DNA e RNA, replicação, transcricao e Traducao

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DNA e RNAReplicação – Transcrição – Tradução

Introdução à Biologia Molecular

Alexandre Havt

Estrutura dos Ácidos Nucléicos

� Moléculas com informações para a síntese de proteínas

� DNA – armazém ou biblioteca celular

� Contém informações para a construção das células e tecidos

� Duplicação dos genes garante a perpetuação das espécies

� Transcrição – síntese de RNA

� RNA mensageiro (mRNA)

� RNA transportador (tRNA)

� RNA ribossômico (rRNA)

� Tradução – síntese de proteínas a partir das informações dos RNAs

� Descoberta da estrutura do DNA em 1953

Watson e Crick

Estrutura dos Ácidos Nucléicos – DNA e RNA Estrutura dos Ácidos Nucléicos – DNA e RNA

Estrutura dos Ácidos Nucléicos – DNA e RNA Estrutura dos Ácidos Nucléicos - DNA

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Estrutura dos Ácidos Nucléicos - RNA RNA mensageiro - mRNA

RNA ribossômico - rRNA� Ribossomos

� Procariotos� Citoplasma � Mitocôndrias

� Procariotos� 3 tipos de moléculas de rRNA

• 16S + 21 proteínas – 30S• 23S• 5S

� Citoplasma de eucariotos� 4 tipos de moléculas de rRNA

• 18S + 33 proteínas – 40S• 5S• 28S• 5,8S

� Mitocondriais� 55S

• Propriedades similares ao das bactérias

Eucariotos

+34 proteínas – 50S70S

+50 proteínas – 60S

80S

RNA transportador - tRNA

� Função� Transportar aminoácidos para

a síntese protéica

� Assegurar a incorporação dos mesmos na posição correta

• anticódon

� Células com pelo menos 20 tRNA

� Pequenas moléculas

� 80 nucleotídeos

� 4S

� Formados por blocos monoméricos � RNA e DNA

• 5 Nucleotídeos

� Proteínas • 20 aminoácidos

� Monômeros adicionados 1 por vez

� Cadeia de formação tem ponto de partida específico com crescimento unidirecional para um terminal fixo� Direção 5´ - 3´

� Produto primário é frequentemente modificado

Regras da Síntese dos Ácidos Nucléicos e Proteínas

Regras da Síntese dos Ácidos Nucléicos e Proteínas

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Replicação do DNA

Replicação do DNA� Duplicação do material genético para a divisão celular

� Replicação é semiconservativa• Uma fita parental e uma nova fita sintetizada

� Forquilha de replicação

� Helicases - Separação das duplas fitas

� Proteínas protegem DNA de fita simples e evitam reaproximação

� Primase – síntese de iniciador

� Topoisomerase• Desenrolam supertorção

� Ligases – união dos fragmentos de Okasaki

� DNA polimerases• α - associação com primase para formação do iniciador

• δ - polimerização das fitas líder e lenta

• γ - polimerização DNA mitocondrial

• β ε κ η ζ ι - polimerases de reparo

Replicação do DNA Eucariótico

Síntese de RNATranscrição

Síntese de RNA Transcrição – Síntese de RNA

� RNA polimerases devem reconhecer

� O ponto de início da transcrição

� Qual das fitas deve ser usada como molde – transcrita

� Região promotora do DNA

� Controla a ligação da RNA polimerase

� Identifica o ponto de início da transcrição

� Controla a frequência da transcrição

• Sequências regulatórias no promotor

• Sequências perto do promotor

• Reforçadores

Interagem com proteínas que estabilizama ligação RNA-polimerase ao promotor

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Transcrição Processamento do mRNA Eucariótico

Síntese dos rRNAs Eucarióticos Síntese dos tRNAs Eucarióticos

Síntese de proteínasTradução

Síntese Protéica - Tradução

� Ocorre nos ribossomos – rRNA

� Direcionado pela sequência dos códons

de mRNA

� Cada tRNA traz um aminoácido

específico ao seu anticódon

� Aminoacil-tRNA

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Código Genético

GGlyGluAlaVal

AGlyGluAlaVal

CGlyAspAlaVal

UGlyAspAlaValG

GArgLysThrMet

AArgLysThrIle

CSerAsnThrIle

USerAsnThrIleA

GArgGlnProLeu

AArgGlnProLeu

CArgHisProLeu

UArgHisProLeuC

GTrpParadaSerLeu

AParadaParadaSerLeu

CCysTrySerPhe

UCysTyrSerPheU

(3’)GACU(5’)

Terceira baseSegunda basePrimeira baseFormação do aminoacil-tRNA

� Aminoacil-tRNA

� tRNA ligado covalentemente a um

aminoácido na terminação 3’

� Cada aminoácido com seu tRNA

• Alanil-tRNAala

• Metionil-tRNAimet

� 20 Aminoacil-tRNA-sintetases

� Processo dependente de ATP

� Ocorre em 2 passos

• Formação do complexo:

� enzima/aminoacil-AMP e pirofosfato

• Transferência do aminoácido ativo

� Hidroxila do carbono 2 ou 3 da ribose

� Nucleotídeo de adenina (CCA)

Processo da Tradução

� Envolvimento de 3 passos

� Iniciação

� Alongamento

� Terminação

Iniciação

Alongamento – Ligação Peptídica – Translocação Terminação

� Códons de parada

� Inexistência de tRNA com anticódons que possam parear com

• UAA

• UGA

• UAG

� Fatores de liberação unem-se ao ribossomo

� Hidrólise da ligação peptidiltransferase

• Cadeia peptídica

• tRNA

� Peptídeo sintetizado é liberado

� Dissociação das subunidades do ribossomo

• Liberação do mRNA

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Polissomos

� Ligação de vários ribossomos ao mRNA

� Cada ribossomo cobre 80 nucleotídeos de mRNA

� Aproximadamente um ribossomo a cada 100 nucleotídeos

Técnicas de Biologia Molecular

� Reação de Polimerase em Cadeia – PCR� Função - Multiplicação de trecho específico de DNA

• Problema – análise de ácidos nucleicos�Baixa quantidade de ácidos nucléicos nos tecidos

� Primers

� Taq – DNA polimerase (Thermus aquaticus)• Enzima termoestável em temperatura até 117 °C

• Temperatura ótima 72 °C

� Início – vários banhos maria com diferentes temperaturas

� 1987 – publicação do artigo de Mulis na Methods in Enzymology

� 1989 – primeiro termociclador

� 1994 – Nobel em química para Karis Mulis

Karis Mulis


� Fundamentos do PCR� Desnaturação das cadeias de DNA à 94 °C

� Anelamento dos primers (de acordo com a TM de cada primer)

� Extensão – incorporação dos nucleotídeos pela enzima Taq á 72 °C

� Reagentes essenciais� Taq – em solução de Tris-HCL (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 1mM

DTT, 50% glicerol

� Tampão – 200 mM Tris-HCL (pH 8,4), 500 mM KCl

� Cloreto de magnésio – cofator para ação da enzima

� Desoxinucleotídios (ATP, TTP, CTP, GTP) – mistura de [ ]’s iguais

� Primers específicos à sequência que se deseja amplificar


� Vídeo da reação de PCR


� Fundamentos da Transcriptase Reversa

� Vírus de RNA tipo VI

• Enzima transcriptase reversa

• Genoma de RNA orienta a formação de uma molécula de DNA

�AMV - Vírus da Mieloblastose aviária

�M-MuL-V (Moloney Murine Leukemia Virus)

� Importante ferramenta para o estudo da expressão gênica a partir do

mRNA

� Síntese de uma fita de DNA complementar de fita simples (cDNA)

� Sequências de cDNA específico podem ser amplificados por PCR

CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA

ACGTCGAATTTTTTTTTTTTT

mRNA

cDNA

CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA

GCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT

mRNA

cDNA

GCAGTACGAATCGGCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT

CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA mRNA

cDNA

RNAse I

GCAGTACGAATCGGCAAGGCCGACGTCGAATTTTTTTTTTTTT

CGTCATGCTTAGCCGTTCCGGCTGCAGCTTAAAAAAAAAAAAA mRNA

cDNA

PCR

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� Isolamento de RNA

� Imprescindível uso de luvas e amostras no gelo quando possível –

evitar RNAse

� Qualquer amostra tecidual, cultura de células - (100mg)

� Método muito utilizado Reagente TRIZOL

Isolamento de RNA por TRIZOL

� Fenol + Isotiocianato de guanidine� Membranas celulares e nucleares destruídas� Manutenção da integridade do RNA� Maceração da amostra com TRIZOL

� Clorofórmio – separação em 3 fases� RNA – sobrenadante� DNA – camada intermediária� Protéinas – camada inferior

� Precipitação com Isopropanol� Lavagem com Etanol 75%� Leitura em espectrofotômetro

� 260nm – quantidade ( A260 x fator de diluição x 0,04 = [ ug/uL])� Razão 260nm/280nm – qualidade do RNA ( ≅ 2,00)

Amostra 100 mg+

1 mL de TRIZOLHomogeneizar

• Centrifugar 12.000 g 10 min. 2- 8 °C

• Remover sobrenadante p/ novo tubo

• Acrescentar 200 uLde clorofórmio

� Vórtex por 15 sec.

� Incubar RT °C p/ 2-3 min

� Centrifugar 12.000 g p/15 min

• Remover sobrenadantetransparente para novo tubo

• Acrescentar 500 uL de isopropanol

• Incubar RT °C 10 min

• Centrifugar 12.000 g p/15 min à 2 – 8 °C

• Descartar sobrenadante

• Acrescentar 3x 1mL de etanol 75%

• Centrifugar 3x a 7.500 g por 5 minutos à 2 – 8 °C

• Descartar 3° sobrenadante

• Evaporar etanol

•Solubilizar pellet com ddH2O autoclavada

•Leitura espectrofotômetro

Análise por Eletroforese

� Principio básico

� O DNA tem carga negativa

� Aplicando uma voltagem as moléculas de DNA migrariam para o

catodo

� Malha de gel de agarose permite o deslocamento do DNA separando-

o por tamanho

• Moléculas menores migram mais rápido

• Moléculas maiores migram mais lento

� A distância percorrida é comparada à distância de uma molécula de

tamanho conhecido

Análise por Eletroforese

� Principio básico

� Agarose – polissacarídeo é aquecido para dissolver em tampão

eletrolítico

• Tris-Acetato-EDTA – TAE

• Tris- Borato-EDTA

• Solubilização do gel por esfriamento

� Aumento da viscosidade da amostra com glicerol

� Visualizaçãoda corrida da amostra com corante – bromofenol blue

� Visualização do DNA no gel por brometo de etídeo

Cuba de Eletroforese Horizontal

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DNA e RNA, replicação, transcricao e Traducao