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Detecção de Resistência em Bacilos Gram-Negativos
André Mario Doi
ENTEROBACTÉRIAS PRODUTORAS DE CARBAPENEMASES
O QUE FAZER?
O QUE TESTAR?
O QUE USAR?
Price et al. Lancet 2013
Nordman and Poirel. Clin Microbiol Infect 2014.
DISSEMINAÇÃO DE NDM
Outras Carbapenemases em Enterobactérias
PONTOS DE CORTE E TRIAGEM
Testes para Detecção de Carbapenemases no Laboratório
ANVISA – NOTA TÉCNICA
TESTE POSITIVO COM AFB
TESTE POSITIVO COM AFB
E CLOXACILINA
TESTE POSITIVO COM
EDTA
KPC
AmpC PLASMIDIAL
Metalo-betalactamase
TESTE NEGATIVO EDTA
AFB E CLOXA Oxa 48 ou deficiência
de porina
M-CIM e E-CIM
https://journals.plos.org/plosone/article/figure?id=10.1371/journal.pone.0123690.g001
Teste de Hodge
Teste de
Hodge
positivo Produção de
Carbapenemase
Cuidado aos falso-positivos
Teste subjetivo
Pouco sensível para detecção de NDM
Carba NP
• Teste fenotípico para Detecção de Carbapenemase
• Baseado na hidrólise do carbapenêmico pela enzima e alteração colorimétrica devido à mudança do PH
Duvidoso
CarbapenemBac
Blue Carba
Teste de
Carbapenemase
Negativo
Teste de
Carbapenemase
Duvidoso
Teste de
Carbapenemase
positivo
J. Pires et al. J. Clin. Microbiol. 2013;51:4281-4283
Blue CARBA
NDM-1-producing
E. coli
OXA-23-
producing
A. baumannii
OXA-48-
producing
K. Pneumoniae
E. coli ATCC
25922
100% Sensibilidade
100%
Especificidade
OXA-48: 90%
OXAs Acinetobacter spp.:100%
OXA-163/247 (Arg.): 20%
Pasteran et al J Clin Microbiol 2015;53(6):1996-8.
2h de incubação
Azul de bromotimol
Indicador de pH
Blue Carba
Teste de
Carbapenemase
Negativo
Teste de
Carbapenemase
Duvidoso
Teste de
Carbapenemase
positivo
Detecção fenotípica baseada na inibição de MBLs
Metalo--lactamases :
Como detectar?
AZTREONAM
Teste fenotípico para detecção de
NDM
Imipenem com
inibidor (EDTA
Imipenem
sozinho
Aumento do halo com o inibidor
(queda de 3 diluições)
Detecção de carbapenemase
Teste imunocrmatográfico
Testes Moleculares para Detecção de Carbapenemases
• PCR multiplex
• Plataformas comerciais
– BDMax
– Biofire
– Cepheid
– GeneXpert
– Check Points
• Cartucho detecta 5 famílias de genes que conferem resistência aos carbapenêmicos ‒ blaKPC
‒ blaNDM
‒ blaVIM
‒ blaOXA-48
‒ blaIMP-1 subgroup
• Amostra: Swab Retal
• TAT: 48 minutos
Sistema GeneXpert
Xpert® Carba-R detection
KP
C
blaKP
C
blaIMP-
1
blaVIM blaND
M-1
bla OXA-48
IMP 1 IMP 6
IMP 25
IMP 3
IMP 10
IMP 30
ALL KPCs
ALL VIMS
All NDMS
OXA-48
IMP-1 subgroup
OXA-162
OXA-163
OXA-204
Utilização do MALDI TOF para detecção de Carbapenemase
• Técnica de proteômica – Espectrometria de Massa
• Análise de proteínas
Porque é importante saber qual tipo de carbapenemase?
• Finalidade epidemiológica
• Controle de Infecção Hospitalar
• Terapia antimicrobiana específica: Novos antimicrobianos
ESβL
• Capacidade de hidrolisar as penicilinas, cefalosporinas de 1ª a 4ª gerações e monobactâmicos
• Classe A de Ambler e grupo 2 Bush-Jacoby-Medeiros
• Não hidrolisam os carbapenêmicos e cefamicinas
• Inibidas pela ação dos inibidores de β-lactamases (clavulanato, tazobactam e sulbactam)
• Expressão constitutiva e genes localizados em plasmídeos
Antibióticos β-lactâmicos: possuem em comum o anel β-lactâmico
Grupo 1
Grupo 2
TESTES CONFIRMATÓRIOS
Zona fantasma ou distorção do halo ao redor do β-lactâmico
MCBOAS PRÁTICAS, ANVISA 2009.
TESTES CONFIRMATÓRIOS
Aumento maior que 5 mm entre os dois discos
MCBOAS PRÁTICAS, ANVISA 2009
TESTES CONFIRMATÓRIOS
Redução da CIM maior que 3 diluições
MCBOAS PRÁTICAS, ANVISA 2009
CAZ CAZ + AC
TESTES CONFIRMATÓRIOS MÉTODOS AUTOMATIZADOS
Vitek 2, Phoenix e Walkaway: Sensibilidade > 90% para detecção de ESβL
Poços com cefotaxima, ceftazidima ou ceftriaxona sozinhas e combinadas com ác. clavulânico
Atenção aos falsos negativos!
DIVERSIDADE DAS ESβL
Bush and Fisher 2011
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DAS ESβL
• Técnicas de PCR
– Single
– Multiplex
– Tempo Real
PCR multiplex (ALERTA)
• TEM
• SHV
• GES
• CTX-M-1/2
• CTX-M-8
• CTX-M-14
CT
X-M
-1/2
CT
X-M
-8
CT
X-M
-14
GE
S
TE
M
SH
V
C-
M M
AmpC – β –lactamase Grupo 1
RESISTÊNCIA INDUZÍVEL: AMP C
AmpC - plasmidial
Resistência às polimixinas em Enterobactérias
Genes Função Mecanismo Referências
Enterobacteriaceae
PhoPQ PmrAB CrrAB
Sistemas de dois componentes que regulam a expressão de genes em
resposta à estímulos ambientais
Regula a modificação do LPS por adição de 4-
amino-arabinose ao lipídio A
Mitrophanov et al. PLoSGene. 2008;4(10):e1000233.
Kato et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100(8):4706-11.
Kato et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2007;104(29):12063-8.
pmrD Promove a interação entre os dois sistemas PhoPQ e
PmrAB
Participa do processo de modificação do
lipídio A
Mitrophanov et al. PLoSGene. 2008;4(10):e1000233.
Kato et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100(8):4706-11.
Kato et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2007;104(29):12063-8.
mgrB Gene que promove a regulação negativa do
sistema PhoPQ
Sequência de inserção leva à inativação deste
gene e consequente ativação de PhoPQ
Cannatelli et al. AAC. 2013;57(11):5521-6. Cannatelli et al. AAC. 2014;58(10):5696-
703. Poirel et al. JAC. 2015;70(1):75-80.
Jayol et al. IJAA. 2015;46(1):108-10.
ugd rcsB wza
Genes envolvidos na via de biossíntese de cápsula
polissacarídica
Sua hiperexpressão leva à hiperprodução
de cápsula polissacarídica
Campos et al. Infect Immun. 2004;72(12):7107.
Llobet et al. Microbiol. 2008;154:3877-86. Cheng et al. J Biomed Scien. 2010;17:60.
mcr-1 Codifica uma proteína
fosfoetanolamina transferase
Promove a modificação de LPS por adição de fosfoetanolamina ao
lipídio A
Liu et al. Lancet Infect Dis. 2016;16(2):161-8.
• Maldi-Tof: E. coli
• Paciente com infecção
sanguínea
• MIC Colistina: 4 µg/mL
• Carbapenêmicos S
• PCR para mcr-1 positivo Fragmento de aprox. 380 bp
RESISTÊNCIA PLASMIDIAL ÀS POLIMIXINAS
Slide gentilmente cedido por
Raquel Girardello
TESTE DE SENSIBILIDADE ÀS POLIMIXINAS
Microdiluição em Caldo
Disco Difusão Etest Métodos automatizados
• Método considerado referência. • Disponíveis no mercado placas com as diluições dos antibióticos prontas.
• Método apresenta erros graves e muito graves. • Não deve ser utilizado para determinação da sensibilidade às polimixinas.
• Boa concordância com a metodologia de referência. • Método de escolha por muito laboratórios de rotina.
• Poucos estudos avaliando a acurácia. • Muitos laboratórios confirmam as MIC de resistência às polimixinas com Etest.
Gales et al. JCM. 2001; 39(1):183-190.
van der Heijden et al. Ann Clin Microb Antimic. 2007;6:8.
Lo-Ten-Foe et al. AAC. 2007;51(10):3726-3730.
Slide gentilmente cedido por Raquel Girardello
APENAS
MICRODILUIÇÃO!!!
Teste de sensibilidade na prática laboratorial: pontos importantes
Polimixina
• Disco difusão não recomendado
• Automação Vitek (não recomendado –
comunicado recente 2017)
• Métodos de gradiente de concentração – não
recomendados (EUCAST 2017)
• APENAS MICRODILUIÇÃO EM CALDO
