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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE BIOLOGIA

TAILA DOS SANTOS ALVES

EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DA RESISTÊNCIA A

ANTIMICROBIANOS E FATORES DE VIRULÊNCIA EM

Escherichia coli ISOLADAS DE DÍPTEROS MUSCOIDES EM

PROPRIEDADE LEITEIRA

CAMPINAS

2017

TAILA DOS SANTOS ALVES

EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR DA RESISTÊNCIA A ANTIMICROBIANOS E FATORES DE VIRULÊNCIA EM

Escherichia coli ISOLADAS DE DÍPTEROS MUSCOIDES EM PROPRIEDADE LEITEIRA

Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestra em Biologia Animal na Área de Relações Antrópicas, Meio Ambiente e Parasitologia.

Orientador: PROF. DR. DOMINGOS DA SILVA LEITE

CAMPINAS

2017

ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À

VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO

DEFENDIDA PELA ALUNA TAILA DOS SANTOS

ALVES E ORIENTADA PELO PROF. DR.

DOMINGOS DA SILVA LEITE.

Campinas, 30 de março de 2017.

COMISSÃO EXAMINADORA

Prof. Dr. Domingos da Silva Leite (orientador)

Profa. Dra. Cristina Elisa Alvarez Martinez

Dra. Monique Ribeiro Tiba Casas Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.

À minha mãe por todo amor, fé e apoio sempre.

Agradecimentos

Ao meu orientador, Prof. Dr. Domingos da Silva Leite, por todos os ensinamentos,

oportunidades, incentivo, confiança, apoio e presença sempre.

Ao Prof. Dr. Márcio Garcia Ribeiro e ao Dr. Gustavo Henrique Batista Lara pela disposição e

auxílio na obtenção das amostras.

À bióloga Ma. Mirtis Maria Giaciani Ferraz pelo auxílio e ensinamentos.

À Profa. Dra. Patrícia Jacqueline Thyssen e a Ma. Natane de Cássia Sibon Purgato pela

identificação das amostras de dípteros.

À Dra. Amanda Keller Siqueira pelo incentivo, disposição, ajuda e ensinamentos.

Ao Prof. Dr. José Luiz Proença Módena, Profa. Dra. Cristina Elisa Alvarez Martinez e Profa.

Dra. Patrícia Jacqueline Thyssen pela participação e sugestões no Exame de Qualificação.

À Dra. Jéssica Wildgrube Bertol pela amizade e apoio.

Profa. Dra. Maria Silvia Viccari Gatti e ao Prof. Dr. Tomomasa Yano pelo apoio e disposição.

Ao Prof. Dr. Wanderley Dias da Silveira e ao Dr. Renato Pariz Maluta pelo auxílio na técnica

de Pulsed-Field Gel Electrophoresis.

À Profa. Dra. Ana Lúcia da Costa Darini, Profa. Dra. Maria Silvia Viccari Gatti e a Dra.

Monique Ribeiro Tiba Casas pelo exame prévio da dissertação.

À Profa. Dra. Cristina Elisa Alvarez Martinez, Dra. Monique Ribeiro Tiba Casas, Profa. Dra.

Fabiana Fantinatti-Garboggini e Prof. Dr. Tomomasa Yano por terem aceitado participar da

banca examinadora.

À Jéssica Gurgel, Taís Baruel Vieira e Guilherme Borelli por toda a ajuda e amizade, e à

Meghi Nogueira de Souza, Luisa de Pontes Ribeiro e Ma. Carolina Lambertini pela amizade e

companheirismo.

A CAPES pela concessão da bolsa de mestrado e a FAPESP pelo apoio financeiro.

À minha família pela compreensão e apoio.

RESUMO

O ambiente rural propicia o desenvolvimento de espécies de dípteros muscoides que podem

atuar como vetores mecânicos de vários patógenos. Dada a possibilidade de veiculação de

bactérias resistentes por meio de moscas, o presente estudo buscou caracterizar a resistência a

antimicrobianos em Escherichia coli isoladas de dípteros muscoides coletados em

propriedades leiteiras, assim como a presença de genes de virulência relacionados à

colibacilose bovina. Musca domestica foi a espécie de díptero muscoide mais abundante nas

duas propriedades estudadas. As cepas de E. coli provenientes das duas propriedades

apresentaram diferenças quanto às frequências de resistência aos antimicrobianos testados por

disco difusão e exibiram frequências baixas ou nulas dos genes de fatores de virulência. A alta

frequência (72%) do grupo filogenético B1 entre as cepas multirresistentes (resistência ≥ a 3

classes de antimicrobianos), aliada a ausência de relação entre presença de multirresistência e

fatores de virulência (p>0,05), indica que a resistência antimicrobiana está associada às

bactérias comensais. A análise de perfil clonal das cepas multirresistentes, realizada por

Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE), mostrou ampla diversidade genômica, de modo

que, moscas diferentes podem veicular cepas com perfis genômicos diferentes, porém com os

mesmos genes de resistência antimicrobiana e/ou integron e que uma única mosca pode

veicular tanto cepas quanto clones com genes de resistência distintos. Moscas distintas

apresentaram integron de classe 1 com o mesmo arranjo genético identificado na análise do

sequenciamento. Uma vez que as moscas veiculam cepas de E. coli com perfis

multirresistentes diversos, é possível afirmar que dípteros muscoides contribuem para a

disseminação de genes de resistência a antimicrobianos no ambiente.

ABSTRACT

Rural environment facilitates muscoid diptera development that can act as mechanical vectors

of several pathogens. Given that flies can carry resistant bacteria, this study aimed to

characterize antimicrobial resistance in Escherichia coli isolated from muscoid diptera

collected in dairy farms, as well as the presence of virulence factors genes related to bovine

colibacillosis. Musca domestica was the most collected species in the two studied farms.

Escherichia coli strains from the two farms showed differences in antimicrobial resistance

frequencies tested by disk diffusion and showed low or no frequency to virulence factor

genes. The high frequency (72%) of phylogenetic group B1 among multidrug resistance

strains (resistant ≥ 3 classes), combined with the lack of relationship between the multidrug

resistance and virulence factors (p>0.05), suggest that the antimicrobial resistance is

associated with the commensal bacteria. The clonal profile analysis of the multiresistant

strains, performed by Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE), showed wide genomic

diversity, so that different flies may carry unrelated strains, but with the same antimicrobial

resistance genes and/or integron and, a single fly may carry strains and clones with distinct

resistance genes. Different flies presented class 1 integron with the same gene arrangement

identified by sequencing analyze. It is possible to affirm that flies contribute to the spread of

antimicrobial resistance genes in the environment, once they carry strains of E. coli with

diverse multiresistant profiles.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Região do município de Botucatu-SP, onde estão localizadas as duas propriedades

leiteiras estudadas (denominadas A e B), quanto à resistência antimicrobiana em E. coli

provenientes de dípteros muscoides...................................................................................... 33

Figura 2. Estrutura do integron de classe 1. A região cinza representa o sítio de inserção dos

cassetes gênicos relacionados à resistência antimicrobiana. Reproduzido de Lèvesque et al.

(1995). ................................................................................................................................. 39

Figura 3. Frequência relativa de E. coli resistentes* a cada um dos antimicrobianos testados.

Visualização dos diferentes perfis dos isolados nas duas propriedades leiteiras (A e B). ....... 47

Figura 4. Escherichia coli positiva para o teste de aproximação de disco. O alargamento do

halo de inibição (seta no topo) e o surgimento da “zona fantasma” (seta embaixo) indica a

produção de ESBL (β-lactamase de espectro estendido). ...................................................... 48

Figura 5. Padrão de digestão enzimática de AluI obtido no ensaio de RFLP da região variável

do integron de classe 1 (5’CS-3’CS) de E. coli isoladas de moscas. ...................................... 51

Figura 6. Desenho esquemático da sequência obtida a partir da amplificação dos iniciadores

5’CS e 3’CS. ........................................................................................................................ 52

Figura 7. Desenho esquemático do integron de classe 1 presente em cepas de E. coli isoladas

de dípteros muscoides. ......................................................................................................... 52

Figura 8. Dendrograma obtido pela técnica de PFGE a partir da digestão enzimática com

XbaI do DNA cromossômico de E. coli isoladas de dípteros muscoides coletados em

propriedades leiteiras da região de Botucatu, SP (2015) e os respectivos genes de resistência e

grupos filogenéticos. Padrão gerado por UPGMA, utilizando coeficiente de Dice com

tolerância e otimização de 1%. ............................................................................................. 55

Figura 9. Eletroforese em gel de agarose 0,8% dos plasmídeos extraídos pelo método de lise

alcalina, correspondentes às cepas de E. coli transconjugantes (A) e doadoras (B)................ 57

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Iniciadores utilizados para a detecção dos fatores de virulência, genes de resistência

e integrons em isolados de E. coli provenientes de dípteros muscoides. ................................ 36

Tabela 2. Iniciadores utilizados no esquema proposto por Clermont et al. (2000) e as

combinações de resultados possíveis. ................................................................................... 37

Tabela 3. Iniciadores relacionados a estruturas de integrons de classe 1 utilizados para a

conclusão das sequências de isolados de E. coli provenientes de dípteros muscoides. ........... 38

Tabela 4. Insetos coletados em duas propriedades da região de Botucatu, SP (2015)

organizados por amostra. Espécies e quantidades. ................................................................ 43

Tabela 5. Espécies e abundância de espécies de dípteros muscoides coletados em duas

propriedades leiteiras da região de Botucatu, SP (2015). ...................................................... 44

Tabela 6. Frequência relativa de E. coli resistentes* isoladas da superfície externa de dípteros

muscoides em duas propriedades leiteiras da região de Botucatu, SP (2015). ....................... 47

Tabela 7. Dados referentes ao perfil de resistência*, presença de plasmídeos e grupos

filogenéticos das cepas de E. coli multirresistentes isoladas de dípteros muscoides em

propriedades leiteiras da região de Botucatu, SP (2015). ..................................................... 49

Tabela 8. Cepas de E. coli selecionadas para a avaliação do perfil clonal organizadas de

acordo com o perfil fenotípico de resistência antimicrobiana. ............................................... 53

Tabela 9. Perfil de resistência fenotípica* e genotípica das cepas E. coli doadoras e

transconjugantes(t)

obtidas no ensaio de conjugação. ............................................................ 58

Tabela 10. Resultados para os genes de resistência a partir de DNA plasmidial extraído por

lise alcalina nas cepas de E. coli doadoras e transconjugantes, obtidos por PCR. .................. 59

Sumário

I - Introdução .............................................................................................................. 13

1.1. BOVINOCULTURA ............................................................................................. 14

1.1.1. Uso de antimicrobianos na bovinocultura ............................................................ 15

1.2. DÍPTEROS MUSCOIDES ..................................................................................... 16

1.2.1. Ecologia e biologia das moscas de importância pecuária ..................................... 17

1.2.2. Vetores de bactérias ............................................................................................. 18

1.3. Escherichia coli ...................................................................................................... 21

1.4. RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA ................................................................... 23

1.4.1. Elementos genéticos móveis ................................................................................ 24

1.4.2. Disseminação no ambiente e implicações ............................................................ 26

II – Objetivos ............................................................................................................... 29

2.2. Específico: ............................................................................................................. 30

III - Material e Métodos .............................................................................................. 31

3.1. Áreas de coleta ....................................................................................................... 32

3.2. Obtenção das amostras ........................................................................................... 32

3.3. Isolamento e identificação de E. coli....................................................................... 33

3.4. Caracterização fenotípica da sensibilidade aos antimicrobianos .............................. 34

3.4.1. Sensibilidade microbiana (antibiograma) ............................................................. 34

3.4.2. Produção de ESBLs – Método da aproximação de disco ...................................... 34

3.5. PCR para a pesquisa dos genes de virulência, resistência e integrons ...................... 35

3.5.1. Extração do DNA (método do choque térmico) ................................................... 35

3.5.2. PCR ..................................................................................................................... 35

3.6. Presença de plasmídeos .......................................................................................... 37

3.7. Classificação filogenética de E. coli........................................................................ 37

3.8. Caracterização dos integrons por Restriction Fragment – Length Polymorphism

(RFLP) e sequenciamento ............................................................................................. 38

3.9. Perfil clonal das cepas resistentes ........................................................................... 39

3.10. Ensaio de conjugação ........................................................................................... 39

3.11. Análise estatística ................................................................................................. 40

IV - Resultados ............................................................................................................. 41

4.1. Coleta dos insetos e isolamento de E. coli ............................................................... 42

4.2. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos ............................................................. 45

4.3. Genes relacionados à resistência a antimicrobianos e fatores de virulência ............. 46

4.4. Análises estatísticas ................................................................................................ 48

4.5. Plasmídeos e classificação filogenética de E. coli (Clermont et al., 2000) ............... 49


(RFLP) .......................................................................................................................... 51

4.7. Sequenciamento da região variável do integron de classe 1 ..................................... 51

4.8. Perfil clonal ............................................................................................................ 53

4.9. Conjugação ............................................................................................................ 56

V - Discussão ............................................................................................................... 60

VI – Conclusões ........................................................................................................... 68

VII - Referências Bibliográficas ................................................................................. 70

VIII – Apêndices ......................................................................................................... 86

APÊNDICE A – Resultado do ensaio de disco aproximação para a dectação fenotípica de

ESBL em cepas de E. coli doadoras e transconjugantes obtidas após conjugação. ......... 87

APÊNDICE B – Antibiograma da cepa transconjugante MA17d. Colônias hipermutantes

no interior do halo de inibição de sulfametazol/trimetoprim (SUT). ............................... 88

IX – Anexos ................................................................................................................. 89

ANEXO A – Declaração sobre bioética e biossegurança. .............................................. 90

ANEXO B – Declaração sobre a não infringência da lei nº 9610/98 e do direito autoral de

qualquer editora ............................................................................................................ 91

I - Introdução

Introdução | 14

1.1. BOVINOCULTURA

Os bovinos estão entre as primeiras espécies domesticadas na Europa. Estudos

arqueológicos têm apontado indícios das atividades de criação desde o período Neolítico

(Serjeantson, 2011), com o objetivo de exploração do poder de tração dos animais e produção

de leite (Ebersbach, 2010). A divisão da criação para diferentes finalidades, como para a

obtenção de carne ou leite, data do século XIX (Ebersbach e Schibler, 2003).

Atualmente, cerca de 150 milhões de produtores movimentam o mercado

econômico mundial de leite, sendo a Índia o maior produtor mundial e o Brasil o sexto

(FAO, 2016). No Brasil, segundo o último censo agropecuário realizado em 2006, a criação

de bovinos com aptidão leiteira esteve presente em 25% dos estabelecimentos (IBGE, 2009;

Brasil, 2014), ganhando destaque na economia e na geração de empregos (Zoccal et al.,

2008).

Os sistemas de produção incluem as formas de criação e manejo do gado leiteiro e

são classificados em extensivo, semi-intensivo e intensivo, de acordo com a produtividade do

rebanho e o grau técnico empregado (Embrapa, 2016).

Nos sistemas extensivos os animais são criados soltos no pasto com

suplementação alimentar apenas de sal comum, apresentando menor nível de aplicação

tecnológica, instalações simples e baixa produtividade. Já nos sistemas semi-intensivos, o

gado é manejado em semiconfinamento, recebendo suplementação alimentar a pasto com sal

enriquecido, silagem de milho, sorgo ou capim, geralmente durante a estação seca. Os

sistemas intensivos são destinados à criação de bovinos com elevada produção leiteira que

permanecem confinados constantemente em estábulos. Tais sistemas empregam maiores

níveis de tecnologia, dietas com altos valores nutricionais e mão de obra especializada (Assis

et al., 2005; Sarcinelli et al., 2007; Brasil, 2015).

Em sistemas extensivos e semi-intensivos em que a principal fonte de alimento é

o pasto, práticas de rodízio de pastagens são importantes para manter a qualidade das plantas

forrageiras e o controle de parasitos que apresentam algum estágio do ciclo de vida

dependente do solo (Florião, 2013). A prática consiste na divisão do pasto em piquetes que

são pastejados alternadamente de modo que haja um período de descanso (Martha Júnior et

al., 2003).

Adicionalmente, práticas de manejo que visam o monitoramento da sanidade

animal são fundamentais para a manutenção da produtividade dos rebanhos leiteiros (Florião,

2013). Nesse sentido, inclui-se o uso terapêutico e profilático de antimicrobianos e o controle

Introdução | 15

populacional de artrópodes – insetos e ácaros (Bogard e Stobberingh, 2000; Rutz e Geden,

2010).

1.1.1. Uso de antimicrobianos na bovinocultura

A utilização de antimicrobianos na pecuária é destinada a fins terapêuticos,

profiláticos e como promotores de crescimento (Ventola, 2015).

Nas propriedades leiteiras, a principal razão para a administração de

antimicrobianos consiste no tratamento e prevenção da mastite bovina (Pol e Ruegg, 2007),

uma vez que várias espécies de bactérias, tais como Streptococcus agalactiae, Staphylococcus

aureus e Mycoplasma spp. (contagiosos), Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae

subsp. dysgalactiae, Escherichia coli e Klebsiella spp. (ambientais), entre outros, são capazes

de infectar as glândulas mamárias das vacas e produzir enfermidade (Oliver e Murinda, 2012).

O tratamento terapêutico é destinado aos animais com manifestações clínicas de

mastite, enquanto o profilático às vacas em período não lactante (seco), e por esse motivo

popularmente conhecido como “terapia da vaca seca” (Oliver e Murinda, 2012). Ambas as

intervenções são administradas principalmente por via intramamária, mas outras vias também

podem ser utilizadas (Royster e Wagner, 2015).

Além disso, o tratamento com antimicrobianos faz-se necessário em bezerros com

menos de trinta dias de vida que apresentam quadro de diarreia com sinais sistêmicos, uma

vez que independente do agente infeccioso (bactérias, vírus ou protozoários), há aumento do

crescimento bacteriano de coliformes, podendo evoluir para bacteremia e endotoxemia

(Constable, 2009).

Nesse contexto, a administração de antimicrobianos principalmente em doses

subterapêuticas é fonte de constantes debates, pois, apesar de resultar em benefícios como o

aumento da produtividade, redução de patógenos, menor ocorrência de doenças, de morbidade

e mortalidade, gera resíduos de antimicrobianos nos alimentos que podem contribuir para a

seleção de resistência antimicrobiana em patógenos de humanos, devido à ingestão de carne,

leite e derivados. Além disso, a prática colabora para a seleção de resistência em micro-

organismos comensais constituintes da microbiota intestinal de animais saudáveis, que podem

atuar como reservatórios de genes de resistência e na disseminação a outros comensais e

patógenos (Bogard e Stobberingh, 2000; Oliver et al., 2011; Ventola, 2015).

A presença de bactérias comensais resistentes a antimicrobianos parece estar

relacionada à idade dos animais, de forma que animais mais jovens apresentariam maior

quantidade de bactérias resistentes quando comparados aos mais velhos. Nesse sentido,

Introdução | 16

Khachatryan et al. (2004) buscaram relacionar idade e resistência antimicrobiana em bovinos

leiteiros, comprovando, experimentalmente, o pressuposto, e sugerindo que o fenômeno pode

estar associado à dieta já que bezerros que receberam leite apresentaram maior frequência de

cepas resistentes. Este evento pode ser explicado pela associação entre genes de resistência e

genes vantajosos para o metabolismo nutricional das bactérias, no mesmo plasmídeo, como

adesinas e sideróforos. Desse modo, cepas resistentes podem persistir mesmo na ausência de

pressões seletivas (Khachatryan et al., 2004).

1.2. DÍPTEROS MUSCOIDES

A ordem Diptera apresenta mais de 150 mil espécies de moscas e mosquitos que

possuem um par de asas anteriores funcionais e o par de asas posteriores modificados em

halteres, sendo esta a principal sinapomorfia que a distingue das demais ordens da Classe

Insecta (Yeates et al., 2007), de modo que, compreende-se por dípteros muscoides os insetos

popularmente conhecidos como moscas, pertencentes a divisão Schizophora da infraordem

Muscomorpha (McAlpine, 1981 apud Borges, 2006). Nesse contexto, as famílias

Calliphoridae, Sarcophagidae, Muscidae, Faniidae e Anthomyiidae destacam-se devido à

sinantropia e a importância médico-sanitário que apresentam (Linhares, 1979).

Povolný (1971) definiu sinantropia como um fenômeno ecológico baseado na

biocenose, ou seja, a coabitação interativa de espécies diferentes no mesmo ambiente, de

modo que a antropobiocenose acontece quando ambientes modificados pelo homem, através

das habitações humanas e dos animais domésticos, permitem a biocenose, sendo os animais

sinantrópicos componentes espontâneos. Analogamente, dípteros simbovinos são aqueles que

se relacionam com a antropobiocenose através das excretas de ruminantes domésticos

(Povolný, 1971).

A sinantropia em dípteros muscoides é comum (Linhares, 1979). Diferentes

espécies apresentam maior ou menor grau de dependência da associação com o homem de

acordo com as exigências tróficas e ecológicas, sendo fezes e matéria orgânica em

decomposição as principais fontes alimentares de moscas sinantrópicas adultas (Povolný,

1971). Por esse motivo, o ambiente rural, assim como o urbano, demonstra-se propício ao

desenvolvimento dessas espécies de moscas.

Dentre as espécies de importância pecuária destacam-se Musca domestica

(Linnaeus, 1758), Stomoxys calcitrans (Linnaeus, 1758) e Haematobia irritans (Linnaeus,

1758), tanto pela possibilidade de veiculação mecânica e biológica de patógenos, quanto pelo

estresse e consequente perda de peso que ocasionam aos bovinos devido ao hábito

Introdução | 17

hematófago de S. calcitrans e H. irritans (Brito et al., 2008), expondo o gado a micro-

organismos patogênicos e implicando na redução do leite produzido (Rutz e Geden, 2010).

1.2.1. Ecologia e biologia das moscas de importância pecuária

O esterco eliminado pelo gado constitui em criadouros para várias espécies de

moscas e outros artrópodes como besouros, vespas e formigas (Marchiori, 1997; Marchiori et

al., 2001). No entanto, algumas espécies como M. domestica, apresentam comportamento

comunicativo, isto é, a circulação entre ambientes microbiologicamente contaminados (fezes

e matéria orgânica em decomposição) e imediações humanas (fontes de alimentos) (Povolny,

1971).

Musca domestica é cosmopolita e estreitamente associada à antrobiocenose, sendo

troficamente adaptada a alimentos e lixo humano, mas mantém a coprofagia em algumas

situações. Possuem alta capacidade de voo chegando a alcançar cerca de 22 km de distância a

partir do ponto de origem, o que aliado ao comportamento comunicativo marcante da espécie,

permite sua classificação como importante vetor mecânico de uma extensa lista de patógenos

que inclui vírus, bactérias, fungos, protozoários e ovos de helmintos (Greenberg e Povolný,

1971; Greenberg 1971; Linhares, 1979). Indivíduos dessa espécie vivem de 15 a 70 dias e a

fêmea ovipõe em média 120 ovos, sendo que o ciclo de vida apresenta duração de 10 a 14 dias

a depender das condições climáticas (temperatura e umidade) (Brito et al., 2008).

Stomoxys calcitrans são moscas simbovinas de hábito alimentar hematófago,

ativas durante a manhã e no final da tarde, atacam preferencialmente bovinos, mas,

ocasionalmente realizam repasto sanguíneo em outros animais incluindo o homem. A fêmea

ovipõe 40 a 80 ovos a cada postura e o desenvolvimento das larvas ocorre em matéria

orgânica em decomposição fermentada e úmida, e o ciclo de vida consiste em 30 dias quando

em estações de temperaturas elevadas. As fêmeas vivem em média 17 dias e os machos 26

dias (Greenberg, 1973).

Haematobia irritans também são moscas simbovinas hematófagas. As fêmeas

vivem em média 20 dias e ovipõem cerca de 20 ovos entre a massa fecal de bovinos e o solo,

sendo que o ciclo apresenta duração de 10 a 15 dias. Permanecem durante a maior parte do

tempo sobre o hospedeiro bovino, mas o repasto sanguíneo em outros mamíferos como

equinos, ovinos e caninos também pode ocorrer (Brito et al., 2005).

Introdução | 18

1.2.2. Vetores de bactérias

A relação de dípteros muscoides com excrementos de animais possibilita a

veiculação de bactérias entéricas (Cadavid-Sanchez, 2015). Desde antes da década de 1970 o

tema vem sendo abordado em trabalhos discutidos por Greenberg (1973) que buscaram

relacionar surtos de diarreia aguda, causada por Salmonella, Shigella e E. coli, com a

proliferação de moscas. Além disso, foi elaborado o danger index com o propósito de

representar numericamente a importância sanitária de moscas, levando em consideração a

frequência de visitação a ambientes contaminados e a sinantropia (Linhares, 1979).

Entre os anos 1940 e 2000, as bactérias representaram uma porcentagem

significativa (54,3% incluindo Rickettsia) dos patógenos envolvidos nas Doenças Infecciosas

Emergentes (EID, do inglês Emerging Infectious Diseases), sendo que 22,8% das EID foram

relacionadas a insetos vetores (Jones et al., 2008).

Nas últimas décadas, diversos trabalhos têm sido conduzidos a fim de investigar o

papel das moscas na veiculação de bactérias patogênicas, assim como a disseminação que

desempenham no ambiente. Em razão do comportamento comunicativo de M. domestica ser

bem estabelecido (Povolny, 1971), grande parte das pesquisas buscaram demonstrar o papel

dessa espécie na epidemiologia de doenças infecciosas.

Entre os trabalhos mais notáveis está o de Fontedar et al. (1992) que buscaram

quantificar e caracterizar o perfil microbiano (bactérias, fungos e protozoários) de

M. domestica coletadas em ambiente hospitalar, na Índia, e encontraram que tais moscas são

mais propensas a veicular bactérias potencialmente patogênicas, quando em comparação com

o grupo controle.

Em 1999, Moriya et al., investigaram as origens de um surto de infecções por

E. coli produtora de verotoxina (VTEC) do sorogrupo O157:H7 em uma escola infantil da

zona rural do Japão. Neste trabalho os autores conseguiram encontrar uma forte relação clonal

entre as cepas de E. coli isoladas de M. domestica coletadas na região e as envolvidas no

surto. Ao constatarem que as moscas vinham de uma fazenda próxima, sugeriram, pela

primeira vez, que a contaminação poderia ter acontecido dado o contato das moscas com os

alimentos ingeridos pelas crianças.

Complementando os estudos de Moriya et al. (1999), Kobayashi et al. (1999)

buscaram verificar a via de transmissão de E. coli O157:H7. Para isso, alimentaram as moscas

com bactérias e concluíram que a liberação de E. coli O157:H7 viáveis era possível até três

dias após a ingestão, apontando que a disseminação de bactérias poderia ocorrer não somente

pelo contato com superfícies contaminadas, em que as moscas atuariam como vetores

Introdução | 19

mecânicos, mas também através das excretas e regurgitados, em uma relação mais próxima a

vetores biológicos.

Desse modo, três vias de transmissão de patógenos por moscas têm sido

consideradas: transporte e contato através do exoesqueleto, deposição de fezes e regurgitação

(Rahuma et al. 2005).

Alam e Zurek (2004) buscaram isolar E. coli O157:H7 a partir de moscas

coletadas em vários ambientes de fazenda de gado bovino e apontaram que M. domestica

poderia transportá-las no interior da fazenda e possivelmente a fazendas vizinhas e ambiente

urbano. Posteriormente, Ahmad et al. (2007) elaboraram experimentos a fim de testar a

transmissão de E. coli O157:H7 presente em M. domestica a bezerros, concluindo que a

transmissão era possível.

No Brasil, poucos estudos com essa temática têm sido conduzidos. Destacam-se

os trabalhos de Paraluppi et al. (1996) que pretendiam isolar bactérias patogênicas de moscas

coletadas em feiras livres, associando-as a contaminações de alimentos a venda; Moraes et al.

(2004) que buscaram relacionar isolados de vacas com mastite com os obtidos de

S. calcitrans; Castro et al. (2007, 2008a, 2008b) que apresentaram dados referentes à

microbiota de S. calcitrans com isolados de enterobactérias (patogênicas e não patogênicas),

Pseudomonas, Staphylococcus e Enterococcus; Kappel et al. (2013) que pesquisaram

bactérias presentes na superfície externa de insetos alados (moscas, besouros, borboletas, etc)

coletados em ambiente hospitalar; Almeida et al. (2014) que procuraram isolar e determinar o

perfil de sensibilidade antimicrobiana de E. coli, Salmonella spp. e Sthaphylococcus spp. de

moscas coletadas em fazendas.

Apesar de muito ser conhecido sobre o papel das moscas como vetores de

bactérias patogênicas, poucas pesquisas abordaram a atuação de moscas na disseminação da

resistência antimicrobiana no ambiente, sendo que até o momento não há referências de tais

estudos no Brasil.

Marshall et al. (1990) foram os primeiros a hipotetizar que as moscas em conjunto

com aerossóis e outros animais, poderiam representar uma via de disseminação de genes de

resistência a antimicrobianos entre os animais de uma fazenda, quando buscaram entender as

condições naturais que contribuíam para a disseminação de bactérias e plasmídeos no

ambiente. Adicionalmente, a presença de moscas transportando bactérias resistentes em

outros ambientes, como o hospitalar, pode significar condições sanitárias precárias, além de

contribuir para a disseminação de resistência e de patógenos dentro do hospital, do hospital

para a comunidade e da comunidade para o hospital (Rahuma et al. 2005).

Introdução | 20

O cultivo de bactérias patogênicas resistentes a antimicrobianos, realizado a partir

de moscas coletadas em restaurantes por Macovei e Zurek (2006), colabora para a hipótese

que relaciona a incidência de moscas com eventos de diarreia, o que, aliado à presença de

elementos genéticos móveis ligados a genes de resistência nessas cepas, indica que

M. domestica – alvo do estudo – pode constituir em uma via de disseminação de genes

também nesses ambientes.

Em 2010, Rybaríková et al. (2010), ao pesquisarem resistência antimicrobiana em

isolados de moscas simbovinas e de bezerros, hipotetizaram que as cepas resistentes presentes

nas moscas seriam originárias dos bezerros, uma vez que ambas apresentaram o mesmo perfil

de resistência (fenotípico e genotípico) e clonal, sugerindo que as moscas ao terem contato

com os bezerros adquiririam bactérias resistentes e disseminariam clones pelo ambiente,

comprovando a hipótese de Marshall et al. (1990).

Da mesma forma, Usui et al. (2013, 2015) encontraram clones de E. coli com o

mesmo perfil de resistência antimicrobiana em moscas e em fezes de bezerros e

posteriormente sugeriram que as moscas podem atuar na disseminação de genes de resistência

não só no interior de fazendas mas também entre fazendas. Além disso, cepas resistentes de

E.coli presentes em moscas também poderiam ser transmitidas à comunidade (Blaak et al.,

2014).

Nesse contexto, os animais de produção constituiriam em reservatórios de cepas

bacterianas portadoras de resistência a antimicrobianos, e os insetos sinantrópicos,

principalmente as moscas, atuariam como agentes dispersores de bactérias resistentes e,

consequentemente, dos genes que portam, de modo que, a disseminação do meio rural para o

urbano seria plausível (Zurek e Ghosh, 2014).

Solà-Ginés et al. (2015), ao pesquisarem resistência antimicrobiana em E. coli

isoladas de moscas coletadas em granjas de frangos, discutem que o estudo das bactérias

obtidas por essa via fornecem informações sobre a microbiota dos animais, mas que também

moscas podem atuar introduzindo bactérias portadoras de genes de resistência e virulência

colaborando para que ocorra a colonização dos animais com elementos genéticos diferentes

daqueles já existentes.

Recentemente, Schaumburg et al. (2016) realizaram um levantamento da

resistência em bactérias veiculadas por moscas em áreas rurais e urbanas da cidade de

Münster na Alemanha e compararam com isolados de humanos. Frente à elevada similaridade

dos isolados, sugeriram que haveria uma fonte comum ou transmissão de bactérias das

Introdução | 21

moscas aos humanos. Ressaltaram, porém, que os dados desse estudo não foram suficientes

para indicar a fonte da resistência e o sentido da transmissão.

1.3. Escherichia coli

Escherichia coli é constituinte da microbiota entérica humana e animal. Apesar de

algumas linhagens estarem relacionadas a doenças intestinais e extraintestinais (Clermont et

al., 2000), a maioria não é considerada patogênica (Madigan et al., 2010). As linhagens

patogênicas são divididas em grupos (patotipos), de acordo com as doenças ou toxinas que

produzem: E. coli entero-hemorrágica (EHEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli

enteropatogênica (EPEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC),

E. coli que adere difusamente (DAEC) e E. coli extraintestinais (ExPEC) (Kaper et al., 2004).

Escherichia coli entero-hemorrágica (EHEC) é classicamente caracterizada pela

presença de verotoxinas (também denominadas toxinas Shiga-like), codificadas pelos genes

vt1 e/ou vt2, e pela lesão attaching and effacing (A/E), produto da expressão de genes

localizados na ilha de patogenicidade denominada locus of enterocyte effacement (LEE), na

qual se destaca o gene eae, que promove a expressão da intimina, responsável pela adesão e

indução da lesão no tecido intestinal do hospedeiro. As E. coli produtoras de verotoxina

(VTEC) podem ser consideradas um subgrupo de EHEC, pois apresentam apenas vt1 e/ou vt2.

Ruminantes, principalmente bovinos saudáveis, são considerados reservatórios de EHEC, e

infecções em humanos produzem Síndrome Hemolítica Urêmica (HUS) e colite hemorrágica

(HC) (Nataro e Kaper, 1998; Kaper et al., 2004; Piérard et al., 2012).

Já E. coli enterotoxigênica (ETEC) apresenta dois grupos de enterotoxinas, as

enterotoxinas termolábeis (LTs) e as termoestáveis (STs), e podem causar diarreia em

humanos ou animais dependendo dos fatores de colonização que expressam – CFAs, em

humanos e K88 ou K99, em animais (Kaper et al., 2004).

Cepas de E. coli enteropatogênica (EPEC) são caracterizadas pela produção da

lesão A/E devido a expressão dos genes contidos na ilha de patogenicidade LEE e são ligadas

a quadros de diarreia infantil aguda, muitas vezes fatal. São denominadas EPEC típicas as

cepas que possuem plasmídeo EAF (fator de aderência de EPEC) (Kaper et al., 2004).

Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC) e Shigella spp. são estreitamente

relacionadas chegando a ser indistinguíveis a nível de espécies, de forma que alguns poucos

testes bioquímicos as diferenciam. Porém, ambas apresentam os mesmos fatores de virulência

essenciais, responsáveis pela penetração das células do epitélio intestinal e apoptose de

macrófagos infectados, gerando colite inflamatória (Kaper et al. 2004).

Introdução | 22

Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) não apresenta secreção de

enterotoxinas LT e ST e são caracterizadas por um padrão especial de agregação das células

semelhante a pilhas de tijolos. Podem apresentar citotoxinas e enterotoxinas ShET1, Pic,

EAST1, Pet e fatores de colonização AAFs. Também são relacionadas à diarreia

principalmente em crianças (Nataro e Kaper, 1998; Kaper et al., 2004).

Escherichia coli que adere difusamente (DAEC) possuem padrão de adesão

difuso, envolvendo o fator de colonização F1845 na maioria dos casos. Geralmente estão

envolvidas em episódios diarreicos em crianças de um a cinco anos de idade (Nataro e Kaper,

1998; Kaper et al., 2004).

As E. coli extraintestinais (ExPEC) são aquelas envolvidas em infecções não

intestinais. Compreendem as E. coli uropatogênicas (UPEC), que causam infecção no trato

urinário; E. coli associadas a meningite/sepse (MNEC) que são a principal causa de meningite

em recém nascidos e E. coli patogênica para aves (APEC), responsável por infecções

respiratórias, pericardite e sepse em aves (Kaper et al., 2004).

A microbiota é resultante de milhões de anos de coevolução entre micro-organismos

e o hospedeiro, podendo ser considerada uma relação mutualística, dada a participação em

processos fisiológicos dos hospedeiros que em contrapartida fornecem nichos e nutrientes

necessários à sobrevivência microbiana. No trato gastrintestinal humano a microbiota

contribui para a prevenção da colonização por patógenos, na produção de vitaminas e

auxilia na digestão, além de fazer parte de mecanismos regulatórios do sistema imune do

hospedeiro e do desenvolvimento do tecido linfoide associado ao intestino (Kamada et al.,

2013b).

Bactérias comensais e patogênicas ocupam nichos ecológicos intestinais

semelhantes, de modo que o equilíbrio populacional da microbiota permite a prevenção da

colonização e proliferação de patógenos e patobiontes. Por outro lado, a barreira epitelial do

hospedeiro é fundamental para impedir a disseminação das bactérias comensais pelo

organismo, o que resultaria em choque séptico letal (Kamada et al., 2013a). Porém, Marshall

et al. (2009) sugeriram que a definição de micro-organismos comensais ou patogênicos pode

ser relativa, estando associada à condição física do hospedeiro.

Atualmente, são admitidos sete grupos filogenéticos para E. coli (A, B1, B2, C, D,

E, F) e um pertencente à Escherichia clado I (Clermont et al., 2013), estando os grupos A e

B1 associados às cepas comensais (Clermont et al., 2000), porém não há correspondência

entre os grupos filogenéticos e os patogênicos (Croxen et al., 2013).

Introdução | 23

Cepas de E. coli provenientes de animais de produção frequentemente apresentam

multirresistência a antimicrobianos que pode ser disseminada para a comunidade (Vieira et

al., 2011). Nesse contexto, Verdier et al. (2012) discutiram o papel de E. coli comensal como

reservatório de genes codificadores de resistência a antimicrobianos, assim como a

possibilidade de transferência, e sugeriram que cepas provenientes de animais saudáveis

poderiam constituir em ferramenta de monitoramento.

1.4. RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA

O grupo dos β-lactâmicos está entre os antimicrobianos mais empregados para o

tratamento de diversas infecções em humanos e outros animais. Atua interferindo na síntese

da parede celular bacteriana, sendo a resistência conferida à produção da enzima β-lactamase

que promove a hidrólise do anel β-lactâmico (Aminov e Mackie, 2007). Entre essas enzimas,

as β-lactamases de espectro estendido (ESBLs) têm sido frequentemente estudadas (Pereira et

al., 2003) e são definidas pela capacidade de hidrolisar penicilinas, cefalosporinas de terceira

geração e monobactam sendo inibidas pelo ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam (Shah

et al., 2004; Perez et al., 2007).

O isolamento de cepas de E. coli produtoras de β-lactamases em animais e

alimentos de origem animal é frequente, sendo o grupo CTX-M o mais encontrado (Paterson e

Bonomo, 2005; Lee et al., 2010). Adicionalmente, o isolamento de cepas de E. coli e

Klebsiella produtoras de ESBLs tem sido documentado em casos de infecções hospitalares

(Bonnedahl et al., 2009) e em amostras de E. coli isoladas de fezes bovinas, suínas e de aves

(Horton et al., 2011).

Segundo Garcia-Alvarez et al. (2012), a descoberta de cepas de E. coli produtoras

de ESBLs provenientes de fazendas de animais de produção contribuiu para a associação

entre o genótipo presente em E. coli isoladas de infecções animais com amostras

diagnosticadas em humanos. A capacidade de disseminação das ESBLs está relacionada à

localização em elementos genéticos móveis, porém as vias de transmissão parecem ser mais

complexas do que o suposto, e os dados referentes aos reservatórios na comunidade ainda são

escassos, devido à dispersão de genes de β-lactamases no ambiente ser pouco conhecida

(Lachmayr et al. 2009). Assim, a melhor compreensão da complexidade dos processos

envolvidos na disseminação da resistência a antimicrobianos poderia conduzir a um melhor

controle (O’Brien, 2002).

As fluorquinonolonas, derivadas das quinolonas, também são amplamente usadas,

atuam nas topoisomerases DNA girase e topoisomerase IV impedindo a replicação, de modo

Introdução | 24

que a resistência mais comum consiste na mutação dos genes, promovendo a substituição de

aminoácidos nas subunidades Gyr (A e/ou B) da DNA girase e ParC ou ParE na

topoisomerase IV, cuja região geralmente mutada é denominada Região Determinante de

Resistência à Quinolona (QRDR, do inglês Quinolone-Resistance-Determining Region)

(Jacoby, 2005).

Outros mecanismos de resistência a quinolonas como as bombas de efluxo,

proteção do sítio-alvo e alteração dos antimicrobianos envolvem a participação de genes

localizados em plasmídeos (Bolon, 2011). As bombas de efluxo proteicas QepA e OqxAB,

codificadas pelos genes qepA e oqxAB, promovem a expulsão de fluorquinolonas para fora da

célula bacteriana (Hernández et al., 2011). Já as proteínas Qnr protegem as topoisomerases da

atividade das quinolonas, sendo que até o momento, cinco famílias Qnr são conhecidas (genes

qnrA, qnrB, qnrS, qnrC e qnrD) (Hernández et al., 2011). Quanto ao mecanismo de alteração

do antimicrobiano é descrita a inativação enzimática de fluorquinolonas por uma variante da

acetiltransferase AAC(6’)-Ib (Jacoby et al., 2014).

As tetraciclinas correspondem à outra classe de antimicrobianos com ação em

vários micro-organismos (de bactérias gram-positivas e gram-negativas a protozoários).

Atuam inibindo a síntese proteica ao impedir a ligação do RNA transportador ao ribossomo,

de modo que a maioria dos genes que promovem resistência expressam sistemas de efluxo e o

restante uma proteína que protege o ribossomo (Chopra e Roberts, 2001).

1.4.1. Elementos genéticos móveis

De acordo com Frost et al. (2005) “elementos genéticos móveis são segmentos de

DNA que codificam enzimas e outras proteínas que medeiam o movimento do DNA dentro

do genoma (mobilidade intracelular) ou entre células bacterianas (mobilidade intercelular)”.

Os movimentos intracelulares correspondem a eventos de recombinação no

genoma realizados por transposons, que podem se integrar a fagos e plasmídeos, podendo ou

não ser transferidos a outras células através dos mecanismos de transferência horizontal

(HGT, do inglês horizontal gene transfer) (Frost et al., 2005).

Entre os movimentos intercelulares estão os mecanismos de transferência

horizontal de genes: transformação, transdução e conjugação. A transformação necessita de

bactérias naturalmente competentes para ocorrer; a transdução ocorre de maneira

independente da célula bacteriana, uma vez que consiste no empacotamento acidental de

DNA bacteriano no capsídeo do bacteriófago, que ao infectar novas células o transfere; a

conjugação também é um sistema independente, pois necessita da presença de um plasmídeo

Introdução | 25

conjugativo ou de elementos conjugativos integrados ao cromossomo como os transposons

conjugativos (Frost et al., 2005).

Desse modo, é possível distinguir três elementos genéticos de importância para a

disseminação de resistência a antimicrobianos – plasmídeos, integrons e transposons (Stokes e

Gillings, 2011).

Por definição, plasmídeos são elementos genéticos extracromossomais, capazes de

autorreplicação e que não carregam genes essenciais para o metabolismo bacteriano

(Carattoli, 2009). Podem ser classificados de acordo com os grupos de incompatibilidade

(Inc), com base no fato que plasmídeos com o mesmo sistema de replicação são incompatíves

e, portanto, não se propagam na mesma célula (Carattoli, 2009).

Nos plasmídeos dois conjuntos de genes são necessários para a conjugação, os

genes de mobilidade (MOB) e do complexo de formação do par de acoplamento (MPF)

associado a membrana, que produz um sistema de secreção tipo IV (T4SS), de modo que

plasmídeos conjugativos são aqueles que apresentam complexo MPF próprio. Os plasmídeos

mobilizáveis possuem MOB, mas não apresentam MPF e podem utilizá-lo de outros

elementos genéticos presentes na célula bacteriana a fim de realizar conjugação, enquanto os

não mobilizáveis não possuem nenhum dos dois conjuntos de genes (MOB e MPF) (Smillie et

al., 2010).

Os plasmídeos geralmente apresentam genes de resistência a antimicrobianos o

que, aliado à conjugação e a possibilidade de agregação de outros elementos genéticos

(integrons e transposons), demonstra o papel significativo que desempenham na disseminação

dessa resistência (Carattoli, 2013).

Os integrons foram descritos pela primeira vez por Stokes e Hall (1989). São

elementos genéticos que promovem a integração de cassetes gênicos através de recombinação

sítio-específica e são constituídos pelo gene da integrase (enzima que atua na integração do

cassete gênico), um sítio de recombinação e o promotor (Koczura et al., 2013; Ravi et al.,

2014). Podem ser divididos em dois grupos, os integrons de resistência e os superintegrons

(Fluit e Schmitz, 2004).

Integrons de resistência não são naturalmente móveis, pois a integrase atua apenas

na movimentação dos cassetes gênicos, porém, frequentemente estão associados a sequências

de inserção, transposons e plasmídeos conjugativos que garantem a mobilidade e

disseminação dos cassetes de resistência a antimicrobianos. São classificados em classes de

acordo com a similaridade genética da integrase (gene intI), sendo que até o momento cinco

Introdução | 26

classes são conhecidas (classe 1, 2, 3, 4 e 5). Os integrons de classe 1 são os mais comuns e os

de classe 4 e 5 presentes em Vibrio spp. (Mazel, 2006; Ravi et al., 2014).

Os superintegrons localizam-se no cromossomo bacteriano e são grandes, uma

vez que possuem mais de 20 cassetes gênicos com funções variadas (Fluit e Schmitz, 2004;

Mazel, 2006).

A estrutura clássica dos integrons de classe 1, no sentido 5’ a 3’ da sequência,

compreende a integrase (intI1), o sítio de recombinação (attI), os cassetes gênicos com seus

respectivos sítos de recombinação (attC) e uma região 3’ conservada apresentando os genes

qacΔE e sul1, que conferem resistência a quaternário de amônio e sulfonamidas,

respectivamente (Mazel, 2006). No entanto, integrons de classe 1 não usuais apresentam o

gene sul3 na região 3’ conservada (Sáenz et al., 2010).

Acredita-se que os integrons de classe 1 tenham surgido a partir da captura do

integron de classe 1 cromossomal de betaproteobactérias ambientais, por um transposon da

família Tn402, evento que tem favorecido a disseminação de genes de resistência no ambiente

e possibilitado o uso dessa classe de integron como indicativo de poluição gerada pela

atividade humana (Gillings et al., 2015).

Já os transposons são caracterizados por um fragmento de DNA com duas

sequências de inserção nas extremidades (Mazel, 2006), sendo que um grupo particular de

transposons apresenta capacidade de conjugação (transposons conjugativos). Tais transposons

apresentam características de transposons clássicos e de bacteriófagos. Semelhante a

transposons clássicos, transposons conjugativos excisam e integram ao DNA de plasmídeos

conjugativos quando apresentam forma circular fechada e são transferidos por conjugação,

apesar de não se replicarem. Por outro lado, apresentam características de excisão e integração

semelhante a fagos temperados (Salyers et al., 1995).

1.4.2. Disseminação no ambiente e implicações

Resultados obtidos em análise retrospectiva, quanto à susceptibilidade

antimicrobiana em E. coli indicaram que a seleção de mecanismos de resistência estaria

temporalmente relacionada ao uso de antimicrobianos na medicina humana e veterinária

(Tadesse et al., 2012).

Nesse sentido, Marshall et al. (2009) ressaltaram que o uso de antimicrobianos na

pecuária, inclusive como aditivo na alimentação, tem contribuído para a seleção de genes de

resistência em bactérias comensais, localizados em elementos móveis como transposons e

plasmídeos. Isso merece atenção especial, pois indica a possibilidade de transferência gênica

Introdução | 27

entre bactérias provenientes de diferentes animais, as associadas aos humanos ou entre

comensais e patógenos. Dessa forma, o estudo da resistência antimicrobiana em bactérias não

patogênicas é fundamental para a melhor compreensão da distribuição ambiental dos genes,

dada a possibilidade de transferência a bactérias patogênicas (Lachmayr et al., 2009).

Devido ao contato que algumas espécies de dípteros muscoides estabelecem com

as fezes de bovinos, torna-se notável a possibilidade de veiculação de bactérias resistentes a

antimicrobianos, fato que contribui para a alocação das moscas nas rotas de disseminação de

resistência antimicrobiana (Rybaríková et al., 2010). Isto, aliado à distribuição de E. coli em

hospedeiros animais ou humanos e no ambiente, e à versatilidade patógeno/comensal da

espécie, permite que estudos direcionados à abordagem de cepas comensais como

reservatórios genéticos, assim como a contribuição com a emergência de fatores de virulência

e resistência sejam conduzidos (Tenaillon et al., 2010). Além disso, trabalhos desenvolvidos

com E. coli podem contribuir para a orientação de estudos em outras bactérias do mesmo

nicho (O’Brien, 2002).

No ambiente, a participação das moscas na disseminação geralmente não é

considerada, sendo associada a alimentos de origem animal, pelo contato direto com animais

ou através de rotas ambientais (Costa et al., 2013), que geralmente incluem os animais

domésticos, seus excrementos e os vegetais cultivados, de modo que um fator importante para

a dispersão de bactérias resistentes pode ser a aplicação de esterco como fertilizante

(Khachatourians, 1998; Marshall et al., 2009; Costa et al., 2013). Isto, aliado ao emprego de

antimicrobianos na pecuária, colocaria as fazendas como fontes de genes e de bactérias

resistentes a antimicrobianos, de modo que entender a contribuição da prática agropecuária

para a disponibilização de genes de resistência no ambiente é essencial (Wichmann et al.,

2014). No entanto, apesar de vários estudos terem como tema a resistência antimicrobiana no

ambiente, análises mais abrangentes sobre os elementos genéticos e o perfil clonal das cepas

presentes na disseminação são secundárias (Novais et al., 2013).

Considerando que a ecologia de genes de resistência antimicrobiana e de

virulência no ambiente não é bem compreendida (Macovei e Zurek, 2006), a abordagem de

dípteros muscoides como vetores mecânicos de bactérias resistentes a antimicrobianos

contribuiria para o desenvolvimento de estudos mais completos sobre a disseminação da

resistência antimicrobiana, não só em termos epidemiológicos clássicos como também

moleculares, uma vez que a relação de dípteros muscoides com fezes de bovinos possibilita a

veiculação de bactérias da microbiota intestinal desses animais.

Introdução | 28

A possibilidade de classificação de E. coli em comensais ou em potenciais

patógenos permite que estudos sobre resistência antimicrobiana e fatores de virulência

relacionados a esses grupos sejam conduzidos, uma vez que E. coli não patogênica pode

significar um importante reservatório de genes de resistência antimicrobiana, sendo a

proximidade entre o ambiente animal e humano um provável fator para a troca de genes entre

bactérias de origens distintas (Liebana et al., 2006).

Assim, estudos de resistência antimicrobiana em isolados animais são

fundamentais para a melhor compreensão do papel dos hospedeiros, e das espécies

ecologicamente associadas a eles, nos processos de disseminação e de eventos de

transferência horizontal dos genes de resistência a antimicrobianos entre cepas comensais e

patogênicas. Nesse sentido, este projeto propõe o isolamento, identificação e a caracterização

fenotípica e genotípica da resistência de E. coli isoladas de dípteros muscoides em

propriedade rural leiteira; a detecção de fatores de virulência relacionados à colibacilose

bovina e a avaliação da capacidade de disseminação dos genes de resistência através da

presença de plasmídeos, ensaios de conjugação e perfil clonal das cepas isoladas.

II – Objetivos

Objetivos | 30

2.1. Objetivo Geral: Caracterizar a resistência fenotípica e genotípica a antimicrobianos e

fatores de virulência em E. coli isoladas de dípteros muscoides presentes em propriedade

leiteira.

2.2. Específicos:

1. Isolar e identificar cepas de E. coli em amostras de dípteros muscoides e determinar o

perfil de sensibilidade fenotípica dos isolados frente aos principais antimicrobianos

administrados em terapia veterinária e humana, assim como a produção fenotípica de

ESBLs;

2. Identificar por PCR os principais genes de resistência, integrons e fatores de

virulência associados à colibacilose em bovinos;

3. Verificar a presença de plasmídeos nas cepas resistentes;

4. Caracterizar os integrons por Restriction Fragment- Length Polymorphism (RFLP) e

sequenciamento

5. Verificar a possibilidade de transferência dos integrons e genes de resistência através

de ensaios de conjugação;

6. Determinar por PCR os grupos filogenéticos das cepas resistentes;

7. Avaliar o perfil clonal das cepas resistentes através de Pulsed Field Gel

Electrophoresis (PFGE);

III - Material e Métodos

Material e Métodos| 32

3.1. Áreas de coleta

A coleta das moscas foi realizada com a colaboração do Prof. Dr. Márcio Garcia

Ribeiro - Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública (DHVSP) da Faculdade de

Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) - UNESP, Botucatu-SP, em dois

estabelecimentos rurais, aqui designados por A e B, localizados na região de Botucatu – SP,

com sistema semi-intensivo de produção leiteira (Figura 1).

A propriedade A caracteriza-se pela produção de leite destinada à

comercialização, apresentando maior densidade de animais (número de animais por área),

com sistema de rotação de pastagem e ordenha mecânica realizada duas vezes ao dia. Os

animais são mantidos em sistema de semiconfinamento e os bezerros são separados de

acordo com a idade. A suplementação alimentar é realizada no estábulo com ração e feno.

A propriedade B apresenta produção de leite para autoconsumo e criação de gado

de corte, sendo que para a realização do presente trabalho apenas o gado leiteiro foi

contabilizado. A propriedade apresenta menor densidade de animais devido a maior área

destinada à pastagem, com ordenha manual realizada uma vez ao dia. A suplementação

alimentar é realizada no estábulo com ração, feno e silagem de milho.

As propriedades distam aproximadamente 35 km.

3.2. Obtenção das amostras

As moscas foram coletadas utilizando puçá entomológico previamente

desinfetado com solução de hipoclorito de sódio a 10% por 30 minutos, a fim de evitar a

interferência de contaminantes presentes anteriormente no equipamento. Foi dada

preferência às moscas que estavam mais próximas aos animais em lactação (vacas e

bezerros). As coletas foram realizadas em junho de 2015, durante o período da manhã por

duas horas (7h30 às 9h30 na propriedade A e das 10h às 12h na propriedade B) com

tentativas a cada 3 minutos, em média.

As moscas obtidas em cada captura foram transferidas para tubos tipo falcon

estéreis e inativadas por congelamento a -10 ºC por 30 minutos.


Figura 1. Região do município de Botucatu-SP, onde estão localizadas as duas propriedades

leiteiras estudadas (denominadas A e B), quanto à resistência antimicrobiana em E. coli

provenientes de dípteros muscoides. Fonte: Elaborado com Google Maps (https://maps.google.com.br/)

3.3. Isolamento e identificação de E. coli

Aos tubos contendo as moscas foram adicionados 2 mL de caldo EC

(Escherichia coli). Os tubos foram incubados a 37 ºC por 24 horas e posteriormente, as

culturas foram semeadas em meio ágar MacConkey, com e sem a adição de ampicilina

(50 μg/mL), e incubadas a 37 ºC por 24 horas. As moscas foram removidas do meio líquido,

lavadas com álcool 70 °GL e mantidas sob refrigeração, também em álcool 70 °GL, para

posterior identificação das espécies.

Cinco colônias típicas de E. coli cultivadas em ágar MacConkey com adição de

ampicilina foram selecionadas por meio das características morfológicas das colônias e da

diferenciação bioquímica a partir das seguintes provas: fermentação de glicose, produção de

gás, urease, L-triptofanase, produção de ácido sulfídrico, lisina descarboxilase, motilidade,

indol e citrato. Para a realização das provas foi utilizado o conjunto de meios

EPM/MILi/Citrato (Toledo et al., 1982 a, b).

As cepas foram estocadas em meio semissólido (ágar nutriente 1,15%; caldo

nutritivo 0,4%) e congeladas (Caldo BHI - Brain Heart Infusion; 20% glicerol).


A identificação das espécies de dípteros foi realizada com a colaboração da Profa.

Dra. Patrícia Jacqueline Thyssen - Departamento de Biologia Animal, Instituto de Biologia –

UNICAMP.

3.4. Caracterização fenotípica da sensibilidade aos antimicrobianos

3.4.1. Sensibilidade microbiana (antibiograma)

O perfil de sensibilidade microbiana foi realizado mediante a técnica de difusão

com discos (Bauer et al., 1966; CLSI, 2012), frente aos antimicrobianos: ampicilina (10 g),

amoxicilina/ácido clavulânico (30 g), cefalexina (30 g), cefoperazona sódica (75 g),

ceftiofur (30 g), ceftriaxona (30 g), cloranfenicol (30 g), enrofloxacina (5 g),

ciprofloxacina (5 g) gentamicina (10 g), sulfametoxazol/trimetoprim (25 g) e tetraciclina

(30 g) (Ribeiro, 2008; Winn Jr. et al., 2008). Como controle de sensibilidade foi utilizada a

linhagem de E. coli ATCC 25922 e a interpretação dos resultados de acordo com o disposto

pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2012).

A técnica consiste no preparo de uma suspensão bacteriana na escala 0,5 de Mc

Farland em solução de NaCl 0,15 M estéril, a partir de colônias com características idênticas,

isoladas em meio ágar triptona de soja (TSA). Posteriormente, a suspensão de cada amostra

foi espalhada na superfície de placas contendo ágar Mueller Hinton com auxílio de swabs

estéreis. Em seguida, os discos correspondentes aos antimicrobianos a serem testados foram

aplicados sobre o meio, obedecendo a uma distância mínima de 20 mm entre os discos e

incubados a 37 °C por 24 horas. As cepas que apresentaram perfil intermediário foram

consideradas resistentes.

3.4.2. Produção de ESBLs – Método da aproximação de disco

A detecção de ESBL foi realizada conforme o método de aproximação de discos

(Jarlier et al.,1988), utilizando discos de aztreonam (30 g), ceftriaxona (30 g), cefotaxima

(30 g), ceftazidima (30 g) e amoxicilina/ácido clavulânico (30 μg). Para a execução da

técnica foram escolhidos os isolados de E. coli que apresentaram perfil resistente, no

antibiograma, aos β-lactâmicos (cefalosporinas) de terceira geração empregando os mesmos

procedimentos do item anterior. Os discos de aztreonam, ceftriaxona, cefotaxima e

ceftazidima foram dispostos a 20 mm do disco de amoxicilina/ácido clavulânico ao centro.

Considera-se o resultado positivo quando há alargamento do halo de inibição ou surgimento


de uma faixa de inibição entre os halos de amoxicilina/ácido clavulânico e os antimicrobianos

testados, conhecida como “zona fantasma”.

3.5. PCR para a pesquisa dos genes de virulência, resistência e integrons

3.5.1. Extração do DNA (método do choque térmico)

O método baseado em Chapman et al. (2001) consistiu na fervura por 10 minutos

da suspensão bacteriana, preparada a partir do crescimento confluente obtido em placas de

TSA em 200 L de água ultrapura estéril, seguido de congelamento a -10 °C por 30 minutos.

Após o descongelamento (temperatura ambiente) as amostras foram centrifugadas a

12.000 rpm (9.676,8 g) (centrífuga Sorvall® MC12) por 5 minutos e o sobrenadante

transferido para um novo tubo.

3.5.2. PCR

A detecção dos genes de interesse (Tabela 1) foi realizada pela Reação em Cadeia

da Polimerase (PCR), primeiramente utilizando pool de DNA de cinco amostras1. Em cada

reação foram adicionados 1,5 U Taq polimerase, 1,5 L de Tampão 10X para PCR, 200 M

de dNTP, 2 mM de MgCl2, 0,5 µL dos iniciadores em concentrações ótimas, água ultrapura

estéril qsp., em um volume final de 15 μL e 2 L de DNA bacteriano obtido por choque

térmico. Cerca de 5 µL dos produtos da PCR adicionados de 1-2 µL de tampão de amostra

(azul de bromofenol 0,25%; sacarose em água 40% w/v) foram submetidos à eletroforese em

gel de agarose em tampão TAE 1X (Tris 2 M; Ácido acético 0,04 M; EDTA 0,01 M em pH

8,0) a 100 V e 200 mA por 50 minutos. Posteriormente, o gel foi incubado em solução de

Brometo de Etídeo a 1 g/mL por 10 minutos e visualizado em transiluminador de luz UV e

as imagens foram capturadas e fotografadas com o sistema Image Master® VDS (Pharmacia

Biotech).

A programação das PCRs (termociclador Techne TC-312) foi realizada da

seguinte forma: desnaturação inicial a 94ºC por cinco minutos, 30 ciclos (94ºC por 45

segundos, temperatura de anelamento por 45 segundos, 72ºC por 45 segundos) e extensão

final a 72ºC por sete minutos.

1 Os resultados positivos foram repetidos para a amostra de DNA de cada bactéria contida no pool.


Tabela 1. Iniciadores utilizados para a detecção dos fatores de virulência, genes de resistência

e integrons em isolados de E. coli provenientes de dípteros muscoides.

Iniciador Produto Sequência (5’-3’) T* pb

** Ref.

Fatores de virulência

eae intimina GACCCGGCACAAGCATAAGG

CCACCTGCAGCAACAAGAGC 63 ºC 384

Yu e Kaper,

1992

vt1 verotoxina AAGTTGCAGCTCTCTTTGAATA

TGCAAACAAATTATCCCCTGAG 50 ºC 364

Ojeniyi et al.,

1994 vt2 verotoxina

GGGCAGTTATTTTGCTGTGGA GTATCTGCCTGAAGCGTAA

50 ºC 386

hlyA hemolisina AACAAGGATAAGCACTGTTCTGGCT ACCATATAAGCGGTCATCCCGTCA

63 ºC 1177 Yamamoto et

al., 1995

K99 fator de

colonização TATTATCTTAGGTGGTATGG

GGTATCCTTTAGCAGCAGTATTTC 50 ºC 314

Franck et al.,

1998

LTII toxina

termolábil AGATATAATGATGGATATGTATC

TAACCCTCGAAATAAATCTC 48 °C 300

Schultsz et al.,

1994

STa toxina

termoestável TCCGTGAAACAACATGACGG ATAACATCCAGCACAGGCAG

48 °C 244 So e McCarty,

1980

β-lactâmicos

ampC AmpC β-

lactamases*** CCCCGCTTATAGAGCAACAA TCAATGGTCGACTTCACACC

61 °C 634 Féria et al.,

2002

blaTEM ESBL TCGGGGAAATGTCGCG

TGCTTAATCAGTGAGGCACC 61 °C 972

Cao et al.,

2002 blaSHV ESBL TTATCTCCCTGTTTAGCCACC GATTTGCTGATTTCGCTCGG

61 °C 795

blaCTX-M ESBL CGATGTGCAGTACCAGTAA

TTAGTGACCAGAATCAGCGG 60 °C 585

Batchelor et al., 2005

blaCMY-4 AmpC β-

lactamases**** GATTCCTTGGACTCTTCAG

TAAAACCAGGTTCCCAGATAGC 56 ºC 1800

Stapleton et al., 1999

Quinolonas

gyrA mutação DNA

girase TACACCGGTCAACATTGAGG

TTAATGATTGCCGCCGTCGG 64 ºC 648

Oram e Fisher,

1992

parC Mutação

topoisomerase

IV

AAACCTGTTCAGCGCCGCATT

GTGGTGCCGTTAAGCAAA 55 ºC 395

Vila et al.,

1996

Tetraciclina

tetA sistema efluxo GTAATTCTGAGCACTGTCGC

CTGTCCTGGACAACATTGCTT 62 °C 937

Guardabassi et

al., 2000

Integrons

intI1 integrase

classe 1 GGGTCAAGGATCTGGATTTCG

ACATGGGTGTAAATCATCGTC 62 ºC 483

Mazel et al.,

2000

5’CS 3’CS

região dos

cassetes GGCATCCAAGCAGCAAG AAGCAGACTTGACCTGA

60 ºC V§ Lévesque et

al., 1995

intI2 integrase

classe 2 CACGGATATGCGACAAAAAGGT GTAGCAAACGAGTGACGAAATG

62 ºC 788 Mazel et al.,

2000

attI2-F

orfX-R região dos

cassetes GACGGCATGCACGATTTGTA

GATGCCATCGCAAGTACGAG 58 ºC V§

Machado et al.,

2005

T*: Temperatura de anelamento; pb

**: tamanho do produto em pares de bases; Ref.: Referência;

***: gene

cromossomal; ****: gene plasmidial; V§: variável; ESBL: β-lactamase de espectro estendido


3.6. Presença de plasmídeos

A extração de DNA plasmidial foi realizada pelo método de lise alcalina

(Birnboim e Doly, 1979) nas cepas que apresentaram multirresistência (perfil fenotípico

resistente a três ou mais classes de antimicrobianos) (Magiorakos et al., 2012). Os plasmídeos

foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 0,8% em tampão TBE (Tris 0,89 M;

ácido bórico 0,89 M; EDTA 0,25 M em pH 8,0) a 50 V e 100 mA durante 2 horas.

Posteriormente o gel foi visualizado e fotografado conforme o item 3.5.2. Como controles da

extração foram utilizadas as cepas de E. coli DH10B com um plasmídeo inserido (positivo),

J53 (negativo) e V517.

3.7. Classificação filogenética de E. coli

As cepas que apresentaram multirresistência foram atribuídas aos grupos

filogenéticos A, B1, B2 e D de acordo com o esquema de PCR multiplex elaborado por

Clermont et al. (2000). As reações foram realizadas de acordo com o exposto no item 3.5.2.,

utilizando 1 L de mix contendo os três pares de iniciadores nas mesmas concentrações e

programação dos ciclos de acordo com o proposto no trabalho citado. As cepas alocadas nos

grupos A e B1 são consideradas comensais e nos grupos B2 e D patogênicas.

Dados referentes aos iniciadores e a interpretação dos resultados estão expostos na

Tabela 2.

Tabela 2. Iniciadores utilizados no esquema proposto por Clermont et al. (2000) e as

combinações de resultados possíveis.

Iniciador Sequência (5’-3’) pb* Cepas

controles** Combinações/Grupos

ChuA GACGAACCAACGGTCAGGAT

TGCCGCCAGTACCAAAGACA 279 O157:H7 - - - + + +

YjaA TGAAGTGTCAGGAGACGCTG

ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC 211 K12C600 - + - + + -

TspE4C2 GAGTAATGTCGGGGCATTCA CGCGCCAACAAAGTATTACG

152 2348/69 - - + - + +

A A B1 B2 B2 D

pb*: tamanho do produto em pares de bases; **controles positivos dos iniciadores



(RFLP) e sequenciamento

Os produtos obtidos na PCR com os primers 5’CS e 3’CS, correspondente à região

variável do integron de classe 1, foram submetidos ao ensaio de RFLP utilizando 10 U da

enzima AluI, 10 µL do produto de PCR, 2 µL do tampão da enzima e água ultrapura estéril

qsp., para o volume final de 30 µL. As reações foram incubadas a 37 °C por 1 hora e

inativadas a 65 °C por 20 minutos. Os perfis das bandas obtidas por eletroforese a 2,5% de

agarose a 100 V e 200 mA por 1 hora foram analisados com o programa de código aberto

GelJ (Heras et al., 2015).

O sequenciamento foi realizado em laboratório prestador de serviços utilizando

BigDye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit e sequenciador ABI-PRISM 3700 DNA

Analyzer (Applied Biosystems, USA) a partir dos produtos de PCR, primeiramente da região

5’CS-3’CS. Os produtos foram purificados com Kit AxyPrep PCR Clean Up®

(Axygen

Biotechnology) conforme normas do fabricante. As amostras foram preparadas e enviadas

para sequenciamento de acordo com as especificações do serviço.

Para a conclusão da sequência correspondente aos genes cassetes e da estrutura do

integron de classe 1 foram realizados novos PCRs (Tabela 3) ligando os fragmentos

correspondentes aos genes amplificados pelos iniciadores (Figura 2), de forma a combinar

diferentes pares. Os produtos das reações foram encaminhados para sequenciamento.

A montagem dos contigs foi realizada com o software Sequencher 4.7 (Gene

Codes Corporation) e as sequências foram analisadas utilizando as ferramentas BLAST e

ORF Finder (National Center for Biotecnology Information - NCBI) visando à identificação

dos cassetes gênicos relacionados à resistência antimicrobiana, a identidade dos isolados com

os depositados no banco de dados e a estrutura dos integrons presentes nos isolados.

Tabela 3. Iniciadores relacionados a estruturas de integrons de classe 1 utilizados para a

conclusão das sequências de isolados de E. coli provenientes de dípteros muscoides.

Iniciador Produto Sequência (5’-3’) T* pb** Ref.

intI1 integrase classe 1

GGGTCAAGGATCTGGATTTCG

ACATGGGTGTAAATCATCGTC 62 °C 483 Mazel et al., 2000

5’CS

3’CS

região dos cassetes

GGCATCCAAGCAGCAAG

AAGCAGACTTGACCTGA 60 °C V§

Lévesque et al.,

1995

dfrA7/dfrA17 resistência a trimetoprim

CAGAAAATGGCGTAATCG TCACCTTCAACCTCAACG

55 °C 345 Frech et al., 2003

qac resistência a quaternário de amônio

GGCTGGCTTTTTCTTGTTATCG TGAGCCCCATACCTACAAAGC

62 °C 287 Mazel et al., 2000

sul1 resistência a sulfonamidas

TGGTGACGGTGTTCGGCATTC GCGAGGGTTTCCGAGAAGGTG

63 °C 789 Sáenz et al., 2004

T*: Temperatura de anelamento; pb

**: tamanho do produto em pares de bases; Ref.: Referência;V

§: variável


Figura 2. Estrutura do integron de classe 1. A região cinza representa o sítio de inserção dos

cassetes gênicos relacionados à resistência antimicrobiana. Reproduzido de Lèvesque et al.

(1995).

3.9. Perfil clonal das cepas resistentes

As cepas multirresistentes foram selecionadas para a avaliação do perfil clonal de

acordo com a sensibilidade fenotípica que apresentaram, dando preferência para os perfis

semelhantes ao das cepas portadoras de integrons. A técnica de eletroforese em campo

pulsado (PFGE) foi realizada conforme o protocolo padronizado para a rede PulseNet (Ribot

et al., 2006). Os blocos (plugs) contendo o DNA das amostras a serem testadas foram

digeridos com a enzima XbaI (NEB). Após a digestão foram transferidos para gel de agarose

para PFGE a 1% (Bio-Rad) e submetidos à eletroforese em TBE 0,5X realizada em

equipamento CHEF-DR III (Bio-Rad) a 6 V e ângulo de 120° com tempo de pulso inicial de

2,2 segundos e final de 54,2 segundos, por 19 horas. Posteriormente, o gel foi incubado em

solução de Brometo de Etídeo a 1g/mL por 30 minutos e descorados em água ultrapura por

30 minutos para a remoção do “fundo” gerado pelo Brometo de Etídeo. O gel foi fotografado

e a imagem capturada pelo sistema Image Master® VDS (Pharmacia Biotech).

As fotos dos géis foram analisadas com o programa GelComparII 5.1(Applied

Mayhs) utilizando o método Unweighted Pair Group Method Using Arithmetic Average

(UPGMA), utilizando coeficiente de Dice com tolerância e otimização de 1%.

3.10. Ensaio de conjugação

A possibilidade de transferência dos genes de resistência e dos integrons foi

avaliada através de ensaio de conjugação baseado no método apresentado por Soufi et al.

(2009). As cepas que apresentaram resultado positivo na PCR para os integrons de classe 1

foram utilizadas como doadoras no ensaio de conjugação. Para o ensaio, a cepa de E. coli J53

resistente a azida sódica foi utilizada como receptora e se mostrou sensível a tetraciclina, o

antimicrobiano escolhido para a seleção dos transconjugantes.


As bactérias foram cultivadas em 2 mL de caldo LB (triptona 10%; extrato de

levedura 5%; NaCl 10% w/v) a 37 °C por 18 horas. Posteriormente, alíquotas das culturas das

cepas doadoras e receptora, foram transferidas para um mesmo tubo na razão 1:10 (v/v) e

incubadas a 37 °C por 18 horas. Após, 100 µL das culturas contendo doadora + receptora

foram semeadas em placas de Mueller Hinton contendo azida sódica (100 µg/mL), tetraciclina

(100 µg/mL) e azida sódica combinada com tetraciclina (100 µg/mL). As placas foram

incubadas a 37 °C por até 72 horas para a visualização das colônias transconjugantes.

Em seguida, uma colônia transconjugante representante de cada amostra foi

escolhida aleatoriamente e estocada por congelamento para a confirmação das marcas

transferidas, de modo que novos ensaios de sensibilidade microbiana, PCR e extração de

plasmídeos foram realizados utilizando as cepas transconjugantes. As cepas doadoras foram

utilizadas como controle na PCR e extração de plasmídeos.

3.11. Análise estatística

A associação entre a presença/ausência de cepas multirresistentes aos

antimicrobianos e a presença/ausência de integron de classe 1 e fatores de virulência foram

realizadas com teste Exato de Fisher com intervalo de confiança 95%. A ocorrência de cepas

fenotipicamente resistentes e a presença dos genes de resistência testados foram analisadas

por regressão logística múltipla. Todos os testes foram realizados utilizando o programa

BioEstat 5.3 (Instituto Mamirauá).

IV - Resultados

Resultados | 42

4.1. Coleta dos insetos e isolamento de E. coli

Na Propriedade A foram coletadas 57 moscas, das quais foram isoladas da

superfície externa, 135 cepas de E. coli (MA). Já na Propriedade B foram coletados 39

insetos, sendo que 63 cepas de E. coli foram isoladas da superfície externa (MB). No entanto

é importante destacar que as moscas coletadas em cada tentativa (varredura de puçá) foram

acondicionadas no mesmo tubo, de modo que o número de indivíduos no tubo foi variável.

Além disso, não foram todas as amostras que apresentaram crescimento de E. coli e para as

que apresentaram, um número de cinco colônias foi fixado para a continuidade do trabalho.

Por esse motivo, cálculos de frequência de isolamento por espécies de dípteros muscoides não

foram possíveis de serem realizados. Porém, efetuando-se uma média simples e considerando

os dados não agrupados, foram isoladas em média 2,4 cepas de E. coli por mosca, na

Propriedade A e 1,6 cepas de E. coli por inseto na Propriedade B. Os dados referentes a cada

amostra (espécies e/ou famílias dos insetos e isolados de E. coli) estão expostos na Tabela 4.

Os resultados referentes à identificação das espécies de dípteros muscoides estão

expostos na Tabela 5, sendo que um indivíduo da família Cicadellidae e um da família

Formicidae não foram contabilizados por não pertencerem ao grupo de dípteros muscoides.

As espécies mais abundantes na Propriedade A foram Musca domestica (Linnaeus, 1758),

Fannia spp. e Stomoxys calcitrans (Linnaeus, 1758), respectivamente. Na Propriedade B, os

dípteros mais abundantes foram M. domestica, Hippelates spp. e Acalyptratae, e Fannia spp.

Resultados | 43

Tabela 4. Insetos coletados em duas propriedades da região de Botucatu, SP (2015)

organizados por amostra. Espécies e quantidades.

Propriedade A

Amostras Espécies/Família Insetos (n) Isolados (n)

MA1 Musca domestica; Fannia sp. 2 5

MA2 Fannia sp. 3 5

MA3 Musca domestica 1 5

MA4 Stomoxys calcitrans 2 0

MA5 Stomoxys calcitrans; Hippelates spp. 3 5




MA9 Chrysomya megacephala 1 5

MA10 Fannia sp. 1 5






MA16 Atherigona orientalis 1 0



MA19 Muscidae 1 0

MA20 Fannia sp., Acalyptratae 3 0


MA22 Fannia sp. 1 0




MA26 Fannia sp. 1 5


MA28 Fannia sp. 1 5

MA29 Musca domestica; Fannia sp. 3 5

MA30 Lucilia cuprina 1 5

MA31 Fannia sp.; Acalyptratae 2 0



MA34 Atherigona orientalis 1 5

MA35 Fannia sp. 1 5

MA36 Stomoxys calcitrans; Fannia sp. 2 0



MA39 Muscidae 1 5



Σ

57 135

Continua

Resultados | 44

Propriedade B

Amostras Espécies/Família Insetos (n) Isolados (n)

MB1 Fannia sp. 1 5

MB2

Hippelates sp., Fannia sp.,

Drosophilidae, Acalyptratae,

Cicadellidae

12 5

MB3 Musca domestica 1 5

MB4 Faniidae 1 5

MB5 Hippelates sp. 1 0


MB7 Stomoxys calcitrans 1 5





MB12 Stomoxys calcitrans 1 0

MB13 Musca domestica; Stomoxys

calcitrans; Acalyptratae 5 5

MB14 Hippelates sp.; Formicidae 4 5


MB16 Toxomerus sp. 1 0

MB17 Sepsidae; Acalyptratae 2 5

MB18 Musca domestica; Euxesta sp. 2 0

Σ 39 63

n: quantidade; Σ: somatório; MA: moscas coletadas na Propriedade A; MB: moscas coletadas na Propriedade B.

Tabela 5. Espécies e abundância de espécies de dípteros muscoides coletados em duas

propriedades leiteiras da região de Botucatu, SP (2015).

Propriedade A

Família Espécie Abundância

Muscidae Musca domestica (Linnaeus, 1758) 20

Stomoxys calcitrans (Linnaeus, 1758) 10

Atherigona orientalis (Schiner) 2

Não identificado 2

Fanniidae Fannia spp. 14

Calliphoridae Chrysomya megacephala (Fabricius, 1794) 4

Lucilia cuprina (Wiedemann, 1830) 1

Chloropidae Hippelates spp. 2

Acalyptratae ----- 2

Continua

Continuação Tabela 4

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Resultados | 45

Propriedade B

Família Espécie Abundância

Muscidae Musca domestica 10

Stomoxys calcitrans 3

Chloropidae Hippelates spp. 7

Acalyptratae ----- 7

Fanniidae Fannia spp. 5

Não identificado 1

Syrphidae Toxomerus sp. 1

Ulidiidae Euxesta sp. 1

Drosophilidae ----- 1

Sepsidae ----- 1

4.2. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos

A adição de ampicilina (50 µg/mL) ao meio MacConkey para o isolamento das

colônias indicativas de E. coli visou oferecer uma pressão seletiva branda, porém para os

resultados de difusão com discos as cepas não apresentaram 100% de resistência a ampicilina

(10 µg), de modo que a concentração do antimcrobiano escolhida para a seleção pode ter sido

insuficiente.

A multirresistência (resistência fenotípica a três ou mais classes de

antimicrobianos) foi observada em 60/135 (44,4%) cepas da propriedade A, sendo 10/135

(7,4%) cepas resistentes a três classes de antimicrobianos, 8/135 (5,9%) a quatro classes,

40/135 (29,6%) a cinco classes e 2/135 (1,5%) a seis classes. Na propriedade B, 2/63 (3,2%)

cepas apresentaram multirresistência, sendo 2/63 (3,2%) resistentes a cinco classes de

antimicrobianos.

Os antimicrobianos que apresentaram maior frequência de cepas de E. coli

resistentes foram amoxicilina/ácido clavulânico, ampicilina, tetraciclina,

sulfametazol/trimetoprim, enrofloxacina, cloranfenicol e ciprofloxacina. A Tabela 6 e a

Figura 3 ilustram a frequência relativa de cepas resistentes a cada antimicrobiano testado.

As cepas que apresentaram resistência fenotípica as cefalosporinas de terceira

geração foram submetidas ao teste de aproximação com discos para a detecção de β-

lactamases de espectro estendido (ESBL). Na propriedade A, 5/18 apresentaram resultado


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Resultados | 46

positivo para os antimicrobianos ceftazidima e aztreonam (Figura 4). Apesar de algumas

cepas de E. coli terem apresentado resultado sugestivo de produção de ESBL para

cefotaxima, tais resultados foram considerados negativos, uma vez que o método utilizado já

emprega distâncias reduzidas de 20 mm entre os discos de amoxicilina/ácido clavulânico e as

cefalosporinas de terceira geração e aztreonam (Bradford, 2001; Rawat e Nair, 2010)

(Figura 4; Apêndice A). Uma cepa da propriedade B foi resistente a cefoperazona, porém não

apresentou resultados positivos para a produção de ESBL.

4.3. Genes relacionados à resistência a antimicrobianos e fatores de virulência

Os genes relacionados à resistência a antimicrobianos foram selecionados para

estudo considerando a frequência com que são abordados na literatura ou a uma marca

específica almejada, no caso do gene blaCMY-4, relacionado à carbapenemase em E. coli

(Stapleton et al., 1999).

Os isolados da Propriedade A apresentaram genotipos positivos para os seguintes

genes e região gênica: intI1 (10/135), 5’CS-3’CS (25/135), sendo integron de classe 1 (intI +

5’CS-3’CS) presente em 8/135, ampC (6/135), blaTEM (49/135), blaCTX-M (15/135), parC

(38/135), gyrA (67/135), tetA (20/135). No total, 89/135 (66%) cepas foram positivas a pelo

menos um gene relacionado à resistência. Entre os fatores de virulência pesquisados houve

genótipo positivo para eae (4/135), vt1 (7/135), hlyA (11/135), K99 (5/135), LTII (13/135),

STa (5/135). Todas as sete E. coli positivas para vt1 foram isoladas de M. domestica.

Quanto à Propriedade B, não foram encontradas cepas positivas para o gene da

integrase (intI), no entanto, 5/63 cepas amplificaram a região 5’CS-3’CS. Houve genótipo

positivo para ampC (5/63), parC (17/63) e gyrA (7/63), sendo que 19/63 (30,2%) foram

positivas a pelo menos um gene relacionado à resistência. Não houve genótipo positivo a

nenhum dos fatores de virulência pesquisados.

Resultados | 47

Tabela 6. Frequência relativa de E. coli resistentes* isoladas da superfície externa de dípteros

muscoides em duas propriedades leiteiras da região de Botucatu, SP (2015).

Antimicrobianos e n (%)

Prop.(n) AMP AMC CFE CRO CFP CTF CIP ENR CLO SUT GEN TET

A(135) 86

(63,7)

87

(64,4)

30

(22,2)

6

(4,4)

18

(13,3)

5

(3,7)

46

(34,1)

50

(37)

48

(35,6)

57

(42,2)

12

(8,9)

72

(53,3)

B(63) 17

(27)

22

(34,9)

4

(6,3)

0

–

1

(1,6)

0

–

3

(4,8)

2

(3,2)

2

(3,2)

2

(3,2)

0

–

2

(3,2)

n: número de cepas resistentes; Prop.: Propriedades; AMP: ampicilina, AMC: amoxicilina/ácido clavulânico; CFE: cefalexina; CRO: ceftriaxona; CFP: cefoperazona; CTF: ceftiofur; CIP: ciprofloxacina; ENR: enrofloxacina; CLO: cloranfenicol; SUT: sulfametoxazol/trimetoprim; GEN: gentamicina; TET: tetraciclina. *Perfil intermediário foi considerado como resistente.

Figura 3. Frequência relativa de E. coli resistentes* a cada um dos antimicrobianos testados.

Visualização dos diferentes perfis dos isolados nas duas propriedades leiteiras (A e B).

Legenda: AMP: ampicilina, AMC: amoxicilina/ácido clavulânico; CFE: cefalexina; CRO: ceftriaxona; CFP: cefoperazona; CTF: ceftiofur; CIP: ciprofloxacina; ENR: enrofloxacina; CLO: cloranfenicol; SUT: sulfametoxazol/trimetoprim; GEN: gentamicina; TET: tetraciclina. *Perfil intermediário foi considerado como resistente.

AMP AMC CFE CRO CFP CTF CIP ENR CLO SUT GEN TET

A(135) 63,7 64,4 22,2 4,4 13,3 3,7 34,1 37 35,6 42,2 8,9 53,3

B(63) 27 34,9 6,3 0 1,6 0 4,8 3,2 3,2 3,2 0 3,2

0

10

20

30

40

50

60

70

Resultados | 48

Figura 4. Escherichia coli positiva para o teste de aproximação de disco. O alargamento do

halo de inibição (seta no topo) e o surgimento da “zona fantasma” (seta embaixo) indica a

produção de ESBL (β-lactamase de espectro estendido).

4.4. Análises estatísticas

Os testes exato de Fisher e regressão logística múltipla foram realizados para a

análise dos dados obtidos com as cepas de E. coli isoladas de dípteros muscoides capturados

na propriedade A. Considerando as 135 cepas e o valor de p<0,05 como estatisticamente

significativo, os resultados demonstraram associação entre multirresistência e a presença de

integron (p=0,0012) e multirresistência e a presença do gene para o fator de virulência K99

(p=0,0158). Porém a presença do gene vt1 foi associada à ausência de multirresistência

(p=0,0171). Os fatores de virulência eae, hlyA, LTII e STa não apresentaram nenhuma

associação (p>0,05).

A regressão logística múltipla foi efetuada a fim de verificar a presença dos genes

de resistência antimicrobiana em relação à resistência fenotípica a cada um dos

antimicrobianos testados, de modo que a resistência genotípica consistiu na variável

dependente (Y) e a resistência fenotípica às variáveis independentes (X). Os genes testados

foram blaTEM, blaCTX-M, ampC e tetA, sendo que houve relação significativa entre blaTEM e

resistência a ampicilina (p=0,0242), cloranfenicol (p=0,0179) e tetraciclina (p= 0,0056). O

gene blaCTX-M apresentou relação significativa com resistência a cefoperazona sódica

(p=0,0458). Os genes ampC e tetA não apresentaram relação com a resistência a nenhum dos

antimicrobianos testados.

Resultados | 49

4.5. Plasmídeos e classificação filogenética de E. coli (Clermont et al., 2000)

Os isolados que apresentaram multirresistência (60 da Propriedade A e dois da

Propriedade B descritos no item 4.2) foram submetidos à extração de plasmídeos e a

classificação filogenética. No total, 57/62 (91,9%) cepas de E. coli apresentaram plasmídeo

visível nas condições estabelecidas pela técnica de lise alcalina, 45/62 (72,6%) das cepas

foram classificadas no grupo filogenético B1, do restante, 9/62 (14,5%) foram alocadas no

grupo A, 6/62 (9,7%) no grupo D, 1/62 (1,6%) em B2 e 1/62 (1,6%) não foi possível de ser

tipada pelo método. Detalhes sobre a resistência de cada isolado, presença de plasmídeo e

grupo filogenético estão apresentados na Tabela 7.

Tabela 7. Dados referentes ao perfil de resistência*, presença de plasmídeos e grupos

filogenéticos das cepas de E. coli multirresistentes isoladas de dípteros muscoides em

propriedades leiteiras da região de Botucatu, SP (2015).

Isolado Perfil de resistência Presença de

plasmídeo**

Grupo

filogenético

MA1c AMP/AMC/CFE/ENR/SUT/TET Sim B1

MA1d AMP/CIP/ENR/SUT/TET Sim A

MA2a AMP/AMC/CFE/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim A

MA2b AMP/CFE/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim B1

MA2c AMP/AMC/CFE/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim B1

MA2d AMP/AMC/CFE/CFP/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim B1

MA2e AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim B1

MA3a AMP/AMC/CFE/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim B1

MA3b AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim B1

MA3c AMP/AMC/CFE/CIP/ENR/CLO/SUT/GEN/TET Sim NT

MA3e AMP/AMC/CFE/CFP/CIP/ENR/CLO/SUT/GEN/TET Sim B1

MA5a AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim B1


MA5c AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim B1

MA5d AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim B1

MA5e AMP/AMC/CFE/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim B1

MA6a AMP/AMC/CFP/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim B1



MA7c AMP/AMC/CFE/SUT/TET Sim B1

MA7e AMP/AMC/CFE/CFP/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim D

MA8b AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim A

MA9a AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim B1



MA9d AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim A

Continua.

Resultados | 50

MA9e AMP/AMC/CFP/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim A

MA17a AMP/AMC/CFE/CRO/CFP/CTF/CIP/ENR/SUT/GEN/TET Sim B1

MA17b AMP/AMC/CFE/CRO/CFP/CTF/CIP/ENR/SUT/GEN/TET Sim B1

MA17c AMP/AMC/CFE/CRO/CFP/CTF/CIP/ENR/SUT/GEN/TET Sim B1

MA17d AMP/AMC/CFE/CRO/CFP/CTF/CIP/ENR/SUT/GEN/TET Sim B1

MA17e AMP/AMC/CFE/CRO/CFP/CTF/CIP/ENR/SUT/GEN/TET Sim B1

MA18a AMP/CRO/SUT/TET Sim A

MA23c AMP/AMC/CLO/TET Sim B2

MA23e AMP/AMC/CLO/TET Sim D

MA25a AMP/AMC/CLO/SUT/GEN Sim D

Ma25b AMP/AMC/CFP/CLO/SUT/GEN Sim D

MA25c AMP/AMC/CFP/CLO/SUT/GEN Sim D

MA25d AMP/AMC/CLO/SUT/GEN Sim D

MA25e AMP/AMC/CLO/SUT/TET Sim A

MA26a AMP/AMC/CFE/CFP/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim B1

MA26b AMP/AMC/CFE/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim B1

MA26c AMP/AMC/CFE/CFP/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim B1

MA26d AMP/AMC/CFE/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim A

MA26e AMP/AMC/CFE/CFP/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim B1

MA29a CLO/SUT/GEN/TET Sim B1

MA29e AMC/CIP/ENR/CLO Sim B1

MA35a AMP/AMC/SUT/TET Sim B1

MA35b AMP/AMC/SUT/TET NV B1

MA35c AMP/AMC/SUT/TET NV B1

MA35d AMP/AMC/SUT/TET NV B1

MA35e AMP/AMC/SUT/TET NV B1


MA37d AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET NV B1


MA39a AMP/AMC/CFP/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim A

MA39b AMP/AMC/CFE/CFP/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim B1




MB1d AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim B1

MB2e AMP/AMC/CFP/CIP/ENR/CLO/SUT/TET Sim B1

*Perfil intermediário foi considerado como resistente.**Plasmídeos detectáveis por lise alcalina em agarose 0,8%; NV: não visível pela técnica; NT: não tipável. AMP: ampicilina, AMC: amoxicilina/ácido clavulânico; CFE: cefalexina; CRO: ceftriaxona; CFP: cefoperazona; CTF:

ceftiofur; CIP: ciprofloxacina; ENR: enrofloxacina; CLO: cloranfenicol; SUT: sulfametoxazol/trimetoprim; GEN: gentamicina; TET: tetraciclina.

Continuação da Tabela 7.

Resultados | 51


(RFLP)

Oito cepas de E. coli da Propriedade A foram positivas para integron de classe 1

(positivas na PCR para o gene da integrase de classe 1 intI1 e para a região variável 5’CS-

3’CS). O produto da PCR para a região 5’CS-3’CS apresentou um tamanho aproximado de

750 pb e foi submetido à digestão enzimática por AluI com o objetivo de caracterizar a região

variável onde são inseridos os cassetes gênicos no integron e, assim, auxiliar nas análises do

sequenciamento dessas mesmas amostras. As bandas geradas pela digestão de cada um dos

fragmentos apresentaram tamanhos aproximados a 750 pb, 450 pb e 300 pb (Figura 5).

O fragmento de 750 pb corresponde ao produto de PCR que não foi completamente digerido

pela enzima.

Figura 5. Padrão de digestão enzimática de AluI obtido no ensaio de RFLP da região variável

do integron de classe 1 (5’CS-3’CS) de E. coli isoladas de moscas. M: Marcador de peso molecular 1 kb (Fermentas); 1: MA17a; 2: MA17b; 3: MA17c; 4: MA17d; 5: MA17e; 6:

MA26a; 7: MA26b; 8: MA26d.

4.7. Sequenciamento da região variável do integron de classe 1

A amplificação da região 5’CS-3’CS, para as oito amostras de E. coli positivas

oriundas das moscas coletadas na propriedade A, gerou produtos de tamanhos aproximados a

750 pb. Visando primeiramente obter as sequências iniciais da região 5’CS e 3’CS, conforme

o ilustrado no esquema apresentado por Lèvesque et al. (1995) (Figura 2), os produtos das

PCRs foram enviados para sequenciamento. As análises das sequências obtidas demonstraram

a presença de um único gene cassete com identidade de 100% com o gene dfrA7 –

diidrofolato redutase tipo VII que confere resistência ao antimicrobiano trimetoprim em todas

as oito amostras. A Figura 6 ilustra o esquema elaborado inicialmente.

Resultados | 52

Figura 6. Desenho esquemático da sequência obtida a partir da amplificação dos iniciadores

5’CS e 3’CS. 59-be: 59- base element (sítio de recombinação do gene cassete)

Posteriormente, novos PCRs foram realizados utilizando os iniciadores dos genes

estruturais do integron de classe 1 (intI1, 5’CS-3’CS, qac, sul1) e do gene cassete

correspondente (dfrA7) de maneira combinada, buscando propor a estrutura completa dos

integrons presentes nas amostras.

Os produtos sequenciados corresponderam às combinações intI1R/dfrA7R,

5’CS/dfrA7R, 5’CS/qacR, dfrA7F/qacR, 3’CS/dfrA7F e intIF/intIR.

A análise dos contigs resultou em uma sequência consenso única para as oito

amostras, contendo a integrase de classe 1 com aproximadamente 1200 pb. O gene dfrA7

apresentou tamanho de 564 pb com start códon alternativo “GTG” e stop códon “TAA”

compartilhado com o sítio de recombinação 59-base element (59-be) também conhecido como

attC, apresentando 143 pb (Figura 7).

Figura 7. Desenho esquemático do integron de classe 1 presente em cepas de E. coli isoladas

de dípteros muscoides.

Resultados | 53

4.8. Perfil clonal

Para a avaliação do perfil clonal, os isolados de E. coli foram organizados em seis

grupos de acordo com o perfil de resistência fenotípico que apresentaram (Tabela 8). No total

foram analisadas 43 E. coli multirresistentes com perfil igual ou semelhante às cepas positivas

para integron ou àqueles obtidos para as duas cepas da Propriedade B. Foram gerados 36

pulsotipos, a partir dos perfis de macrorrestrição do DNA genômico, analisados segundo os

critérios estabelecidos por Tenover et al. (1995), representados na Figura 8 pelos números 1

a 36.

As cepas que apresentaram 100% de similaridade genômica foram: MA9a e

MA37c (pulsotipo 3), MA3a e MA2e (pulsotipo 12), MA2c e MA3b (pulsotipo 13), MB2e,

MA39b e MA39d (pulsotipo 24) e MA17a e MA17c (pulsotipo 34). A cepa MB1d apresentou

94% de similaridade com as cepas MA6a e MA2d.

Quanto as cepas com integrons MA17a, MA17c, MA17d e MA17e, formaram um

cluster com similaridade maior que 94%. O pulsotipo de MA26a com MA2a também

apresentaram 94% de similaridade e MA26b com MA5a, 98%. A cepa MA26d apresentou

80% de similaridade com as outras cepas de MA26, e a cepa MA17b, não foi relacionada a

nenhum dos outros pulsotipos obtidos.

Tabela 8. Cepas de E. coli selecionadas para a avaliação do perfil clonal organizadas de

acordo com o perfil fenotípico de resistência antimicrobiana.

Cepas Resistência* Genes de resistência

Grupo I

MA7e AMP/AMC/CFE/CFP/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaTEM / ampC

MA2d AMP/AMC/CFE/CFP/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaTEM / tetA

MA26aint AMP/AMC/CFE/CFP/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaTEM / blaCTX-M / ampC / tetA

MA26c AMP/AMC/CFE/CFP/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaTEM / blaCTX-M / ampC /tetA

MA26e AMP/AMC/CFE/CFP/CIP/ENR/CLO/SUT/TET ampC/ tetA

MA39b AMP/AMC/CFE/CFP/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaCTX-M

Grupo II

MA17aint AMP/AMC/CFE/CRO/CFP/CTF/CIP/ENR/SUT/GEN/TET blaTEM / blaCTX-M

MA17bint AMP/AMC/CFE/CRO/CFP/CTF/CIP/ENR/SUT/GEN/TET blaTEM / blaCTX-M

MA17cint AMP/AMC/CFE/CRO/CFP/CTF/CIP/ENR/SUT/GEN/TET blaCTX-M

MA17dint AMP/AMC/CFE/CRO/CFP/CTF/CIP/ENR/SUT/GEN/TET blaTEM / blaCTX-M

MA17eint AMP/AMC/CFE/CRO/CFP/CTF/CIP/ENR/SUT/GEN/TET blaCTX-M

Continua.

Resultados | 54

Grupo III

MA26bint AMP/AMC/CFE/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaCTX-M / ampC / tetA

MA26dint AMP/AMC/CFE/CIP/ENR/CLO/SUT/TET ampC / tetA

MA2a AMP/AMC/CFE/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaTEM / tetA

MA2c AMP/AMC/CFE/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaTEM / tetA

MA3a AMP/AMC/CFE/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaTEM

MA5e AMP/AMC/CFE/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaTEM

Grupo IV

MB1d AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET N

MA2e AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaTEM / tetA

MA3b AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET N

MA5a AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaTEM

MA5b AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaTEM

MA5c AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaTEM

MA5d AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaTEM

MA6b AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaTEM

MA6d AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaTEM

MA8b AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET N

MA9a AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaTEM / tetA

MA9b AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaTEM / tetA

MA9c AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaTEM / blaCTX-M / tetA

MA9d AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaTEM / tetA

MA37c AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET N

MA37d AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET N

MA37e AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET N

MA39c AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET N

MA39d AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET N

MA39e AMP/AMC/CIP/ENR/CLO/SUT/TET N

Grupo V

MB2e AMP/AMC/CFP/CIP/ENR/CLO/SUT/TET N

MA39a AMP/AMC/CFP/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaCTX-M

MA9e AMP/AMC/CFP/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaTEM / blaCTX-M / tetA

MA6a AMP/AMC/CFP/CIP/ENR/CLO/SUT/TET blaTEM

Grupo VI

MA3e AMP/AMC/CFE/CFP/CIP/ENR/CLO/SUT/GEN/TET blaTEM

MA3c AMP/AMC/CFE/CIP/ENR/CLO/SUT/GEN/TET N

*Perfil intermediário foi considerado como resistente. AMP: ampicilina, AMC: amoxicilina/ácido clavulânico; CFE: cefalexina; CRO: ceftriaxona; CFP: cefoperazona; CTF: ceftiofur; CIP: ciprofloxacina; ENR: enrofloxacina; CLO: cloranfenicol; SUT: sulfametoxazol/trimetoprim; GEN: gentamicina; TET: tetraciclina. N: negativo. int: cepas com integron.


Resultados | 55

Figura 8. Dendrograma obtido pela técnica de PFGE a partir da digestão enzimática com

XbaI do DNA cromossômico de E. coli isoladas de dípteros muscoides coletados em

propriedades leiteiras da região de Botucatu, SP (2015) e os respectivos genes de resistência e

grupos filogenéticos. Padrão gerado por UPGMA, utilizando coeficiente de Dice com

tolerância e otimização de 1%. *Os números de 1 a 36 representam os pulsotipos. I a VI representam a organização das cepas segundo o perfil de resistência antimicrobiana obtido. Cepas com integron; N: negativo; NT: não tipável.

Resultados | 56

4.9. Conjugação

As oito cepas de E. coli que apresentaram integrons foram selecionadas como

doadoras para o ensaio de conjugação in vitro, uma vez que um dos objetivos propostos foi

verificar a transferência desses elementos genéticos, assim como dos genes de resistência a

antimicrobianos presentes nessas cepas.

Dada a possibilidade da localização cromossomal dos integrons, os

antimicrobianos estruturalmente relacionados a esses elementos, como as sulfonamidas, não

puderam ser utilizados na seleção das cepas transconjugantes obtidas após a conjugação.

Portanto, o antimicrobiano selecionado para esse fim foi a tetraciclina, uma vez que é

amplamente administrada em animais de produção e a resistência em cepas bacterianas é bem

documentada (Marshall e Levy, 2011). Além disso, alguns trabalhos já descreveram relação

entre genes de resistência a tetraciclinas e integrons de classe 1, uma vez que ambos podem

estar localizados no mesmo elemento móvel (Agersø e Sandvang, 2005).

A fim de confirmar a transferência dos genes relacionados à resistência

antimicrobiana, os testes fenotípicos foram repetidos para as cepas doadoras e

transconjugantes, assim como as PCRs utilizando DNA total de ambas. Os resultados

referentes às cepas doadoras e transconjugantes estão apresentados na Tabela 9.

Adicionalmente, os plasmídeos das cepas transconjugantes e doadoras foram purificados pela

técnica da lise alcalina (Figura 9) e as PCRs, anteriormente realizadas com DNA total, foram

repetidas utilizando o DNA plasmidial extraído pela técnica (Tabela 10). Os plasmídeos

extraídos das cepas transconjugantes não puderam ser nitidamente visualizados nas condições

estabelecidas pela técnica (Figura 9).

É possível verificar que a resistência fenotípica aos antimicrobianos testados

apresenta genes ligados a elementos conjugativos, uma vez que as colônias transconjugantes

adquiriram perfis resistentes. Apesar de o perfil de resistência ter se mantido nas

transconjugantes de MA17a, MA17b, MA17c, MA17d e MA17e, estas apresentaram as

medidas dos halos de inibição diferentes da doadora (exceto MA17e), significando perfis

intermediários de resistência, mas que foram considerados no trabalho todo, para

contabilização, como perfis resistentes.

Já as cepas MA26a, MA26b e MA26d apresentaram resultados divergentes entre

as cepas doadoras e suas respectivas transconjugantes quanto a produção de ESBL (Tabela 9).

Esses resultados são complementados com as imagens dos testes de disco aproximação

presentes no Apêndice A.

Resultados | 57

A cepa doadora MA26b não foi contabilizada no item 4.2 pois não foi resistente a

cefalosporinas de terceira geração, porém apresentou resultado positvo para a produção de

ESBL em aztreonam (Tabela 9; Apêndice A) .

Os resultados expostos nas Tabelas 9 não incluem o gene ampC, pois a cepa

receptora E. coli J53, utilizada no ensaio de conjugação, apresentou amplificação desse gene

na PCR, o que pode ser devido a origem constitutiva de ampC em E. coli (Peter-Getzlaff et

al., 2011), apesar de as cepas de E. coli analisadas no presente estudo terem apresentado

baixas frequências de detecção (Propriedade A, 6/135 e Propriedade B, 5/63).

Interessantemente, o gene tetA foi amplificado apenas nas cepas transconjugantes

de MA17b e MA17d, e a região variável 5’CS-3’CS não foi dectada na cepa MA26a doadora,

apesar desta ser comprovadamente uma das cepas positivas para integron de classe 1.

Figura 9. Eletroforese em gel de agarose 0,8% dos plasmídeos extraídos pelo método de lise

alcalina, correspondentes às cepas de E. coli transconjugantes (A) e doadoras (B). 1: E. coli V517; 2: MA17a; 3: MA17b; 4: MA17c; 5: MA17d; 6: MA17e; 7: MA26a; 8: MA26b; 9: MA26d; 10:

E. coli J53; 11: MA17a; 12: MA17b; 13: MA17c; 14: MA17d; 15: MA17e; 16: MA26a; 17: MA26b; 18:

MA26d.

A B

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Peter-Getzlaff%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21653764

Resultados | 58

Tabela 9. Perfil de resistência fenotípica* e genotípica das cepas E. coli doadoras e transconjugantes(t)

obtidas no ensaio de conjugação.

Cepa Resistência fenotípica Genes de resistência

DD** DA§

(ESBL)

intI 5CS-3CS dfrA7 qac sul1 blaTEM blaCTX-M tetA

DNA total

MA17a AMP/AMC/CFE/CRO/CFP/CTF/CIP/ENR/SUT/GEN/TET CAZ/ATM + + + + + - + +

MA17at AMP/AMC/CFE/CRO/CFP/CTF/CIP/ENR/SUT/GEN/TET ATM + + + + + - + +

MA17b AMP/AMC/CFE/CRO/CFP/CTF/CIP/ENR/SUT/GEN/TET CAZ/ATM + + + + + + + -

MA17bt AMP/AMC/CFE/CRO/CFP/CTF/CIP/ENR/SUT/GEN/TET ATM + + + + + - + +

MA17c AMP/AMC/CFE/CRO/CFP/CTF/CIP/ENR/SUT/GEN/TET CAZ/ATM + + + + + + + +

MA17ct AMP/AMC/CFE/CRO/CFP/CTF/CIP/ENR/SUT/GEN/TET ATM + + + + + - + +

MA17d AMP/AMC/CFE/CRO/CFP/CTF/CIP/ENR/SUT/GEN/TET CAZ/ATM + + + + + + + -

MA17dt AMP/AMC/CFE/CRO/CFP/CTF/CIP/ENR/SUT/GEN/TET ATM + + + + + - + +

MA17e AMP/AMC/CFE/CRO/CFP/CTF/CIP/ENR/SUT/GEN/TET CAZ/ATM + + + + + - + +

MA17et AMP/AMC/CFE/CRO/CFP/CTF/CIP/ENR/SUT/GEN/TET ATM + + + + + - + +

MA26a

AMP/AMC/CFE/CFP/CIP/ENR/CLO/SUT/TET N + - + + + + + +

MA26at AMP/AMC/CFE/CRO/CFP/CTF/CIP/ENR/CLO/SUT/TET ATM/CTX + + + + + + + +

MA26b AMP/AMC/CFE/CIP/ENR/CLO/SUT/TET ATM + + + + + + + +

MA26bt AMP/AMC/CFE/CRO/CFP/CTF/CIP/ENR/CLO/SUT/TET CAZ + + + + + + + +

MA26d AMP/AMC/CFE/CIP/ENR/CLO/SUT/TET N + + + + + + + +

MA26dt AMP/AMC/CFE/CRO/CFP/CTF/CIP/ENR/CLO/SUT/TET N + + + + + + + +

J53 Sensível a todos os antimicrobianos testados N - - - - - - - -

*Perfil intermediário foi considerado como resistente.**DD: disco difusão/antibiograma; § DA:disco aproximação; ESBL: β-lactamase de espectro estendido; N: negativo; AMP: ampicilina,

AMC: amoxicilina/ácido clavulânico; CFE: cefalexina; CRO: ceftriaxona; CFP: cefoperazona; CTF: ceftiofur; CIP: ciprofloxacina; ENR: enrofloxacina; CLO: cloranfenicol; SUT: sulfametoxazol/trimetoprim; GEN: gentamicina; TET: tetraciclina; CAZ: ceftazidima; ATM: aztreonam; CTX: Cefotaxima; SUT: presença de colônias hipermutantes no interior do halo de 21mm de diâmetro.

Resultados | 59

Tabela 10. Resultados para os genes de resistência a partir de DNA plasmidial extraído por

lise alcalina nas cepas de E. coli doadoras e transconjugantes, obtidos por PCR.

Cepa Genes de resistência

intI 5CS-3CS dfrA7 qac sul1 blaTEM blaCTX-M tetA

DNA plasmidial

MA17a - - - + - - - -

MA17at + + + + + - + +

MA17b - - - - - - - -

MA17bt + + + + + - + +

MA17c - - - - - - - -

MA17ct + + + + + - + +

MA17d - - - - - - - -

MA17dt - + + + - - + +

MA17e - - - - - - - -

MA17et + + + + + - + +

MA26a

- - + + - - - -

MA26at + + + + + - + +

MA26b - - + + - - - -

MA26bt + + + + + - - -

MA26d - - + + - - - -

MA26dt + + + + + - - -

J53 - - - - - - - -

t Cepas transconjugantes

V - Discussão

Discussão | 61

O ambiente é considerado fonte de resistência antimicrobiana, uma vez que os

micro-organismos presentes nas comunidades bióticas do solo e água naturalmente

apresentam genes de resistência devido à produção de antibióticos por outras bactérias e

fungos, além da constante pressão seletiva a qual estão submetidos devido a resíduos de

antimicrobianos depositados no ambiente, advindos da utilização na medicina humana,

veterinária e na agricultura (Allen et al., 2010; Costa et al., 2013).

Nesse sentido, vários autores têm proposto esquemas que buscam conectar as

fontes de resistência antimicrobianas não naturais às vias de disseminação no ambiente

(Khachatourians, 1998; Marshall, 2009; Cantas et al., 2013; Costa et al., 2013; Berglund,

2015).

Considerando que nenhum dos trabalhos consultados inclui a veiculação de

bactérias multirresistentes por moscas nas rotas de disseminação ambiental de resistência

antimicrobiana, este estudo buscou caracterizar a resistência de E. coli isoladas de moscas em

ambiente de ordenha, a fim de propor que bactérias constituintes da microbiota de animais

eliminadas em excrementos podem ser transportadas por moscas, fato ainda pouco discutido

na literatura (Marshall et al., 1990; Rahuma et al., 2005; Macovei e Zurek, 2006; Rybaríková

et al., 2010; Usui et al., 2013; Wang, 2013; Blaak et al., 2014; Zurek e Ghosh, 2014; Solà-

Ginés et al., 2015; Usui et al., 2015).

Entre as espécies de dípteros muscoides coletadas, Musca domestica foi a espécie

mais abundante nas duas propriedades estudadas, o que já era esperado devido a elevada

sinantropia que apresenta (Povolný, 1971).

A maioria das cepas de E. coli multirresistentes (68%) isoladas da superfície

externa de cada grupo de moscas, apresentaram resistência a cinco classes de antimicrobianos

– β-lactâmicos, quinolonas, fenicois, inibidores de folato e tetraciclinas ou β-lactâmicos,

quinolonas, inibidores de folato, aminoglicosídeo e tetraciclina. Isso aliado à produção de

enzimas β-lactamases de espectro estendido (ESBLs), detectada em um grupo de cepas a

partir da sinergia entre amoxicilina/ácido clavulânico e ceftazima e aztreonam, indica que tais

cepas estão expostas a pressões seletivas geradas pelos principais antimicrobianos utilizados

na medicina veterinária e humana.

Nesse contexto, destaca-se a resistência a quinolonas, uma vez que a resistência

selecionada para um antimicrobiano do grupo implica em resistência a todos, pois apresentam

o mesmo mecanismo de ação, de modo que a administração não terapêutica em animais é

considerada ilegal em muitos países (Webber e Piddock, 2001), além de serem amplamente

usadas no tratamento de infecções bacterianas na medicina humana (Lastours et al., 2014).

Discussão | 62

Porém, estudos conduzidos na Suécia indicam que a existência de E. coli resistente a

quinolonas parece ser comum em amostras fecais de bovinos, principalmente bezerros (Duse

et al., 2016).

Nesse contexto, Rybaríková et al. (2010), discutiram sobre a possibilidade de

disseminação de cepas oriundas dos bezerros no ambiente, e Costa et al. (2013) alertaram

quanto ao desenvolvimento de resistência cruzada para os antimicrobianos usados na

veterinária, agricultura e tratamento humano, possívelmente devido a similaridade química

que possuem. Segundo Costa et al. (2013), a resistência antimicrobiana encontrada em

bactérias comensais, prediz a resistência em patógenos.

Desse modo, os resultados deste trabalho podem contribuir para confirmação da

hipótese apresentada por Solà-Ginés et al. (2015) que bactérias provenientes de moscas

podem refletir as condições da microbiota dos animais.

Os isolados das Propriedades A e B diferiram quanto à frequência relativa de

resistência fenotípica e genotípica, uma vez que os resultados obtidos para a Propriedade A

foram maiores em relação à Propriedade B.

Em contrapartida, quanto aos genes cromossomais gyrA, parC e ampC era

esperado que todas as cepas de E. coli testadas apresentassem amplificação na PCR, já que

correspondem a sequências de genes constitutivos bacterianos (gyrA e parC) (Jacoby, 2005)

e de E. coli (ampC) (Peter-Getzlaff et al., 2011). No entanto, das 198 cepas isoladas da

Propriedade A e B, 124 foram negativas para gyrA, 143 para parC e 187 para ampC. Tais

resultados podem significar diferenças nas enzimas em relação às de referência e devem ser

estudadas em maiores detalhes.

Quanto aos fatores de virulência investigados, todas as sete amostras de E. coli

positivas para verotoxina (vt1) detectadas foram isoladas de M. domestica, analogamente aos

estudos de Moriya et al. (1999), e de maneira geral, as amostras apresentaram frequência de

genes de virulência relativamente baixos para as cepas de E. coli isoladas da Propriedade A e

ausentes para a Propriedade B.

A ausência de associação entre multirresistência e virulência, aliada à baixa

frequência ou ausência de genes de virulência nas E. coli estudadas, sugere que a

multirresistência está direcionada às cepas comensais. Este dado é sustentado pela

classificação de mais de 72% das cepas multirresistentes no grupo filogenético B1,

conhecidos como comensais, sendo o mais frequente em E. coli de animais (Tenaillon et al.,

2010).

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Peter-Getzlaff%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21653764

Discussão | 63

Nesse contexto, Beceiro et al. (2013) apresentaram um extenso trabalho de

revisão, discutindo os mecanismos e as vantagens evolutivas da seleção de genes de

resistência antimicrobiana e de virulência em bactérias, no qual argumentaram que a

vantagem evolutiva bacteriana constituiria na cosseleção de resistência e virulência, de modo

que os casos de resistência elevada e virulência diminuída, levaria a um processo de seleção

mais longo até que alguns genes de virulência apresentassem vantagens suficientes para serem

fixados na população. Considerando esses mecanismos os autores concluem alertando para a

necessidade de práticas de monitoramento aliando resistência antimicrobiana e virulência em

cepas e clones.

As diferenças de frequência de resistência e fatores de virulência entre as duas

propriedades pode ser explicada, de acordo com Lara (2016)2, pelo manejo dos bovinos em

cada propriedade. A maior aglomeração de animais na Propriedade A pode facilitar a

circulação e a manutenção de cepas multirresistentes e/ou patogênicas entre os animais,

implicando em surtos mais frequentes e na necessidade de intervenção antibiótica em doses

mais levadas, de modo que as moscas poderiam desempenhar um papel importante na

disseminação dessas cepas nas propriedades leiteiras.

A presença de integron de classe 1 nos isolados de E. coli foi considerada quando

houve genotipo positivo para intI1 e 5’CS-3’CS. Porém, alguns isolados apresentaram apenas

intI1 ou apenas a região variável 5’CS-3’CS. É possível que esses isolados apresentem

organização não frequente do integron de classe 1, mas a ausência do gene sul3 (confere

resistência a sulfonamidas) associado a esse evento, indica que outras organizações, diferentes

das estudadas por Sáenz et al. (2010) podem estar presentes.

As oito cepas de E. coli selecionadas para sequenciamento apresentaram o mesmo

arranjo do integron de classe 1, com um único cassete gênico, dfrA7, inserido. A presença de

start códon alternativo “GTG” e sítio de recombinação (59-base element) com 143 pb, parece

ser variável entre dfrA7 de diferentes origens, já que trabalhos caracterizando esses genes e o

presente estudo, apresentaram diferenças no tamanho do sítio de recombinação, o que pode

estar relacionado a mobilização desses genes (Ojo et al., 2002; Kumar et al., 2015).

Os genes dfr estão relacionados à resistência ao antimicrobiano trimetoprim, uma

vez que expressam variantes da enzima diidrofolato redutase que não são sensíveis ao

fármaco (Sköld, 2001). O mecanismo de ação de trimetoprim consiste na analogia química

entre o antimicrobiano e o ácido fólico, que interage com a enzima diidrofolato redutase,

2 Lara, G.H.B. (Médico Veterinário, presta atendimento às propriedades estudadas – Faculdade de Medicina

Veterinária e Zootecnia, Unesp – Botucatu, SP. Comunicação pessoal, 2016).

Discussão | 64

impedindo a redução do ácido diidrofólico e consequentemente a síntese de timina em

procariotos (Sköld, 2001).

Considerando que as cepas de E. coli portadoras de dfrA7 foram isoladas de

moscas diferentes (MA17, M. domestica e MA26 Fannia sp.), e que possuem pulsotipos

distintos, é possível sugerir que dfrA7 pode apresentar disseminação regional, do mesmo

modo que o discutido por Labar et al. (2012) que encontraram altas frequências de integron de

classe 1 com uma única cópia desse cassete gênico em E. coli isoladas de humanos saudáveis

na Nigéria.

Ainda segundo Labar et al. (2012), o arranjo contendo apenas dfrA7 no integron

não é comum na literatura, e não há registros desse cassete gênico em isolados no Brasil.

A avaliação do perfil clonal revelou elevada diversidade cromossômica entre as

cepas de E. coli multirresistentes, dentre os quais destaca-se a presença de três perfis

genéticos apresentando 100% de similaridade (MB2e, MA39b e MA39d) provenientes de

insetos coletados em propriedades diferentes e que exibiram diferentes perfis de resistência

(fenotípico e genotípico), representadas pelo pulsotipo 24. Este pulsotipo apresentou

similaridade maior que 90% com os pulsotipos 21 (MA2d), 22 (MA6a), 23 (MB1d), 25

(MA8d) e 26 (MA39c), exibindo perfis de resistência diferentes entre si.

A presença de isolados clones em propriedades distintas e relativamente distantes

(35 km entre Propriedade A e B), com perfis de resistência antimicrobiana distintos, indica

que cepas podem ser disseminadas no ambiente assim como os genes de resistência.

As cepas MA39b e MA39d, apesar de serem isoladas de uma única mosca

(família Muscidae) e apresentarem perfil genético 100% similar (pulsotipo 24), são diferentes

quanto aos genes de resistência que possuem e à sensibilidade aos antimicrobianos testados.

Diferentemente, as cepas MA26d e MA26e, isoladas de uma única mosca (Fannia sp.),

apresentaram similaridade menor que 80%, mas os mesmos genes de resistência

Diante disso e das discussões realizadas anteriormente, é possível notar que uma

única mosca pode veicular cepas clones com genes de resistência distintos, ou que moscas

diferentes podem veicular cepas não relacionadas, porém com os mesmos genes – como

ocorrido com as cepas portadoras de integron de classe 1.

Nesse sentido, a investigação de integrons teve por objetivo estabelecer um

referencial para os estudos de disseminação molecular da resistência a antimicrobianos, de

modo que os resultados obtidos com PFGE, aliados as diferenças e similaridades dos perfis de

sensibilidade antimicrobiana, suportam a interpretação que genes de resistência e integrons

Discussão | 65

podem ser disseminados não apenas por meio de cepas clones, mas também ao serem

transferidos por elementos genéticos conjugativos.

Ensaios de conjugação são importantes para avaliar a capacidade de disseminação

de genes por essa via, devido à associação com elementos conjugativos que podem estar

presentes no genoma bacteriano.

Os resultados obtidos e apresentados na Tabela 9 indicam que o integron de classe

1 e os outros genes de resistência presentes nas cepas testadas, com exceção de blaTEM, podem

ser transferidos por conjugação, assim como aqueles envolvidos nos perfis de resistência

fenotípicos e na produção de ESBLs. No entanto, alguns resultados atípicos foram observados

nas cepas transconjugantes. Interessantemente, as cepas transconjugantes de MA26a, MA26b

e MA26d, expressaram no teste de difusão com discos, além da resistência anteriormente

verificada para as doadoras, resistência a ceftriaxona e ceftiofur (MA26a), e a ceftriaxona,

cefoperazona sódica e ceftiofur (MA26b e 26d). Adicionalmente, no ensaio de aproximação

de discos, a cepa transconjugante de MA26a produziu ESBL diante dos antimicrobianos

aztreonam e cefotaxima, sendo que na cepa doadora a produção de ESBL não havia sido

identificada, e a cepa transconjugante MA26b para ceftazidima, porém, a produção de ESBL

havia sido identificada apenas para aztreonam na cepa doadora.

A partir disso, é possível propor que os resultados obtidos podem estar

relacionados à regulação da expressão de genes de resistência aos β-lactâmicos de terceira

geração nas cepas doadoras, uma vez que tais genes poderiam estar sobre o efeito de

repressores e/ou que tiveram a expressão induzida com a ocorrência da conjugação.

Segundo Depardieu et al. (2007), a expressão de resistência antimicrobiana é

constantemente regulada, pois a manutenção desses genes em ambientes favoráveis

significaria gasto energético desnecessário, e diante desse tema elaboraram uma revisão dos

mecanismos envolvidos na regulação gênica da resistência. Uma das formas de regulação

apresentadas pelos autores, e que são relacionadas aos resultados deste trabalho, diz respeito

às funções de regulação que podem ser desempenhadas por elementos de inserção e integrons,

uma vez que os elementos de inserção podem conter nas extremidades sequências parciais ou

completas de promotores que conduzem a expressão de genes vizinhos.

São conhecidos vários elementos de inserção portadores de promotores que atuam

na transcrição de genes de ESBLs, dentre os quais se destaca o elemento ISEcp1, responsável

pela regulação da expressão de fenótipos resistentes a cefotaxima, aztreonam e ceftazidima,

em enterobactérias e Pseudomonas aeruginosa, afetando principalmente os genes blaCTX-M

(Depardieu et al., 2007). Adicionalmente, é conhecida a associação de ISEcp1 com a

Discussão | 66

mobilização de blaCTX-M por transposição e como os genes blaCTX-M podem estar localizados

downstream de integrons de classe 1, é possível relacioná-los também a esses elementos

(Poirel et al., 2008), sendo que, no Brasil, o elemento de inserção ISEcp1 já foi associado a

blaCTX-M em enterobactérias de origem humana (Minarini et al., 2009).

Nesse sentido, é plausível que as cepas transconjugantes que apresentaram

produção de ESBLs apresentem genes regulados por ISEcp1. Porém, estudos mais

minunciosos precisam ser realizados a fim de comprovar tal hipótese.

Por outro lado, os plasmídeos das cepas transconjugantes, extraídos por lise

alcalina, não puderam ser visualizados nitidamente nas condições estabelecidas pela técnica,

enquanto que aqueles extraídos das cepas doadoras sim (Figura 9), de modo que PCRs a partir

do DNA plasmidial extraído foram realizados. No entanto, alguns genes não foram

amplificados a partir do DNA plasmidial de cepas doadoras, mas somente das

transconjugantes (Tabela 10).

Diante disso, duas situações são possíveis: a) os genes estudados estão localizados

no DNA cromossômico na forma de elementos conjugativos integrados ao cromossomo

(como transposons conjugativos ou epissomos), de modo que foram transferidos através da

conjugação e permaneceram na conformação circular covalentemente fechada após o

processo, sendo os genes detectados por PCR, mas os plasmídeos não; b) os genes estão

localizados em megaplasmídeos e os plasmídeos de tamanhos menores purificados por lise

alcalina e visualizados em eletroforese comum não correspondem aos elementos onde os

genes estudados estão localizados.

Os elementos conjugativos integrados ao cromossomo (ICE, do inglês integrative

and conjugative element) são grandes, apresentando tamanho de 20 kb até 500 kb, pois

carregam todos os genes necessários a conjugação, podendo portar elementos de inserção,

transposons e integrons. Vários estímulos podem estar envolvidos na indução da conjugação

desses elementos, tais como resposta SOS, contato entre células e indução dependente do

fenótipo, de modo que é conhecido que tetraciclina pode induzir conjugação em ICE (Johnson

e Grossman, 2015).

A extração de plasmídeos pela técnica de lise alcalina é amplamente conhecida e

utilizada para a detecção de plasmídeos em várias situações, porém, o tamanho dos

plasmídeos é um fator limitante da técnica, uma vez que megaplasmídeos podem ser

renaturados juntamente com o DNA cromossomal (Pedraza e Díaz, 2002), além de as

condições oferecidas por equipamentos de eletroforese convencional não permitirem a

Discussão | 67

visualização de plasmídeos grandes, sendo necessária a digestão do DNA com enzima S1 e

separação dos fragmentos por PFGE (Barton et al., 1995).

Devido às características gerais dos ICEs e as limitações da técnica utilizada, é

possível propor que ambas as hipóteses (a e b) anteriormente apresentadas são aceitáveis e

podem ter acontecido em conjunto, pois, ICEs são grandes e, portanto não detectáveis em

eletroforese convencional quando em estado não integrado ao cromossomo.

Outra situação incomum ocorrida durante a execução do trabalho foi a

inconstância na amplificação de algumas regiões como 5’CS-3’CS, do gene tetA e blaTEM,

quando réplicas de PCR da mesma amostra apresentaram resultados distintos, ou quando a

cepa doadora não amplificou o gene transferido à transconjugante. Tais eventos podem estar

relacionados à inespecificidade dos iniciadores usados frente às amostras testadas ou resultado

da atuação de elementos móveis associados a esses casos.

Apesar de resistência a antimicrobianos em cepas bacterianas ser um tema

mundialmente difundido e amplamente estudado, ainda são poucos os trabalhos direcionados

aos mecanismos envolvidos na resistência de cepas de origem animal, as práticas veterinárias

e às pressões ambientais envolvidas na seleção dos micro-organismos resistentes.

No presente estudo, são apresentados resultados inéditos no Brasil referente à

possibilidade de disseminação de E. coli comensais multirresistentes por meio de moscas,

dado que fornece subsídios para a inclusão desses insetos nas rotas de disseminação ambiental

de resistência antimicrobiana, o que é favorecido pelo comportamento sinantrópico e

comunicativo das moscas.

VI – Conclusões

Conclusões | 69

Diante dos resultados obtidos é possível concluir que espécies de dípteros

muscoides podem veicular, em ambiente de ordenha, cepas de E. coli não patogênicas

multirresistentes a antimicrobianos com e sem integrons e cepas de E. coli potencialmente

patogênicas não multirresistentes, de modo que dípteros muscoides podem contribuir para a

disseminação de resistência antimicrobiana, associada a E. coli, entre os animais e o ambiente

ao veicularem cepas e/ou clones, que apresentam diversidade de perfis de resistência

fenotípico e genotípico.

VII - Referências Bibliográficas

Referências Bibliográficas| 71

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VIII – Apêndices

Apêndices| 87

APÊNDICE A – Resultado do ensaio de disco aproximação para a dectação fenotípica

de ESBL em cepas de E. coli doadoras e transconjugantes obtidas após conjugação.

Cepas doadoras: A: MA17a; B: MA17b; C: MA17c; D: MA17d; I: MA17e; J: MA26a; K: MA26b; L: MA26d.

Cepas transconjugantes: E: MA17a; F: MA17b; G: MA17c; H: MA17d; M: MA17e; N: MA26a; O: MA26b; P:

MA26d.

A B C D

E F G H

I J K L

M N O P

Apêndices| 88

APÊNDICE B – Antibiograma da cepa transconjugante MA17d. Colônias

hipermutantes no interior do halo de inibição de sulfametazol/trimetoprim (SUT).

IX – Anexos

Anexos| 90

ANEXO A – Declaração sobre bioética e biossegurança.

Anexos| 91

ANEXO B – Declaração sobre a não infringência da lei nº 9610/98 e do direito autoral de

qualquer editora

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