UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS

DESENVOLVIMENTO E EMPREGO DE VACINAS NO CONTROLE DOS PROTOZOÁRIOS PARASITOS DE RUMINANTES

Marcelo Sales Guimarães

Orientadora: Profa. Dra. Andréa Caetano da Silva

GOIÂNIA

2011

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MARCELO SALES GUIMARÃES

DESENVOLVIMENTO E EMPREGO DE VACINAS NO CONTROLE DOS PROTOZOÁRIOS PARASITOS DE RUMINANTES

Seminário apresentado junto à disciplina

de Seminários Aplicados do Programa de

Pós-Graduação em Ciência Animal da

Escola de Veterinária e Zootecnia da

Universidade Federal de Goiás.

Nível: Doutorado

Área de Concentração: Sanidade Animal, Higiene e Tecnologia de Alimentos

Linha de Pesquisa: Parasitos e doenças parasitárias dos animais

Orientadora: Profa. Dra. Andréa Caetano da Silva – IPTSP/UFG

Comitê de Orientação: Profa. Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis – IPTSP/UFG

Dra. Débora Pereira Garcia Melo – PNPD/EVZ/UFG

GOIÂNIA

2011

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1

2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................... 3

2.1 Aspectos importantes no desenvolvimento de vacinas ......................................... 3

2.2 Vacinas baseadas no agente vivo ......................................................................... 4

2.2.1 Theileria .............................................................................................................. 4

2.2.2 Toxoplasma gondii ............................................................................................. 7

2.2.3 Neospora caninum ............................................................................................. 8

2.2.4 Babesia .............................................................................................................. 9

2.3 Vacinas baseadas no agente inativado, subunidades e antígenos recombinantes

.................................................................................................................................. 10

2.3.1 Theileria ............................................................................................................ 10

2.3.2 Toxoplasma gondii ........................................................................................... 11

2.3.3 Neospora caninum ........................................................................................... 11

2.3.4 Cryptosporidium parvum .................................................................................. 13

2.3.5 Babesia ............................................................................................................ 14

2.3.6 Tritrichomonas foetus ....................................................................................... 15

2.3.7 Sarcocystis ....................................................................................................... 16

2.3.8 Eimeria ............................................................................................................. 17

2.4 Aspectos econômicos no desenvolvimento de vacinas ....................................... 17

3 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................... 19

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 20

1 INTRODUÇÃO

Os protozoários estão entre os mais bem sucedidos organismos no

mundo, sendo capazes de sobreviver e se multiplicar em uma grande variedade de

hospedeiros. As doenças causadas por estes parasitas causam perdas produtivas de

grande importância nos rebanhos, como falhas reprodutivas, redução no ganho de

peso, contaminação da carne e redução na produção de leite, podendo chegar à

perda do animal. Além disso, protozoários como Cryptosporidium parvum e

Toxoplasma gondii representam risco potencial à população humana por serem

agentes zoonóticos.

Os protozoários apresentam ciclos biológicos complexos nos organismos

hospedeiros. Por meio de mecanismos adaptativos, desenvolveram diferentes

estratégias para a evasão da resposta imune do hospedeiro, de modo que consigam

sobreviver, se multiplicar e diferenciar até que se complete seu ciclo de vida

(DALTON & MULCAHY, 2001). Em situações particulares, a resposta imune do

hospedeiro acaba por favorecer a estabilidade e permanência do protozoário no

organismo parasitado. Exemplos clássicos são N. caninum e T. gondii, que diante da

ação de citocinas pró-inflamatórias como interferon gama, se diferenciam em

bradizoítos, desacelerando sua multiplicação e se perpetuando no hospedeiro no

interior de cistos teciduais (INNES et al., 2007).

Entender a relação parasito-hospedeiro é fundamental para nortear o

desenvolvimento de drogas e produtos imunobiológicos eficazes no controle destes

protozoários. Os mecanismos pelos quais iniciam a infecção, se estabelecem e se

multiplicam no organismo hospedeiro, bem como os principais eventos que podem

levar a uma evolução da doença, são importantes para possibilitar o

desenvolvimento e a implementação racional de estratégias de intervenção

adequadas.

Uma vez iniciado o processo de invasão do organismo hospedeiro, os

protozoários são capazes de induzir tanto a resposta imune inata quanto a

adaptativa. A indução destas respostas imunes e a forma como estas funcionarão no

2 papel de debelar o ataque são críticos na determinação do resultado da infecção. A

compreensão de como o sistema imunológico é capaz de proteger o hospedeiro

contra uma variedade de patógenos é um componente vital na concepção de vacinas

eficazes (DALTON & MULCAHY, 2001).

O mercado de anti-parasitários é um dos setores que mais cresce no

segmento pecuário. Enquanto a pesquisa, o desenvolvimento e a re-formulação de

drogas para o tratamento de parasitas de animais ainda dominam este setor, a

demanda dos consumidores por alimentos livres de produtos químicos e de

preocupações relativas ao impacto ambiental e bem-estar animal motivam o

interesse crescente no desenvolvimento de vacinas seguras e eficazes (DALTON &

MULCAHY, 2001).

O uso de vacinas vai de encontro à tendência crescente e irreversível de

um sistema de produção de proteína de origem animal dentro dos preceitos da

sustentabilidade. Promovem o controle das enfermidades, reduzindo a dependência

de drogas farmacológicas e pesticidas. Assim, melhoram a saúde e o bem-estar

animal, contribuem para a saúde pública por atuarem no controle de agentes

zoonóticos e de patógenos de origem alimentar nos animais, além de solucionarem

problemas associados à resistência aos quimioterápicos. Este aspecto contribui

ainda na manutenção do ambiente livre de resíduos químicos (INNES et al., 2011).

Diante da importância dos efeitos deletérios que os protozoários provocam

na produção pecuária, e com o entendimento que a adoção de estratégias de

controle baseadas no uso de vacinas é de grande importância em um sistema

sustentável de produção, este seminário busca abordar questões relacionadas à

pesquisa, desenvolvimento e uso de vacinas no controle de protozoários parasitos de

ruminantes domésticos.

3 2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Aspectos importantes no desenvolvimento de vacinas

Vacinas são imunobiológicos que, administrados em um indivíduo,

apresentam capacidade imunogênica e conferem a este proteção contra desafios

com organismos patogênicos em condições naturais (INNES et al., 2011).

As vacinas em uso na atualidade são formuladas baseando-se em três

categorias principais: contendo uma versão enfraquecida do patógeno original

(vacinas vivas atenuadas); contendo o patógeno morto (vacinas inativadas), ou parte

do patógeno (vacinas de subunidade). Recentemente, vacinas baseadas em ácido

nucléico foram desenvolvidas, chamadas recombinantes, onde o DNA que codifica

um importante gene do patógeno é diretamente transcrito e traduzido em um vetor

plasmidial e, então, administrado ao animal hospedeiro, induzindo-lhe imunidade

contra o patógeno de origem (INNES et al., 2011).

O uso do agente patogênico vivo, inativado, ou mesmo de seus

fragmentos antigênicos, objetiva induzir uma resposta imune efetiva, simulando uma

infecção natural e produzindo uma memória capaz de proteger o organismo

hospedeiro diante de um desafio real com maior rapidez e eficiência (INNES et al.,

2007; INNES et al., 2011).

Outro ponto de vital importância no sucesso de uma vacina é o

componente que desempenha papel de adjuvante na formulação, especialmente em

vacinas a partir de antígenos inativados ou recombinantes. Dentre as alternativas já

relatadas, têm destaque a associação dos antígenos a organismos vetores, como

Escherichia coli ou partículas virais (vaccínia vírus), a fusão em peptídios

hidrofóbicos ou moléculas lipídicas e a utilização de complexos imunoestimulantes

(ISCOMs), que são emulsificações a base de moléculas de colesterol, fosfatidilcolina

e saponina purificada (Quil A) (WIKMAN et al., 2005).

4

O processo de invasão do organismo hospedeiro desencadeia diferentes

respostas imunes, trazendo consequências distintas na relação parasito-hospedeiro.

Enquanto determinados tipos de resposta atuam na proteção do organismo contra a

invasão e o ataque, outros tipos acabam por provocar danos graves aos tecidos

devido ao processo de imunopatogenia da doença, como severos processos

inflamatórios em órgãos vitais. Uma vacina eficaz atuará para estimular a proteção

do hospedeiro sem agravar a imunopatogenia (INNES et al., 2007, INNES et al.,

2011).

2.2 Vacinas baseadas no agente vivo

O uso de vacinas a partir do agente vivo atenuado tem grande sucesso na

indução de imunidade protetora contra alguns protozoários. Esta modalidade de

vacina é a que mais se aproxima da infecção natural. De maneira mais eficaz,

promove uma ativação de resposta mediada por células T, por meio do

processamento intracelular adequado do agente invasor pelas células

apresentadoras de antígeno, em associação com MHC classes I e II (INNES et al.,

2011).

2.2.1 Theileria

Agente etiológico da Febre da Costa Leste Africana ou Febre da Costa

Oriental (East Coast Fever), Theileria parva é um protozoário intracelular que utiliza

como vetor carrapatos do gênero Rhipicephalus. Foi desenvolvida nos anos 70 uma

estratégia de imunização em associação a um esquema terapêutico, onde os

bovinos eram inoculados com uma dose definida de esporozoítos criopreservados

(uma diluição de 1:80 da solução original de aproximadamente 5,9x104 parasitos)

5 concomitantemente à administração de oxitetraciclina na formulação de longa ação

(RADLEY et al., 1975; DI GIULIO et al., 2009). Tal dose corresponde à quantidade

de parasitos presentes nos ácinos das glândulas salivares de carrapatos alimentados

em bovinos naturalmente infectados e é considerada fatal em animais que não

recebem o protocolo terapêutico adequado (DI GIULIO et al., 2009). Esta inoculação

simultânea da droga e do agente atenua o desenvolvimento do parasito no

organismo, proporcionando ao sistema imune o tempo necessário ao

desenvolvimento de imunidade sólida contra o agente (MORZARIA et al., 1987).

O uso dessa estratégia perdura até a atualidade, principalmente no leste

do continente africano, apesar de oferecer alguns riscos e limitações na sua

utilização. Requer estrutura no preparo dos lotes de esporozoítos, apresenta risco de

contaminação por outros patógenos, visto que tem seu preparo a partir de material

de animais naturalmente infectados, e demanda um sistema de resfriamento

constante, pois deve ser administrada dentro de curto período após a retirada do

nitrogênio líquido, o que reduz sua aplicabilidade a campo (MORRISON &

MCKEEVER, 2006; KATZER et al., 2007).

Atualmente, pesquisas estão em desenvolvimento na busca por uma

vacina recombinante que apresente, além de eficácia satisfatória, custo reduzido e

meio de conservação menos exigente, melhorando sua viabilidade de aplicação.

Ainda não existem publicações que garantam níveis adequados de imunização para

estas vacinas recombinantes, suficientes para subsidiar a comercialização. Diante

disso, têm-se priorizado a busca de melhorias na tecnologia atual do método de

infecção-tratamento (DI GIULIO et al., 2009).

A imunização de bovinos contra T. annulata, agente da Theileriose

Tropical, adota estratégia diferente, também a partir do agente vivo. Em situação

natural, uma vez infectados, os leucócitos hospedeiros são induzidos a uma

proliferação clonal onde multiplicam-se também os parasitos diferenciados em

esquizontes. Assim, essa sincronização entre divisão da célula hospedeira e do

parasito possibilita sua proliferação protegido em ambiente intracelular (INNES et al.,

2011).

6

A partir do emprego de técnicas de cultura de células in vitro, cultivam-se

leucócitos bovinos infectados por esporozoítos de T. annulata. Estas células

transformadas são mantidas por passagens sucessivas em laboratório tornando-se

atenuadas, ou seja, não capazes de produzir sinais clínicos aos animais quando

inoculadas, bem como são incapazes de se diferenciar em merozoítos quando

ingeridas pelo carrapato. Estes aspectos conferem segurança na utilização de

linhagens de células transformadas in vitro como vacinas (INNES et al., 2011).

Esta estratégia de imunização consiste na inoculação de células

cultivadas in vitro e infectadas com esquizontes atenuados. Os macrófagos do

organismo identificam os antígenos MHC destas células, as fagocitam e os

esquizontes são capazes de sobreviver no interior destes macrófagos, conferindo ao

sistema imune hospedeiro a capacidade de proteção. Este é o ponto que diferencia

as duas espécies de Theileira, permitindo a adoção deste método para T. annulata e

não para T. parva. Enquanto que T. annulata tem capacidade de infectar macrófagos

e induzir imunidade, T. parva tem predileção por células T. Assim, se a mesma

técnica fosse aplicada utilizando T. parva, este seria incapaz de multiplicar nos

macrófagos e uma imunidade protetora não seria induzida (INNES et al., 2011).

Animais vacinados com esquizontes de cultura de células adquirem

imunidade que perdura por seis meses, quando então começa declinar se não

houver nova exposição (BENIWAL et al., 2000). A eficiência deste mecanismo de

imunização foi comprovada em estudo por SINGH et al. (2001), onde animais

vacinados apresentaram títulos de anticorpos significativamente maiores,

comparados a animais não vacinados que se infectaram naturalmente. Além disso,

apenas animais que não receberam imunização sofreram os efeitos deletérios da

infecção.

7 2.2.2 Toxoplasma gondii

Vacinas com agente vivo atenuado têm sido utilizadas para conferir

proteção contra a ocorrência de toxoplasmose congênita em ovelhas. Isso se deve

ao fato dos animais serem capazes de desenvolver uma memória imunológica

protetora a partir do primeiro contato com Toxoplasma gondii, eficaz contra novos

desafios em prenhezes subsequentes (INNES et al., 2009; INNES et al., 2011).

Trata-se de um protozoário que se apresenta ao organismo hospedeiro de

duas maneiras diferentes: ora no interior da célula hospedeira, o que significa que a

resposta mediada por células T é de fundamental importância na proteção; ora no

ambiente extracelular, no intervalo que antecede a invasão de novas células, o que

possibilita a atuação do sistema imune humoral no objetivo final de debelar a

infecção (INNES et al., 2009; INNES et al., 2011).

O desenvolvimento de vacinas para T. gondii pode ser direcionado a

distintos objetivos: limitar a parasitemia aguda e evitar a toxoplasmose congênita;

limitar a formação de cistos teciduais e reduzir a transmissão aos hospedeiros

definitivos; ou mesmo direcionada a estes, na tentativa de reduzir a excreção de

oocistos e reduzir a transmissão aos hospedeiros intermediários (INNES et al., 2009;

INNES, 2010, INNES et al., 2011).

A única vacina disponível é constituída de taquizoítos do parasito vivo

atenuado, por meio de sucessivas passagens da cepa T gondii S48 em ratos e

cultivados in vitro. Esta cepa foi inicialmente cultivada com o propósito de fornecer

antígeno para diagnóstico. Observou-se, porém que o protozoário havia perdido a

habilidade de diferenciação em bradizoíto, não sendo, portanto capaz de permanecer

in vivo em sua forma cística (INNES et al., 2011).

Produzida comercialmente para ovelhas, com licença de uso em países da

Europa e na Nova Zelândia, estimula a imunidade protetora efetiva por pelo menos

18 meses. Sua aplicação é subcutânea e não é capaz de produzir cistos teciduais,

fazendo com que os animais não permaneçam com infecção vacinal permanente.

8 Apresenta risco em potencial para indivíduos imunodeprimidos e para fêmeas

gestantes (DUBEY & LINDSAY, 2006; OIE, 2008)

2.2.3 Neospora caninum

Para Neospora caninum não se observa imunidade protetora após a

infecção. Uma alta taxa de abortamentos ou transmissão vertical pode ser observada

em sucessivas gerações e em sucessivas prenhezes, possivelmente devido a uma

nova exposição ao agente ou a recrudescência de uma infecção persistente (INNES

et al., 2002).

Entretanto, a probabilidade de ocorrência de transmissão vertical nos

rebanhos parece sofrer decréscimo em prenhezes subsequentes, o que poderia

sugerir o surgimento de algum tipo de imunidade efetiva do hospedeiro interferindo

neste processo (ROMERO & FRANKENA, 2003). Da mesma forma, rebanhos que

experimentaram abortamentos epidêmicos por N. caninum, ou mesmo que foram

previamente expostos ao protozoário, parecem ser menos propensos a novas

ocorrências desta natureza pelo mesmo agente (WOUDA et al., 1998; MCALLISTER

et al., 2000). Assim, mesmo que de maneira menos eficiente, é possível inferir sobre

a possibilidade do uso de vacina no controle da neosporose bovina (INNES et al.,

2011).

A administração de taquizoítos vivos previamente ao início da gestação se

mostrou uma maneira de proteção contra a transmissão vertical ou abortamento em

bovinos desafiados durante a gestação, em comparação a animais sem imunização

prévia (BUXTON et al., 2001; INNES et al., 2001; WILLIAMS et al., 2007).

A busca por uma vacina formulada com parasitos vivos de N. caninum

evidencia especial interesse na identificação de cepas de N. caninum que

apresentem baixa virulência e patogenicidade in vivo, que possam ser consideradas

naturalmente atenuadas (INNES et al., 2011). Para tal propósito, modelos murinos

são utilizados para demonstrar esta característica em alguns dos isolados obtidos

9 pelo mundo (MILLER et al., 2002; REGIDOR-CERRILLO et al., 2008; GARCÍA-

MELO et al., 2009). Para sua utilização como vacina, é de fundamental importância

que estas cepas não permaneçam no organismo hospedeiro, bem como não

ofereçam risco de transmissão congênita (INNES et al., 2011).

2.2.4 Babesia

A babesiose bovina é uma enfermidade conhecida por provocar infecção

aguda e possivelmente fatal em bovinos adultos (WAAL & COMBRINK, 2006).

Animais que se recuperam de uma primo-infecção adquirem a condição de

persistentemente infectados e ainda apresentam certa resistência a parasitos

relacionados, sendo animais jovens geralmente mais resistentes que adultos

(BROWN et al., 2006; WAAL & COMBRINK, 2006).

Vacinas vivas contra B. bovis e B. bigemina são baseadas em sangue

obtido de bovinos naturalmente infectados (PIPANO, 1995). Os parasitos obtidos são

inoculados por sucessivas vezes em bezerros esplenectomizados e em cultura de

células para que sua virulência seja reduzida, conferindo segurança na sua

utilização, especialmente em animais adultos (SHKAP et al., 2007).

Embora uma formulação ideal deva ser capaz de induzir imunidade sem

produzir manifestação clínica nos animais, neste tipo de vacina é necessário um

acompanhamento quando da aplicação, por se tratar da utilização de agente vivo. A

intervenção por meio da administração de quimioterápicos como o imidocarb,

embora possa se mostrar necessária, foi relatada como fator prejudicial à eficácia do

esquema vacinal, destruindo os protozoários vacinais e evitando que se estabeleça

uma imunidade duradoura, devendo ser evitada (COMBRINK et al., 2002; WAAL &

COMBRINK, 2006).

A Embrapa Gado de Corte, em parceria com o laboratório Hemopar, com

sede no Rio Grande do Sul, desenvolveu e disponibilizou comercialmente uma

vacina atenuada que contempla os agentes do complexo Tristeza Parasitária Bovina

10 (EMBRAVAC®-HEMOPAR), apresentada em três tubos criogênicos, sendo que cada

tubo contém, separadamente, as cepas atenuadas de B. bovis, B. bigemina e A.

centrale e um frasco contendo o diluente. A vacina é conservada congelada em

nitrogênio líquido até o momento do uso.

2.3 Vacinas baseadas no agente inativado, subunidades e antígenos recombinantes

Vacinas formuladas a partir do protozoário inativado ou mesmo frações

antigênicas deste apresentam uma característica extremamente desejável no

desenvolvimento de um produto imunobiológico: são seguras para indivíduo ao qual

se destinam, não representando risco de instalação de doença ou demais efeitos

deletérios possíveis no uso de vacinas vivas. O desafio no desenvolvimento de

vacinas inativadas eficazes está na seleção de componentes antigênicos

suficientemente capazes de induzir respostas imunes inata e adaptativa efetivas,

conferindo assim ao organismo a proteção desejada (INNES & VERMEULEN, 2006;

INNES et al., 2011).

2.3.1 Theileria

Enquanto o uso de parasito vivo na imunização contra as theilerioses está

consolidado e é amplamente difundido, os estudos com antígenos inativados e

recombinantes têm demonstrado baixa eficácia nesse propósito. Antígenos

imunodominantes de esporozoítos e esquizontes de T. parva e T. annulata já foram

identificados (GRAHAM et al., 2006; INNES et al., 2011). De acordo com

MORRISON & MCKEEVER (2006), estes antígenos são reconhecidos por

anticorpos, resultando na neutralização do esporozoíto e proteção das células

11 hospedeiras. Formas recombinantes do antígeno de T. parva, com massa de 67 KDa

(conhecido como p67) foram capazes de proteger, ainda que parcialmente, bovinos

de desafio agudo experimental (BALLINGALL et al., 2004). Por outro lado, não se

obteve eficácia na imunização pelo uso deste antígeno associado a formas vivas

recombinantes como o vírus da varíola (HONDA et al., 1998) ou Salmonella

(GENTSCHEV et al., 1998). A habilidade dos antígenos imunodominantes de

esquizontes para induzirem imunidade efetiva em bovinos foi verificada usando

técnicas de imunização com DNA plasmidial ou vetores vivos recombinantes, não se

obtendo resposta imune satisfatória. Entretanto, em alguns protocolos, a gravidade

da enfermidade foi atenuada, sugerindo que houve certa proteção (GRAHAM et al.,

2006).

2.3.2 Toxoplasma gondii

Para T. gondii, o uso de vacinas inativadas não tem promovido imunidade

satisfatória, demonstrando que o sucesso obtido em vacinas vivas não é alcançado

nesta modalidade de imunobiológico (INNES et al., 2011). BUXTON et al. (1989)

relataram falha na indução de proteção contra abortamentos em ovelhas por T.

gondii após a administração de antígenos de Toxoplasma incorporados em partículas

ISCOM (immunostimulating complexes). Para que se atinja uma eficácia adequada,

INNES et al. (2011) afirmam que o antígeno inativado de T. gondii deveria ser capaz

de induzir respostas efetivas de células CD4+, CD8+ e de interferon gama.

2.3.3 Neospora caninum

Há uma vacina feita de taquizoítos inteiros inativados (Bovilis® Neoguard,

Intervet) formulados com um adjuvante a base de polímero de ácido acrílico

12 (Havlogen), que embora não previna a infecção fetal, relatos têm associado sua

administração com a redução estatística do abortamento bovino em áreas endêmicas

para a enfermidade (BIELSA et al., 2004). É administrada em dois momentos: antes

da prenhez e no primeiro trimestre da gestação, com reforço anual (INNES et al.,

2011).

Por outro lado, apesar dos animais imunizados serem capazes de produzir

respostas humoral e celular, estas não se mostram eficazes, visto que em uma

situação de desafio, além da infecção congênita não ser evitada, não se percebe

diferença na redução de abortamentos, em comparação a animais não vacinados

(SCHETTERS et al., 2004).

Além disso, o uso da vacina interfere no resultado da sorologia, não

permitindo diferenciar animais infectados de vacinados (GIVENS, 2006). Sua eficácia

duvidosa provocou sua indisponibilização para comércio no mercado nacional.

Estudos vêm sendo conduzidos no sentido de obter um produto que apresente

resultados mais satisfatórios (REICHEL & ELLIS, 2009).

Existe grande interesse por parte dos pesquisadores na identificação de

antígenos imunodominantes de N. caninum, candidatos à formulação de vacinas.

Dentre estes, são destacados os antígenos parasitários que possam estar envolvidos

na invasão e sobrevivência no hospedeiro, como micronemas, roptrias, grânulos

densos ou demais antígenos abundantes na superfície dos taquizoítos (JENKINS,

2001).

Como ocorre para Theileria, existe a busca de maneiras de estimular

adequadamente as respostas imunes do organismo hospedeiro por meio da

associação de antígenos imunodominantes de N. caninum a vetores vivos

recombinantes, obtendo resultados promissores (NISHIKAWA et al., 2001).

13 2.3.4 Cryptosporidium parvum

Outra importante enfermidade no rebanho bovino, a Criptosporidiose é

também alvo de estudos na busca por um produto imunobiológico eficaz. Em estudos

realizados nos Estados Unidos, bezerros imunizados com oocistos inativados de

Cryptosporidium parvum apresentaram, após desafio experimental, redução na

diarréia e na eliminação de oocistos, em comparação a animais não vacinados

(HARP & GOFF, 1995). Entretanto, em condições naturais de desafio, os mesmos

autores relataram a ineficácia desta vacina (HARP & GOFF, 1998).

Uma forma interessante e promissora de imunização é a administração de

proteínas recombinantes da superfície de oocistos de C. parvum a fêmeas prenhes,

poucas semanas antes do parto, tornando o colostro produzido por estas fêmeas

uma solução hiperimune de anticorpos anti-C. parvum. Estudos mostraram que

bezerros alimentados com esse colostro foram capazes de responder ao desafio oral

com oocistos viáveis de C. parvum, apresentando proteção contra diarréia e redução

na eliminação de oocistos, trazendo efeito benéfico no controle da enfermidade por

meio da redução da contaminação no ambiente (PERRYMAN et al., 1999; JENKINS,

2004; BURTON et al., 2011).

A verificação de eficácia para vacinas formuladas a partir de subunidades

do protozoário têm mostrado resultados favoráveis em camundongos Balb/C

experimentalmente desafiados sendo, portanto, promissoras para uso a campo. YU

et al. (2010) avaliaram a capacidade indutora de imunidade de proteínas de

superfície dos esporozoítos de C. parvum (Cp12 e Cp21), identificadas como

antígenos imunodominantes envolvidos na resposta imune à infecção pelo parasito.

As sequências de DNA que codificam tais proteínas foram amplificadas e clonadas

em plasmídio (vetor PVAX1), sendo estimulada posteriormente a expressão da

proteína recombinante. Após a administração desta proteína aos animais, estes

foram desafiados com oocistos de C. parvum. Foi observado que houve redução de

77,5% nos níveis de eliminação de oocistos, sugerindo o desenvolvimento de

imunidade efetiva. Além disso, foi verificada diferença significativa quando se

14 associou as duas proteínas, em comparação à sua ação separadamente, mostrando

que o uso desses antígenos em formulações de imunobiológicos deverá priorizar

esta associação.

Buscando verificar a capacidade de indução de imunidade efetiva cruzada

entre espécies de Cryptosporidium, um estudo realizado na China utilizou a proteína

AB de C. andersoni na imunização de camundongos Balb/C, com posterior desafio

destes com oocistos de C. parvum. Foi observado que o uso da proteína AB

recombinante (em plasmídio) foi capaz de induzir resposta humoral e celular, com

taxa de redução de 48,6% na excreção de oocistos. Apesar do resultado pouco

expressivo, os autores ressaltam a ocorrência de imunidade cruzada e o potencial

deste resultado no desenvolvimento de uma formulação eficaz para este protozoário

(ZHENG et al., 2011).

2.3.5 Babesia

A pesquisa por antígenos imunodominantes é também uma realidade para

este protozoário. Embora se tenha alguns já identificados, sua aplicação na proteção

dos animais contra um desafio não obteve sucesso (BROWN et al., 2006).

O desenvolvimento de vacinas de subunidade para Babesia foi baseado

primeiramente na identificação de proteínas que apresentassem características

como: estar na superfície do protozoário, ser altamente conservadas entre as cepas,

ter importância funcional na virulência do agente e ter alta capacidade imunogênica.

Buscando tais características, proteínas associadas a estruturas como micronemas,

roptrias, e antígenos de superfície são pesquisados, ainda com níveis insatisfatórios

de êxito (SUAREZ & NOH, 2011).

Ainda com o mesmo objetivo, estudos nos campos da genômica e

proteômica são cada vez mais evidenciados como ferramentas importantes, visto

que um melhor entendimento sobre a biologia e virulência de Babesia contribuirá

15 para o desenvolvimento de uma formulação que associe a segurança da vacina de

subunidade a uma eficácia satisfatória (SUAREZ & NOH, 2011).

Atualmente não existem vacinas formuladas a partir do protozoário

inativado ou mesmo de subunidades antigênicas, disponíveis para aplicação (WAAL

& COMBRINK, 2006; SUAREZ & NOH, 2011).

2.3.6 Tritrichomonas foetus

Um trabalho realizado nos Estados Unidos buscou verificar a capacidade

de proteção de duas diferentes formulações de vacina contra Tritrichomonas foetus,

comparando-as a um grupo sem imunização (controle). As formulações foram vacina

com antígeno solúvel e vacina com parasito inteiro inativado. Foi observado que

todos os animais imunizados desenvolveram altos títulos de anticorpos (a partir de

1:1000). Diante do desafio oferecido a todos os animais, os indivíduos vacinados

apresentaram um período de infecção significativamente mais curto, além da

verificação de 27% das novilhas vacinadas prenhes, contra nenhuma prenhez

verificada no grupo que não recebeu imunização. Concluiu-se que ambas as

formulações foram capazes de conferir certa proteção às novilhas contra perdas

fetais decorrentes de Tricomonose (KVASNICKA et al., 1989).

COBO et al. (2002), em estudo conduzido na Argentina, verificaram a

eficácia de composições de vacinas diferentes e a resposta ao desafio com touros

contaminados com T. foetus. As formulações utilizadas foram protozoários inteiros

inativados pela formalina e membranas celulares obtidas da sonicação com posterior

purificação dos parasitos, ambas em adjuvante oleoso. A aplicação contemplou a via

subcutânea, com reforço de uma dose aplicada via intravaginal. Após a imunização,

as fêmeas foram cobertas por touro infectado (desafio). Foi observada que a taxa de

mortalidade fetal foi significativamente maior nas fêmeas não vacinadas. Ainda que

houve incremento nos níveis séricos de anticorpos e nos níveis de IgA na mucosa

genital nos animais imunizados, o que reduziu a persistência da infecção genital.

16

Este mesmo grupo de pesquisa verificou a eficácia da imunização em

associação a Campylobacter fetus na Argentina. Grupos distintos de fêmeas foram

imunizados com vacina comercial polivalente com formulação contendo

Tritrichomonas, Campylobacter e Leptospira (Trichguard V5L®, Fort Dodge, EUA) e

aplicação subcutânea, e com vacina produzida e inativada em laboratório contendo

Tritrichomonas e Campylobacter, de aplicação subcutânea e intravaginal. Foi

observado que novilhas vacinadas foram resistentes à infecção ou mesmo a

debelaram rapidamente para ambos os patógenos, tinham uma maior taxa de

prenhez e uma maior resposta imunológica sistêmica durante e após o período de

reprodução. Em uma avaliação geral, a vacina experimental foi superior à vacina

comercial (COBO et al., 2004). Este fato pode ser explicado pela adoção da via

intravaginal desta vacina, que propicia a produção de IgA no local onde ocorre a

infecção (CHEN & CERUTTI, 2010; ALVES et al., 2011).

Embora com resultados promissores, o uso de vacinas no controle da

Tricomonose ainda não é considerado muito satisfatório, pois a imunização conferida

não é duradoura (SPÓSITO-FILHA & OLIVEIRA, 2009). Trichguard®, Trichguard

Plus®, Trichguard V5L® (Fort Dodge Animal Health) são exemplos de vacinas contra

T. foetus existentes no mercado, embora ainda não disponíveis no Brasil (ALVES et

al., 2011).

2.3.7 Sarcocystis

As pesquisas na busca de um produto imunobiológico contra o gênero

Sarcocystis têm se concentrado na espécie S. neurona, um dos agentes da

Mieloencefalite Protozoária Equina. Dentre as espécies que afetam ruminantes,

ABDEL-BAKI et al. (2009) desenvolveram um estudo com Sarcocystis ovicanis (S.

tenella), onde esporocistos do parasito foram inativados por radiação ultra-violeta e

inoculados em ovinos, submetidos a posterior desafio com esporocistos viáveis. Os

animais que receberam imunização apresentaram alta resistência à infecção, com

17 sinais clínicos ausentes ou atenuados. Foi verificado que os cistos formados nos

tecidos do hospedeiro se apresentaram com tamanho reduzido e não aderidos às

fibras musculares. Além disso, detectaram-se altos níveis de interferon gama, o que

pode ser interpretado como uma melhor indução de resposta do tipo Th1 e efeito

protetor contra a infecção (ABDEL-BAKI et al., 2009).

2.3.8 Eimeria

Embora se tenha tentado imunizar bovinos contra eimeriose, o

desenvolvimento de vacinas comerciais é difícil diante dos resultados insatisfatórios

obtidos e a vacinação não está disponível como uma alternativa para o tratamento

(DAUGSCHIES & NAJDROWSKI, 2005).

A imunização através da administração de oocistos vivos de E.

alabamensis foi relatada, seguida de desafio em pastagem naturalmente infectada.

No entanto, apenas uma proteção parcial foi obtida e a doença clínica foi verificada

após a imunização (SVENSSON et al., 1996). O uso de vacina a partir de oocistos

inativados por radiação induz apenas imunidade parcial e não eficaz. O animal

permanece exposto à infecção por toda a vida e pode apresentar pequena excreção

de oocistos, mesmo em animais adultos, o que evidencia a pequena possibilidade de

sucesso em uma estratégia de imunização (DAUGSCHIES & NAJDROWSKI, 2005).

2.4 Aspectos econômicos no desenvolvimento de vacinas

O desenvolvimento de uma vacina comercial compreende várias fases

distintas. Embora novos estudos na área sejam motivados pelo resultado promissor

ou não de um estudo prévio, o início de um projeto de pesquisa na busca de uma

18 nova vacina é fortemente influenciado por demandas do mercado (SCHETTERS,

1995).

A viabilidade de um novo produto é avaliada, a partir do atendimento a

requisitos comerciais e técnicos. Assim, inicia-se a pesquisa visando chegar à

formulação ideal do novo imunobiológico, que atenda as características de eficácia e

segurança exigidas de uma boa vacina. Diante dos resultados obtidos, é traçado o

perfil do produto e este está sujeito à avaliação da aplicabilidade em situação prática.

Como exemplo, este novo produto deve preferencialmente se encaixar em esquemas

de vacinação já existentes, o que facilitaria o manejo dos animais.

Aspectos técnicos afetam igualmente o perfil do produto visando sua

viabilidade a campo (por exemplo, se o produto liofilizado é de fácil reconstituição ou

se é muito exigente em termos de conservação). Após uma análise positiva do custo-

benefício do produto, a fase de desenvolvimento é direcionada para os experimentos

necessários para obter o registro junto ao órgão regulamentador competente. Depois

que o produto obtém este registro, está pronto para produção em larga escala e

comercialização (SCHETTERS, 1995).

19 3 CONSIDERAÇÕES FINAIS

O desenvolvimento de vacinas eficazes a partir de parasitos inativados é

de grande dificuldade, em se tratando de agentes tão complexos quanto

protozoários, que apresentam muita heterogeneidade nos mecanismos de resposta

imune em infecção natural. Entretanto, vacina inativada é mais segura por garantir

que não hajam efeitos deletérios decorrentes de uma possível instalação de doença

provocada por antígeno vacinal. Assim, a busca por vacinas inativadas capazes de

induzir uma imunidade protetora adequada e que estimulem os mecanismos

humorais e celulares deve ser incentivada.

A gama de informações nos campos da genômica, proteômica e

imunologia é cada vez maior. Tal fato subsidia novos métodos e tecnologias de

produção e distribuição de imunobiológicos, sugerindo que novas vacinas devem

chegar ao mercado em um futuro próximo.

O uso de vacinas no controle dos principais protozoários parasitos de

ruminantes domésticos já é uma realidade em situação prática em casos como

Theileria, Toxoplasma, Babesia e Tritrichomonas. Por outro lado, protozoários como

Neospora, Cryptosporidium, Sarcocystis e Eimeria em ruminantes permanecem sem

a disponibilidade de formulações indutoras de imunidade satisfatória e uso em larga

escala, embora a maioria das pesquisas com estes parasitos tenham resultados

promissores. O desenvolvimento de técnicas utilizando antígenos recombinantes

tanto abre possibilidades de criação de um produto efetivo para os protozoários onde

ainda não existem tais opções, quanto possibilitam reformulações para produtos já

existentes comercialmente, otimizando sua eficácia e utilização.

Embora vacinas desenvolvidas e testadas experimentalmente apresentem

potencial considerável para imunização, nem todas são possíveis candidatas para o

desenvolvimento de vacinas comerciais. Além de problemas de controle de

qualidade e biossegurança, questões de viabilidade de mercado devem ser

consideradas. Em áreas de criação onde o poder aquisitivo é reduzido e as despesas

com saúde animal são baixas, vacinas muito onerosas e/ou de difícil administração

têm pouca chance de serem comercializadas.

20 REFERÊNCIAS 1. ABDEL-BAKI, A. A.; ALLAM, G.; SAKRAN, T.; EL-MALAH, E. M. Lambs infected with UV-attenuated sporocysts of Sarcocystis ovicanis produced abnormal sarcocysts and induced protective immunity against a challenge infection. Korean Journal of Parasitology, Seul, v. 47, n. 2, p. 131-138, jun. 2009. doi: 10.3347/kjp.2009.47.2.131 2. ALVES, T. A.; STYNEN, A. P. R.; MIRANDA, K. L.; LAGE, A. P. Campilobacteriose genital bovina e tricomonose genital bovina: epidemiologia, diagnóstico e controle. Pesquisa Veterinária Brasileira, Rio de Janeiro, v. 31, n. 4, p. 336-344, abr. 2011. doi: 10.1590/S0100-736X2011000400011 3. BALLINGALL, K. T.; LUTAI, A.; ROWLANDS, G. J.; SALES, J.; MUSOKE, A. J.; MORZARIA, S. P.; MCKEEVER, D. J. Bovine leucocyte antigen major histocompatibility complex class II DRB3*2703 and DRB3*1501 allelles are associated with variation in levels of protection against Theileria parva challenge following immunisation with the sporozoite p67 antigen. Infection and Immunity, Washington, v. 72, n. 5, p. 2738-2741, maio 2004. doi: 10.1128/IAI.72.5.2738-2741.2004 4. BENIWAL, R. K.; SHARMA, R. D.; NICHANI, A. K. Determination of duration of immunity of calves vaccinated with the Theileria annulata schizont cell culture vaccine. Veterinary Parasitology, Amsterdã, v. 90, n. 1-2, p. 25-35, jun. 2000. doi: 10.1016/S0304-4017(00)00226-0 5. BIELSA, J. M.; ROMERO, J. J.; HEUER, C. Controle de Neosporose em bovinos com Bovilis® Neoguard: a experiência de campo. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, Jaboticabal, v. 13, suplemento 1, set. 2004. 6. BROWN, W. C.; NORIMINE, J.; KNOWLES, D. P.; GOFF, W. L. Immune control of Babesia bovis infection. Veterinary Parasitology, Amsterdã, v. 138, n. 1-2, p. 75-87, maio 2006. doi: 10.1016/j.vetpar.2006.01.041

21 7. BURTON, A. J.; NYDAM, D. V.; JONES, G.; ZAMBRISKI, J. A.; LINDEN, T. C.; COX, G.; DAVIS, R.; BROWN, A.; BOWMAN, D. D. Antibody responses following administration of a Cryptosporidium parvum rCP15/60 vaccine to pregnant cattle. Veterinary Parasitology, Amsterdã, v. 175, n. 1-2, p. 178-181, jan. 2011. doi: 10.1016/j.vetpar.2010.09.013 8. BUXTON, D.; UGGLA, A.; LÖVGREN, K.; THOMSON, K.; LUNDÉN, A.; MOREIN, B.; BLEWETT, D. A. Trial of a novel experimental Toxoplasma iscom vaccine in pregnant sheep. British Veterinary Journal, Londres, v. 145, n. 5, p. 451-457, set. /out. 1989. doi: 10.1016/0007-1935(89)90053-5 9. BUXTON, D.; WRIGHT, S.; MALEY, S. W.; RAE, A. G.; LUNDÉN, A.; INNES, E. A. Immunity to experimental neosporosis in pregnant sheep. Parasite Immunology, Oxford, v. 23, n. 2, p. 85-91, fev. 2001. doi: 10.1046/j.1365-3024.2001.00362.x 10. CHEN, K.; CERUTTI, A. Vaccination strategies to promote mucosal antibody responses. Immunity, Cambridge, v. 33, n. 4, p. 479-491, out. 2010. doi: 10.1016/j.immuni.2010.09.013 11. COBO, E. R.; CANO, D.; ROSSETTI, O.; CAMPERO, C. M. Heifers immunized with whole-cell and membrane vaccines against Tritrichomonas foetus and naturally challenged with an infected bull. Veterinary Parasitology, Amsterdã, v. 109, n. 3-4, p. 169-184, nov. 2002. doi: 10.1016/S0304-4017(02)00301-1 12. COBO, E. R.; MORSELLA, C.; CANO, D.; CIPOLLA, A.; CAMPERO, C. M. Immunization in heifers with dual vaccines containing Tritrichomonas foetus and Campylobacter fetus antigens using systemic and mucosal routes. Theriogenology, Stoneham, v. 62, n. 8, p. 1367-1382, nov. 2004. doi: 10.1016/j.theriogenology.2003.12.034 13. COMBRINK, M. P.; TROSKIE, P. C.; DEWAAL, D. T. Residual effect of antibabesial drugs on the live redwater blood vaccines. Annals of the New York Academy of Sciences, Nova Iorque, v. 969, p. 169-173, out. 2002. doi: 10.1111/j.1749-6632.2002.tb04372.x

22 14. DALTON, J. P.; MULCAHY, G. Parasite vaccines - a reality? Veterinary Parasitology, Amsterdã, v. 98, n. 1-3, p. 149-167, jul. 2001. doi: 10.1016/S0304-4017(01)00430-7 15. DAUGSCHIES, A.; NAJDROWSKI, M. Eimeriosis in cattle: current understanding. Journal of Veterinary Medicine B, Berlim, v. 52, n. 10, p. 417-427, dez. 2005. doi: 10.1111/j.1439-0450.2005.00894.x 16. DI GIULIO, G.; LYNEN, G.; MORZARIA, S.; OURA, C.; BISHOP, R. Live immunization against East Coast fever – current status. Trends in Parasitology, Oxford, v. 25, n. 2, p. 85-92, jan. 2009. doi: 10.1016/j.pt.2008.11.007 17. DUBEY, J. P.; LINDSAY, D. S. Neosporosis, Toxoplasmosis, and Sarcocystosis in ruminants. The Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice, Philadelphia, v. 22, n. 3, p. 645-671, nov. 2006. doi: 10.1016/j.cvfa.2006.08.001 18. GENTSCHEV, I.; GLASER, I.; GOEBEL, W.; MCKEEVER, D. J.; MUSOKE, A.; HEUSSLER, V. T. Delivery of the p67 sporozoite antigen of Theileria parva using recombinant Salmonella dublin: secretion of the product enhances specific antibody responses in cattle. Infection and immunity, Washington, v. 66, n. 5, p. 2060-2064. maio 1998. 19. GIVENS, M. D. A clinical, evidence-based approach to infectious causes of infertility in beef cattle. Theriogenology, Stoneham, v. 66, n. 3, p. 648-654, ago. 2006. doi: 10.1016/j.theriogenology.2006.04.021 20. GRAHAM, S. P.; PELLÉ, R.; HONDA, Y.; MWANGI, D. M.; TONUKARI, N. J.; YAMAGE, M.; GLEW, E. J.; DE VILLIERS, E. P.; SHAH, T.; BISHOP, R.; ABUYA, E.; AWINO, E.; GACHANJA, J.; LUYAI, A. E.; MBWIKA, F.; MUTHIANI, A. M.; NDEGWA, D. M.; NJAHIRA, M.; NYANUI, J. K.; ONONO, F. O.; OSASO, J.; SAYA, R. M.; WILDMANN, C.; FRASER, C. M.; MAUDLIN, I.; GARDNER, M. J.; MORZARIA, S. P.; LOOSMORE, S.; GILBERT, S. C.; AUDONNET, J. C.; VAN DER BRUGGEN, P.; NENE, V.; TARACHA, E. L. N. Theileria parva candidate vaccine

23 antigens recognized by immune bovine cytotoxic T lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Washington, v. 103, n. 103, v. 9, p. 3286-3291, fev. 2006. doi: 10.1073/pnas.0511273103 21. HARP, J. A.; GOFF, J. P. Protection of calves with a vaccine against Cryptosporidium parvum. The Journal of Parasitology, Lincoln/NE, v. 81, n. 1, p. 54-57, fev. 1995. 22. HARP, J. A.; GOFF, J. P. Strategies for the control of Cryptosporidium parvum infection in calves. Journal of Dairy Science, Champaign/IL, v. 81, n. 1, p. 289-294, jan. 1998. doi: 10.3168/jds.S0022-0302(98)75578-X 23. HONDA, Y.; WAITHAKA, M.; TARACHA, E. L. N.; DUCHATEAU, L.; MUSOKE, A. J.; MCKEEVER, D. J. Delivery of Theileria parva p67 antigen to cattle using recombinant vaccinia virus: IL-2 enhances protection. Vaccine, Kidlington, v. 16, n. 3, p. 1276-1282, ago. 1998. doi: 10.1016/S0264-410X(98)00041-3 24. INNES, E. A.; WRIGHT, S. E.; MALEY, S.; RAE, A.; SCHOCK, A.; KIRVAR, E.; BARTLEY, P.; HAMILTON, C.; CAREY, I. M.; BUXTON, D. Protection against vertical transmission in bovine neosporosis. International Journal for Parasitology, Nova Iorque, v. 31, n. 13, p. 1523-1534, nov. 2001. doi: 10.1016/S0020-7519(01)00284-3 25. INNES, E. A.; ANDRIANARIVO, A. G.; BJÖRKMAN, C.; WILLIAMS, D. J.; CONRAD, P. A. Immune responses to Neospora caninum and prospects for vaccination. Trends in Parasitology, Oxford, v. 18, n. 11, p. 497-504, nov. 2002. doi: 10.1016/S1471-4922(02)02372-3 26. INNES, E. A.; VERMEULEN, A. N. Vaccination as a control strategy against the coccidial parasites Eimeria, Toxoplasma and Neospora. Parasitology, Londres, v. 133, n. Supl. 2, p. S145-S168, out. 2006. doi: 10.1017/S0031182006001855 27. INNES, E. A.; BARTLEY, P. M.; MALEY, S. W.; WRIGHT, S. E.; BUXTON, D. Comparative host–parasite relationships in ovine toxoplasmosis and bovine

24 neosporosis and strategies for vaccination. Vaccine, Kidlington, v. 25, n. 30, p. 5495-5503, jul. 2007. doi: 10.1016/j.vaccine.2007.02.044 28. INNES, E. A.; BARTLEY, P. M.; MALEY, S.; KATZER, F.; BUXTON, D. Veterinary vaccines against Toxoplasma gondii. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 104, n. 2, p. 246-251, mar. 2009. doi: 10.1590/S0074-02762009000200018 29. INNES, E. A. Vaccination against Toxoplasma gondii: an increasing priority for collaborative research? Expert Review of Vaccines, Londres, v. 9, n. 10, p. 1117-1119, out. 2010. doi: 10.1586/erv.10.113 30. INNES, E. A.; BARTLEY, P. M.; ROCCHI, M.; BENAVIDAS-SILVAN, J.; BURRELLS, A.; HOTCHKISS, E.; CHIANINI, F.; CANTON, G.; KATZER, F. Developing vaccines to control protozoan parasites in ruminants: Dead or alive? Veterinary Parasitology, Amsterdã, v. 180, n. 1-2, p. 155-163, ago. 2011. doi: 10.1016/j.vetpar.2011.05.036 31. JENKINS, M. C. Advances and prospects for subunit vaccines against protozoa of veterinary importance. Veterinary Parasitology, Amsterdã, v. 101, n. 3-4, p. 291-310, nov. 2001. doi: 10.1016/S0304-4017(01)00557-X 32. JENKINS, M. C. Present and future control of cryptosporidiosis in humans and animals. Expert Review of Vaccines, Londres, v. 3, n. 6, p. 669-671, dez. 2004. doi: 10.1586/14760584.3.6.669 33. KATZER, F.; NGUGI, D.; SCHNIER, C.; WALKER, A. R.; MCKEEVER, D. J. Influence of host immunity on parasite diversity in Theileria parva. Infection and immunity, Washington, v. 75, n. 10, p. 4909-4916, out. 2007. doi: 10.1128/IAI.00710-07 34. KVASNICKA, W. G.; TAYLOR, R. E. L.; HUANG, J. C.; HANKS, D.; TRONSTAD, R. J.; BOSOMWORTH, A.; HALL, M. R. Investigations of the incidence of bovine trichomoniasis in nevada and of the efficacy of immunizing cattle with

25 vaccines containing Tritrichomonas foetus. Theriogenology, Stoneham, v. 31, n. 5, p. 963-971, maio 1989. doi: 10.1016/0093-691X(89)90479-2 35. McALLISTER, M. M.; BJÖRKMAN, C.; ANDERSON-SPRECHER, R.; ROGERS, D. G. Evidence of point-source exposure to Neospora caninum and protective immunity in a herd of beef cows. Journal of the American Veterinary Medical Association, Schaumburg, v. 217, n. 6, p. 881-887, set. 2000. doi: 10.2460/javma.2000.217.881 36. GARCÍA-MELO, D. P.; REGIDOR-CERRILLO, J.; ORTEGA-MORA, L. M.; COLLANTES-FERNÁNDEZ, E.; OLIVEIRA, V. S. F.; OLIVEIRA, M. A. P.; SILVA, A. C. Isolation and biological characterisation of a new isolate of Neospora caninum from an asymptomatic calf in Brazil. Acta Parasitologica, Warsaw, v. 54, n. 2, p. 180-185, jun. 2009. doi: 10.2478/s11686-009-0018-2 37. MILLER, C. M.; QUINN, H. E.; WINDSOR, P. A.; ELLIS, J. T. Characterisation of the first Australian isolate of Neospora caninum from cattle. Australian Veterinary Journal, Victoria, v. 80, n. 10, p. 620-625, out. 2002. doi: 10.1111/j.1751-0813.2002.tb10967.x 38. MORZARIA, S. P.; IRVIN, A. D.; TARACHA, E.; SPOONER, P. R.; VOIGT, W. P.; FUJINAGA, T.; KATENDE, J. Immunization against East Coast fever: the use of selected stocks of Theileria parva for immunization of cattle exposed to field challenge. Veterinary Parasitology, Amsterdã, v. 23, n. 1-2, p. 23-41, jan. 1987. doi: 10.1016/0304-4017(87)90022-7 39. MORRISON, W. I.; MCKEEVER, D. J. Current status of vaccine development against Theileria parasites. Parasitology, Londres, v. 133, n. Supl. 2, p. S169-S187, out. 2006. doi: 10.1017/S0031182006001867 40. NISHIKAWA, Y.; INOUE, N.; XUAN, X.; NAGASAWA, H.; IGARASHI, I.; FUGISAKI, K.; OTSUKA, H.; MIKAMI, T. Protective efficacy of vaccination by recombinant vaccinia virus against Neospora caninum infection. Vaccine, Kidlington, v. 19, n. 11-12, p. 1381-1390, dez. 2001. doi: 10.1016/S0264-410X(00)00389-3

26 41. OIE. Toxoplasmosis. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 6th edition, 2008. Disponível em: http://www.oie.int/manual-of-diagnostic-tests-and-vaccines-for-terrestrial-animals/. Acesso em: 16 set. 2011. 42. PERRYMAN, L. E.; KAPIL, S. J.; JONES, M. L.; HUNT, E. L. Protection of calves against cryptosporidiosis with immune bovine colostrums induced by a Cryptosporidium parvum recombinant protein. Vaccine, Kidlington, v. 17, n. 17, p. 2142-2149, abr. 1999. doi: 10.1016/S0264-410X(98)00477-0 43. PIPANO, E. Live vaccines against hemoparasitic diseases in livestock. Veterinary Parasitology, Amsterdã, v. 57, n. 1-3, p. 213-231, mar. 1995. doi: 10.1016/0304-4017(94)03122-D 44. RADLEY, D. E.; YOUNG, A. S.; BROWN, C. G. D.; BURRIDGE, M. J.; CUNNINGHAM, M. P.; MUSISI, F. L.; PURNELL, R. E. East Coast fever: 2. Cross-immunity trails with a Kenyan strain of Theileria lawrencei. Veterinary Parasitology, Amsterdã, v. 1, n. 1, p. 43-50, jun. 1975. doi: 10.1016/0304-4017(75)90006-0 45. REGIDOR-CERRILLO, J.; GÓMEZ-BAUTISTA, M.; PEREIRA-BUENO, J.; ADURIZ, G.; NAVARRO-LOZANO, V.; RISCO-CASTILLO, V.; FÉRNANDEZ-GARCÍA, A.; PEDRAZA-DÍAZ, S.; ORTEGA-MORA, L. M. Isolation and genetic characterization of Neospora caninum from asymptomatic calves in Spain. Parasitology, Londres, v. 135, n. 14, p. 1651-1659, nov. 2008. doi: 10.1017/S003118200800509X 46. REICHEL, M. P.; ELLIS, J. T. Neospora caninum – How close are we to development of an efficacious vaccine that prevents abortion in cattle? International Journal for Parasitology, Nova Iorque, v. 39, n. 11, p. 1173-1187, set. 2009. doi: 10.1016/j.ijpara.2009.05.007 47. ROMERO, J. J.; FRANKENA, K. The effect of the dam calf relationship on serostatus to Neospora caninum on 20 Costa Rican dairy farms. Veterinary Parasitology, Amsterdã, v. 114, n. 3, p. 159-171, jun. 2003. doi: 10.1016/S0304-4017(03)00135-3

27 48. SCHETTERS, T. Vaccine development from a commercial point of view. Veterinary Parasitology, Amsterdã, v. 57, n. 1-3, p. 267-275, mar. 1995. doi: 10.1016/0304-4017(94)03125-G 49. SCHETTERS, T.; DUBEY, J. P.; ADRIANARIVO, A.; FRANKENA, K.; ROMERO, J. J.; PÉREZ, E.; HEUER, C.; NICHOLSON, C.; RUSSELL, D.; WESTON, J. Intervet symposium: bovine neosporosis. Veterinary Parasitology, Amsterdã, v. 125, n. 1-2, p. 137-146, out. 2004. doi: 10.1016/j.vetpar.2004.05.010 50. SHKAP, V.; RASULOV, I.; ABDURASULOV, S.; FISH, L.; LEIBOVITZ, B.; KRIGEL, Y.; MOLAD, T.; MAZUZ, M. L.; SAVITSKY, I. Babesia bigemina: Attenuation of an Uzbek isolate for immunization of cattle with live calf- or culture-derived parasites. Veterinary Parasitology, Amsterdã, v. 146, n. 3-4, p. 221-226, maio 2007. doi: 10.1016/j.vetpar.2007.02.018 51. SINGH, S.; KHATRI, N.; MANUJA, A.; SHARMA, R. D.; MALHOTRA, D. V.; NICHANI, A. K. Impact of field vaccination with a Theileria annulata schizont cell culture vaccine on the epidemiology of tropical theileriosis. Veterinary Parasitology, Amsterdã, v. 101, n. 2, p. 91-100, dez. 2001. doi: 10.1016/S0304-4017(01)00502-7 52. SPÓSITO-FILHA, E.; OLIVEIRA, S. M. Divulgação Técnica: Tricomonose Bovina. Biológico, São Paulo, v.71, n.1, p.9-11, jan. /jun. 2009. 53. SUAREZ, C. E.; NOH, S. Emerging perspectives in the research of bovine babesiosis and anaplasmosis. Veterinary Parasitology, Amsterdã, v. 180, n. 1-2, p. 109-125, ago. 2011. doi: 10.1016/j.vetpar.2011.05.032 54. SVENSSON, C.; OLOFSSON, H.; UGGLA, A. Immunisation of calves against Eimeria alabamensis coccidiosis. Applied Parasitology, Jena, v. 37, n. 3, p. 209-216, set. 1996. 55. WAAL, D. T.; COMBRINK, M. P. Live vaccines against bovine babesiosis. Veterinary Parasitology, Amsterdã, v. 138, n. 1-2, p. 88-96, maio 2006. doi: 10.1016/j.vetpar.2006.01.042

28 56. WILLIAMS, D. J. L.; GUY, C. S.; SMITH, R. F.; ELLIS, J.; BJÖRKMAN, C.; REICHEL, M. P.; TREES, A. J. Immunization of cattle with live tachyzoites of Neospora caninum confers protection against fetal death. Infection and Immunity, Washington, v. 75, n. 3, p. 1343-1348, mar. 2007. doi: 10.1128/IAI.00777-06 57. WIKMAN, M.; FRIEDMAN, M.; PINITKIATISAKUL, S.; ANDERSSON, C.; HEMPHILL, A.; LÖVGREN-BENGTSSON, K.; LUNDÉN, A.; STÁHL, S. General strategies for efficient adjuvant incorporation of recombinant subunit immunogens. Vaccine, Kidlington, v. 23, n. 17-18, p. 2331-2335, mar. 2005. doi: 10.1016/j.vaccine.2005.01.035 58. WOUDA, W.; MOEN, A. R.; SCHUKKEN, Y. H. Abortion risk in progeny of cows after a Neospora caninum epidemic. Theriogenology, Stoneham, v. 49, n. 7, p. 1311-1316, maio 1998. doi: 10.1016/S0093-691X(98)00078-8 59. YU, Q.; LI, J.; ZHANG, X.; GONG, P.; ZHANG, G.; LI, S.; WANG, H. Induction of immune responses in mice by a DNA vaccine encoding Cryptosporidium parvum Cp12 and Cp21 and its effect against homologous oocyst challenge. Veterinary Parasitology, Amsterdã, v. 172, n. 1-2, p. 1-7, ago. 2010. doi: 10.1016/j.vetpar.2010.04.036 60. ZHENG, J.; REN, W.; PAN, Q.; WANG, Q.; ELFAKI-ELHAG, I. A.; LI, J.; LI, M.; GONG, P.; LIU, Y.; ZHANG, X. A recombinant DNA vaccine encoding C. andersoni oocyst wall protein induces immunity against experimental C. parvum infection. Veterinary Parasitology, Amsterdã, v. 179, n. 1-3, p. 7-13, jun. 2011. doi: 10.1016/j.vetpar.2011.02.016