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EVELINE JUNQUEIRA SILVA
ESPECTROSCOPIA RAMAN E HISTOPATOLOGIA CLÁSSICA NA AVALIAÇÃO DE TENDINITE INDUZIDA POR COLAGENASE EM
RATOS WISTAR Dissertação apresentada à Universidade de Franca, como exigência parcial para a obtenção do título de Mestre em Promoção de Saúde. Orientador: Prof. Dr. César Mello Co-Orientador: Prof. Dr. Márcio Botelho
FRANCA 2005
DEDICO aos meus pais, Paulo e Maria do Carmo, ao meu noivo, Gilney, e à minha irmã, Viviane, pelo amor, dedicação, incentivo e apoio em todas as etapas da minha vida, pela compreensão nos momentos de ausência e pela amizade sem fim. Vocês são os meus Anjos...
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao meu orientador, Prof. Dr. César Mello, pelo incentivo, ensinamentos e orientação durante a execução deste trabalho e pelo entusiasmo em aceitar novos desafios.
Ao Prof. Dr. Márcio Botelho, meu co-orientador, pelas importantes contribuições ao trabalho e pela disponibilidade e gentileza com que sempre me recebeu.
Ao Prof. Ms. José Alexandre Bachur, pela inestimável ajuda, pelos valiosos conselhos, pela amizade e pelo exemplo.
Aos colegas do Grupo de Espectroscopia Vibracional e Quimiometria da UNIFRAN, em especial ao Diórgenes por toda a ajuda e direcionamento durante a obtenção e tratamento dos espectros Raman, e à Márcia, pelo companheirismo, participação e empenho durante a execução do experimento.
Ao Sr. Luís, funcionário do Laboratório de Dissecação de Peças, pela grande disponibilidade em compartilhar comigo um pouco da sua arte.
Aos funcionários do Laboratório de Patologia, Alexandre e José Luís, pela valiosa ajuda, durante e depois da realização do experimento, e pela preparação das lâminas.
Às funcionárias do Biotério, Marta e D. Hermelinda, pela alegre disposição em colaborar, aprender e ensinar.
Aos Professores, estagiários e funcionários do Departamento de Química, Hospital Veterinário e Clínica de Fisioterapia da Universidade de Franca.
Aos funcionários da Secretaria de Pós-Graduação, em especial às secretárias Ana Maria e Tatiana, sempre atenciosas, competentes e dispostas a ajudar.
A todos os colegas da Pós-Graduação pela amizade e convivência gratificante, especialmente Álvaro, Virgínia e Elaine, nosso “Trem das Dez”.
Aos meus pais, pelo exemplo, pelos sacrifícios, por acreditarem em mim e por me proporcionarem alcançar mais uma conquista.
Ao meu noivo, pelo carinho, por seus conselhos, por torcer por mim, pela paciência em me ouvir naquelas horas em que “só você me entende” e por me compreender e me esperar.
À minha irmã, companheira e amiga, por dividir comigo a bagunça, as contas e a limpeza da casa, mas também pela companhia, conversas e risadas.
Aos amigos e familiares, grandes incentivadores. A Deus, por tudo isso e por todos vocês... Obrigado!
RESUMO
SILVA, Eveline Junqueira. Espectroscopia Raman e histopatologia clássica na avaliação de tendinite induzida por colagenase em ratos Wistar. 2005. 78 f. Dissertação (Mestrado em Promoção de Saúde) – Universidade de Franca, Franca.
Neste trabalho utilizou-se uma nova abordagem ainda pouco explorada para a avaliação e quantificação da tendinite através da espectroscopia Raman, com espectrômetros de baixa resolução (785 nm), e métodos quimiométricos. Para isso empregou-se o modelo experimental de tendinite produzida pela colagenase intratendínea em Rattus norvegicus variedade Wistar. A avaliação do processo inflamatório intratendíneo foi feita, além dos métodos espectroscópicos, através de estudo histopatológico clássico utilizando-se avaliação microscópica de tecidos corados com hematoxilina-eosina (HE). Propôs-se o uso de métodos matemáticos para o pré-processamento dos espectros (remoção de efeitos de matriz dos tecidos e identificação de bandas) e o uso de métodos quimiométricos de classificação para o modelamento eficiente do método desenvolvido, devido à baixa resolução do espectrômetro e similaridade estrutural do tecido avaliado, o que acarreta forte similaridade espectral. A análise dos resultados nos mostrou que é possível avaliar a evolução do processo de tendinite através da espectroscopia Raman cujos resultados foram fortemente correlacionados com os achados.
Palavras-chave: Tendinite; Colagenase; Histopatologia; Espectroscopia Raman.
ABSTRACT
SILVA, E.J. Raman spectroscopy and classical histology to evaluation a collagenase-induced model of tendinitis in Wistar rats. 2005. 78 f. Dissertação (Mestrado em Promoção de Saúde) – Universidade de Franca, Franca.
In this work was used a new approach for the evaluation of tendinitis through Raman spectroscopy and chemometrics methods. For so much was used the experimental model of tendinitis induced by collagenase in Rattus norvegicus variety Wistar. The evaluation of the inflammatory process was done by Raman spectroscopy and classical Histological methods using microscopic evaluation of tissues stained with hematoxylin and eosin (HE). It proposes the use of mathematical methods for pre-processing of the spectra and the use of classification chemometrics methods for efficient modeling of the data, due to low resolution of the spectrometer and high similarity of the tissue evaluated. The analysis of the results showed that it is possible to evaluate the evolution of the tendinitis through Raman spectroscopy whose results were highly correlated with the histological findings.
Key words: Tendinitis; Collagenase; Histology; Raman spectroscopy.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 –– Em A temos um modelo da alfa-hélice da molécula de colágeno ilustrando os átomos de carbono (C), incluindo o Galfa. Em B temos um modelo da alfa-hélice da molécula de colágeno com inclusão dos outros átomos que compõem a estrutura principal. Em C está representada a molécula de colágeno, evidenciando a conformação de tríplice hélice incluindo os radicais que formam as cadeias laterais. Notar as ligações intermoleculares por meio de pontes de hidrogênio (H)
18
Figura 2 –– Em A temos a representação esquemática da tríplice hélice da molécula de colágeno e seu auto-enrolamento organizado. A conformação estrutural é resultado das forças intra e inter-moleculares. A figura B representa um corte transversal do esquema A localizando as ligações intramoleculares realizadas por intermédio das pontes de hidrogênio
19
Figura 3 –– Espectros Raman no infravermelho próximo de tecido cancerígeno de pulmão humano fresco. (a) Estimulado a 785nm [tempo exposto, 1 minuto; potência do laser, 46mW; largura da fenda, 50 µm (5 cm-1)]; (b) Estimulado a 1064nm [tempo exposto, 5 minutos; potência do laser, 38mW; largura da fenda, 150 µm (9 cm-1)]
32
Figura 4 –– Padrão dos espectros Raman no infravermelho próximo obtidos de tecidos de pulmões humanos cancerígenos e normais
32
Figura 5 –– Exemplos de bandas Raman de tecidos de artérias coronárias, excitados a 830nm, em vários estágios de aterosclerose. Notar o proeminente estiramento fosfato de hidroxiapatita de cálcio a 960 cm-1, presente somente no espectro da placa calcificada 33
Figura 6 –– Espectro Raman de tecido mamário (a) normal, (b) benigno e (c) maligno 34
Figura 7 –– Embalagem de Colagenase Sigma®, C6885 39
Figura 8 –– Cabine Plástica com algodão embebido em Halothano
40
Figura 9 –– Halothano 40
Figura 10 –– Dissecação do tendão calcâneo comum esquerdo, Grupo II
41
Figura 11 –– Espectrômetro Raman 42
Figura 12 –– Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo I (Controle). Notar aparência normal da fibras colágenas, fibroblastos e substância básica. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x) 47
Figura 13 –– Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo II, lado D (1 dia após a injeção de colagenase). Notar presença de infiltrado inflamatório intenso. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x) 48
Figura 14 –– Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo II, lado E (1 dia após a injeção de solução fosfato). Notar presença de infiltrado inflamatório peritendíneo moderado. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x) 49
Figura 15 –– Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo III, lado D (3 dias após a injeção de colagenase). Notar presença de células inflamatórias mononucleares. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x) 50
Figura 16 –– Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo III, lado E (3 dias após a injeção de solução fosfato). Notar presença de infiltrado inflamatório peritendíneo discreto HE (A e B 100x) 51
Figura 17 –– Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo IV, lado D (7 dias após a injeção de colagenase). Notar atividade fibroblástica e neovascularização. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x) 52
Figura 18 –– Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo IV, lado E (sete dias após a injeção de solução fosfato). Notar aspecto normal do tecido. HE (A 100x e B 400x) 53
Figura 19 –– Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo V, lado D (14 dias após a injeção de colagenase). Notar produção de fibras colágenas. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x) 54
Figura 20 –– Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo V, lado E (14 dias após a injeção de solução fosfato). Notar ausência de indícios de lesão (A e B) e foco degenerativo discreto (C, D, E e F). HE (A 100x; B 400x; C 40x; D 100x; E e F 400x) 55
Figura 21 –– Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo VI, lado D (28 dias após a injeção de colagenase). Notar tentativa de reorganização tecidual. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x) 56
Figura 22 –– Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo VI, lado E (28 dias após a injeção de solução fosfato). Notar ausência de indícios de lesão. HE (A 40x; B e C 100x; D 400x) 57
Figura 23 –– Esquema de fotos das lâminas histológicas dos grupos I [(controle) A], II [B], III [C], IV [D], V [E] e VI [F], perna D. HE (100x) 58
Figura 24 –– Espectros Raman no infravermelho próximo de tendões de ratos estimulados a 785nm (tempo exposto, 20 segundos; potência do laser, 250mW), antes de realizar o tratamento dos dados 59
Figura 25 –– Espectros Raman no infravermelho próximo de tendões de ratos estimulados a 785nm (tempo exposto, 20 segundos; potência do laser, 250mW), após tratamento quimiométrico. Notar o pico da banda amida apontado pela seta 60
Figura 26 –– Dendograma de dados com processamento centrado na média dos espectros dos Grupos I, II, III, IV, V e VI, lado direito 61
Figura 27 –– Espectros Raman no infravermelho próximo de tendões de ratos do Grupo I, lado direito, e Grupo II, lado esquerdo, plotados juntos, estimulados a 785nm [tempo exposto, 20 segundos; potência do laser, 250mW; largura da fenda, 150 µm (15 cm-1)], antes de realizar o tratamento dos dados 61
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 13
REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................... 15
1 ESTRUTURA TENDÍNEA .............................................................................. 15
1.1 TECIDO CONJUNTIVO DENSO .................................................................... 15
1.2 COLÁGENO ................................................................................................... 16
1.3 TENDÕES ...................................................................................................... 20
1.4 TENDINITE..................................................................................................... 22
1.5 MODELO EXPERIMENTAL DE TENDINITE BIOQUÍMICA ........................... 26
1.6 DIAGNÓSTICO............................................................................................... 26
2 ESPECTROSCOPIA RAMAN ........................................................................ 29
OBJETIVO ................................................................................................................ 37
MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 38
1 ANIMAIS......................................................................................................... 38
2 TENDINITE EXPERIMENTAL ........................................................................ 38
3 ESPECTROSCOPIA RAMAN ........................................................................ 40
4 HISTOPATOLOGIA ....................................................................................... 43
RESULTADOS..........................................................................................................‘45
1 RESULTADOS DA ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA .................................... 45
2 RESULTADOS DA ANÁLISE POR ESPECTROSCOPIA RAMAN ............... 59
DISCUSSÃO ............................................................................................................. 62
CONCLUSÃO ........................................................................................................... 68
REFERÊNCIAS......................................................................................................... 69
ANEXOS ................................................................................................................... 74
13
INTRODUÇÃO
Tendinite é uma condição na qual o tendão agredido exibe uma
resposta inflamatória (KHAN et al., 1999; HYMAN, RODEO, 2000). Deve-se levar em
conta, porém, que em todos os casos de lesões tendíneas a inflamação é a parte
inicial do processo de reparação tecidual (SALATE, 2002).
Estima-se que lesões tendíneas por sobrecarga, incluindo-se as
tendinites, correspondam de 30 a 50% do total das lesões esportivas
(ALMEKINDERS, TEMPLE, 1998; WOO et al., 2000).
Entretanto, até hoje, os métodos tradicionalmente empregados para a
análise de processos inflamatórios teciduais (observação microscópica, p. ex.) têm
fornecido somente uma visão qualitativa destes processos, não sendo possível
quantificar as alterações ultra-estruturais e moleculares dos tecidos sob análise,
dificultando o conhecimento detalhado destes processos. Assim sendo, o
desenvolvimento de novos métodos de análise que permitam a identificação e a
quantificação destas alterações, principalmente àquelas que se referem ao
colágeno, é extremamente desejável e importante.
Saindo-se da dimensão tecidual clássica (macro e microscopia) e
direcionando para a dimensão molecular, a espectroscopia Raman possibilita
quantificar a inflamação e a fibroplasia das lesões tendíneas, visto que os espectros
Raman são fingerprints da estrutura das moléculas que compõem os tecidos
avaliados. Este fato é de grande relevância, pois se abre a possibilidade de
comparar a eficiência de diferentes métodos de análise de tecidos em diferentes
14
escalas, partindo-se da microscopia óptica para o nível molecular. É possível assim
comparar as alterações químicas ocorridas, obviamente, no nível molecular, com as
alterações morfológicas microscópicas observadas no desenvolvimento da tendinite,
resultando no conhecimento mais detalhado deste processo.
A perspectiva de utilização da espectroscopia Raman (SALA, 1995) de
baixa resolução (MELLO, 1997; CLARKE et al., 1998; CLARKE et al., 1999;
WOMBLE et al., 1999) para a quantificação do processo inflamatório tendíneo e
alteração na estrutura colágena é extremamente atraente dada à possibilidade se
obter um fingerprint, ou seja, uma “impressão digital” das transformações teciduais,
podendo-se detectar além das alterações ultra-estruturais, alterações moleculares.
Acrescenta-se a isso os baixos limites de detecção possíveis de serem alcançados
e, principalmente, a diferenciação química a ser obtida. Contudo, a sobreposição de
bandas espectrais (FURUSJO et al., 1998; BIJLSMA, SMILDE, 1999) e os efeitos de
fluorescência da matriz (HIRSCHFELD, CHASE, 1986; SCHRADER et al., 1999;
HANLON et al., 2000; MAQUELIN et al., 2000), conferem ao sistema características
não lineares que podem dificultar a quantificação do processo inflamatório em
questão.
Uma alternativa bastante viável para a quantificação da tendinite,
utilizando espectroscopia Raman, é a aplicação de métodos não lineares de
classificação/calibração multivariada (SEKULIC et al., 1993; ZUPAN et al., 1994;
CHAN et al., 1997; CLADERA et al., 1997). Dentre os métodos não lineares de
classificação/calibração multivariada, destacam-se os métodos quimiométricos de
reconhecimento de padrões, como, por exemplo, Hierarchical Cluster Analysis
(HCA), que permite desenvolver sistemas automatizados para o reconhecimento de
padrões diagnósticos (MELLO et al., 1999).
15
REVISÃO DE LITERATURA
1 ESTRUTURA TENDÍNEA
1.1 TECIDO CONJUNTIVO DENSO
O tecido conjuntivo denso fornece a matriz de suporte para
praticamente todos os órgãos (WEISS; GREEP, 1981). Ele é composto por células
(fibroblastos, macrófagos e mastócitos); fibras (colágeno e elastina) e substância de
sustentação (glicosaminoglicanas, proteoglicanas e glicoproteínas) (KOEKE, 2003).
Muitas vezes as fibras predominantes são responsáveis por certas
propriedades do tecido (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1999). O comportamento
mecânico como resistência à compressão, tensão, extensibilidade e torção são
influenciados pelas propriedades físicas do colágeno e outras fibras; organização da
arquitetura das fibras; tipo de fibras de colágeno; proporção de colágeno e outras
fibras; maturidade de fibras de colágeno; orientação das fibrilas; diâmetro e
comprimento dessas fibrilas e quantidade, tipo, arranjo e hidratação das substâncias
de sustentação (BIRK et al., 1997; CULAW; CLARK; MERRILEES, 1999; KOEKE,
2003).
A substância de sustentação, também chamada matriz extracelular do
16
tecido conjuntivo, é um gel incolor, muito hidratado e transparente que preenche o
espaço entre as células e as fibras do conjuntivo, constituindo um veículo para a
passagem de células, moléculas hidrossolúveis e íons diversos, e uma barreira à
penetração de microrganismos. Por sua hidratação, as moléculas de proteoglicanas
ocupam enorme espaço, tornando-se muito eficientes para resistir a forças de
compressão, enquanto as fibras colágenas são muito resistentes a forças de
distensão (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1999).
1.2 COLÁGENO
O colágeno é a proteína mais abundante no corpo humano,
representando 30% do total das proteínas do organismo (JUNQUEIRA; CARNEIRO,
1999). Ele compõe a matriz extracelular dos animais multicelulares, com cerca de 19
tipos distintos de colágeno, todos com características individuais que determinam as
funções específicas dos diferentes tecidos (CULAW et al., 1999).
Assim como outros tecidos conectivos fibrosos, os tendões são
compostos primariamente por colágeno tipo I, com quantidades menores dos tipos
III, IV, V e VI (HYMAN; RODEO, 2000).
O colágeno provê ao tendão resistência tênsil, enquanto a matriz
extracelular fornece suporte estrutural para as fibras colágenas e regula a
transformação extracelular de procolágeno em colágeno maduro (KHAN et al.,
1999).
A unidade protéica que se polimeriza para formar fibrilas colágenas é
uma molécula alongada denominada tropocolágeno, que mede 280 nm de
17
comprimento por 1,5 nm de espessura. A molécula de tropocolágeno consiste em
três cadeias polipeptídicas dispostas em hélice. As diferenças na estrutura química
dessas cadeias são responsáveis pelos vários tipos de colágeno (JUNQUEIRA;
CARNEIRO, 1999).
Essa estrutura molecular relativamente simples é insolúvel em água,
uma propriedade que lhe é conferida pela grande concentração de aminoácidos
hidrofóbicos, quer no interior da proteína, quer na sua superfície (LEHNINGER;
NELSON; COX, 1995).
Nos colágenos dos tipos I, II e III, as moléculas de tropocolágeno se
agregam em unidades miofibrilares que se juntam para formar fibrilas. Pontes de
hidrogênio e interações hidrofóbicas são importantes para a união dessas unidades
que, posteriormente, são reforçadas por ligações covalentes, catalisadas pela
atividade da enzima extracelular lisil-oxidase, que oxida moléculas do aminoácido
lisina, estabelecendo pontes entre elas (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1999).
O colágeno tem a seguinte composição: 35% em glicina, 11% em
alanina, 21% em prolina e hidroxiprolina. O conteúdo incomum em aminoácidos do
colágeno é devido às restrições estruturais únicas da hélice do mesmo. A seqüência
de aminoácidos no colágeno é, em geral, uma unidade tripeptídica, glicina-X-prolina
ou glicina-X-hidroxiprolina, onde X pode ser qualquer um dos 20 aminoácidos
padrão (LEHNINGER; NELSON; COX, 1995).
Sua resistência mecânica é aumentada pelo enrolamento helicoidal de
múltiplos segmentos em uma super-hélice. O percurso helicoidal da superestrutura
é, em sentido oposto ao enrolamento das hélices polipeptídicas individuais, uma
conformação que permite o enrolamento mais apertado possível das múltiplas
cadeias polipeptídicas. O enrolamento, em super-hélice é provavelmente orientado à
direita. O enrolamento apertado da hélice tríplice do colágeno fornece uma grande
18
Figura 1 – Em A temos um modelo da alfa-hélice da molécula de colágeno ilustrando os átomos de carbono (C), incluindo o Galfa. Em B temos um modelo da alfa-hélice da molécula de colágeno com inclusão dos outros átomos que compõem a estrutura principal. Em C estárepresentada a molécula de colágeno, evidenciando a conformação de tríplice héliceincluindo os radicais que formam as cadeias laterais. Notar as ligações intermoleculares por meio de pontes de hidrogênio (H). Fonte: Modelo modificado de OKUYAMA et al., 1981 apud KOEKE, 2003, p. 20.
resistência a forças de tensão, sem nenhuma capacidade para o estiramento. As
fibras do colágeno podem suportar até dez mil vezes o seu próprio peso e são ditas
possuir resistência à tensão maior que a de um fio de aço de igual área de secção
(LEHNINGER; NELSON; COX, 1995).
A resistência dessa estrutura é também aumentada por ligações
covalentes entre as cadeias polipeptídicas no interior das cordas multi-helicoidais e
entre aquelas que estão adjacentes (LEHNINGER; NELSON; COX, 1995) (Figuras 1
e 2).
19
Figura 2 – Em A temos a representação esquemática da tríplice hélice da molécula de colágeno eseu auto-enrolamento organizado. A conformação estrutural é resultado das forças intra e inter-moleculares. A figura B representa um corte transversal do esquema A localizando as ligaçõesintramoleculares realizadas por intermédio das pontes de hidrogênio. Fonte: Modelo modificado de OKUYAMA et al., 1981 apud KOEKE, 2003, p. 21.
Os fibroblastos são os principais responsáveis pela síntese de
colágeno tipo I. Contudo, outras células como os mastócitos, os macrófagos e
algumas células indiferenciadas originadas do tendão, epitendão e paratendão
podem sintetizá-lo (CHAN et al., 1997; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1999).
A renovação do colágeno é, em geral, muito lenta, e em muitos órgãos,
como tendões e ligamentos, ela é praticamente estável. A degradação, para
renovação, é iniciada por enzimas específicas, as colagenases. Essas enzimas
quebram as moléculas em dois pedaços que são suscetíveis ao ataque de proteases
não específicas (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1999).
A forma dos fibroblastos é normalmente estrelada com poucas
projeções citoplasmáticas correndo entre os feixes de colágeno adjacentes (KOEKE,
2003).
É o conjunto de eventos, intracelulares e extracelulares, que determina
o controle da biossíntese do colágeno. Além de colágeno, o fibroblasto produz
outros componentes da matriz extracelular (KOEKE, 2003).
Próximo à superfície dos fibroblastos, dentro do espaço extracelular, as
moléculas de colágeno são secretadas. Para cada conjunto de cinco moléculas de
20
colágeno há uma compactação para a formação da menor unidade de organização
da fibra de colágeno: a microfibrila. A próxima unidade da organização é a subfibrila,
que agrupadas constituirão as fibrilas. Esta hierarquia reflete a alta organização da
estrutura molecular do colágeno (KOEKE, 2003).
1.3 TENDÕES
Os tendões são estruturas anatômicas densas, bem organizadas e
fibrosas, interpostas entre músculos e ossos, que transmitem a força gerada dentro
do músculo ao osso, tornando possível o movimento articular (KAINBERGER et al.,
1997; KHAN et al., 1999; KOOB; SUMMERS, 2002; RITTY; HERZOG, 2003).
Comparados à maioria de outros sistemas orgânicos, os tendões têm
baixa celularidade e a força é transmitida através de uma cadeia densa de fibras de
colágeno tipo I, fortemente alinhadas através do eixo da força, somadas com várias
proteoglicanas e outras proteínas não colagenosas (RITTY; HERZOG, 2003).
Os tendões normais têm uma superfície branca brilhante, geralmente
coberta por uma fina camada de tecido conectivo. Histologicamente, eles consistem
em fibras colágenas onduladas com fileiras dispersas de fibroblastos com núcleo
alongado. A substância extracelular é esparsa, com fibras longitudinais frouxamente
arranjadas e escassos vasos sanguíneos (LEE et al., 1997).
As fibras são unidas em feixes em uma rede tridimensional por um
septo do endotélio chamado peritendão. Eles se originam de uma fina bainha de
tecido conectivo, chamado epitendão, que envolve o tendão inteiro. Em tendões
maiores, vasos sanguíneos, linfáticos e terminações nervosas passam dentro deste
21
septo, enquanto que tendões pequenos são quase avasculares (KAINBERGER et
al., 1997).
O tendão é inteiramente coberto pelo epitendão, uma bainha fina,
frouxa, de tecido conectivo contendo o suprimento vascular, linfático e nervoso. O
epitendão se estende profundamente dentro do tendão entre o feixe terciário como o
endotendão. Mais superficialmente, o epitendão é envolvido pelo paratendão, tecido
conectivo frouxo, formado essencialmente por fibrilas de colágeno tipo I e tipo III,
algumas fibrilas elásticas e um revestimento interno de células sinoviais. Juntos, o
paratendão e o epitendão são, às vezes, chamados de peritendão (KHAN et al.,
1999).
Bainhas tendíneas também cobrem completa ou parcialmente as
porções do tendão que atravessam uma fáscia ou túnel ósteo-fibroso. Elas
promovem o deslizamento e contribuem para a nutrição do tecido tendíneo.
Considerando que o próprio tendão é pobremente provido de sangue e linfa, a
bainha tendínea, ou paratendão, exerce um papel ativo no remodelamento do tecido
(KAINBERGER et al., 1997).
As fibras colágenas dos tendões são orientadas de modo a oferecer o
máximo de resistência às forças que normalmente atuam sobre o tecido
(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1999). Por isso, essas fibras de colágeno são orientadas
longitudinalmente, transversalmente e horizontalmente com fibrilas de colágeno
longitudinais formando cordões espirais. Esta complexa estrutura proporciona ao
tendão uma capacidade de equilibrar forças longitudinais, transversais, horizontais e
rotacionais durante os movimentos e atividades (WEINSTEIN; BUCKWALTER,
2000; KOEKE, 2003).
Porém, grande parte das fibras é orientada em paralelo ao eixo
longitudinal do tendão, o que permite resistir e transmitir eficientemente às forças
22
unidirecionais geradas dos músculos para os ossos (CULAW; CLARK; MERRILEES,
1999).
Os tendões assumem a forma de cordões fibrosos rígidos, embora
flexíveis e complacentes, consistindo de tecido fibroso denso altamente orientado. O
elevado grau de organização e densidade da matriz reflete uma elevada
concentração de colágeno (WEINSTEIN; BUCKWALTER, 2000).
As junções musculotendinosas devem transmitir eficientemente a força
da contração muscular ao tendão. A inserção do músculo ao tendão ocorre por meio
da continuidade das fibrilas de colágeno das camadas de tecido fibroso do músculo
(epimísio, perimísio, e endomísio) nas fibrilas de colágeno do tendão, e por meio de
uma elaborada interdigitação da membrana da célula muscular com as fibrilas de
colágeno do tendão (WEINSTEIN; BUCKWALTER, 2000).
Moléstias ou lesões que afetam os tendões podem desestabilizar
articulações, ou levar à perda da função muscular. Contraturas com encurtamento
desses tecidos limitam os movimentos musculares e articulares, e contribuem para a
instalação de deformidade esquelética (WEINSTEIN; BUCKWALTER, 2000).
1.4 TENDINITE
Lesões tendinosas são comumente vistas na prática esportiva e vêm
aumentando sua incidência (LEE et al., 1997; CHAN et al., 1997; SALATE, 2002;
DAHLGREN et al., 2002; TSUZAKI et al., 2003). Estimativas do Bureau of Labor
Statistics (USA) indicam que lesões tais como tendinites somam 48% das doenças
ocupacionais relatadas. Os números na medicina esportiva são similarmente
23
impressionantes. Estima-se que lesões tendíneas por sobrecarga correspondam de
30 a 50% do total das lesões esportivas (ALMEKINDERS; TEMPLE, 1998; WOO et
al., 2000).
Tendinopatia é um termo genérico usado para descrever todas as
doenças que se originam nos tendões e ao redor deles (KHAN et al., 1999).
As diferentes maneiras com que o organismo reage frente à agressão
tenossinovial são: tendinites, paratendinites, tenossinovites, apofisites ou uma
combinação de todas elas (SALATE, 2002).
Tendinite é uma condição na qual o tendão agredido exibe uma
resposta inflamatória (KHAN et al., 1999; HYMAN; RODEO, 2000). Deve-se levar em
conta, porém, que em todos os casos de lesões tendíneas a inflamação é a parte
inicial do processo de reparação tecidual (SALATE, 2002).
Sua patofisiologia ainda não é completamente compreendida, mas os
esforços físicos excessivos e repetitivos provocam micro-traumas nos tecidos,
levando, assim, à rupturas tendíneas espontâneas, principalmente nas atividades
esportivas; sobrecarga mecânica; hipertermia local; isquemia ou hipoxemia são
fatores apontados como as causas mais comuns das lesões tendíneas
(ALMEKINDERS; TEMPLE, 1998; WOO et al., 2000; SALATE, 2002; DAHLGREN et
al., 2002; MCLAUCHLAN; HANDOLL, 2003).
Essas lesões são também chamadas de síndromes por sobrecarga,
resultando na inabilidade do tendão em suportar qualquer tensão adicional, ponto
onde os elastômeros biológicos apresentam ruptura (no nível molecular), as ligações
colágenas começam a se quebrar ou uma situação bioquímica local (por exemplo,
acúmulo de radicais ácidos) é criada impossibilitando a continuidade do processo
funcional (ALMEKINDERS; TEMPLE, 1998; SALATE, 2002; MCLAUCHLAN;
HANDOLL, 2003).
24
Se a lesão causada pelo movimento repetitivo continua até exceder a
capacidade de reparação do tendão, uma lesão tendínea sintomática ou tendinite irá
se desenvolver. Dessa forma, a estrutura do tendão pode romper-se, resultando em
inflamação (ALMEKINDERS; TEMPLE, 1998; SALATE, 2002; MCLAUCHLAN;
HANDOLL, 2003).
Algumas pesquisas forneceram evidências de que sobrecarga,
compressão, degeneração intrínseca, irritação química e tenotomia parcial ou
completa, induzem um dano estrutural e inflamação no tendão, que são
histopatologicamente semelhantes àqueles observados no músculo esquelético
após uma lesão (WOO et al., 2000; MARSOLAIS et al., 2001).
O reparo de um tendão lesado é similar ao reparo de outras lesões de
tecidos conectivos, onde, num processo ordenado de estágios múltiplos, ocorre a
proliferação e a migração de muitos tipos celulares (CHAN et al., 1997; LEE et al.,
1997). Porém esta seqüência de aparecimento das células inflamatórias após uma
agressão ainda é um processo pouco estudado nos tendões traumatizados, tendo
sido pesquisado por apenas alguns autores (MARSOLAIS et al., 2001).
O acúmulo de células inflamatórias baseia-se no recrutamento de
novas células provenientes do sistema circulatório ou na mitose das células
inflamatórias residentes. O recrutamento de novas populações de células
inflamatórias através de substâncias quimiotáticas parece ser o mecanismo primário
pelo qual as células se acumulam no tecido danificado (MARSOLAIS et al., 2001).
Os neutrófilos são normalmente as primeiras células a aparecer nos
locais de infecção ou inflamação, onde liberam uma variedade de agentes
destrutivos, tais como radicais livres e proteases, e citocinas que atraem macrófagos
(MARSOLAIS et al., 2001). A concentração de neutrófilos normalmente declina 24h
após a lesão e neutrófilos apoptóticos são fagocitados pelos macrófagos ou
25
fibroblastos (HALL et al., 1994).
As populações de macrófagos se tornam as células predominantes até
o final do processo inflamatório. Macrófagos ativos podem liberar o fator de
crescimento (TGFβ1) que induz a síntese de matriz extracelular e inibe sua
degradação e estimula fibroblastos ou células-tronco a proliferar. Colágeno e
proteoglicanas são secretados e quaisquer rupturas no tecido são eventualmente
reparadas por fibras de colágeno, principalmente do tipo III (CHAN et al., 1997; LEE
et al., 1997; MARSOLAIS et al., 2001; HEINEMEIER et al., 2003).
Outros componentes da matriz extracelular são sintetizados e
depositados no sítio da lesão. Ao mesmo tempo, inicia-se a angiogênese para
restabelecer o suprimento vascular. Finalmente, as células tendíneas e as fibras
colágenas são orientadas de uma maneira altamente organizada numa tentativa de
restaurar, tão próximo quanto possível, a estrutura e a função original do tendão
lesado (CHAN et al., 1997; LEE et al., 1997).
A resistência e firmeza de um tendão são fornecidas pelas ligações
cruzadas que ocorrem entre as numerosas fibras de colágeno. Em decorrência do
desarranjo destas fibras pela hemorragia e pelo infiltrado de células inflamatórias a
resistência de um tendão tende a diminuir (KUO et al., 1999).
Durante esse processo de recuperação, as fibras colágenas destruídas
são reparadas para reaver a força e rigidez, enquanto o tecido de granulação
gradualmente se condensa em tecido cicatricial e diminui sua celularidade (KUO et
al., 1999).
26
1. 5 MODELO EXPERIMENTAL DE TENDINITE BIOQUÍMICA
Vários modelos experimentais utilizando animais foram desenvolvidos
para tentar entender melhor o processo biológico que conduz a tendinite (WOO et
al., 2000), como isquemia provocada no tendão (KUO et al., 1999) ou aplicação de
substâncias inflamatórias clássicas (KURTZ et al., 1999). Entretanto, conforme
descrito na literatura, a colagenase produzida por fibroblastos e células inflamatórias,
é uma enzima altamente específica capaz de induzir a degradação da conformação
em tripla hélice do colágeno (KOMSA-PENKOVA; RASHAP; YOMTOVA, 1997;
MARSOLAIS et al., 2001; FERNANDES; ALVES; SOUZA, 2003).
O modelo de tendinite induzida por colagenase é bem descrito
bioquímica, ultrasonográfica e histologicamente, e tem sido usado extensivamente
em estudos terapêuticos (DAHLGREN et al., 2002). O edema agudo, a inflamação e
a destruição da matriz nos tendões são similares àquelas encontradas nas lesões
tendíneas naturalmente ocorridas (WANG et al., 2003).
A avaliação do processo inflamatório intratendíneo experimental
geralmente é feita através de estudo histopatológico utilizando colorações clássicas,
especialmente a hematoxilina-eosina (MARSOLAIS et al., 2001; DAHLGREN et al.,
2002; FERNANDES; ALVES; SOUZA, 2003).
1.6 DIAGNÓSTICO
A utilização de meios modernos de diagnóstico por imagem possibilita
27
uma melhor identificação das doenças tendíneas, colaborando para o tratamento
(SALATE, 2002).
O papel da obtenção de imagens de alta resolução parece ser de
importância crescente para analisar mecanismos adaptáveis e degenerativos.
Alguns autores afirmam que a ultra-sonografia e a ressonância magnética deveriam
ser usadas conjuntamente a fim de melhor diagnosticar doenças tendíneas
(KAINBERGER et al., 1997).
A ultra-sonografia tem sido crescentemente utilizada para examinar
lesões tendíneas, pois é um método disponível, rápido, seguro e barato. Sua
principal desvantagem é ser um pouco limitada, principalmente em comparação com
a ressonância magnética (PAAVOLA et al., 2002). Além disso, existem as
dificuldades de documentação das imagens de uma forma padrão, e
conseqüentemente, a impossibilidade de diagnósticos exatamente reproduzíveis
(KAINBERGER et al., 1997).
A ressonância magnética proporciona um alto contraste do tecido, o
que permite distinguir entre tendões normais de tendões anormais, além de permitir
identificar estruturas anatômicas de forma detalhada (PAAVOLA et al., 2002).
Porém, apesar das melhorias técnicas consideráveis, como técnicas de obtenção de
imagens rápidas e máquinas de pequeno tamanho, a ressonância magnética
permanece como a modalidade mais cara para a obtenção de imagens de estruturas
de tecidos moles (KAINBERGER et al., 1997).
O exame radiográfico raramente é de valor no estabelecimento de um
diagnóstico de tendinite. Ele deveria ser usado como modalidade auxiliar para
descobrir espículas ósseas ou outros tipos de calcificação anormal, ou quantificar
fatores causais, como o mau alinhamento anatômico. Anormalidades estruturais
dentro de um tendão geralmente não são radiograficamente visíveis a menos que
28
calcificações aconteçam (KAINBERGER et al., 1997).
Deve-se ressaltar que, caso não sejam levadas em consideração as
propriedades biológicas e mecânicas dos tecidos, as alterações teciduais causadas
por moléstia ou lesão, ou as respostas dos tecidos a alterações persistentes por uso,
podem ocorrer interpretações equivocadas das informações diagnósticas, decisões
terapêuticas inadequadas e resultados indesejáveis no tratamento. Além disso, os
futuros avanços no diagnóstico e tratamento dos problemas musculoesqueléticos
dependerão de um conhecimento cada vez maior da célula e da matriz biológica dos
tecidos musculoesqueléticos (WEINSTEIN; BUCKWALTER, 2000).
A perspectiva de utilização da espectroscopia Raman (SALA, 1995) de
baixa resolução (MELLO, 1997; CLARKE; LHONDE; WOMBLE, 1998; CLARKE et
al., 1999; WOMBLE et al., 1999) para a quantificação do processo inflamatório
tendíneo e alteração na estrutura colágena é extremamente atraente dada à
possibilidade se obter um fingerprint, ou seja, uma “impressão digital” das
transformações teciduais, podendo-se detectar além das alterações ultra-estruturais,
alterações moleculares. Acrescenta-se a isso os baixos limites de detecção
possíveis de serem alcançados e, principalmente, a diferenciação química a ser
obtida. Contudo, a sobreposição de bandas espectrais (FURUSJO et al., 1998;
BIJLSMA; SMILDE, 1999) e os efeitos de fluorescência da matriz (HIRSCHFELD;
CHASE, 1986; SCHRADER et al., 1999; HANLON et al., 2000; MAQUELIN et al.,
2000), conferem ao sistema características não lineares que podem dificultar a
quantificação do processo inflamatório em questão.
Uma alternativa bastante viável para a quantificação da tendinite,
utilizando espectroscopia Raman, é a aplicação de métodos não lineares de
classificação/calibração multivariada (SEKULIC et al., 1993; ZUPAN; NOOVI;
GASTEIGER, 1994; CHAN et al., 1997; CLADERA et al., 1997). Dentre os métodos
29
não lineares de classificação/calibração multivariada, destacam-se os métodos
quimiométricos de reconhecimento de padrões, como, por exemplo, Hierarchical
Cluster Analysis (HCA), que permite desenvolver sistemas automatizados para o
reconhecimento de padrões diagnósticos (MELLO et al., 1999).
2 ESPECTROSCOPIA RAMAN
A espectroscopia estuda a interação da radiação eletromagnética com
a matéria, sendo um dos seus principais objetivos a determinação dos níveis de
energia de átomos ou moléculas. Diretamente obtêm-se as diferenças entre estes e
a partir destas medidas determinam-se as posições relativas dos níveis energéticos
(SALA, 1995).
A energia total de uma molécula é a soma da energia eletrônica, da
energia vibracional e da energia rotacional, sendo a eletrônica muito maior que a
vibracional e esta muito maior do que a rotacional: Etot = Eele+Evib+Erot (SALA, 1995).
Sendo o movimento dos elétrons muito mais rápido do que o dos
núcleos pode-se considerar a posição dos núcleos fixada durante a transição
eletrônica. Do mesmo modo, durante o movimento dos núcleos, pode-se considerar
uma distribuição média dos elétrons. A interação de radiação eletromagnética com o
movimento vibracional dos núcleos origina os espectros vibracionais no
infravermelho ou o Raman (SALA, 1995; LORINCZ et al., 2004).
Pode-se definir o espalhamento Raman como o espalhamento
inelástico de radiação eletromagnética monocromática que interage com as
moléculas. As freqüências vibracionais são determinadas pelas diferenças entre as
30
freqüências das radiações espalhadas e a da radiação incidente (SALA, 1995;
HANLON et al., 2000).
O espectro Raman de uma determinada molécula consiste de uma
série de picos ou faixas, cada um transferido por uma freqüência vibracional
característica daquela molécula. Cada molécula tem o seu próprio espectro
característico, e dessa forma, o espectro Raman pode fornecer uma “impressão
digital” de uma substância da qual a composição molecular pode ser determinada
(LORINCZ et al., 2004).
No espalhamento Raman uma radiação, geralmente na faixa visível,
ultravioleta, ou infravermelho, interage com a molécula e é espalhada com
freqüência ligeiramente modificada. Esta variação de freqüência corresponde à
diferença de energia entre dois estados vibracionais (SALA, 1995).
Os espectros Raman são obtidos irradiando-se uma amostra com uma
fonte laser potente de radiação monocromática no visível ou no infravermelho
próximo. Durante a irradiação, o espectro da radiação espalhada é medido em um
certo ângulo com um espectrômetro apropriado (SKOOG et al., 2002).
A espectroscopia Raman tem sido amplamente aplicada no estudo de
sistemas biológicos. As vantagens dessa técnica incluem a exigência de amostras
pequenas, a sensibilidade mínima no tocante à interferência da água, o
detalhamento espectral e a sensibilidade conformacional e ambiental (SKOOG;
HOLLER; NIEMAN, 2002).
Entre várias técnicas, ela pode fornecer a mais detalhada informação
sobre a composição química de uma amostra tecidual sob estudo, pois suas
informações são ao nível molecular (LORINCZ et al., 2004; HANLON et al., 2000).
As aplicações diagnósticas da espectroscopia Raman têm sido
amplamente pesquisadas. Ela pode ser usada de maneira minimamente invasiva,
31
em tempo real, em diagnósticos teciduais in vivo, em casos onde biópsias não
podem ser prontamente realizadas, tais como na doença arterial coronariana e
doença de Alzheimer, ou quando existe uma alta incidência de resultados de
exames falso-positivos, que levam a realizações de biópsias desnecessárias, como
no câncer de mama (HANLON et al., 2000).
Partindo-se da informação de que a maioria das doenças é induzida
por processos bioquímicos, é certo afirmar que elas são necessariamente
acompanhadas por mudanças na composição molecular dos tecidos (MIN et al.,
2005).
Como a espectroscopia Raman é altamente sensível a estas
mudanças, alguns autores têm se dedicado a pesquisar a sua utilização para o
diagnóstico precoce do câncer, e talvez, até mesmo para a elucidação dos
mecanismos do desenvolvimento das doenças cancerígenas (LORINCZ et al., 2004;
MIN et al., 2005).
A aplicação in vivo da Espectroscopia Raman na prática clínica,
depende do desenvolvimento de um equipamento sensível e uma poderosa análise
do espectro para capacitar a coleta de sinais em tempo real e a descoberta de
relevantes parâmetros clínicos destes espectros (SCHUT et al., 2000).
Min et al. (2005) coletaram amostras de tecidos de pulmão normais e
cancerígenos de 35 pacientes com câncer de pulmão e, pela análise por
espectroscopia Raman, foi possível fazer uma distinção clara entre amostras de
tecido fresco com câncer e normal (Figuras 3 e 4). Observou-se que na intensidade
de 1659 cm1 na banda amida I a vibração aumenta notavelmente indo do estado
normal para o cancerígeno.
32
Figura 3 – Espectros Raman no infravermelho próximo de tecido cancerígeno de pulmão humano fresco. (a) Estimulado a 785nm [tempo exposto, 1 minuto; potência do laser, 46mW; largura da fenda, 50 µm (5 cm-1)]; (b) Estimulado a 1064nm [tempo exposto, 5 minutos; potência do laser, 38mW; largura da fenda, 150 µm (9 cm-1)]. Fonte: MIN, 2005.
Figura 4 - Padrão dos espectros Raman no infravermelho próximo obtidos de tecidos de pulmões humanos cancerígenos e normais. Fonte: MIN, 2005.
Hanlon et al. (2000) estudaram a aplicação da espectroscopia Raman
na aterosclerose utilizando amostras de artérias coronárias obtidas de corações
humanos. Os resultados indicaram que existem diferenças espectrais significativas
entre a maioria dos aspectos morfológicos encontrados em artérias coronárias
33
normais e placas ateroscleróticas (Figura 5).
Figura 5 - Exemplos de bandas Raman de tecidos de artérias coronárias, excitados a 830nm, em vários estágios de aterosclerose. Notar o proeminente estiramento fosfato de hidroxiapatita de cálcio a 960 cm-1, presente somente no espectro da placa calcificada. Fonte: BRENAN et al. apud HANLON, 2000.
Frank et al. (1995) utilizaram um comprimento de onda 784 nm para
obter espectros Raman de tecido mamário normal, benigno (fibrocístico) e maligno
(carcinoma). A análise dos espectros indicou uma mudança na banda 1439 cm-1 no
tecido normal para 1450 cm-1 no tecido maligno, mudança esta atribuída ao aumento
da concentração de proteínas nas amostras malignas. Usando uma área
proporcional de bandas de 1654 – 1439 cm-1, foi possível diferenciar facilmente
34
tecido maligno e tecido normal. Entretanto, não houveram diferenças
estatisticamente significativas nas mudanças observadas entre tecidos maligno e
benigno.
Baseado no estudo de Frank, McCreery e Reed (1995), Manoharan et
al. (1998) utilizaram um comprimento de onda de 830 nm para analisar amostras de
tecido mamário normal, benigno e maligno, obtidas por biópsias e mastectomia. Os
aspectos espectrais foram insuficientes para separar todas as três categorias. Foi
possível diferenciar amostras de tecido normal e maligno com alta sensibilidade e
especificidade (Figura 6), porém as amostras benignas não foram bem separadas
das malignas.
Figura 6 - Espectro Raman de tecido mamário (a) normal, (b) benigno e (c) maligno. Fonte: MANOHARAN, 1998.
Pesquisado por vários autores (TASHIBU, 1990; MIZUNO et al., 1992;
KITAJIMA et al., 1993 e ONG et al., 1997 apud WOLTHUIS et al., 2001), a análise
espectroscópica de tecido cerebral tem avançado significativamente.
Wolthuis et al. (2001) investigaram a possibilidade de se utilizar a
35
espectroscopia Raman para mensurar a concentração de água no tecido cerebral,
visando sua aplicação no controle de edema cerebral, um dos fatores mais comuns
de morbidade em pacientes com doenças cerebrovasculres. Utilizando cérebros de
porcos em seu estudo e um comprimento de onda de 720 nm, demonstraram que é
possível determinar a fração de água no cérebro com uma acurácia melhor que 0,01,
numa escala de 0,75-0,95, utilizando Espectroscopia Raman e modelamento com
PLS (Partial Least Squares).
As futuras aplicações diagnósticas da espectroscopia Raman
dependem da habilidade dos pesquisadores em aprofundar e entender a origem dos
aspectos espectrais. O modelamento, seja químico ou morfológico, é a “chave” para
a descoberta das repostas (HANLON et al., 2000).
Os métodos tradicionalmente empregados para a análise de processos
inflamatórios teciduais (observação microscópica, p. ex.) fornecem somente uma
visão qualitativa destes processos, não sendo possível quantificar as alterações
ultra-estruturais e moleculares dos tecidos sob análise, dificultando o conhecimento
detalhado destes processos. Assim sendo, o desenvolvimento de novos métodos de
análise que permitam a identificação e a quantificação destas alterações,
principalmente àquelas que se referem ao colágeno, é extremamente desejável e
importante.
Saindo-se da dimensão tecidual clássica (macro e microscopia) e
direcionando para a dimensão molecular, a espectroscopia Raman possibilita
quantificar a inflamação e a fibroplasia das lesões tendíneas, visto que os espectros
Raman são fingerprints da estrutura das moléculas que compõem os tecidos
avaliados. Este fato é de grande relevância, pois se abre a possibilidade de
comparar a eficiência de diferentes métodos de análise de tecidos em diferentes
escalas, partindo-se da microscopia óptica para o nível molecular. É possível assim
36
comparar as alterações químicas ocorridas, obviamente, no nível molecular, com as
alterações morfológicas microscópicas observadas no desenvolvimento da tendinite,
resultando no conhecimento mais detalhado deste processo.
37
OBJETIVO
Comparar a espectroscopia Raman, como método de análise, com a
histopatologia clássica do tecido tendíneo na tendinite experimentalmente induzida
pela colagenase no tendão do músculo gastrocnêmio de Rattus norvegicus da
variedade Wistar.
38
MATERIAL E MÉTODOS
Todos os procedimentos experimentais foram submetidos ao Comitê
de Ética em Pesquisa da Universidade de Franca e aprovados, de acordo com o
Protocolo no 108/04 (Anexo A).
1 ANIMAIS
Foram utilizados 48 ratos machos albinos (Rattus norvegicus)
variedade Wistar, com peso aproximado de 180g (+ ou – 40g), saudáveis, sem
variação acentuada de idade, fornecidos pelo Biotério da Universidade de Franca.
Durante todo o período de estudo os animais foram mantidos em
caixas identificadas apropriadas de polietileno padrão no Biotério e alimentados com
ração própria para roedores e água ad libitum.
2 TENDINITE EXPERIMENTAL
Os animais foram pesados e divididos em seis grupos por aproximação
39
de peso, sendo o grupo I controle, e os grupos experimentais II, III, IV, V e VI, os
quais eram constituídos de oito animais cada.
Os animais dos grupos II, III, IV, V e VI receberam uma injeção
intratendínea no tendão calcâneo direito, de 30 µl de colagenase (10 mg/ml; Sigma,
C6885) usando-se uma agulha 30G (Figura 7). A colagenase foi dissolvida em
solução salina tamponada estéril de fosfato, contendo 50 mM NaH2PO4, 150 mM
NaCl, com pH 7.4.
O mesmo volume de solução salina tamponada estéril de fosfato foi
injetado no tendão calcâneo esquerdo dos animais.
Figura 7 – Embalagem de Colagenase Sigma®, C6885.
Os animais do grupo I, controle, receberam injeção do mesmo volume
de solução salina tamponada estéril de fosfato no tendão calcâneo esquerdo. O
tendão calcâneo direito destes animais foi preservado.
Os animais foram sacrificados 1 (grupo II), 3 (grupo III), 7 (grupo IV), 14
(grupo V) e 28 (grupo VI) dias após receberem as injeções. O grupo I foi sacrificado
no nono dia, data esta escolhida aleatoriamente (adaptado de MARSOLAIS et al.,
2001).
40
3 ESPECTROSCOPIA RAMAN
No dia determinado para o sacrifício, os animais eram transferidos do
Biotério para o Laboratório de Dissecação de Peças, onde eram sacrificados
individualmente por superdosagem de Halotano em uma cabine plástica (Figuras 8 e
9) (adaptado de DAHLGREN et al., 2002). Em seguida, eram dissecados os tendões
calcâneo direito e esquerdo (Figura 10), os quais eram imediatamente imersos em
um recipiente com solução fisiológica e mantidos em caixa de isopor com gelo, em
temperatura próxima a 18ºC, e transportados para o Laboratório de Espectroscopia
Vibracional e Quimiometria da Universidade de Franca.
Figuras 8 e 9 – Cabine Plástica com algodão embebido em Halothano (8); Halothano (9).
41
Figura 10 – Dissecação do tendão calcâneo comum esquerdo, Grupo II.
O Laboratório de Espectroscopia foi mantido com temperatura próxima
a 18ºC, cortinas fechadas, luzes apagadas, e não houve interferências externas que
pudessem prejudicar a coleta dos Espectros Raman.
Os espectros Raman foram obtidos usando a espectrômetro Raman de baixa
resolução, da Raman Systems, Inc (Watertown, MA, USA), modelo R-2001, o qual
utiliza um Laser multimodo de estado sólido, operando a 785 nm, fornecido por
Power Technologies (Little Rock, AK, USA), ajustado para liberar na amostra 250
mW, e um espectrômetro OceanOptics S-200 (Dunnedin, FL, USA) como
monocromador com um detector CCD com 2048 elementos termoeletricamente
refrigerado fornecido pela Hamamatsu (Hamamatsu, Sunayama-cho, Japan) para
mensurar espectros de 200 a 2800 cm-1, com uma resolução espectral da ordem de
15 cm-1 (Figura 11).
42
Figura 11 – Espectrômetro Raman
A fibra óptica contém dois tipos de filtro na sua ponta. A fibra que leva
o feixe contém o filtro passa-banda para remover a fluorescência da fibra
proveniente da excitação do feixe e a fibra de aquisição contém um filtro passa-
longo para remover o espalhamento Rayleigh. O ruído inerente no sistema originado
dos elementos ópticos no caminho da luz foi subtraído de todos os espectros. Para
cada amostra de tecido tendíneo foram adquiridos três espectros e o espectro final
foi a média dos três espectros.
A calibração do espectrômetro Raman foi feita usando isopropanol de
grau espectroscópico Carlo-Erba. Estas amostras de isopropanol foram colocadas
em cubetas de quartzo e seus espectros obtidos no espectrômetro Raman. A
aquisição do sinal foi feita através de uma interface RS-232, controlada pelo
software RBase –2001, versão 1, em um Pentium III operando a 750 Mhz. Esta
calibração é necessária para que se possa fazer a correlação entre pixel e
comprimento ou número de onda. Tal calibração deve ser feita diariamente ou
quando se ajusta o Laser para operar em um comprimento de onda diferente.
Escolhe-se o isopropanol por suas bandas características de fácil atribuição [Manual
de Operação do Aparelho - Raman Systems, Inc (Watertown, MA, USA), modelo R-
43
2001].
O espectro foi processado usando filtros wavelets, com função de base
Dubauchie (db4) para a minimização de ruído, subtração do espectro do meio
isotônico, correção de espalhamento multiplicativo (MSC – Multiplicative Scattering
Correction) para minimizar o espalhamento Rayleigh devido a variação do índice de
refração para cada uma das amostras de tecido tendíneo, e um polinômio de
segundo grau para minimizar a fluorescência da matriz.
Os cálculos da Análise Hierárquica de Agrupamentos (HCA –
Hierarchical Cluster Analysis) foram feitos utilizando-se o PLS (Partial Least
Squares) Toolbox, para uso com Matlab 4.2. Os programas para minimização de
ruído, MSC e minimização da fluorescência da matriz foram implementados pela
utilização de sub rotinas do Matlab 4.2.
Cada amostra de tendão era colocada em papel absorvente comum, e
o Laser era posicionado bem próximo à amostra e fixado por uma garra.
O tempo de aquisição de cada espectro foi de 20 segundos. A cada
três amostras era realizada uma corrente escura.
4 HISTOPATOLOGIA
Após a obtenção dos espectros Raman, os tendões eram
individualmente colocados em recipientes com solução de Formol tamponado a
10%. O tempo decorrido entre a dissecação dos tendões e sua imersão em Formol
foi de aproximadamente três horas, em todos os grupos, inclusive o grupo controle.
Durante este período, as amostras foram mantidas a uma temperatura próxima de
44
18ºC em solução fisiológica em caixa de isopor com gelo, conforme descrito no item
3 – Espectroscopia Raman.
As amostras eram levadas ao Laboratório de Patologia da
Universidade de Franca, onde foram preparadas para a realização da Análise
Histopatológica.
Após permanecerem por 24 horas na solução de Formol, os tendões
foram desidratados por uma série crescente de álcool (soluções a 70%, 80%, 95%,
100%), diafanizados com xilol e embebidos em parafina. Posteriormente foram
seccionados em micrótomo (marca Leica, modelo RM2125RT) numa espessura de
três micrometros, colocados em lâminas para microscópio, corados com
hematoxilina-eosina (H&E) e montados com lamínulas.
Para a análise histopatológica das lâminas foi utilizado um microscópio
(marca Leica, modelo DMBL) acoplado a uma câmera fotográfica (marca Leica,
modelo MPS60).
Um score de zero a três, sendo 0 = ausente, 1 = leve, 2 = médio e 3 =
intenso, foi apontado para cada uma das seguintes categorias: necrose celular,
infiltrado intratendíneo de polimorfonucleares, infiltrado intratendíneo de células
mononucleares, infiltrado peritendíneo de polimorfonucleares, infiltrado peritendíneo
de células mononucleares, atividade fibroblástica, neovascularização e produção e
reorganização de fibras colágenas (adaptado de DAHLGREN et al., 2002).
45
RESULTADOS
1 RESULTADOS DA ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
Os resultados agrupados da análise histopatológica estão
demonstrados na Tabela 1. A Tabela 2 (Anexo B) apresenta os dados individuais por
amostra.
46
Tabela 1 – Scores da Análise Histopatológica (dados agrupados)
INF TENDÃO INF PERITENDÃO GRUPO
S NECROSE
PMN MON PMN MON AF NV FC
G I E - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 + n = 4 - n = 8 - n = 8 - n = 8 G I D - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8
G II E + n = 2 + n = 3 + n = 2 + n = 4 + n = 4 ++ n = 1 - n = 8 - n = 8 - n = 8
G II D + n = 3 ++ n = 1 +++ n = 2
+ n = 3 ++ n = 3 +++ n = 1
- n = 8 ++ = 4 +++ = 4
+ n = 1 - n = 8 - n = 8 - n = 8
G III E - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 + n = 4 - n = 8 - n = 8 - n = 8
G III D ++ n = 3 + n = 2 + n = 1 ++ n = 2
+++ n = 1
+ n = 5++ n = 1
+ n = 3 ++ n = 3+++ n = 2
- n = 8 - n = 8 - n = 8
G IV E - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 + n = 2 - n = 8 - n = 8 - n = 8
G IV D - n = 8 - n = 8 + n = 5 - n = 8 + n = 7 + n = 1 ++ n = 3 +++ n = 4
+ n = 6 ++ n = 2
- n = 8
G V E - n = 8 - n = 8 + n = 1 - n = 8 - n = 8 + n = 1 + n = 1 - n = 8
G V D - n = 8 - n = 8 + n = 5 - n = 8 + n = 5 + n = 5 ++ n = 1 + n = 1
+ n = 2 ++ n = 1
G VI E - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8
G VI D - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 - n = 8 ++ n = 2 + n = 1 + n = 4 ++ n = 1 +++n = 1
LEGENDA: G: Grupo; E: Esquerdo; D: Direito; INF Tendão: Infiltrado de Células Inflamatórias Intratendíneas; INF Peritendão: Infiltrado de Células Inflamatórias Peritendíneas; PMN: Células Inflamatórias Polimorfonucleares; MON: Células Inflamatórias Mononucleares; AF: Atividade Fibroblástica; NV: Neovascularização; FC: Produção e Reorganização de Fibras Colágenas; n: Número de Amostras; - : Ausente; + : Leve; ++ : Moderado; +++ : Intenso
Histologicamente, os tendões do Grupo Controle (I), lado direito,
apresentaram fibras colágenas onduladas, com fileiras dispersas de fibrócitos com
núcleo alongado, substância básica esparsa com fibras longitudinais frouxamente
arranjadas e escassos vasos sanguíneos (Figura 12).
47
Figura 12 – Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo I (Controle). Notar aparência normal da fibras colágenas, fibroblastos e substância básica. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x).
O Grupo II (um dia), lado direito, apresentou, macroscopicamente,
grande extravasamento de sangue e edema. Microscopicamente, observou-se
necrose, infiltrado intenso de células polimorfonucleares, principalmente neutrófilos,
tanto intra quanto peritendíneo (Figura 13). As amostras do lado esquerdo, utilizadas
como controle, apresentaram sinais moderados de inflamação, com infiltrado celular
A
C
B
D
E F
48
principalmente peritendíneo (Figura 14).
Figura 13 – Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo II, lado D (1 dia após a injeção de colagenase). Notar presença de infiltrado inflamatório intenso. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x).
E
A B
C D
F
49
Figura 14 – Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo II, lado E (1 dia após a injeção de solução fosfato). Notar presença de infiltrado inflamatório peritendíneo moderado. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x).
O Grupo III (três dias), lado direito, não apresentou sinais
macroscópicos tão exuberantes quanto o grupo II. Microscopicamente, ocorreu uma
diminuição do extravasamento sanguíneo, sinais moderados de necrose e
A B
C D
E F
50
predominância de células inflamatórias mononucleares, especialmente macrófagos
(Figura 15). As amostras contralaterais apresentaram sinais discretos de inflamação
mononuclear peritendínea (Figura 16).
Figura 15 – Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo III, lado D (3 dias após a injeção de colagenase). Notar presença de células inflamatórias mononucleares. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x).
E F
C D
A B
51
FIGURA 16 – Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo III, lado E (3 dias após a injeção de solução fosfato). Notar presença de infiltrado inflamatório peritendíneo discreto. HE (A e B 100x).
A análise do Grupo IV (sete dias), lado direito, revelou uma mudança
acentuada das alterações microscópicas, com discretos focos de inflamação
mononuclear, intra e peritendíneos, intensa atividade fibroblástica e sinais
moderados de neovascularização (Figura 17). Seis amostras do lado esquerdo
apresentaram aspecto normal (Figura 18) e duas amostras demonstraram a
presença de neutrófilos peritendíneos.
A B
52
Figura 17 – Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo IV, lado D (7 dias após a injeção de colagenase). Notar atividade fibroblástica e neovascularização. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x).
A B
E F
DC
53
Figura 18 – Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo IV, lado E (sete dias após a injeção de solução fosfato). Notar aspecto normal do tecido. HE (A 100x e B 400x).
O Grupo V (14 dias), lado direito, apresentou uma diminuição da
atividade fibroblástica, raros neutrófilos e o início da produção e reorganização de
fibras colágenas (Figura 19). No lado esquerdo não havia mais sinal algum de lesão,
com exceção de uma única amostra, que apresentou um foco degenerativo discreto
(Figura 20).
BA
54
Figura 19 – Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo V, lado D (14 dias após a injeção de colagenase). Notar produção de fibras colágenas. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x).
FE
C D
BA
55
Figura 20 – Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo V, lado E (14 dias após a injeção de solução fosfato). Notar ausência de indícios de lesão (A e B) e foco degenerativo discreto (C, D, E e F). HE (A 100x; B 400x; C 40x; D 100x; E e F 400x).
No Grupo VI, lado direito, 28 dias após a injeção de colagenase, a
microscopia revelou uma produção de fibras colágenas mais intensa, com sinais
moderados de atividade fibroblástica em duas amostras, porém o tecido tinha uma
aparência desorganizada (Figura 21). As amostras contralaterais apresentaram-se
normais, sem qualquer sinal indicativo de lesão (Figura 22).
E F
C
A B
D
56
Figura 21 – Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo VI, lado D (28 dias após a injeção de colagenase). Notar tentativa de reorganização tecidual. HE (A e B 40x; C e D 100x; E e F 400x).
E
D
A B
F
C
57
Figura 22 – Aspecto histopatológico do tendão de rato do Grupo VI, lado E (28 dias após a injeção de solução fosfato). Notar ausência de indícios de lesão. HE (A 40x; B e C 100x; D 400x).
A Figura 23 apresenta um esquema de fotos das lâminas histológicas
dos grupos I (controle), II, III, IV, V e VI (grupos de estudo), perna D, visando melhor
ilustrar as alterações ocorridas durante a evolução do processo de tendinite.
A B
DC
58
Figura 23 – Esquema de fotos das lâminas histológicas dos grupos I [(controle) A], II [B], III [C], IV [D], V [E] e VI [F], perna D. HE (100x).
A B
C D
E F
59
2 RESULTADOS DA ANÁLISE POR ESPECTROSCOPIA RAMAN
Para permitir a análise dos dados, foi obtido um espectro médio de cada
grupo e, em seguida, foi feita a comparação entre o espectro médio do Grupo I
(controle), com os espectros médios dos Grupos II, III, IV, V e VI, lado direito
(colagenase), os quais são mostrados na Figura 24.
Figura 24 – Espectros Raman no infravermelho próximo de tendões de ratos estimulados a 785nm (tempo exposto, 20 segundos; potência do laser, 250mW), antes de realizar o tratamento dos dados.
Após o tratamento quimiométrico dos dados para a minimização da
fluorescência das amostras, foi possível identificar e separar os grupos, observando,
tal como visto em outros estudos, que as alterações características de cada amostra
encontram-se na banda amida, a qual apresenta um pico no grupo I, que diminui nos
grupos II e III, voltando a estar presente nos grupos IV, V e VI (Figura 25).
Inte
nsid
ade
Ram
an (a
. µ.)
Comprimento de Onda 1/cm
60
Figura 25 – Espectros Raman no infravermelho próximo de tendões de ratos estimulados a 785nm (tempo exposto, 20 segundos; potência do laser, 250mW), após tratamento quimiométrico. Notar o pico da banda amida apontado pela seta.
Realizando a distribuição dos espectros em classes de um
dendograma, observou-se que o Grupo I forma um ramo distinto dos outros grupos,
e a seqüência de proximidade destes em relação ao Grupo I segue a ordem do
Grupo VI, mais próximo, ao Grupo II, mais distante (Figura 26).
Inte
nsid
ade
Ram
an (a
. µ.)
Comprimento de Onda 1/cm
61
Figura 26 – Dendograma de dados com processamento centrado na média dos espectros dos Grupos I, II, III, IV, V e VI, lado direito
Na comparação dos espectros médios do Grupo I, lado direito, com os
espectros médios dos Grupos II, III, IV, V e VI, lado esquerdo, não foi possível fazer
uma diferenciação (Figura 27), impossibilitando a formação de um Dendograma.
Figura 27 – Espectros Raman no infravermelho próximo de tendões de ratos do Grupo I, lado direito, e Grupo II, lado esquerdo, plotados juntos, estimulados a 785nm [tempo exposto, 20 segundos; potência do laser, 250mW; largura da fenda, 150 µm (15 cm-1)], antes de realizar o tratamento dos dados.
Distância entre K e o vizinho próximo
Comprimento de Onda 1/cm
Inte
nsid
ade
Ram
an (a
. µ.)
62
DISCUSSÃO
A tendinite é uma das doenças mais comuns, tanto em atividades
profissionais quanto esportivas (CHAN et al., 1997; LEE et al., 1997; SALATE, 2002;
DAHLGREN et al., 2002; TSUZAKI et al., 2003). De acordo com Woo et al. (2000),
uma das principais causas dos problemas nos tendões é a sobrecarga desta
estrutura por esforços físicos excessivos e repetitivos. Muitos estudos vêm sendo
realizados na tentativa de aprofundar o conhecimento de sua etiologia. Entretanto,
estes estudos são limitados, pois a compreensão da tendinite está principalmente
baseada em amostras de tendões coletadas durante cirurgias, análise
histopatológica de material de biópsias e análises biomecânicas de tendões
humanos sintomáticos. Assim, eles não esclarecem a origem e o desenvolvimento
da tendinite. Por isso, alguns modelos animais vêm sendo utilizados visando melhor
entender o processo biológico que conduz a tendinite.
Dentre os modelos bioquímicos utilizados, a tendinite induzida pela
colagenase é um dos mais empregados, uma vez que é um modelo bem descrito
bioquímica, ultrasonográfica e histologicamente (MARSOLAIS; CÔTÉ; FRENETTE,
2001; DAHLGREN et al., 2002; WANG et al., 2003; FERNANDES; ALVES; SOUZA,
2003). A injeção de colagenase no tendão calcâneo induz uma resposta inflamatória,
que começa com um acúmulo inicial de neutrófilos, seguido por macrófagos,
conforme observado por Marsolais, Côté e Frenette (2001). Dahlgren et al. (2002)
relatam ainda que ocorre inflamação, dano vascular e hemorragia, seguida pela
63
migração e proliferação de fibroblastos, e produção de componentes da matriz
extracelular, tal qual a progressão de uma injúria ocorrida naturalmente.
No estudo de Marsolais, Côté e Frenette (2001), em um grupo de ratos
foi feita a exposição cirúrgica do tendão calcâneo, seguida de injeção de colagenase
dissolvida em solução fosfato tamponada estéril e, em outro grupo, foi feito a injeção
de colagenase nas mesmas condições que o primeiro grupo, porém
percutaneamente. A análise de seus resultados demonstrou então que a injeção
percutânea de colagenase constitui um modelo confiável para a indução de
tendinite, não sendo necessário realizar procedimentos cirúrgicos para a exposição
do tendão. Assim, no presente trabalho, realizou-se uma adaptação ao modelo
desenvolvido por Marsolais, Côté e Frenette (2001), com injeções de colagenase no
tendão calcâneo direito de ratos machos, e injeção somente da solução solvente da
colagenase no tendão calcâneo esquerdo dos mesmos animais, resultando em um
processo de tendinite com características acentuadas nos tendões submetidos à
injeção de colagenase.
A proliferação de fibroblastos e o aumento da produção de
componentes da matriz extracelular são cruciais na recuperação de uma injúria
tendínea. Um tendão normal é um tecido relativamente acelular, no qual a
degradação e a produção de moléculas da matriz extracelular são mantidas em
equilíbrio pelos fibroblastos. Com uma injúria, este equilíbrio é quebrado e a
regulação individual do metabolismo celular pode se tornar inadequada para reparar
este dano. O número de células precisa aumentar por divisão e/ou migração
(DAHLGREN et al., 2002).
Através da análise histopatológica é possível afirmar que a tendinite
observada nos grupos submetidos à aplicação da colagenase neste estudo
obedeceu a uma ordem cronológica de desenvolvimento, tal como relatado por
64
Marsolais, Côté e Frenette (2001), Dahlgren et al. (2002) e Fernandes, Alves e
Souza (2003), com necrose e infiltrado intenso de células polimorfonucleares,
principalmente neutrófilos, um dia após a injeção. Após três dias observou-se a
predominância de células inflamatórias mononucleares, especialmente macrófagos.
Com sete dias era possível notar atividade fibroblástica e neovascularização. A partir
de 14 dias, as amostras já indicavam o início da produção e reorganização de fibras
colágenas.
O reparo completo de um tendão lesado é um processo complexo que
requer resposta inflamatória, neoangiogênese, fibrilogênese e remodelamento
tecidual (WANG et al., 2003). Entretanto, 28 dias após o início da tendinite, notou-se
que, apesar seguir estas etapas, as amostras não apresentaram uma recuperação
satisfatória fornecendo indícios de que isto pode não acontecer.
Paralelamente à histopatologia, foi realizada a análise por
espectroscopia Raman das amostras, visando a correlação dos dois métodos de
análise.
Entre várias técnicas, a espectroscopia Raman vem se destacando por
ser capaz de fornecer informações detalhadas sobre a composição química de uma
amostra tecidual sob estudo, pois suas informações são obtidas no nível molecular.
Essas informações podem, então, ser utilizadas para distinguir tecidos normais de
tecidos “doentes” (HANLON et al., 2000; LORINCZ et al., 2004).
Contudo, a sobreposição de bandas espectrais (FURUSJO et al., 1998;
BIJLSMA; SIMILDE, 1999) e os efeitos de fluorescência da matriz de tecidos
biológicos (HIRSCHFELD; CHASE, 1986; SCHRADER et al., 1999; HANLON et al.,
2000; MAQUELIN et al., 2000), conferem ao sistema características não lineares que
podem dificultar sua identificação.
65
Uma alternativa bastante viável para minimizar estes efeitos de
fluorescência tecidual, utilizando espectroscopia Raman, é a aplicação de métodos
não lineares de classificação/calibração multivariada (SEKULIC et al., 1993; ZUPAN;
NOVI; GASTEIGER, 1994; CHAN et al., 1997; CLADERA et al., 1997). Dentre estes
métodos, destacam-se os métodos quimiométricos de reconhecimento de padrões
(MELLO et al., 1999).
Min et al. (2005) compararam amostras de tecido pulmonar fresco com
câncer e normal através da espectroscopia Raman com dois diferentes
comprimentos de ondas, 785nm e 1064nm. Com 785nm de estímulo, não houve
nenhuma faixa Raman reconhecível no espectro devido à forte fluorescência de
fundo que disfarçava os espectros Raman. Por outro lado, no caso do estímulo de
1064nm, uma proporção alta de sinal para ruído, o espectro Raman foi medido sem
dificuldade.
No estudo de Manoharan et al. (1998) foi utilizado um comprimento de
onda de 830 nm para analisar amostras de tecido mamário. Este estudo demonstrou
que os espectros Raman contêm as informações necessárias para diferenciar
tecidos mamários normal, benigno e maligno. No entanto, os autores sugeriram que
deve haver pesquisas mais aprofundadas que abranjam desde a interpretação da
informação espectral até o detalhamento do nível bioquímico.
No presente estudo, foi utilizado um laser com comprimento de onda
de 785 nm para avaliar as amostras de tendões normais, tendões submetidos à
injeção de colagenase e tendões submetidos à injeção de solução salina tamponada
de fosfato. Conforme descrito anteriormente, o espectro foi processado usando filtros
wavelets, com função de base Dubauchie (db4) para a minimização de ruído,
subtração do espectro do meio isotônico, correção de espalhamento multiplicativo
(MSC) para minimizar o espalhamento Rayleigh devido a variação do índice de
66
refração para cada uma das amostras de tecido tendíneo, e um polinômio de
segundo grau para minimizar a fluorescência da matriz. Para os cálculos da Análise
Hierárquica de Agrupamentos (HCA) utilizou-se o PLS Toolbox, para uso com
Matlab 4.2. Os programas para minimização de ruído, MSC e minimização da
fluorescência da matriz foram implementados pela utilização de sub rotinas do
Matlab 4.2.
Através destes parâmetros foi possível realizar a minimização da
fluorescência das amostras e obter os espectros de cada grupo. Nota-se que as
alterações características de cada grupo encontram-se na banda amida, a qual
apresenta um pico no grupo I, que diminui nos grupos II e III, voltando a estar
presente nos grupos IV, V e VI.
Min et al. (2005) encontraram, no estudo realizado com câncer de
pulmão, que na intensidade de 1659 cm-1 na banda amida I, a vibração aumenta
notavelmente, indo do estado normal para o cancerígeno.
De acordo com estes autores, quando o câncer se desenvolve, o tecido
torna-se denso devido ao aumento dos componentes de fibra, em geral proteínas
como o colágeno. Essa mudança na concentração de proteína é a mais provável
causa do aumento na intensidade da banda amida I, em tecidos cancerígenos.
Venkata Krishna et al. (2001 apud MIN et al., 2005) estudaram espectros Raman de
tecidos bucais com 785nm de estímulo. Também neste estudo, interpretou-se as
diferenças dos espectros entre amostras de tecidos malignos e normais como
originárias da mudança na composição de proteínas com o desenvolvimento do
câncer.
Portanto, pode-se sugerir que as alterações observadas na banda
amida entre os espectros de tecido tendíneo normal e espectros dos vários estágios
de tendinite sejam decorrentes do aumento de células inflamatórias, alterações nas
67
fibras de colágeno e liberação de mediadores químicos, entre outros fatores.
Realizando a distribuição destes espectros em classes de um
dendograma, observou-se que o Grupo I forma um ramo distinto dos outros grupos,
e a seqüência de proximidade destes em relação ao Grupo I segue a ordem do
Grupo VI, mais próximo, ao Grupo II, mais distante, conforme já demonstrado na
figura 26.
Isto pode sugerir que, após sofrer um processo de tendinite, mesmo
passando pelas etapas normais de um processo de regeneração tecidual, um
tendão não volta a ter as mesmas características moleculares de um tendão
saudável.
Entretanto, novos estudos devem ser realizados para que se possa
afirmar com maior precisão quais alterações encontradas durante a evolução do
processo de tendinite são responsáveis pelas alterações encontradas nos espectros
Raman e por quanto tempo estas alterações ainda permanecem no tendão.
68
CONCLUSÃO
Empregando o modelo de tendinite induzida pela colagenase, foi
possível demonstrar o curso normal da doença, uma vez que os grupos
contralaterais à aplicação desta substância não apresentaram evolução no processo
inflamatório.
A utilização de dois métodos de análise para a caracterização da
tendinite mostrou-se satisfatória, pois a diferenciação dos estágios da tendinite pela
histopatologia sustentou as informações obtidas pelos espectros Raman.
Foi possível demonstrar que a aplicação da espectroscopia Raman,
aliada aos métodos quimiométricos, apresenta um grande potencial para o estudo
de tecidos biológicos, entre os quais, os tendões.
69
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74
ANEXOS
75
ANEXO A –– Aprovação da pesquisa pelo Comitê de Ética da Universidade de Franca
76
ANEXO B –– Dados individuais por amostra da análise histopatológica TABELA 2 - SCORES DA ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
INFLAMAÇÃO (TENDÃO)
INFLAMAÇÃO (PERITENDÃO) AMOSTRA NECROSE
PMN MON PMN MON
AF NV FC
GI R1D - - - - - - - - GI R2D - - - - - - - - GI R3D - - - - - - - - GI R4D - - - - - - - - GI R5D - - - - - - - - GI R6D - - - - - - - - GI R7D - - - - - - - - GI R8D - - - - - - - - GI R1E - - - - + - - - GI R2E - - - - + - - - GI R3E - - - - + - - - GI R4E - - - - + - - - GI R5E - - - - - - - - GI R6E - - - - - - - - GI R7E - - - - - - - - GI R8E - - - - - - - - GII R1E + + - + + - - - GII R2E - + - + ++ - - - GII R3E - - - + + - - - GII R4E - - - - - - - - GII R5E - - - - + - - - GII R6E - - + - - - - - GII R7E + + + + - - - - GII R8E - - - - + - - - GII R1D + + - +++ - - - - GII R2D +++ ++ - +++ - - - - GII R3D + + - ++ + - - - GII R4D - - - ++ - - - - GII R5D ++ ++ - ++ - - - - GII R6D +++ +++ - +++ - - - - GII R7D + ++ - ++ - - - - GII R8D - + - +++ - - - - GIII R1E - - - - + - - - GIII R2E - - - - - - - - GIII R3E - - - - + - - - GIII R4E - - - - - - - - GIII R5E - - - - + - - - GIII R6E - - - - + - - - GIII R7E - - - - - - - - GIII R8E - - - - - - - -
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INFLAMAÇÃO (TENDÃO)
INFLAMAÇÃO (PERITENDÃO) AMOSTRA NECROSE
PMN MON PMN MON AF NV FC
GIII R1D - - - + ++ - - - GIII R2D - - - + ++ - - - GIII R3D - - - + + - - - GIII R4D ++ + ++ + ++ - - - GIII R5D - - + + +++ - - - GIII R6D - - - - + - - - GIII R7D ++ + +++ - +++ - - - GIII R8D ++ - ++ ++ + - - - GIV R1E - - - - - - - - GIV R2E - - - - + - - - GIV R3E - - - - + - - - GIV R4E - - - - - - - - GIV R5E - - - - - - - - GIV R6E - - - - - - - - GIV R7E - - - - - - - - GIV R8E - - - - - - - - GIV R1D - - + - - +++ ++ - GIV R2D - - + - + ++ + - GIV R3D - - - - + ++ + - GIV R4D - - - - + +++ ++ - GIV R5D - - + - + +++ + - GIV R6D - - + - + +++ + - GIV R7D - - - - + + + - GIV R8D - - + - + ++ + - GV R1E - - - - - - - - GV R2E - - - - - - - - GV R3E - - - - - - - - GV R4E - - - - - - - - GV R5E - - - - - - - - GV R6E - - + - - + + - GV R7E - - - - - - - - GV R8E - - - - - - - - GV R1D - - + - + + - ++ GV R2D - - - - - - - - GV R3D - - + - - + - + GV R4D - - + - + ++ + + GV R5D - - + - - + - - GV R6D - - - - + + - - GV R7D - - + - + - - - GV R8D - - - - + + - -
78
INFLAMAÇÃO (TENDÃO)
INFLAMAÇÃO (PERITENDÃO) AMOSTRA NECROSE
PMN MON PMN MON AF NV FC
GVI R1E - - - - - - - - GVI R2E - - - - - - - - GVI R3E - - - - - - - - GVI R4E - - - - - - - - GVI R5E - - - - - - - - GVI R6E - - - - - - - - GVI R7E - - - - - - - - GVI R8E - - - - - - - - GVI R1D - - - - - - - - GVI R2D - - - - - - - - GVI R3D - - - - - ++ - +++ GVI R4D - - - - - - - + GVI R5D - - - - - - - + GVI R6D - - - - - ++ - + GVI R7D - - - - - - - + GVI R8D - - - - - - - ++
LEGENDA:
G: Grupo
E: Esquerdo
D: Direito
R: Rato
INFLAMAÇÃO TENDÃO: Infiltrado de Células Inflamatórias Intratendíneas
INFLAMAÇÃO PERITENDÃO: Infiltrado de Células Inflamatórias Peritendíneas
PMN: Células Inflamatórias Polimorfonucleares
MON: Células Inflamatórias Mononucleares
AF: Atividade Fibroblástica
NV: Neovascularização
FC: Produção e Reorganização de Fibras Colágenas
- : Ausente
+ : Leve
++ : Moderado
+++ : Intenso
