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Londrina 2015
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO
ROBERTO KIYOSHI KASHIMOTO
EFEITOS DO ESTRESSE REPETIDO SOBRE A PROGRAMAÇÃO EPIGENÉTICA DO CÉREBRO DE RATOS
PRATICANTES E NÃO PRATICANTES DE ATIVIDADE FÍSICA
Londrina 2015
ROBERTO KIYOSHI KASHIMOTO
EFEITOS DO ESTRESSE REPETIDO SOBRE A PROGRAMAÇÃO EPIGENÉTICA DO CÉREBRO DE RATOS
PRATICANTES E NÃO PRATICANTES DE ATIVIDADE FÍSICA
Dissertação apresentada à Unopar, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação. Orientador: Prof. Dr. Marcus Vinícius de Matos Gomes
AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Dados Internacionais de catalogação-na-publicação
Universidade Norte do Paraná Biblioteca Central
Setor de Tratamento da Informação
Kashimoto, Roberto Kiyoshi K29e Efeitos do estresse repetido sobre a programação epigenética do cérebro de
ratos praticantes e não praticantes de atividades de atividade física / Roberto Kiyoshi Kashimoto. Londrina: [s.n], 2015.
55f. Dissertação (Mestrado). Ciências da Reabilitação. Universidade Norte do
Paraná e Universidade Estadual de Londrina. Orientador: Prof. Dr. Marcus Vinícius de Matos Gomes 1- Ciências da reabilitação - dissertação de mestrado – UNOPAR /UEL 2-
Estresse 3- Epigenética 4- Metilação do DNA 5- Dnmt 1 6- Polimorfismo I- Gomes, Marcus Vinícius de Matos Gomes, orient. II- Universidade Norte do Paraná. III- Universidade Estadual de Londrina.
CDU 615.8: 618.89
ROBERTO KIYOSHI KASHIMOTO
EFEITOS DO ESTRESSE REPETIDO SOBRE A PROGRAMAÇÃO EPIGENÉTICA DO CÉREBRO DE RATOS PRATICANTES E NÃO
PRATICANTES DE ATIVIDADE FÍSICA
Dissertação apresentada à Unopar, no mestrado em Ciências da Reabilitação, área de concentração Avaliação e Intervenção em Reabilitação, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre, conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores:
____________________________________ Prof. Dr. Marcus Vinícius de Matos Gomes
Universidade Norte do Paraná
____________________________________ Prof. Drª Karen Barros Parron Fernandes
Universidade Norte do Paraná
____________________________________ Prof. Dr. Celio Roberto Estanislau
Universidade Estadual de Londrina
Londrina, 09 de Fevereiro de 2015.
DEDICATÓRIA
Primeiramente agradeço a Deus, por sempre
estar presente com sua infinita sabedoria.
Dedico este trabalho a meus pais, que sempre me deram
suporte nas minhas escolhas com a paciência e experiência
que só eles poderiam transmitir; um agradecimento especial a
meu pai (in memorian), uma pessoa que acreditou no meu
potencial, e dedicou-se ao máximo para que meus sonhos
fossem realizados; a minha noiva Cristhiane, meu amor, minha
amiga e companheira nesta jornada, que me auxiliou e
incentivou em todos os momentos.
Gratidão Eterna!!
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Prof. Dr. Marcus Vinícius de Matos Gomes pelos
ensinamentos, pela compreensão, pela paciência, pelo companheirismo e pelo fato
de sempre ter acreditado e confiado em mim.
Aos professores da Banca Examinadora, Profª. Karen Barros Parron
Fernandes e Prof. Celio Roberto Estanislau pela disponibilidade e dedicação,
contribuindo de forma valiosa.
Aos participantes do Laboratório de Epigenética da Unopar: Marcelo
Ferreira Manfredo, Lucas Nascimento, Wyllian Beasi da Silva, Tatiane Donati,
Cláudia Sahd, Virginia Concato e Juzeli Passador, pelos bons momentos que
passamos nas atividades de laboratório e pela colaboração neste projeto.
Deixo um agradecimento especial ao mestrando Leandro Toffoli, que com
sua experiência e paciência contribuiu de forma imprescindível para a viabilização
das coletas e análise dos dados, sempre disposto a ajudar.
Aos integrantes do Laboratório de Farmacologia Cardiovascular da UEL,
pela indispensável colaboração com este trabalho, e ao Laboratório de Análise de
Materiais e Moléculas da UEL, por toda colaboração necessária para a finalização
deste trabalho.
À Funadesp, pelo apoio financeiro na execução do projeto.
Aos professores e alunos do Programa de Pós-Graduação em Ciências
da Reabilitação UEL/Unopar, que contribuíram de alguma forma na minha
caminhada, e que contribuem a cada dia para a melhoria deste programa.
Aos meus amigos Rodrigo Camarinho, Talita Shigueoka, Alfredo Costa,
Michelli Toyohara, Cleverson e Thaís Ohara; Aos amigos e colegas de trabalho
Cláudia Siqueira, Christiane Macedo, Carrie Galvão, Claudiane Rodrigues, Juleimar
Amorim, Heloisa Tsukamoto e Fabiola Borges pela compreensão, ajuda e força em
toda a trajetória.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para este trabalho.
“A mente que se abre a uma nova idéia jamais
voltará ao seu tamanho original”
Albert Einstein
KASHIMOTO, Roberto Kiyoshi. Efeitos do estresse repetido sobre a programação epigenética do cérebro de ratos praticantes e não praticantes de atividade física. 2015. 56 fls. Dissertação (Mestrado em Ciências da Reabilitação) – Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2015.
RESUMO
Um número crescente de evidências tem indicado o envolvimento de mecanismos epigenéticos com as respostas biológicas adaptativas ao estresse comportamental. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi identificar o efeito do estresse repetido no perfil global de metilação do DNA e na expressão do gene Dnmt1 de células cerebrais de ratos, e avaliar o potencial do exercício físico (natação) na modulação dos efeitos do estresse sobre o perfil de metilação do DNA e na expressão do gene Dnmt1. Ratos Wistar, sedentários, foram divididos em quatro grupos para o estudo. Um grupo foi submetido ao protocolo validado de estresse repetido (grupo ST) do 75 dias pós-natal (DPN) ao 79 DPN. Para o grupo de praticantes de exercício físico (grupo EX) foram considerados ratos submetidos a natação no período de 53 a 78 DPN. O grupo de exercício físico e estresse (grupo EX-ST) foi constituído por animais submetidos à natação no período de 53 a 78 DPN e ao protocolo de estresse do 75 a 79 DPN. O grupo controle (CTL) foi constituído por animais que não foram submetidos a qualquer intervenção. Aos 80 DPN, os animais foram sacrificados para obtenção de amostra do hipocampo, córtex, hipotálamo e substância cinzenta periaquedutal (Periaqueductal Gray Matter – PAG). O perfil de metilação global do DNA foi quantitativamente avaliado pelo método de ELISA de alto rendimento específica para metilação (Sigma-Aldrich). A expressão do gene Dnmt1 foi avaliada quantitativamente por PCR em tempo real utilizando o sistema de detecção Taqman e o gene Gapdh como controle endógeno. Um aumento significativo da metilação global do DNA foi observado no hipotálamo (P=0,037) dos animais do grupo EX em comparação ao grupo CTL. Quando interrogado o efeito do estresse sobre a metilação global do DNA nos grupos ST versus EX-ST, foi observado um aumento significativo da porcentagem de metilação no hipotálamo (P=0,003), córtex (P=0,011), hipocampo (P=0,000) e PAG (P=0,000) dos animais do grupo EX-ST. Além disso, foi verificada uma redução significativa na expressão do gene Dnmt1 no hipocampo (P=0,035) e hipotálamo (P=0,035) dos animais do grupo EX-ST quando comparados com o grupo ST. Com base nas evidências do presente estudo podemos concluir que a prática de exercício físico induz um aumento significativo da metilação global do DNA no hipotálamo de ratos. Além disso, nossos dados demonstram que a prática de exercício físico modula o impacto do estresse repetido sobre a metilação global do DNA no hipotálamo, córtex, hipocampo e PAG e que esse efeito modulador está relacionado à uma diminuição da expressão do gene Dnmt1 no hipotálamo e hipocampo.
Palavras-chave: Estresse; Epigenética; Metilação do DNA; Dnmt1; Exercício Físico
KASHIMOTO, Roberto Kiyoshi. Effects of repeated stress on epigenetic programming of rat brains in practitioners and non-practitioners of physical activity. 2015. 56 p. Dissertação (Mestrado em Ciências da Reabilitação) – Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2015.
ABSTRACT
A growing body of evidence has indicated the involvement of epigenetic mechanisms with adaptive biological responses to behavioral stress. In this context, the objective of this study was to identify the effect of repeated stress in the global DNA methylation profile and expression of Dnmt1 gene of rat brain cells, and evaluate the potential of physical exercise (swimming) in modulating the effects of stress on the DNA methylation profile and expression of Dnmt1 gene. Wistar sedentary rats were divided into four groups for the study. One was submitted to the validated protocol repeated stress (ST group) of 75th postnatal day (PND) to 79th PND. For the group of physical exercise (group EX) we considered animals that were submitted to swimming sessions during the 53 – 78th PND. The exercise-stress group (EX-ST) was constituted by animals that were submitted to swimming at the 53 – 78th PND and to the restraint stress at the 75 – 79th PND. The control group (CTL) consisted of animals that have not undergone any intervention. At 80th PND, the animals were sacrificed to obtain samples of the hippocampus, cortex, hypothalamus, and periaqueductal gray (PAG). The global DNA methylation profile was quantitatively assessed Imprint Methylated DNA Quantification Kit (Sigma-Aldrich). The expression of Dnmt1 gene was quantitatively measured by real-time PCR using the Taqman detection system and the Gapdh gene as endogenous control. A significant increase in overall DNA methylation was observed in the hypothalamus (P=0.037) of the animals of group EX compared to the CTL group. When interrogated the effect of stress on the global DNA methylation in ST versus EX-ST groups we observed a significant increase in the percentage of methylation in the hypothalamus (P= .003), cortex (P=0.011), hippocampus (P=0.000) and PAG (P=0.000) of the animals of the EX-ST group. Furthermore, a significant reduction was observed in the expression of the gene Dnmt1 in the hippocampus (P=0.035) and hypothalamus (P=0.035) animals of group EX-TS when compared with the ST group. Based on the evidence of this study we can conclude that physical exercise induces a significant increase in global DNA methylation in the hypothalamus of rats. Furthermore, our data show that physical exercise modulates the impact of repeated stress on the global DNA methylation in the hypothalamus, cortex, hippocampus and PAG and that the modulating effect is related to a decrease in the expression of the gene in the hypothalamus and Dnmt1 hippocampus. Key words: Stress; Epigenetics. DNA methylation; Dnmt1; Physical exercise.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 – GRÁFICO DEMONSTRANDO AS FASES DA SÍNDROME GERAL DA ADAPTAÇÃO (SGA) ..................................................................................................................................... 12 FIGURA 2 – PROCESSO DE METILAÇÃO DO DNA, COM A ADIÇÃO DE UM GRUPO METIL NO CARBONO 5 DE CITOSINAS. ..................................................................................................... 18 FIGURA 3 – MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUCIONAIS DE HISTONAS: O GENE “LIGADO” (CROMATINA ABERTA) PERMITE QUE OCORRA A TRANSCRIÇÃO; O GENE “DESLIGADO” (CROMATINA CONDENSADA) IMPEDE A TRANSCRIÇÃO GÊNICA. .............................................. 19
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Bdnf Brain derived neurotrophic factor
CTL Controle
DNA Desoxiribonucleic acid
Dnmt DNA-metiltransferase
DPN Dias pós-natal
EX-ST Exercício-estresse
Gapdh Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
PAG Periaqueductal gray matter
PCR Polymerase Chain Reaction
SN Sistema Nervoso
SNA Sistema Nervoso Autônomo
ST Estresse
UEL Universidade Estadual de Londrina
UNOPAR Universidade Norte do Paraná
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 12 2 REVISÃO DE LITERATURA – CONTEXTUALIZAÇÃO ....................................... 15
2.1 CONCEITO DE ESTRESSE ........................................................................................................................... 15 2.2 ASPECTOS FISIOLÓGICOS E NEUROBIOLÓGICOS DO ESTRESSE .............................................................. 16 2.3 ASPECTOS EPIGENÉTICOS DO ESTRESSE ................................................................................................. 18 2.4 EXERCÍCIO FÍSICO ...................................................................................................................................... 20
3 ARTIGO .................................................................................................................. 21 CONCLUSÃO GERAL .............................................................................................. 36 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 37 ANEXOS ................................................................................................................... 43 ANEXO A – NORMAS DE FORMATAÇÃO DO PERIÓDICO BEHAVIOURAL BRAIN RESEARCH .................................................................................................. 44 ANEXO B – PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA EM ANIMAIS ..... 56
12
1 INTRODUÇÃO
A sobrevivência do ser humano é dependente de um equilíbrio dinâmico
desempenhado por todos os órgãos e tecidos do corpo, que através de suas
funções específicas ajudam a manter as condições constantes no organismo, ou
seja, a homeostasia (GUYTON e HALL, 2006; LOURES et al., 2002). Os sistemas
nervoso, endócrino e imunológico estão conectados através de todo o sistema de
comunicação fisiológico dos mamíferos via rede neuronal, hormonal e imunológicos,
respectivamente. Estes sistemas são amplamente integrados uns com os outros e
permitem que o organismo se adapte às mudanças e desafios ambientais. Dentre
estas mudanças podemos citar o estresse, que pode ser definido como toda
agressão ao organismo, de origem interna ou externa, que perturbe o equilíbrio
homeostático causando um desgaste geral desse organismo (MCEWEN, 2000).
O estresse foi caracterizado por Selye (1959) como uma síndrome geral da
adaptação (Figura 1), que consiste nas seguintes fases:
1. Alarme: é a primeira reação do organismo frente a um estímulo estressor e gera a
resposta imediata de “luta ou fuga”.
2. Resistência: com a exposição prolongada ao estímulo, o organismo se adapta e
aumenta sua resistência frente ao mesmo estímulo.
3. Exaustão: o organismo mesmo adaptado não é capaz de manter-se
indefinidamente desta forma e entra na fase de exaustão.
Figura 1 – Gráfico demonstrando as fases da Síndrome Geral da Adaptação (SGA)
Fonte: http://educar-fazbem.blogspot.com.br/2012/11/qualidade-de-vida-o-fator-estresse_9.html,
acessado em 27 de Outubro de 2014
13
Em relação aos aspectos neurofisiológicos do estresse, sabe-se que as
principais áreas cerebrais ativadas no mecanismo adaptativo do estresse são o eixo
hipotálamo-pituitária, sendo esse eixo responsável pela liberação de fatores e
hormônios que desencadeiam a ativação do córtex da glândula adrenal (GUYTON e
HALL, 2006; LOURES et al., 2002). Juntos eles compoem o chamado eixo
hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA). Em relação as respostas adaptativas ao
estresse, também tem-se atribuido um papel importante a outras áreas cerebrais,
tais como o hipocampo (COLLINS et al., 2009), o córtex e a substância cinzenta
periaquedutal (Periaqueductal Gray Matter – PAG) (BRANDÃO et al., 2006).
As características do estresse dependem de diversos fatores, como o tipo de
estímulo ao estresse (HERMAN et al., 2003; REYES et al., 2003), idade, sexo,
estado hormonal, controle do agente estressor, polimorfismo genético e experiências
prévias do indivíduo (JOELS e BARAM, 2009). Certos processos celulares afetados
pelo estresse como a apoptose, neurogênese e as modificações na cromatina
podem ser responsáveis pelos efeitos irreversíveis e a longo prazo do estresse
(LISOWSKI et al., 2011). Acredita-se que estas alterações persistentes nos
processos biológicos sejam causados por mudanças na expressão gênica
(STANKIEWICZA et al. 2013).
A epigenética, expressão que significa “acima do genoma”, consiste no
estudo das alterações na expressão de genes específicos que independem de
mudanças na sequência primária do DNA (BIRD, 2007). Os mecanismos
epigenéticos como a metilação do DNA e as modificações de histonas tem sido
considerados fatores fundamentais na regulação a longo prazo da expressão gênica
durante o estresse (TSANKOVA et al., 2009). O papel da epigenética é fortemente
enfatizado na plasticidade sináptica, memória e processos cognitivos e também em
moldar fenótipos vulneráveis ao estresse e adaptações comportamentais ao
estresse crônico (SIEGMUND et al., 2007; UCHIDA et al., 2011).
Em adição a estes conceitos, a prática regular de atividade física tem sido
evidenciada como importante intervenção profilática e terapêutica para diversas
disfunções relacionadas ao estresse. O aumento das respostas adaptativas do eixo
HPA provocada pelo exercício físico realizado voluntariamente por animais melhora
a resposta adaptativa ao estresse e diminui a ansiedade relacionada a esse evento
(COLLINS et al., 2009). Um número significativo de estudos experimentais têm
demonstrado que o exercício físico constitui um importante estímulo ambiental capaz
14
de induzir alterações epigenéticas no encéfalo capazes de alterar a maquinaria
transcricional de genes específicos envolvidos com a função cerebral (ELSNER et
al., 2011; FEINBERG, 2008; GOMEZ-PINILLA et al., 2011; LOVATEL et al., 2013).
Além disso, a prática de atividade física tem um potencial efeito terapêutico
relacionado com a melhora da função cognitiva (COTMAN e BERCHTOLD, 2002;
VAYNMAN e GOMEZ-PINILLA, 2005), redução da ansiedade e depressão
(MARTINSEN, 2008) e a capacidade de proteger o cérebro contra desordens
neurogenerativas (GOODWIN et al., 2008; HONEA et al., 2009).
Certamente, muito pouco se sabe ainda a respeito dos efeitos do estresse, ou
da prática de exercício físico, sobre as marcações epigenéticas do DNA e a
expressão gênica em células encefálicas.
Nesse contexto, estudos envolvendo modelos experimentais podem propiciar
dados adicionais à compreensão da vulnerabilidade epigenética ao estresse que
potencialmente podem ser extrapolados de forma translacional ao conhecimento da
neurobiologia humana. Similarmente, estudos em modelos experimentais de ratos
praticantes e não-praticantes de atividades físicas podem proporcionar informações
adicionais e suplantáveis à população humana sobre a importância da prática de
atividade física na manutenção da homeostase e prevenção de doenças
Assim, este estudo teve por objetivo identificar o efeito do estresse repetido e
do exercício físico sobre a metilação global do DNA e a expressão do gene Dnmt1
de áreas encefálicas de ratos, especificamente do hipocampo, hipotálamo, córtex e
substância periaquedutal cinzenta.
15
2 REVISÃO DE LITERATURA – CONTEXTUALIZAÇÃO
2.1 CONCEITO DE ESTRESSE
Vivemos em um ambiente onde constantemente sofremos diversos estímulos
internos e externos, e assim o nosso organismo necessita constantemente da
manutenção de uma homeostase. Em uma situação de desarmonia, o nosso
sistema pode-se encontrar desafiado, e desencadear reações de resistência
denominada estresse.
O pesquisador Hans Selye foi o pioneiro em abordar os princípios gerais da
fisiologia e da fisiopatologia do estresse, e o definiu como uma ameaça real ou
potencial à homeostasia (SELYE, 1965). O estresse é um desequilíbrio substancial
entre a capacidade de demanda (física ou psicológica) e a capacidade de resposta,
que repercute em consequências importantes (MCGRATH, 1970).
Em geral, esses estímulos estressores, tratados inicialmente como demanda
por Selye (1959), podem ser atualmente agrupados em duas grandes categorias:
(a) Estressores físicos, também chamados de sistêmicos. Exigem respostas
fisiológicas imediatas do organismo sem a necessidade de consciência do estímulo
pelo indivíduo. Como por exemplo uma hemorragia, estresse ortostático, exposição
ao calor ou ao frio.
(b) Estressores psicológicos, também chamados de psicogênicos. Dependem da
percepção e da interpretação individual em resposta à ameaça iminente de uma
condição adversa (medo, ansiedade, exposição a um ambiente incontrolável, etc.)
(VAN DE KAR; BLAIR, 1999).
Basicamente, o estresse pode ser definido como uma reação complexa e
global do organismo, envolvendo componentes físicos, psicológicos, mentais e
hormonais frente a situações que representem um desafio maior e que ultrapassem
sua capacidade de enfrentamento, visando adaptar o indivíduo à nova situação
(JOCA et al., 2003).
16
2.2 ASPECTOS FISIOLÓGICOS E NEUROBIOLÓGICOS DO ESTRESSE
A manutenção da homeostasia é realizada principalmente pelo Sistema
Nervoso Autônomo (SNA), tanto no repouso quanto em situação de estresse. Este
sistema coordena respostas reflexas em sistemas específicos como o cardíaco e o
gastrointestinal, correlacionando reações globais com comportamentos voluntários
(LENT, 2010).
Essas mobilizações fisiológicas e comportamentais complexas provocadas
pelo estresse compõem um conjunto de mecanismos compensatórios que são
benéficos e adaptativos, pois preparam o organismo para reagir de maneira rápida e
eficiente aos agentes estressores (PACÁK; PALKOVITS, 2001). Quando prolongada
ou sob condições específicas é capaz de provocar efeitos prejudiciais ao longo da
vida de um indivíduo, causando alterações cognitivas e comportamentais, além de
gerar uma predisposição a estados patológicos (MCEWEN, 2000; VAN DE KAR;
BLAIR, 1999).
Essa resposta adaptativa é regulada por um mecanismo
neuroimunoendócrino que abrange desde o Sistema Nervoso Central (SNC) ao
sistema imune. Estruturas do SNC como o sistema límbico, componentes endócrinos
como o eixo hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) e as catecolaminas liberadas pela
medula adrenal são os centros de controle desta reposta fisiológica (PACÁK e
PALKOVITS, 2001; VAN DE KAR; BLAIR, 1999). É importante destacar uma área
específica do sistema límbico denominado hipocampo, a qual têm-se atribuído um
importante papel nas respostas adaptativas ao estresse (COLLINS et al., 2009).
Com a ativação do eixo HPA, os neurônios do núcleo paraventricular do
hipotálamo são estimulados a secretar o hormônio de liberação de corticotrofina
(CRH), que é transportado para a adeno-hipófise, onde induz a liberação do
hormônio adrenocorticotrofina (ACTH), que por sua vez estimula a síntese e
secreção de hormônios glicocorticoides pelo córtex da adrenal, elevando a
concentração destes na corrente sanguínea, principalmente do cortisol em humanos,
e corticosterona em roedores (ULRICH-LAI; HERMAN, 2009).
Os corticoesteróides atuam em diversos órgãos e várias áreas cerebrais
através de dois tipos receptores: mineralocorticóides e glicocorticóides (REUL; DE
KLOET, 1985). Os glicocorticóides são encontrados em múltiplas áreas cerebrais
relevantes para a cognição, como hipocampo, amígdala e córtex pré-frontal. O
17
hipocampo é especialmente importante para a memória declarativa e espacial, a
amígdala é crítica para a memória emocional e o córtex pré-frontal é relacionada
com a memória de trabalho. Estas regiões não são apenas alvos da ação dos
glicocorticóides mas também são ativamente envolvidos na regulação via feedback
do eixo HPA; os glicocorticóides exercem um feedback negativo nos mesmos níveis
dos quais a sua liberação havia sido previamente iniciada, por exemplo, na pituitária,
hipotálamo (levando a redução da atividade do eixo HPA) e hipocampo (FUCHS et
al., 2004; QUIRARTE et al., 1997; ROOZENDAAL, 2002).
Outras substâncias têm sido estudadas visando a compreender a
neurofisiologia do estresse, dentre elas estão a noradrenalina, a dopamina, a
serotonina, o ácido gama-aminobutírico (GABA), a glicina e o glutamato (MARGIS et
al., 2003).
Uma série de eventos cerebrais e endócrinos envolvidos com a resposta
adaptativa ao estresse são observados após o início do processo citado, incluindo
respostas cardiovasculares importantes resultantes da mediação do SNA simpático.
Pode-se evidenciar alterações como o aumento da pressão arterial e da frequência
cardíaca, vasoconstrição a nível cutâneo e a vasodilatação a nível
musculoesquelético, que acarretam em queda na temperatura cutânea e aumento
na temperatura corporal, respectivamente (REIS et al., 2011).
Dessa forma, tanto os traumas agudos, que podem levar a um Transtorno de
Estresse Pós-Traumático, como situações de adversidades crônicas como
subordinação social ou um estresse crônico imprevisível, podem contribuir para um
comportamento depressivo. Em uma bem sucedida resposta ao estresse, caso o
indivíduo tenha escapado a situação, o corpo irá retornar a um estado de pré-
esforço. Nestes casos, o estresse é uma resposta positiva que mantém o indivíduo
bem e vivo, e pode até aumentar a resiliência a futuros fatores estressores. Tanto as
adaptações negativas quanto positivas ao estresse podem levar o SNC a se
submeter a mudanças epigenéticas que influenciam suas respostas futuras
(GRIFFITHS; HUNTER, 2014).
18
2.3 ASPECTOS EPIGENÉTICOS DO ESTRESSE
As evidências da influência da epigenética nos aspectos envolvidos com as
respostas comportamentais adaptativas vem crescendo a cada dia. Um dos temas
bastante estudados atualmente neste contexto é o estresse, que pode possuir
mecanismos estressores de natureza temporária ou não. Definem-se como
epigenéticos os mecanismos capazes de controlar a atividade e a expressão gênica
das células, sem que a sequência do DNA seja modificada. Entre as principais
modificações epigenéticas conhecidas incluem-se a metilação do DNA e as
modificações pós-traducionais de histonas (JENUWEIN; ALLIS, 2001; JONES;
TAKAI, 2001).
A metilação do DNA ocorre quando um grupo metil (CH3) é adicionado no
carbono 5 de citosinas situados adjacentes a guanina (Sítio CpG) (Figura 2). As
partes de sequências de DNA com uma elevada concentração de CpG são referidos
como 'ilhas' CpG, e geralmente estão localizados no início da sequência do gene
dentro da região promotora. A metilação de DNA dentro da região promotora de um
gene pode ser a explicação do porque essa modificação tem um efeito tão profundo
na expressão gênica, geralmente silenciando a expressão do respectivo gene
(ILLINGWORTH; BIRD, 2009).
Figura 2 – Processo de metilação do DNA, com a adição de um grupo metil no carbono 5 de citosinas.
Fonte: http://www.ks.uiuc.edu/Research/methylation/ , acessado em 04 de Novembro de 2014.
19
As alterações epigenéticas também podem ocorrer pelas modificações pós-
traducionais nas histonas (Figura 3). Elas são as principais proteínas constituintes do
nucleossomo, a unidade fundamental da cromatina. Os nucleossomos estão
dispostos em octâmeros, com quatro proteínas histonas presentes em cada
nucleossomo: H2A, H2B, H3, e H4 (GRIFFITHS; HUNTER, 2014). O número de
possíveis modificações nas histonas é bastante grande (ALLIS et al., 2007; TAN et
al., 2011), porém as três mais estudadas são: metilação, acetilação e fosforilação
(HUNTER, 2012; JIANG et al., 2008).
Figura 3 – Modificações pós-traducionais de histonas: o Gene “ligado” (cromatina aberta) permite que ocorra a transcrição; o Gene “desligado” (cromatina condensada) impede a transcrição gênica.
Fonte: Adaptado e traduzido de http://cnx.org/content/m26565/latest/graphics35.jpg , acessado em
04 de Novembro de 2014.
Algumas alterações moleculares específicas podem ser fruto de um conjunto
característico de modificações epigenéticas, que podem estar envolvidos em
processos como o silenciamento do gene, inativação do cromossomo-X ou
imprinting. Fatores ambientais como o estresse vem sendo estudados atualmente
pois podem apresentar uma relação direta ou indireta com as modificações
epigenéticas, através de certas reações químicas que podem influenciar o estado da
cromatina. Estas reações podem deixar a cromatina em um estado não condensado,
e fazer com que extensões do DNA contendo um gene permaneçam expostos por
períodos mais longos ou curtos de tempo, tornando-o ativo ou inativo e permitindo
assim as mudanças na produção de proteína (STANKIEWICZA et al., 2013).
20
2.4 EXERCÍCIO FÍSICO
O exercício físico é compreendido como qualquer atividade associado à
movimento corporal produzido por músculos que resulta em maior dispêndio de
energia, desde que seja estruturado, repetitivo e aplicado de forma proposital
(NEDER; NERY, 2004).
Diversos estudos sugerem que a atividade física apresenta um efeito
fisiológico e cognitivo positivo mediada por alteração nos perfis de transcrição.
Porém, os mecanismos moleculares responsáveis são desconhecidos. Neste
contexto, estudos recentes têm examinado o impacto epigenético do exercício físico.
Embora os dados experimentais que possam conectar o exercício físico e a
epigenética ainda serem limitados, eles abrem novos caminhos que podem ajudar
projetar intervenções médicas e de estilo de vida inovadoras (KALIMAN, 2011).
Em humanos, estudos preliminares revelaram efeitos do exercício sobre
modificações globais de histonas nos músculos esqueléticos. Evidências
demonstraram que o exercício resulta em um aumento global na acetilação do
H3K36 (histona H3 nos resíduos de lisina na posição 36), o que induz a
remodelação da cromatina associada com um aumento da transcrição gênica.
Também encontrou-se durante o exercício físico a exportação nuclear de HDAC4 e
5, tornando estas enzimas incapazes de suprimir a acetilação das histonas,
aumentando também a transcrição (MCGEE et al., 2009).
Assim, os indícios de adaptações evocadas pela prática de exercício físico no
organismo tornam de grande interesse a realização de estudos adicionais focados
na compreensão dos aspectos moleculares, como por exemplo dos mecanismos
epigenéticos, sobre os efeitos provocados pela prática de exercício e/ou atividade
física (MCARDLE et al., 2011).
21
3 ARTIGO
EFEITOS DO ESTRESSE REPETIDO SOBRE A PROGRAMAÇÃO EPIGENÉTICA DO CÉREBRO DE RATOS PRATICANTES E NÃO PRATICANTES DE ATIVIDADE
FÍSICA
Kashimoto RK1, Toffoli LV1, Manfredo MHF1, Volpini VL2, Martins-Pinge MC2, Pelosi GG2, Gomes MV1.
1 Centro de Pesquisa em Ciências da Saúde, Universidade Norte do Paraná (Unopar), Londrina, Paraná, Brasil,
2 Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Ciências Fisiológicas, Universidade Estadual de Londrina (UEL), Paraná, Brasil Telefone: +55 43 3371 9859 Email: [email protected]; [email protected]
URL: http://www.unopar.br
22
ABSTRACT
A growing body of evidence has indicated the involvement of epigenetic mechanisms, such as DNA methylation with the neuroadaptive responses to behavioral stress. In this context, the present study aimed to assess the effect of the repeated restraint stress on the global DNA methylation profile of rat brain and its relationship with the expression of Dnmt1 gene. Additionally, we aimed to evaluate the potential of the physical activity (swimming) to modulate the molecular responses evoked by stress. Wistar sedentary rats were repetitively submitted to the validated protocol of restraint stress during the period that correspond the 75th postnatal day (PND) and the 79th PND (ST). The animals of the physically active group (EX) were submitted to swimming sessions during the 53th PND to 78th PND. The animals of the exercise-stress group (EX-ST) were submitted to swimming session during 53-78th PND and to the restraint stress during 75-79th PND. We considered for the control group (CTL) animals that were not submitted to any intervention. Animals from all the experimental and control groups were sacrificed at the 80th PND to obtain samples from the hippocampus, cortex, hypothalamus, and periaqueductal gray (PAG). The global DNA methylation profile was quantitatively assessed using an ELISA-based method and the quantitative expression of the Dnmt1 was evaluated by real time PCR. A significant increase in the methylation profile was observed in the hypothalamus of animals from the EX group in comparison to CTL, although no significant change was observed in the cortex, PAG or hippocampus. When interrogated the adaptive response to stress, significant increase in the global DNA methylation profile was observed in the hippocampus, cortex, hypothalamus and PAG of exercised animals (EX-ST). Furthermore, our data revealed a significant reduction in the expression of the Dnmt1 gene in the hippocampus and hypothalamus of the animals from the EX-ST group. Based on the present evidences we suggest that physical exercise might modulate the changes in the DNA methylation profile evoked by the repeated restraint stress. Furthermore, our data reveal that the increase in the DNA methylation evoked by the repeated restraint stress in the EX-ST group is associated to a decrease in the expression of the Dnmt1 gene, especially in the hippocampus and hypothalamus.
23
Introdução
O estresse e suas implicações vem sendo cada vez mais estudados, a medida que
aumentam as evidências das relações entre os fatores ambientais e as atividades
desencadeadas a nível central e periférico pelo corpo como resposta aos desequilíbrios
gerados. Os estressores podem ser físicos, como mudanças de temperatura, treinamento físico
intenso, danos ao tecido, privação de sono e dificuldades interpessoais; e também podem ser
psicológicos, como medo, pressão ocupacional, ansiedade e frustrações [1].
As respostas do corpo aos agentes estressores ocorrem principalmente devido a
atividade do eixo denominado Hipotálamo-Pituitária-Adrenal (HPA), que incluem a
modulação na produção do hormônio de liberação da corticotrofina (CRF), subsequente
liberação do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) na corrente sanguínea e também do
cortisol pela adrenal [2].
Um assunto que vem sendo discutido, e que se apresenta como importante fator nas
alterações envolvidas nos desequilíbrios do sistema HPA, é a epigenética. Os mecanismos
epigenéticos como a metilação de DNA e as modificações nas histonas estão fortemente
ligadas as regulações na expressão gênica a longo prazo durante o estresse [3]. Todo o
processo de metilação é mediado, ao menos, por três DNA metiltransferase (Dnmt1, Dnmt3a
e Dnmt3b), e para as modificações nas histonas a reação de catalisação é realizada pela enz
ima histona acetiltransferase (HAT). As Dnmt3a e Dnmt3b são expressos em embriões,
chamados de metilação de novo [4,5]. Já a Dnmt1 tem ação crucial para a metilação
hereditária normal na fase pós-embrionária, pois age reconhecendo os sítios CpG hemi-
metilados estabelecidos pela Dnmt3a e Dnmt3b, realizando a metilação que complementa os
sítios CpG e, por conseguinte, converte-os para um estado totalmente metilado. Assim, a
Dnmt1 é responsável pela metilação de manutenção [6]
Dentro destes conceitos, a prática regular de atividade física tem sido evidenciada
como intervenção profilática e terapêutica para diversas disfunções, dentre elas as que
envolvem o estresse. O aumento das respostas adaptativas do eixo HPA provocada pelo
exercício físico realizado voluntariamente por animais melhora a resposta adaptativa ao
estresse e diminui a ansiedade relacionada a esse evento [7]. Estudos experimentais têm
demonstrado que o exercício físico constitui um importante estímulo ambiental capaz de
induzir alterações epigenéticas no encéfalo, o que pode alterar a maquinaria transcricional de
genes específicos envolvidos com a função cerebral [8-11]. Além disso, a prática de atividade
física tem um potencial efeito terapêutico relacionado com a melhora da função cognitiva
[12,13]; redução da ansiedade e depressão [14] e a capacidade de proteger o cérebro contra
24
desordens neurogenerativas [15,16].
Assim, o objetivo do presente estudo foi identificar o efeito do estresse repetido no
perfil global de metilação do DNA e na expressão do gene Dnmt1 de células cerebrais de
ratos. Além disso, foi avaliado o potencial do exercício físico (natação) na modulação dos
efeitos do estresse sobre o perfil de metilação do DNA e na expressão do gene Dnmt1.
Metodologia
Animais e Grupos Experimentais
Os procedimentos experimentais foram realizados seguindo protocolos aprovados pelo
Comitê de Ética em Pesquisa local (CEUA n°14441.2013.18). Ratos machos sem parentesco
foram mantidos em condições de temperatura ambiente (25±1 °C, fotoperíodo de 12h luz /
12h escuro) com água e ração ad libitum, no biotério da Universidade Estadual de Londrina.
Os animais foram classificados em quatro grupos, contendo de 4-10 animais cada: 1) o grupo
exercício físico (EX): animais que foram submetidos ao exercício físico (natação por 60
minutos/dia) do 53 dia pós-natal (DPN) ao 78 DPN; 2) grupo estresse (ST): animais que
foram submetidos ao estresse repetido de contenção do 75 ao 79 DNP; 3) grupo exercício
físico e estresse (EX-ST): animais que foram submetidos ao exercício físico (natação por 60
minutos/dia) do 53 DPN ao 78 DPN e também ao estresse repetido de contenção do 75 DPN
ao 79 DPN; e 4) grupo controle (CTL): animais que não foram submetidos a intervenções.
Estresse de Repetição
No período da manhã (7:00 - 09:00), os animais dos grupos ST e EX-ST foram
transportados para a sala experimental em suas gaiolas e permitido que eles se adaptassem a
este ambiente por pelo menos 30 minutos. Após este período, os animais foram submetidos ao
protocolo de estresse, sendo colocados em um cilindro metálico de 6,5 cm de diâmetro e 15
cm de comprimento com orifícios que permitiam ventilação, onde permaneceram fechados e
mantidos imobilizados durante 60 minutos.
Exercício Físico
Os animais do grupo EX e EX-ST foram submetidos ao treinamento físico (natação),
sem estímulos ou tarefas, de acordo com Martins-Pinge et al [17]. As sessões de natação
foram realizadas na parte da manhã num tanque de vidro cheio com água morna (31 ± 1 °C),
área de superfície de 4000 cm2 e 60 cm de profundidade.
25
O treinamento consistiu de 4 semanas (20 sessões) de natação, realizada 5 dias por
semana com 60 minutos de duração por dia. Durante a primeira semana, houve uma
habituação ao treino, iniciando com 15 minutos no primeiro dia, 30 minutos no segundo dia, e
45 minutos no terceiro dia, para adaptação ao processo de treinamento. A partir do quarto dia
em diante, cada sessão consistiu de 60 minutos de natação até o 78 DPN. Após cada sessão de
natação, os animais foram secos com toalha e mantidos por um período de reajuste em caixa
coletiva, e depois voltaram para suas gaiolas individuais.
Os animais foram acompanhados durante todas as sessões de natação, para evitar a
flutuação passiva do rato e minimizar o viés relacionado a diferentes intensidades de exercício
físico de cada animal.
Amostras
As coletas foram realizadas no período matutino (08:00 - 12:00) para evitar a
interferência do ciclo circadiano sobre as variáveis biológicas estudadas. Os animais foram
mortos por decapitação e a amostra sanguínea foi obtida do tronco.
O cérebro foi rapidamente removido do crânio e as amostras do hipotálamo, região
frontal do córtex (aproximadamente 2mm incluindo a área do córtex cingulado e excluindo o
corpo caloso), PAG e hipocampo foram obtidas imediatamente.
As áreas do cérebro foram seccionadas de acordo com o atlas anatômico de Paxinos e
Watson [18], e os tecidos foram armazenados a -80 °C.
Metilação global do DNA
O DNA genômico foi obtido pelo protocolo padrão salting out [19]. A avaliação da
pureza e concentração de DNA foi realizada pela análise de absorbância em um
espectofotômetro (NanoDrop ND-2000 – Thermo Scientific) a 260nm e 280nm
O perfil de metilação global de DNA foi avaliado pela dosagem (porcentagem) dos
grupos metil (CH3) utilizando o Kit de Quantificação de DNA Metilado (Sigma-Aldrich®), de
acordo com as recomendações do fabricante e já previamente descritas [20]. De forma
resumida, o estado de metilação de cada amostra foi calculada pela quantidade de citosinas
metiladas na amostra (5mC) em relação a citidina global (5mC + dC) em um controle positivo
(100% metilado) que havia sido previamente metilado e no controle negativo (0% metilado)
utilizando as leituras de absorbância a 450 nm e seguindo a fórmula: A450amostra –
A450NTC / (A450metilado – A450NTC) x100. Todas as amostras foram analisadas em
triplicata.
26
Análise quantitativa da expressão gênica
As amostras de RNA foram obtidas utilizando Trizol (Invitrogen®) e a transcrição
reversa foi realizada utilizando o Kit de Alta Capacidade (Applied Biosystems®), de acordo
com as recomendações dos fabricantes. Os níveis de expressão dos genes Dnmt1 foram
avaliadas por PCR em tempo real (Applied Biosystems®, Foster City, CA, USA).
Amplificações foram obtidas utilizando sondas Taqman (Applied Biosystems®, Foster City,
CA, USA) para o gene Dnmt1 (Assay I.D. Rn00709664_M1). Para a normalização da
diferença na quantidade de cDNA foi utilizado o gene Gapdh (Assay I.D Rn01775763_G1)
como controle endógeno. Os experimentos foram realizados em triplicata.
Análise estatística
A análise da normalidade dos dados foi realizada utilizando o teste de Shapiro-Wilk.
Os testes não-paramétricos de Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis (Pós-teste: Dunn) foram
utilizados para comparar o perfil de metilação global de DNA e também para análise
quantitativa da expressão do gene Dnmt1 entre os grupos. O programa GraphPad Prism 6.0
foi utilizado para as análises estatísticas. Foi considerado o intervalo de confiança de 95% e o
nível de significância de 5% (P<0.05) em todos os testes utilizados.
Resultados
Efeitos do exercício físico e do estresse sobre a metilação global do DNA
Aumento significativo (P=0,037), teste de Mann-Whitney, da porcentagem de
metilação global do DNA foi observado no hipotálamo de animais praticantes de exercício
físico (EX) em comparação aos animais controles (CTL). Não foi observada diferença
significativa na metilação global do DNA da PAG, hipocampo e córtex (Figura 1).
27
H ip o tá la m oM
eti
laç
ão
Glo
ba
l (%
)
C T L E X0
2 0
4 0
6 0
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Glo
ba
l (%
)
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2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
Figura 1 – Perfil de metilação global do DNA no Hipotálamo, Córtex, PAG e Hipocampo nos grupos CTL e EX. CTL: grupo controle; EX: grupo exercício físico. *P < 0.05. Teste de Mann-Whitney. .
Quando comparada a porcentagem de metilação global do DNA em animais
sedentários submetidos ao estresse por restrição repetido (ST) e animais praticantes de
exercício físico submetidos ao mesmo protocolo repetido de estresse (EX-ST) foi observado
um aumento da metilação global no hipotálamo (P=0,003), córtex (P=0,011), hipocampo
(P=0,000) e PAG (P=0,000) (Figura 2).
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H ip o tá la m oM
eti
laç
ão
Glo
ba
l (%
)
C T L S T
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2 0
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H ip o c a m p o
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0
2 0
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1 0 0 *
Figura 2 – Perfil de metilação global do DNA no Hipotálamo, Córtex, PAG e Hipocampo nos grupos CTL, ST e EX-ST. CTL: grupo controle; ST: grupo estresse; EX-ST: grupo exercício físico e estresse. *P < 0.05. Teste de Kruskal-Wallis (pós-teste: Dunn).
Expressão quantitativa do gene Dnmt1
A análise quantitativa revelou uma diminuição significativa da expressão do gene
Dnmt1 nas amostras obtidas de hipocampo (P=0,035) e hipotálamo (P=0,035) dos animais do
grupo EX-ST quando comparados ao grupo ST (Figura 3).
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H ip o tá lam o
ST
E X-ST
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
QR
*
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H ip o c am p o
ST
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0
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8
1 0
QR
*
Figura 3 – Expressão quantitativa do gene Dnmt1 no Hipotálamo, Córtex e Hipocampo nos grupos ST e EX-ST. ST: grupo estresse; EX-ST: grupo exercício físico e estresse. *P < 0.05. Teste de Mann-Whitney. QR = quantificação relativa de acordo com a expressão do gene Gapdh.
30
Discussão
O presente estudo demonstra o envolvimento de alterações significativas na metilação
global do DNA principalmente do hipotálamo em consequência à prática de exercício físico,
além de revelar o potencial do exercício físico em modular as respostas adaptativas ao
estresse repetido no que diz respeito à metilação do DNA no hipocampo, cortex, hipotálamo e
PAG e expressão do gene Dnmt1 no hipocampo e hipotálamo.
Um número crescente de estudos tem interrogado a relação entre o exercício físico e as
alterações epigenéticas. Recentemente, Elsner et al. [21] demonstraram que mesmo uma única
série de exercícios, realizada com ratos machos Wistar em esteira, induz um decréscimo
significativo da metilação global do DNA no hipocampo, assim como na expressão dos genes
Dnmt1 e Dnmt3b. Gomez-Pinilla et al. [10] relataram em seu estudo que o exercício físico
reduz a metilação global do DNA no gene Bdnf (Brain-Derived Neurotrophic Factor) no
hipocampo de ratos com três meses de idade, o que leva a idéia de que o exercício físico pode
aumentar a atividade de transcrição de genes envolvidos na formação da memória e
plasticidade neuronal através da modulação da metilação do DNA.
Corroborando com as evidências de vulnerabilidade da metilação do DNA no cérebro,
os dados do presente estudo demonstraram que a prática de exercício físico está associada
estatisticamente ao aumento da metilação global do DNA no hipotálamo. Entretanto, embora
não estatisticamente significativo, a análise dos dados do presente estudo sugere uma
tendência ao aumento da metilação global no hipocampo e cortex e uma diminuição na PAG
dos animais do grupo EX. Estudos futuros, envolvendo um número amostral maior podem
confirmar nossa especulação de efeito do exercício físico sobre a metilação global do
hipocampo, cortex e PAG.
Também verificou-se no presente estudo que não houve uma relação diretamente
proporcional entre a metilação global nas estruturas cerebrais com a expressão do gene DNA
31
metiltransferase 1 (Dnmt1). Esta enzima é responsável pela propagação da informação da
metilação do DNA através da manutenção destes padrões após a replicação do DNA [22], e
mostram preferência pelo sítios de Citosina-Guanina hemi-metilados, como aqueles que
aparecem após o processo de replicação.
Em nosso estudo, uma redução na expressão do gene Dnmt1 foi observada de forma
significativa no hipocampo e hipotálamo no grupo EX-ST em relação ao grupo ST,
contrapondo o aumento na metilação global do DNA observada nas mesmas áreas cerebrais.
Diante dessa evidência, especulamos que embora a metilação específica pela Dnmt1
em DNA hemi-metilado seja a base molecular da hereditariedade dos padrões de metilação,
ainda permanecem obscuros os mecanismos pelas quais a Dnmt1 consegue realizar essa
função [23]. Estudos futuros certamente são necessários para identificar o envolvimentos de
outros fatores no processo de metilação do DNA.
Dados recentes de nosso grupo demonstraram que a diminuição da metilação global do
DNA é uma caracteristica normalmente associada às respostas adaptativas ao estresse agudo
[24]. A redução da metilação global do DNA pode ser explicada por um possível processo
denominado demetilação, que vem recentemente sendo estudado. A perda da metilação de
forma ativa refere-se a um processo enzimático que remove ou modifica o grupo metil do sítio
5-metilcitosina (5mC). Já a forma passiva é relacionado à perda do 5mC durante as sucessivas
replicações na ausência da manutenção da maquinaria funcional de metilação do DNA [25].
Embora a demetilação passiva seja, de forma geral, entendida e aceita, a evidência da
demetilação ativa e como ocorre seu processo ainda permanece controverso [26,27]. Na
última década uma séria de descobertas vem sendo realizadas, e uma delas, considerada um
divisor de águas na compreensão dos mecanimos de demetilação, é a oxidação do 5mC (5-
hidroximetilcitosina – 5hmC) mediada por uma família de enzimas denominada Ten-Eleven-
Translocations (TET).
32
Embora o 5hmC já tivesse sido previamente observado em genomas de mamíferos,
elas não haviam recebido atenção até a descoberta das enzimas TET, pois estes catalisadores
são capazes de propositalmente gerar essa base oxidada [28-30]. Dessa forma, embora ainda
não seja possível de fato comprovar a relação do estresse com a demetilação, é uma
possibilidade a ser considerada mediante os resultados encontrados no presente estudo.
Apesar das evidências demonstradas no presente estudo envolvendo alterações
significativas da metilação global do DNA, estudos adicionais são ainda necessários para a
identificação de genes específicos cujas expressões podem ser afetadas pelo estresse. Além
disso, em virtude da necessidade de realizar as análises moleculares das áreas cerebrais
imediatamente após os protocolos propostos, não foi possível determinar as consequências e a
durabilidade das modificações encontradas. Estudos visando um acompanhamento destas
alterações por um maior período poderão esclarecer estas questões.
Em suma, nossos dados revelam, pela primeira vez na literatura, que a prática de
exercício físico induz um aumento significativo da metilação global do DNA no hipotálamo
de ratos. Além disso, nossos dados demonstram que a prática de exercício físico modula a
resposta neurobiológica ao estresse por restrição repetido, no que diz respeito à metilação
global do DNA no hipotálamo, córtex, hipocampo e PAG, e à expressão do gene Dnmt1 no
hipotálamo e hipocampo.
33
Referências
1. Aguilera G, Kiss A, Liu Y, Kamitakahara A. Negative regulation of corticotropin
releasing factor expression and limitation of stress response. Stress 2007;10(2): 153-161.
2. Trollope AF, Gutièrrez-Mecinas M, Mifsud KR, Collins A, Saunderson EA, Reul JMHM.
Stress, epigenetic control of gene expression and memory formation. Experimental
Neurology 2012;233:3–11.
3. Tsankova N, Renthal W, Kumar A, Nestler EJ. Epigenetic regulation in psychiatric
disorders. Nat. Rev. Neurosci. 2007;8:355–367.
4. Lyko, F., B. H. Ramsahoye, H. Kashevsky, M. Tudor, M. A. Mastrangelo, T. L. Orr-
Weaver, and R. Jaenisch. 1999. Mammalian (cytosine-5) methyltransferases cause
genomic DNA methylation and lethality in Drosophila. Nat. Genet. 23:363–366.
5. Okano, M., D. W. Bell, D. A. Haber, and E. Li. 1999. DNA methyltransferases Dnmt3a
and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell
99:247–257.
6. Li, E., C. Beard, and R. Jaenisch. 1993. Role for DNA methylation in genomic
imprinting. Nature 366:362–365.
7. Collins A, Hill LE, Chandramohan Y, Whitcomb D, Droste SK, Reul JMHM. Exercise
improves cognitive responses to psychological stress through enhancement of epigenetic
mechanisms and gene expression in the dentate gyrus. PLoS One 2009;4(1):e4330.
8. Elsner, V.R., Lovatel, G.A., Bertoldi, K., Vanzella, C., Santos, F.M., Spindler, C., de
Almeida, E.F., Nardin, P., Siqueira, I.R., 2011. Effect of different exercise protocols on
histone acetyltransferases and histone deacetylases activities in rat hippocampus.
Neuroscience. 192:580-7.
9. Feinberg, A.P., 2008. Epigenetics at the epicenter of modern medicine. JAMA. 299:1345-
50.
10. Gomez-Pinilla F, Zhuang Y, Feng J, Ying Z, Fan G. Exercise impacts brain-derived
neurotrophic factor plasticity by engaging mechanisms of epigenetic regulation. Eur J
Neurosci 2011;33(3):383-90.
11. Lovatel, G.A., Elsner, V.R., Bertoldi, K., Vanzella, C., Moysés Fdos, S., Vizuete, A.,
Spindler, C., Cechinel, L.R., Netto, C.A., Muotri, A.R., Siqueira, I.R., 2013. Treadmill
exercise induces age-related changes in aversive memory, neuroinflammatory and
epigenetic processes in the rat hippocampus. Neurobiol Learn Mem. 101:94-102.
34
12. Cotman, C.W., Berchtold, N.C., 2002. Exercise: a behavioral intervention to enhance
brain health and plasticity. Trends Neurosci. 25: 295–30.
13. Vaynman, S., Ying, Z., Yin, D., Gomez-Pinilla, F., 2006. Exercise differentially regulates
synaptic proteins associated to the function of BDNF. Brain Res. 1070:124-130.
14. Martinsen EW. Physical activity in the prevention and treatment of anxiety and
depression. Nord J Psychiatry. 2008;62 Suppl 47:25-9.
15. Goodwin VA, Richards SH, Taylor RS, Taylor AH, Campbell JL. The effectiveness of
exercise interventions for people with Parkinson's disease: a systematic review and meta-
analysis. Mov Disord. 2008 Apr 15;23(5):631-40.
16. Honea RA, Thomas GP, Harsha A, Anderson HS, Donnelly JE, Brooks WM et al. (2009).
Cardiorespiratory fitness and preserved medial temporal lobe volume in Alzheimer
disease. Alzheimer Dis. Assoc. Disord. 23, 188–197.
17. Martins-Pinge MC, Becker LK, Garcia MRL, Zoccal DB, Neto RV, Basso LS et al.
Attenuated pressor responses to amino acids in the rostral ventrolateral medulla after
swimming training in conscious rats. Auton Neurosci 2005;122: 21–28.
18. Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. San Diego: Academic
Press; 2009.
19. Sambrook J, Fritschi EF, Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual. 3rd ed.
New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.
20. Toffoli LV, Rodrigues GM Jr, Oliveira JF, Silva AS, Moreira EG, Pelosi GG et al.
Maternal exposure to fluoxetine during gestation and lactation affects the DNA
methylation programming of rat's offspring: modulation by folic acid supplementation.
Behav Brain Res 2014;265:142-147.
21. Elsner VR, Lovatel GA, Moysés F, Bertoldi K, Spindler C, Cechinel LR et al. Exercise
induces age-dependent changes on epigenetic parameters in rat hippocampus: A
preliminary study. Experimental Gerontology 2013;48:136–139.
22. Hermann A, Gowher H, Jeltsch A. Biochemistry and biology of mammalian DNA
methyltransferases.Cell Mol Life Sci 2004;61:2571–2587.
23. Bashtrykov P, Jankevicius G, Smarandache A, Jurkowska RZ, Ragozin S, Jeltsch A.
Specificity of Dnmt1 for Methylation of Hemimethylated CpG Sites Resides in Its
Catalytic Domain. Chemistry & Biology 2012;19:572–578.
24. Rodrigues-Jr GM, Toffoli LV, Manfredo MH, Oliveira JF, Silva AS, Raquel HA et al.
Acute stress affects the global DNA methylation profile in rat brain: Modulation by
physical exercise. Behavioural Brain Research 2015; 279:123–128.
35
25. Kohli RM, Zhang Y. TET enzymes, TDG and the dynamics of DNA demethylation.
Nature 2013;502:472–79.
26. Ooi SK, Bestor TH. The colorful history of active DNA demethylation. Cell
2008;133:1145–1148.
27. Wu SC, Zhang Y. Active DNA demethylation: many roads lead to Rome. Nature Rev
Mol Cell Biol 2010;11:607–620.
28. Kriaucionis S, Heintz N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in
Purkinje neurons and the brain. Science 2009;324:929–930.
29. Tahiliani M, Koh KP, Shen Y, Pastor WA, Bandukwala H, Brudno Y et al. Conversion of
5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner
TET1. Science 2009;324:930–935.
30. Ito S, D'Alessio AC, Taranova OV, Hong K, Sowers LC, Zhang Y. Role of Tet proteins
in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.
Nature 2010;466:1129–1133.
36
CONCLUSÃO GERAL
Com base nas evidências do presente estudo podemos concluir que:
1) A prática de exercício físico altera o perfil de metilação global no hipotálamo de
ratos.
2) A prática de exercício físico modula o efeito do estresse por restrição repetido
sobre a metilação global do DNA, principalmente no hipocampo, córtex,
hipotálamo e PAG.
3) A prática de exercício físico modula o efeito do estresse repetido por restrição
sobre a expressão do gene Dnmt1 principalmente no hipotálamo e hipocampo.
37
REFERÊNCIAS
ALLIS, C.D.; BERGER, S.L.; COTE J. et al. New nomenclature for chromatin-
modifying enzymes. Cell, v. 131, n. 4, p. 633–636, 2007.
BIRD, A. Perceptions of epigenetics. Nature, v. 447, p.396–398, 2007.
BRANDÃO, M.L.; VIANNA, D.M.; MASSON, S. et al. Organização neural de
diferentes tipos de medo e suas implicações na ansiedade. Rev Bras Psiquiatria, v.
25, p. 36–41, 2003.
COLLINS, A.; HILL, L.E.; CHANDRAMOHAN, Y. et al. Exercise improves cognitive
responses to psychological stress through enhancement of epigenetic mechanisms
and gene expression in the dentate gyrus. PLoS One, v. 4, n. 1, p. e4330, 2009.
COTMAN, C.W.; BERCHTOLD, N.C. Exercise: a behavioral intervention to enhance
brain health and plasticity. Trends Neuroscience, v. 25, p. 295–30, 2002.
ELSNER, V.R.; LOVATEL, G.A.; BERTOLDI, K. et al. Effect of different exercise
protocols on histone acetyltransferases and histone deacetylases activities in rat
hippocampus. Neuroscience, v. 192, p. 580-7, 2011.
FEINBERG, A.P. Epigenetics at the epicenter of modern medicine. JAMA, v. 299, p.
1345-50, 2008.
FUCHS, E.; CZE´H, B.; KOLE, M.H.P. et al. Alterations in neuroplasticity in
depression: the hippocampus and beyond. European Neuropsychopharmacolgy,
v. 4, s. 5, p.S481–S490, 2004.
GOMEZ-PINILLA, F.; ZHUANG, Y.; FENG, J. et al. Exercise impacts brain-derived
neurotrophic factor plasticity by engaging mechanisms of epigenetic regulation.
European Journal of Neuroscience, v. 33, n. 3, p. 383-90, 2011.
38
GOODWIN, V.A.; RICHARDS, S.H.; TAYLOR, R.S. et al. The effectiveness of
exercise interventions for people with Parkinson's disease: a systematic review and
meta-analysis. Moviment Disorders, v. 23, n. 5, p. 631-40, 2008.
GRIFFITHS, B.B.; HUNTER, R.G. Neuroscience forefront review: Neuroepigenetics
of stress. Neuroscience, v. 275, p. 420–435, 2014.
GUYTON, A.C.; HALL, J.E. (2006) Tratado de Fisiologia Médica. 9 ed. Rio de
Janeiro: Elsevier, 2006.
HERMAN, J.P.; FIGUEIREDO, H.; MUELLER, N.K. et al. Central mechanisms of
stress integration: hierarchical circuitry controlling hypothalamo–pituitary–
adrenocortical responsiveness. Frontiers in Neuroendocrinolgy, v. 24, n. 3, p.
151–180, 2003.
HONEA, R.A.; THOMAS, G.P.; HARSHA, A. et al. Cardiorespiratory fitness and
preserved medial temporal lobe volume in Alzheimer disease. Alzheimer Dis. Assoc. Disord., v. 23, p. 188–197, 2009.
HUNTER, R.G. Epigenetic effects of stress and corticosteroids in the brain. Frontiers in Cellular Neuroscience, v. 6, n. 18, 2012.
ILLINGWORTH, R,.S.; BIRD, A.P. CpG islands – a rough guide. FEBS Letters, v.
583, n. 11, p. 1713–1720, 2009.
JENUWEIN, T; ALLIS, C. Translating the histone code. Science, v. 293, n.
5532:1074-80, 2001
JIANG, Y., LANGLEY, B., LUBIN, F.D. et al. Epigenetics in the nervous system. The Journal of Neuroscience, v. 28, n. 46,, p. 11753–11759, 2008.
JOCA, S.R.L.; MARIA, C.S.F. Estresse, depressão e hipocampo. Revista Brasileira
de Psiquiatria, v. 25, p. 46-51, 2003.
39
JOELS, M.; BARAM, T.Z. The neuro-symphony of stress. Nat. Rev. Neurosci, v. 10,
p. 459–466, 2009.
JONES, P.; TAKAI, D. The role of DNA methylation in mammalian epigenetics.
Science, v. 293, p. 1068–70, 2001.
KALIMAN, P.; PÁRRIZASA, M.; LALANZAB, J.F. et al. Neurophysiological and
epigenetic effects of physical exercise on the aging process. Ageing Research Reviews, v. 10, p. 475– 486, 2011.
LENT, R. Cem Bilhões de Neurônios: Conceitos Fundamentais de Neurosciência. 2. ed. São Paulo: Atheneu, 2010.
LISOWSKI, P.; JUSZCZAK, G.R.; GOSCIK, J. et al. Effect of chronic mild stress on
hippocampal transcriptome in mice selected for high and low stress-induced
analgesia and displaying different emotional behaviors. Eur. Neuropsychopharmacol, v. 21, p. 21:45–62, 2011.
LOURES, D.L.; SANT’ANNA, I.; BALDOTTO, C.S.R. et al. Estresse Mental e
Sistema Cardiovascular. Arq Bras Cardiol, v. 78, n. 5, p. 525–30, 2002.
LOVATEL, G.A.; ELSNER, V.R.; BERTOLDI, K. et al. Treadmill exercise induces
age-related changes in aversive memory, neuroinflammatory and epigenetic
processes in the rat hippocampus. Neurobiol Learn Mem., v. 101, p. 94-102, 2013.
MARGIS, R., PICON, P., COSNER, A.F. et al. Relação entre estressores, estresse e
ansiedade. Rev Psiquiatr do Rio Gd do Sul, v. 25, n. 1, p. 65-74.
MARTISEN, E.W. Physical activity in the prevention and treatment of anxiety and
depression. Nord J Psychiatry, v. 62, s. 47, p. 25-9.
MCARDLE, W.D.; KATCH, F.I.; KATCH, V.L. Fisiologia do Exercicio - Energia,
Nutrição e Desempenho Humano. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 7. ed.; 2011.
40
MCEWEN, B.S. The neurobiology of stress: from serendipity to clinical relevance.
Brain Res, v. 886, p. 172–189, 2000.
MCGEE, S.L.; FAIRLIE, E.; GARNHAM, A.P.. Hargreaves M. Exercise-induced
histone modifications in human skeletal muscle. J Physiol, v. 587; p.5951–5958.
2009.
MCGRATH, J.E. Social and psychological factors in stress. Illinois: Air Force,
1970.
NEDER, J.A.; NERY, L.E. Fisiologia clínica do exercício: teoria e prática. 1st ed:
São Paulo: Artes Médicas, 2004.
PACÁK, K.; PALKOVITS, M. Stressor specificity of central neuroendocrine
responses: implications for stress-related disorders. Endocr Rev, v. 22, n. 4, p. 502-
48, 2001.
QUIRARTE, G.L., ROOZENDAAL, B., MCGAUGH, J.L. Glucocorticoid enhancement
of memory storage involves noradrenergic activation in the basolateral amygdala.
Proc Natl Acad Sci, v. 94, p. 14048-14053, 1997.
REIS, D.G.; SCOPINHO, A.; GUIMARÃES, F.S. Behavioral and autonomic
responses to acute restraint stress are segregated within the lateral septal area of
rats. PLoS One 2011;6(8):e23171.
RENTHAL, W.; MAZE, I.; KRISHNAN, V. Histone deacetylase 5 epigenetically
controls behavioral adaptations to chronic emotional stimuli. Neuron, v. 56, n. 3, p.
517–529, 2007.
REUL, JM.; DE KLOET, E.R. Two receptor systems for corticosterone in rat brain:
microdistribution and differential occupation. Endocrinology, v. 117, p. 2505–2511,
1985.
41
REYES, T.M.; WALKER, J.R.; DECINO, C. et al. Categorically distinct acute
stressors elicit dissimilar transcriptional profiles in the paraventricular nucleus of the
hypothalamus. J Neurosci, v. 23, p. 5607–5616, 2003.
ROOZENDAAL, B. Stress and memory: opposing effects of glucocorticoids on
memory consolidation and memory retrieval. Neurobiol Learn Mem, v. 78, p. 578–
579, 2002.
Selye H. Stress: a Tensao da Vida. 2nd ed. São Paulo: IBRASA; 1965. p. 380.
Selye H. Stress: a tensão da vida. São Paulo: IBRASA; 1959.
SIEGMUND, K.D.; CONNOR, C.M.; CAMPAN, M. et al. DNA methylation in the
human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves
differentiated neurons. PLoS One, v. 56, número 3, p. e895. 2007.
STANKIEWICZA, A.M.; SWIERGIELB, A.H.;. Epigenetics of stress adaptations in the
brain. Brain Research Bulletin, v. 98, p. 76–92, 2013.
TAN, M.; LUO, H.; LEE, S. Identification of 67 histone marks and histone lysine
crotonylation as a new type of histone modification. Cell, v. 146, n. 6, p. 1016–1028,
2011.
TSANKOVA, N.; RENTHAL, W.; KUMAR, A. et al. Epigenetic regulation in psychiatric
disorders. Nature Rev. Neurosci, v. 8, p. 355–367, 2007.
UCHIDA, S.; HARA, K.; KOBAYASHI, A. et al. Epigenetic status of gdnf in the ventral
striatum determines susceptibility and adaptation to daily stressful events. Neuron, v.
69, p 359–372, 2011.
ULRICH-LAI, Y.; HERMAN, J. Neural regulation of endocrine and autonomic stress
responses. Nat Rev Neurosci, v. 10, n. 6, p. 307–409, 2009.
42
VAN DE KAR, L.D.; BLAIR, M.L. Forebrain pathways mediating stress-induced
hormone secretion. Front Neuroendocrinol, v. 20, n. 1, p. 1-48.
VAYNMAN S.; YING,, Z.; YIN, D.,. Exercise differentially regulates synaptic proteins
associated to the function of BDNF. Brain Res, v. 1070, p. 124-130. 2006.
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ANEXOS
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ANEXO A – Normas de Formatação do Periódico Behavioural Brain Research
DESCRIPTION Behavioural Brain Researchis an international, interdisciplinary journal dedicated to the publication of articles in the field of behavioural neuroscience, broadly defined. Contributions from the entire range of disciplines that comprise the neurosciences, behavioural sciencesor cognitive sciences are appropriate, as long as the goal is to delineate the neural mechanisms underlying behaviour. Thus, studies may range from neurophysiological, neuroanatomical, neurochemical or neuropharmacological analysis of brain-behaviour relations, including the use of molecular genetic or behavioural genetic approaches, to studies that involve the use of brain imaging techniques, to neuroethological studies. Reports of original research, of major methodological advances, or of novel conceptual approaches are all encouraged. The journal will also consider critical reviews on selected topics. Benefits to authors We also provide many author benefits, such as free PDFs, a liberal copyright policy, special discounts on Elsevier publications and much more. Please click here for more information on our author services. Please see our Guide for Authors for information on article submission. If you require any further information or help, please visit our support pages: http://support.elsevier.com AUDIENCE Neuroscientists, Neurophysiologists, Neuropharmacologists, Psychologists, Psychiatrists, Behavioral Scientists and Neurologists. IMPACT FACTOR 2013: 3.391 © Thomson Reuters Journal Citation Reports 2014 ABSTRACTING AND INDEXING Animal Behaviour Abstracts BIOSIS Elsevier BIOBASE Chemical Abstracts Current Contents/Life Sciences MEDLINE® EMBASE PsycINFO Psychological Abstracts Reference Update Scopus EDITORIAL BOARD Editors-in-Chief J.P. Huston, Center for Behavioral Neuroscience, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Universitätsstr.1, 40225, Düsseldorf, Germany, Fax: +49 211 811 2024 S. Maren, Dept. of Psychology, Texas A&M University, Mailstop 4235 College Station, TX 77843-4235, Texas, USA, Fax: (979) 458-7960 Editorial Board J.P. Aggleton, Cardiff University, Cardiff, UK M. Ammassari-Teule, National Research Council of Italy (CNR), Rome, Italy A.K. Braun, Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg, Magdeburg, Germany D. J. Bucci, Dartmouth College, Hanover, New Hampshire, USA
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G. Buszaki, Rutgers University, Newark, New Jersey, USA R.M. Carelli, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, North Carolina, USA R.J. Carey, Veterans Affairs (VA) Medical Center, Syracuse, New York, USA J.C. Crabbe, Veterans Affairs (VA) Medical Center, Portland, Oregon, USA J.N. Crawley, University of California, Davis, Sacramento, California, USA H. Crombag, University of Sussex, Brighton, UK M.A. de Souza Silva, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Dresden, Germany G. Di Chiara, Università di Cagliari, Cagliari, Italy S.B. Dunnett, Cardiff University, Cardiff, UK H. Eichenbaum, Boston University, Boston, Massachusetts, USA R. Jaffard, Institut Universitaire de Technologie, Talence Cedex, France P.W. Kalivas, Medical University of South Carolina (MUSC), Charleston, South Carolina, USA B.E. Kolb, University of Lethbridge, Lethbridge, Alberta, Canada J.E. LeDoux, New York University, New York, New York, USA L. Lenard, University of Pécs (Pécs Tudományegyetem), Pecs, Hungary B. Moghaddam, Yale University School of Medicine, New Haven, Connecticut, USA C.P. Müller, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen, Germany T. Nabeshima, Nagoya University, Nagoya, Japan M.S. Oitzl, Universiteit van Amsterdam, Amsterdam, Netherlands A.D. Phillips, University of British Columbia, Vancouver, British Columbia, Canada B. Poucet, Université de Provence, Marseille, France G.V. Rebec, Indiana University, Bloomington, Indiana, USA G. Riedel, University of Aberdeen, Foresterhill, Scotland, UK T.W. Robbins, University of Cambridge, Cambridge, UK T.E. Robinson, University of Michigan, Ann Arbor, Michigan, USA R.J. Rodgers, University of Leeds, Leeds, UK A.G. Sadile, Seconda Università degli Studi di Napoli, Napoli, Italy J.D. Salamone, University of Connecticut, Storrs, Connecticut, USA T. Schallert, University of Texas at Austin, Austin, Texas, USA W. Schultz, University of Cambridge, Cambridge, UK D. Schulz, Brookhaven National Laboratory, Upton, New York, USA R.K.W. Schwarting, Philipps-Universität Marburg, Gutenberstr 18, Germany R. Spanagel, Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg, Mannheim, Germany D. van der Kooy, Toronto Western Hospital, Toronto, Ontario, Canada M. Watanabe, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science (Rinshoken), Fuchu, Japan I.Q. Whishaw, University of Lethbridge, Lethbridge, Canada L. Xu, Chinese Academy of Sciences (CAS), Yunnan, China GUIDE FOR AUTHORS BEFORE YOU BEGIN Ethics in publishing For information on Ethics in publishing and Ethical guidelines for journal publication see http://www.elsevier.com/publishingethicsand http://www.elsevier.com/journal-authors/ethics. Conflict of interest All authors are requested to disclose any actual or potential conflict of interest including any financial, personal or other relationships with other people or organizations within three years of beginning the submitted work that could inappropriately influence, or be perceived to influence, their work. See also http://www.elsevier.com/conflictsofinterest. Further information and an example of a Conflict of Interest form can be found at: http://help.elsevier.com/app/answers/detail/a_id/286/p/7923. Submission declaration and verification
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Submission of an article implies that the work described has not been published previously (except in the form of an abstract or as part of a published lecture or academic thesis or as an electronic preprint, see http://www.elsevier.com/postingpolicy), that it is not under consideration for publication elsewhere, that its publication is approved by all authors and tacitly or explicitly by the responsible authorities where the work was carried out, and that, if accepted, it will not be published elsewhere in the same form, in English or in any other language, including electronically without the written consent of the copyright-holder. To verify originality, your article may be checked by the originality detection service CrossCheck http://www.elsevier.com/editors/plagdetect. Changes to authorship This policy concerns the addition, deletion, or rearrangement of author names in the authorship of accepted manuscripts: Before the accepted manuscript is published in an online issue: Requests to add or remove an author, or to rearrange the author names, must be sent to the Journal Manager from the corresponding author of the accepted manuscript and must include: (a) the reason the name should be added or removed, or the author names rearranged and (b) written confirmation (e-mail, fax, letter) from all authors that they agree with the addition, removal or rearrangement. In the case of addition or removal of authors, this includes confirmation from the author being added or removed. Requests that are not sent by the corresponding author will be forwarded by the Journal Manager to the corresponding author, who must follow the procedure as described above. Note that: (1) Journal Managers will inform the Journal Editors of any such requests and (2) publication of the accepted manuscript in an online issue is suspended until authorship has been agreed. After the accepted manuscript is published in an online issue: Any requests to add, delete, or rearrange author names in an article published in an online issue will follow the same policies as noted above and result in a corrigendum. Copyright This journal offers authors a choice in publishing their research: Open access and Subscription. For subscription articles Upon acceptance of an article, authors will be asked to complete a 'Journal Publishing Agreement' (for more information on this and copyright, see http://www.elsevier.com/copyright). An e-mail will be sent to the corresponding author confirming receipt of the manuscript together with a 'Journal Publishing Agreement' form or a link to the online version of this agreement. Subscribers may reproduce tables of contents or prepare lists of articles including abstracts for internal circulation within their institutions. Permission of the Publisher is required for resale or distribution outside the institution and for all other derivative works, including compilations and translations (please consult http://www.elsevier.com/permissions). If excerpts from other copyrighted works are included, the author(s) must obtain written permission from the copyright owners and credit the source(s) in the article. Elsevier has preprinted forms for use by authors in these cases: please consult http://www.elsevier.com/permissions. For open access articles Upon acceptance of an article, authors will be asked to complete an 'Exclusive License Agreement' (for more information see http://www.elsevier.com/OAauthoragreement). Permitted reuse of open access articles is determined by the author's choice of user license (see http://www.elsevier.com/openaccesslicenses). Retained author rights As an author you (or your employer or institution) retain certain rights. For more information on author rights for: Subscription articles please see
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http://www.elsevier.com/journal-authors/author-rights-and-responsibilities. Open access articles please see http://www.elsevier.com/OAauthoragreement. Role of the funding source You are requested to identify who provided financial support for the conduct of the research and/or preparation of the article and to briefly describe the role of the sponsor(s), if any, in study design; in the collection, analysis and interpretation of data; in the writing of the report; and in the decision to submit the article for publication. If the funding source(s) had no such involvement then this should be stated. Funding body agreements and policies Elsevier has established agreements and developed policies to allow authors whose articles appear in journals published by Elsevier, to comply with potential manuscript archiving requirements as specified as conditions of their grant awards. To learn more about existing agreements and policies please visit http://www.elsevier.com/fundingbodies. Open access This journal offers authors a choice in publishing their research: Open access • Articles are freely available to both subscribers and the wider public with permitted reuse • An open access publication fee is payable by authors or their research funder Subscription • Articles are made available to subscribers as well as developing countries and patient groups through our access programs (http://www.elsevier.com/access) • No open access publication fee All articles published open access will be immediately and permanently free for everyone to read and download. Permitted reuse is defined by your choice of one of the following Creative Commons user licenses: Creative Commons Attribution (CC BY): lets others distribute and copy the article, to create extracts, abstracts, and other revised versions, adaptations or derivative works of or from an article (such as a translation), to include in a collective work (such as an anthology), to text or data mine the article, even for commercial purposes, as long as they credit the author(s), do not represent the author as endorsing their adaptation of the article, and do not modify the article in such a way as to damage the author's honor or reputation. Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike (CC BY-NC-SA): for noncommercial purposes, lets others distribute and copy the article, to create extracts, abstracts and other revised versions, adaptations or derivative works of or from an article (such as a translation), to include in a collective work (such as an anthology), to text and data mine the article, as long as they credit the author(s), do not represent the author as endorsing their adaptation of the article, do not modify the article in such a way as to damage the author's honor or reputation, and license their new adaptations or creations under identical terms (CC BY-NC-SA). Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs (CC BY-NC-ND): for noncommercial purposes, lets others distribute and copy the article, and to include in a collective work (such as an anthology), as long as they credit the author(s) and provided they do not alter or modify the article. To provide open access, this journal has a publication fee which needs to be met by the authors or their research funders for each article published open access. Your publication choice will have no effect on the peer review process or acceptance of submitted articles. The open access publication fee in this journal is $2200, excluding taxes. Learn more about Elsevier's pricing policy: http://www.elsevier.com/openaccesspricing. Language (usage and editing services)
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Please write your text in good English (American or British usage is accepted, but not a mixture of these). Authors who feel their English language manuscript may require editing to eliminate possible grammatical or spelling errors and to conform to correct scientific English may wish to use the English Language Editing service available from Elsevier's WebShop (http://webshop.elsevier.com/languageediting/) or visit our customer support site (http://support.elsevier.com) for more information. Submission Submission to this journal proceeds totally online and you will be guided stepwise through the creation and uploading of your files. The system automatically converts source files to a single PDF file of the article, which is used in the peer-review process. Please note that even though manuscript source files are converted to PDF files at submission for the review process, these source files are needed for further processing after acceptance. All correspondence, including notification of the Editor's decision and requests for revision, takes place by e-mail removing the need for a paper trail. Submission Address http://ees.elsevier.com/bbr/ PREPARATION Use of word processing software It is important that the file be saved in the native format of the word processor used. The text should be in single-column format. Keep the layout of the text as simple as possible. Most formatting codes will be removed and replaced on processing the article. In particular, do not use the word processor's options to justify text or to hyphenate words. However, do use bold face, italics, subscripts, superscripts etc. When preparing tables, if you are using a table grid, use only one grid for each individual table and not a grid for each row. If no grid is used, use tabs, not spaces, to align columns. The electronic text should be prepared in a way very similar to that of conventional manuscripts (see also the Guide to Publishing with Elsevier: http://www.elsevier.com/guidepublication). Note that source files of figures, tables and text graphics will be required whether or not you embed your figures in the text. See also the section on Electronic artwork. To avoid unnecessary errors you are strongly advised to use the 'spell-check' and 'grammar-check' functions of your word processor. Article structure Length of Article Original Research Articles should not exceed 12,000 words (inclusive of abstract, references, and figure legends). Short communications should not exceed 3500 words (inclusive of abstract, references, and figure legends) and should not be divided into sections. No more than 25 references and four figures or tables should be included. Subdivision - numbered sections Divide your article into clearly defined and numbered sections. Subsections should be numbered 1.1 (then 1.1.1, 1.1.2, ...), 1.2, etc. (the abstract is not included in section numbering). Use this numbering also for internal cross-referencing: do not just refer to 'the text'. Any subsection may be given a brief heading. Each heading should appear on its own separate line. Introduction State the objectives of the work and provide an adequate background, avoiding a detailed literature survey or a summary of the results. Material and methods
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Provide sufficient detail to allow the work to be reproduced. Methods already published should be indicated by a reference: only relevant modifications should be described. Results Results should be clear and concise. Discussion This should explore the significance of the results of the work, not repeat them. A combined Results and Discussion section is often appropriate. Avoid extensive citations and discussion of published literature. Conclusions The main conclusions of the study may be presented in a short Conclusions section, which may stand alone or form a subsection of a Discussion or Results and Discussion section. Appendices If there is more than one appendix, they should be identified as A, B, etc. Formulae and equations in appendices should be given separate numbering: Eq. (A.1), Eq. (A.2), etc.; in a subsequent appendix, Eq. (B.1) and so on. Similarly for tables and figures: Table A.1; Fig. A.1, etc. Essential title page information • Title. Concise and informative. Titles are often used in information-retrieval systems. Avoid abbreviations and formulae where possible. • Author names and affiliations. Where the family name may be ambiguous (e.g., a double name), please indicate this clearly. Present the authors' affiliation addresses (where the actual work was done) below the names. Indicate all affiliations with a lower-case superscript letter immediately after the author's name and in front of the appropriate address. Provide the full postal address of each affiliation, including the country name and, if available, the e-mail address of each author. • Corresponding author. Clearly indicate who will handle correspondence at all stages of refereeingand publication, also post-publication. Ensure that phone numbers (with country and area code) are provided in addition to the e-mail address and the complete postal address. Contact details must be kept up to date by the corresponding author. • Present/permanent address. If an author has moved since the work described in the article was done, or was visiting at the time, a 'Present address' (or 'Permanent address') may be indicated as a footnote to that author's name. The address at which the author actually did the work must be retained as the main, affiliation address. Superscript Arabic numerals are used for such footnotes. Abstract A concise and factual abstract is required. The abstract should state briefly the purpose of the research, the principal results and major conclusions. An abstract is often presented separately from the article, so it must be able to stand alone. For this reason, References should be avoided, but if essential, then cite the author(s) and year(s). Also, non-standard or uncommon abbreviations should be avoided, but if essential they must be defined at their first mention in the abstract itself. The Abstract should not exceed 250 words Graphical abstract Although a graphical abstract is optional, its use is encouraged as it draws more attention to the online article. The graphical abstract should summarize the contents of the article in a concise, pictorial form designed to capture the attention of a wide readership. Graphical abstracts should be submitted as a separate file in the online submission system. Image size: Please provide an image with a minimum of 531 × 1328 pixels (h × w) or proportionally more. The image should be readable at a size of 5 × 13 cm using a regular screen resolution
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of 96 dpi. Preferred file types: TIFF, EPS, PDF or MS Office files. See http://www.elsevier.com/graphicalabstractsfor examples. Authors can make use of Elsevier's Illustration and Enhancement service to ensure the best presentation of their images and in accordance with all technical requirements: Illustration Service. Highlights Highlights are mandatory for this journal. They consist of a short collection of bullet points that convey the core findings of the article and should be submitted in a separate file in the online submission system. Please use 'Highlights' in the file name and include 3 to 5 bullet points (maximum 85 characters, including spaces, per bullet point). See http://www.elsevier.com/highlightsfor examples. Keywords Immediately after the abstract, provide a maximum of 6 keywords, using American spelling and avoiding general and plural terms and multiple concepts (avoid, for example, 'and', 'of'). Be sparing with abbreviations: only abbreviations firmly established in the field may be eligible. These keywords will be used for indexing purposes. Abbreviations Define abbreviations that are not standard in this field in a footnote to be placed on the first page of the article. Such abbreviations that are unavoidable in the abstract must be defined at their first mention there, as well as in the footnote. Ensure consistency of abbreviations throughout the article. Acknowledgements Collate acknowledgements in a separate section at the end of the article before the references and do not, therefore, include them on the title page, as a footnote to the title or otherwise. List here those individuals who provided help during the research (e.g., providing language help, writing assistance or proof reading the article, etc.). Database linking Elsevier encourages authors to connect articles with external databases, giving their readers oneclick access to relevant databases that help to build a better understanding of the described research. Please refer to relevant database identifiers using the following format in your article: Database: xxxx (e.g., TAIR: AT1G01020; CCDC: 734053; PDB: 1XFN). See http://www.elsevier.com/databaselinking for more information and a full list of supported databases. Footnotes Footnotes should be used sparingly. Number them consecutively throughout the article, using superscript Arabic numbers. Many wordprocessors build footnotes into the text, and this feature may be used. Should this not be the case, indicate the position of footnotes in the text and present the footnotes themselves separately at the end of the article. Do not include footnotes in the Reference list. Table footnotes Indicate each footnote in a table with a superscript lowercase letter. Artwork Electronic artwork General points • Make sure you use uniform lettering and sizing of your original artwork. • Embed the used fonts if the application provides that option. • Aim to use the following fonts in your illustrations: Arial, Courier, Times New Roman, Symbol, or use fonts that look similar. • Number the illustrations according to their sequence in the text. • Use a logical naming convention for your artwork files.
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• Provide captions to illustrations separately. • Size the illustrations close to the desired dimensions of the printed version. • Submit each illustration as a separate file. A detailed guide on electronic artwork is available on our website: http://www.elsevier.com/artworkinstructions You are urged to visit this site; some excerpts from the detailed information are given here. Formats If your electronic artwork is created in a Microsoft Office application (Word, PowerPoint, Excel) then please supply 'as is' in the native document format. Regardless of the application used other than Microsoft Office, when your electronic artwork is finalized, please 'Save as' or convert the images to one of the following formats (note the resolution requirements for line drawings, halftones, and line/halftone combinations given below): EPS (or PDF): Vector drawings, embed all used fonts. TIFF (or JPEG): Color or grayscale photographs (halftones), keep to a minimum of 300 dpi. TIFF (or JPEG): Bitmapped (pure black & white pixels) line drawings, keep to a minimum of 1000 dpi. TIFF (or JPEG): Combinations bitmapped line/half-tone (color or grayscale), keep to a minimum of 500 dpi. Please do not: • Supply files that are optimized for screen use (e.g., GIF, BMP, PICT, WPG); these typically have a low number of pixels and limited set of colors; • Supply files that are too low in resolution; • Submit graphics that are disproportionately large for the content. Color artwork Please make sure that artwork files are in an acceptable format (TIFF (or JPEG), EPS (or PDF), or MS Office files) and with the correct resolution. If, together with your accepted article, you submit usable color figures then Elsevier will ensure, at no additional charge, that these figures will appear in color on the Web (e.g., ScienceDirect and other sites) regardless of whether or not these illustrations are reproduced in color in the printed version. For color reproduction in print, you will receive information regarding the costs from Elsevier after receipt of your accepted article. Please indicate your preference for color: in print or on the Web only. For further information on the preparation of electronic artwork, please see http://www.elsevier.com/artworkinstructions. Please note: Because of technical complications that can arise by converting color figures to 'gray scale' (for the printed version should you not opt for color in print) please submit in addition usable black and white versions of all the color illustrations. Figure captions Ensure that each illustration has a caption. Supply captions separately, not attached to the figure. A caption should comprise a brief title (noton the figure itself) and a description of the illustration. Keep text in the illustrations themselves to a minimum but explain all symbols and abbreviations used. Tables Number tables consecutively in accordance with their appearance in the text. Place footnotes to tables below the table body and indicate them with superscript lowercase letters. Avoid vertical rules. Be sparing in the use of tables and ensure that the data presented in tables do not duplicate results described elsewhere in the article. References Citation in text Please ensure that every reference cited in the text is also present in the reference list (and vice versa). Any references cited in the abstract must be given in full. Unpublished results and personal communications are not recommended in the reference list, but may be mentioned in the text. If these references are included in the reference list they should follow the standard reference style of the journal and should include a substitution of the publication
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date with either 'Unpublished results' or 'Personal communication'. Citation of a reference as 'in press' implies that the item has been accepted for publication. Reference links Increased discoverability of research and high quality peer review are ensured by online links to the sources cited. In order to allow us to create links to abstracting and indexing services, such as Scopus, CrossRef and PubMed, please ensure that data provided in the references are correct. Please note that incorrect surnames, journal/book titles, publication year and pagination may prevent link creation. When copying references, please be careful as they may already contain errors. Use of the DOI is encouraged. Web references As a minimum, the full URL should be given and the date when the reference was last accessed. Any further information, if known (DOI, author names, dates, reference to a source publication, etc.), should also be given. Web references can be listed separately (e.g., after the reference list) under a different heading if desired, or can be included in the reference list. References in a special issue Please ensure that the words 'this issue' are added to any references in the list (and any citations in the text) to other articles in the same Special Issue. Reference management software This journal has standard templates available in key reference management packages EndNote (http://www.endnote.com/support/enstyles.asp) and Reference Manager (http://refman.com/support/rmstyles.asp). Using plug-ins to wordprocessing packages, authors only need to select the appropriate journal template when preparing their article and the list of references and citations to these will be formatted according to the journal style which is described below. Reference formatting There are no strict requirements on reference formatting at submission. References can be in any style or format as long as the style is consistent. Where applicable, author(s) name(s), journal title/book title, chapter title/article title, year of publication, volume number/book chapter and the pagination must be present. Use of DOI is highly encouraged. The reference style used by the journal will be applied to the accepted article by Elsevier at the proof stage. Note that missing data will be highlighted at proof stage for the author to correct. If you do wish to format the references yourself they should be arranged according to the following examples: Reference style Text: Indicate references by number(s) in square brackets in line with the text. The actual authors can be referred to, but the reference number(s) must always be given. List: Number the references (numbers in square brackets) in the list in the order in which they appear in the text. Examples: Reference to a journal publication: [1] Van der Geer J, Hanraads JAJ, Lupton RA. The art of writing a scientific article. J Sci Commun 2010;163:51–9. Reference to a book: [2] Strunk Jr W, White EB. The elements of style. 4th ed. New York: Longman; 2000. Reference to a chapter in an edited book: [3] Mettam GR, Adams LB. How to prepare an electronic version of your article. In: Jones BS, Smith RZ, editors. Introduction to the electronic age, New York: E-Publishing Inc; 2009, p. 281–304.
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Note shortened form for last page number. e.g., 51–9, and that for more than 6 authors the first 6 should be listed followed by 'et al.' For further details you are referred to 'Uniform Requirements for Manuscripts submitted to Biomedical Journals' (J Am Med Assoc 1997;277:927–34) (see also http://www.nlm.nih.gov/bsd/uniform_requirements.html). Video data Elsevier accepts video material and animation sequences to support and enhance your scientific research. Authors who have video or animation files that they wish to submit with their article are strongly encouraged to include links to these within the body of the article. This can be done in the same way as a figure or table by referring to the video or animation content and noting in the body text where it should be placed. All submitted files should be properly labeled so that they directly relate to the video file's content. In order to ensure that your video or animation material is directly usable, please provide the files in one of our recommended file formats with a preferred maximum size of 50 MB. Video and animation files supplied will be published online in the electronic version of your article in Elsevier Web products, including ScienceDirect: http://www.sciencedirect.com. Please supply 'stills' with your files: you can choose any frame from the video or animation or make a separate image. These will be used instead of standard icons and will personalize the link to your video data. For more detailed instructions please visit our video instruction pages at http://www.elsevier.com/artworkinstructions. Note: since video and animation cannot be embedded in the print version of the journal, please provide text for both the electronic and the print version for the portions of the article that refer to this content. AudioSlides The journal encourages authors to create an AudioSlides presentation with their published article. AudioSlides are brief, webinar-style presentations that are shown next to the online article on ScienceDirect. This gives authors the opportunity to summarize their research in their own words and to help readers understand what the paper is about. More information and examples are available at http://www.elsevier.com/audioslides. Authors of this journal will automatically receive an invitation e-mail to create an AudioSlides presentation after acceptance of their paper. Supplementary data Elsevier accepts electronic supplementary material to support and enhance your scientific research. Supplementary files offer the author additional possibilities to publish supporting applications, highresolution images, background datasets, sound clips and more. Supplementary files supplied will be published online alongside the electronic version of your article in Elsevier Web products, including ScienceDirect: http://www.sciencedirect.com. In order to ensure that your submitted material is directly usable, please provide the data in one of our recommended file formats. Authors should submit the material in electronic format together with the article and supply a concise and descriptive caption for each file. For more detailed instructions please visit our artwork instruction pages at http://www.elsevier.com/artworkinstructions. 3D neuroimaging You can enrich your online articles by providing 3D neuroimaging data in NIfTI format. This will be visualized for readers using the interactive viewer embedded within your article, and will enable them to: browse through available neuroimaging datasets; zoom, rotate and pan the 3D brain reconstruction; cut through the volume; change opacity and color mapping; switch between 3D and 2D projected views; and download the data. The viewer supports both single (.nii) and dual (.hdr and .img) NIfTI file formats. Recommended size of a single uncompressed dataset is 100 MB or less. Multiple datasets can be submitted. Each dataset will have to be zipped and uploaded to the online submission system via the '3D neuroimaging data' submission category. Please provide a short informative description for each dataset by filling in the 'Description' field when uploading a dataset.
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Note: all datasets will be available for downloading from the online article on ScienceDirect. If you have concerns about your data being downloadable, please provide a video instead. For more information see: http://www.elsevier.com/3DNeuroimaging. Submission checklist The following list will be useful during the final checking of an article prior to sending it to the journal for review. Please consult this Guide for Authors for further details of any item. Ensure that the following items are present: One author has been designated as the corresponding author with contact details: • E-mail address • Full postal address • Phone numbers All necessary files have been uploaded, and contain: • Keywords • All figure captions • All tables (including title, description, footnotes) Further considerations • Manuscript has been 'spell-checked' and 'grammar-checked' • References are in the correct format for this journal • All references mentioned in the Reference list are cited in the text, and vice versa • Permission has been obtained for use of copyrighted material from other sources (including the Web) • Color figures are clearly marked as being intended for color reproduction on the Web (free of charge) and in print, or to be reproduced in color on the Web (free of charge) and in black-and-white in print • If only color on the Web is required, black-and-white versions of the figures are also supplied for printing purposes For any further information please visit our customer support site at http://support.elsevier.com. AFTER ACCEPTANCE Use of the Digital Object Identifier The Digital Object Identifier (DOI) may be used to cite and link to electronic documents. The DOI consists of a unique alpha-numeric character string which is assigned to a document by the publisher upon the initial electronic publication. The assigned DOI never changes. Therefore, it is an ideal medium for citing a document, particularly 'Articles in press' because they have not yet received their full bibliographic information. Example of a correctly given DOI (in URL format; here an article in the journal Physics Letters B): http://dx.doi.org/10.1016/j.physletb.2010.09.059 When you use a DOI to create links to documents on the web, the DOIs are guaranteed never to change. Online proof correction Corresponding authors will receive an e-mail with a link to our online proofing system, allowing annotation and correction of proofs online. The environment is similar to MS Word: in addition to editing text, you can also comment on figures/tables and answer questions from the Copy Editor. Web-based proofing provides a faster and less error-prone process by allowing you to directly type your corrections, eliminating the potential introduction of errors. If preferred, you can still choose to annotate and upload your edits on the PDF version. All instructions for proofing will be given in the e-mail we send to authors, including alternative methods to the online version and PDF. We will do everything possible to get your article published quickly and accurately - please upload all of your corrections within 48 hours. It is important to ensure that all corrections are sent back to us in one communication. Please check carefully before replying, as inclusion of any subsequent corrections cannot be
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guaranteed. Proofreading is solely your responsibility. Note that Elsevier may proceed with the publication of your article if no response is received. Offprints The corresponding author, at no cost, will be provided with a personalized link providing 50 days free access to the final published version of the article on ScienceDirect. This link can also be used for sharing via email and social networks. For an extra charge, paper offprints can be ordered via the offprint order form which is sent once the article is accepted for publication. Both corresponding and co-authors may order offprints at any time via Elsevier's WebShop (http://webshop.elsevier.com/myarticleservices/offprints). Authors requiring printed copies of multiple articles may use Elsevier WebShop's 'Create Your Own Book' service to collate multiple articles within a single cover (http://webshop.elsevier.com/myarticleservices/booklets). AUTHOR INQUIRIES You can track your submitted article at http://help.elsevier.com/app/answers/detail/a_id/89/p/8045/. You can track your accepted article at http://www.elsevier.com/trackarticle. You are also welcome to contact Customer Support via http://support.elsevier.com
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ANEXO B – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa em Animais
