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Desenvolvimento de Métodos Bionalíticos Aplicação em HPLC
Farmacologia Clínica
Universidade Mogi das Cruzes
Março 2004
Princípios Gerais
Em uma análise quantitativa de fármacos em matriz
biológica deve-se tomar cuidado em todas as etapas, para
evitar erros. A amostra a ser analisada deve ser
representativa do total; não deve haver perdas e nem
contaminações durante seu preparo.
A etapa de separação dos componentes da amostra
no cromatógrafo também pose ser fonte de erros como:
• Adsorção irreversível de parte da amostra na fase
estacionária
• Resposta do detector afetada por alterações de
temperatura e vazão
• Quantidade de amostra injetada for da faixa linear
do detector e etc.
Após a obtenção do cromatograma, faz a in-
tegração dos sinais, que tem por finalidade trans-
formar a intensidade do sinal emitido pelo detector
em uma medida relacionada com a quantidade da
substância analisada na amostra.
A integração dos sinais pode ser feita usando
os seguintes métodos:
• Altura do pico: Este método não é muito usado
porque sofre influência de variações
instrumentais. Trata-se de uma perpendicular à
linha de base passando pela inflexão máxima do
pico; a medida desde a linha de base até este
ponto de inflexão máxima deste pico;
corresponde a altura do pico.
• Área do pico: Pode-se calcular a área do pico
traçando -se tangentes nos dois lados do pico; a
intersecção destas duas tangentes com a linha
de base fornece um triângulo cuja área pode ser
calculada pela fórmula:
A = a x w 2
Onde: A = área do pico
a = altura do pico
w = largura do pico na linha de base
A área também pode ser calculada
utilizando-se a largura na meia meia altura, isto é,
formando um triângulo na metade superior do
pico. Neste caso, a area é calculada:
A = a x wH
onde: W H = largura do pico na meia altura
1 2 3
aa
w
a2
WH
Métodos para a integração dos sinais fornecidos pelo registrador:
1. altura pelo pico
2. área do pico
3. área na meia altura
Com base nas medidas obtidas na
integração,
estas poderão ser relacionadas com a
concentração de uma dada substância na amostra,
através dos seguintes métodos:
• Normalização: Este método requer que todas as
substâncias presentes na amostra sejam eluídas,
e que a resposta do detector seja idêntica para
todas. Consiste em comparar a área obtida no
cromatograma com a porcentagem da
composição da mistura.
% A = área A x 100
área total
• Fator de resposta: Se o detector não responde de
maneira similar para todas as substâncias
presentes na amostra, é necessário corrigir esta
equação usando o chamado fator de resposta que é
determinado como a porcentagem conhecida e
observada para cada composto. Assim por
exemplo:
fA = % A conhecida
% A observada
Para calcular a porcentagem da substância
presente na amostra, basta multiplicar a área
obtida pelo fator de resposta e dividir pela
somatória de todas as áreas multiplicadas pelos
respectivos fatores de resposta.
• Calibração externa: Este método compara a área da
substância a ser quantificada na amostra com as
áreas obtidas desta mesma substância em
soluções padrão de concentrações conhecidas.
Dessa forma obtém-se um gráfico, relacionando as
áreas obtidas com as concentrações estabelecidas.
Utilizando este gráfico, pode-se calcular a
concentração desta substância com a amostra.
Este método é sensível a erros de injeção das
soluções padrão e das amostras, bem como a
erros relacionados com a preparação dos padrões.
Calibration curve
0 250 500 750 1000 1250
0
500
1000
1500
Slope
Y-intercept
X-intercept
1/slope
95% Conf idence Intervals
Slope
Goodness of Fit
r²
0.9644 ± 0.03746
-5.000
5.185
1.037
0.8727 to 1.056
0.9910
C (ng/mL)
Áre
a
• Padronização interna: Consiste em adicionar uma
quantidade conhecida de uma sunstância padrão na
amostra a ser analisada, e relacionar ad duas áreas
resultantes. Normalmente, uma substância
empregada como padrão interno deve possuir
características:
– mesma similaridade à substância em análise
– ter concentração e tempo de retenção a
substância em exame
– inerte
– não fazer parte da amostra analítica
– ter um perfil cromatográfico característico e
diferente das demais substâncias presentes na
amostra
Após a análise dessas substâncias constrói-se um
gráfico, relacionando a razão de áreas (Ax/Api) com a
concentração desta substância. Através da razão de
áreas obtidas no cromatograma tem-se a concentração
da substância na amostra, utilizando o gráfico da
calibração externa.
Este método é menos sensível a erros de
injeção, variações instrumentais, etc. É o melhor
método para análise quantitativa.
Calibration curve
0 250 500 750 1000 1250
0
500
1000
1500
Slope
Y-intercept
X-intercept
1/slope
95% Confidence Intervals
Slope
Goodness of Fit
r²
0.9644 ± 0.03746
-5.000
5.185
1.037
0.8727 to 1.056
0.9910
C (ng/mL)
Ra
tio
(A
x /
AP
I)
General Procedure of Liquid/Liquid
Extraction
Applied Bioequivalence Studies
Step 1 Step 2 Step 3
SampleSample
+Internal standard
Vortexmixing
Step 4 Step 5 Step 6
Adittion OrganicSolvent
sample extractionvortex mixing
Centrifugation
Separation phases Collection organic phase
Driedorganic phase
N2
Step 7 Step 8 Step 9
Reconstitutedsample
Brief mixing
Injection sample
Step 10 Step 11 Step 12
Phase Solid Extraction
Quantitative Determination of Drugs in Serum by HPLC
Applied Bioequivalence Studies
Determination of diclofenac in Human Plasma by HPLC
Method:
• System Chromatography: consisted of a LKB-Bromma 2150
HPLC, pump coupled to a VWM 2141 dual wavelenght UV
detector (Pharmacia-LKB,Uppsala, Sweden). The output sinal
was registered in a Nryans 28000 chart recorder ( Bryan
Souththern Instruments, Kent, Great Britain)
• Mobile Phase: acetonitrile;water (40:60, v/v) and 0.1 mol/L
acetic acid solution; the pH was ajusted to 5.6 with 3 mol?L
sodium hidroxide.
• Flow rate: 2.3 mL/min
• Column Chromatography: Spherisorb ODS-25mm, 4.6 mm x
250mm Sigma Aldrich (ST. Louis,MO,USA
• Detection: 276nm (U.V absorbance)
500 µL calibretion point or serum sample + 580 ng Indometacina (I.S) + 200 µL of 5% phosphoric acid
4 mL Dicloromethane
Phase organic washed with 200 µL amonium acetate 1:20 in water
Brief vortex mixing
Extraction Procedure
Vortex mixing 1 min
Centrifuged 2000 rpm 10 min
Centrifuged 2000 rpm 2 min
Organic Phase 45 ºC under nitrogen stream
The residue
100 µL of acetonitrile
Analytical Sample
20 µL
Determination of Terbinafine in Human Plasma by LC/MS-MS
Method:
• System Chromatography: consisted of a Hewlett Packard
HPLC, binary pump, autosampler injector, degasser,
thermostat column, variable-wavelenght UV, coupled a The
Quatro II (Micromass, Altringham, Cheshire UK equipped with a
electrospray source.
• Mobile Phase: Acetonitrile:water (80:20) containing 10 mmol/L
formic acid
• Flow rate: 0.50 mL/min
• Column Chromatography: Genius C18 4um analytical
column (150 mm x 4.6 mm i.d) 40°C
• Detection: The Quatro II equipped with a electrospray
source using a crossflow counter electrode in mode (ES+)
and mutiple reaction mode (MRM), monitoring 292.2>140.7
and. 288.2>116.9 for terbinafine and naftifine, repectively.
The cone voltage and collission energy were 35V and 15 eV
for terbinafine and 12 eV for naftifine.
200 µL calibretion point or serum sample + 20 µL Naftifine ( 1 µg/mL methanol: water 50:50)
4 mLDiethyl Ether:Hexane (80:20)
Organic Phase 37 ºC under nitrogen stream
Brief vortex mixing
Extraction Procedure
Vortex mixing 1 min
Centrifuged 2000 rpm 10 min
The residue200 µL of acetonitrile: water (80:20)
containing 10 mmol/L formic acid
Analytical Sample
50 µL
Determination of Fluconazole in Human Plasma by LC/MS-MS
Method:
• System Chromatography: consisted of a Hewlett Packard
HPLC, binary pump, autosampler injector, degasser,
thermostat column, variable-wavelenght UV, coupled a The
Quatro II (Micromass, Altringham, Cheshire UK equipped
with a electrospray source.
• Mobile Phase: Acetonitrile:water (40:60) containing 5 mM
acetic acid pH= 3.7
• Flow rate: 0.9 mL/min isocratic gradient
• Column Chromatography: Genesis C18 4um analytical
column (10 mm x 4.0 mm i.d) 40°C
• Detection: The Quatro II equipped with a electrospray
source using a crossflow counter electrode in mode (ES+)
and mutiple reaction mode (MRM), monitoring 171.8>127.7
and 306.9>219.8 for metronidazole and fluconazole,
repectively. The cone voltage and collission energy were
30V and 20eV, respectively.
200 µL calibretion point or serum sample + 200 µL of carbonate-bicarbonate buffer containing metronidazole (I.S) 1 µg/mL
3 mL Diethyl ether/dicloromethane (70:30)
Organic Phase 37 ºC under nitrogen stream
Brief vortex mixing
Extraction Procedure
Vortex mixing 5 min
Centrifuged 2000 rpm 10 min
The residue
Acetonitrile:water (40:60) containing 5 mM acetic acid
Analytical Sample
10 µL
Propanolol in Serum
HPLC Method
• Column: Symmetric Shield ® RP8 3.9 x 150 mm, 5 µm
• Guard Column: Sentry guard column, 3.9 x 20 mm, 5 µm
• Mobile Phase: 20mM phosphate potassium, pH 7/methanol
39:62
• Flow rate: 1 mL/min
• Injection volume: 20 µL porcine serum
• Temperature: 30 Cº
• Detection: 254 nm (U.V)
• Components: Propanolol and Butyl Paraben (I.S)
Oasis® HLB Extraction MethodOasis® HLB 1cc/ 30 mg Extraction Cartridge
Condition1mL methanol/1ml water
Load1mL spicked porcine serum
Wash1mL 5% Methanol in water
Eluent1mL Methanol + 5µg butyl
paraben
Evaporate and Constitute40 ºC under nitrogen stream
200µL Methanol
Tetracyclines in Serum
HPLC Method
• Sample: 1 mL spicked porcine serum / 2% phosphoric acid
solution / demecycline as I.S
• Column: Symmetric Shield ® RP8 3.9 x 150 mm, 5 µm
• Guard Column: Sentry guard column, 3.9 x 20 mm, 5 µm
• Mobile Phase: 0.1 % TFA in water Acetonitrile:methanol (91:7:2)
• Flow rate: 0.9mL/min
• Injection volume: 20 µL porcine serum
• Temperature: 30 Cº
• Detection: 279 nm (U.V)
Oasis® HLB Extraction MethodOasis® HLB 1cc/ 30 mg Extraction Cartridge
Prepare SampleMix 20µL (H2 PO4) to 1mL serum
Condition1mL methanol
Rinse 1mL water
Load1mL sample
Elute1mL Methanol
Evaporate to 0.2 mL
Reconstitute with mobile phase
Wash1mL 5% Methanol in water
Sulfa Drugs in Serum
HPLC Method
• Column: Symmetric Shield ® RP8 3.9 x 150 mm, 5 µm
• Guard Column: Sentry guard column, 3.9 x 20 mm, 5 µm
• Mobile Phase: 1% glacial acetic acid and 4% methanol in water
• Flow rate: 1 mL/min
• Injection volume: 10 µL porcine serum
• Temperature: 25Cº
• Detection: 254 nm (U.V)
• Components: Sulfadiazine, Sulfathiazole (I.S) and Sulfamerazine
Condition1mL methanol/1ml water
Load1mL spicked porcine serum with 10µg/mL sulfathiazole
(I.S), 20 µL phosphoric acid
Wash1mL 5% Methanol in water
Oasis® HLB Extraction MethodOasis® HLB 1cc/ 30 mg Extraction Cartridge
Eluent1mL Methanol
Evaporate and Constitute40 ºC under nitrogen stream
1mL mobile phase