Enzimas Cap 06 - Sa Pereira P

IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS ESUA ESTABILIZAÇÃO

Heizir Ferreira de Castro, Gisella Maria Zanin,

Flávio Faria de Moraes, Paula Sá-Pereira

SUMÁRIOAs vantagens das enzimas imobilizadas, em relação às solúveis, surgem de sua maior esta-bilidade e facilidade de separação do meio de reação, o que acarreta economia significati-va no custo global do processo, desde que o procedimento de imobilização não seja mui-to dispendioso, haja boa recuperação da atividade enzimática e que a meia-vida operacio-nal da enzima imobilizada seja suficientemente longa. Os métodos de imobilização vari-am da simples ligação por adsorção física em suportes diversos até a encapsulação em ma-trizes de sol-gel e granulação. Durante o uso das enzimas imobilizadas, efeitos de transfe-rência de massa podem ocasionar gradientes adversos de substratos ou de pH, que po-dem reduzir a velocidade de reação e o rendimento em produto. Impurezas presentes nomeio podem ocluir a enzima imobilizada e também reduzir a velocidade de reação e orendimento em produto. A perda de atividade biocatalítica durante o processo de imobi-lização deve ser reduzida para compensar o custo extra da imobilização, o suporte porosodeve ser apropriado para facilitar a transferência de reagentes e produtos, e a purificaçãoexaustiva da solução de substrato deve ocorrer para obter-se uma longa vida operacional.

Este capítulo conceitua inicialmente os diversos termos relacionados com a técnicade imobilização, fornece uma classificação dos métodos e destaca ainda as vantagens e li-mitações do uso de enzimas. Na seqüência, apresenta os métodos de imobilização de en-zimas, correlacionando-os com os tipos de suportes mais comumente utilizados. Aborda ainteração enzima-suporte com base nos fatores que interferem no comportamento da en-zima imobilizada;. discute a aplicação de enzimas imobilizadas em meio orgânico, bemcomo, a influência de aditivos como agentes estabilizantes da atividade catalítica da enzi-ma imobilizada, e, finalmente, enfoca o tema das aplicações das enzimas imobilizadas.

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IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS – UMA PERSPECTIVA HISTÓRICAA imobilização de enzimas começou a ser estudada no início do século passado, ao seobservar que o carvão ativo, ao qual havia sido adicionada uma preparação biológicacom atividade invertásica, mantinha a capacidade de hidrolisar sacarose mesmo apósser lavado (NELSON e GRIFFIN, 1916). Após esta observação inicial da imobilização deenzimas em suportes insolúveis, o assunto só foi novamente retomado após a SegundaGuerra Mundial. Em 1948, o bioquímico americano James Batcheller Sumner(1887-1955), ganhador do Prêmio Nobel de Química, em 1946, pelo isolamento e cris-talização da enzima urease e pela identificação da sua natureza protéica, reportou suaimobilização. Na continuação dos estudos, pesquisadores alemães, em 1954, demons-traram que polímeros sintéticos, resinas diazotadas de poliaminoestireno, poderiamser usados para imobilizar proteínas com atividade biológica. Eles usaram as enzimaspepsina, diastase, ribonuclease e carboxipeptidase (CHIBATA, 1978).

Outros trabalhos subseqüentes incluíram a imobilização da catalase por ligação iô-nica em DEAE-celulose, da tripsina, da papaína, da amilase e da ribonuclease em gel depoliacrilamida, e a demonstração do método de ligações cruzadas, utilizando-se carbo-xipeptidase com glutaraldeído. A microencapsulação da carbono-anidrase foi descritaem 1964 e a preparação de lipossomas contendo glicoamilase em 1971, sendo que estasduas últimas preparações foram usadas com fins terapêuticos. A partir de 1960, houveum aumento significativo no número de publicações sobre imobilização de enzimas,tendo em vista as potenciais vantagens econômicas e operacionais que a técnica oferecepara a tecnologia enzimática. Estes esforços resultaram no desenvolvimento, em 1969,por Chibata e colaboradores da companhia japonesa Tanabe Seiyaku Co., de um pro-cesso para a produção de L-aminoácidos, a partir de misturas racêmicas, usando L-ami-noacilase imobilizada em DEAE-Sephadex. Quase simultaneamente foi colocado emoperação, nos EUA, o processo de produção de xaropes de frutose a partir de amido demilho, utilizando glicose-isomerase imobilizada (CHIBATA, 1978).

Até os meados da década de 1960, a maior parte dos trabalhos com enzimas imobi-lizadas era realizada por pesquisadores de áreas básicas, que perceberam que estes siste-mas poderiam ser utilizados como catalisadores industriais altamente específicos e efici-entes. Neste período, passou-se também a buscar suportes com boa resistência químicae mecânica, de modo a prolongar o uso do biocatalisador. Foram estudados métodosdiferentes de imobilização (combinação de métodos), e observou-se que as proprieda-des catalíticas de uma mesma enzima poderiam ser alteradas em função do método deimobilização utilizado e do suporte empregado. E finalmente, tiveram início os estudosda aplicação de enzimas imobilizadas em biorreatores contínuos (leito fixo e reatoresagitados). Isto marca o inicio da contribuição dos engenheiros químicos para o projetode biorreatores (VIETH, 1994).

A importância de processos industriais com enzimas imobilizadas motivou a orga-nização, em 1971, da primeira Conferência em Engenharia Enzimática, realizada emHenniker. Nela estabeleceu-se o uso do termo enzima imobilizada, empregado por Kat-chalski–Katzir, para os biocatalisadores ligados a suportes insolúveis ou confinados a es-

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paços físicos definidos, em contraposição ao uso de enzimas “fixadas” ou “insolubiliza-das” ou “ligadas em matrizes”. Em 1985, houve um outro avanço significativo com o de-senvolvimento em escala industrial de um processo em reator de membrana para a pro-dução de aminoácidos a partir de cetoácidos, com duas enzimas imobilizadas e envol-vendo a regeneração do co-fator. O processo, que foi desenvolvido por pesquisadoresda Wandrey e Kula, na Alemanha, foi empregado em escala industrial naquele país pelacompanhia Degussa (HARTMEIER, 1988).

O advento das enzimas imobilizadas abriu novos e promissores campos de atuação.Como exemplos, os eletrodos enzimáticos que proporcionam um número muito maiorde análises em curtos espaços de tempo, característica esta muito valiosa para a moder-na industria biotecnológica, e a reutilização da enzima por tempos prolongados deprocesso, implicando numa grande redução de custos.

ENZIMAS IMOBILIZADAS

As enzimas têm, intrinsecamente, excelentes propriedades como a atividade, a seletivi-dade e a especificidade. Estas características permitem o desenho de processos de sínte-se de produtos muito complexos em condições ecossustentadas. Mas apesar do elevadopotencial de aplicação das enzimas, devido à pressão dos consumidores, elas têm de serotimizadas, de modo a cumprirem suas funções biológicas com eficácia e eficiência. Acatálise de reações em processos metabólicos complexos pode ser regulada em váriosníveis. E assim, algumas delas passam a ter as características adequadas para seremintegradas em processos industriais.

Enzimas na sua forma nativa (enzimas livres) têm sido usadas por séculos na indús-tria de alimentos e mais recentemente nas indústrias farmacêuticas e químicas. Sua es-trutura e modo de ação vêm sendo gradativamente elucidados por métodos experi-mentais bem estabelecidos, como as técnicas clássicas de raios X e avançadas de resso-nância magnética nuclear (RMN). Modernas metodologias de engenharia genéticapossibilitaram a produção de enzimas em grande escala ou a modificação de sua estru-tura primária, alterando, portanto algumas de suas características físico-químicas e bio-lógicas (MA et alii, 2003). De igual significância são as recentes técnicas de evolução di-recionada, que permitem, via modificação do DNA, a preparação de enzimas especial-mente dirigidas para uma determinada finalidade, isto é, enzimas que atuam em valoresextremos de pH e temperatura, bem como em presença de meios não convencionais(solventes orgânicos, fase gasosa, CO2 supercrítico) (POWELL et alii, 2001).

O valor de venda de enzimas para o uso em indústrias de alimentos, detergentes eespecialidades químicas, que perfazia um total de aproximadamente US$ 700 milhõesem 1992 (KATCHALSKI-KATZIR e KRAEMER, 2000), aumentou para US$ 2 bilhõesem 2004 (RAJAN, 2004). De acordo com as projeções, o crescimento no mercado de en-zimas é de aproximadamente 4-5% ao ano, acompanhado pela redução de preço, de-corrente do grande número de empresas que comercializam enzimas com preços maiscompetitivos (RAJAN, 2004).

CAPÍTULO 6 � IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMAS E SUA ESTABILIZAÇÃO 125

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De particular interesse é o aumento do uso de enzimas imobilizadas, fisicamenteconfinadas ou localizadas numa certa região do espaço com retenção de sua atividadecatalítica, podendo ser usada repetidamente e continuamente (WINGARD JR., 1972).Nesta técnica, a enzima fica retida no interior (poros) ou na superfície de um materialque é utilizado como suporte. O complexo enzima–suporte mantém as característicasfísicas do suporte e, ao mesmo tempo, retém a atividade biológica da enzima na formasolúvel. O termo “enzima imobilizada” inclui:

1. A modificação das enzimas de forma a torná-las insolúveis em água.

2. A utilização de enzimas na forma solúvel em reatores equipados com membra-nas de ultrafiltração, que permitem o escoamento dos produtos da reação, masretêm a enzima no interior do reator.

3. A restrição da mobilidade da enzima pela ligação a outra molécula, que torna osistema insolúvel no meio de reação (ZANIN e MORAES, 2004). O sistema imo-bilizado permite a condução de reações em reatores contínuos, com fácil sepa-ração de catalisador–produto, e o aumento da produtividade do processo(massa de substrato/massa de biocatalisador).

Classificação das Enzimas ImobilizadasNa literatura especializada encontram-se diversas formas de classificação dos biocatali-sadores imobilizados, todos em concordância com a definição apresentada. Zaborski(1973, 1976) propôs uma classificação que leva em consideração – o tipo de interaçãoresponsável pela imobilização - , que pode ser conseguida por meios químicos (com for-mação de, no mínimo, uma ligação covalente entre os resíduos terminais de uma enzi-ma e um grupo funcional do suporte, ou entre duas ou mais moléculas de enzima) oupor meios físicos, que não envolvem ligações químicas, porém somente forças físicas(adsorção, interações eletrostáticas e outras) como também, a encapsulação ou micro-encapsulação em matrizes poliméricas; – a natureza dos suportes – que podem ser poro-sos ou não-porosos, orgânicos ou inorgânicos (VIETH, 1994; ZANIN e MORAES,2004). Do ponto de vista prático, o método de classificação não altera o sistema obtido,uma vez que as técnicas mais utilizadas para a preparação dos biocatalisadores deaplicação comercial envolvem uma combinação de métodos básicos.

A classificação dos métodos de imobilização de enzimas, mais aceita na literatura,foi proposta por Kennedy e Roig (1995), que considera a combinação da natureza dainteração responsável pela imobilização e o tipo de suporte utilizado. Assim:

a) Ligação em suportes – modificação da enzima, por meio de técnicas apropria-das, para torná-las imóveis no meio de reação () e cross-linking- ligação cruzadaintermolecular ou reticulação.

b) Enzimas solúveis sem derivatização- enzimas solúveis, utilizadas em reatoresequipados com membranas semipermeáveis de ultrafiltração e fibras ocas queretêm a enzima no interior do reator.


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c) Enzimas solúveis com derivatização- enzimas cuja mobilidade foi restringidapela ligação com outra macromolécula, porém permanecendo o complexosolúvel em água.

Outra forma sugerida na literatura para classificar as enzimas imobilizadas leva emconsideração a necessidade da presença, ou não, de co-fatores para a melhor atuaçãoda enzima. De um modo geral, as enzimas que não requerem co-fatores, ou aquelas cu-jos co-fatores estão ligados como um grupo prostético à apoenzima, são fáceis de imobi-lizar. Por outro lado, o processo de imobilização torna-se complexo, se a coenzima deveser regenerada pela ação de uma segunda enzima, ou nos sistemas multienzimáticosque requerem a dissociação da coenzima. Portanto, de acordo com a complexidade daimobilização, pode-se ter os seguintes grupos:

I) Enzima sem co-fator.

II) Enzima com grupo prostético.

III) Enzima com dissociação de coenzima.

IV) Sistema multienzimático com dissociação de coenzima.

De maneira global, pode-se afirmar que os processos de imobilização desenvolvi-dos e descritos na literatura, até aproximadamente 1980, são todos pertencentes aosgrupos (I) e (II), isto é, de primeira geração. A partir desse período, a ênfase maior temsido para os sistemas de segunda geração, ou seja, sistemas multienzimáticos comcoenzimas e regeneração de co-fatores (HARTMEIER, 1988).

Métodos de imobilização de enzimas

O objetivo deste tópico é apresentar, em linhas gerais, uma introdução às principais téc-nicas disponíveis para a preparação de enzimas imobilizadas. Para mais detalhes, reco-menda-se a consulta de literatura especializada.

Existem basicamente duas formas de reter uma enzima no interior dos biorreato-res: a imobilização de enzima no interior de um suporte (encapsulação e retenção pormeio de membranas); e, a imobilização na superfície de um suporte (ligação covalentee não-covalente). Estes métodos são bem revisados e discutidos na literatura(MESSING, 1975; MOSBACH, 1976; TREVAN, 1980; ROSEVEAR et alii, 1987;HARTMEIER, 1988; GEMEINER, 1992; ZANIN e MORAES, 2004). Para os vários méto-dos disponíveis no que respeita à estabilização de enzimas imobilizadas, duas vertentestêm de ser consideradas, a estabilidade no armazenamento e a estabilidade operacio-nal. A estabilidade no armazenamento, ou tempo de meia-vida, refere-se à capacidadede uma enzima manter a sua capacidade catalítica durante o período entre a produçãoe o seu uso. A estabilidade operacional descreve a manutenção da atividade catalítica daenzima durante a reação. A estabilidade operacional pode ser ainda avaliada na ausên-cia ou presença do substrato (LEMOS et alii, 2001; SÁ-PEREIRA et alii, 2003, 2004;CHANIOTAKIS, 2004).


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Suportes para a imobilização de enzimasAs propriedades das preparações de enzimas imobilizadas são influenciadas pelas pro-priedades da enzima e do material do suporte (TISCHER e KASCHE, 1999). A intera-ção entre esses dois componentes proporciona um derivado imobilizado com proprie-dades químicas, bioquímicas, mecânicas e cinéticas específicas (figura 6.1).

Dentre os vários parâmetros que devem ser considerados os mais importantes sãoapresentados na tabela 6.1, os quais incluem pH, temperatura, força iônica, pressão,agitação, liberação de co-fatores e do substrato com a remoção dos produtos. Estes fato-res influem no desempenho do suporte, na conformação da enzima, na velocidade detransferência de massa e de reação intrínseca, e, portanto, afetam o comportamento daenzima imobilizada.


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Figura 6.1 Interação entre suporte e enzima.

DesempenhoConsumo de enzima (U/kg de produto)

Produtividade (kg produto/U)

Métodosde imobilização

Efeitos detrasferênciade massa

Estabilidadeoperacional

Tipo de reaçãoe Cinética

PropriedadesMecânicas

PropriedadesBioquímicas

PropriedadesBioquímicas

Enzima Suporte

Tabela 6.1 Fatores que influenciam o desempenho de um sistema de enzima imobilizada

Enzima Propriedades Bioquímicas: Massa molecular, grupos funcionais dasuperfície protéica, pureza (funções de inativação ou proteção dasimpurezas)

Parâmetros Cinéticos: Atividade específica, perfil de pH e temperatura,parâmetros cinéticos para a ativação e inibição, estabilidade térmica, pH,solventes, contaminantes e impurezas

Suporte Características Químicas: Composição e base química, gruposfuncionais, estabilidade química, contribuições da superfície do suporte,tais como: os micro-efeitos (pH, carga da superfície, natureza hidrofóbica ehidrofílica, efeito redutor e a presença de íons metálicos)

Características Mecânicas: Diâmetro do poro, comportamento decompressão, tamanho da partícula; área superficial; volume acessível damatriz, resistência à compactação em operações em altas vazões parareatores de leito fixo; abrasão para reatores agitados e velocidade desedimentação para leitos fluidizados.

Características Morfológicas: Suportes não-porosos (baixa áreasuperficial), porosos (grande área superficial), estrutura de gel

Enzima Imobilizada Método de Imobilização: Fixação de proteína, eficiência da enzima ativa,parâmetros cinéticos intrínsecos

Efeitos de transferência de massa: Partição (diferente concentração dosoluto dentro e fora das partículas do catalisador), difusão interna (poros) eexterna

Estabilidade: operacional (expressa em tempo de meia-vida sobcondições operacionais), estabilidade de estocagem

Desempenho: Produtividade (produto formado por unidade de atividadeou massa de enzima), consumo de enzima (e.g. unidades por kg deproduto)

Fonte: Tischer e Kasche (1999).

De todos os fatores anteriormente citados, com exceção da enzima, a maior contri-buição para o bom desempenho da enzima imobilizada é dada pelo suporte. Se, de umlado um suporte criteriosamente selecionado pode aumentar o tempo de meia-vida daenzima imobilizada, de outro uma escolha errada pode afetar adversamente não só otempo de meia-vida, mas o desempenho global do sistema. Na seleção de um suportepara uma determinada aplicação, devem ser analisadas suas propriedades físicas e quí-micas, bem como as relativas à possibilidade de regeneração do material.

� Características morfológicas: para possibilitar a imobilização de quantidades signifi-cativas de enzima, o suporte deve possuir uma área superficial superior a 10 m2.g-1, oque equivale a se ter alta porosidade e poros de pequeno diâmetro. Naturalmente, odiâmetro dos poros deve permitir o fácil acesso da enzima e do substrato.


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� Características químicas: os suportes devem possuir grupos químicos que po-dem ser ativados ou modificados de modo a permitir a ligação da enzima em con-dições que não a desnaturem.

�Natureza hidrofílica: nos critérios de seleção do suporte de imobilização, deveser levada em conta a sua afinidade pela água, porque a água do meio se particio-na entre a matriz de imobilização, a enzima e o meio de reação, afetando o seumicroambiente. São desejáveis suportes com características hidrofílicas de modoa se obter uma boa difusividade do substrato, além de permitir a estabilização daenzima. Suportes hidrofóbicos diminuem a estabilidade e a atividade da enzimaimobilizada por um mecanismo semelhante à desnaturação das enzimas em sol-ventes orgânicos.

� Insolubilidade: esta característica é essencial, não somente para prevenir a libe-ração da enzima do suporte, mas principalmente para evitar a contaminação doproduto, pelo suporte dissolvido e pela enzima. Em alguns casos, principalmen-te quando o produto desejado é um alimento ou um fármaco, há a necessidadede estabilização da superfície do suporte, de modo a se evitar a liberação de íonstóxicos ou a formação de particulados finos. Estas situações são encontradasquando se utilizam pós de metais magnéticos ou sílica de porosidade controlada.Os pós liberam íons tóxicos e, portanto, devem ser recobertos com albumina. Asílica de porosidade controlada, por sua vez, se dissolve lentamente com o usoprolongado e o recobrimento da superfície com zircônia é recomendável demodo a estabilizar a superfície antes da derivatização (MESSING, 1978).

� Estabilização química, mecânica e térmica: já existem várias estratégias de estabili-zação enzimática, tais como a interação seletiva não covalente com polieletrólitos,baseadas em cargas de superfície (entrapment): uso de sais, polieletrólitos ou es-paços confinados, cujas características físicas e químicas podem ser controladas di-retamente na reação de catálise. Este controle baseia-se em múltiplas interações iô-nicas ou armadilhas físicas e na imobilização covalente de enzimas a outras proteí-nas ou superfícies sólidas, através de formação de ligações covalentes (intra e in-ter-enzimáticas), polimerização enzimática, ligação covalente com outras proteí-nas, imobilização em superfícies sólidas, estabilização da nanoconcavidade enzi-mática usando a mutagênese dirigida com alterações em locais específicos, au-mento da lipofilia do centro activo e/ou remoção de grupos reativos.

O suporte deve ser quimicamente resistente nas condições de ativação, durante oprocesso de imobilização e nas condições em que se processa a reação. A resistência me-cânica deve permitir o uso de filtração, centrifugação e agitação, pois o processo de imo-bilização e o uso repetido e contínuo, algumas vezes, requerem o emprego dessas ope-rações. A estabilidade térmica é outra característica importante. Suportes com grandecoeficiente de expansão podem sofrer distorção ou destruir o sítio ativo da enzima sobexpansão ou contração, quando submetido a variações de temperatura. Estas situaçõespodem ocorrer quando se utiliza a imobilização em várias temperaturas, ou quando a


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enzima imobilizada é levada da situação de estocagem (normalmente em baixastemperaturas) diretamente às condições operacionais, ou vice versa.

� Estabilidade ao escoamento: partículas esféricas, rígidas e de tamanho unifor-me, normalmente, são mais apropriadas para a utilização em reatores contínuos,por produzirem pequenas variações de pressão e possuírem boas característicasde escoamento do fluido intersticial. Uma estrutura rígida de poros (matriz rígi-da) protege a enzima de situações de escoamento turbulento.

� Resistência ao ataque microbiológico: o suporte deve ser resistente à degrada-ção por microrganismos, de modo a evitar a liberação da enzima para a solução.

� Regenerabilidade: as leis ambientais sobre a poluição e o esgotamento das reservasnaturais tornaram a regeneração e o reciclo necessidades prementes nos processosem larga escala.Por isto, tanto a possibilidade de regeneração como a reutilização damatrizdevemserconsideradasnaavaliaçãoeconômicadosistemacomenzimaimobi-lizada.Quantoàcomposiçãoquímicaossuportes sãoclassificadosemorgânicos(natu-raise sintéticos)e inorgânicos(mineraise fabricados).Comoexemplodesuportesor-gânicos naturais podem ser citados os polissacarídeos (celulose, ágar, quitina, quitosa-na, amido, entre outros) e as proteínas (colágeno, albumina, gelatina, glúten, seda,entre outras). Dentre os sintéticos encontram-se o poliestireno, os poliacrilatos, os po-livinílicos, o nailon, entre outros.Os suportes inorgânicos minerais mais utilizados são:areia, bentonita, horneblenda e pedra-pomes. Dentre os fabricados pode-se citar: vi-dro, cerâmicae sílicade porosidade controlada, aluminossilicatos, óxido de ferro, óxi-do de níquel, aços inoxidáveis, entre outros. Os suportes mais amplamente estudadose utilizados são os derivados de polissacarídeos, especialmente os extraídos de algas,como: agarose, alginato e K-carragenina. A celulose e seus derivados têm boas propri-edadesparaa imobilizaçãodeenzimas.Outrosuportequeapresentaboascaracterísti-cas para a imobilização de enzimas é o carvão ativo, que pode ser obtido pela desidra-tação e carbonização, seguida de ativação, de materiais como casca de coco, madeira,carvão, coque, ossos animais e lignina (MESSING, 1978).

Um suporte que tem merecido a atenção dos pesquisadores é a sílica xerogel obti-da pela técnica sol-gel, que envolve a hidrólise e condensação de Si(OR)2 em presençade um trialcoxissilano (PIERRE, 2004; KANDIMALLA et alii, 2006). Na funcionalizaçãoobtém-se um material do tipo xSiO2.SiO3/2 – (CH2)n-L, onde é possível controlar a den-sidade do ligante (L) ancorado à superfície da sílica. Essa técnica tem sido utilizada,principalmente, para a imobilização da enzima lipase por apresentar boa retenção deatividade (REETZ et alii, 1996; SOARES et alii, 2004, 2005, 2006).

Os suportes inorgânicos são mais apropriados para uso industrial por apresentaremelevada resistência mecânica, boa estabilidade térmica, resistência a solventes orgânicos eao ataque por microrganismos. Eles são de fácil regeneração por pirólise e apresentamboa rigidez da matriz, sendo estáveis em uma ampla faixa de pressões, temperaturas e pH.Entretanto, a maioria das enzimas imobilizadas comercializadas é obtida com matrizes or-gânicas devido, provavelmente, à variedade de grupos funcionais reativos que podem serintroduzidos nesses suportes.


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Os processos de imobilização de mais de uma enzima em um mesmo suporte têmse destacado porque constituem sistemas interessantes para o estudo e compreensão daforma como ocorrem as reações nos seres vivos, onde as enzimas agem de forma se-qüencial. Embora os suportes e as técnicas de imobilização sejam as mesmas emprega-das nos processos com uma única enzima, são parâmetros importantes nos processosmultienzimáticos: a razão molar entre as enzimas e entre estas e o suporte, a resistênciadifusional no reator e a conversão em produto final (VIETH, 1994).

Na seleção do suporte para a imobilização da enzima, os fatores de maior peso sãoas suas propriedades físicas, químicas e mecânicas. Idealmente um suporte deve ser qui-micamente inerte, ter grande área superficial (>10 m2/g), ter resistência mecânica ele-vada e baixo custo de produção. Infelizmente, a combinação destas qualidades nemsempre é possível e um compromisso deve ser encontrado. Do exposto, pode-se inferirque não se conhece um suporte ideal e universal para a imobilização de enzimas, e estetalvez nunca seja encontrado, devido à diversidade dos sistemas enzimáticos. Isto signifi-ca que é necessário avaliar criteriosamente todos os aspectos envolvidos e, então,decidir qual é o suporte mais apropriado para a aplicação desejada.

Na otimização de um tipo de suporte para uma aplicação específica é importanteconhecer a natureza catalítica da enzima, e e o tipo de reator que será utilizado.

Imobilização no Interior de um Suporte

Este método está fundamentado na diferença de tamanho entre as moléculas do catali-sador e do soluto, e aqui duas aproximações têm sido adotadas: a formação de uma es-trutura porosa na presença da enzima, envolvendo-a em uma estrutura tridimensional,ou a retenção do biocatalisador por uma membrana porosa. Em ambos os casos a enzi-ma tem sua mobilidade mantida, pois não são envolvidas ligações físicas ou químicas en-tre a enzima e o suporte. Conseqüentemente, somente substratos de baixo peso mole-cular podem ser empregados com este tipo de enzima imobilizada. Este método inclui aencapsulação em gel e em fibras e a microencapsulação, como mostrado na figura 6.2(ROSEVEAR et alii, 1987).

O método de encapsulação em gel envolve a retenção da enzima no interior deuma matriz polimérica insolúvel no meio de reação. A maior parte dos métodos base-ia-se na mistura do biocatalisador com um fluido precursor do gel e subseqüente gelifi-cação por polimerização ou precipitação, ficando a enzima distribuída no interior damatriz. As matrizes preferidas são normalmente as do tipo hidrogel, que podem serobtidas nas mais variadas formas.

A preparação de enzimas imobilizadas no interior de fibras pode ser realizada peladissolução de um polímero, como o acetato de celulose, em um solvente orgânico imiscí-vel em água seguida da emulfisicação da solução formada com a solução aquosa que con-tém a enzima. Em seguida estruda-se a emulsão em um líquido coagulante (tolueno ouéter de petróleo) que precipita o polímero na forma de filamentos. No interior do polí-mero são retidas as microgotas contendo a enzima (FERNANDES e CABRAL, 2006).


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As principais vantagens da encapsulação de enzimas incluem a grande área super-ficial para contato entre o substrato e a enzima no interior de um volume relativamentepequeno, e a possibilidade de imobilização simultânea de diferentes enzimas em umaúnica etapa. Como principais desvantagens, têm-se:

a) A restrição de que os biocatalisadores somente podem ser utilizados com subs-tratos de baixo peso molecular.

b) A possível inativação da enzima durante o procedimento de imobilização.

c) A alta concentração de enzima necessária para garantir a encapsulação.

d) Os possíveis efeitos de inibição por produtos ou substrato no interior da matrizporosa. O laboratório de investigação japonês Toyota Center R&D Labs desen-volveu uma nova estratégia de estabilização de enzimas, com aplicação na indús-tria de automóveis, por imobilização em suportes com mesoporos, o FSM-16(Folded Sheet Mesoporous Material), que apresenta resultados surpreendentes.


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Figura 6.2 Classificação dos métodos de imobilização.

em gel em fibras microencapsulação

Encapsulamento

adsorção ligação iônica quelação ligação covalente

ligação simples reticulação

Ligação

Enzimas insolúveis

sem derivação com derivação

Enzimas solúveis

A atividade enzimática e a termoestabilidade em solventes orgânicos foi significa-tivamente aumentada porque o poro do FSM-16 corresponde ao tamanho mole-cular da enzima (LI e TAKAHASHI, 2000; TAKAHASHI e MIYZAKI, 2000).

Imobilização sobre um SuporteA enzima pode ser permanentemente fixada na superfície de um suporte por meio deinterações como a adsorção física, a ligação iônica, as ligações covalentes e a ligação aum metal (quelação), como mostrado na figura 6.2. O método de imobilização por ad-sorção física é a técnica mais antiga de produção de enzimas imobilizadas, assim como, amais simples. Consiste em se colocar em contato a solução da enzima em água com o su-porte (superfície adsorvente), em determinadas condições de pH, temperatura e agita-ção. Após a imobilização o suporte é lavado para remoção das moléculas de enzima quenão foram adsorvidas (MESSING, 1978).

O princípio envolvido nesse tipo de método é a atração da enzima pela superfície dosuporte por meio das forças de Van der Waals, que são fracas, o que permite a desadsor-ção da enzima durante a utilização. Para minimizar este problema é recomendável lavar aenzima imobilizada com solução de substrato nas mesmas condições de pH e temperatu-ra empregados no meio de reação. O processo de adsorção não é específico e algumas ve-zes pode provocar a inativação parcial ou total da enzima. Neste caso, somente suportescom alta afinidade pela enzima podem causar a menor desnaturação da enzima.

Os suportes mais utilizados são: alumina, carvão ativo, argila, colágeno, vidro, terradiatomácea e hidroxiapatita (MESSING, 1978).

O método de imobilização por ligação iônica baseia-se na atração da enzima pelosuporte sólido que contém íons residuais. A principal diferença entre a adsorção física ea ligação iônica é a energia da ligação envolvida entre a enzima e o suporte, as intera-ções íon–íon são mais fortes do que as forças de Van der Waals, porém mais fraca que aligação covalente (FERNANDES e CABRAL, 2006). A preparação do derivado imobili-zado é feita da mesma forma que no processo de adsorção física, isto é, coloca-se emcontato a solução enzimática com o suporte. Também, neste caso, pode ocorrer a libe-ração da enzima pelo suporte, o que contamina o produto final e reduz a atividade espe-cífica do biocatalisador. Dado o caráter iônico da ligação e as condições amenas de imo-bilização, ocorre pouca mudança conformacional na enzima, o que conduz à obtençãode derivados imobilizados com altas atividades enzimáticas.

Enzimas imobilizadas ativas podem ser obtidas utilizando-se a técnica da ativaçãoda superfície do suporte com metais de transição (ligação com metais ou quelação), for-mando ao final, um quelato entre a enzima e a superfície ativa do suporte. Os principaissais de metais utilizados para o processo de ativação são: TiCl3, TiCl4, Ti2(SO4)3, FeCl3,FeCl2, FeSO4, ZnCl4, SnCl2, SnCl4 e VCl3 (Zanin e Moraes, 2004). Esta técnica tem sidoutilizada para ativar tanto materiais orgânicos (papel de filtro, quitina, quitosana, ácidoalgínico), e inorgânicos (Celite, vidro, sílica de porosidade controlada, horneblenda, lãde vidro e alumina, entre outros). Embora a preparação de enzimas imobilizadas poreste método seja bastante simples, estando envolvidas somente duas etapas (ativação do


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suporte e imobilização da enzima), a estabilidade operacional obtida, quando se traba-lha com substratos de alta massa molecular, é baixa, devido aos metais envolvidos. Tam-bém foram observados casos em que houve dessorção da enzima, que resulta da fracainteração entre a enzima e o metal (suporte ativado). Por este motivo alguns autoresconsideram este método como de quelação (ligação covalente parcial) e outros, comode adsorção.Os métodos de adsorção, ligação iônica e ligação metálica são de fácil apli-cação, entretanto eles não são muito utilizados em processos em grande escala, devidoàs forças de ligação fracas, o que possibilita a perda da enzima do suporte. O método daligação covalente baseia-se na formação de uma ligação forte entre a enzima e o supor-te. Este método de imobilização é o mais difundido e o mais estudado. A seleção dascondições de imobilização é mais difícil do que nos outros métodos. O método é,freqüentemente, mais complexo e utiliza condições menos brandas do que os demais.Como a ligação formada é forte, a enzima imobilizada obtida por este método é estável,isto é, não se solta do suporte em presença do substrato ou de soluções de altaconcentração iônica.

A ativação do grupo ligante é freqüentemente realizada no suporte a fim de redu-zir o risco de diminuição da atividade catalítica da enzima. As reações de ativação do su-porte podem ser por: diazotização, formação de ligação amida, alquilação e arilação,formação de base de Schiff, reação de Ugi, reações de amidinação, troca do dissulfe-to-tiol, interações enzima-mercúrio e ligação induzida por radiação (KENNEDY eWHITE, 1985; HARTMEIER, 1988; FERNANDES e CABRAL, 2006).

Os materiais inorgânicos mais comumente utilizados na imobilização de enzimas são:cerâmica, vidro, sílica e metais. Muitos métodos de ligação covalente de enzimas em supor-tes inorgânicos envolvem a utilização de derivados de silano contendo um grupo orgânicofuncional (método de silanização). Às vezes, os suportes silanizados podem reagir direta-mente com as enzimas, mas na maior parte dos casos, estes grupos funcionais devem sermodificados para produzir intermediários reativos. O reagente mais utilizado é o glutaral-deído, devido à simplicidade do método e obtenção de preparações enzimáticas ativas e es-táveis (WEETALL,1975,1976;ZANINeMORAES,2004;FERNANDESeCABRAL,2006).

Para conseguir preparações com alta atividade, algumas vezes, são utilizadas técni-cas que procuram evitara inativação dos resíduos de aminoácidos do centro ativo da en-zima. Dentre estas se pode citar: a ligação covalente da enzima na presença de um inibi-dor competitivo ou do substrato, a ligação reversível de um complexo enzima-inibidor,a modificação química de uma enzima solúvel, induzindo a ligação com o suporte pelosnovos grupos introduzidos, e a ligação multipontual da enzima ao suporte.

Os suportes orgânicos não necessitam da etapa de silanização, uma vez que dis-põem de grupos funcionais capazes de promover a ligação enzima-suporte. Porém, asenzimas imobilizadas são mais ativas e estáveis quando se introduz um espaçador entre aenzima e o suporte. Como espaçador pode-se empregar a hexametilenodiamina(HEMDA), que tem a função de aumentar a mobilidade da enzima.

Amiloglicosidase, lipase e ciclodextrina-glicosil-transferase, dentre outras enzi-mas, têm sido imobilizadas em quitina e quitosana, obtendo-se boa recuperação de ati-


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vidade em relação à enzima solúvel (BON et alii, 1984; ZANIN et alii, 1998; PEREIRA etalii, 2001; SOBRAL et alii, 2003a,b; GOMES et alii, 2004).

Uma enzima insolúvel pode ser obtida pela formação de ligações cruzadas inter-moleculares (reticulação ou cross-linking) entre moléculas da enzima sem a presençade um suporte sólido. Sempre que possível, deve-se escolher um reagente que promovaa ligação entre grupos não envolvidos na catálise e que esteja em concentração suficien-te para a completa imobilização com retenção da atividade. O glutaraldeído tem sido oreagente bifuncional mais amplamente utilizado (FERNANDES e CABRAL, 2006).

Em algumas situações, quando se deseja obter enzimas imobilizadas com maior ati-vidade, ou aumentar a resistência mecânica dos suportes, é recomendável a utilizaçãode uma combinação de métodos para a imobilização de enzimas. Por exemplo, pode-semelhorar a estabilidade da enzima imobilizada por adsorção promovendo-se umaligação cruzada entre as moléculas da enzima com o glutaraldeído.

Imobilização MultipontualA imobilização multipontual de uma enzima consiste na formação de várias ligações cova-lentesentreumamoléculadeenzimaeváriosgruposativosdosuporte.Para seobterderiva-do estável pela técnica de imobilização multipontual, deve-se selecionar um suporte morfo-logicamente apropriado. Suportes porosos, cuja estrutura interna tem grande área superfi-cial, como por exemplo, sílica, alumina e géis de agarose, promovem congruência geomé-trica entre a enzima e o suporte, aumentando a rigidez de uma pequena parte da área su-perficial da enzima (10 a 20%), que é transladada para toda a estrutura terciária, devido àsfortes interações entre todas as partes da molécula de proteína (GUISÁN et alii, 1991).

A ligação da enzima ao suporte dá-se entre grupos amino da enzima e grupos aldeí-do alifáticos pequenos do suporte. Géis glioxil-agarose (Ag-O-CH2-CHO) possibilitammultiinteração enzima-suporte intensa, sem distorção da estrutura da enzima, devido àausência de impedimentos estéricos para a reação química amina-aldeído, estabilidadedos grupos aldeídos e reversibilidade de cada ligação unipontual amina-aldeído.

Com o uso do sistema insolubilização-estabilização de enzimas proposto por Guisán(1988) e controle das variáveis que definem a intensidade das multiinterações enzima(amino) suporte (aldeído), a saber, a densidade superficial dos grupos aldeído no gel ati-vado, o tempo de contato enzima insolubilizada-suporte ativado, a temperatura e o pH, épossível preparar derivados mais ativos e mais estáveis com, por exemplo, penicilina G-aci-lase (BLANCO e GUISÁN, 1989), quimotripsina (GUISÁN et alii, 1991), esterase termo-fílica (FERNADEZ-LAFUENTE et alii, 1995), carboxipeptidase A (PEDROCHE et alii,2002), alcalase (TARDIOLI et alii, 2003b) e lipase (PALOMO et alii, 2005).

A tabela 6.2 mostra a atividade recuperada e o fator de estabilidade de diversas en-zimas imobilizadas em gel glioxil-agarose (MATEO et alii, 2005). A atividade recupera-da variou de 60 a 100% e a estabilização, de acordo com o tempo de meia vida do bioca-talisador, em muitos casos foi 1.000 a 10.000 vezes mais alta do que a conseguida para aenzima imobilizada unipontualmente.


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Tabela 6.2 Atividade recuperada e fator de estabilidade para diversas enzimas imobilizadasmultipontualmente em glioxil-agarose

Enzima Atividade Recuperada (%) Fator de Estabilidade

Tripsina 75 10.000a

Quimotripsina 70 60.000a

Penicilina G acilase (E. coli) 70 8.000a

Lipase (C. rugosa) 50 150a

Lipase (B. thermocatenulatus) 75 500a

Esterase (B. stearothermophilus) 70 1000a

Termolisina (B. thermoproteolyticus) 100 100a

Glutamato racemase 70 1000a

Alcalase 54 500

Uroquinase 80 10

a: comparada com enzimas imobilizadas unipontualmente.Fonte: Mateo et alii (2005).

Imobilização pela tecnologia de granulaçãoUm novo método, já patenteado, de imobilização baseia-se na interação entre a enzimae um ligador líquido que são vaporizados por atomização sobre um suporte de sílica, cu-jas partículas têm diâmetros inferiores a 100 �m – o mesmo que um grão de areia. Du-rante a granulação, as partículas de sílica aglomeram-se e transformam-se em partículasporosas de maiores dimensões, com a enzima distribuída uniformemente sobre toda aárea da superfície da sílica. O diâmetro médio das partículas é de cerca de 600 �m e aárea da superfície é de cerca de 50 m2 por grama. Isto cria uma grande área de contatoentre o substrato e a enzima. Muito embora os granulados de sílica sejam porosos, elessão mecanicamente estáveis (NOVOZYMES, 2002).

Imobilização de Enzimas em Meio Orgânico e na Presença deAditivosAs moléculas de água, que estão ao redor da enzima em meio aquoso, têm papel im-portante na estabilidade protéica devido, principalmente, às interações hidrofóbicas,além das forças de van der Waals, pontes salinas e pontes de hidrogênio. Desta forma,pequenas variações no meio reacional, tais como: temperatura, pH, força iônica entreoutras, podem induzir modificações estruturais na enzima desativando-a (YAMANEet alii, 1990). Esta desnaturação decorre da exposição da parte hidrofóbica da enzimaà água, o que promove um aumento do nível de hidratação da enzima. Assim, não ésurpresa que a manipulação da natureza do meio e da quantidade de água ao redor daenzima tenha um profundo efeito sobre a estabilidade. A remoção da água da superfí-cie da enzima conduz à reorganização das moléculas de água, devido ao aumento do


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número de ligações hidrogênio intramoleculares, o que contribui para a estabilizaçãoe o aumento da rigidez da enzima. Este efeito pode ser alcançado pelo uso de aditivoshidrofílicos, como os polióis e polissacarídeos, como mostra na figura 6.3 a e b. Essesaditivos agem como reguladores da estrutura da enzima em meio aquoso (YAMANEet alii, 1990).

As principais desvantagens, associadas ao uso de solventes orgânicos como meiosde bioconversão, são o aumento das limitações difusionais à transferência de massa desubstratos e produtos, uma vez que se introduz mais uma fase (orgânica) além da faseaquosa (e de uma fase sólida se a enzima estiver imobilizada), e a toxicidade do solventeorgânico para a enzima.

Por outro lado, quando a água é substituída por um solvente orgânico, alteraçõesna conformação nativa da enzima podem ocorrer, tanto na estrutura terciária comonas mais proeminentes estruturas secundárias (�-hélice e a conformação �), acarre-tando, desta maneira, a sua desestabilização. Com o objetivo de assegurar uma confor-mação enzimática cataliticamente ativa em meio orgânico, a molécula de enzima deveter uma camada de hidratação definida (FABER, 1997), que reduz o contato do sol-vente com a superfície da proteína e contribui para o aumento de sua flexibilidade in-terna.


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Figura 6.3a Desnaturação da enzima em solução aquosa. (b) Efeito de polióis na estabilização dasenzimas.

Água

Enzima

Polióis

Enzima Enzima

Água

a)

b)

Outra maneira de proteger a configuração nativa da enzima é a insolubilização emsuportes sólidos (MATTIASON e ADLERCREUTZ, 1991). Uma grande variedade demateriais naturais e sintéticos, orgânicos ou inorgânicos, com diferentes tamanhos, for-mas e densidades, foram estudados para a imobilização de enzimas para uso em solven-tes orgânicos (BALCÃO et alii, 1996; VILLENEUVE et alii, 2000). No caso particular daenzima lipase, estudos comparativos mostram diferenças acentuadas no desempenhoda mesma fonte de lipase imobilizada em diferentes suportes (tabela 6.3) e evidencia-ram que, apesar das várias experiências reportadas na literatura, a imobilização de lipa-ses ainda é um desafio complexo, uma vez que a extensão da imobilização depende daestrutura da enzima, do método de imobilização e do tipo de suporte (RESLOW et alii,1988; BALCÃO et alii, 1996; VILLENEUVE et alii, 2000). Em muitos casos, suportes queproporcionam uma elevada atividade e estabilidade da enzima mostram sérias limita-ções de resistência mecânica e à pressão, que os tornam inviáveis para a utilização emalguns tipos de biorreatores (ISON et alii, 1994).

Tabela 6.3 Propriedades catalíticas da lipase microbiana de Candida rugosa imobilizada emdiferentes suportes

Característica STY-DVB Quitosana Quitina SPC Celulignina Sílica xerogel

Método deimobilização

Adsorção Ligação covalente Encapsulação

Rendimento deimobilização (%)

42 17 26 18 64 32

Atividade daenzima (U/mg)

110 51 60 51 193 129

pH ótimo 7,5 6,0 7,5 7,5 8,0 7,5

Temperaturaótima (�C)

50 45 45 50 40 55

Inativaçãotérmica a 50�C(h-1)

Nd 0,63 1,07 0,26 0,79 0,19

Estabilidadeoperacional

Hidrólise(t1/2 a 37�C, h)

nd 5,0 3,3 21 3,5 65

Esterificação(t1/2 a 37�C, h)

620 83 426 32 302 135

Referência Oliveira et

alii, 2000Pereira et

alii, 2001Gomes et

alii, 2004Soares et

alii, 1999Gomes et

alii, 2005,2006

Soares et alii,2004, 2005,2006

STY-DVB: copolímero de estireno-divinilbenzeno; SPC: sílica de porosidade controlada; nd: não determinado.Sílica xerogel obtida pela técnica sol-gel empregando tetraetil ortosilicato (TEOS) como precursor.


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O aumento da estabilidade é observado em algumas preparações de lipases quan-do imobilizadas, possivelmente devido à capacidade do suporte em reter a quantidadecorreta de água para manter ativa a enzima sem aumentar a flexibilidade que proporci-ona a desnaturação. Gray et alii (1990) estudaram a imobilização da lipase de Candidarugosa em vários suportes e encontraram atividades, em muitos casos, muito superioresas observadas na enzima livre. A atividade da lipase imobilizada especialmente em su-portes hidrofóbicos, como o polietileno, foi superior à da enzima livre. Isto foi explica-do pelo efeito de orientação promovido pela estrutura do suporte, que provavelmenteforneceu à enzima uma melhor exposição ao substrato (BALCÃO et alii, 1996).

Dentre os métodos de imobilização, a adsorção física é talvez o procedimento deimobilização mais simples e de menor custo. A especificidade do substrato permaneceinalterada, existindo ainda a possibilidade de regeneração do suporte. A adsorção da li-pase pode ser efetuada em meio aquoso ou por imersão do suporte em ácidos graxos ouóleo antes de sua exposição à solução da enzima livre. Geralmente adotam-se procedi-mentos experimentais semelhantes na adsorção física da lipase em suportes hidrofóbi-cos ou hidrofílicos. Pequenas variações incluem a suspensão do suporte na forma de póem uma mistura água/álcool desgaseificada, lavagem com água e tampão em uma colu-na empacotada e finalmente percolação da solução de lipase através de uma coluna(BALCÃO et alii, 1996).

No procedimento de ligação cruzada, as moléculas de lipase são quimicamente liga-das umas às outras, por meio de vários reagentes bifuncionais. Um procedimento comumconsiste de uma etapa preliminar que envolve a imobilização da enzima em uma resina detroca iônica (Dowex ou Amberlite), para obter alta “carga” da enzima, seguida por uma oumais etapas, nas quais formam-se as ligações covalentes. Essas etapas incluem o contato daresina pré-tratada com glutaraldeído, dissolvido em um tampão adequado, para formaruma base de Schiff (produto da reação com os grupos amino), seguido do tratamento comuma solução de sulfito de hidrogênio para reduzir o excesso de glutaraldeído e da base, oualternativamente, seguido pela lavagem com uma solução de fosfato tamponada. A imobili-zação de lipase em Amberlite foi obtida pela formação de ligações cruzadas dessas resinasadsorvidas pela enzima com (HEMDA) e glutaraldeído (VILLENEUVE et alii, 2000).

Embora seja extensa a literatura referente à imobilização de lipases, são poucos osdados relativos à estabilidade operacional desses derivados. Isto pode estar associado àbaixa estabilidade operacional das lipases imobilizadas, que atinge, em alguns traba-lhos, cerca de 50 a 70% de redução em menos de cinco bateladas consecutivas(BALCÃO et alii, 1996).

Para superar essas limitações, diversas tentativas têm sido descritas na literatura.Controle das condições em que se efetua a imobilização, por exemplo, na presença deaditivos, solventes orgânicos ou substrato, podem geralmente conduzir a preparaçõesmais estáveis (VILLENEUVE et alii, 2000).

Segundo Rocha et alii (1998), existem diversas formas de aumentar a atividade li-política do sistema imobilizado, inclusive o uso de aditivo. A maior parte dos estudos en-volve a imobilização simultânea do aditivo em processo de adsorção simples (ou por po-cesso parcialmente modificado por precipitação da enzima, por evaporação da água oupor liofilização). Alguns efeitos são atribuídos a esta nova técnica:


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a) Proteção da inativação da enzima durante a etapa de imobilização (WEHTJE etalii, 1993; TRIANTAFYLLOU et alii, 1995).

b) Retenção da camada de água ao redor do biocatalisador (TRIANTAFYLLOU etalii, 1995).

c) Efeitos dispersantes das moléculas da enzima e facilitadores de transporte demassa, quando aditivos são usados como matrizes de imobilização. Às vezes, opapel destes aditivos (proteínas, sacarídeos, polióis e sais) pode ser desempe-nhado pelas impurezas inativas incluídas na solução enzimática bruta. O aditivopode estar presente ou ausente no meio durante a reação. O contato do aditivocom o suporte e com a enzima pode apresentar comportamento antagônico,isto é, a interação do sistema (aditivo+suporte+enzima) pode ser suficiente, outambém pode apresentar efeito negativo na reação de síntese ou resistência natransferência de massa. A influência do aditivo na atividade enzimática aindanão é totalmente compreendida (ROCHA et alii, 1998).

A seleção do aditivo adequado é função do tipo de enzima e do método de imobiliza-ção utilizado. No caso específico das lipases, que exigem uma interface água-solvente, parasua total atividade catalítica, o uso de aditivos macromoleculares mostra efeitos estabilizan-tes significativos na atividade da enzima, pormeio do revestimento da interface, impedindodesta forma, alterações da estrutura protéica. Segundo Bosley (1991), caseína, gelatina, al-bumina de ovo e albumina bovina são aditivos eficientes para a imobilização de lipases emvários suportes. Resultados semelhantes foram descritos por Reetz et alii (1996). É tambémrecomendado o uso de outros tipos de aditivos macromoleculares, como por exemplo, po-lietilenoglicol (PEG) e polivinilálcool (PVA). Em ambos os artigos, o uso de aditivos de bai-xa massa molecular (sorbitol, glicerol e triglicerídeos) foi descartado.

Outro parâmetro que interfere na eficiência de um determinado aditivo é sua for-ma de adição no procedimento de imobilização, isto é, em que etapa esta adição é maisindicada e qual a quantidade de aditivo necessária para promover um grau satisfatóriode estabilização.

Com relação ao primeiro fator, o estudo detalhado realizado por Wehje et alii(1993) sugere que a adição de aditivos deve ser efetuada antes da adição da enzima ousimultaneamente com a enzima. A adição de aditivos após a imobilização da enzima nosuporte não mostrou nenhum efeito benéfico. Quanto à quantidade de aditivo, os auto-res também recomendam uma avaliação experimental em função do tipo de aditivousado, tendo em vista, que o efeito do aditivo depende do seu tamanho molecular. Essefato é exemplificado na tabela 6.4 que reúne dados de atividade hidrolítica e de recupe-ração da lipase de Candida rugosa, após imobilização em sílica de porosidade controla-da, na ausência e presença de diversos agentes estabilizantes.


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Tabela 6.4 Rendimento de imobilização da lipase de Candida rugosa em sílica de porosidadecontrolada na presença de diferentes aditivos

Aditivo Atividade lipolíticaU/mg

Recuperação de enzima (%)

Controle 58 19

Lecitina 50 17

Albumina 78 26

Ciclodextrina 36 12

Polietilenoglicol (MM 10000) 42 14

Polietilenoglicol (MM 1500) 104 35

Fonte: Soares et alii, 2001.

Ressaltamos que há extensa literatura disponível para o aprofundamento do estu-do do uso de enzimas em meios orgânicos, assim como sobre a imobilizaçãona presençaou ausência de aditivos (REETZ et alii, 1996; GONÇALVES et alii, 1999; PEREIRA etalii, 2001; SOARES et alii, 2001, 2003).

VANTAGENS E LIMITAÇÕES DA IMOBILIZAÇÃO DE ENZIMASA imobilização da enzima tem um efeito benéfico na sua estabilidade, em função das inte-rações físicas e químicas entre o suporte e as moléculas da enzima. A imobilização, tam-bém auxilia a dispersão homogênea da enzima no meio, essencial, para a condução de re-ações enzimáticas (DE CASTRO e ANDERSON, 1995; VILLENEUVE et alii, 2000).

Do ponto de vista comercial, as principais vantagens da utilização de enzimas imobi-lizadas, em relação às enzimas solúveis são, praticamente, as relativas à catálise heterogê-nea. São vantagens:

a) Aproveitar a atividade catalítica por um maior período de tempo, uma vez que aenzima não deve ser desnaturada ao final do processo em batelada.

b) Operar de forma contínua possibilita o melhor controle das variáveis do proces-so, pois o biocatalisador é retido no interior do biorreator e o substrato passapelo leito catalítico em escoamento contínuo, ou, então, transfere-se o biocata-lisador para novas bateladas que contêm uma solução de substrato novo(processo em bateladas repetidas).

c) Facilitar a separação do catalisador e do produto da reação, já que a enzimaimobilizada, não é solúvel no meiode reação, é retida no interior do biorreator,e o substrato não convertido e o produto são retirados sem contaminação dobiocatalisador.

d) Reduzir o volume de reação, porque a enzima imobilizada e retida no biorrea-tor permite alta concentração enzimática em menor volume de reator, isto é,alta atividade por unidade de volume, muito superior a que se seria obtida com


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a enzima livre. Isto conduz a uma alta produtividade volumétrica (kg) por volu-me de reator (m3) e por hora. Além disto, como o substrato e produto são ex-postos a condições de reação mais brandas por um menor tempo de reação, im-pede-se a ocorrência de reações indesejáveis e a contaminação do meio dereação.

e) Alterar, em alguns casos, as propriedades catalíticas da enzima em relação a suaforma solúvel, como por exemplo, conferir-lhe maior estabilidade ao pH e àtemperatura, reduzir os efeitos de inibição pelo substrato e produto que sãoremovidos continuamente do biorreator.

f) Facilitar a interrupção da reação, quando se atinge um determinado grau de con-versão, pela remoção do biocatalisador, se a operação está sendo realizada em ba-telada, ou pelo ajuste do tempo de residência, se é utilizado um reator contínuo(MESSING, 1975; ROSEVEAR et alii, 1987; HARTMEIER, 1988; TISCHER eWEDEKIND, 1999).

O sucesso da tecnologia de imobilização mostra que, de modo geral, as vantagenssuperam as limitações. Porém, alguns fatores devem ser apontados, não como desvanta-gens do processo, mas sim como pontos a serem evitados. Dentre estes fatores podemser citados (ROSEVEAR et alii, 1987):

Perda da atividade durante o processo de imobilização

A estabilidade termodinâmica e cinética das enzimas e as diferenças nas sequências deaminoácidos e respectivas estruturas tridimensionais, entre as enzimas intrinsecamentetermoestáveis e as termolábeis, justificam a sua performance e o seu elevadíssimo inte-resse industrial. Vários são os exemplos de tentativas bem sucedidas de aumentar a esta-bilidade das proteínas modificadas por metodologias de design específico (na moléculade DNA ou na própria enzima) ou por evolução dirigida. A relação que existe entre ter-moestabilidade elevada das enzimas isoladas de hipertermófilos e a sua baixa actividadeespecífica continua a ser um entrave ao aparecimento mais frequente de novas enzimasno mercado, das quais se exige o binômio elevada termoestabilidade -alta atividade ca-talítica. Nem todas as enzimas de hipertermófilos têm nível de termoestabilidade sufici-ente para manter suas estruturas e funções fisiológicas quando sujeitas a altas tempera-turas. Assim, são necessários fatores extrínsecos como chaperoninas moleculares esolutos compatíveis, os osmólitos (STERNER e LIEBL, 2001).

A imobilização da enzima envolve o manuseio do biocatalisador (enzima–supor-te), o que adiciona custos ao processo e invariavelmente resulta em inativação parcial daenzima. Para melhor aproveitamento da técnica, recomenda-se utilizar elevadas con-centrações de enzima em relação ao suporte. Como os métodos de imobilização, demodo geral, envolvem interações fracas (forças de VAN DER WAALS), ou fortes (liga-ção covalente), entre a frágil estrutura da enzima e o suporte, ocorre invariavelmente al-teração da estrutura tridimensional da proteína, resultando em menor atividade. Alémdisso, também podem ocorrer alterações de orientação e acesso do substrato ao sítio ati-


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vo, reduzindo a atividade da enzima, ou ainda levando à redução aparente da especifici-dade ao substrato. Isto poderia ser vantajoso porque diminui os efeitos de inibição pelosubstrato. Porém, como a maior parte dos processos enzimáticos envolve a transforma-ção de macromoléculas, a redução da especificidade é uma desvantagem. Para se supe-rar esse problema, busca-se a proteção do sítio ativo da enzima durante o processo deimobilização, o que pode ser conseguido empregando-se altas concentrações desubstrato ou um inibidor de sítio ativo. Nestes casos, as substâncias protetoras devempoder ser facilmente removidas ao final do processo de imobilização.

Efeitos difusionais (transferência de massa)

A enzima, com sua mobilidade restringida pelo fato de estar ligada a um suporte, perdeparte da acessibilidade ao substrato, o que leva à aparente redução da atividade, nestecaso provocada por restrições difusionais, ou seja, limitações do acesso do substrato aosítio ativo devido à presença da matriz sólida. Pode, também, ocorrer acúmulo de pro-duto na proximidade do sítio ativo, o que pode afetar a cinética da reação, pela reduçãoda velocidade de reação, ou alterar o pH no microambiente da enzima. Estes efeitos de-vem ser evitados ou diminuídos pela escolha criteriosa do suporte, ou pelas condiçõesde operação do biorreator. De um modo geral, pequenas partículas de suporte redu-zem a resistência à difusão intrapartícula, enquanto altas vazões de fluido (vazões) redu-zem os efeitos difusionais interpartículas. Estes dois fatores, são, normalmente, incom-patíveis (partículas pequenas promovem uma alta queda de pressão ao longo do leito,reduzindo a vazão de fluido), portanto, a aplicação específica determinará o grau decompromisso desejável entre estes fatores.

Características físicas do biocatalisador e do fluido

Normalmente as enzimas imobilizadas devem ser utilizadas quando o substrato é solú-vel. Quando as enzimas estão retidas no interior de matrizes porosas, os poros devem fa-cilitar o livre acesso do substrato e reter ao mesmo tempo a molécula de enzima no seuinterior.

Estabilidade do biocatalisador

O custo da imobilização deve ser compensado pela longa vida do biocatalisador. O su-porte deve manter suas propriedades físicas (resistência mecânica e ao ataque por rea-gentes químicos) durante o tempo de meia-vida estimado. Normalmente, os substratosutilizados nas reações enzimáticas contêm substâncias em suspensão, lipídios, que po-dem se adsorver ao suporte e bloquear os poros, diminuindo a acessibilidade do subs-trato à enzima e promovendo uma redução aparente do tempo de meia-vida da enzimaimobilizada. Neste caso, as soluções de substrato devem ser purificadas antes daalimentação do biorreator.


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APLICAÇÕES DAS ENZIMAS IMOBILIZADASAs enzimas imobilizadas têm uma série de características especiais que tornam suas apli-cações mais promissoras em relação às enzimas solúveis. Existem, na literatura, muitostrabalhos e livros que apresentam e discutem o uso das enzimas imobilizadas nos cam-pos industrial, analítico, médico, química fina, entre outros (tabela 6.1) (CHIBATA,1978; CHEETHAM, 1985; ROSEVEAR et alii, 1987; TANAKA et alii, 1993; VELIK eMCLEAN, 1994; CABRAL et alii, 1994; FERNANDES e CABRAL, 2006).

Dentre as aplicações de enzimas imobilizadas em larga escala, e que são considera-das um sucesso, pode-se citar: a produção de xaropes de glicose e frutose a partir de ami-do de milho; a produção do ácido 6-amino penicilínico (CABRAL et alii, 1994), penici-lina semi-sentitética, com a enzima penicilina-G ou L-acilase, cuja produção mundial éda ordem de 5 x 103 ton/ano; a produção de acrilamida empregando células imobiliza-das; a produção de aspartame com a termolisina imobilizada; e a hidrólise da lactosepresente no soro de queijo.

A tabela 6.5 apresenta as principais aplicações comerciais das enzimas imobiliza-das. O uso uso em escala industrial de enzimas imobilizadas incluem atualmente a pro-dução de milhões de toneladas de xaropes de frutose (HFCS) em biorreatores que ope-ram por 1 000 a 2 000 horas seguidas com um rendimento de 2 000 a 4 000 kg/kg de en-zima. Milhares de toneladas desta enzima imobilizada são produzidas por quase umadezena de empresas espalhadas pelo mundo. Segue-se a essa enzima, considerando aimportância industrial, a penicilina-acilase usada para a produção do ácido 6-aminope-nicilânico (6APA), precursor de mais de 15 penicilinas semi-sintéticas disponíveis nomercado. Nesta tecnologia os biorreatores operam 2 000 a 4 000 horas seguidas comrendimentos de 1 000 a 2 000 kg/kg de enzima. Aproximadamente 3 500 toneladas de6APA são produzidas anualmente, sendo utilizadas 30 toneladas de preparaçãoenzimática.

De importância industrial equivalente são as enzimas imobilizadas usadas para aprodução de vários L-aminoácidos (como a L-alanina, a L-isoleucina, a L-metionina, aL-fenilalanina, o L-triptofano e a L-valina usados para aumentar o valor nutricional dosalimentos) e para a hidrólise de lactose. Os sistemas de enzimas imobilizadas têm tam-bém espaço definido em metodologias analíticas, porque são usados na confecção debiossensores (BON e PEREIRA, 1999). Os biossensores enzimáticos tornam-se cada vezmais úteis em aplicações analíticas, devido à possibilidade de se combinar a seletividadee sensibilidade da enzima com a simplicidade dos transdutores eletroquímicos(FERRAZ et alii, 2006). Hoje em dia o mercado dos biossensores é dominado pelos bi-ossensores de glicose, eletrodos enzimáticos produzidos em massa para um diagnósticorápido dos níveis de glicose sanguínea para diabéticos (NEWMAN e SETFORD, 2006).As etapas fundamentais no desenvolvimento de um biossensor são a imobilização e esta-bilização das enzimas ou outras proteínas sobre a superfície da matriz (KLIBANOV,1979). Materiais que possam permitir a imobilização de espécies mediadoras e molécu-las biológicas são de grande potencial para o desenvolvimento de sensores e biossenso-res. Como citado, dentre os materiais inorgânicos, a sílica-gel tem um grande potencial


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de aplicação em eletroquímica, entretanto essa é uma área de pesquisa relativamenterecente e que tende a crescer, como descreve Walcarius (1998) em sua recente revisãosobre o uso de materiais à base de sílica nos estudos sobre eletrodos modificados e dire-cionados para aplicações eletroanalíticas (GUPTA e CHAUDHURY, 2007).

Tabela 6.5 Exemplos de aplicações comerciais de enzimas imobilizadas

Enzima Substrato Produto

Glicose isomerase (5.3.1.5 ) Glicose Xarope de frutose

�-galactosidase (5.3.1.5) Lactose Glicose e galactose (leite livre delactose)

Lipase ( 3.1.1.3) Triglicerídeos Análogos de manteiga de cacau

Nitrila hidratase (4.2.1.84) Acrilonitrila Acrilamida

Amilocilase (3.5.1.14) D,L Aminoácidos L-amino ácidos (alanina,isoleucina, metionina,fenilalanina, triptofano e valina

Rafinase (3.2.1.22) Rafinose Soluções de galactose esacarose

Invertase (3.2.1.26) Sacarose Glicose/frutose mistura (açúcarinvertido)

Aspartame amônia liase (4.3.1.1) Amônia e ácido fumárico L-acido aspártico (usado nasíntese do aspartame)

Termolisina (3.4.24.27) Peptídeos Aspartame

Glicoamilase (3.2.1.3) Amido D- glicose

Papaína (3.4.22.2) Proteínas Remoção do “chill haze” emcervejas

Penicilina amidase (3.5.1.11) Penicilina G e V Ácido 6-aminopenicilânico(precursor das penicilinassemi-sintéticas)

�-tirosinase Pirocatenol Ácido L-DOPA

As aplicações mais recentes de biocatalisadores imobilizados incluem a produçãode substâncias de alto valor agregado por bioconversão regioespecífica ou estereoespe-cífica. São exemplos, o tratamento seletivo de poluentes específicos, para resolver pro-blemas ambientais, a análise contínua com alta sensibilidade e especificidade de com-postos de interesse, a conversão de energia em sistemas biológicos e, finalmente, emmedicina, a confecção de órgãos artificiais e a formulação de fármacos à base deenzimas (BON e PEREIRA JR., 1999).


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PERSPECTIVASEmbora seja grande o número de trabalhos publicados no campo da imobilização deenzimas os processos que as utilizam em escala industrial são poucos e isto se deve prin-cipalmente aos seguintes fatores: o suporte e os reagentes para a imobilização são caros;a ainda baixa eficiência dos métodos de imobilização; a relativamente baixa estabilida-de operacional da enzima imobilizada; o fato de os equipamentos requeridos para aoperação contínua serem, via de regra, mais sofisticados e pouco versáteis; a pequenademanda dos produtos, que, normalmente, não incentiva a produção em larga escala; ea baixa eficiência das enzimas imobilizadas para produtos de alto peso molecular.

Para viabilizar a aplicação industrial, é necessário otimizar os seguintes parâme-tros: custo de imobilização, retenção da atividade enzimática, estabilidade da enzima àtemperatura e ao pH, a estabilidade operacional e projeto do biorreator; além daobtenção de suportes mais resistentes e baratos.

A tecnologia de imobilização reune os conhecimentos da química, da bioquímica,da biologia molecular e celular aos da engenharia, buscando sempre se ampliar as apli-cações das enzimas na conversão de matérias-primas, normalmente de baixo custo, emprodutos de maior valor agregado. Dessa forma, a imobilização de enzimas é realizadanão só com o propósito de atender aplicações puramente científicas, onde são utiliza-das como modelos para estudar a relação entre a atividade catalítica e a estrutura protéi-ca, mas principalmente visando o uso comercial em processos contínuos.

As estratégias de posicionamento da indústria de enzimas imobilizadas dependemdiretamente do avanço de investigação em áreas relacionadas com a estabilização enzi-mática, entre elas aa investigação do uso de proteínas de proteção, como as chaperoni-nas (MOSKOVITZ e SREBNIK, 2005). Outras estratégias têm sido abordadas com êxitocomo a aplicação de modelos de inativação, a modificação química e a estabilizaçãocom aditivos e solutos compatíveis (O’FAGAIN, 2003; SÁ-PEREIRA et alii, 2004). A áreaque mais se destaca é a engenharia de proteínas que tem contribuído decisivamentepara o desenvolvimento de novos processos de estabilização enzimática.

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