisa ser corrigido de forma a evitar um erro de sinalque introduzido pelo uso da norma Euclidiana. Esta correo pode ser feita pela multiplicao de cada elemento do vetor nas pelo seu sinal correspondente no vetor ( yy ) , onde y a mdia do vetor y que contm os valores de referncia.

2.4.7. Razo sinal/rudo

Em calibrao univariada, a razo sinal/rudo, S/N k,i [56] , representa o quanto do sinal do analito maior do que o rudo instrumental. No caso da

42

calibrao multivariada, esta razo indica o quanto da intensidade do NAS da espcie de interesse est acima do desvio padro do sinal de referncia:

S / Nk ,i

nask ,i x

(2.29)

em que, nsk,i o valor escalar do sinal analtico lquido para a amostra i e x o desvio padro do sinal de referncia.

2.4.8. Robustez

Em processos industriais, ou mesmo em anlises de bancada, existem diversas variveis instrumentais ou ambientais, que no so possveis de se controlar. Alguns exemplos so a umidade, temperatura, pequenas variaes na quantidade dos componentes para a formao de um produto na indstria, entre outros. Para tanto, um mtodo analtico robusto no deve ser sensvel a esses tipos de variaes, pois isto acarretaria na introduo de erros que podem ser significativos ao resultado. A robustez [57] em calibrao multivariada, consiste em testar a performance do modelo de calibrao multivariada frente a alguns tipos de variaes e averiguar se estas so ou no significativas.

2.4.9. Limite de deteco e quantificao

O limite de deteco (LD) e o limite de quantificao (LQ) [58] de um procedimento analtico expressam respectivamente, as menores quantidades da espcie de interesse que podem ser detectadas e determinadas

quantitativamente. Para um conjunto de dados que apresenta comportamento homoscedstico (varincia constante ao longo da faixa de trabalho, erros com previso no correlacionados e que seguem uma distribuio normal), os LD e LQ na calibrao multivariada podem ser calculados por:

43

LD

3x bk

3x

1 SEN1 SEN

(2.30)

LQ 10x bk

10x

(2.31)

em que, x o desvio padro do sinal de referncia, bk o vetor dos coeficientes de regresso do modelo PLS para a espcie k, SN corresponde ao valor de sensibilidade obtido atravs das equaes 2.20 ou 2.22.

2.4.10. Seletividade

Seletividade [59] a medida do grau de sobreposio entre o sinal da espcie de interesse e os interferentes presentes na amostra e indica a parte do sinal que perdida por essa sobreposio. Para modelos de calibrao multivariada esse parmetro definido como: nas i xi

SEL

(2.32)

Em que nas i o escalar NAS estimado para amostra i e xi o vetor de dadosoriginais. O valor de seletividade estimado a partir da expresso 2.32 informa quanto do sinal original usado na calibrao por no ser ortogonal propriedade de interesse. Dessa forma, a seletividade calculada a partir dessa equao no se refere ao sentido geralmente empregado para o termo em qumica analtica, com modelos univariados, e sim a uma forma de estimar quanto do sinal perdido por ortogonalidade.

44

CAPTULO 3OBTENO DO EFEITO SERS

45

Nesta tese, o efeito SERS foi obtido pela deposio do analito em ouro coloidal. Apesar da literatura reportar a possibilidade da utilizao de prata, ou mesmo cobre, no foi possvel obter resultados quantitativos em colides desses metais. Tambm foi avaliada a possibilidade de obter o efeito em sol-gel de ouro, mas tambm no foi observada amplificao significativa do sinal Raman neste caso. A seguir sero apresentados o procedimento experimental e a

caracterizao da suspenso de nanopartculas de ouro e espectros do efeito SERS.

3.1. Instrumentao

Os espectros Raman foram obtidos num espectrmetro Raman de baixa resoluo (Raman System,Inc) com LASER diodo, laser operando no

infravermelho prximo (785 nm) e detector do tipo CCD de 2048 elementos e interface grfica desenvolvida em ambiente MATLABTM. Espectros de deslocamento Raman foram obtidos na faixa de 700 a 2.000 cm -1, com tempo de integrao de 60 segundos.

3.2. Preparao da suspenso de nanopartculas de ouro

Para preparao dos substratos ativos, foram usados os seguintes reagentes: cido Tetracloroaurico (Sigma-Aldrich, Co.), Citrato de Sdio (Merck, Co.) gua deionizada Milli-Q, Cloreto de Sdio (Merck, Co.). A suspenso de nanopartculas de ouro foi preparada de acordo com a metodologia proposta por Lee-Meisel [60]. Foram adicionados 20 mL de uma soluo de cido tetracloroaurico 1mmol/L em um erlenmeyer de 50 mL, envolto por papel alumnio. Esta soluo foi aquecida at ebulio, onde em seguida, sob agitao vigorosa, foram adicionados 2 mL de uma soluo de citrato de sdio a 1%. O ouro (Au3+) gradualmente se reduz a (Au0) na presena do citrato de sdio. Neste ponto pode47

se perceber a formao de nanopartculas comprovada pela cor vermelha bem intensa da suspenso. Aps mudana de cor da suspenso, o aquecimento e agitao foram paralisados. Aps o resfriamento da suspenso de nanopartculas de ouro, foram adicionadas soluo 5 mL de cloreto de sdio 0,1 mol/L, cujo papel foi aglutinar as partculas de ouro para potencializar ainda mais a intensificao do sinal Raman.

3.3. Caracterizao da suspenso de nanopartculas de ouro

A suspenso de nanopartculas de ouro, preparada conforme relatada na parte experimental foi caracterizada pela espectrofotometria eletrnica de absoro no ultravioleta-visvel e tambm pela microscopia eletrnica de varredura. Alguns testes foram realizados para escolher a melhor soluo coloidal a ser utilizada nos experimentos. Dentre eles, foram-se adicionando 1 mL de cloreto de sdio 0,1 mol/L e obtendo-se os espectros UV/vis. para se ter uma idia do tamanho e distribuio das nanopartculas de ouro. Sabe-se que quanto mais o plasmon de absoro das partculas de ouro deslocado para a regio do vermelho, maiores so as partculas [61]. O objetivo, no entanto, aumentar os tamanhos das nanopartculas, com a adio da soluo de cloreto de sdio, fazendo com que seus plasmons de absoro se desloquem para a regio do vermelho para que possam entrar em ressonncia com a freqncia do laser do espectrmetro Raman e com isso intensificar o espalhamento Raman. Na figura 3.1 apresentado o espectro de absoro no UV-Vis da soluo de ouro coloidal. Nota-se que a absoro do plasmon superficial d origem a uma banda larga, com o mximo de absoro em torno de 527 nm. No caso deste substrato SERS ativo, teramos intensificao do campo eltrico para radiaes de comprimento de onda dentro da banda de absoro do plasmon (~370 e 600 nm). O mximo de absoro no espectro UV-VIS de solues coloidais est relacionado ao tamanho mdio das partculas, enquanto que a largura da banda de absoro relaciona-se disperso das partculas [62]. 48

O laser do espectrmetro Raman, utilizado para obteno das medidas, possui comprimento de onda de 785 nm e para que o efeito SERS tenha um mximo de intensificao, soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L foi adicionada suspenso com a finalidade de aumentar o tamanho das nanopartculas. medida que estas nanopartculas aumentam de tamanho, a banda de seus plasmons de absoro desloca-se para a regio do infravermelho prximo, fazendo com que o campo eltrico das nanopartculas entre em ressonncia com o campo eltrico do laser incidente aumentando significativamente o

espalhamento Raman. Nota-se, na figura 3.2, um deslocamento no plasmon de absoro para 700 nm aps adio de 1 mL de soluo de cloreto de sdio. As figuras 3.3, 3.4, 3.5 e 3.6 apresentam os respectivos deslocamentos de 725, 735, 740 e 745 nm.

0,80 0,75 0,70 0,65 0,60 0,55 0,50 527

Absorbncia

0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 450 500 550 600 650

Comprimento de onda (nm)

Figura 3.1. Espectro de absoro no ultravioleta-visvel da suspenso de nanopartculas de ouro.

49

0,70 0,65 0,60 0,55 0,50 0,45

700

Absorbncia

0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 550 600 650 700 750 800 850

Comprimento de onda (nm)

Figura 3.2. Espectro de absoro no ultravioleta-visvel da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 1 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L.0,70 0,65 0,60 0,55 0,50 0,45

725

Absorbncia

0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 550 600 650 700 750 800 850 900

Comprimento de onda (nm)

Figura 3.3. Espectro de absoro da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 2 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L. 50

0,60 0,55 0,50 0,45 0,40

735

Absorbncia

0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000

Comprimento de onda (nm)

Figura 3.4. Espectro de absoro da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 3 mL soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L.0,60 0,55 0,50 0,45 0,40

740

Absorbncia

0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000

Comprimento de onda (nm)

Figura 3.5. Espectro de absoro da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 4 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L. 51

0,50 0,45 0,40 0,35

745

Absorbncia

0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 550

600

650

700

750

800

850

900

950

1000

Comprimento de onda (nm)

Figura 3.6. Espectro de absoro da suspenso de nanopartculas de ouro contendo 5 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L.

Pode-se observar, pelos espectros apresentados, que a suspenso de nanopartculas de ouro que propiciar as melhores medidas ser a soluo contendo 5 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L. Tambm foram obtidas micrografias eletrnicas de varredura da referida suspenso, a fim de caracterizar o tamanho e homogeneidade das partculas de ouro da soluo coloidal. Foi utilizado um Microscpio Eletrnico de Varredura MEV Jeol JMS 6360-Lv com microssonda de Raios-X. A figura 3.7 mostra uma micrografia eletrnica de varredura onde as partculas brilhantes correspondem ao ouro metlico. Aumentando a resoluo da imagem (MEV), proveniente da figura 3.7, observamos na figura 3.8 a distribuio das partculas de ouro com formato esfrico uniforme, com tamanho mdio de 400 nm.

52

Figura 3.7. Microscopia eletrnica de varredura (MEV) da soluo de ouro coloidal contendo 5 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol/L.

Figura 3.8. Microscopia eletrnica de varredura (MEV) da soluo de ouro coloidal contendo 5 mL de soluo de cloreto de sdio 0,1 mol.L/L.

53

Para verificar o efeito SERS, primeiramente foram obtidos espectros Raman de solues de violeta genciana nas concentraes 1x10-3, 1x10-4 e 1x10-5 mol/L. Para isso, foram adicionados em uma cubeta de quartzo, 1 mL da suspenso de nanopartculas de ouro e 1 mL das solues de violeta genciana nas concentraes descritas acima e obtidos os espectros. Para comparao foram obtidos os espectros Raman sem o efeito SERS. A figura 3.9 mostra os espectros Raman das solues de violeta genciana, onde se pode observar que no h uma distino entre os espectros, apresentando apenas rudo. Na figura 3.10 so apresentados os espectros de duas solues de violeta genciana, onde aps processamento para eliminao da fluorescncia e normalizao dos espectros, nota-se claramente o efeito SERS com grande amplificao do espalhamento Raman.

Deslocamento Raman (cm-1)

Figura 3.9. Espectros Raman de violeta genciana.

54

Deslocamento Raman (cm-1)

Figura 3.10. Espectros Raman de violeta genciana na presena de ouro coloidal.

55

CAPTULO 4DETERMINAO DE PESTICIDAS EM GUA UTILIZANDO O EFEITO SERS

57

4.1. Introduo

Pesticida um termo usado para uma substncia ou misturas de substncias, sintticas ou naturais, que servem para controlar a proliferao de insetos, fungos, bactrias, ervas daninhas, roedores e outras pestes [63]. Com a crescente necessidade de fornecer alimentos populao torna-se indispensvel o controle das doenas, pragas e plantas invasoras, com a utilizao de pesticidas que se destaca entre as principais formas de controle, visando assegurar maior produtividade. Os primeiros grupos utilizados como pesticidas, foram substncias txicas de origem natural, tais como o piretro e a nicotina, alguns elementos inorgnicos como o mercrio e enxofre, alm da cal e alguns sais de arsnio [63]. Aps a segunda guerra mundial, o nmero de substncias novas e o uso extensivo dessas na agricultura aumentaram enormemente. O BHC e o DDT surgiram como uns dos mais importantes produtos qumicos, sendo usados em larga escala nas lavouras para combater insetos. Com o aumento do plantio de monoculturas, ocorreu o aparecimento de vrias pragas, as quais so combatidas pelo uso de pesticidas. Como resultado, diversos problemas ambientais surgem a cada momento, muitos deles praticamente irreversveis e de extrema relevncia. Como exemplo, pode-se citar as conseqncias ambientais da expanso do uso de produtos qumicos orgnicos sintticos, com nfase naquelas substncias cuja toxicidade chega a afetar a sade humana, especialmente no que diz respeito ao cncer e aos defeitos congnitos, assim como o bem-estar de organismos inferiores [64]. O impacto das atividades agrcolas modernas sobre a qualidade da gua subterrnea tornou-se conhecido na dcada de 70. Em particular, demonstrou-se a existncia de altas taxas de lixiviao de nitratos e outros ons mveis em muitos slos submetidos ao plantio contnuo. Com a contaminao das guas por pesticidas, e com o crescimento geomtrico da populao, o suprimento de gua potvel e de boa qualidade nas reas mais desenvolvidas torna-se cada vez mais difcil e de maior custo. A gua potvel e a no contaminao dos alimentos s 59

pode ser assegurada atravs de programas de monitoramento ambiental, que podero minimizar o risco de poluio [65]. Estudos desenvolvidos em vrias regies do mundo tm mostrado que a porcentagem dos produtos utilizados na agricultura que atingem os ambientes aquticos geralmente baixa. Entretanto, como foi citado no pargrafo anterior, os pesticidas com grande mobilidade no meio ambiente tm sido detectados, no s em guas subterrneas, mas tambm em guas superficiais. A concentrao da maioria dos pesticidas em gua baixa em parte devido ao fato de serem geralmente pouco solveis em gua e em parte devido ao fato da sua diluio. Isto, no entanto, no exclui a possibilidade de que concentraes muito altas venham a ocorrer atravs da eroso dos solos, pelo descarte, lavagem de tanques e embalagens, ou mesmo depois de chuvas torrenciais, especialmente quando as reas ao redor de um pequeno crrego tenham sido recentemente tratadas com altas doses de pesticidas. Todavia, mesmo em concentraes baixas, os pesticidas representam riscos para algumas espcies de organismos aquticos que podem concentrar estes produtos por at 1000 vezes. Devemos ressaltar que a preocupao com a contaminao de ambientes aquticos aumenta, principalmente, quando a gua usada para o consumo humano. Em conseqncia de sua toxicidade, a Agncia de Proteo Ambiental (EPA do ingls, Environmental Protection Agency) dos Estados Unidos e a Unio Europia (EU do ingls, European Union) incluram os pesticidas em suas listas de prioridades. A Unio Europia estabeleceu em sua diretriz a Concentrao Mxima Admissvel (CMA) de um pesticida individual na gua potvel de 0,1 g/L, sem, no entanto, ultrapassar 0,5 g/L quando se considera a soma total de todos os pesticidas. Limites semelhantes so adotados por outros pases, como Estados Unidos e Canad [66].

60

4.1.1. Classificao dos pesticidas quanto toxidade

Os pesticidas esto divididos em quatro classes toxicolgicas para o ser humano, conforme apresentado na tabela 4.1.

Tabela 4.1. Classificao toxicolgica de Pesticidas Classe I Classe II Classe III Classe IV Rtulo Vermelho Rtulo Amarelo Rtulo Azul Rtulo Verde Extremamente Txico Altamente Txico Mediamente Txico PoucoTxico

Devido grande diversidade de produtos existentes (somente no Brasil so cerca de 300 princpios ativos em 2 mil formulaes comerciais diferentes), os pesticidas podem ser classificados de acordo com sua funo, como por exemplo, inseticidas, herbicidas, fungicidas, algicidas, dentre outros, e tambm com de acordo com seu poder txico. Esta segunda classificao fundamental para o conhecimento da toxicidade aguda de um determinado pesticida. Os pesticidas podem ser classificados quanto afinidade (aficida, ovicida, larvicida, raticida, formicida, acaricida, inseticida entre outros) e quanto ao modo de ao (ingesto, contato, microbiano e fumegante) sendo possvel o enquadramento em mais de uma classe. Quanto origem, a diviso envolve os compostos inorgnicos (compostos de mercrio, brio, enxofre e cobre), os pesticidas de origem vegetal, bacteriana e fngica (piretrinos, antibiticos e fitocidas), e os pesticidas orgnicos. Os pesticidas orgnicos, que apresentam tomos de carbono em sua estrutura, constituem o maior grupo de produtos com alta atividade fisiolgica. As principais classes desses compostos so os organoclorados (OCs),

organofosforados (OPs) e Carbamatos [64]. Vamos nos ater neste trabalho em dois pesticidas dos mais

comercializados nos Brasil. O endosulfan que compem a classe dos organoclorados e o metamidofs que compem a classe dos organofosforados. 61

4.2. Pesticida Metamidofs

O pesticida de ingrediente ativo ou nome comum metamidofs, com nome qu