Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su

Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión del parásito al

glóbulo rojo

Angela Patricia Guerra Vega

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Química

Bogotá, Colombia

2019

Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión del parásito al

glóbulo rojo

Angela Patricia Guerra Vega

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Doctor en Química

Director:

Ph.D., José Manuel Lozano Moreno1

Codirectora:

Ph.D., Jacqueline Chaparro Olaya2

Línea de Investigación:

Motores moleculares en Apicomplexa2

Grupo de Investigación:

Mimetismo molecular de los agentes infecciosos1-U Nacional/ Laboratorio de Parasitología

Molecular2-U El Bosque

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento que Química

Bogotá, Colombia

2019

A mi querida Osita

Agradecimientos

A las instituciones que financiaron este trabajo:

COLCIENCIAS. Convocatoria Nacional para la Conformación del Banco de Proyectos de

Investigación Científica o Tecnológica. Proyecto 110152128729.

DIB-Dirección de Investigación de la Sede Bogotá - Universidad Nacional de Colombia.

Convocatoria “Proyectos de investigación, desarrollo, innovación o creación artística de la

DIB”, en la modalidad “Proyectos de investigación, desarrollo, innovación o creación

artística en colaboración con instituciones académicas o de investigación

internacionales”. Proyecto 15828.

DIB-Dirección de Investigación de la Sede Bogotá - Universidad Nacional de Colombia.

Convocatoria “Apoyo de la DIB a tesis de investigación en Posgrados”. Proyecto 19106.

Instituto Nacional de Salud (INS), por acogerme en su plan de estímulos y beneficios y

concederme el tiempo para cursar el programa de doctorado.

Al bioterio del INS

A las personas:

Siempre estaré en deuda con la profesora Jacqueline Chaparro-Olaya; muchas gracias por

toda tu generosidad académica y acompañamiento a lo largo de estos años. Gracias por

tanta dedicación, guía, discusiones fértiles y paciencia en la consecución de los objetivos

de este trabajo.

Al profesor José Manuel Lozano por su apoyo, confianza y orientación.

A Eliana Calvo, por sus enseñanzas, acompañamiento profesional en el quehacer diario

del laboratorio y por su amistad.

Al profesor Moisés Wasserman por su asesoría y consejo crítico a lo largo del desarrollo

de este trabajo.

A la profesora Lisa Ranford-Cartwright, investigadora de la Universidad de Glasgow por

permitirme realizar la pasantía en su laboratorio, por todo su apoyo, dedicación,

amabilidad y confianza.

A la profesora Sylke Müller, investigadora de la Universidad de Glasgow, quien

generosamente nos donó el vector de transfección y a la doctora Eleanor H Wong de la

misma universidad, quien me enseñó la técnica para producir parásitos “knock-out”.

A Liliana Morales del grupo de Parasitología Molecular de la Universidad El Bosque y a

Ricardo Cubillos del grupo de Bioquímica del Instituto Nacional de Salud por toda su

ayuda y apoyo durante el desarrollo de este trabajo.

A Magda, Luis, Paula y Rosalba, por compartir desinteresadamente su conocimiento y

experiencia y por toda la colaboración prestada en el trabajo de laboratorio.

A todas las personas que donaron un poquito de su sangre para darle vida a mis parásitos.

A Laurita y Marco por su apoyo, respaldo continuo, amor, paciencia y compañía.

A mis padres y hermanas por su cariño incondicional.

Resumen

Plasmodium falciparum es un parásito intracelular obligado cuya supervivencia y

proliferación depende de su capacidad para invadir células del hospedero. Como todos los

miembros del phylum Apicomplexa, P. falciparum presenta una forma inusual de locomoción

llamada “gliding”, la cual involucra una sofisticada maquinaria proteica (“glideosoma”) que es

impulsada por un motor actina-miosina. En P. falciparum se han identificado seis genes que

codifican para las miosinas PfMyoA a PfMyoF, pero hasta ahora sólo se ha caracterizado

funcionalmente a PfMyoA. Esta miosina hace parte del motor molecular del “glideosoma” y

participa activamente en la invasión a células hospederas. No se conoce la función de las

otras miosinas, pero se ha sugerido que PfMyoB también podría estar involucrada en este

proceso. Para explorar la posible participación de PfMyoB en la invasión y si tiene

redundancia funcional con PfMyoA, este trabajo se dirigió a identificar interacciones entre

PfMyoB y otras proteínas, así como a establecer el efecto del silenciamiento (“knock out”) del

gen pfmyo-b. Para lograr lo anterior, inicialmente se produjeron anticuerpos policlonales a

partir de proteínas recombinantes del “glideosoma” (PfMyoA, MTIP, GAP45 y GAP50) y de

PfMyoB. Aunque los anticuerpos anti-PfMyoB permitieron establecer que la localización

celular de esta proteína es distinta a la de PfMyoA, no fueron útiles para reconocer proteínas

de interacción porque fallaron al intentar inmunoprecipitar a PfMyoB. Por su parte, el

silenciamiento de pfmyo-a resultó en la muerte de la población “knock-out”, lo que impidió

estudiar el comportamiento de PfMyoB en ausencia de PfMyoA. Finalmente, el silenciamiento

de pfmyo-b no tuvo efecto aparente sobre la invasión, aunque alteró el desarrollo del

parásito. Los resultados obtenidos parecen indicar que pfmyo-b no es un gen esencial para la

supervivencia de los estadíos intraeritrocíticos de P. falciparum y PfMyoB parece no tener

una función complementaria con PfMyoA.

Palabras clave: Plasmodium falciparum, PfMyoB, “glideosoma”, invasión, proteínas

recombinantes, silenciamiento de genes.

X Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión del

parásito al glóbulo rojo

Abstract

Plasmodium falciparum is an obligate intracellular parasite whose survival and proliferation

depend on its ability to invade host cells. Like all members of the phylum Apicomplexa, P.

falciparum has an unusual form of motility called gliding, which is powered by an

actomyosin-motor and involves the coordinate work of a sophisticated multi-protein

machinery named glideosome. In P. falciparum, the six genes coding for myosins (PfMyoA to

PfMyoF) have been identified, but until now only PfMyoA has been functionally

characterized. This myosin is part of the molecular motor of glideosome and actively

participates in the invasion process to host cells. The function of the other myosins is still

unknown, but it has been suggested that PfMyoB could also be involved in this process. To

explore the possible role of PfMyoB in host cell invasion and define its possible functional

redundancy with PfMyoA, our work was aimed at identifying the interactions between

PfMyoB and other proteins, and establishing the effect of knock out of the pfmyo b gene. To

achieve these objectives, polyclonal antibodies were initially produced from recombinant

proteins of the glideosome (PfMyoA, MTIP, GAP45, and GAP50) and of PfMyoB. Although the

anti-PfMyoB antibodies showed that the cellular localization of this protein is different from

that of PfMyoA, they were not useful to identify interaction proteins because they failed to

immunoprecipitate PfMyoB. In addition, the pfmyo-a gene knock out resulted in the death of

these parasites, which prevented the evaluation of the behavior of PfMyoB in the absence of

PfMyoA. Finally, the pfmyo-b gene knock out had no apparent effect on host cell invasion

process, although it altered the parasite development. Our results seem to indicate that

pfmyo-b is not an essential gene for the survival of the intraerythrocytic stages of P.

falciparum and its associated protein does not have a complementary function to PfMyoA.

Keywords: Plasmodium falciparum, PfmyoB, glideosome, invasion, recombinant proteins,

gene silencing (“knock-out”).

Contenido

1 MARCO TEÓRICO...................................................................................................................... 3

1.1 Epidemiología de la malaria ........................................................................................................................ 3

1.2 Biología de parásitos Apicomplexa .......................................................................................................... 5

1.3 Ciclo de vida de Plasmodium ....................................................................................................................... 7

1.4 Miosinas ................................................................................................................................................................ 9

1.4.1 Mecanismo molecular del motor actina-miosina ......................................................................................... 12

1.4.2 Miosinas de Plasmodium falciparum .................................................................................................................. 13

1.4.2.1 Miosina A................................................................................................................................................................................ 14

1.4.2.2 Miosina B ................................................................................................................................................................................ 15

1.4.2.3 Miosina C, D, E y F .............................................................................................................................................................. 16

1.5 Invasión del eritrocito por merozoítos de Plasmodium .............................................................. 17

1.6 El “glideosoma” ............................................................................................................................................... 20

1.6.1 Actina y miosina del “glideosoma” de Plasmodium ...................................................................................... 21

1.6.1.1 Actina en Plasmodium falciparum .............................................................................................................................. 22

1.6.1.2 PfMyoA y sus cadenas livianas .................................................................................................................................... 23

1.6.2 Proteínas asociadas a “glideosoma”: GAP45 y GAP50 ................................................................................ 25

1.6.2.1 GAP45 ...................................................................................................................................................................................... 25

1.6.2.2 GAP50 ...................................................................................................................................................................................... 26

1.6.3 Proteínas transmembranales tipo adhesinas que comunican el motor con receptores sobre la célula a invadir ................................................................................................................................................... 26

1.6.4 Proteínas que median la interacción del motor con las adhesinas ...................................................... 27

1.6.5 Proteínas que conducen al rompimiento de las interacciones con el sustrato .............................. 27

1.6.6 Mecanismos que controlan la función del “glideosoma” ........................................................................... 28

2 JUSTIFICACIÓN ....................................................................................................................... 31

3 OBJETIVOS ............................................................................................................................... 33

3.1 Objetivo general ............................................................................................................................................. 33

3.2 Objetivos específicos.................................................................................................................................... 33

4 MÉTODOS, RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................... 35

XII Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión

del parásito al glóbulo rojo

4.1 Cultivo de Plasmodium falciparum y preparación de extractos ..............................................36

4.1.1 Cultivo continuo ........................................................................................................................................................... 36

4.1.2 Obtención de parásitos libres ................................................................................................................................ 36

4.1.3 Extracción de ADN....................................................................................................................................................... 36

4.1.4 Extracción de ARN ....................................................................................................................................................... 37

4.1.5 Extracción de proteínas ............................................................................................................................................ 38

4.2 Producción de proteínas recombinantes: PfMyoA, PfMyoB, MTIP, GAP45 y GAP50 ....38

4.2.1 Métodos ............................................................................................................................................................................ 38

4.2.1.1 Diseño de cebadores y clonación ............................................................................................................................... 38

4.2.1.2 Expresión de las proteínas recombinantes ........................................................................................................... 40

4.2.1.3 Análisis bioinformático ................................................................................................................................................... 41

4.2.1.4 Evaluación de la solubilidad de las proteínas recombinantes ..................................................................... 42

4.2.1.5 Purificación de proteínas recombinantes .............................................................................................................. 42

4.2.2 Resultados ....................................................................................................................................................................... 43

4.2.2.1 Diseño de cebadores y clonación ............................................................................................................................... 44

4.2.2.2 Expresión de las proteínas recombinantes ........................................................................................................... 46

4.2.2.3 Análisis bioinformático ................................................................................................................................................... 49

4.2.2.4 Evaluación de la solubilidad de las proteínas recombinantes ..................................................................... 50

4.2.2.4.1 Efecto de la cepa .......................................................................................................................................................................................... 50

4.2.2.4.2 Efecto de la temperatura en la solubilidad de las proteínas recombinantes expresadas en la cepa pG-KJE8 ....................................................................................................................................................................................................................... 51

4.2.2.5 Purificación de proteínas recombinantes .............................................................................................................. 52

4.2.3 Discusión .......................................................................................................................................................................... 54

4.3 Producción y evaluación de anticuerpos policlonales .................................................................56

4.3.1 Métodos ............................................................................................................................................................................ 56

4.3.1.1 Esquemas de inmunización .......................................................................................................................................... 57

4.3.1.2 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de western blot (WB) ............................................ 57

4.3.1.2.1 Detección de proteínas recombinantes ........................................................................................................................................... 57

4.3.1.2.2 Detección de proteínas sobre extractos del parásito ................................................................................................................ 59

4.3.1.3 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de inmunofluorescencia (IF) ............................. 59

4.3.1.4 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de inmunoprecipitación (IP) ............................. 60

4.3.2 Resultados ....................................................................................................................................................................... 61

4.3.2.1 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de western blot (WB) ............................................ 61

4.3.2.1.1 Detección de las proteínas recombinantes .................................................................................................................................... 61

4.3.2.1.2 Detección de las proteínas del parásito ........................................................................................................................................... 63

4.3.2.2 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de inmunofluorescencia (IF) ............................. 64

4.3.2.3 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de inmunoprecipitación (IP) ............................. 65

4.3.2.4 Alternativas para la producción del anticuerpo anti-PfMyoB ..................................................................... 66

4.3.2.4.1 Ensayos Western Blot (WB) con anti-MyoB-P1 y anti-MyoB-P2. ....................................................................................... 68

Contenido XIII

4.3.2.4.2 Ensayos de IF con anti-MyoB-P2 ......................................................................................................................................................... 69

4.3.2.4.3 Ensayos de IP con anti-MyoB-P2 ......................................................................................................................................................... 70

4.3.3 Discusión .......................................................................................................................................................................... 73

4.4 Generación de parásitos “knock-out” para el gen pfmyo-a o el gen pfmyo-b .................... 74

4.4.1 Métodos ............................................................................................................................................................................ 74

4.4.1.1 Diseño de constructos y PCR diagnóstico .............................................................................................................. 75

4.4.1.1.1 Diseño de constructos “knock-out” ..................................................................................................................................................... 75

4.4.1.1.2 Diseño de constructos control .............................................................................................................................................................. 79

4.4.1.1.3 Diseño de la PCR diagnóstica ................................................................................................................................................................ 83

4.4.1.2 Clonación y transfección................................................................................................................................................. 87

4.4.1.2.1 Extracción y purificación del ADNp ................................................................................................................................................... 88

4.4.1.2.2 Transfección de Plasmodium falciparum mediante electroporación................................................................................. 89

4.4.1.2.3 Monitoreo de los cultivos transfectados .......................................................................................................................................... 91

4.4.1.3 Evaluación de “knock-out” pfmyo-a y pfmyo-b .................................................................................................... 92

4.4.1.3.1 Ensayos de PCR ............................................................................................................................................................................................ 92

4.4.1.3.2 Ensayos de RT-PCR .................................................................................................................................................................................... 92

4.4.1.3.3 Ensayos WB ................................................................................................................................................................................................... 93

4.4.1.4 Evaluación del comportamiento de los parásitos “knock-out” en cultivo .............................................. 93

4.4.2 Resultados ....................................................................................................................................................................... 93

4.4.2.1 Monitoreo de los cultivos ............................................................................................................................................... 93

4.4.2.2 Evaluación de parásitos MyoA-KO y MyoA-C ....................................................................................................... 94

4.4.2.2.1 PCR diagnóstica ........................................................................................................................................................................................... 94

4.4.2.2.2 Ensayos RT-PCR y WB .............................................................................................................................................................................. 97

4.4.2.3 Evaluación de parásitos MyoB-KO y MyoB-C ....................................................................................................... 99

4.4.2.3.1 PCR diagnóstica ........................................................................................................................................................................................... 99

4.4.2.3.2 Ensayos adicionales de PCR ................................................................................................................................................................ 101

4.4.2.3.3 Ensayos RT-PCR (retrotranscripción reversa-PCR) ............................................................................................................... 102

4.4.2.3.4 Ensayos de WB .......................................................................................................................................................................................... 105

4.4.2.4 Evaluación del comportamiento de los parásitos MyoB-KO en cultivo ................................................ 106

4.4.2.5 Localización de MTIP en parásitos MyoB-KO.................................................................................................... 109

4.4.3 Discusión ....................................................................................................................................................................... 111

4.5 Identificación de potenciales motivos funcionales en PfMyoB usando herramientas informáticas .................................................................................................................................................. 115

4.5.1 Métodos ......................................................................................................................................................................... 115

4.5.1.1 Búsqueda de motivos IQ sobre PfMyoB con modelos ocultos de Markov (HMM) .......................... 115

4.5.1.2 Búsqueda de motivos IQ sobre PfMyoB con expresiones regulares ...................................................... 116

4.5.2 Resultados .................................................................................................................................................................... 116

4.5.2.1 Búsqueda de motivos IQ sobre PfMyoB con HMM.......................................................................................... 116

4.5.2.2 Búsqueda de motivos IQ sobre PfMyoB con expresiones regulares ...................................................... 117

4.5.3 Discusión ....................................................................................................................................................................... 119

XIV Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión


5 DISCUSIÓN GENERAL.......................................................................................................... 121

6 CONCLUSIONES .................................................................................................................... 125

7 ANEXOS .................................................................................................................................. 127

8 BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................... 145

Contenido XV

Lista de figuras

Figura 1-1. Morfología comparativa de zoítos de Apicomplexa. ............................................................... 6

Figura 1-2. Ciclo de vida de Plasmodium. ............................................................................................................. 8

Figura 1-3.Modelo de cintas de una miosina clase II. ..................................................................................... 9

Figura 1-4. Organización por dominios de algunas miosinas .................................................................. 11

Figura 1-5. Dominios de cola de las miosina II y V confieren especificidad de función. ............. 12

Figura 1-6. Modelo de movimiento de la miosina. ........................................................................................ 13

Figura 1-7. Invasión del eritrocito por el merozoíto. ................................................................................... 19

Figura 1-8. Modelo para la movilidad “gliding” de Apicomplexas ......................................................... 21

Figura 1-9. Organización por dominios de PfMyoA y motivos IQ .......................................................... 24

Figura 4-10. Amplificación por PCR de los fragmentos de interés y ligación de los productos en el vector pGEM-T easy. .............................................................................................................. 45

Figura 4-11. Confirmación de colonias transformadas. .............................................................................. 45

Figura 4-12. Subclonación en vector de expresión pGEX-4T 2. .............................................................. 46

Figura 4-13. Expresión de 5 proteínas recombinantes en dos cepas de E. coli BL21. ................. 49

Figura 4-14. Evaluación de la solubilidad de las proteínas recombinantes ...................................... 51

Figura 4-15. Efecto de la temperatura sobre la solubilidad de GST-GAP50 y GST-MyoA .......... 52

Figura 4-16. SDS-PAGE de las 5 recombinantes purificadas y WB con anti-GST y Anti-His ..... 53

Figura 4-17. WB sobre las proteínas recombinantes con los anticuerpos producidos ............... 62

Figura 4-18. WB sobre extracto del parásito con los anticuerpos producidos. .............................. 63

Figura 4-19. WB sobre extractos del parásito con αMyoB-ratón usando quimioluminiscencia ..................................................................................................................................................................... 64

Figura 4-20. IF sobre parásitos en estadio de esquizontes, usando anti-MTIP producido en conejo y anti-MyoA producido en ratón. ................................................................................. 65

Figura 4-21. Inmunoprecipitación con anti-MyoB ........................................................................................ 66

XVI Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión


Figura 4-22. Secuencia de las proteínas recombinantes de PfMyoB .....................................................67

Figura 4-23. Localización de los péptidos P1 y P2. ........................................................................................68

Figura 4-24. Western blot con anti-MyoB-P2 sobre extractos del parásito (esquizontes) ........69

Figura 4-25. Inmunofluorescencia sobre trofozoitos y esquizontes usando anti-MyoB-P2......70

Figura 4-26. IP con anti-MyoB-P2 ..........................................................................................................................71

Figura 4-27. IP con anti-MTIP ..................................................................................................................................72

Figura 4-28. Constructo pHH1-PfMyoA_knock-out .......................................................................................76

Figura 4-29. Secuencia del gen pfmyo-a y diseño del constructo pHH1-PfMyoA_knock-out ....77

Figura 4-30. Constructo pHH1-PfMyoB_knock-out .......................................................................................78

Figura 4-31. Secuencia del gen pfmyo-b y diseño del constructo pHH1-PfMyoB_knock-out ....79

Figura 4-32. Constructo pHH1-PfMyoA_Control .............................................................................................80

Figura 4-33. Secuencia del gen pfmyo-a y diseño del constructo pHH1-PfMyoA_Control. .......81

Figura 4-34. Constructo pHH1-PfMyoB_Control .............................................................................................82

Figura 4-35. Secuencia del gen pfmyo-b y diseño de constructo pHH1-PfMyoB_Control ...........83

Figura 4-36. Diseño de iniciadores para detectar formas integradas en cultivos PfMyoA_knock-out .............................................................................................................................84

Figura 4-37. Diseño de iniciadores para detectar formas integradas en cultivos PfMyoB_knock-out..............................................................................................................................85

Figura 4-38. Diseño de iniciadores para detectar formas integradas en cultivos PfMyoA_Control ...................................................................................................................................86

Figura 4-39. Diseño de iniciadores para detectar formas integradas en cultivos PfMyoB_Control ...................................................................................................................................87

Figura 4-40. PCR diagnóstica para comprobar integración en el cultivo MyoA-KO ......................95

Figura 4-41. Estimación de la proporción de parásitos con integración en el cultivo MyoA-KO ......................................................................................................................................................................97

Figura 4-42. RT-PCR y WB sobre cultivo MyoA-KO .......................................................................................98

Figura 4-43. PCR diagnóstica para comprobar integración en el cultivo MyoA-C..........................99

Figura 4-44. PCR diagnóstica para comprobar integración en el cultivo MyoB-KO ................... 100

Figura 4-45. PCR diagnóstica para comprobar integración en el cultivo MyoB-C ....................... 101

Figura 4-46. PCR semi-anidada para comprobar ausencia de parásitos silvestres (ADNg) en el cultivo MyoB-KO ............................................................................................................................... 102

Contenido XVII

Figura 4-47. RT-PCR sobre cultivo MyoB-KO con iniciadores para amplificar pfmyo-b .......... 103

Figura 4-48. RT-PCR sobre cultivo MyoB-KO con iniciadores para amplificar los genes hrp2 y gap50 ..................................................................................................................................................... 104

Figura 4-49. PCR diagnóstica y RT-PCR sobre parásitos MyoB-KO ................................................... 105

Figura 4-50. WB para comprobar ausencia de expresión de PfMyoB en parásitos MyoB-KO .................................................................................................................................................................. 106

Figura 4-51. Comportamiento de parásitos MyoB-KO y MyoB-C durante el proceso de invasión y de maduración ........................................................................................................... 107

Figura 4-52. Morfología de los parásitos MyoB-C y MyoB-KO en cultivo ....................................... 109

Figura 4-53. IF con anticuerpo anti-MTIP sobre esquizontes de P.falciparum ............................ 111

Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la

invasión del parásito al glóbulo rojo

XVIII

Lista de tablas

Tabla 4-1. Información de los genes de interés ...............................................................................................44

Tabla 4-2. Frecuencia de codones raros en las cinco proteínas recombinantes y dos tags .......50

Tabla 4-3. Motivos IQ identificados en las miosinas de Plasmodium falciparum con el modelo HMM ....................................................................................................................................................... 117

Tabla 4-4. Motivos IQ encontrados con tres estrategias de búsqueda .............................................. 118

Lista de Símbolos y abreviaturas

Símbolo Término

°C grados celsius

g gramo

x g unidades por gravedad

h hora

kDa kiloDalton

L litro

μ micro

m mili

M molar

U unidades

rpm revoluciones por minuto

Abreviatura Término Aa Aminoácido ADN Acido desoxiribonucleico ADNg ADN genómico ADNp ADN plasmídico

ADNe ADN episomal

ARN Acido ribonucleic ARNm ARN mensajero CaM Calmodulina Cultivo MyoA-KO Cultivo de P. falciparum sometido a transfección con el constructo

pHH1-PfMyoA_ knock out Cultivo MyoA-C Cultivo de P. falciparum sometido a transfección con el constructo

pHH1-PfMyoA_control Cultivo MyoB- KO Cultivo de P. falciparum sometido a transfección con el constructo

pHH1-PfMyoB_knock out Cultivo MyoB-C Cultivo de P. falciparum sometido a transfección con el constructo

pHH1-PfMyoB_control FA Fosfatasa alcalina FA-ST Fosfatasa alcalina-Estreptavidina FITC Isotiocianato de fluoresceína GAP45 Proteína asociada al “glideosoma” 45 GAP50 Proteína asociada al “glideosoma” 50 GR Glóbulos rojos GRI Glóbulos rojos infectados

XX Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión


GST Glutation S transferasa

HA Hemaglutinina

HMM Modelos ocultos de Markov HRP Peroxidasa de rábano HRP-ST Peroxidasa-estreptavidina Hto Hematocrito IMC Complejo interno de membranas IF Inmunofluorescencia IP Inmunoprecipitación IPTG Isopropyl-beta-thio-galactopyranoside Medio de selección Medio de cultivo completo + 5 nM de WR99210 min Minuto MP Membrana plasmática MTIP Proteína que interactúa con el dominio de cola de PfMyoA nt Nucleótido pb Pares de bases P. falciparum Plasmodium falciparum PfMyoA Miosina A de P. falciparum pfmyo-a Gen que codifica para la miosina A de P. falciparum PfMyoB Miosina B de P. falciparum pfmyo-b Gen que codifica para la miosina B de P. falciparum PM Peso molecular PVDF Membrana de fluoruro de polivinilideno RT-PCR Transcripción Reversa- Reacción en Cadena de la ADN Polimerasa SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones denaturantes seg Segundo TRITC Tetrametilrodamina VP Vacuola Parasitófora WB Western Blot

Introducción

A pesar de los innegables logros alcanzados en la reducción de la morbilidad y mortalidad

por malaria en los últimos años (OMS, 2017), esta enfermedad infecciosa continúa siendo un

grave problema de salud pública mundial. La transmisión endemo epidémica persistente de

la malaria, junto con la aparición de cepas de Plasmodium falciparum resistentes a los

derivados de artemisininas (WHO, 2017) y de vectores resistentes a los insecticidas (Lol et

al., 2013), han planteado la necesidad de utilizar nuevas estrategias encaminadas ya no al

control sino a la eliminación de la transmisión local de la malaria en los países y territorios

donde la enfermedad es endémica (OPS, 2016). De manera simultánea, los grandes avances

de la ciencia han permitido un mayor entendimiento de los mecanismos biológicos del

parásito y la identificación y priorización de candidatos para el desarrollo de nuevos

medicamentos o de la tan anhelada vacuna contra la malaria. Siendo Plasmodium spp. un

organismo intracelular obligado, la invasión de la célula hospedera es un paso esencial

durante su ciclo de vida. Así, el proceso de invasión reviste gran importancia como blanco

terapéutico, ya que al bloquear la invasión se bloquearía la enfermedad.

Plasmodium spp. tiene un ciclo de vida complejo, el cual se lleva a cabo en dos hospederos

diferentes; el ciclo esporogónico o sexual, se desarrolla en mosquitos del género Anopheles y

el ciclo esquizogónico o asexual, en un hospedero vertebrado. Este parásito invade diferentes

tipos de células a través de tres formas infectantes distintas (zoítos) que aparecen a lo largo

de su ciclo de vida: el ooquinete, el esporozoíto y el merozoíto. Entre otras características

morfológicas/estructurales, estos “zoitos” comparten la maquinaria proteica que le permite

al parásito moverse e invadir células. Esta maquinaria, conocida como “glideosoma”, debido a

que dirige un tipo de movimiento llamado “gliding”, produce movimiento gracias a la fuerza

proporcionada por un motor molecular de actina-miosina. En P. falciparum se han

identificado seis genes que codifican para miosinas, las cuales se han nombrado con letras,

desde la A a la F (PfMyoA a PfMyoF). Hasta ahora sólo se ha dilucidado la función de PfMyoA,

proteína que constituye el motor molecular del “glideosoma” y que por tanto participa

2 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la invasión


activamente en el proceso de invasión (Pinder et al., 1998; Baum et al., 2006; Jones et al.,

2006). Para las otras miosinas aún no se conoce su función; sin embargo, diferentes

investigaciones (Chaparro-Olaya et al., 2003; Chaparro-Olaya et al., 2005; Foth et al., 2006;

Hernández et al., 2017; Hernández et al., 2018) han permitido establecer numerosas

similitudes entre la miosina A y B, evidencias que sugieren que PfMyoB puede tener una

función redundante con PfMyoA durante el proceso de invasión de P. falciparum.

En este trabajo se exploró la participación de PfMyoB en el proceso de invasión de P.

falciparum a glóbulos rojos, con el propósito de establecer si interactúa con el “glideosoma”

en la misma forma que lo hace PfMyoA, es decir a través de MTIP (“Myosin A Tail domain-

Interacting Protein”). Para estudiar esta interacción, fue necesario generar previamente una

serie de herramientas como constructos plasmídicos, proteínas recombinantes del

“glideosoma” y anticuerpos policlonales contra ellas. Para tratar de dilucidar el papel de

PfMyoB en la invasión, se usó una técnica de silenciamiento de genes, a partir de la cual se

generaron parásitos “knock-out”. Finalmente, mediante herramientas bioinformáticas se

buscaron motivos funcionales en PfMyoB que pudieran dar indicios sobre su posible función.

Los resultados generados en este estudio aportan conocimiento en torno a la posible

participación de PfMyoB en el proceso de invasión. Además, la estandarización y uso de

técnicas genéticas moleculares relacionadas con silenciamiento de genes nos permitió

establecer si PfMyoB es un gen esencial o no para el parásito. Este tipo de información sobre

el repertorio genético del parásito es de gran relevancia a la hora de priorizar blancos para el

desarrollo de fármacos antipalúdicos. Se espera que este acercamiento metodológico apoye

la búsqueda futura de la función de las demás miosinas de P. falciparum.

1 Marco teórico

1.1 Epidemiología de la malaria

La malaria es la infección parasitaria más importante a nivel mundial y uno de los grandes

retos en salud pública que enfrentan los países ubicados en la franja intertropical. Esta

enfermedad es causada por parásitos del género Plasmodium, los cuales son transmitidos al

humano por la picadura de mosquitos Anopheles sp infectados (OMS, 2018). Se conocen cinco

especies de Plasmodium que infectan humanos: P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale y

P. knowlesi, siendo las dos primeras las causantes de la mayor morbi-mortalidad (OMS,

2018). La transmisión zoonótica de P. knowlesi, especie propia de monos catarrinos, sólo se

ha reportado en poblaciones humanas del sureste asiático (Millar y Cox-Singh, 2015).

La incidencia de la malaria depende de que los vectores locales se encuentren en condiciones

ambientales apropiadas en términos de altitud, clima, vegetación y de la implementación de

medidas de control (Ashley et al., 2018). Los cambios en los sistemas biológicos asociados

con el clima, así como la alteración en la distribución de mosquitos, indican que

enfermedades como la malaria tienen el potencial para propagarse a regiones donde no

existía, aumentando la población que estaría en riesgo de contraer la enfermedad (Short et

al., 2017).

Según el informe mundial 2018 sobre el paludismo, para el año 2017 se presentaron a nivel

mundial 219 millones de casos y 435.000 muertes debidas a esta enfermedad (WHO, 2018).

La mayoría de los casos se presentaron en Africa subsahariana (92%), seguidos por Asia

Suroriental (5 %) y la región del Mediterráneo Oriental (2%), siendo Plasmodium falciparum

la especie más prevalente en estas tres regiones. En las Américas, P. vivax fue la especie

predominante (74,1%), observándose un incremento en el número de casos debido en gran

medida al aumento en la transmisión en países como Brasil, Venezuela y Nicaragua, (WHO,

2018).



Colombia ocupó en la región de las Américas el tercer lugar entre los países que más casos de

malaria reportaron (8%), después de Venezuela (53%) y Brasil (22%) (WHO, 2018). El 85 %

del territorio rural colombiano está situado por debajo de los 1.600 m.s.n.m y presenta

condiciones climáticas, geográficas y epidemiológicas aptas para la transmisión de la

enfermedad. En 2017 se presentó una disminución del 35 % en la notificación de casos de

malaria respecto al 2016, registrándose 55117 casos de malaria, de los cuales 54102 fueron

de malaria no complicada, 1015 de malaria complicada y 19 fueron fatales (INS, 2017). Los

casos se concentraron en los departamentos de Chocó (30,5 %) y Nariño (26,6 %), seguidos

en menor proporción por Antioquia (9,1 %), Córdoba (7,3 %), Guainía (5,4 %), Amazonas

(4,8 %), Cauca (3,8 %) y Vichada (3 %). En cuanto a las especies parasitarias circulantes hubo

predominio de infección por P. falciparum con 30170 casos (54,7 %), seguido por P. vivax con

23736 casos (43,1 %) y 1211 casos (2,2 %) correspondieron a infección mixta (P. falciparum

y P. vivax) (INS, 2017). Aunque para el año 2018 hubo un incremento de 7024 casos respecto

al año anterior, vale la pena resaltar que hubo una reducción del 52,6 % en el número de

muertes y del 5 % en los casos de malaria complicada. Para 2018 se conservó la misma

tendencia en cuanto a las especies parasitarias; es decir, mayor número de casos por P.

falciparum (50,1 %) que por P. vivax (47,9 %) (INS, 2018), al igual que los departamentos con

la mayor casuística.

Dentro de las estrategias que despliegan los países en la lucha contra la malaria, el

diagnóstico y el tratamiento oportunos constituyen la intervención más costo-efectiva, ya que

contribuyen a reducir la incidencia, los efectos mortales y la transmisión de la enfermedad

(OMS, 2018). Actualmente, las terapias disponibles a nivel mundial se basan en el

tratamiento combinado con derivados de artemisinina, medicamento que tiene la capacidad

de reducir la biomasa parasitaria rápida y eficientemente (10000 veces cada 48 horas) (Cui y

Su, 2009). Otra de las estrategias es la reducción de la transmisión, que se basa en la lucha

antivectorial y dentro de ésta se utilizan dos intervenciones, el uso de mosquiteros

impregnados con insecticidas y la fumigación de interiores con insecticidas de acción

residual (OMS, 2018). A pesar de las múltiples estrategias de control que se han

implementado a nivel mundial para reducir la morbi-mortalidad de la malaria, éstas no han

tenido el progreso esperado, especialmente durante los últimos 4 años, siendo prioritario

que los países reorienten sus programas y establezcan nuevas medidas que apunten al

cumplimiento de las metas propuestas en la Estrategia Técnica Mundial contra el paludismo

Marco teórico 5

2016-2030 de la OMS: reducir la incidencia de casos y las tasas de mortalidad en al menos un

40 % con respecto a los niveles de 2015 (WHO, 2018). A la par con esta situación, el

surgimiento de parásitos resistentes a los diferentes antimaláricos y la ausencia de una

vacuna efectiva, empeoran el panorama. Todas estas situaciones han llevado a la OMS a

proponer una nueva estrategia encaminada ya no al control, sino a la eliminación (OMS,

2017).

1.2 Biología de parásitos Apicomplexa

Los parásitos del phylum Apicomplexa constituyen uno de los grupos más significativos de

patógenos que infectan al hombre y a los animales de granja. Dentro de éstos se encuentran

los parásitos de los géneros Plasmodium, Toxoplasma, Eimeria, Teileria y Cryptosporidium.

Todos los Apicomplexa son parásitos intracelulares obligados que comparten una gran

variedad de características morfológicas y exhiben ciclos de vida complejos que involucran

diferenciación a formas que invaden tejidos distintos en huéspedes diferentes. Las formas

invasivas o móviles denominadas zoítos son elongadas y polarizadas, con un extremo basal y

un extremo apical claramente diferenciados. En el polo apical se observan organelos únicos

que participan en la invasión a la célula hospedera (Morrissette y Sibley, 2002). Dentro de

éstos se encuentran las roptrias, los micronemas, el anillo polar y el conoide (Figura 1-1); los

dos primeros secretan proteínas que se requieren durante la locomoción, la adhesión, la

invasión y la formación de la vacuola parasitófora, mientras que el anillo polar funciona como

uno de los 3 centros organizadores de microtúbulos, a partir del cual se originan los

microtúbulos subpeliculares (Morrissette y Sibley, 2002; Baum et al., 2006b). La estructura

denominada conoide juega un papel mecánico en la invasión, pero no está presente en

Plasmodium. Esta visible especialización de la región apical es la característica principal que

clasifica a estos protozoos dentro del phylum Apicomplexa.

Los Apicomplexa tienen otra característica estructural única que es fundamental para la

locomoción del parásito y que se conoce como el complejo interno de membranas (IMC por

su acrónimo en inglés), el cual está formado por dos membranas estrechamente asociadas,

una interna y otra externa, que se localizan por debajo de la membrana plasmática (MP) del

parásito y se extienden a lo largo de todo el cuerpo del zoíto. En conjunto esta estructura de 3

capas membranosas se denomina película (Morrissette y Sibley, 2002; Santos et al., 2009).

Adicionalmente, entre la membrana externa del IMC y la MP hay un pequeño compartimiento



que reviste una importancia fundamental, ya que éste contiene las proteínas que participan

en el proceso de invasión (Figura 1-1). Esta maquinaria proteica se conoce como

“glideosoma” (Frénal y Soldati-Favre, 2013).

Figura 1-1. Morfología comparativa de zoítos de Apicomplexa.

Taquizoíto de Toxoplasma gondii (izquierda) y merozoíto de Plasmodium falciparum (derecha). La

estructura apical constituye la característica más sobresaliente de los “zoitos” del phylum

Apicomplexa. Dentro de ésta se encuentran las roptrias y los micronemas (organelos secretores) y el

anillo polar, del cual se originan los microtúbulos sub-peliculares que se extienden hacia el polo

posterior del zoíto. Entre la membrana plasmática externa (MP) y los microtúbulos sub-peliculares se

encuentra el complejo interno de membranas, el cual junto con la MP forman la película. Tomado de

Baum et al., 2006b.

Los Apicomplexa presentan una estrategia única de locomoción denominada “gliding”, la cual

les permite atravesar membranas para invadir y salir activamente de las células hospederas

(Morrissette y Sibley, 2002; Keeley y Soldati, 2004; Frénal y Soldati-Favre, 2013). Esta

inusual forma de movimiento es dependiente de sustrato y se caracteriza por la ausencia de

cambios en la forma de la célula y por el mantenimiento de su polaridad antero posterior

(Pinder et al., 2000; Baum et al., 2006a). Este tipo de movilidad no requiere de estructuras

extracelulares como cilios o flagelos (Sibley, 2004; Baum et al., 2006ª) y es distinto al

movimiento de “arrastre” propio de las amebas, en el cual la célula no mantiene la polaridad

Marco teórico 7

y hay deformación y reorganización del citoesqueleto (Pinder et al., 2000). Para que se lleve a

cabo este movimiento por deslizamiento o “gliding”, los parásitos necesitan una compleja

maquinaria proteica denominada “glideosoma” (Sibley, 2004; Keeley y Soldati, 2004), la cual

se basa en la actividad de un motor molecular compuesto por actina-miosina (Pinder et al.,

2000; Jones et al., 2006).

Aunque el citoesqueleto de los Apicomplexa contiene los típicos elementos del citoesqueleto

de las células eucariotas, también presentan características específicas e inusuales. Así, los

microtúbulos subpeliculares de los Apicomplexa son muy estables y pueden soportar muchas

condiciones adversas (Morrissette y Sibley, 2002), los microfilamentos son cortos e

inestables, y la actina se encuentra mayormente en forma globular (Schmitz et al., 2005;

Vahokoski et al., 2014). En cuanto a las miosinas, se encuentra la miosina A, que es del tipo

no convencional, se localiza en la película y pertenece a la clase XIV, la cual se caracteriza

porque sus miembros tienen muy cortos dominios de cola (Pinder et al., 1998; Heintzelman y

Schwartzman., 1997; Foth et al., 2006). Estas características le proporcionan altísima

flexibilidad al citoesqueleto, asegurando no sólo el mantenimiento de la forma del parásito y

la integridad estructural, sino que durante el proceso de invasión y locomoción, el parásito es

capaz de ajustar su forma sin sufrir deformaciones mayores (Santos et al., 2009).

1.3 Ciclo de vida de Plasmodium

Plasmodium falciparum tiene un ciclo de vida complejo que se lleva a cabo en dos huéspedes

diferentes de modo que una parte se desarrolla en un mosquito del género Anopheles y la

otra en un hospedero vertebrado. A lo largo de todo su ciclo de vida, el parásito presenta tres

formas infectantes distintas: ooquinete, esporozoíto y merozoíto, que tienen la capacidad de

invadir diferentes tipos celulares (Figura 1-2) (Botero y Restrepo, 2012; CDC, 2017). Los

esporozoítos y los merozoítos están diseñados para invadir únicamente hepatocitos y

glóbulos rojos, respectivamente, a diferencia de los taquizoítos de Toxoplasma gondii que

tiene la capacidad de invadir la mayoría de tipos celulares (Cowper et al., 2012).

Ciclo esporogónico: ocurre en mosquitos hembra del género Anopheles, los cuales se

infectan al ingerir sangre de una persona que porte parásitos sexualmente diferenciados

(gametocitos). Estas formas entran al estómago del mosquito y allí los microgametocitos

(gametocito masculino) por el proceso de exflagelación dan origen a formas flageladas



móviles que fecundan las células femeninas (macrogametocitos). Las cromatinas de las dos

células se fusionan dando origen al zigote, el cual se transforma en una célula alargada y

móvil llamada ooquinete, la cual penetra la pared del estómago del mosquito, crece y forma

el ooquiste. En su interior ocurre la división del núcleo y del citoplasma para dar origen a los

esporozoítos. Al estallar el ooquiste, se liberan los esporozoítos, que se localizan en las

glándulas salivares del mosquito (Botero y Restrepo, 2012; CDC, 2017; Cowman et al., 2017).

Figura 1-2. Ciclo de vida de Plasmodium. Tomado de: http://www.nature.com/nature/journal/v419/n6906/images/419495a-f1.2.jpg

Ciclo esquizogónico: comienza con la penetración de esporozoítos a través de la piel,

durante la picadura del mosquito. Estas formas móviles rápidamente pasan a la circulación y

luego de 30 minutos invaden los hepatocitos. Allí se dividen formando el esquizonte tisular

primario, que después de 6 a 12 días sufre ruptura liberando miles de merozoítos tisulares,

los cuales van a la circulación para invadir los eritrocitos. Los merozoítos (1- 3µm) pasan a

una forma de anillo y luego maduran a trofozoítos, los cuales al dividir su cromatina forman

el esquizonte. A medida que el esquizonte madura se van formando los merozoítos (16-32),

los cuales son liberados por ruptura del eritrocito y salen a buscar un glóbulo rojo para

comenzar el ciclo nuevamente. Algunos parásitos se diferencian a gametocitos y cuando son

ingeridos por la hembra del mosquito dan inicio al ciclo esporogónico. Los parásitos del ciclo

sanguíneo tienen un genoma haploide, se reproducen exponencialmente y son los causantes

http://www.nature.com/nature/journal/v419/n6906/images/419495a-f1.2.jpg

Marco teórico 9

de las manifestaciones clínicas de la enfermedad (Botero y Restrepo, 2012; CDC, 2017;

Cowman et al., 2017).

1.4 Miosinas

La miosina junto con la dineina y la kinesina constituyen los tres tipos de motores

moleculares que se encuentran en el citoesqueleto de las células eucariotas (Xiao et al.,

2016). Las miosinas constituyen una gran superfamilia de proteínas conocidas como

mecanoenzimas, ya que son capaces de moverse a lo largo de filamentos de actina utilizando

la energía liberada de la hidrólisis del ATP. Estructuralmente están constituidas por una o

dos cadenas pesadas idénticas y una o más cadenas livianas por cada cadena pesada. La

cadena pesada se compone típicamente de tres dominios funcionales (Sellers, 2000): una

cabeza o dominio motor N-terminal donde se encuentra el sitio de unión al nucleótido ATP

y el sitio de unión al filamento de actina; un dominio de cuello que contiene motivos IQ por

medio de los cuales se une a las cadenas livianas o a calmodulina (CaM) y un dominio de

cola C-terminal en el cual se pueden encontrar uno o varios motivos funcionales que sirven

para anclar la miosina o para unirse a otras proteínas (Figura 1-3).

Figura 1-3.Modelo de cintas de una miosina clase II.

ELC: cadena liviana esencial. RLC: cadena liviana reguladora. Modificado de Sellers, 2000.



En el dominio motor se encuentran secuencias y estructuras ampliamente conservadas entre

especies y un subdominio denominado región convertidora (converter region), que es el sitio

de unión con el brazo palanca. La región convertidora tiene una estructura de tipo bisagra

que permite que los pequeños cambios ocurridos en el dominio motor durante la hidrólisis

del ATP, se traduzcan en grandes cambios conformacionales de esta región, lo cual conlleva a

un desplazamiento mucho mayor de la miosina sobre la actina (Houdusse et al., 1999)

El domino del cuello está constituido por el brazo palanca, que es una larga hélice que se

extiende desde la región convertidora y que sirve como sitio de unión para las cadenas

livianas esenciales o reguladoras (Sellers, 2000). Las cadenas livianas esenciales se unirán al

sitio más cercano a la región convertidora y las reguladoras al más distal. La unión de estas

cadenas produce un cambio en la conformación α-helicoidal de esta región poniéndola rígida

(Lu et al., 2014), con lo cual se estabiliza el brazo palanca y así logra regular la función del

dominio motor (Masters et al., 2016). Los motivos helicoidales IQ presentes en el cuello

varían en número y tienen una secuencia consenso IQXXXRGXXXR (Rhoads y Friedberg,

1997), que en algunas miosinas es muy degenerada. El número de estos motivos determina la

longitud del brazo palanca de cada miosina.

El dominio de cola típicamente contiene regiones α-helicoidales tipo coiled-coil para

dimerización (generación de miosinas de dos cabezas) y una gran variedad de dominios o

motivos que determinan la interacción de la miosina con otras proteínas y por tanto, su

función y su localización intracelular (Sellers, 2000; Krendel y Mooseker, 2005; Masters et al.,

2016). Dentro de éstos se encuentran: dominios SH3 y PH propios de proteínas involucradas

en señalización celular; dominios MyTH4 y FERM para la asociación a membranas; dominios

GAP con actividad enzimática; dominio Smc relacionados con división celular y segregación

de cromosomas; dominios DIL relacionados con unión a vesículas secretoras; dominios TH1

los cuales interactúan con los lípidos de membrana y ayudan a la apropiada localización

celular; dominio SMC_N asociado con motores dependientes de microtúbulos; dominio SbcC

el cual es una ATPasa involucrada en reparación del ADN, entre otros (Sellers, 2000; Krendel

y Mooseker, 2005; Sattarzadeh et al., 2011; Mazerik et al., 2014) (Figura 1-4). A pesar de la

diversidad de subdominios presentes en el dominio de cola, se ha evidenciado que las

miosinas que están involucradas en procesos similares comparten los mismos subdominios.

Adicionalmente, los dominios de cabeza y cola no actúan independientemente, es decir, las

Marco teórico 11

propiedades mecánicas de un dominio motor dado, deben corresponder exactamente con los

requerimientos mecánicos de una función específica, la cual es dictada por el domino de cola

(Korn, 2000).

Figura 1-4. Organización por dominios de algunas miosinas

Se muestra la organización de la miosina II y 4 miosinas no convencionales. En el dominio de la cola se

pueden observan diferentes subdominios. Tomado de Lu et al., 2014.

Con base en su función, las miosinas se dividen en dos grupos, las convencionales o clase II,

las cuales se encargan de la contracción muscular y las no convencionales (Figura 1-5), las

cuales están implicadas en un sinnúmero de funciones fundamentales que se agrupan en dos

grandes actividades: transporte intracelular (Ross et al., 2008; Lu et al., 2014) y soporte

mecánico (es decir cuando se anclan a filamentos de actina) (Lu et al., 2014). Dentro de las

funciones que se han descrito para la miosinas están el transporte de cargas a través de

microfilamentos (ya sean organelos como vesículas endocíticas o mitocondrias o

macromoléculas como partículas de ARNm), endocitosis, exocitosis, mantenimiento de la

arquitectura celular, control de la dinámica de las extensiones celulares ricas en actina (como

en el caso del movimiento por arrastre de las amebas), transducción de señales, regulación

del ensamblaje de actina, cooperación entre el transporte dependiente de microtúbulos y

actina, regulación de las interacciones miosina-organelo, fagocitosis y generación de la fuerza

necesaria para que organismos como los Apicomplexa puedan desplazarse e invadir células

(Krendel y Mooseker, 2005; Wu et al., 2000; Titus, 1997; Buss et al., 2004; Hartman et al.,

2011; Foth et al., 2006).

En el año 2006, Foth y colaboradores clasificaron las miosinas con base en análisis

filogenéticos realizados con las secuencias del dominio motor y polimorfismos de



aminoácidos específicos. Los autores incluyeron miosinas que no habían sido clasificadas

previamente y enfatizaron sobre las secuencias de los Apicomplexa y otros protistos. Las

miosinas se agruparon en 24 clases distintas nombradas de la I a la XXIV y dentro de éstas,

las miosinas de los Apicomplexa se ubicaron en las clases XIV, VI, XXII, XXIII y XXIV (Foth et

Figura 1-5. Dominios de cola de las miosina II y V confieren especificidad de función.

Las cadenas pesadas tipo II poseen colas en espiral que median la dimerización y el ensamblaje en

estructuras filamentosas que funcionan en procesos como la contracción muscular. Las cadenas

pesadas de miosina V no convencional también se dimerizan, pero no se ensamblan en filamentos y

están implicadas en el transporte intracelular de una variedad de cargas. Las proteínas X y Y

representan proteínas de unión a la cola de miosina V que pueden mediar en las interacciones con la

carga. Tomado de Hutagalung et al., 2002.

al., 2006). Actualmente, con la clasificación propuesta por Sebé-Pedrós y colaboradores las

miosinas se agrupan en 31 clases de la I a la XXXIV y a diferencia de la clasificación previa, las

miosinas de los Apicomplexa se distribuyeron en tres clases: XIV, XXIII y XXVII (Sebé-Pedrós

et al., 2014).

1.4.1 Mecanismo molecular del motor actina-miosina

El movimiento de la miosina a lo largo del filamento de actina se produce gracias a la energía

liberada tras la hidrólisis del ATP. La actividad ATPasa de la miosina es activada por actina

asegurando que la miosina actúe a su máxima capacidad. El movimiento neto ocurre cada vez

Marco teórico 13

que se presenta el ciclo denominado puente cruzado, es decir cada vez que la miosina se une

y se libera del filamento de actina en respuesta al estado de unión del ATP (Figura 1-6).

Figura 1-6. Modelo de movimiento de la miosina.

Hipótesis del brazo palanca oscilante. Inicialmente, el motor está en estado rígido, unido a la actina

pero no al nucleótido. 1) La unión del ATP hace que el dominio motor se separe de la actina. 2) La

hidrólisis del ATP inclina el dominio motor que se vuelve a unir a la actina. 3) Se produce la liberación

de fosfato, lo que desencadena la ejecución de la carrera de trabajo. (4) Se libera ADP, completando el

ciclo. Tomado de Masters et al., 2016.

Durante este ciclo, el dominio motor de la miosina que se encuentra rígido y unido a la actina

se libera de ésta una vez entra una molécula de ATP al sitio ATPasa. La miosina rápidamente

hidroliza el ATP a ADP y un grupo fosfato (Pi), el cual permanece unido a la cabeza. En este

estado el dominio motor se une a la actina y a la par se libera el Pi, lo cual genera pequeños

cambios conformacionales en el dominio motor, que se amplifican y transmiten al brazo

palanca. Esta reorganización estructural del dominio motor se traduce en un movimiento

conocido como “power stroke”, el cual desplaza a la miosina a una nueva posición sobre el

filamento de actina, en dirección al extremo positivo. El dominio motor permanecerá unido a

la actina hasta que se libere el ADP y se una otra molécula de ATP, volviendo nuevamente a

un estado de rigor. Este modelo de movimiento de la miosina es denominado hipótesis del

brazo palanca oscilante, el cual se basó originalmente en estudios hechos con miosina

muscular clase II (Holmes, 1997).

1.4.2 Miosinas de Plasmodium falciparum

Hasta el momento se conocen seis genes que codifican para miosinas en P. falciparum, las

cuales se han denominado de la A a la F (PfMyoA-PfMyoF). Las miosinas PfMyoA, B y E tanto

en la clasificación del 2006, como en la del 2014, se agruparon en la clase XIV, mientras que

PfMyoC (clase XXII) y PfMyoD y F (clase VI) se reclasificaron en las clases XXVII y XXIII,

respectivamente (Foth et al., 2006; Sebé-Pedrós et al., 2014).



1.4.2.1 Miosina A

El gen pfmyo-a consta de 2841 pb, contiene dos intrones y como producto de su

transcripción se produce un ARN mensajero de 2457 pb. El gen se transcribe en los 3

estadios del ciclo intraeritrocítico aunque el nivel del transcrito es mucho mayor en

esquizontes (Chaparro-Olaya et al., 2005). La proteína PfMyoA contiene 818 residuos, tiene

un peso molecular de 92.276 Da y no tiene dominios transmembrana o secuencias para

péptido señal (PlasmoDB). Posee un dominio motor canónico, pero adolece de un verdadero

dominio de cola (Foth et al., 2006); en el C-terminal, los últimos 50 residuos son en su

mayoría básicos y contienen dos motivos IQ degenerados (IQ1 e IQ2), lo cual identifica esta

región como un dominio de cuello y no de cola. PfMyoA sólo se expresa en esquizontes

maduros y merozoítos libres (y ooquinetes en el ciclo sexual) y se localiza en la periferia de

estos últimos o de merozoítos segmentados. Después que el merozoíto invade al eritrocito y

da paso a la forma de anillo, PfMyoA desaparece y vuelve a detectarse durante la

esquizogonia (Pinder et al., 1998; Pinder et al., 2000; Margos et al., 2004; Green et al., 2017).

Teniendo en cuenta la localización y el patrón de expresión de la proteína, se sugirió que

PfMyoA era la miosina del “glideosoma” y que participaba en el proceso de invasión. En su

momento, esta hipótesis fue reforzada por la similitud estructural con la miosina A de T.

gondii (TgMyoA), para la cual dicha función ya había sido comprobada.

En 2003, Bergman y colaboradores mediante ensayos de doble híbrido, utilizando como

anzuelo los 75 aa del C-terminal de la miosina A de P. yoelii (PyMyoA) lograron identificar

una proteína de 24 kDa que interactuaba con esta miosina y la denominaron “Proteína que

interactúa con la cola de la miosina”, en inglés MTIP (“Myosin A Tail domain-Interacting

Protein”). Adicionalmente, determinaron los aa críticos involucrados en esta interacción y

encontraron que correspondían a los 15 aa finales de la miosina A (residuo 903 al 917) y a

los residuos 79 a 204 de MTIP. La expresión de esta proteína solo se observó en esquizontes

y esporozoítos y se localizó en la periferia de los merozoítos, específicamente en el IMC,

donde colocalizó con miosina A (Bergman et al., 2003). Posteriormente, Green y

colaboradores demostraron que MTIP se expresa en merozoítos de P. falciparum, se localiza

en la periferia del zoíto e interactúa con PfMyoA (Green et al., 2006). Así, el dominio C-

terminal de PfMyoA media la unión con la proteína MTIP y ésta a su vez interactúa con otras

proteínas haciendo posible el anclaje del complejo PfMyoA/MTIP a componentes del

citoesqueleto (Bosch et al., 2006).

Marco teórico 15

1.4.2.2 Miosina B

El gen pfmyob consta de 3493 pb, contiene siete intrones y cuando se transcribe produce un

ARN mensajero de 2406 pb. El gen se transcribe en los 3 estadíos del ciclo intraeritrocítico

aumentando gradualmente hasta alcanzar el pico de transcripción en el estadio de

esquizonte (Chaparro-Olaya et al., 2003; Chaparro-Olaya et al., 2005). PfMyoB al igual que

PfMyoA es una miosina pequeña comparada con las otras miosinas de Plasmodium y se cree

que el tamaño puede estar relacionado con el compartimiento donde se localizan, es decir la

película. PfMyoB se compone de 801 residuos, tiene un peso molecular de 93176 Da, no

posee dominios transmembrana o secuencias de péptido señal (PlasmoDB) y comparte alta

identidad de secuencia con PfMyoA. En cuanto a su expresión, se detecta únicamente en

esquizontes tardíos (>de 40 horas) y merozoítos. PfMyoB no posee un verdadero dominio de

cola (Foth et al., 2006) y al igual que PfMyoA, los 50 aa del extremo C-terminal son básicos.

Esta particularidad se asemeja a otras miosinas no convencionales, como las miosinas clase I

que debido a su carga de aa básicos tienen la habilidad para unir fosfolípidos ácidos y así

mediar interacciones miosina-membrana (Mooseker y Cheney, 1996; Sellers et al., 1996).

Recientemente, Yusuf y colaboradores lograron establecer con precisión la localización

celular de MyoB, a partir de líneas transgénicas de P. falciparum, P knowlesi y P. berghei, en

las cuales la miosina B se expresó concomitantemente con la proteína verde fluorescente

(GFP por sus siglas en inglés) o con una etiqueta (tag) de HA. En esquizontes de P. knowlesi y

P. falciparum de 38 horas post-invasión, es decir esquizontes con 8 a 10 núcleos, no se

detectó señal fluorescente; sin embargo, cuando los parásitos tuvieron más de 10 núcleos (40

horas post-invasión) PfMyoB-GFP se detectó como un punto en el extremo apical de cada

merozoíto dentro del esquizonte y en merozoítos libres. El mismo patrón se encontró en

ooquinetes, esporozoítos y merozoítos dentro de esquizontes de P. berghei (Yusuf et al.,

2015).

En 2017, Hernández y colaboradores modelaron (in sílico) y compararon las estructuras 3D

de PfMyoA y PfMyoB, encontrando que las dos presentan alta similitud estructural.

Adicionalmente, simularon mediante docking molecular la posible unión entre PfMyoB y

MTIP y de acuerdo con los modelos de interacción 3D obtenidos y los valores de energía

encontrados, los autores sugirieron que es posible la interacción entre estas dos proteínas

(Hernández et al., 2017). Por otro lado y con el propósito de verificar experimentalmente los

resultados previos, se realizaron ensayos de interacción proteína-proteína in vitro con



PfMyoB y PfMTIP recombinantes y ensayos de inhibición con péptidos sintéticos, resultados

que mostraron unión específica entre estas dos proteínas (Hernández et al., 2018). En

conjunto estos resultados apoyan la hipótesis que estas dos miosinas pueden cumplir

funciones similares

1.4.2.3 Miosina C, D, E y F

Estas cuatro miosinas son de mayor tamaño que PfMyoA y PfMyoB y presentan dominios de

cola largos. Poco se conoce acerca de éstas, solo algunos datos en cuanto a las características

de la proteína y la abundancia del transcrito durante el ciclo eritrocítico. Así, para PfMyoC, el

gen se transcribe principalmente en trofozoítos (Chaparro et al., 2005), la proteína está

constituida por 2159 aa, su peso molecular es de 250 kDa y no tiene dominios

transmembrana. PfMyoC posee los tres dominios típicos de las miosinas, con 3-6 motivos IQ

en el dominio de cuello y 4-6 motivos WD40 en el dominio de cola (Foth et al., 2006).

Respecto a PfMyoD, el gen se transcribe principalmente en el estadio de trofozoítos y en

menor proporción en esquizontes, la proteína está constituida por 2287 aa, no tiene

dominios transmembrana y su peso molecular es de 272 kDa. PfMyoD se localiza en el

citoplasma de trofozoítos y esquizontes maduros; sin embargo, en algunos casos se evidenció

que la fluorescencia de los esquizontes maduros fue más débil comparada con la de las

formas más jóvenes, lo cual sugiere que puede ser importante en pasos intermedios de la

maduración de esquizontes (Chaparro-Olaya et al., 2005). PfMyoD tiene 1 motivo IQ

degenerado (Foth et al., 2006). En PfMyoE, el pico de expresión del ARN mensajero se detectó

en esquizontes (Chaparro-Olaya et al., 2005), la proteína está constituida por 2153 aa, su

peso molecular es de 255 kDa y no tiene dominios transmembrana. PfMyoE es expresada en

los estados invasivos del parásito y se detectó como un punto en el extremo basal de

ooquinetes y esporozoitos y como un punto en merozoitos; sin embargo, en estos últimos no

se ha podido identificar claramente su ubicación (Wall et al., 2019). PfMyoE es una miosina

de la clase XIV, no se le han asignado motivos IQ y su dominio de cola está constituido por

estructura coiled-coil (Foth et al., 2006). En PfMyoF, el gen se transcribe durante los 3

estadios del ciclo asexual (Chaparro et al., 2005), la proteína está constituida por 2160 aa, su

peso molecular es de 250 kDa y no tiene dominios transmembrana. PfMyoF, tiene 1 motivo

IQ y su dominio de cola está constituido por estructura coiled-coil y motivos WD40 (Foth et

al., 2006).

Marco teórico 17

1.5 Invasión del eritrocito por merozoítos de Plasmodium

Siendo Plasmodium un organismo intracelular obligado, la invasión es un proceso crítico para

su supervivencia y proliferación. Este proceso es complejo, dinámico, rápido, se lleva a cabo

en varios pasos secuenciales y es conducido activamente por el parásito (Weiss et al., 2016;

Cowman et al., 2017). El estudio molecular del proceso de invasión ha permitido generar

alternativas terapéuticas significativas en la lucha contra la malaria, ya que desde este campo

de investigación ha sido posible postular un número importante de proteínas del esporozoíto

y del merozoíto como posibles candidatos a vacuna (Regules et al., 2016; Kublin et al., 2017;

Beeson et al., 2016).

Los merozoítos son formas activamente móviles cuando entran en contacto con el glóbulo

rojo durante la invasión (Baum et al., 2006ª), se ha reportado que en cultivos pretratados con

compuestos que alteran la dinámica de la actina (Field et al., 1993) o la actividad ATPasa de

la miosina (Pinder et al., 1998), se inhibe la invasión de los eritrocitos, lo cual sugiere que los

merozoitos utilizan un motor basado en actina y miosina durante el proceso de invasión.

Evidencia experimental ha demostrado que los merozoítos poseen todos los componentes

proteicos (“glideosoma”) asociados con la invasión del glóbulo rojo (Baum et al., 2006; Jones

et al., 2006).

El proceso de invasión del eritrocito por el merozoíto se basa en una secuencia altamente

organizada de interacciones ligando-receptor y se divide en tres etapas: 1) interacción inicial

y deformación de la membrana del eritrocito (Preinvasión), 2) interacción apical e invasión

(Invasión) y 3) equinocitosis y recuperación de la célula hospedera invadida (Weiss et al.,

2016; Cowman et al., 2017) (Figura 1-7). La primera etapa comienza cuando un merozoíto

entra en contacto con la superficie del eritrocito. Luego, a través de la proteína 1 de

superficie del merozoíto (MSP1) (Lin et al., 2014), el parásito establece una interacción con la

membrana del glóbulo rojo, produciéndole una ligera deformación.

La segunda etapa inicia con la unión de ligandos de la vía denominada alterna, los cuales

establecen una unión más fuerte (que la anterior) con los receptores del glóbulo rojo, se

produce una deformación importante del eritrocito y la reorientación del merozoíto,

fenómenos que cursan con aumento en la fosforilación del citoesqueleto del eritrocito y la

participación activa de la actina del parásito (Weiss et al., 2016; Koch y Baum, 2016; Cowman

et al., 2017). Dentro de los ligandos de la vía alterna se encuentran dos familias



principalmente, los antígenos de unión al eritrocito (EBA) y homólogos de la proteína de

unión al reticulocito (Rh), proteínas secretadas desde los micronemas y las roptrias,

respectivamente. La liberación de EBA parece darse en respuesta a la baja concentración de

potasio que encuentra el merozoíto en el plasma humano una vez sale del eritrocito. Esta

señal activa la fosfolipasa C (PLC) citoplasmática del merozoito promoviendo la liberación de

calcio desde el retículo endoplásmico y este aumento del calcio citosólico activa una proteína

quinasa (CDPK1), que a su vez produce la liberación de los contenidos de los micronemas. La

proteína EBA-175 es translocada a la superficie del merozoíto y desde allí se une a la

glicoforina A del eritrocito. Una vez se restaura el nivel basal del Ca++ citosólico se liberan las

proteínas de las roptrias (Sharma y Chitnis, 2013). La función de las adhesinas PfRh1,

PfRh2a, PfRh2b y PfRh4 no está completamente definida, pero se cree que se relaciona con el

establecimiento de la especificidad de la célula hospedera que será invadida, mientras que

EBA-175, EBA-140 y EBA-181 son proteínas que presentan dominios ricos en cisteína, los

cuales le permiten unirse a glicoproteínas específicas (glicoforina A, C y banda 4) presentes

en la superficie del eritrocito (Cowman y Crabb, 2006). Estas proteínas son importantes en la

invasión, pero no son esenciales, cada una media rutas específicas de invasión a través de

receptores independientes, hecho que le proporciona al parásito un amplio rango de

ligandos. Lo anterior le ha permitido al merozoíto de P. falciparum desarrollar vías

redundantes para asegurar la entrada a la célula hospedera a través de múltiples

interacciones ligando receptor. Estos ligandos son proteínas altamente variables y esta

variabilidad se da como respuesta a la presión inmune ejercida por el hospedero (Cowman y

Crabb, 2006; Baum et al., 2005). Durante esta segunda etapa, el parásito logra colocar su

extremo apical en contacto directo con la membrana del eritrocito (Aikawa et al., 1978), se

produce un aumento del flujo de calcio en la interfase eritrocito-parásito y el ligando PfRh5

se une al receptor basigina, señales que disparan una nueva liberación del contenido de los

organelos apicales (micronemas y roptrias).

En general, las proteínas micronemales están involucradas en el reconocimiento y unión al

eritrocito, mientras que los contenidos de las roptrias participan en la formación de la

vacuola parasitófora (VP). La proteína micronemal AMA1 (proteína transmembrana) es

traslocada a la superficie del merozoíto antes que comience la invasión, mientras que el

complejo de proteínas RON procedente del cuello de las roptrias se inserta en la membrana

del eritrocito.

Marco teórico 19

Figura 1-7. Invasión del eritrocito por el merozoíto.

La invasión es un proceso de múltiples pasos, rápido, altamente regulado e involucra muchos ligandos.

En la parte superior se observa la duración de cada etapa en segundos y en la parte inferior cada uno

de los pasos que se llevan a cabo en las respectivas etapas. Tomado de Weiss et al., 2016 con algunas

modificaciones.

La proteína AMA1 utiliza a RON2 como su receptor y la unión de estas dos proteínas da

origen a la “unión móvil” o “unión fuerte” (Cao et al., 2009). En principio esta estructura se

observa como una cubierta o engrosamiento sobre la zona apical del merozoíto y luego como

un anillo alrededor del zoíto (Aikawa et al., 1978). Una vez se forma esta estructura,

permanece estable y fija en un punto de la célula hospedera proporcionando un sólido

anclaje que hala el parásito hacia adentro de la célula durante el proceso de invasión

(González et al., 2009). La unión móvil mantiene al merozoíto y al eritrocito en contacto

estrecho durante la invasión y a través de ésta el merozoíto entra al eritrocito en una VP

utilizando la fuerza proporcionada por el motor de actina –miosina (Koch y Baum, 2016). La

miosina A del merozoíto está anclada al ICM a través de MTIP. Esta interacción es esencial

para la generación de fuerza en una dirección específica, lo cual ocurre cuando PfMyoA une y

libera filamentos de actina que a su vez están asociados con proteínas transmembrana

(Thomas et al., 2010). A medida que el parásito se desplaza a través de la unión móvil la

membrana plasmática del eritrocito se invagina para formar la VP alrededor del parásito y el



parásito pierde la capa superficial que lo recubre por la acción de serin-proteasas; la invasión

se completa una vez la VP está totalmente formada y la unión móvil se localiza en el extremo

posterior del merozoíto (González et al., 2009; Aikawa et al., 1978). El proceso de invasión

dura alrededor de 60 segundos.

Durante la tercera etapa, el eritrocito recién infectado adquiere una apariencia de estrella,

fenómeno conocido como equinocitosis. Esta forma permanece durante 5 a 10 minutos para

luego regresar a su típica forma bicóncava (Cowman et al., 2017).

1.6 El “glideosoma”

El estudio de la movilidad “gliding” y del “glideosoma” comenzó en el modelo Toxoplasma, a

partir del cual se caracterizaron funcionalmente varias proteínas del “glideosoma”, dando

inicio a una explosión de investigaciones orientadas a explicar los mecanismos implicados en

la movilidad y la invasión. Aunque mucho de este conocimiento se ha extrapolado al modelo

Plasmodium, diferentes acercamientos bioinformáticos y experimentales han permitido

identificar ortólogos de la mayoría de estas proteínas en P. falciparum (Pinder et al., 1998;

Baum et al., 2006ª; Jones et al., 2006; Weiss et al., 2015; Cowman et al., 2017), encontrándose

que aunque comparten aspectos comunes, cada organismo tiene sus particularidades.

El “glideosoma” es un complejo molecular proteico localizado entre el IMC y la MP de los

zoítos, el cual se basa en un motor molecular actina-miosina, a partir del cual se genera la

fuerza necesaria para que el parásito pueda invadir, migrar a través de las células, o salir de

ellas (Figura 1-8). Esta maquinaria está compuesta por proteínas que constituyen el motor

molecular, proteínas que anclan el motor al complejo interno de membranas del parásito,

proteínas que median la interacción del motor con proteínas transmembranales tipo

adhesinas (las cuales se comunican con receptores sobre la célula a invadir), y proteínas que

conducen al rompimiento de las interacciones entre las adhesinas del parásito y los

receptores de la célula, a medida que el parásito avanza (Opitz y Soldati, 2002; Keeley y

Soldati, 2004). En general, las proteínas que hacen parte del “glideosoma” son

extremadamente conservadas en el phylum Apicomplexa, mostrando una identidad de

aminoácidos entre el 30 y el 60% (Soldati et al., 2004).

Marco teórico 21

Figura 1-8. Modelo para la movilidad “gliding” de Apicomplexas

Una vez se da la unión inicial del zoíto con los receptores presentes en la célula hospedera, las

adhesinas tipo TRAP son liberadas de los micronemas a la membrana plasmática del zoíto. Los

filamentos cortos de actina (actina F) son nucleados desde un pool de actina G localizado en el

citoplasma del parásito. El C-terminal de la proteína TRAP interactúa con la actina F a través de la

enzima aldolasa. La miosina que está anclada al IMC a través de MTIP, GAP 45 y GAP50 se mueve a lo

largo del filamento de actina hacia el extremo positivo (+), moviendo las proteínas tipo TRAP hacia la

parte posterior del parásito con lo cual impulsa al parásito hacia adelante. Las proteínas tipo TRAP son

clivadas mediante proteasas romboides. Tomado y modificado de Kumpula y Kursula, 2015 y Baum et

al., 2006b

1.6.1 Actina y miosina del “glideosoma” de Plasmodium

La actina y la miosina son las dos proteínas que constituyen el motor molecular del

“glideosoma”. La participación de la actina en el proceso se evidenció experimentalmente

cuando el movimiento y la invasión de los zoítos fueron bloqueados usando citocalasina-D

(Miller et al., 1979; Field et al., 1993), compuesto que desestabiliza microfilamentos e inhibe

la polimerización de la actina. Los parásitos tratados con citocalasina-D son incapaces de

invadir células aún cuando permanecen unidos a la superficie de ésta y secretan los

componentes necesarios para la invasión. Así mismo, la participación de la miosina en el

“gliding” se evidenció experimentalmente al observar una disminución importante del

porcentaje de invasión al usar 2,3 butanedione monoxime (BDM), un inhibidor específico de

la actividad ATPAsa de la miosina (Pinder et al., 1998). PfMyoA fue la primera miosina

asociada con la movilidad “gliding” y el proceso de invasión en Plasmodium (Pinder et al.,

1998; Pinder et al., 2000).



Se han propuesto varios modelos sobre la topología de la maquinaria de movilidad “gliding”

en Apicomplexa, los cuales han ido variando a medida que se caracterizan nuevos

componentes del “glideosoma” (Kappe et al., 2004). El primer modelo propuso que la miosina

se localizaba cerca de la membrana plasmática, mientras que la actina se ubicaba cerca del

IMC (King, 1988). Hoy en día se sabe que la ubicación de la miosina y la actina es la opuesta:

la actina se localiza cerca de la membrana plasmática, mientras que la miosina se ubica hacia

el IMC.

1.6.1.1 Actina en Plasmodium falciparum

La actina es una de las proteínas citoplasmáticas más abundantes, siendo el componente

predominante del citoesqueleto. En general la actina existe en dos formas, globular o

monómerica (actina G) y filamentosa (actina F). La polimerización de la actina G es

dependiente de ATP, se hace en dirección cabeza a cola y forma microfilamentos estables

(actina F) con longitudes que varían de cientos de nanómetros a micras (Baum, 2006b). La

formación o disociación de estos microfilamentos se da por la polimerización o

despolimerización de la actina G, procesos que se dan en respuesta a señales para producir

movimiento, cambiar la forma, transportar organelos, promover la división celular o invadir

células (Vahokoski et al., 2014). La propiedad fundamental de la actina que le permite

cumplir con un sinnúmero de funciones radica en su habilidad para formar estructuras

dinámicas con polaridad definida (Kumpula y Kursula, 2015).

Las primeras observaciones en merozoítos de P. falciparum revelaron que éstos contenían

microtúbulos pero parecían no tener filamentos de actina, a pesar que ya se había

demostrado que la invasión podía ser inhibida si los zoítos eran pretratados con citocalasina,

lo cual apoyaba la existencia de un sistema motor basado en actina (Miller et al., 1979).

Posteriormente, Wesseling y colaboradores identificaron dos secuencias de actina en el

genoma de P. falciparum y detectaron el ARNm de una de ellas en los estadíos

intraeritrocíticos del parásito (Wesseling et al., 1989). Más tarde se demostró la presencia de

actina en los merozoitos de P. falciparum y P. knowlesi (Field et al., 1993) y se estableció que

en T. gondii y P. falciparum la mayoría de la proteína (>97 %) se encontraba en forma

monomérica (Dobrowolski et al., 1997; Pinder et al., 1998). Por otro lado, al no poder

demostrar la existencia de microfilamentos mediante microscopía electrónica se propuso

que eran inestables o demasiado cortos para ser observados con esta técnica (Shaw y Tilney,

Marco teórico 23

1999; Pinder et al., 2000). Fue sólo hasta la introducción de un inductor de polimerización de

actina denominado Jasplakinolida (JAS), que fue posible aportar evidencia experimental de la

presencia de microfilamentos y por tanto sustentar la existencia de un motor basado en

actina. Así, los merozoitos de P. falciparum fueron estudiados por microscopía electrónica

después del tratamiento con JAS, y se determinó que los filamentos de actina de P. falciparum

tienen una longitud promedio de 100 nm (Schmitz et al., 2005).

Hoy en día se conoce que la actina de los Apicomplexa es codificada por un gen de copia

única, excepto en P. falciparum, el cual posee dos genes expresados diferencialmente, uno en

gametocitos y en los estadios que se desarrollan en el mosquito (Pfact II) y otro, que se

expresa a lo largo del ciclo de vida del parásito (Pfact I) (Wesseling et al., 1989). La actina 1,

es la isoforma más abundante, es expresada constitutivamente, se considera esencial para el

parásito y entre otras funciones está implicada en tráfico de vesículas y endocitosis

(Kumpula y Kursula, 2015). Las secuencias de PfActina 1 y PfActina 2 son muy divergentes

entre sí (Wesseling et al., 1988) y con la secuencia canónica de la actina de eucariotes

(identidad <80 %), que es una familia de proteínas altamente conservada. Esta gran

divergencia a nivel de secuencia se traduce en estructuras diferentes con dinámicas de

polimerización distintas. Esto podría explicar las diversidad funcional entre las dos actinas

de Plasmodium; así, mientras que la Actina 2 produce filamentos largos que serán usados en

funciones particulares en el mosquito como la exflagelación y formación de ookinete, la

Actina 1, está implicada en el proceso del “gliding” y se arregla en filamentos cortos, de vida

corta, que son usados por PfMyoA como caminos para moverse sobre ellos (Vahokoski et al.,

2014). Así, mientras la miosina constituye el componente que genera la fuerza, la Actina 1

constituye la pieza central estructural. En general, los componentes de este motor junto con

las proteínas reguladoras de la actina tienen características únicas comparadas con los otros

eucariotes; así, mientras en eucariotes superiores la dinámica de la actina es regulada por

alrededor de 100 proteínas, en Apicomplexa bastan 10, las cuales se dividen en el grupo de

las que se unen a actina G y en el grupo de las que se unen a actina F (Kumpula y Kursula,

2015).

1.6.1.2 PfMyoA y sus cadenas livianas

Sobre el dominio de cuello de PfMyoA se encuentran 2 motivos IQ degenerados: IQ1 ubicado

entre los aa 786 y 803 e IQ2 ubicado entre los aa 804 y 818 de PfMyoA (Green et al., 2017), a



los cuales se unen las 2 cadenas livianas: MTIP (Bergman et al., 2003; Green et al., 2006) y

ELC por sus siglas en inglés “Essential Light Chain of myosin” (Green et al., 2017; Bookwalter

et al., 2017)(Figura 1-9).

Figura 1-9. Organización por dominios de PfMyoA y motivos IQ

El óvalo azul representa el dominio de motor y el rectángulo gris el dominio de cuello. Dentro de este

último se muestran las secuencias de los dos motivos IQ identificados en PfMyoA.

MTIP es una proteína pequeña constituida por 204 aa con un peso molecular de 23491 Da, no

contiene dominios transmembrana, ni péptido señal, hace parte de la familia de proteínas EF

hand y no presenta homología de secuencia significativa con las cadenas livianas de otras

miosinas o con la calmodulina (Bergman et al., 2003; Bosch et al., 2006). Su función es anclar

el motor molecular al IMC a través de la interacción con otras proteínas del glideosoma. MTIP

se une mediante su extremo carboxilo al motivo IQ2 presente en PfMyoA y una vez se unen

estas dos proteínas, MTIP adopta una conformación compacta rodeando el C-terminal de la

miosina con sus dos dominios. La lisina ubicada en la posición 813 de MyoA es un residuo

clave de esta unión (Bosch et al., 2007). Lo anterior está acorde con los resultados de

Bergman y colaboradores, quienes usando un sistema de dos híbridos en levadura

demostraron que el motivo de 15 aminoácidos de la región C-terminal de MyoA (hoy

conocida como motivo IQ2) es necesario y suficiente para la interacción con MTIP (Bergman

et al., 2003).

Marco teórico 25

La proteína ELC es la primera cadena liviana esencial que se ha encontrado para PfMyoA, esta

proteína es altamente divergente de las cadenas livianas esenciales que se han descrito en T.

gondii y su unión a la cadena pesada PfMyoA mejora la velocidad del motor. Para que ELC se

una a PfMyoA, MTIP debe estar previamente unida. La unión de las dos cadenas livianas se

traduce en un aumento de la velocidad (hasta dos veces) a la cual PfMyoA se mueve sobre la

actina (3,8 μm/s), en comparación a cuando sólo se une MTIP. Al parecer, este incremento

obedece a que el dominio de unión a la ELC se comporta como el brazo de una palanca, que

permite amplificar el movimiento dependiente de la hidrólisis del ATP que ocurre en el

dominio motor (Green et al., 2017; Bookwalter et al., 2017). Por otro lado, aunque se ha

propuesto que MTIP ancla a PfMyoA al interactuar con otras proteínas sobre la MP o el IMC,

vale la pena mencionar que MTIP sufre una modificación post-traduccional tipo

palmitoilación (Jones et al., 2012), la cual podría regular la localización de la proteína a través

de uniones a membrana (Linder y Deschenes, 2007) con lo cual MTIP podría unirse

directamente al IMC (Jones et al., 2012) y anclar PfMyoA a este complejo de membranas; sin

embargo, falta evidencia experimental para sustentar esta hipótesis

1.6.2 Proteínas asociadas a “glideosoma”: GAP45 y GAP50

1.6.2.1 GAP45

La proteína Asociada al “glideosoma” 45 (GAP45 por sus siglas en inglés) tiene 204 residuos y

un peso molecular teórico de 23631 Da, no posee péptido señal, ni dominios transmembrana,

es altamente conservada entre Apicomplexas y no tiene homología de secuencia con

proteínas conocidas. La proteína GAP45 posee un dominio N-terminal, en el cual se predice la

formación de una estructura coil-coiled y un dominio C-terminal, para el cual se predice una

estructura globular (Gilk et al., 2009). Esta conformación estructural le permite unirse tanto

a la MP como al IMC, manteniendo la cohesión de estas dos membranas y preservando la

integridad de la película durante la invasión (Frénal et al., 2010). GAP45 posee en su dominio

N-terminal sitios de miristoilación y palmitoilación (Rees-Channer et al., 2006), con los

cuales se ancla a la MP, mientras que en su C-terminal recluta el complejo MyoA-MTIP al IMC

(Frénal et al., 2010). Así, MTIP ancla el motor actina-miosina al IMC a través de la interacción

con la proteína GAP45 (Frénal et al., 2010).



1.6.2.2 GAP50

La Proteína Asociada al “glideosoma” 50 (GAP50 por sus siglas en inglés) posee 396 residuos

y un peso molecular de 44603 Da, es una glicoproteína integral de membrana propia del IMC

que ancla e inmoviliza el proto-”glideosoma” (MyoA/MTIP/GAP45) a la membrana externa

del IMC en una manera dependiente de colesterol (Johnson et al., 2007). GAP50 posee tres

sitios de glicosilación (N-linked) en el extremo amino terminal (lumen del IMC), un dominio

transmembrana y un dominio citoplasmático de 6 residuos en el extremo carboxi terminal.

Esta proteína es insertada cotraduccionalmente en el retículo endoplásmico y trasportada al

IMC presumiblemente por tráfico vesicular (Gilk et al., 2009), donde en parásitos maduros se

asocia con el proto-”glideosoma” para formar el “glideosoma” funcional asociado a la

membrana (Gaskins et al., 2004).

Junto a estas proteínas también se han descrito otras como la familia de proteínas GAPM

(Bullen et al., 2009) y GAP40 (Green et al., 2017) de las cuales no se conoce exactamente su

función pero se encuentran en el “glideosoma”. Las proteínas de la familia GAPM poseen 6

pasos transmembrana, son muy conservadas y específicas en los Apicomplexa y se localizan

en el IMC donde forman complejos oligoméricos resistentes a la solubilización con

detergentes como el SDS. Se cree que están implicadas en anclaje del IMC al citoesqueleto

(Bullen et al., 2009).

En el año 2006, Baum y colaboradores y Jones y colaboradores demostraron que todos los

componentes del “glideosoma” presentes en esporozoítos de Plasmodium spp y taquizoítos de

T. gondii, también se expresan en merozoítos de P. falciparum y que su función estaba

asociada con la invasión de eritrocitos (Baum et al., 2006; Jones et al., 2006). Además,

PfMyoA colocaliza con MTIP, ELC, GAP45 y GAP50, lo cual es consistente con su coexistencia

dentro del “glideosoma” (Jones et al., 2006; Green et al., 2017).

1.6.3 Proteínas transmembranales tipo adhesinas que comunican el motor con receptores sobre la célula a invadir

Estas proteínas son miembros de la familia TRAP (Thrombospondin-Related Anonymous

Proteins). Se han encontrado en esporozoítos (TRAP), merozoítos (MTRAP) y ooquinetes

(CTRP) de P. falciparum y en taquizoítos (MIC2) de T. gondii. Todos los miembros de esta

familia presentan números variables de repeticiones en tandem de dos dominios adhesivos

Marco teórico 27

extracelulares: un dominio A o dominio I de integrinas y una repetición trombospondina tipo

I (Menard, 2001). Las proteínas TRAP exhiben un dominio citoplasmático ácido conteniendo

un triptófano subterminal y se ha visto que mutaciones o deleciones introducidas en este

dominio, incluyendo el reemplazo del residuo de triptófano por alanina, resulta en un

esporozoíto no invasivo con movilidad alterada o ausencia de movilidad (Kappe et al., 1999).

Experimentos han mostrado que el intercambio del dominio citoplasmático de TRAP por el

de MIC2 produce esporozoítos móviles o invasivos, aun cuando estos dominios muestran

poca similitud de secuencia.

1.6.4 Proteínas que median la interacción del motor con las adhesinas

Se ha visto que no hay interacción directa entre la actina F y la cola citoplasmática de las

proteínas de la familia TRAP. Evidencia reciente reveló que estas dos proteínas interactúan a

través de una enzima glicolítica tetramérica, la fructosa 1,6- fosfato aldolasa (Jewett y Sibley,

2003). Ensayos de “pull down” (o coprecipitación por afinidad) en taquizoítos de T. gondii

mostraron que la unión de MIC2 a la aldolasa era totalmente dependiente de la presencia del

residuo de triptófano subterminal propio de las proteínas de la familia TRAP, lo cual sugiere

que este aminoácido es crucial para la movilidad “gliding” (Jewett y Sibley, 2003). La aldolasa

tiene un motivo conservado de unión a actina y puede interactuar con la actina del

citoesqueleto de mamíferos (Kusakabe et al., 1997). En Plasmodium se encontraron los

mismos hallazgos y adicionalmente se evidenció que el residuo de triptófano no es el único

responsable de la unión, sino que también depende de interacciones electrostáticas que

involucran residuos cargados negativamente en el tallo citoplasmático de TRAP y una región

cargada positivamente en la aldolasa (Buscaglia et al., 2003).

1.6.5 Proteínas que conducen al rompimiento de las interacciones con el sustrato

El clivaje proteolítico de las proteínas de los micronemas incluyendo los miembros de la

familia TRAP y AMA-1 es un evento clave durante el proceso de invasión (Soldati et al., 2004;

Dowse y Soldati, 2004). En T. gondii se encontraron dos proteínas con actividad proteasa

denominadas MPP1 y MPP2 (“Microneme Protein Protease”). La actividad MPP1 ocurre

dentro del dominio transmembrana produciendo la liberación del dominio extracelular de



TgMIC2 en el medio extracelular. Urban y Freeman propusieron que las proteasas romboides

intramembrana pueden ser las responsables de este procesamiento proteolítico (Urban y

Freeman, 2003). En T. gondii se han caracterizado 5 proteasas romboides como posibles

candidatos con actividad MPP1 (Dowse y Soldati, 2004).

1.6.6 Mecanismos que controlan la función del “glideosoma”

El momento exacto, la duración y la orientación de la movilidad “gliding” debe ser altamente

regulada para asegurar el establecimiento de la infección; por lo tanto, el control de la

función del “glideosoma” debe ocurrir en varios niveles. Se han identificado 3 (Daher y

Soldati, 2009):

a) Control del ensamblaje y función del complejo motor, el cual es gobernado por

modificaciones post-traduccionales resultado de una cascada de señalización dependiente

de calcio. Dentro de estas modificaciones se encuentran la miristoilación y la

palmitoilación de GAP45. La primera modificación es irreversible, mientras que la

palmitoilación es reversible, lo cual puede jugar un papel en regular la función del motor

por afectar su anclaje al IMC (Rees-Channer et al., 2006). Otra modificación post-

traduccional es la fosforilación de GAP45 a expensas de quinasas dependientes de calcio

(CDPK1, PKB) o cGMP como parte de una cascada de señalización activada durante la

locomoción del parásito o invasión (Green et al., 2008; Wiersma et al., 2004; Vaid et al.,

2008).

b) Polimerización controlada de la actina. La polimerización controlada de los filamentos de

actina en tiempo y lugar gobierna la dirección y la duración de la movilidad “gliding”

(Wetzel et al., 2003). La actina de Apicomplexa difiere del resto de actinas y dentro de sus

propiedades atípicas se ha observado la formación de filamentos inusualmente cortos

(100 nm) que son altamente dinámicos y fragmentados (Sahoo et al., 2006; Schmitz et al.,

2005). Adicionalmente, la polimerización de la actina de T. gondii ocurre a

concentraciones críticas 3 a 4 veces más baja que las actinas clásicas (Sahoo et al., 2006).

El ensamblaje rápido de los filamentos se produce gracias a la acción de dos forminas,

proteínas que utilizan la habilidad de la profilina para acoplar la hidrólisis del ATP al

ensamblaje rápido del filamento (Romero et al., 2004). Respecto al desensamblaje de los

microfilamentos en Apicomplexa, es un proceso rápido provocado por un factor

Marco teórico 29

depolimerizante de actina (ADF) o cofilina (Van Troys et al., 2008). Lo anterior sugiere

que los Apicomplexa contienen las proteínas claves involucradas en la dinámica de la

actina; sin embargo, el mecanismo de acción y la forma de regulación hasta el momento no

es totalmente conocido.

c) Accesibilidad optimizada de fuentes energéticas para impulsar el “glideosoma”. El ATP es

requerido en altos niveles para abastecer localmente la actividad ATPasa de la miosina y

la activa reconstrucción del citoesqueleto de actina. La hidrólisis del ATP y la liberación de

Pi conducen la dinámica de la actina al controlar la estabilidad del filamento y la

interacción con proteínas de unión a actina reguladoras (Sablin et al., 2002). La energía

requerida para el “gliding” de T. gondii es derivada casi en su totalidad de la glicólisis y de

la producción de ácido láctico. Pomel y colaboradores demostraron que las enzimas

glicolíticas, entre ellas aldolasa, experimentan una marcada relocalización pasando del

citoplasma del parásito al espacio entre la membrana plasmática y el IMC y a la cara

citoplasmática del IMC. Las enzimas glicolíticas permanecen en la película hasta que el

parásito ha completado la invasión de la célula hospedera y posteriormente regresan al

citoplasma. Lo anterior sugiere que el parásito es capaz de relocalizar su principal fuente

de energía en respuesta al proceso de invasión y esta habilidad le permite optimizar la

liberación de ATP en aquellos eventos celulares que son más críticos para su

supervivencia (Pomel et al., 2008).

2 Justificación

Para convertir los combustibles químicos celulares como el ATP en energía mecánica, los

sistemas biológicos cuentan con un arsenal de proteínas motoras, conocidas como motores

moleculares. Dentro de éstos, la miosina que hace parte del grupo de los motores del

citoesqueleto está implicada en un sinnúmero de funciones esenciales para la vida celular.

Toxoplasma y Plasmodium, parásitos del phylum Apicomplexa, son organismos intracelulares

obligados que comparten una estrategia única de locomoción conocida como “gliding”,

movimiento que requiere una maquinaria proteica especializada denominada “glideosoma”

(Sibley, 2004; Keeley y Soldati, 2004), la cual se basa en la actividad de un motor molecular

compuesto por actina-miosina (Pinder et al., 2000; Jones et al., 2006).

En T. gondii se han identificado 11 miosinas (TgMyoA a TgMyoK) (Heintzelman, 2015) y fue

en este organismo en donde por primera vez se asoció a TgMyoA como la miosina

responsable del “gliding” (Meisner et al., 2002). Esta idea se mantuvo por años, hasta que

Andenmatten y colaboradores (2013) lograron obtener parásitos TgMyoA “knock-out”, lo

cual sugirió que TgMyoA podría no ser la única miosina implicada en el “gliding”, o que

podían existir mecanismos alternos de invasión. Poco después Frénal y colaboradores (2014)

reportaron la existencia de un segundo “glideosoma”, en el cual el motor molecular fue

TgMyoC y éste a diferencia del “glideosoma” TgMyoA se localizó en el polo basal del parásito.

Interesantemente, la ausencia de TgMyoA hizo que TgMyoC se relocalizará al sitio de acción

del “glideosoma” TgMyoA, es decir al polo apical y a la periferia del parásito, compensando

parcialmente la función de TgMyoA.

En P. falciparum se han identificado 6 genes que codifican para miosina, pero sólo se ha

caracterizado funcionalmente a PfMyoA (Pinder et al., 1998; Baum et al., 2006; Jones et al.,

2006), de la cual se sabe que hace parte del motor actina-miosina del “glideosoma”. Con

respecto a las demás miosinas nada se conoce acerca de su función; sin embargo, trabajos

recientes sobre PfMyoB han permitido establecer que esta proteína comparte numerosas



similitudes con PfMyoA, ya sea a nivel de tamaño (ambas miosinas son proteínas pequeñas,

818 y 801 aa y sus pesos moleculares son muy similares, 92,3 y 93,2 kDa), secuencia

(presentan una serie de aminoácido básicos en su C-terminal y poseen los residuos

necesarios para interactuar con otra proteína), estructura (ambas carecen de dominio de cola

y en el dominio del cuello presentan una hélice con estructura “coil-coiled”), clasificación

filogenética dentro de la familia de miosinas (ambas se ubican en la clase XIV), patrón de

transcripción (el gen se transcribe en los 3 estadios del ciclo intraeritrocítico aunque el nivel

del transcrito es mayor en esquizontes), patrón de expresión (ambas se expresan en estadio

de esquizontes y merozoitos) y de la ubicación y secuencia de los motivos IQ (Chaparro-

Olaya et al., 2003; Chaparro-Olaya et al., 2005; Foth et al., 2006; Hernández et al., 2017;

Hernández et al., 2018). Todas estas características hacen pensar que PfMyoB podría jugar

un papel importante durante la invasión al eritrocito, y teniendo en cuenta que este proceso

es vital para el parásito, no sería extraño que Plasmodium tuviera dos miosinas

funcionalmente redundantes (al menos parcialmente).

Con este trabajo se pretende explorar si PfMyoB está involucrada en la invasión de P.

falciparum a glóbulos rojos, de la misma forma que lo hace la miosina A, es decir, a través de

la articulación con el “glideosoma”. El conocimiento generado sobre las miosinas

involucradas en el proceso de invasión, podría sugerir una novedosa estrategia de control de

la enfermedad, orientada hacia el bloqueo del motor molecular involucrado en la invasión, ya

que al inhibir el motor, se impide la invasión y por tanto la propagación del parásito, sin

afectar al hospedero humano dado que las miosinas humanas son muy diferentes a las del

parásito.

3 Objetivos

3.1 Objetivo general

Explorar la participación de PfMyoB en el proceso de invasión al eritrocito y establecer si

interactúa con MTIP en el complejo molecular del “glideosoma”.

3.2 Objetivos específicos

Producir anticuerpos policlonales a partir de proteínas recombinantes de PfMyoA,

PfMyoB y tres proteínas del “glideosoma”: MTIP, GAP45 y GAP50.

Evaluar los anticuerpos producidos en ensayos de inmunoprecipitación para intentar

establecer si PfMyoB interactúa con estas proteínas del “glideosoma”.

Generar parásitos pfmyo-a “knock-out” o pfmyo-b “knock-out” para tratar de elucidar

el papel de PfMyoB durante el proceso de invasión.

Evaluar el comportamiento de los parásitos “knock-out” en cultivo para explorar si el

silenciamiento del gen pfmyob afecta la invasión.

Identificar potenciales motivos funcionales en PfMyoB usando herramientas

bioinformáticas.

4 Métodos, resultados y discusión

Para establecer si PfMyoB interactúa con las proteínas del “glideosoma”, se planteó como

estrategia metodológica el uso de técnicas inmunoquímicas, como inmunofluorescencia (IF),

western blot (WB) e inmunoprecipitación (IP). Todas estas metodologías requerían

anticuerpos específicos y por tanto se propuso la producción de proteínas recombinantes de

PfMyoA, MTIP, GAP45, GAP50 y PfMyoB, para generar los respectivos anticuerpos

policlonales en ratones y conejos. Una vez se comprobó que los anticuerpos obtenidos

detectaban específicamente la respectiva proteína en el parásito, se planteó su uso en

ensayos de inmunoprecipitación para revelar las interacciones proteína:proteína en las que

participara PfMyoB y hacer análisis de esas proteínas por espectrometría de masas.

Por otro lado, para explorar la posible participación de PfMyoB en la invasión, se hizo un

acercamiento de genética reversa. La estrategia propuesta fue el silenciamiento (“knock-out”)

del gen pfmyo-a o del gen pfmyo-b de P. falciparum (cepa 3D7) por recombinación homóloga.

La ausencia de proteína permitiría explorar la importancia de cada proteína en el proceso de

invasión al eritrocito. El comportamiento de los parásitos “knock-out” se evaluó en cultivo,

determinando porcentajes de invasión contra un cultivo control. También se determinó si

hubo variaciones en la localización de MTIP.

Finalmente se usaron herramientas bioinformáticas (como modelos ocultos de Markov o

expresiones regulares) para buscar motivos IQ sobre PfMyoB.

A continuación se describe en detalle la metodología que se llevó a cabo durante el desarrollo

de esta tesis.



4.1 Cultivo de Plasmodium falciparum y preparación de extractos

4.1.1 Cultivo continuo

La cepa 3D7 de P. falciparum fue cultivada de acuerdo con la metodología descrita por Trager

y Jensen (Trager y Jensen, 1976). Los parásitos fueron mantenidos en eritrocitos humanos

grupo O positivo al 5 % de hematocrito en medio RPMI-1640 suplementado con 25 mM de

hepes ácido, 0,19 mM de hipoxantina, 50 mg/L de sulfato de gentamicina, 0,86 mg/L de

glutatión reducido, 21 mM de bicarbonato de sodio y 10 % de suero humano (medio

completo) a 37 °C en una atmósfera baja en oxígeno (90 % N2, 5 % O2, 5 % CO2). Las formas

jóvenes del parásito fueron sincronizadas mediante varios tratamientos con sorbitol al 5 %

(Lambros y Vanderberg, 1979) y la concentración de esquizontes se realizó mediante

centrifugación en gradiente de densidad de percoll (Rivadeneira et al., 1983). El seguimiento

de la densidad parasitaria se realizó mediante recuento de extendidos teñidos con colorante

de Giemsa, expresado en porcentaje.

4.1.2 Obtención de parásitos libres

El primer paso en la preparación de cualquier extracto de P. falciparum consistió en la lisis de

los glóbulos rojos y la liberación de los parásitos. Para esto, el cultivo se centrifugó a 1110 xg

por 5 min, el sobrenadante se descartó y el “pellet” de eritrocitos se trató con 9 volúmenes de

saponina al 0,15 % en PBS durante 10 minutos a 4 °C. El hemolizado fue centrifugado a

23700 xg por 10 min a 4 °C, el sobrenadante se descartó y el “pellet” de parásitos obtenido se

lavó 3 veces con PBS frío, centrifugando a 23700 xg por 5 min a 4 °C. El “pellet” de parásitos

se almacenó a -70 °C y posteriormente se usó para preparar extractos proteicos o para

extraer ADN o ARN del parásito.

4.1.3 Extracción de ADN

La extracción del ADN de P. falciparum se realizó mediante el kit comercial QIAamp® DNA

Micro Kit (Qiagen, Hilden, Germany) siguiendo las instrucciones del fabricante (QIAamp®

DNA Micro Handbook). Brevemente, se tomó 1 mL de cultivo con parasitemia entre 2 – 6 %

(1 – 3 x 107 parásitos), se centrifugó y se eliminó el sobrenadante. Al “pellet” se adicionaron

Métodos, resultados y discusión 37

100 µL de buffer ATL, 10 μL de proteinasa K y 100 μL de buffer AL, se mezcló en vortex por

15 segundos y se incubó a 56 °C por 10 min en agitación. Después de una corta centrifugación

se agregaron 50 μL de etanol absoluto, se mezcló en vortex por 15 segundos y se incubó a

temperatura ambiente por 3 min. La mezcla se centrifugó brevemente y se depositó sobre

una columna QIAamp MinElute unida a un tubo colector, se centrifugó a 6000 xg por 1 min y

se descartó el filtrado. La columna se colocó sobre un nuevo tubo colector y se adicionaron

500 µL de buffer de lavado AW1, se centrifugó a 6.000 xg por 1 min y se descartó el tubo

colector con el filtrado. El paso anterior se repitió, pero esta vez con 500 µL de buffer de

lavado AW2. Nuevamente se reemplazó el tubo colector y se centrifugó a 20000 xg por 3 min

para secar la membrana de la columna. La columna se transfirió a un tubo eppendorf nuevo y

para eluir el ADN se agregaron 70 μL de agua libre de nucleasas, se incubó a temperatura

ambiente por 5 min y se centrifugó a 20000 xg por 1min. El filtrado, el cual contiene el ADN,

se cuantificó en un espectrofotómetro para micro volúmenes BioSpec-nano (Shimadzu,

Kyoto, Japón) a 260 nm. Para estimar la pureza, se calculó la relación absorbancia a 260 nm/

absorbancia a 280 nm. El ADN se almacenó a -20 °C hasta su uso.

4.1.4 Extracción de ARN

Para la extracción del ARN de P. falciparum se utilizó TRIzol® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)

y el kit comercial Direct-zolTM RNA MiniPrep (Zymo Research, Irvine, CA, USA) de acuerdo

con las recomendaciones del fabricante. Brevemente, a un “pellet” de parásitos de 15 µL

(proveniente de 15 mL de cultivo al 3 - 4 % de parasitemia: 2,2 - 3 x 108 parásitos) se le

agregaron 0,7 mL de TRIzol atemperado a 37 °C; esta mezcla se resuspendió por pipeteo

constante hasta lisis completa. Al lisado anterior se le agregó un volumen igual de etanol (95-

100 %) y esta mezcla se transfirió a una columna Zymo-Spin™ IIC montada sobre un tubo de

recolección de desechos y se centrifugó a 16000 xg por 1 min. La columna se transfirió a un

nuevo tubo recolector y se lavó con 400 µL de buffer Direct-zol RNA PreWash centrifugando

como se mencionó previamente. El filtrado se descartó y se repitió el lavado. Luego se

agregaron 700 µL de buffer de lavado RNA Wash y se centrifugó por 2 min para asegurar la

completa remoción del buffer. Finalmente, la columna se transfirió a un microtubo libre de



RNasas y el ARN se eluyó de la columna con 15 µL de agua tratada con DEPC1 mediante

centrifugación durante 1 min. El ARN se cuantificó inmediatamente y de acuerdo con la

concentración obtenida se hizo tratamiento con DNAsa a 37 °C durante 30 min, la reacción se

paró incubando a 65 °C x 15 min y el ARN se volvió a cuantificar y se almacenó a -70 °C hasta

su uso.

4.1.5 Extracción de proteínas

Pasadas las 42 horas de desarrollo o más, se recolectaron aproximadamente 2 x 109 parásitos

para preparar extractos proteicos ricos en los componentes del “glideosoma”. La extracción

de proteínas se realizó con buffer E2 (Gaskins et al., 2004) o con buffer RIPA3 (Bullen et al.,

2009) y siempre se trabajó sobre hielo. Por cada volumen de “pellet” de parásitos se

agregaron 4 volúmenes de buffer. Los parásitos tratados con buffer E se homogenizaron con

émbolo de teflón 10 veces a velocidad intermedia y los parásitos procesados con buffer RIPA

se sonicaron 2 a 3 veces por 3 a 4 segundos usando una amplitud del 30 %. Tanto el extracto

homogenizado como el sonicado se centrifugaron a 23700 xg por 20 min a 4 °C. En ambos

casos el sobrenadante se guardó a -70 °C en alícuotas y la cuantificación de las proteínas se

hizo mediante el método de Bradford o del ácido bicinconínico.

4.2 Producción de proteínas recombinantes: PfMyoA, PfMyoB, MTIP, GAP45 y GAP50

4.2.1 Métodos

4.2.1.1 Diseño de cebadores y clonación

Con base en las secuencias de los genes pfmtip, pfgap45, pfgap50 y pfmyo-a (PlasmoDB gen

ID: PF3D7_1246400, PF3D7_1222700, PF3D7_0918000 y PF3D7_1342600,

respectivamente), se diseñaron iniciadores específicos (Anexo A) usando el programa primer

1 Agua DEPC: agua ultrapura tipo I tratada con dietilpirocarbonato al 0,1% por 1 hora a 37 °C y autoclavada 15 minutos a 15 psi. 2 Buffer E: Tris-HCl 50mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, Triton X-100 1%, Deoxicolato de sodio 1% e inhibidores de proteasas 1X 3 Buffer RIPA: Tris-HCl 20mM pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NP-40 1%, Deoxicolato de sodio 0,5%, , SDS 0,1% e inhibidores de proteasas 1X


34. Tanto el iniciador sentido como el antisentido fueron diseñados para contener en su

extremo 5' una secuencia de reconocimiento para las enzimas de restricción BamHI y NotI

respectivamente. Cada fragmento fue amplificado a partir de 50 ng de ADN de la cepa 3D7 de

P. falciparum, extraído por lisis con proteinasa K, extracción fenol cloroformo y posterior

diálisis contra buffer TE5 pH 7,4 (Sambrook y Russell, 2001). Para PfMTIP y PfGAP45 se

amplificó la secuencia completa del gen y para PfMyoA y PfGAP50, una secuencia parcial. Las

condiciones de la mezcla de PCR fueron: 200 µM de dNTPs (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),

1µM de iniciadores, 1,5 mM de MgSO4 y 0,625 U de Pfu ADN polimerasa (EP0502, Thermo

Scientific, Carlsbad, CA, USA) que tiene actividad correctora exonucleasa 3' → 5'. El programa

de amplificación consistió en un ciclo de denaturación inicial de 94 °C x 5 minutos, 35 ciclos

de 94 °C x 30 segundos, 50 °C x 30 seg y 72 °C x 1 min, seguido por una extensión final de 72

°C x 7 min. Los productos de PCR se clonaron en el vector pGEM-T easy (Promega, Madison,

WI, USA) (Anexo B.), usando las recomendaciones del fabricante, previa adición de una cola

de adeninas al extremo 3’ de los amplicones. Los productos de la ligación (vector

recombinante) se emplearon para transformar bacterias competentes Escherichia coli TOP10

mediante choque térmico. La detección de colonias positivas se realizó con base en el sistema

de selección presente en el vector, mediante selección blanco/azul sobre cajas de agar LB

adicionado con ampicilina, IPTG y X-Gal a concentraciones de 100 µg/mL, 0,5 mM y 80

µg/mL, respectivamente. Las colonias blancas escogidas se repicaron en una caja nueva y se

confirmaron mediante PCR, usando iniciadores del vector y del inserto. Una colonia positiva

se sembró en caldo LB-ampicilina (100 µg/mL) y a partir de este cultivo se hizo extracción de

ADN plasmídico mediante kit comercial (Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification

System-Promega, Madison, WI, USA).

Los fragmentos clonados en pGEM-T easy fueron liberados por digestión con las enzimas

BamHI y NotI. La digestión fue verificada mediante electroforesis en gel de agarosa, desde

donde las bandas correspondientes a los insertos se cortaron y se purificaron (Montage gel

extraction kit, Millipore, Bedford, MA, USA) y el ADN se cuantificó por espectrofotometría.

Los insertos se ligaron al vector de expresión pGEX-4T2 (Amershan Pharmacia Biotech,

4 http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/ 5 Buffer TE pH 7,4: Tris-HCl 100mM pH 7.4, EDTA 10 mM pH 8.0



Buckinghamshire, UK), que previamente había sido digerido con las mismas enzimas, en una

proporción 3:1 (inserto:vector) durante 16 horas a 22 °C en presencia de T4 ADN ligasa

(Promega, Madison, WI, USA) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los productos

de la ligación se usaron para transformar bacterias E. coli TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA,

USA) por choque térmico y las colonias obtenidas se confirmaron por PCR usando iniciadores

del inserto y del vector. Una colonia positiva se creció en caldo LB-ampicilina y a partir de

este cultivo se extrajo ADN plasmídico, el cual se envió a secuenciar para verificar la

presencia del fragmento de interés.

El vector pGEX-4T-2 (Anexo B) contiene una secuencia que codifica para la proteína glutatión

S transferasa seguida por un sitio de corte para trombina y un sitio de clonación múltiple en

el cual se encuentran las secuencias de corte para las enzimas BamHI y NotI. Así, cuando se

produce la proteína de interés, ésta queda unida en su extremo amino a GST (26,3 kDa),

característica que permite la purificación de la proteína recombinante por cromatografía de

afinidad.

4.2.1.2 Expresión de las proteínas recombinantes

Para la expresión de las recombinantes se usaron dos cepas de E. coli genéticamente

modificadas, BL21 CodonPlus (DE3)-RIL (Agilent, Upton, NY, USA) y BL21 pG-KJE8 (Takara,

Kusatsu, Japón). La primera cepa sobreexpresa cuatro tARNs normalmente escasos en cepas

silvestres de E. coli y que frecuentemente limitan la producción de proteínas heterólogas en

esta bacteria. Por su parte, la cepa BL21 pG-KJE8 sobreexpresa cinco chaperonas (dnaK, dnaJ,

grpE, groES y groEL), las cuales promueven el correcto plegamiento de las proteínas evitando

la formación de cuerpos de inclusión.

Previamente en el laboratorio se había producido el plásmido recombinante pET-pfmyo-b, el

cual contiene un inserto de 438 pb del gen pfmyo-b que abarca la región comprendida entre

los nucleótidos 1525 y 1962, la cual se localiza en el dominio motor que se denominó clon

B38. El vector pET-15b contiene una secuencia que codifica para 6 histidinas seguida por un

sitio de corte para trombina y tres sitios de clonación para las enzimas BamHI, XhoI y NdeI

(Anexo B). Las proteínas expresadas en este vector contienen en su N-terminal una cola de 6

histidinas, etiqueta que permite su purificación mediante cromatografía de afinidad con

metales inmovilizados (iones metálicos tales como Ni++).


Las dos cepas bacterianas fueron transformadas con los 5 plásmidos recombinantes (pGEX-

Pfmtip, pGEX-Pfgap45, pGEX-Pfgap50, pGEX- pfmyo-a y pET-pfmyo-b) y para determinar las

condiciones de tiempo y cepa en las cuales se obtenía la mejor expresión de cada proteína, se

tomó una colonia de cada una de las cepas (incluida TOP10) y se creció en 5 mL de medio LB

suplementado con 100 μg/mL de ampicilina y 50 μg/mL de cloranfenicol durante toda la

noche a 37 °C con agitación constante a 200 rpm. Al medio para el plásmido pET

adicionalmente se le agregó glucosa al 1 %. Al día siguiente, cada cultivo se diluyó 1:50 con el

respectivo medio y para el sistema BL21 pG-KJE8, el medio se suplementó adicionalmente

con 1 mg/mL de arabinosa y 10 ng/mL de tetraciclina (agentes inductores de la expresión de

las chaperonas). Los cultivos se incubaron hasta alcanzar una densidad óptica de 0,6 a 0,8 a

una longitud de onda de 600 nanómetros (OD600), momento en el cual se adicionó IPTG en

concentración 0,1 mM para los plásmidos pGEX y 1 mM para el plásmido pET y se permitió el

crecimiento por 16 horas a 37 °C. Se tomaron alícuotas de 1 mL justo antes de la inducción

(tiempo 0) y a las 2, 4 y 16 horas post inducción para los plásmidos recombinantes pGEX y a

las 3 y 16 horas para el plásmido pET y se determinó la densidad óptica de cada alícuota,

para posteriormente calcular la masa bacteriana y cargar los geles con la misma cantidad.

Estas alícuotas se centrifugaron a 1000 xg por 5 minutos, el sedimento se solubilizó en buffer

carga6 1X y esta mezcla de calentó a 95 °C por 5 min. El extracto obtenido se corrió en

condiciones denaturantes en geles de poliacrilamida al 10 % y las proteínas recombinantes

se detectaron por tinción con azul de coomassie y/o WB usando el anticuerpo policlonal anti-

GST (Abcam, Cambridge, MA, USA) y el anticuerpo monoclonal anti-His (Abcam, Cambridge,

MA, USA).

4.2.1.3 Análisis bioinformático

Para cada proteína recombinante se evaluaron los siguientes parámetros: el contenido A/T

mediante el programa GC Content Calculator

(http://www.biologicscorp.com/tools/GCContent); el peso molecular teórico y el punto

isoeléctrico (pI) con la herramienta ExPASy compute pI/Mw

(http://web.expasy.org/compute_pi/) y la carga y el número de aminoácidos ácidos con

6 Buffer de carga: Tris-HCl 100 mM pH 6.8, SDS al 4%, azul de bromofenol al 0.2%, glicerol al 20%, ditiotreitol (DTT) o ß-mercaptoetanol 200 mM

http://www.biologicscorp.com/tools/GCContent

http://web.expasy.org/compute_pi/



PEPSTATS (http://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_pepstats/). También se evaluó el

uso del codon, teniendo en cuenta que éstos se utilizan de manera desigual en diferentes

organismos, el sesgo de uso del codón entre E. coli y P. falciparum se examinó utilizando la

base de datos de uso de codones en http://www.kazusa.or.jp/codon/. Para evaluar las

preferencias de determinados codones sinónimos, el número y la frecuencia de cada codón

en las secuencias recombinantes se calcularon utilizando Sequence Manipulation Suite (SMS)

(http://www.bioinformatics.org/sms2/reference.html).

4.2.1.4 Evaluación de la solubilidad de las proteínas recombinantes

Una vez se determinaron las condiciones de tiempo y cepa en las cuales se obtuvo la mayor

cantidad de cada proteína, se hizo producción a 1 litro de cultivo, siguiendo el protocolo

establecido en el paso previo. El cultivo bacteriano se centrifugó a 1000 xg y el sedimento se

resuspendió con 5 volúmenes de buffer R7 y lisozima a una concentración final de 1 mg/mL y

coctel de inhibidores de proteasas 1:200 (Sigma P8465, Saint Louis, MO, USA), se hicieron 5

ciclos de congelamiento (nitrógeno líquido x 45 seg) y descongelamiento (baño de agua a 37

°C x 2 min) y finalmente la suspensión se centrifugó a 15.000 xg por 15 minutos para separar

el sobrenadante de la fracción particulada. La presencia de la proteína de interés se

monitoreó en ambas fracciones mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en

condiciones denaturantes (SDS-PAGE) y WB.

4.2.1.5 Purificación de proteínas recombinantes

La purificación de las proteínas recombinantes solubles se hizo mediante cromatografía de

afinidad en resina de glutatión-agarosa (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) a partir de 1

litro de cultivo bacteriano. La purificación se realizó por lote (batch) incubando 300 μL de

cama de resina por cada 6 mL de extracto durante 30 min a 4 °C con agitación suave, luego la

mezcla se centrifugó a 1000 xg durante 2 min y se guardó el sobrenadante. La resina se lavó

10 veces con 10 volúmenes de buffer de lavado8 o hasta que la absorbancia a 280 nm de la

7 Buffer R: NaCl 50 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7,5 y glicerol al 5% 8 Buffer de lavado-resina: Tris-HCl 50 mM pH 8.0, NaCl 150 mM

http://www.bioinformatics.org/sms2/reference.html


solución de lavado fue igual o inferior a 0,010. La proteína recombinante se eluyó con 300 µL

de buffer de elución9 y los eluídos obtenidos se almacenaron a -70 °C.

La purificación de las proteínas recombinantes insolubles se hizo a partir de la fracción

particulada. Para obtener los cuerpos de inclusión (CI) se tomó un gramo de sedimento, el

cual se homogenizó en 4 mL de buffer de lavado10 y se centrifugó a 22.000 xg por 30 min a 4

°C. El precipitado obtenido se volvió a lavar 2 veces más. Los CI obtenidos se resuspendieron

en buffer de lavado sin urea ni tritón y se centrifugó 2 veces como se mencionó antes. Al

sedimento se le adicionaron 0,5 mL de buffer de extracción11, se homogenizó y la suspensión

se centrifugó a 17.000 xg por 1 hora a 4 °C. El sobrenadante se dializó contra 1litro de buffer

de diálisis12 haciendo dos cambios de buffer (Sambrook y Russell, 2001). La solución

dializada se sembró en un gel preparativo de 16 cm x 21 cm x 1,5 cm y se sometió a SDS-

PAGE. Para ubicar exactamente la proteína en el gel, una tira de éste fue teñida con azul de

coomassie y por comparación se cortó la franja correspondiente a la recombinante en el

resto de gel. Este trozo se homogenizó con jeringa y la proteína fue eluída del gel con cuatro

volúmenes de agua ultra pura (conductividad 0,055 µS/cm) a 37 °C durante 4 h (Scheer y

Ryan, 2001).

En ambos casos la pureza de la recombinante obtenida se analizó por SDS-PAGE y WB y la

concentración se determinó por comparación contra un patrón de albúmina sérica bovina de

concentración conocida.

4.2.2 Resultados

La expresión heteróloga de un determinado gen en E. coli depende, entre otros factores, de la

facilidad del plegamiento de la proteína, de la degradación de la proteína por proteasas de la

célula hospedera y de las potenciales diferencias en el uso de codón entre la bacteria y el

organismo del cual proviene el gen foráneo (Jonasson et al., 2002). Por eso, la expresión de

las proteínas de P. falciparum de interés, se evaluó en dos cepas de E. coli diferentes, BL21

CodonPlus (DE3)-RIL y BL21 pG-KJE8 (en adelante se denominarán CodonPlus y pG-KJE8).

9 Buffer de elución: Tris-HCl 50 mM pH 8.0, NaCl 150 mM y glutatión reducido 10 mM 10 Buffer de lavado-cuerpos de inclusión: Tris-HCl 100 mM pH 7,0, EDTA 5 mM, DTT 5mM, Urea 2M, triton X-100 al 2% 11 Buffer de Extracción-cuerpos de inclusión: Tris-HCl 50 mM pH 7,0, EDTA 5 mM, DTT 5mM, Guanidina HCl 8M 12 Buffer de diálisis: NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM pH 8.0



4.2.2.1 Diseño de cebadores y clonación

A partir de las secuencias de los genes pfgap45, pfgap50, pfmtip y pfmyoa, disponibles en

plasmoDB (Tabla 4-1), se diseñaron 4 parejas de iniciadores (Anexo A), a los cuales se les

adicionaron sitios de reconocimiento para las enzimas BamHI y NotI, secuencias presentes en

el sitio de clonación múltiple del vector de expresión pGEX-4T 2. En el anexo C se muestran

las regiones que fueron expresadas en las 5 proteínas.

Tabla 4-1. Información de los genes de interés

pb: pares de bases; aa: aminoácidos; Amplicón: corresponde al tamaño del producto de PCR.

Mediante PCR se amplificó la secuencia completa del gen pfmtip y pfgap45 y una secuencia

parcial de los genes pfmyo-a y pfgap50 (figura 4-10A) a partir de ADN genómico (ADNg) del

parásito y cada amplicón se ligó con el vector pGEM-T easy. Los constructos obtenidos se

comprobaron mediante PCR con los iniciadores del vector (T7 y SP6) (figura 4-10B) y se

usaron para transformar bacterias E. coli Top10. La detección de colonias positivas, es decir,

bacterias que contienen el plásmido recombinante (pGEM-myoa, pGEM-mtip, pGEM-gap45 y

pGEM-gap50) se hizo mediante PCR usando iniciadores del inserto o del vector (figura 4-11).

Luego, para cada gen se seleccionó una colonia positiva, la cual se inoculó y cultivó en medio

LB para extraer y purificar ADN plasmídico (ADNp), y éste, junto con el vector de expresión

pGEX-4T 2, fueron digeridos con las enzimas de restricción BamHI y NotI. Los insertos

liberados de los plásmidos recombinantes pGEM fueron purificados y ligados en el vector

pGEX linearizado.

PfMyoA PfMyoB MTIP GAP45 GAP50

Cromosoma 13 5 12 12 9

PlasmoDB PF3D7_1342600 PF3D7_0503600 PF3D7_1246400 PF3D7_1222700 PF3D7_0918000

Intrones 2 7 0 0 0

Tamaño con intrones/pb 2841 3493 615 615 1191

Tamaño sin intrones/pb 2457 2406 615 615 1191

Tamaño de la proteína/aa 818 801 204 204 396

Inserto/pb 753 438 615 615 456

Amplicon iniciadores

específicos/pb766 455 629 629 470

Amplicon pGEM T7-SP6/pb 945 808 808 649

Amplicon pGEX S-AS/pb 902 765 765 606


Figura 4-10. Amplificación por PCR de los fragmentos de interés y ligación de los productos en

el vector pGEM-T easy.

Electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % teñido con bromuro de etidio y visualizado bajo luz UV. A. PCR con iniciadores específicos para cada gen: carril 1: control negativo (sin plantilla); carril 2: Marcador de peso (ladder) de 100 pb; carril 3: iniciadores para pfgap45 (629 pb); carril 4: iniciadores para pfgap50 (470pb); carril 5: iniciadores para pfmtip (629 pb); carril 6: iniciadores para pfmyoa (766 pb). B. PCR de los constructos pGEM-T easy con los iniciadores del vector: (T7 y SP6) carril 1: Marcador de peso (ladder) de 100 pb; carril 2: control negativo: vector vacio; carril 3: PCR sobre constructo pGEM-gap45 (808 pb); carril 4: PCR sobre constructo pGEM-gap50 (649 pb); carril 5: PCR sobre constructo pGEM-mtip (808 pb); carril 6: PCR sobre constructo pGEM-myoa (945 pb).

Figura 4-11. Confirmación de colonias transformadas.

Electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % teñido con bromuro de etidio y visualizado bajo luz UV.

Rastreo de colonias por PCR con iniciadores específicos de cada gen sobre un determinado número de

colonias, para confirmar la presencia del plásmido recombinante. En los 4 paneles el carril 1

corresponde al control negativo y el carril 13 y 10 del último gel al control positivo. Carril 2: ladder de

100 pb. Los carriles restantes corresponden a las colonias rastreadas.

A continuación, con los productos de ligación obtenidos se transformaron bacterias TOP10 y

mediante PCR con iniciadores del vector se hizo el rastreo de colonias. En la figura 4-12A se

Rastreo para pGEM/gap45

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13

Rastreo para pGEM/myoa

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Rastreo para pGEM/mtip

1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112 13

Rastreo para pGEM/gap50

1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112 13

1000

500



muestran los resultados para pGEX- pfmyo-a y en la figura 4-12B se presentan los resultados

de la PCR para los clones pGEX-gap45, pGEX-gap50 y pGEX-mtip. A partir de estos 4 clones (y

del clon pET-myo-b, previamente obtenido en el laboratorio) se purificó ADNp con el kit

Wizard® Plus SV Minipreps DNA purification system (Promega, Madison, WI, USA). El ADN

se envió a secuenciar (Servicio de secuenciación y análisis molecular del Instituto de genética

de la Universidad Nacional) para comprobar la identidad de los fragmentos clonados.

Figura 4-12. Subclonación en vector de expresión pGEX-4T 2. Electroforesis en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio y visualizado bajo luz UV. A. Rastreo de 10 colonias pGEX-pfmyo-a, de éstas 3 tuvieron el plásmido recombinante (902 pb) (flecha). Carril 1: ladder 100 pb; carril 2: control positivo; carriles 3-12 PCR de 10 colonias pGEX/pfmyo-a; carril 13: control negativo. B. PCR con iniciadores del vector sobre los siguientes clones: Carril 1: ladder 100 pb; carril 2: pGEX-gap45 (765 pb); carriles 3 y 4: pGEX-gap50 (606 pb), carriles 5 y 6: pGEX-mtip (765 pb) y carriles 7: pGEX-control

El alineamiento de la secuencia esperada (tabla 4-1) que codifica cada proteína contra la

secuencia obtenida (reportada por el Instituto de genética de la Universidad Nacional)

permitió comprobar identidad del 100 % en los todos los casos (Anexo D).

4.2.2.2 Expresión de las proteínas recombinantes

Cada constructo pGEX se usó para transformar las cepas de E. coli, CodonPlus y pG-KJE8. Las

dos cepas provienen de la cepa BL21 y son ampliamente usadas en expresión de proteínas, ya

que no sólo presentan una actividad proteasa disminuida, sino que facilitan la traducción

(CodonPlus) o el plegamiento de las proteínas (pG-KJE8). Para los ensayos de expresión se


tomó una colonia positiva de cada cepa para cada constructo y se creció en medio LB

suplementado con 100 μg/mL de ampicilina y 50 μg/mL de cloranfenicol durante toda la

noche a 37°C con agitación constante a 200 rpm. Al día siguiente, cada cultivo se diluyó 1:50

con medio fresco y para el sistema pG-KJE8, el medio se suplementó con 1 mg/mL de

arabinosa y 10 ng/mL de tetraciclina (agentes inductores de la expresión de las chaperonas).

Los cultivos se incubaron hasta alcanzar una densidad óptica (OD600) entre 0,6 y 0,8,

momento en el cual se adicionó Isopropil-beta-tio galactopiranósido (IPTG) en concentración

0,1 mM y se permitió el crecimiento por 16 horas a 37°C. Se tomaron alícuotas de 1 mL justo

antes de la inducción (tiempo 0) y a las 2, 4 y 16 ó 3 y 16 horas post inducción. Estas alícuotas

se centrifugaron a 1000 x g por 5 minutos, el sedimento se solubilizó en buffer carga 1X para

SDS-PAGE y las proteínas se denaturaron a 95°C por 5 min. El extracto obtenido se corrió en

geles denaturantes de acrilamida del 10 % y las proteínas recombinantes se detectaron por

tinción con azul de coomassie y/o WB. La aparición de bandas de aproximadamente 60, 55,

43, 52 y 19 kDa en los ensayos de SDS-PAGE, confirmó la producción de las proteínas

recombinantes GST-GAP451-204, GST-MTIP1-204, GST-GAP5026-175, GST-MyoA227-476 e His-

MyoB357-502, respectivamente, en las cepas probadas (Figura 4-13). Sin embargo, se

observaron diferencias significativas en la cantidad de proteína producida dependiendo de la

cepa hospedadora y del tiempo de incubación.

En CodonPlus la expresión de GST-GAP451_204, GST-MTIP1-204, GST-GAP5026-175 e His-MyoB357-

502 fue mucho mayor que en pG-KJE8 (Figura 4-13). La recombinante GST-PfGAP451_204 tuvo

el mismo peso molecular de una de las chaperonas moleculares (groEL) expresada en la cepa

pG-KJE8, lo que ocasionó sobrelapamiento de bandas, por ello en el tiempo cero se observa

una banda, la cual corresponde a la chaperona; la expresión de la recombinante se confirmó

mediante WB observándose expresión débil en este sistema. E. coli pG-KJE8 no fue capaz de

expresar GST-MTIP1-204 e His-MyoB357-502, a diferencia de las otras tres proteínas (Figura 4-

13).




Figura 4-13. Expresión de 5 proteínas recombinantes en dos cepas de E. coli BL21.

La producción de cada proteína recombinante se indujo con IPTG 100 µM y se monitoreó a las 2, 4 y 16

horas y para MyoB con IPTG 1 mM a las 3 y 16 horas. Las células fueron recolectadas y resuspendidas

en buffer de carga 1X e incubadas a 95°C por 5 min. Las muestras fueron corridas en gel de acrilamida

al 10 % ó 12 % en condiciones denaturantes y la presencia de la proteína de interés se verificó por

tinción con azul de Coomassie y/o por WB con anti-GST de los carriles 0, 2, 4 y 16 en GAP45 y MyoA.

M: Marcador de peso molecular en kDa (Sigma). En la parte superior se especifica la cepa y el tiempo

de inducción (horas). C: Control-células que solo expresan el tag de GST (27 kDa). La flecha negra (o

roja para His-PfMyoB) indica la proteína de interés: GST-PfGAP451-204 (~60 kDa), GST-PfMTIP1-204

(~55 kDa), GST-PfGAP5026-175 (~43 kDa), GST-PfMyoA227-476 (~52 kDa) y His-PfMyoB357-502 (~19 kDa).

Los pesos moleculares de las recombinantes se calcularon comparando el Rf de la proteína con el de

las proteínas de peso molecular conocido (marcador de peso). La cepa E.coli pG-KJE8 sobre-expresa 5

chaperonas moleculares: dnaK ( 70), groEL ( 60), dnaJ ( 40), grpE ( 22) y groES ( 10). Todas las

proteínas recombinantes fueron expresadas en ambas cepas de E.coli, excepto GST-PfMTIP1-204 e His-

MyoB357-502 que no se produjeron en E. coli BL21 pG-KJE8. En los WB no se observó señal en el tiempo

0 pero si en los tiempos post inducción con IPTG.

En cuanto al tiempo de incubación para el sistema CodonPlus, tenemos que GST-GAP451-204

se expresó desde las 2 horas post inducción; sin embargo, a las 16 horas se observó

disminución de la señal, lo que sugiere degradación proteolítica. GST-MTIP1-204 se expresó

bastante bien desde las 2 horas y fue en aumento hasta las 16 horas. Para GST-GAP5026-175, la

expresión fue considerablemente mayor con respecto a las otras dos recombinantes, la

proteína se produjo en gran cantidad desde las 2 horas y se mantuvo así hasta las 16 horas.

En el caso de His-MyoB357-502, solo se evaluaron 2 puntos de tiempo, 3 y 16 horas post-

inducción; y en ambos puntos la proteína se expresó bien (Figura 4-13). La expresión de GST-

MyoA227-476 no aumentó en la cepa CodonPlus y fue casi indetectable con azul de coomasie;

por el contrario, en la cepa pG-KJE8 la síntesis de la proteína fue evidente entre las 2 y las 4

horas de incubación (Figura 4-13).

La expresión de las recombinantes His-MyoB357-502 y GST-MyoA227-476 también se evaluó a

30°C; para His-MyoB357-502 se observó aumento de la expresión respecto a la obtenida a 37°C,

siendo mayor a las 16 horas. Para GST-MyoA227-476 no hubo diferencias significativas en la

expresión.

4.2.2.3 Análisis bioinformático

El contenido de A/T de las secuencias que codifican las cinco proteínas recombinantes fue de

alrededor del 65% en todos los casos. El peso molecular teórico y el pI de las recombinantes

GST-MyoA227-476, GST-MTIP1-204, GST-GAP451-204, GST-GAP5026-175 e His-MyoB357-502 fueron



54,6 kDa/5,67, 49,8 kDa/4,71, 49,9 kDa/4,83, 43,6 kDa/6,33 y 19,4 kDa/5,05,

respectivamente. La herramienta PEPSTATS encontró 70, 77, 90, 51 y 27 aminoácidos ácidos

equivalentes al 15%, 18%, 21%, 13% y 16% del total de aminoácidos en las proteínas

mencionadas. Se calculó la frecuencia de los diez codones más raros en E. coli cepa B para

cada proteína recombinante producida, utilizando la base de datos del uso del codón, Codon

Usage Database (https://www.kazusa.or.jp/codon/); los 10 codones fueron AGG, AGA, CCC,

CGA, CUA, UGU, AUA, CGG, CCU y UGC (Tabla 4-2).

Tabla 4-2. Frecuencia de codones raros en las cinco proteínas recombinantes y dos tags

La frecuencia de diez codones (codones menos usados en E. coli cepa B) fue calculada para cada

proteína recombinante y dos tags. Los 4 primeros codones de la izquierda corresponden a los 4 ARNt

que son suplementados por la cepa CodonPlus. El tag 6His no contiene cualquiera de estas tripletas.

4.2.2.4 Evaluación de la solubilidad de las proteínas recombinantes

4.2.2.4.1 Efecto de la cepa

Una vez se establecieron las condiciones óptimas para la producción de cada recombinante,

se procedió a evaluar su solubilidad; para ello se prepararon extractos proteicos en

condiciones no denaturantes y se evaluó la presencia de la proteína de interés tanto en el

extracto citosólico como en el sedimento. GST-GAP451-204 y GST-MTIP1-204 se encontraron

tanto en la fracción citosólica como en el sedimento, mientras que GST-GAP5026-175, GST-

Aminoácido / Codon / Frecuencia por mil en E. coli cepa B

Arg Arg Ile Leu Arg Pro Cys Arg Pro Cys

AGG AGA AUA CUA CGA CCC UGU CGG CCU UGC

2,1 2,4 5,0 3,4 2,4 2,4 4,2 5,0 5,8 5,8

Proteína recombinante

Frecuencia por cien en cada proteína recombinante (%)

GST-MTIP1-204 0,23 0,7 2,33 0,47 0,7 0,47 1,63 0 1,86 0,47

GST-GAP451-204 0 1,86 2,09 0,47 0,47 0,93 2,33 0 2,33 0,23

GST-GAP5026-175 - 1,06 2,39 0,80 0,53 0,53 0,80 - 1,86 0,27

GST-MyoA227-476 0,42 1,89 3,15 0,42 0,42 0,42 1,05 - 1,47 0,21

His-MyoB357-502 - 1,17 7,06 1,17 - - 1,17 - 1,17 -

Etiqueta Frecuencia por cien en cada etiqueta (tag) (%)

GST-tag 0 0,88 1,77 0,88 0,88 0,88 1,33 0 2,65 0,44

6His-tag - - - - - - - - - -


MyoA227-476 e His-MyoB357-502 en el sedimento (Figura 4-14); estas tres proteínas sólo fueron

solubles en presencia de agentes caotrópicos fuertes como la guanidina-HCl 8M, lo que indicó

que forman agregados proteicos insolubles o cuerpos de inclusión (CI). No se observó un

efecto en la solubilidad de GST-GAP451-204, GST-GAP5026-175 o GST-MyoA227-476 al utilizar

como cepa hospedadora la cepa que co-expresa chaperonas ya que no se observó incremento

de la producción de la proteína en la fracción soluble con respecto a la fracción particulada.

Figura 4-14. Evaluación de la solubilidad de las proteínas recombinantes

Los clones GST se crecieron a 37°C y el clon His-MyoB a 30°C, se cosecharon luego de 2 (GST-MyoA227-

476 y GST-GAP451-204) ó 16 horas de inducción (GST-MTIP1-204, GST-GAP5026-175 e His-MyoB357357-502). Se prepararon extractos a partir de 5 mL de cultivo bacteriano y la presencia de la proteína de interés en la fracción soluble (S) y/o en el sedimento (P) se detectó por SDS-PAGE y WB con anti-GST. M: marcador de peso molecular (Sigma). GST-GAP451-204 se encuentra en ambas fracciones, GST-MTIP1-204 se encuentra mayormente en la fracción soluble y GST-GAP5026-175, GST-MyoA227-476 y His-MyoB357-502 se encuentran en el sedimento.

4.2.2.4.2 Efecto de la temperatura en la solubilidad de las proteínas recombinantes

expresadas en la cepa pG-KJE8

Dado que la actividad y expresión de algunas chaperonas de E. coli son incrementadas a

temperaturas alrededor de 30°C, que las interacciones hidrofóbicas que conllevan a la

agregación son fuertemente dependientes de la temperatura, y que la reducción de la

temperatura al momento de la inducción ha sido utilizada favorablemente para mejorar la

solubilidad de las proteínas recombinantes (Donovan et al., 1996; Jonasson et al., 2002;

Sørensen y Mortensen, 2005), se hizo un ensayo de expresión incubando a 30°C los clones de

la cepa pG-KJE8 productores de GST-MyoA227-476 y GST-GAP5026-175. A pesar de esta



modificación, no se observó un aumento en la solubilidad de ninguna de las dos proteínas

(Figura 4-15).

Figura 4-15. Efecto de la temperatura sobre la solubilidad de GST-GAP50 y GST-MyoA

Los plásmidos recombinantes para MyoA y GAP50 mantenidos en la cepa E.coli pG-KJE8 se crecieron a

30°C y se cosecharon a las 2h en el caso de GST-MyoA y a las 16 h para GST-GAP50. Se prepararon

extractos a partir de 5 mL de cultivo bacteriano y la presencia de la proteína de interés se detectó por

SDS-PAGE y WB con anti-GST en la fracción soluble (S) y/o en el sedimento (P). M: marcador de peso

molecular (Sigma). En ambos casos la solubilidad de la proteína no mejoró cuando los cultivos se

crecieron a 30°C, encontrándose siempre en el precipitado. La mayor expresión de las proteínas se

produjo a 37°C.

4.2.2.5 Purificación de proteínas recombinantes

Con base en los resultados previos se escaló el cultivo a 1 L para obtener suficiente materia

prima para iniciar el proceso de purificación. La proteína GST-MTIP1-204 soluble se purificó

por cromatografía de afinidad y aunque en el SDS-PAGE se evidenciaron otras bandas de

menor tamaño, siempre GST-PfMTIP1-204 se encontró en mayor cantidad respecto a las demás

especies. Las bandas de diferentes pesos moleculares corresponden muy probablemente a

proteínas truncadas o degradadas cuyo tag GST en el extremo amino, permitió co-purificarlas

en la cromatografía de afinidad y reconocerlas con el anticuerpo anti-GST. Por otro lado,

aunque GST-GAP451-204 se detectó en el extracto citosólico, no pudo ser purificada por

afinidad con la resina glutatión–agarosa y fue necesario extraerla desde geles de acrilamida.

De GST-MTIP1-204 se obtuvieron 7 mg, mientras que de GST-GAP451-204 se recuperó tan solo 1

mg. GST-MyoA227-476, GST-GAP5026-175 e His-MyoB357-502 se solubilizaron a partir de cuerpos


de inclusión con guanidina-HCl (8M) y se analizaron por SDS-PAGE. GST- MyoA227-476 e His-

MyoB357-502 a diferencia GST-GAP5026-175, presentaron proteínas contaminantes, por lo cual

fue necesario extraerlas desde geles de acrilamida. De GST-GAP5026-175 se recuperaron

alrededor de 3,2 mg, mientras que de GST-MyoA227-476 e His-MyoB357-502 se recuperaron 800 y

1500 µg, respectivamente. Una vez purificadas, todas las proteínas se confirmaron mediante

WB con anti-GST y para el caso de MyoB, con anti-His (Figura 4-16).

Figura 4-16. SDS-PAGE de las 5 recombinantes purificadas y WB con anti-GST y Anti-His

Panel de la izquierda: SDS-PAGE: gel teñido con azul de coomassie mostrando las 5 proteínas

recombinantes purificadas. Las flechas rojas corresponden a las recombinantes GST y la flecha verde

corresponde a His-MyoB357-502. Panel de la derecha: WB de las proteínas recombinantes GST y His

revelado con anti-GST y anti-His respectivamente, usando un sistema de amplificación (anti-IgG-

biotina/streptavidina-fosfatasa alcalina).

En resumen, se produjeron cinco proteínas recombinantes en un sistema de expresión

procariote, las cuales fueron expresadas como proteínas de fusión, cuatro con el tag GST y

una con el tag 6xHis. En el caso de GST-GAP451-204 y de GST-MTIP1-204 las proteínas se

expresaron completas y éstas fueron solubles, mientras que para GST-GAP5026-175, GST-

MyoA227-476 y His-MyoB357-502 se expresó una parte de la proteína y las tres fueron insolubles.

Para PfMyoA y PfMyoB se expresó un segmento correspondiente a la región de la cabeza de

la miosina. Todas las proteínas fueron usadas como inmunógenos para la producción de

anticuerpos, herramienta fundamental para el desarrollo de este trabajo.



4.2.3 Discusión

Las particularidades de cada proteína juegan un papel importante al momento de

expresarlas; la dificultad en la expresión de proteínas del parásito P. falciparum en sistemas

heterólogos se correlaciona fuerte e independientemente con características físicas de éstas

como el peso molecular, el grado de desorden de la estructura, el punto isoeléctrico (pI) y la

carencia de homología con proteínas de E. coli (Mehlin et al., 2006). Así, a mayor peso

molecular, mayor pI o mayor desorden de la estructura, menor posibilidad de expresar la

proteína. El pI también fue correlacionado con la solubilidad de la proteína, observándose

una mayor tendencia a la insolubilidad cuando éste se vuelve más básico; los pIs por debajo

de 6 tienen mayor probabilidad de generar proteínas solubles (Mehlin et al., 2006). En este

trabajo se expresaron 5 proteínas y al revisar algunos de los parámetros mencionados por

Mehlin, éstas se encontraron en rangos de pI y peso molecular donde se esperaría una

adecuada expresión. GST-GAP5026-175, GST-MyoA227-476 y His-MyoB357-502 tuvieron los pI más

altos de las 5 recombinantes (6,33, 5,67 y 5,05, respectivamente) y justamente estas tres

proteínas se produjeron como agregados proteicos. GST-GAP451-204 y GST-PfMTIP1-204, las

cuales se encontraron en la fracción citoplasmática tuvieron pI de 4,83 y 4,71,

respectivamente.

Las proteínas GST-PfGAP451-204, GST-PfGAP5026-175 y GST-PfMyoA227-476 fueron expresadas en

las dos cepas de E. coli, mientras que GST-PfMTIP1-204 y His-PfMyoB357-502 solo pudieron ser

expresadas en una cepa. De las dos cepas probadas, CodonPlus mostró la expresión más

eficiente para cuatro de las cinco recombinantes. Esta cepa posee un plásmido que contiene

copias extras de los genes argU, ileY y leuW, los cuales codifican tARNs específicos para los

codones arginina (AGA/AGG), isoleucina (AUA) y leucina (CUA), codones poco frecuentes en

E. coli. Así, la co-expresión de este plásmido provee a la bacteria con un suplemento de tARNs

específicos para codones propios del parásito. Al hacer un análisis de las secuencias clonadas,

se encontró que AGA es el codón más usado para arginina, AUA y AUU para isoleucina y UUA

para leucina. Cuando se compara la frecuencia de uso del codón entre P. falciparum y E. coli,

los codones AGA y AUA son usados 6,6 y 10 veces más por Plasmodium. Esta gran diferencia

en el uso del codón explica por qué en la cepa CodonPlus, la expresión de las proteínas GST-

PfMTIP1-204, GST-PfGAP451-204 y GST-PfGAP5026-175 está aumentada, comparada con la

expresión en la cepa pG-KJE8, que solo cuentan con niveles basales de estos tARNS. Lo


anterior pone de manifiesto la utilidad de la cepa CodonPlus en la expresión de proteínas de

P. falciparum y concuerda con lo reportado en otros estudios (Baca y Hol, 2000; Karmodiya et

al., 2005).

Para GST-PfMyoA227-476, no se observó un aumento significativo de la expresión en la cepa

CodonPlus. Aunque no hay parámetros que predigan con exactitud si la expresión de un gen

heterólogo en E. coli será afectada o no por el uso del codón, se ha propuesto que puede

haber baja o nula expresión si la frecuencia de al menos un tipo de codón escaso en la

bacteria es ≥3% en la proteína a expresar (Carstens, 2003). En el caso de GST-MyoA227-476 y

His-MyoB357-502 se encontró que el codón AUA, alcanzó una frecuencia del 3,15% y 7,06%

respectivamente, cifras que sobrepasan el valor límite. Estas dos proteínas fueron expresadas

débilmente, especialmente GST-MyoA227-476. Por otro lado, Carstens sugirió que la presencia

de codones raros consecutivos es el factor más importante que incide sobre la expresión de

una proteína heteróloga en E.coli (Carstens, 2003). En MyoA227-476 se encontraron tres casos:

dos dupletes (AUAAGA) y un triplete (AUAAUAAGA), en MyoB357-502 se encontró un triplete

(AUAUGUAGA) y un duplete (AGAAUA), en GAP451-204 se encontró un solo caso (duplete

AGAAGA) y en GAP5026-175 y MTIP1-204 ninguno. Goldman y colaboradores reportaron que el

efecto de codones raros consecutivos sobre la expresión es más notable cuando ellos se

localizan cerca al extremo amino de la proteína, especialmente cuando los codones codifican

para arginina (Goldman et al., 1995). Chen e Inouye explican esta situación como resultado

de la inestabilidad que sufre la maquinaria de síntesis proteica al estar cerca del inicio del

mensaje (Chen e Inouye, 1990). Al analizar las 5 secuencias, solo MyoA227-476 presentó esta

condición en los codones 14-15 y 36-37. Todos los argumentos mencionados ponen de

manifiesto la notable influencia de las características de la secuencia de PfMyoA sobre su

expresión en un sistema heterólogo y cómo a pesar del uso de dos cepas genéticamente

distintas no se logró aumentar en forma importante su producción.

Aunque la cepa CodonPlus favorece la expresión de ciertas proteínas de P. falciparum,

también se ha reportado un efecto negativo: la insolubilidad de las recombinantes. Al hacer

más eficiente la traducción, el conjunto de chaperonas disponibles para asistir el plegamiento

se satura, lo que causa la acumulación y agregación de proteínas mal plegadas en el

citoplasma (Rosano y Ceccarelli, 2009). La cepa E. coli BL21 pG-KJE8 sobre-expresa los dos

complejos multi-componente de chaperonas presentes en E.coli: las proteínas gro, EL (60

kDa) y ES (10 kDa) y el complejo KJE conformado por las chaperonas dnaK, dnaJ y grpE



(Schumann y Ferreira, 2004); de esta manera si hay un plegamiento deficiente por la

saturación del sistema de chaperonas propio de la célula, la presencia de moléculas extra

facilitan el plegamiento adecuado de la proteína, lo cual se ve reflejado en un aumento de su

solubilidad. En nuestro caso, la evaluación de la solubilidad de las proteínas recombinantes

producidas en las dos cepas hospedadoras, arrojó resultados similares, independiente de la

cantidad de proteína producida y de la temperatura de incubación. Así, el uso de un sistema

bacteriano que provee chaperonas extras, no evitó la formación de agregados insolubles de

GST-GAP5026-175 ni de GST-MyoA227-476, lo cual indica que factores adicionales a la cantidad de

proteína producida y a la disponibilidad de la maquinaria encargada del plegamiento,

determinan la solubilidad de una recombinante producida en E.coli. De acuerdo con Wall y

Plϋckthun el papel específico de la coproducción de chaperonas sobre la expresión de un gen

en E. coli no es claro y parece ser específico de cada proteína (Wall y Plϋckthun, 1995).

El propósito principal de producir las 5 recombinantes fue obtener proteína suficiente para

inmunizar animales y generar anticuerpos. Para esto se probaron diferentes cepas de E. coli,

no sólo para establecer la cepa y las condiciones en las cuales se obtenía la expresión más

eficiente, sino también buscando la expresión de las recombinantes de forma soluble. Los

resultados indicaron que el uso de las cepas E. coli genéticamente modificadas favoreció la

expresión de la mayoría de las proteínas (4 de 5), pero no su solubilidad. Todo lo anterior

puso de manifiesto que no hay un método universalmente aplicable a la expresión de

proteínas de Plasmodium y que cada proteína tiene características intrínsecas que la hacen

única e impiden generalizar las estrategias de expresión heteróloga.

4.3 Producción y evaluación de anticuerpos policlonales

4.3.1 Métodos

Todos los procedimientos realizados en los animales de experimentación conducentes a la

producción de los anticuerpos, se realizaron en el bioterio del Instituto Nacional de Salud, y

fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de

Laboratorio-CICUAL del INS, de acuerdo con el acta No. 9 de 2010 y por el Comité de Etica de

la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional según acta No. 5 de 2010.


4.3.1.1 Esquemas de inmunización

Para la producción de los anticuerpos se utilizaron los modelos murino y lagomorfo (conejo).

Las proteínas recombinantes GST-MyoA227-476, GST-MTIP1-204, GST-GAP451-204, GST-GAP5026-

175 y His-MyoB357-502 purificadas se usaron como antígeno para la producción de anticuerpos;

así, por cada proteína se inocularon 3 ratones hembra BALB/c de 5 - 6 semanas de edad por

vía intraperitoneal. Un cuarto ratón fue dejado como control sin inoculación. El esquema de

inmunización consistió en tres dosis de antígeno administradas los días 1, 14 y 35, la primera

dosis con 100 µg de proteína en adyuvante completo de Freund´s y dos refuerzos con 50 µg

de antígeno en adyuvante incompleto. El máximo volumen inoculado por ratón fue de 400 µL.

El día 42 se hizo sangría en blanco mediante punción cardíaca y uso de anestesia (Harlow y

Lane, 1988). Una vez la sangre obtenida en la punción se coaguló, se centrifugó por 10 min a

2500 rpm y el suero obtenido se guardó en alícuotas a -70 °C con 10% de glicerol estéril.

La producción de los anticuerpos en conejo se realizó con el siguiente protocolo: las

proteínas recombinantes purificadas GST-MTIP1-204, GST-GAP5026-175 y His-MyoB357-502 se

inocularon por vía intradérmica en dos conejos cepa Nueva Zelanda con un peso aproximado

de 1000-1500 gramos. El esquema de inmunización consistió en cuatro inoculaciones por

conejo los días 1, 30, 60 y 90. La primera inyección se hizo con 200 μg de proteína en

adyuvante completo de Freund’s y los tres refuerzos con adyuvante incompleto y 100 μg de

antígeno. Antes de la primera inoculación se tomó una muestra de sangre de los conejos para

obtención del suero pre-inmune. El día 40 se practicó una sangría parcial, con el propósito de

hacer un seguimiento a la producción de anticuerpos. El día 96 se hizo sangría en blanco

mediante punción cardíaca y uso de anestesia (Harlow y Lane, 1988). La especificidad de los

anticuerpos se evaluó mediante WB contra cada proteína recombinante y posteriormente, se

realizó la detección de las respectivas proteínas en extractos del parásito.

4.3.1.2 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de western blot (WB)

4.3.1.2.1 Detección de proteínas recombinantes

El protocolo de WB que se describe a continuación se usó a lo largo del desarrollo de este

trabajo; sin embargo, cada WB tuvo sus particularidades en cuanto a la dilución del

anticuerpo primario, la concentración del Tween 20 y de la leche descremada en los buffers

de bloqueo y de lavado, y el conjugado usado. El protocolo general consistió en la



electrotransferencia a membranas de PVDF o nitrocelulosa de las proteínas recombinantes

previamente separadas mediante SDS-PAGE. La detección de cada recombinante se hizo

mediante la adición de su correspondiente anticuerpo primario (el anticuerpo producido),

seguido de la adición del anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina (FA) o

peroxidasa de rábano (HRP por sus siglas en ingles “horseradish peroxidase”). Finalmente, se

agregó el sustrato específico para cada enzima.

Cada proteína recombinante purificada (250 ng) fue resuspendida en buffer carga para SDS-

PAGE e incubada a 95 °C durante 5min. Las proteínas se sembraron en geles de

poliacrilamida del 9-12% y se resolvieron por electroforesis vertical, la cual se corrió en

buffer de electroforesis13 a voltaje constante (80 voltios gel concentrador y 120 voltios gel

separador). Las proteínas presentes en el gel se transfirieron a membranas de PVDF

(Immobilon P-Millipore, Darmstadt, Alemania) o Nitrocelulosa (Thermo Scientific, Rockford,

IL, USA) empleando buffer de transferencia14 durante 16 horas a 30mA ó durante 1 hora a

200mA y al cabo de este tiempo, la membrana se bloqueó con una solución de leche

descremada en TBST15 durante toda la noche. La detección de cada proteína se realizó

mediante la adición del anticuerpo específico producido en ratón (para las cinco proteínas) o

en conejo (para GST-MTIP1-204, GST-GAP5026-175 y His-MyoB357-502). El exceso de anticuerpo no

unido se retiró mediante 4 lavados de 10 minutos cada uno con TBST solo o con leche

descremada (porcentaje entre el 3% y 5% dependiendo del anticuerpo usado) y luego se

adicionó el anticuerpo secundario (anti-IgG conjugado a FA o a HRP, o anti-IgG

covalentemente unido a biotina). El exceso de anticuerpo se retiró mediante 4 lavados de 10

min con TBST y se procedió a revelar o se continuó con el sistema de amplificación mediante

la adición de estreptavidina conjugada a una enzima. Mediante 4 lavados con TBST se retiró

el material no unido y se reveló con el sustrato apropiado para la enzima: Nitro Blue

Tetrazolium/Bromo Cloro Indolil Fosfato, (NBT/BCIP) (Sigma, Saint Louis, MO, USA) para FA

y 3,3' Diaminobencidina (DAB) (Sigma, Saint Louis, MO, USA) para HRP.

13 Buffer de electroforesis- SDS-PAGE: Tris 25mM pH 8,3, Glicina 192mM y SDS al 1%. 14 Buffer de transferencia: Tris 25mM pH 8,3, Glicina 192mM y metanol 10% v/v. 15 Buffer de lavado: TBST: Tris 20mM pH 7,5, NaCl 150mM, Tween 20 al 0,1 ó 0,05% v/v


4.3.1.2.2 Detección de proteínas sobre extractos del parásito

A continuación se evaluó si los anticuerpos producidos eran capaces de detectar las cuatro

proteínas del “glideosoma” y PfMyoB en extractos proteicos del parásito. El extracto del

parásito (25-100 µg) se sometió a SDS-PAGE y posterior transferencia a membrana PVDF o

nitrocelulosa. El bloqueo de sitios inespecíficos se hizo con leche descremada al 5% en

TBST16. Para la detección de las proteínas se probaron tanto los sueros producidos en ratón

como los producidos en conejo y como anticuerpo secundario se usó anti-IgG hecho en ratón

o anti-IgG hecho en conejo (dependiendo del origen del anticuerpo primario), conjugados a

FA o HRP. El exceso de anticuerpo se retiró mediante 4 lavados de 10 min con el mismo

buffer y se procedió a revelar por reacción colorimétrica o quimioluminiscente. En esta

última, HRP cataliza la oxidación del luminol en presencia de peróxido de hidrógeno (H2O2),

reacción que genera luz. Para detectar esta reacción, se colocó una película fotográfica sobre

la membrana; así, la exposición a la luz que se desprende en esta reacción permite detectar la

actividad enzimática al impresionar la película.

4.3.1.3 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de inmunofluorescencia (IF)

Cultivos sincrónicos de P. falciparum en estadio de esquizontes y parasitemia superior al 3%

fueron lavados 2 veces con PBS17 a 1100 x g por 5 minutos. El procedimiento de preparación

de las células y el ensayo de inmunofluorescencia se realizaron a temperatura ambiente. Un

mililitro de eritrocitos parasitados al 5% de parasitemia y hematocrito del 10% fue fijado con

paraformaldehido18 (Polysciences, Warrington, PA, USA) al 4% y glutaraldehído19 (Sigma,

Saint Louis, MO, USA) al 0,0075%, durante 30 minutos en rotación. Las células fijadas fueron

lavadas 2 veces con PBS y entonces permeabilizadas con Triton X-100 a una concentración

final de 0,1%20 durante 10 min en rotación. El detergente se eliminó mediante 2 lavados con

PBS y los eritrocitos se trataron con borohidruro de sodio (NaBH4) preparado fresco en PBS a

una concentración final de 0,1 mg/mL durante 10 min para reducir cualquier grupo aldehído

libre. Las células se lavaron 2 veces con PBS y se procedió al bloqueo de sitios inespecíficos

16 TBST: Tris 20mM pH 7,5, NaCl 150mM, Tween 20 al 0,1 ó 0,05% v/v 17 PBS-buffer fosfato salino: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2P04 2 mM, pH 7,4 18 Paraformaldehido grado microscopia electrónica. Solución al 4% en PBS, pH 7,4 y filtrada por membrana de 0,45 µM 19 Glutaraldehído grado I. Solución stock al 2,5% en PBS 20 Triton X-100 al 0,1% en PBS

https://es.wikipedia.org/wiki/Per%C3%B3xido_de_hidr%C3%B3geno

https://es.wikipedia.org/wiki/Pel%C3%ADcula_fotogr%C3%A1fica



con albúmina de suero bovino, BSA (Sigma, Saint Louis, MO, USA) al 3% en PBS por 1 hora.

Las células se centrifugaron, se retiró el sobrenadante y se adicionó 1 mL del anticuerpo

primario en dilución 1:100 en solución de bloqueo durante 1 hora en rotación. Las células se

lavaron 3 veces con PBS durante 1 minuto a 8000 rpm para remover el exceso de anticuerpo

y se agregó el correspondiente anticuerpo secundario marcado con Alexa fluor (anti-IgG

ratón/alexa 488 o anti-IgG conejo/alexa 488 ó 594) en dilución 1:1000 en solución de

bloqueo durante 1 hora en rotación. Diez minutos antes de completar la hora se adicionó un

colorante fluorescente de ADN como Dapi o Hoechst a una concentración final de 0,1 µg/mL y

finalmente los eritrocitos fueron lavados nuevamente 3 veces con PBS a 8000 rpm (Tonkin et

al., 2004). Durante el periodo de incubación, láminas portaobjetos y cubreobjetos nuevas

fueron tratadas con una solución de poli-L-lisina al 0,1% en agua, colocando 1 ó 2 gotas que

se extendieron para cubrir la lámina y se dejaron secar a temperatura ambiente. Sobre estas

láminas se colocaron dos gotas de la suspensión de células obtenida, una en cada extremo y

una más concentrada que la otra, se extendieron con una punta de micropipeta y se dejó

secar la preparación. Luego se adicionó 1 gota pequeña de medio de montaje (VECTASHIELD

hardset antifade, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) y se colocó encima una laminilla

nueva. Las láminas se visualizaron en microscopio de epifluorescencia Axio-imager A2 (Zeiss,

Thornwood, NY, USA) y la adquisición de imágenes se hizo mediante el software ZEN 2012. A

la par se hizo el mismo ensayo pero utilizando un suero preinmune como anticuerpo

primario. Vale la pena mencionar que los primeros ensayos se hicieron con un anti-IgG

conejo marcado con Isotiocianato de Fluorosceína (FITC) y un anti-IgG ratón marcado con

Isotiocianato de Tetrametil Rodamina (TRITC) y posteriormente se usaron los colorantes

Alexa.

4.3.1.4 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de inmunoprecipitación (IP)

El extracto usado en la IP fue aclarado previamente con proteína G agarosa durante 30

minutos a 4 °C para eliminar proteínas inespecíficas. Brevemente, a 1 mg de extracto

aclarado se le adicionó un volumen igual de buffer de co-inmunoprecipitación21(Co-IP) e

21 Buffer de co-inmunoprecipitación: Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM y Tritón X-100 0,1%.


inhibidores de proteasas (Sigma, Saint Louis, MO, USA) y 10 µL de anticuerpo. Esta mezcla se

incubó por 2 horas a 4 °C en rotación para permitir la formación del complejo antígeno-

anticuerpo, luego se adicionaron 50 µL de proteína G agarosa previamente lavada, durante

toda la noche a 4 °C en rotación. Al día siguiente el microtubo se centrifugó y el

inmunoprecipitado se lavó 10 veces con buffer de Co-IP. Finalmente las proteínas atrapadas

en la resina se procesaron para SDS-PAGE y WB con el mismo anticuerpo con el que se hizo la

IP u otro anticuerpo.

4.3.2 Resultados

La producción de los anticuerpos policlonales en ratón y conejo se realizó de acuerdo con la

metodología descrita previamente. La sangría en blanco para ambos animales se hizo

mediante punción cardíaca bajo anestesia. Los anticuerpos producidos constituyeron una

herramienta clave, proyectada para detectar las proteínas del “glideosoma” en el parásito,

explorar posibles interacciones proteína-proteína y monitorear la expresión en parásitos

“knock-out”.

4.3.2.1 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de western blot (WB)

4.3.2.1.1 Detección de las proteínas recombinantes

Una vez se obtuvieron los sueros de los ratones y los conejos, se hizo un inmunoblot para

probarlos contra los antígenos usados. Para esto, 250 ng/carril de cada una de las cinco

recombinantes fueron sometidos a SDS-PAGE y posterior electrotransferencia a membranas

PVDF o nitroceluosa. Como anticuerpo primario se probaron los sueros obtenidos en la

sangría final de los ratones y conejos. En la figura 4-17 se presentan los resultados de la

inmunodetección, donde se puede apreciar que los anticuerpos producidos reconocen

específicamente cada recombinante.



Figura 4-17. WB sobre las proteínas recombinantes con los anticuerpos producidos

A. Membrana de PVDF. Anticuerpos primarios producidos en ratón: Anti-MTIP 1:20000, anti-

GAP45 1:30000, anti-GAP50 1:15000, anti-MyoA 1:15000, anti-MyoB 1:10000. Anticuerpo

secundario: anti-IgG ratón biotinilado 1:2000. Sustrato NBT/BCIP. GST-MTIP1-204 (55 kDa), GST-

GAP451-204 (60 kDa), GST-GAP5026-175 (43 kDa), GST-MyoA227-476 (52 kDa), 6His-MyoB357-502 (19

kDa). Las flechas señalan las recombinantes. B. Membrana de nitrocelulosa. Anticuerpos primarios producidos en conejo: Anti-MTIP 1:5000,

anti-GAP50 1:2000, anti-MyoB 1:7000. Anticuerpo secundario: anti-IgG conejo biotinilado 1:7500.

HRP-ST 1:10000. GST-MTIP: 55 kDa, GST-GAP50 43 kDa, y 6His-MyoB 19 kDa.


4.3.2.1.2 Detección de las proteínas del parásito

Extractos proteicos del parásito en estadio de esquizonte fueron preparados con buffer E,

sometidos a SDS-PAGE (10-50 µg/carril) y posterior electrotransferencia a membranas de

PVDF o nitrocelulosa. Estas membranas se usaron en ensayos WB con los anticuerpos

producidos en ratón y conejo. Para el revelado se usó un sistema colorimétrico con la enzima

FA o HRP y sus respectivos sustratos. Los anticuerpos generados contra GST-MTIP, GST-

GAP50, GST-GAP45 y GST-MyoA detectaron una banda en ~32 kDa, ~45 kDa, ~50kDa y ~97

kDa, respectivamente. Estos tamaños son similares a los reportados por Jones y

colaboradores (Jones et al., 2006) y corresponden a las proteínas PfMTIP, PfGAP50, PfGAP45

y PfMyoA, respectivamente (Figura 4-18).

Figura 4-18. WB sobre extracto del parásito con los anticuerpos producidos.

Membrana bloqueada con leche descremada al 3% en TBS-Tween al 0,1%. Anticuerpos primarios:

anti-MTIP y anti-MyoA 1:3000 en TBS-Tween al 0,1%+ leche descremada al 3%, anti-GAP50 y anti-

GAP45 1:2000 en TBS-Tween al 0,1%. Anticuerpo secundario: anti-IgG ratón o conejo biotinilado

1:5000 en TBS-Tween al 0,05%. HRP-ST 1:10000 en TBS-Tween al 0,05%. Lavados con TBS-Tween

al 0,1%. Panel de la izquierda, anticuerpos producidos en ratón y panel de la derecha, en conejo.

Para PfMyoB no se obtuvo señal con ninguno de los anticuerpos (ratón y conejo), los cuales

estaban dirigidos contra el segmento comprendido entre los aa 357 a 502 del dominio de

cabeza de PfmyoB. Ante la falta de señal se probó quimioluminiscencia por ser un sistema de

detección más sensible; sin embargo, tampoco se logró detectar a PfMyoB en el extracto del

parásito. En la figura 4-19 se muestran los resultados con el anticuerpo hecho en ratón.



Figura 4-19. WB sobre extractos del parásito con

αMyoB-ratón usando quimioluminiscencia

Membrana de nitrocelulosa bloqueada con TBS-

Tween al 0,05% por 2 horas. Anticuerpos primarios:

Anti-MyoA 1:5000 (ratón), Anti-MyoB 1:500 (ratón)

y pre-inmune 1:500 (ratón) en TBS-Tween al 0,05%.

Anticuerpo secundario: anti-IgG ratón conjugado con

HRP 1:5000 en TBS-Tween al 0,05%. Sustrato:

luminol. La membrana se expuso contra una película

fotográfica y se reveló con dektol (Kodak). Se

observa una señal intensa para PfMyoA en el carril

izquierdo, pero no se observa señal para PfMyoB en

ninguno de los dos carriles (100 y 50 µg).

4.3.2.2 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de inmunofluorescencia (IF)

Para establecer si los anticuerpos producidos tenían la capacidad de inmunolocalizar las

proteínas del “glideosoma” en el parásito, se probaron los anticuerpos anti-MTIP y anti-MyoA

y adicionalmente anti-MyoB en ensayos de IF. En la figura 4-20 se muestra la localización de

MTIP y MyoA en esquizontes de P. falciparum, donde se observa que MTIP y MyoA se

localizan en la periferia de los merozoítos.

Estos hallazgos están de acuerdo con lo reportado en la literatura donde se observa la misma

localización, es decir cerca a la membrana plasmática y el complejo interno de membranas

(Jones et al., 2006; Baum et al., 2006). Con el anticuerpo anti-MyoB no se logró detectar señal

en el parásito.


Figura 4-20. IF sobre parásitos en estadio de esquizontes, usando anti-MTIP producido en conejo y anti-MyoA producido en ratón.

4.3.2.3 Evaluación de los anticuerpos obtenidos: ensayos de inmunoprecipitación (IP)

La ausencia de detección de PfMyoB en los ensayos previos nos llevó a pensar que la cantidad

de PfMyoB podía ser muy baja y que por esta razón no se había podido detectar. Ante esta

posibilidad, se intentó concentrar la proteína mediante IP (Trieu y Targoff, 2015) con el anti-

MyoB. Como control de la técnica se hizo al mismo tiempo una IP con anti-MTIP y con suero

preinmune. En la figura 4-21 se aprecia que el control de la técnica funcionó correctamente,

es decir, el anticuerpo anti-MTIP inmunoprecipitó a MTIP. En cuanto a la IP con anti-MyoB,

en el WB se evidenció una banda ubicada por encima de la banda correspondiente a 97 kDa

(aproximadamente 103 kDa), la cual se pensó podría corresponder a PfMyoB.



Figura 4-21. Inmunoprecipitación con anti-MyoB

En la película de la derecha se muestra la IP con anti-MTIP, usada como control de la técnica. Las

flechas rojas muestran la banda correspondiente a MTIP tanto en la IP como en el extracto del

parásito. En la película de la izquierda se puede observar la IP con anti-MyoB, la flecha blanca señala la

banda que posiblemente es PfMyoB y la flecha roja corresponde a MTIP inmunoprecipitada. S.Pre-I:

Suero pre-inmune, αMTIP: anti-MTIP, αMyoB: anti-MyoB.

Para confirmar la identidad de esta banda, el inmunoprecipitado se resolvió por SDS-PAGE y

el gel se tiñó con el kit SilverSNAP® Stain (for Mass Spectrometry, Pierce, Rockford, IL, USA).

La zona cercana a la banda de 97 kDa del marcador de peso, se cortó del gel y se envió para

análisis por espectrometría de masas (Applied Biomics, Hayward, CA, USA). Ninguna de las

proteínas detectadas correspondió a PfMyoB y de hecho las proteínas con los mayores

niveles de confianza tuvieron pesos moleculares bastante alejados del tamaño esperado

(erythrocyte membrane protein-PM 21882 kDa y conserved Plasmodium protein-PM 221918

kDa).

4.3.2.4 Alternativas para la producción del anticuerpo anti-PfMyoB

Resumiendo los resultados anteriores, se generaron anticuerpos contra las 4 proteínas del

“glideosoma” pero no se logró obtener un anticuerpo contra PfMyoB. Paralelamente en el


laboratorio se intentó producir un anti-PfMyoB en rata usando como inmunógeno tres

proteínas recombinantes de PfMyoB, producidas previamente (Morales et al., 2018;

Hernández et al., 2018). En la figura 4-22, se muestra la ubicación en la secuencia de PfMyoB

de las recombinantes MBP-PfMyoB1-346, MBP-PfMyoB671-801, MBP-PfMyoB740-801 y de la

recombinante His-MyoB357-502. Seis ratas Wistar macho de 5 semanas de edad, fueron

inmunizadas con las proteínas MBP-PfMyoB1-346, MBP-PfMyoB671-801 y MBP-PfMyoB740-801

(dos ratas por recombinante) y una séptima rata, la cual no fue inoculada, se usó como

control de no inmunización. Una vez concluyó el tiempo del esquema de inmunización, las

ratas fueron sangradas en blanco y con los sueros obtenidos se hizo WB contra extractos

proteicos del parásito. No se logró detectar PfMyoB con ninguno de los 6 sueros obtenidos.

MVNKINELNNYFRINSTFINKSENESENFYVWTYKSPNVDLYPDLVFFKCQVLNINGDNYEVKEIS

PETNSVYTVKKEHLFNCNNMVNINSHRLNDMVHQNSAEVLNTLALRYEKNYIYTIAEPMLISVNPY

QVIDTDMNEYKNKSTDLLPPHVYTYAKDAMLDFINTKNSQSIIISGESGSGKTEASKLVIKFYLSG

VREDNDISKTLWDSNFILEAFGNAKTVKNNNSSRYGKYIKIQLDENQNIVSSSIEIFLLEKIRVVS

QEPDERCYHIFYEILKGMNDEMKKKYKIKSEEDYKYISNKSINIPEIDDAKDFENLMISFDKMKMS

DLKDDLFLTLSGLLLLGNIQFNGIEKGGKSNCSELDDENLEVVNEASELLGIDYESLKNSLVITEK

SIANQKIEIPLSIEESLSICRSISKDIYNKIFEYITKRINNFLNNNKELENFIGILDIFGFEIFVK

NSLEQLLINIANEEIHNIYLFVVYEKESNLYKKEGIIIESVKYTNNESIIDLLRGKTSIISILEDN

CLAPGKKDESIVSVYTNKFSKNEHYSVCKKNITESFVIKHTVSDVTYSISNFISKNKDILSPNILK

LLKVSNNKLIQNLYDDAEVTDSLGRKNLITYKYLENLKKICSYLKSTNIYFIKCIKPNETKEKNNF

NPKKVYPQLFSLSIVETLNIKYFFQYKYTFASFLSYYQYLDIAVSNDSSLDEKTKVTMLLERNFDK

DSYKVGHTMVFLKKEAVHKIRDIINSNLKCYRNLCCITSALIMKIKKKRIVEENIKNLQLAQAYFR

KYKYIKEHE

Figura 4-22. Secuencia de las proteínas recombinantes de PfMyoB

Los diferentes formatos corresponden a las 3 proteínas recombinantes con las cuales se intentó

producir un anticuerpo contra PfMyoB: MBP-PfMyoB1-346 (negrita), la secuencia de esta proteína

corresponde al N-terminal del dominio motor de PfMyoB; MBP-PfMyoB671-801 (negrita y cursiva), su

secuencia corresponde al C-terminal del dominio motor de PfMyoB y MBP-PfMyoB740-801, (negrita,

cursiva y subrayado), la cual corresponde al domino de cola (en esta región se encuentra un motivo

IQ, motivo que hace parte del dominio del cuello de las miosinas). La secuencia sombreada correspode

a la recombinante His-MyoB357-502 expresada en este trabajo.

Como último recurso para obtener un anticuerpo anti-PfMyoB, se buscó una opción

comercial para la compra del anticuerpo en la empresa de biotecnología GenScript

(Piscataway, NJ, USA), previo análisis de las regiones inmunogénicas de PfMyoB. Se eligieron

dos péptidos de acuerdo con los valores de antigenicidad, baja hidrofobicidad, facilidad de

síntesis, solubilidad y especificidad para el genoma de P. falciparum. Las secuencias de estos



péptidos se ubicaron entre los residuos 56 a 69 (NGDNYEVKEISPET) y 720 a 733

(LERNFDKDSYKVGH) de PfMyoB y se denominaron P1 y P2, respectivamente (Figura 4-23).

Figura 4-23. Localización de los péptidos P1 y P2.

Se muestra la ubicación de los péptidos P1 y P2 sobre PfMyoB, con los cuales se produjeron los

anticuerpos anti-MyoB-P1 y anti-MyoB-P2, respectivamente.

Los anticuerpos anti-MyoB-P1 y anti-MyoB-P2 fueron producidos (en conejo) y purificados

(por afinidad) (Brown et al., 2015) por GenScript y con éstos se intentó la detección de

PfMyoB sobre extractos del parásito mediante WB e IF. Para todos los ensayos se utilizaron

parásitos en estadio avanzado de desarrollo (>44 horas), teniendo en cuenta que la proteína

no se expresa, ni se detecta en anillos o trofozoitos (Chaparro et al., 2005).

4.3.2.4.1 Ensayos Western Blot (WB) con anti-MyoB-P1 y anti-MyoB-P2.

En un trabajo simultáneo en el laboratorio, se demostró la ineficacia del anticuerpo anti-

MyoB-P1 para detectar a PfMyoB en ensayos de WB e IF sobre extractos de parásitos. Para

evaluar el anticuerpo anti-MyoB-P2, se prepararon extractos proteicos con buffer E, T o RIPA

a partir de cultivos del parásito en estadio de esquizonte, los cuales se resolvieron en SDS-

PAGE (50-100 µg/carril) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante

transferencia húmeda por 16 horas a 20 V. La membrana fue incubada con una solución de

leche descremada al 3% en TBS-twen 0,05% durante 16 horas a 4 °C horas en agitación para

bloquear sitios de unión inespecíficos. El anticuerpo anti-MyoB-P2 se usó en dilución 1:1000

en TBS-tween 0,05% + leche descremada al 3% durante toda la noche en agitación a 4 °C.

Posteriormente se hicieron 3 lavados de 10 min cada uno con TBS-tween 0,05% y se adicionó

el anticuerpo secundario anti-IgG/HRP hecho en conejo en dilución 1:5000 TBS-tween 0,05%

+ leche descremada al 3% durante 1 hora en agitación a temperatura ambiente. Luego la


membrana se lavó 3 veces x 10 min como se indicó previamente y se le adicionó el respectivo

sustrato. En el caso de la detección con sustrato cromogénico, se utilizó DAB (DAB Enhanced

Liquid Sustrate System, Sigma, Saint Luis, MO, USA), la cual al reaccionar con HRP y H2O2,

produce un precipitado café. Para la detección quimioluminiscente se usó luminol (kit

SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Thermo ScientificTM, Rockford, IL, USA),

que en presencia de HRP y H2O2 se oxida y forma 3–aminoftalato, compuesto que emite luz.

Después de reaccionar con el sustrato, la membrana se guardó dentro de un protector

plástico en un cassette para autorradiografía. En el cuarto oscuro se expuso contra una

película (CL-XPosure film, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) durante 5 minutos y al cabo

de este tiempo se reveló el film. En algunos casos la membrana se reveló posteriormente con

DAB. En la figura 4-24 se muestra el resultado del WB con el anticuerpo anti-MyoB-P2, donde

por primera vez, se obtuvo una señal por debajo de la banda de 100 kDa, acorde con el

tamaño esperado para PfMyoB (93 kDa).

Figura 4-24. Western blot con anti-MyoB-P2

sobre extractos del parásito (esquizontes)

Se muestran las membranas correspondientes a

dos WB distintos. En la membrana de la

izquierda, el anticuerpo anti-MyoB-P2 reconoció

a PfMyoB en extractos del parásito (flecha roja).

En la membrana de la derecha, se hicieron dos

WB, uno con anti-MyoA y otro con anti-MyoB.

Nótese la diferencia sutil que hay en el tamaño

de estas dos proteínas, PfMyoA (flecha azul) está

ligeramente por encima de PfMyoB (flecha roja).

4.3.2.4.2 Ensayos de IF con anti-MyoB-P2

Para establecer la localización celular de PfMyoB en el parásito, se hizo IF con anti-MyoB-P2

utilizando la metodología previamente mencionada. En la parte derecha de la figura 4-25 se

observa un esquizonte con al menos 12 merozoitos, lo cual se evidencia por el número de

núcleos (cuadro DAPI). La señal fluorescente para PfMyoB se concentra en un punto

específico de cada merozoito, al parecer en uno de sus polos. La imagen de campo claro

muestra al esquizonte dentro del eritrocito, el cual presenta una zona oscura que



corresponde al pigmento malárico. En el panel izquierdo se presenta un trofozoito en el cual

no hay señal para PfMyoB. Estos hallazgos están de acuerdo con lo reportado por Chaparro y

colaboradores, quienes encontraron que PfMyoB sólo se expresa en esquizontes maduros y

merozoitos libres (Chaparro et al., 2003). Por otro lado, Yusuf y colaboradores encontraron el

mismo patrón puntual (Yusuf et al., 2015).

Figura 4-25. Inmunofluorescencia sobre trofozoitos y esquizontes usando anti-MyoB-P2

Ensayo de inmunofluorescencia utilizando el anticuerpo anti-MyoB-P2 y DAPI. Anticuerpo

secundario anti-conejo acoplado a Alexa 546. Bar: 20 μm.

4.3.2.4.3 Ensayos de IP con anti-MyoB-P2

Teniendo en cuenta los resultados previos, es decir que finalmente se obtuvo un anticuerpo

que podía reconocer a PfMyoB en extractos del parásito, se procedió a evaluar si este

anticuerpo podría funcionar en ensayos de IP, para así poder explorar interacciones entre

PfMyoB y otras proteínas. Para la IP, a 1000 μg del extracto proteico se le adicionaron 10 μL

de anti-MyoB-P2. Luego de realizar el procedimiento ya descrito en métodos, el

inmunoprecipitado fue resuelto mediante SDS-PAGE y posteriormente se hizo transferencia a


membranas de nitrocelulosa. El WB se hizo con anti-MyoB-P2 como se mencionó en el ítem

anterior y como ensayo control se hizo IP con anti-MTIP o anti-MyoA y WB con los mismos

anticuerpos.

En la figura 4-26 se presentan los resultados donde claramente se observa señal para PfMyoB

en el carril donde se cargó extracto del parásito, pero ausencia de señal en los carriles de la

IP. En cuanto a la IP control se observa señal para PfMyoA en la IP con anti-MyoA. Estos

resultados sugieren que el anticuerpo anti-MyoB-P2 no es capaz de inmunoprecipitar a

PfMyoB y por tanto, no es posible identificar proteínas de unión a esta miosina.

Figura 4-26. IP con anti-MyoB-P2

Tanto la membrana como la película corresponden al mismo ensayo. La membrana fue revelada con

sustrato quimioluminiscente y con DAB. La flecha roja indica la banda correspondiente a PfMyoB y

la flecha azul a MyoA. Las bandas intensas a la altura de 55 kDa corresponden a la cadena pesada de

las inmunoglobulinas.

Ante la falta de un anticuerpo capaz de inmunoprecipitar a PfMyoB, se buscó otra alternativa

para tratar de establecer si PfMyoB interactúa con MTIP y para ello se realizó una IP con anti-

MTIP y se reveló con anti-MyoB-P2 y con anti-MyoA como control. En la figura 4-27 se

presentan los resultados de esta IP, donde PfMyoA aparece en el carril revelado con anti-



MyoA, pero no hay señal alguna en el carril revelado con anti-MyoB. Estos resultados revelan

la interacción ya reportada entre MTIP y PfMyoA y nos permiten deducir que PfMyoB no

interactúa con MTIP bajo las condiciones experimentales usadas.

Figura 4-27. IP con anti-MTIP

Tanto la membrana como la película corresponden al mismo ensayo. La membrana fue revelada con

sustrato quimioluminiscente y con DAB. La flecha roja en el carril 3 indica la banda correspondiente a

PfMyoB y la flecha azul en los carriles 1 y 2 a MyoA.

En resumen, se generaron seis anticuerpos policlonales contra PfMyoB usando como

inmunógenos cuatro proteínas recombinantes y dos péptidos sintéticos. Sólo uno de los

anticuerpos logró detectar a PfMyoB en ensayos de WB sobre extractos proteicos del

parásito, pero infortunadamente no fue útil para inmunoprecipitarla. Por esta razón, no fue

posible explorar interacciones entre PfMyoB y otras proteínas. Sin embargo, haciendo uso de

un anticuerpo anti-MTIP se logró establecer que PfMyoB no interactúa con MTIP. Todos los

demás anticuerpos, producidos contra las otras proteínas del glideosoma, reconocieron

específicamente a sus respectivas proteinas blanco.


4.3.3 Discusión

Se produjeron anticuerpos policlonales en diferentes modelos animales (ratón y conejo) a

partir de cuatro proteínas recombinantes. Los cuatro anticuerpos (anti-MyoA, anti-MTIP,

anti-GAP45 y anti-GAP50) reconocieron las recombinantes contra las que fueron producidos

y a las proteínas específicas en extractos del parásito. Simultáneamente, se trabajó en la

generación de un anticuerpo anti-MyoB en ratón, rata o conejo; sin embargo, los anticuerpos

obtenidos solo reconocieron la recombinante usada como antígeno y no lograron detectar la

proteína en extractos del parásito. Posteriormente, se usaron dos péptidos sintéticos para

inmunizar conejos Nueva Zelanda y solo a partir de uno de ellos se logró obtener un

anticuerpo anti-MyoB que tuvo la capacidad de detectar la proteína en extractos del parásito

(mediante WB) y en células fijadas (mediante IF). El anticuerpo, llamado anti-MyoB-P2,

detectó específicamente a PfMyoB y no produjo reacción cruzada con PfMyoA. La señal para

PfMyoB se detectó cerca al marcador de 100 kDa, ligeramente por debajo de la señal

observada para PfMyoA. Por otro lado, el patrón de fluorescencia con anti-MyoA y anti-

MyoB-P2 fue completamente distinto. En el año 2003 (Chaparro-Olaya et al., 2003) y luego en

el año 2015 (Yusuf et al., 2015), dos trabajos describieron para PfMyoB un patrón de

fluorescencia puntual localizado en la región apical de los merozoitos dentro de esquizontes

maduros con más de 10 núcleos. En el presente trabajo también se encontró un patrón

puntual, que se observó en esquizontes maduros. Los patrones de fluorescencia hallados

para PfMyoA y PfMyoB son muy distintos, mientras que PfMyoA se distribuye en la periferia

del merozoito, excepto en el polo apical, PfMyoB tiene una localización apical. Esta diferencia

lleva a pensar que PfMyoB no reemplaza a PfMyoA en el “glideosoma”-MyoA, sino que

PfMyoB puede ser el motor de otro “glideosoma” distinto, como ya se ha reportado en

Toxoplasma gondii (Graindorge et al., 2016).

A pesar de los promisorios resultados en los ensayos WB e IF con el anticuerpo anti-MyoB-

P2, éste no logró inmunoprecipitar PfMyoB en extractos del parásito y por lo tanto no se

pudo establecer con qué proteínas interactúa esta miosina. La IP es un inmunoensayo

comúnmente utilizado para estudiar proteínas en solución; sin embargo, hay dos factores

relevantes que determinan su éxito, uno es la abundancia del antígeno en la preparación

original y otro la afinidad del anticuerpo por el antígeno (Harlow y Lane, 1988). Con relación

al primer factor, PfMyoB parece estar en menor cantidad respecto a PfMyoA, ya que para

lograr su detección en ensayos de WB, siempre fue necesario usar una mayor cantidad de



extracto por carril. Obviamente hay que tener en mente que la afinidad de los anticuerpos

puede variar pero la señal para PfMyoB siempre fue más tenue con respecto a la señal para

PfMyoA. Adicionalmente, los estudios del transcriptoma de los estadíos intraeritrocíticos de

P. falciparum han revelado que la cantidad de transcrito para PfMyoB en esquizontes, es 6

veces más baja que la de PfMyoA o MTIP, lo cual puede indicar que la cantidad de proteína

también puede ser mucho menor (Otto et al., 2010; plasmodb.org). Esta observación sobre la

menor cantidad de PfMyoB en el parásito ha sido discutida tambien en trabajos anteriores

(Yusuf et al., 2015; Hernández et al., 2018). Con relación a la afinidad del anticuerpo, los

ensayos de IP requieren anticuerpos con una afinidad más alta (109 mol-1), mientras que el

WB y la IF funcionan con anticuerpos de menor afinidad (108 mol-1); es posible que la

afinidad del anticuerpo anti-MyoB-P2 esté por debajo del valor requerido y esto explicaría

por qué este anticuerpo no funcionó en ensayos de IP. Adicionalmente, una menor afinidad

del anticuerpo repercute sobre la avidez haciendo que el complejo no sea lo suficientemente

estable para ser inmunoprecipitado.

Finalmente, para investigar si PfMyoB interactúa con MTIP y aprovechando que el anticuerpo

anti-MTIP sí inmunoprecipitaba a su respectivo antígeno, se hizo un ensayo de co-

inmunoprecipitación, en el cual se evidenció que MTIP no interactúa con PfMyoB en

parásitos donde el “glideosoma”-MyoA está intacto. Estos resultados apoyan la idea que

PfMyoB en condiciones normales del parásito no hace parte del “glideosoma”-MyoA, lo cual

permite sugerir que PfMyoB no participa en el proceso de invasión.

4.4 Generación de parásitos “knock-out” para el gen pfmyo-a o el gen pfmyo-b

4.4.1 Métodos

Para silenciar los genes pfmyo-a y pfmyo-b se usaron técnicas de genética reversa que

permitieron anular la expresión de los genes de interés y establecer si son esenciales para la

invasión y supervivencia del parásito. La estrategia usada fue la generación de parásitos

pfmyo-a o pfmyo-b “knock-out” por recombinación homóloga.


4.4.1.1 Diseño de constructos y PCR diagnóstico

Los estadios asexuales de Plasmodium tienen un genoma haploide, característica que permite

la generación de parásitos “knock-out” vía recombinación homóloga. En este trabajo se

diseñaron constructos para ser integrados en el genoma del parásito mediante

recombinación sitio específica; es decir, el gen de interés (pfmyo-a o pfmyo-b) fue

intercambiado por una secuencia modificada del mismo gen. Se generaron dos tipos de

constructos: el “knock-out” y el control del “knock-out”, ambos en el plásmido pHH1 (Crabb y

Cowman, 1996), el cual es ampliamente utilizado para transfección de P. falciparum. El vector

pHH1 (Anexo B) contiene el gen humano de la dihidrofolato reductasa (hdhfr), marcador de

selección positiva que le confiere resistencia al medicamento antifolato WR99210; este gen

está bajo el control del promotor de la calmodulina (CaM) y de la región 3' del gen de la

proteína rica en histidina 2 del parásito (hrp2). Finalmente, la región 3'PbDT corresponde a

la región 3’UTR del gen de la dihidrofolato reductasa-timidilato sintasa de Plasmodium

berghei (Anexo B). Con este vector se espera que la integración del constructo en el

cromosoma del parásito ocurra mediante un evento de recombinación homóloga sencilla.

4.4.1.1.1 Diseño de constructos “knock-out”

Los constructos pHH1-PfMyoA_Knock out y pHH1-PfMyoB_Knock out, denominados pHH1-

AKO y pHH1-BKO, fueron diseñados de tal forma que una vez se lleva a cabo la

recombinación homóloga sencilla con el gen endógeno, se producen dos copias no

funcionales del gen. Para lograr lo anterior, los constructos se diseñaron de modo que

carecían de un codón de inicio (ATG) en su extremo 5’ y contenían un codón de parada

prematuro en el extremo 3’. Así, la primera copia del gen retiene el promotor endógeno y el

codón de inicio, pero su extremo 3’ está alterado por la introducción de un codón de parada

prematuro, mientras que la segunda copia del gen no tiene promotor ni codón de inicio.

Constructo pHH1-AKO

El gen que codifica a PfMyoA se localiza en el cromosoma 13, tiene 2 intrones y un tamaño de

2841 pb. Para construir a pHH1-AKO, el fragmento de PCR de pfmyo-a (714 pb), el cual

portaba en sus extremos las secuencias de reconocimiento de las enzimas BglII y XhoI, se ligó

al plásmido pHH1 previamente digerido con las mismas enzimas de restricción. Este

fragmento se encontraba 1911 pb corriente abajo del primer codón (ATG) en la secuencia de

PfmyoA. En la figura 4-28 se esquematiza el diseño del constructo pHH1-AKO y en la figura 4-



29 se presenta la secuencia del constructo, su ubicación en la secuencia del gen y otros

detalles considerados cuando se diseña un constructo de esta naturaleza.

Figura 4-28. Constructo pHH1-PfMyoA_knock-out

A. Gen endógeno pfmyo-a. B. Constructo pHH1-AKO: el vector pHH1 contiene un fragmento de 714 pb

del gen pfmyo-a, el cual se ubica 1911 pb corriente abajo del codón de inicio (ATG) del gen endogéno y

un codón de parada introducido artificialmente en el extremo 3’. ΔATG denota ausencia de codón de

inicio ATG, STOP prematuro denota la introducción artificial de un codón de parada, 216 pb antes del

codón de parada propio del gen endógeno. C. Constructo integrado en el gen pfmyo-a, producto de un

evento de recombinación homóloga sencilla entre la secuencia del gen pfmyo-a presente en el

plásmido y el gen endógeno: se generan dos copias no funcionales del gen, una copia corresponde a un

fragmento de 2625 pb que contiene un codón de parada prematuro y la segunda copia de 930 pb sin

promotor y con el codón de parada original.

ATGGCTGTTACAAATGAAGAAATAAAAACGGCAAGTAAGATTGTTAGAAGAGTTTCAAATGTAGAAGCATTTGACAAAAGT

GGTTCAGTTTTTAAGgtaatagaattgtatatctttatatacatacatatatttttttttttgtatatgtagttttatttt

tcgcatctcctatatataattgtttacatattttcccaatgtgtattaaaaaaaaaatttttttctttttttttttttctc

atttttttagGGTTATCAAATATGGACTGATATATCTCCGACAATAGAAAATGATCCAAATATTATGTTTGTAAAATGTGT

TGTACAACAAGGATCAAAAAAAGAAAAATTAACCGTTGTACAAATTGATCCACCCGGAACAGGAACTgtaaatgataaacg

aataaaaaaaaaaaaaaaaaatatatatatatatatatataatagaataattatatatacatattgaaaaaaaaaaatata

catgtttatggaattaaacatattcaaatatttatatacttgatgtcttttgagagattatattacatatacatgtatatt

attttttattatattatattatattataattttaatttattttatttacagCCATACGATATTGATCCAACTCACGCATGG

AACTGCAACTCTCAAGTAGACCCCATGTCTTTTGGTGATATTGGTCTTTTAAATCACACCAACATCCCATGTGTTCTTGAC

TTTTTAAAGCACAGATATTTAAAAAATCAAATATACACCACTGCTGTTCCCCTTATTGTTGCAATAAACCCATACAAGGAT

TTAGGAAACACAACTAATGAATGGATTCGTAGATATCGTGATACAGCTGATCATACTAAGTTGCCACCACACGTGTTCACA

TGTGCTAGGGAAGCTTTGTCTAATCTCCATGGTGTAAACAAGAGCCAAACTATTATTGTATCTGGTGAATCTGGTGCAGGA

AAAACCGAAGCAACAAAACAAATCATGAGATATTTTGCTTCTTCTAAGAGTGGAAATATGGATTTACGTATTCAGACAGCA

ATAATGGCTGCAAATCCAGTTCTTGAAGCTTTTGGTAATGCGAAAACTATAAGAAATAACAATTCATCTCGTTTTGGTCGT

TTCATGCAGTTGGTTATATCCCATGAAGGAGGTATAAGATACGGTTCCGTTGTTGCTTTTCTGTTGGAAAAATCTAGAATT

ATTACACAAGATGATAATGAAAGGTCATATCATATATTTTATCAATTTCTTAAGGGTGCAAATAGTACGATGAAATCTAAA


TTTGGTTTAAAAGGAGTTACTGAATACAAATTATTGAACCCAAATTCAACAGAGGTAAGTGGAGTAGATGATGTAAAAGAT

TTTGAAGAGGTAATTGAATCGTTGAAAAATATGGAATTAAGTGAATCAGATATTGAAGTAATATTTTCAATAGTAGCTGGT

ATATTAACATTAGGAAATGTAAGATTAATTGAGAAGCAAGAAGCTGGATTAAGTGATGCTGCTGCTATTATGGATGAGGAT

ATGGGTGTGTTTAATAAAGCTTGTGAATTGATGTATTTAGACCCTGAATTAATAAAAAGGGAAATATTAATTAAGGTAACT

GTTGCTGGAGGAACAAAAATTGAAGGTAGATGGAATAAAAATGATGCAGAAGTGTTGAAATCTTCCTTATGTAAAGCTATG

TATGAGAAATTGTTTTTATGGATAATAAGACATTTGAATTCAAGAATTGAACCAGAAGGAGGATTTAAAACATTTATGGGT

ATGTTAGATATTTTTGGTTTTGAAGTATTTAAAAATAATTCATTGGAACAATTATTTATTAACATTACTAACGAAATGCTT

CAGAAAAATTTTGTAGATATTGTTTTTGAAAGAGAATCAAAATTATATAAAGACGAAGGAATATCAACAGCTGAATTAAA

GTACACCAGTAATAAGGAAGTAATAAACGTACTTTGTGAGAAGGGTAAATCAGTACTTTCATACTTAGAGGACCAATGTTT

AGCACCTGGAGGAACCGATGAAAAGTTTGTAAGTTCCTGTGCTACAAATTTAAAGGAAAATAATAAGTTTACCCCAGCAAA

AGTAGCATCGAATAAAAATTTTATAATACAACATACTATAGGACCAATTCAATATTGTGCTGAAAGCTTTTTGCTTAAAAA

CAAGGATGTCTTAAGAGGTGATTTAGTTGAAGTAATTAAGGATTCCCCCAATCCAATAGTACAACAGTTATTTGAAGGTCA

AGTAATTGAGAAGGGTAAAATAGCTAAAGGTTCATTAATAGGTTCTCAATTTTTAAATCAATTGACATCTTTAATGAACTT

GATAAATAGTACTGAACCACATTTCATACGTTGTATTAAACCAAATGAAAATAAAAAACCATTAGAATGGTGTGAACCAAA

AATATTAATTCAGCTTCATGCCTTATCAATTTTAGAAGCATTAGTATTAAGACAATTAGGATATTCTTATAGAAGAACCTT

TGAAGAATTCTTATATCAATATAAATTTGTGGACATTGCTGCTGCTGAAGATTCATCAGTTGAAAACCAAAATAAATGTGT

TAATATATTAAAGTTGTCTGGACTATCTGAATCCATGTATAAGATAGGAAAAAGCATGGTCTTTTTGAAACAAGAAGGTG

CAAAAATATTGACAAAAATACAAAGAGAGAAACTTGTTGAATGGGAAAATTGTGTGAGTGTAATTGAAGCTGCTATACTTA

AACACAAATACAAACAAAAGGTTAACAAAAATATACCTTCTCTTTTGAGAGTACAAGCTCATATAAGAAAAAAAATGGTAG

CTCAATAA

Figura 4-29. Secuencia del gen pfmyo-a y diseño del constructo pHH1-PfMyoA_knock-out

El gen pfmyo-a tiene un tamaño de 2841 pb. Las letras minúsculas corresponden a los 2 intrones

presentes en el gen. ATG señala la ubicación de los 20 codones ATG presentes en la secuencia,

posiciones que se tuvieron en cuenta al momento de diseñar el constructo, el cual debe carecer de un

ATG inicial. Las CAJAS corresponden a las secuencias de los iniciadores sentido y antisentido. El texto

en ÍTÁLICA Y SOMBREADO corresponde al fragmento de 714 pb que fue clonado en el vector pHH1 y

que corresponde al constructo KO. Las letras subrayadas corresponden a la secuencia del gen que

codifica la región de la cola de la miosina A. TAA corresponde al codón de parada del gen endógeno.

Constructo pHH1-BKO

El gen que codifica para PfMyoB se localiza en el cromosoma 5, tiene 7 intrones y un tamaño

de 3493 pb. Se diseñó un constructo “knock-out” utilizando una región ubicada 1559 pb

corriente abajo del primer ATG presente en el gen. En la figura 4-30 se esquematiza el diseño

del constructo pHH1-BKO y en la figura 4-31 se presenta la secuencia del constructo, su

ubicación en la secuencia del gen y las particularidades consideradas en su diseño.



Figura 4-30. Constructo pHH1-PfMyoB_knock-out

A. Gen endógeno pfmyo-b. B. Constructo pHH1-BKO: el vector pHH1 contiene un fragmento de 918 pb

del gen pfmyo-b, el cual se ubica 1559 pb corriente abajo del codón de inicio (ATG) del gen endogéno y

un codón de parada introducido artificialmente en el extremo 3’. ΔATG denota ausencia de codón de

inicio ATG, STOP prematuro denota la introducción artificial de un codón de parada, 1017 pb antes del

codón de parada propio del gen endógeno. C. Constructo integrado en el gen de miosina b, producto de

un evento de recombinación homóloga sencilla entre la secuencia del gen de la miosina b presente en

el plásmido y el gen endógeno: se generan dos copias no funcionales del gen, una copia corresponde a

un fragmento de 2477 pb que está precedido por el promotor endógeno del gen Pfmyo-b y que

contiene un codón de inicio ATG y un codón de parada prematuro en la posición 2476 y la segunda

copia de 1935 pb sin promotor, sin codón de inicio y con el codón de parada original del gen.

ATGGTGAATAAAATCAACGAATTAAATAATTATTTCAGGATTAATAGTACATTTATAAATAAAAGTGAAAATGAAAGTGAA

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GAAAAAAGTATATCCTCAATTATTTTCTTTATCTATTGTTGAAACGTTAAATATAAAATATTTTTTTCAGTATAAATATAC

GTTTGCTTCTTTCTTAAGTTATTATCAATATTTGGATATTGCTGTTTCAAATGATTCAAGTTTGGATGAAAAAACTAAAGT

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atatatatataatacctttacatatttaacttcttagGTTGGACATACCATGGTATTTTTAAAAAAGGAAGCGGTTCATAA

AATTCGGGATATCATAAATTCCAACTTGAAATGTTATAGAAATTTATGTTGTATAACTAGTGCACTCATCATGAAAATAAA

GAAAAAGAGAATAGTAGAAGAAAACATAAAAAATTTACAACTAGCTCAAGCATATTTTAGGAAATATAAATATATTAAGGA

ACACGAATAA

Figura 4-31. Secuencia del gen pfmyo-b y diseño del constructo pHH1-PfMyoB_knock-out

El gen de la miosina b tiene un tamaño de 3493 pb. Las letras minúsculas de color azul corresponden a

los 7 intrones presentes en el gen. ATG corresponde a la ubicación de los 14 codones ATG presentes en

la secuencia, posiciones que se tuvieron en cuenta al momento de diseñar el constructo pHH1-

PfMyoB_Knock out, el cual debe carecer de ATG inicial. Las letras rojas en negrilla corresponden a las

secuencias de los iniciadores sentido y antisentido. El texto resaltado en azul corresponde al

fragmento de 918 pb que fue clonado en el vector pHH1. Las letras subrayadas corresponden a la

secuencia del gen que codifica la región de la cola de la miosina B. TAA corresponde al codón de

parada del gen endógeno.

4.4.1.1.2 Diseño de constructos control

Los constructos pHH1-PfMyoA_Control y pHH1-PfMyoB_Control, designados pHH1-AC y

pHH1-BC, se diseñaron teniendo en cuenta que una vez ocurre el evento de recombinación

homóloga sencilla se debe generar al menos una copia funcional del gen. Para lograr lo

anterior, los constructos fueron diseñados sin codón de inicio (ATG) en su extremo 5' y con

una extensión que sobrepasada al codón de parada propio del gen de interés, es decir hasta la

región 3' UTR del gen. De ese modo, una de las copias del gen retiene el promotor endógeno,

el codón de inicio y el extremo 3' completo, es decir corresponde a una copia funcional del

gen, mientras que la otra copia no posee promotor ni codón de inicio.



Constructo pHH1-AC

En la figura 4-32 se esquematiza el diseño del constructo pHH1-AC. En la figura 4-33 se

muestra la secuencia del constructo, su ubicación en la secuencia del gen y otros detalles

considerados a la hora de diseñar el constructo control.

Figura 4-32. Constructo pHH1-PfMyoA_Control

A. Gen endógeno pfmyo-a. B. Constructo pHH1-AC: el vector pHH1 contiene un fragmento de 981 pb

del gen PfmyoA, el cual se ubica 1909 pb corriente abajo del codón de inicio (ATG) del gen endogéno.

ΔATG denota ausencia de codón de inicio ATG, STOP denota el codón de parada (TAA) propio el gen

endógeno. C. Constructo integrado en el gen de miosina a, producto de un evento de recombinación

homóloga sencilla entre la secuencia de la miosina a presente en el plásmido y el gen endógeno: se

generan dos copias del gen, una funcional y otra no funcional; en la primera, se reconstituye el gen

completamente y éste no posee ninguna modificación, el gen esta precedido del promotor endógeno

de pfmyo-a y no tiene codones prematuros de parada. La segunda copia corresponde a un fragmento

de 932 pb sin promotor, sin codón de inicio y con codón de parada original.

ATGGCTGTTACAAATGAAGAAATAAAAACGGCAAGTAAGATTGTTAGAAGAGTTTCAAATGTAGAAGCATTTGACAAAAGT

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AACTGCAACTCTCAAGTAGACCCCATGTCTTTTGGTGATATTGGTCTTTTAAATCACACCAACATCCCATGTGTTCTTGAC

TTTTTAAAGCACAGATATTTAAAAAATCAAATATACACCACTGCTGTTCCCCTTATTGTTGCAATAAACCCATACAAGGAT

TTAGGAAACACAACTAATGAATGGATTCGTAGATATCGTGATACAGCTGATCATACTAAGTTGCCACCACACGTGTTCACA


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ATTACACAAGATGATAATGAAAGGTCATATCATATATTTTATCAATTTCTTAAGGGTGCAAATAGTACGATGAAATCTAAA

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TACACCAGTAATAAGGAAGTAATAAACGTACTTTGTGAGAAGGGTAAATCAGTACTTTCATACTTAGAGGACCAATGTTTA

GCACCTGGAGGAACCGATGAAAAGTTTGTAAGTTCCTGTGCTACAAATTTAAAGGAAAATAATAAGTTTACCCCAGCAAAA

GTAGCATCGAATAAAAATTTTATAATACAACATACTATAGGACCAATTCAATATTGTGCTGAAAGCTTTTTGCTTAAAAAC

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ATAAATAGTACTGAACCACATTTCATACGTTGTATTAAACCAAATGAAAATAAAAAACCATTAGAATGGTGTGAACCAAAA

ATATTAATTCAGCTTCATGCCTTATCAATTTTAGAAGCATTAGTATTAAGACAATTAGGATATTCTTATAGAAGAACCTTT

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AATATATTAAAGTTGTCTGGACTATCTGAATCCATGTATAAGATAGGAAAAAGCATGGTCTTTTTGAAACAAGAAGGTGCA

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CAATAAgcataaacaatttttgaaaaaatatacactcatagatgcaacatgtaagtatacaaataaatatggtatgtagag

tacgttataatattgatcaaataa

Figura 4-33. Secuencia del gen pfmyo-a y diseño del constructo pHH1-PfMyoA_Control.

Las letras azules en minúscula corresponden a los 2 intrones presentes en el gen. ATG o ATG

corresponde a la localización de los 20 codones ATG presentes en la secuencia, posiciones que se

tuvieron en cuenta al momento de diseñar el constructo, el cual debe carecer de ATG. Las letras rojas

en negrilla corresponden a las secuencias de los iniciadores sentido y antisentido. El texto resaltado en

amarillo corresponde al fragmento de 981 pb que fue clonado en el vector pHH1. Las letras

subrayadas corresponden a la región de la cola de la miosina A. TAA corresponde al codón de parada

del gen endógeno. Las letras en marrón corresponden a la región 3' no traducible (3' UTR) del gen de

la miosina a.

Constructo pHH1-BC

En la figura 4-34 se muestra un esquema con el diseño del constructo pHH1-BC y en la figura

4-35 se presenta la secuencia del gen pfmyo-b y la ubicación del inserto.



Figura 4-34. Constructo pHH1-PfMyoB_Control

A. Gen endógeno pfmyo-b. B. Constructo pHH1-BC: el vector pHH1 contiene un fragmento de 904 pb, el

cual se ubica 2628 pb corriente abajo del codón de inicio (ATG) del gen pfmyo-b. ΔATG denota

ausencia del codón de inicio ATG, STOP denota el codón de parada (TAA) propio el gen endógeno. C.

Constructo integrado en el gen de miosina b, producto de un evento de recombinación homóloga

sencilla entre el plásmido y el gen endógeno: se generan dos copias del gen, una funcional y otra no

funcional; en la primera se reconstituye el gen completamente y éste no posee ninguna modificación,

está precedido por el promotor de myob y contiene la secuencia de parada del gen. La segunda copia

corresponde a un fragmento de 866 pb sin promotor, sin codón de inicio y con el codón de parada

original.

ATGGTGAATAAAATCAACGAATTAAATAATTATTTCAGGATTAATAGTACATTTATAAATAAAAGTGAAAATGAAAGTGAA

AATTTTTATGTGTGGACATATAAAAGTCCAAATGTTGATCTATATCCTGATTTGGTTTTTTTTAAATGTCAAGTTCTTAAT

ATAAATGGAGATAATTATGAGGTAAAAGAAATATCTCCTGAAACTAACAGTGTATATACGGTGAAAAAGGAACATTTATTT

AATTGCAATAATATGGTAAATATAAATAGTCATCGATTAAATGATATGGTTCATCAAAACTCAGCAGAGGTATTAAACACT

TTAGCTTTAAGATATGAAAAGAATTATATATATACTATAGCTGAGCCAATGCTAATATCGGTAAATCCTTATCAAGTAATT

GATACTGATATGAATGAGTATAAGAATAAGAGCACAGATTTATTACCACCTCACGTGTATACATATGCAAAGGATGCAATG

CTTGATTTTATAAATACAAAAAATAGTCAGTCAATAATTATAAGTGGAGAAAGTGGATCAGGAAAAACAGAAGCATCCAAA

CTTGTAATCAAATTTTATTTATCTGGTGTTAGGGAGGATAATGATATATCAAAAACGTTATGGGACTCGAACTTTATATTG

GAGgtgggaagacaatacataaatatataaataaataaataaataaataaataaataaatatatatatatatatatatata

tatgtatatacgtatatctcttttttatgatattttaattagGCGTTTGGTAATGCAAAAACTGTAAAGAACAATAATTCC

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GAAAAAATAAGAGTAGTATCACAGgttaattgaaataaataatatacatatatatgtatgtatatgtgactatatttatat

atttatatatttacatatttacatattttatcttataattttaaaaataatagGAACCAGACGAACGATGTTATCACATTT

TTTATGAAATTCTAAAAGGAATGAATGATGAAATGAAAAAAAAGTACAAGATAAAATCAGAAGAAGATTACAAATATATTT

CAAATAAATCTATTAACATTCCTGgtaggcatgatatgcgtaaatgcctacataactatatatttatatatatatatatat

ttactatatggttaaaacatacttcatatatttattaaacatatagAAATTGATGACGCAAAGGATTTTGAGAATTTAATG

ATATCTTTTGATAAAATGAAAATGTCTGATTTAAAAGATGACCTTTTCCTTACTTTGTCAGgtaaagattgaaagataatt

atgagtagttatataaaattacatgttatatattatgaatatatatatatatatatatatatatatatatatatatatata


tatatatgttataattatttagGGTTGTTACTTTTGGGAAATATTCAATTTAATGGGATCGAAAAGGGTGGTAAATCTAAT

TGTAGTGAACTTGATGATGAGAACTTAGAGGTGGTTAATGAGGCTAGTGAATTATTAGGTATAGATTATGAGAGTTTAAAG

AATAGTTTAGTTATTACTGAAAAGAGTATAGCTAATCAGAAAATCGAAATTCCTTTGAGTATAGAAGAGTCTTTATCAATA

TGTAGATCGATATCTAAGGATATATATAATAAGATATTTGAGTACATTACGAAAAGAATAAATAATTTTTTAAATAATAAT

AAAGAATTAGAGAATTTCATAGGTATTTTGGATATTTTTGGATTTGAGATTTTTGTTAAGAATTCATTAGAGCAGTTGCTA

ATTAATATAGCGAATGAAGAGATACATAATATATATTTATTTGTTGTATATGAAAAAGAAAGCAATTTATATAAAAAGGAA

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ATATTGGAAGATAATTGTTTAGCACCTGGAAAGAAGGATGAGgtgggttttaaaaaaaaaaaaaaatataaatatatatat

atatatatataataaatcaatacataatatgtgtgtaaatatatgaatctaggaatatattgataaaccttatttatataa

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aattattaagTCGATCGTAAGTGTTTATACAAATAAATTTTCTAAGAATGAACATTATTCAGTATGTAAGAAAAACATAAC

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TTCGCCTAACATTTTGAAATTATTGAAGgtgaggacgagtgatcatggaataaacagaaaaatataaaatgatatatatat

atatattaatatatatgtgtgtatatttatttatttgaataattatatagagatatcatcatatatatatatatatatata

tatatatatatatttatttatttatttatttatttatctttctgattagGTGTCGAATAACAAATTAATTCAGAACTTGTA

TGATGATGCTGAAGTAACGGATTCATTAGGACGTAAAAACTTAATAACTTATAAATATTTAGAAAATCTAAAAAAAATATG

CTCCTATTTAAAGAGCACAAATATATATTTTATAAAATGTATTAAACCAAATGAAACAAAAGAGAAAAATAACTTTAATCC

GAAAAAAGTATATCCTCAATTATTTTCTTTATCTATTGTTGAAACGTTAAATATAAAATATTTTTTTCAGTATAAATATAC

GTTTGCTTCTTTCTTAAGTTATTATCAATATTTGGATATTGCTGTTTCAAATGATTCAAGTTTGGATGAAAAAACTAAAGT

AACCATGTTGTTGGAAAGGAACTTTGACAAGGATTCATATAAGgttaaaatgtatatatatatatatatatatatatatat

atttatatatatgtgtgtgtttattttaataacgtactttttttttttatttttttttattttatttttcgttaaatatat

tattatatactcatgtagagtacatccgtatgtactcatatattaatatatccatatatatatatatatatatatatatat

atatatatataatacctttacatatttaacttcttagGTTGGACATACCATGGTATTTTTAAAAAAGGAAGCGGTTCATAA

AATTCGGGATATCATAAATTCCAACTTGAAATGTTATAGAAATTTATGTTGTATAACTAGTGCACTCATCATGAAAATAAA

GAAAAAGAGAATAGTAGAAGAAAACATAAAAAATTTACAACTAGCTCAAGCATATTTTAGGAAATATAAATATATTAAGGA

ACACGAATAAAAATCGGGAAAATAAAATGGATGACCAGAAAGTTGTATACTTTGGCAAATTTATTCTTTTAAAAGTGTAGG

AATATA

Figura 4-35. Secuencia del gen pfmyo-b y diseño de constructo pHH1-PfMyoB_Control

Las letras azules en minúscula corresponden a los 7 intrones presentes en el gen. ATG o ATG

corresponde a la localización de los 14 codones ATG presentes en la secuencia, posiciones que se

tuvieron en cuenta al momento de diseñar el constructo, el cual debe carecer de un ATG inicial. Las

letras rojas corresponden a las secuencias de los iniciadores sentido y antisentido. El texto resaltado

en gris corresponde al fragmento de 904 pb que fue clonado en el vector pHH1. Las letras subrayadas

corresponden a la secuencia del gen que codifica la región de la cola de la miosina B. TAA corresponde

al codón de parada del gen endógeno. Las letras en marrón corresponden a la región 3’ no traducible

(3’ UTR) del gen.

4.4.1.1.3 Diseño de la PCR diagnóstica

El seguimiento de las formas integradas en los cultivos se hizo mediante PCR diagnóstica,

estrategia que demandó un diseño cuidadoso de los iniciadores para poder rastrear

correctamente cada una de las posibles formas presentes en el cultivo: parásitos con

integración, parásitos con episomas y parásitos silvestres. Una vez ocurre la recombinación

homóloga, el plásmido pHH1 queda insertado en el genoma, flanqueado por los dos

fragmentos del gen endógeno que fue interrumpido. Así, el término integración 5’ hace

referencia a la región del gen endógeno que quedó corriente arriba del plásmido integrado.

En ese orden de ideas, esta región puede ser monitoreada por PCR usando un iniciador

sentido sobre la secuencia del gen endógeno y un iniciador anti-sentido sobre la secuencia



del plasmido pHH1. Por su parte, el término integración 3’ hace referencia a la región del gen

endógeno que quedó corriente abajo del plásmido integrado. Así, esta región puede ser

monitoreada por PCR usando un iniciador sentido sobre la secuencia del plásmido pHH1 y un

iniciador anti-sentido sobre la secuencia del gen endógeno. En las figuras 4-36, 4-37, 4-38 y

4-39 se muestra la ubicación de los iniciadores.

Figura 4-366. Diseño de iniciadores para detectar formas integradas en cultivos PfMyoA_knock-

out

A. Pareja de iniciadores A y Z: amplifican un fragmento de 977 pb presente únicamente en el gen

pfmyo-a endógeno, es decir amplifican un segmento que solo está presente en parásitos donde no

hubo integración del constructo. B. Pareja de iniciadores C y D: amplifican un fragmento de 911pb

presente exclusivamente en el constructo, es decir parásitos que contienen el constructo como un

episoma, pero que no lo integraron. C. Pareja de iniciadores A y D y C y Z: amplifican un fragmento de

982 y 906 pb, respectivamente. La amplificación con estas parejas de cebadores solo puede ser posible

cuando hay presencia de formas integradas en los cultivos, es decir cuando los parásitos integraron el

constructo en su genoma, específicamente en el gen de la miosina a.


Figura 4-37. Diseño de iniciadores para detectar formas integradas en cultivos

PfMyoB_knock-out

A. Pareja de iniciadores Y y B: amplifican un fragmento de 1198 pb presente únicamente en el gen

Pfmyo-b endogéno, es decir amplifican un segmento que solo está presente en parásitos donde no

hubo integración del constructo. B. Pareja de iniciadores C y D: amplifican un fragmento de 1115 pb


episoma, pero que no lo integraron C. Pareja de iniciadores Y y D y C y B: amplifican un fragmento

de 1071 y 1242 pb, respectivamente. La amplificación con estas parejas de cebadores solo puede ser

posible cuando hay presencia de formas integradas en los cultivos, es decir cuando los parásitos

integraron el constructo en su genoma, específicamente en el gen de la miosina b.



Figura 4-388. Diseño de iniciadores para detectar formas integradas en cultivos

PfMyoA_Control

A. Pareja de iniciadores A y W: amplifican un fragmento de 1272 pb presente únicamente

en el gen pfmyo-a endogéno, es decir amplifican un segmento que solo está presente en

parásitos donde no hubo integración del constructo. B. Pareja de iniciadores C y D:

amplifican un fragmento de 1178 pb presente exclusivamente en el constructo, es decir

parásitos que contienen el constructo como un episoma, pero que no lo integraron. C.

Pareja de iniciadores A y D y C y W: amplifican un fragmento de 1246 y 1120 pb,

respectivamente. La amplificación con estas parejas de cebadores solo puede ser posible

cuando hay formas integradas en los cultivos, es decir cuando los parásitos integraron el

constructo en su genoma, específicamente en el gen de la miosina


Figura 4-39. Diseño de iniciadores para detectar formas integradas en cultivos PfMyoB_Control

A. Pareja de iniciadores E y G: amplifican un fragmento de 1294 pb presente únicamente en el gen

pfmyo-a endogéno, es decir amplifican un segmento que solo está presente en parásitos donde no

hubo integración del constructo. B. Pareja de iniciadores C y D: amplifican un fragmento de 1101pb


episoma, pero que no lo integraron C. Pareja de iniciadores E y D y C y G: amplifican un fragmento de

1211 y 1184 pb, respectivamente. La amplificación con estas parejas de cebadores solo puede ser

posible cuando hay presencia de formas integradas en los cultivos, es decir cuando los parásitos

integraron el constructo en su genoma, específicamente en el gen de la miosina b.

4.4.1.2 Clonación y transfección

De acuerdo con las secuencias reportadas en PlasmoDB para los genes pfmyo-a y pfmyo-b

(PF3D7_1342600 y PF3D7_0503600, respectivamente), se diseñaron oligonucleótidos

específicos (Anexo A) con secuencias de reconocimiento para las enzimas BglII y XhoI en su

extremo 5’, sitios que también están presentes en el vector de transfección pHH1. Cada

fragmento fue amplificado a partir de 50 ng de ADN de la cepa 3D7 de P. falciparum con las

siguientes condiciones de PCR: buffer 1X (cloned Pfu buffer), dNTPs 200 µM (Invitrogen,



Carlsbad, CA, USA), primers 0,1µ M, Pfu ADN polimerasa 1,25 U (Agilent Technologies, La

Jolla, CA, USA) y MgSO4 2,0 mM. El programa de amplificación consistió en un ciclo de

denaturación inicial de 94 °C x 4 minutos, 30 ciclos de 94 °C x 45 segundos, 50 °C x 30

segundos y 60 °C x 2 minutos, seguido por una extensión final de 60 °C x 10 minutos. Los

amplicones de pfmyo-a se clonaron en el vector pGEM-T easy (Promega, Madison, WI, USA) y

los de pfmyo-b en el vector pSC-B-amp/kan (Stratagene, La Jolla, CA, USA) (ver Anexo B)

mediante T4 ADN ligasa (Promega, Madison, WI, USA) y con estos plásmidos recombinantes

se transformaron, mediante choque térmico, bacterias competentes E. coli JM109 (Promega)

y E. coli DH5α (MAX Efficient DH5 α competent cells, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),

respectivamente. El rastreo de colonias se hizo mediante PCR usando iniciadores del inserto

y del vector. Los insertos clonados fueron liberados del vector con las enzimas BglII y XhoI y

la digestión fue verificada mediante electroforesis en gel de agarosa, desde donde las bandas

correspondientes a los insertos se cortaron y se purificaron (Montage gel extraction kit,

Millipore, Bedford, MA, USA) y el ADN extraído se cuantificó por espectrofotometría. Los

insertos puros se ligaron al vector pHH1, que previamente había sido digerido con las

mismas enzimas, en una proporción 3:1 (inserto:vector) durante 16 horas a 22 °C en

presencia de T4 ADN ligasa (Promega, Madison, WI, USA). Se transformaron bacterias E. coli

JM109 competentes y los clones se confirmaron mediante secuenciación. Una vez se

comprobó que los clones poseían la secuencia correcta se hizo cultivo a gran escala y se

extrajo el ADN plasmídico (ADNp) que se usaría para transfectar los parásitos.

4.4.1.2.1 Extracción y purificación del ADNp

Los clones bacterianos pHH1/AC, pHH1/AKO, pHH1/BC y pHH1/BKO se sembraron por

agotamiento en agar LB/amp22 y se incubaron a 37 °C durante toda la noche. Al día siguiente

se tomó una colonia y se sembró en 5 mL de medio LB/amp y se incubó a 37 °C durante toda

la noche en agitación (200 rpm). A partir de este cultivo se hizo una dilución 1:1600 (250 µL

22Agar LB-amp: caja de agar LB suplementado con 100 µg/mL de ampicilina. El caldo Luria está constituido por peptona 10 g/L, extracto de levadura 5 g/L y NaCl 10 g/L.


en 400 mL de medio) en caldo Terrific23 suplementado con ampicilina (100 µg/mL) y se

incubó a 37 °C en agitación a 200 rpm durante toda la noche. Posteriormente, el cultivo se

transfirió a botellas de 250 mL y se centrifugó a 5000 x g durante 20 min (de aquí en

adelante se trabajo a temperatura ambiente). Se descartó el sobrenadante y a cada “pellet”

bacteriano se le adicionaron 12 mL de solución de resuspensión celular (kit PureYieldTM

Plasmid Maxiprep system, Promega, Madison, WI, USA). Luego de mezclar muy bien, se

adicionaron 12 mL de solución de lisis celular, se mezcló por inversión varias veces y la

suspensión se incubó por 3 min. Se agregaron 12 mL de solución de neutralización se mezcló

por inversión y se centrifugó a 14000 x g por 20 min. El lisado obtenido se agregó lentamente

sobre una columna (ensamblada de acuerdo con las instrucciones del fabricante) y se filtró

todo el volumen, se removió la columna superior y se hicieron dos lavados mediante

aspiración por vacío. El primero, con 5 mL de buffer de lavado (Endotoxin Removel Wash) y

el segundo, con 20 mL de buffer de lavado (Column Wash). La membrana de la columna se

secó mediante la aplicación de vacío durante 5 min y posteriormente, se hizo la elución del

ADNp con 1,5 mL de agua libre de nucleasas por centrifugación a 2000 x g durante 10 min y

se guardó a -20 °C hasta su uso. Se dejó una pequeña alícuota para cuantificar y hacer

electroforesis para verificar la pureza del material obtenido.

4.4.1.2.2 Transfección de Plasmodium falciparum mediante electroporación

La electroporación es un proceso físico que permite introducir ADN a células en cultivo y se

lleva a cabo mediante la aplicación de pulsos eléctricos a las células, lo que provoca la

apertura transitoria de poros en la membrana plasmática. En este trabajo se electroporaron

eritrocitos mediante un pulso eléctrico tipo caída exponencial, y de esa forma se obtuvieron

eritrocitos precargados (con el ADN de interés) que fueron adicionados al cultivo de P.

falciparum. El objetivo era lograr que los parásitos infectaran estos eritrocitos precargados y

tuvieran así la oportunidad de internalizar los plásmidos. El protocolo de transfección es un

protocolo complejo que contempla varios pasos, los cuales van desde la preparación del

23 Caldo terrific: es un medio altamente enriquecido para mejorar la obtención de bacterias en menor tiempo. plásmidos en E. coli. Sus componentes son triptona 11.8 g/L, extracto de levadura 23,6 g/L, K2HPO4 9,4 g/L y KH2PO4 2,2 g/L.



ADNp hasta el mantenimiento de los parásitos transfectados en cultivo. A continuación se

describe cada uno:

Preparación del ADN plasmídico

Para cada transfección, 100 µg de ADNp fueron precipitados adicionando 2,5 – 3 volúmenes

de etanol al 100 % y 1/10 de volumen de acetato de sodio 3M pH 5,2. La solución de ADNp se

centrifugó a 13000 x g por 20 min a 4 °C. El sobrenadante se removió y el “pellet” fue lavado

con etanol al 70 % y centrifugado por 10 min usando las condiciones anteriores. El

sobrenadante fue removido en cabina de flujo laminar, el ADNp se dejó secar y luego fue

resuspendido en 30 µL de Buffer TE 1X estéril y almacenado a 4 °C.

Cultivo de Plasmodium falciparum

El cultivo de P. falciparum cepa 3D7 fue sincronizado mediante 2 ó 3 tratamientos con

sorbitol, de tal forma que el día previo a la transfección se tuviera un cultivo sincrónico en

anillos a al menos 5 % de parasitemia.

Transfección

Todas las actividades realizadas durante la transfección se llevaron a cabo en cabina de flujo

laminar y bajo condiciones de esterilidad. Dos cubetas de electroporación (2 mm de

separación entre los electrodos) nuevas y estériles se colocaron sobre hielo. Diez mililitros de

sangre total fresca grupo O positivo fue centrifugada a 710 x g por 5 min a temperatura

ambiente en un tubo falcon estéril. El plasma y la capa de glóbulos blancos fueron removidos

y los eritrocitos fueron lavados con HBS 1X 3 veces. El cuarto lavado se realizó con buffer

Cytomix24 centrifugando las células a 400 x g por 5 min a 4 °C. El sobrenadante fue

descartado y con el botón de glóbulos rojos se realizaron las electroporaciones. En un tubo

eppendorf de 1,5 mL se colocaron 175 µL de glóbulos rojos lavados del paso anterior, 30 µL

de ADNp en buffer TE 1X y 195 µL de Cytomix para obtener un volumen final de 400 µL. La

mezcla fue transferida a una de las cubetas teniendo cuidado de no introducir burbujas, se

tapó y se dejó en hielo mientras se realizó la misma mezcla, para la segunda cubeta. Luego

cada cubeta se colocó en la celda del electroporador (Gene Pulser XcellTM Electroporation

24 Cytomix: KCl 120 mM, CaCl2 0,15 mM, K2HPO4 10 mM, Hepes 25 mM, EDTA 2 mM, MgCl2 5 mM, pH 7,6. Estéril


system, BioRad, Hercules, CA) y los eritrocitos se electroporaron usando las siguientes

condiciones: Protocolo exponencial: voltaje: 310V, Capacitancia: 950µF, Cubeta: espacio

entre electrodos 2mm, Resistencia: ∞. Inmediatamente, el contenido de la cubeta se

transfirió a un tubo falcon estéril de 15 ó 50 mL en cabina de flujo laminar y la cubeta fue

lavada suavemente dos veces utilizando 2,5 – 3 mL de medio sin suero (RPMI 1640), el cual

también se depositó en el tubo falcón. Las células fueron centrifugadas a 400 x g por 5 min a

temperatura ambiente y el sobrenadante fue descartado. Los eritrocitos obtenidos en las dos

electroporaciones (aproximadamente 200 µL) se llevaron a un flask de 25 cm3 con 5 mL de

medio completo, al cual se le adicionaron glóbulos rojos parasitados con formas maduras,

ajustando el hematocrito al 5 % y la parasitemia en 1 %.

4.4.1.2.3 Monitoreo de los cultivos transfectados

A las 24 horas después de la transfección, se hizo cambio de medio de los cultivos con medio

completo suplementado con el medicamento antifolato WR99210 a una concentración de 5

nM (medio de selección). La evaluación de los cultivos se hizo diariamente mediante

extendido teñido con Giemsa y cambio de medio con medio suplementado25 durante los

primeros siete días. Al cabo de ese tiempo el cultivo se continuó alimentando día de por

medio y una vez por semana se hicieron extendidos y se adicionaron 100 µL de glóbulos

rojos frescos y lavados al 50% de hematocrito. Los cultivos se mantuvieron con medio de

selección hasta que se detectaron eritrocitos parasitados en los extendidos, lo cual de

acuerdo con la literatura puede tomar entre 4 a 5 semanas, aunque en algunos casos las

formas asexuales pueden aparecer más tardíamente (60 días); el experimento se abortó si al

cabo de 60 días no se observaron parásitos. Los cultivos transfectados donde se detectaron

formas asexuales se mantuvieron por 6 meses, alternando un mes de mantenimiento con

medio sin medicamento, y un mes de mantenimiento con medio de selección (con WR99210)

Este procedimiento se realizó con el objeto de enriquecer las formas integradas; así, durante

el ciclo de presión con el antifolato se seleccionan los parásitos que tienen el plásmido

integrado y durante la fase sin presión continúan creciendo los transfectantes y se espera que

se reduzca la población de parásitos que albergan el plásmido como un episoma. Sin

25 Medio suplementado: medio de cultivo completo adicionado con 5 nM de WR99210



embargo, debido a la persistencia del plásmido episomal en algunos parásitos, cuando se

aplica la presión con WR99210, también se seleccionan los parásitos que contienen

episomas. Durante cada mes se congelaron alícuotas de los cultivos que tuvieron

parasitemias ≥2 % en anillos y también se tomaron alícuotas de 0,5-1 mL para extraer ADN

genómico y realizar PCR diagnóstica y así comprobar la integración del plásmido en el

genoma del parásito.

4.4.1.3 Evaluación de “knock-out” pfmyo-a y pfmyo-b

4.4.1.3.1 Ensayos de PCR

A partir del ADNg extraído de los parásitos PfMyoA-KO se hizo PCR diagnóstica con las

parejas de cebadores A y D y C y Z para detectar integración 5´ y 3´. También se usaron las

parejas A y Z y C y D, para detectar ADNg y ADN episomal, respectivamente. Brevemente, las

condiciones de la mezcla de reacción fueron 1U Taq ADN polimerasa (Promega, Madison, WI,

USA), 1,5 mM de MgCl2, 200 µM de dNTP (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 0,1 µM de

cebadores (Eurofins e IDT) y como plantilla se usaron 5 µL de ADN. Las condiciones de PCR

fueron: denaturación inicial 95 °C x 3 min, seguido por 35 ciclos a 95 °C x 30 seg, 55 °C x 45

seg y 60 °C x 1 min, con una extensión final a 72 °C x 5 min.

Para los parásitos PfMyoB-KO se hizo PCR diagnóstica con las parejas de cebadores Y y D y C

y B para detectar integración 5´ y 3´. A la par se usaron las parejas Y y B y C y D para detectar

ADNg y ADN episomal. Las condiciones de la mezcla de reacción fueron las mismas de la PCR

para PfMyoA-KO. Las condiciones de PCR fueron: denaturación inicial 94 °C x 4 min, seguido

por 30 ciclos a 94 °C x 45 seg, 50 °C x 30 seg y 60 °C x 2 min, con una extensión final a 60 °C x

10 min.

4.4.1.3.2 Ensayos de RT-PCR

Para determinar si en los parásitos “knock-out” había transcripción de los genes silenciados,

se extrajo ARN a partir de cultivos PfMyoA_KO y PfMyoB_KO como se describió previamente.

Despues de ser tratado con DNasa, el ARN se usó para sintetizar ADN complementario

(ADNc) usando la enzima transcriptasa reversa M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus)

(Promega, Madison, WI, USA) y el iniciador oligo-dT. Brevemente, 1000 ng de ARN se


incubaron con 500 ng de oligo-dT durante 5 min a 70 °C. La reacción se enfrió colocándola en

hielo y se le adicionó una mezcla de transcriptasa reversa M-MLV, buffer de la enzima, dNTPs

y RNasin, y se incubó a 42 °C durante 1 hora. Con el ADNc producido se hizo una PCR usando

cebadores específicos para los genes pfmtip, pfcrt, pfgap50, previo tratamiento con DNasa.

Posteriormente se hizo PCR con cebadores para los genes pfmyo-a y pfmyo-b.

4.4.1.3.3 Ensayos WB

Para comprobar la ausencia de la proteína en los cultivos de parásitos “knock-out” se

crecieron cultivos hasta obtener parásitos de más de 40 horas y a partir de éstos se hicieron

extractos de proteínas con buffer RIPA, los cuales fueron usados en ensayos WB.

4.4.1.4 Evaluación del comportamiento de los parásitos “knock-out” en cultivo

El comportamiento de los parásitos “knock-out” se evaluó comparando los porcentajes de

invasión contra un cultivo control y la morfología de los diferentes estadios asexuales

presentes en ambos cultivos. También se determinó si hubo variaciones en la localización de

MTIP tanto en parásitos “knock-out” como control mediante inmunofluorescencia.

4.4.2 Resultados

Con el propósito de explorar la posible participación de PfMyoB en el proceso de invasión

del merozoíto al eritrocito y obtener mayor conocimiento acerca del papel que juega

PfMyoA durante este proceso, se produjeron parásitos “knock-out” por recombinación

homóloga sencilla. Así, los genes que codifican para PfMyoB (3493 pb) y PfMyoA (2841 pb)

fueron truncados con el constructo pHH1-BKO y pHH1-AKO respectivamente, con lo cual se

esperaba, que al ocurrir la recombinación, se produjeran dos copias no funcionales del gen. A

la par, los constructos “knock-out” control pHH1-BC y pHH1-AC fueron diseñados para

integrarse en el gen pfmyo-b y pfmyo-a, y producir una copia funcional y otra no funcional del

gen en cuestión.

4.4.2.1 Monitoreo de los cultivos

Eritrocitos fueron precargados mediante electroporación con 100 µg de ADNp de cada

constructo generado (pHH1-BKO; pHH1-BC; pHH1-AKO y pHH1-AC) y puestos en cultivo con

medio completo. A cada frasco de cultivo se le adicionaron esquizontes de P. falciparum a una



parasitemia final del 1% y al cabo de 24 horas el medio se reemplazó por medio de selección;

de aquí en adelante los cultivos fueron mantenidos en medio suplementado con WR99210.

Durante los primeros 8 días post-transfección, se evidenció la disminución progresiva de los

parásitos asexuales, cambios en la morfología de los parásitos y la aparición de gametocitos.

A partir del día 9 no se volvieron a encontrar parásitos en los extendidos, situación que se

mantuvo por varias semanas. A los 38 días post-transfección, se observaron parásitos en el

cultivo sometido a transfección con el constructo pHH1-AKO (MyoA-KO) y en el cultivo

control (MyoA-C). Diez días después aparecieron parásitos en el cultivo sometido a

transfección con el constructo pHH1-BC (MyoB-C) y 7 días más tarde en el cultivo “knock-out”

(MyoB-KO). Una vez aparecieron los primeros parásitos, los diferentes cultivos alcanzaron

rápidamente parasitemias del 2 %, momento en el cual se empezaron a congelar alícuotas.

Treinta días después de la aparición de parásitos resistentes al antifolato WR99210, se

suspendió la adición de este medicamento al medio de cultivo y de aquí en adelante se

iniciaron ciclos alternados de 30 días cada uno, en los cuales el cambio de medio se hizo sin

WR99210 y luego con WR99210 con el propósito de enriquecer las formas integradas. El

seguimiento de los cultivos para rastrear la integración del plásmido en el genoma del

parásito se hizo mediante PCR diagnóstica sobre el ADNg, el cual fue extraído la última

semana de cada ciclo (cada mes) usando un kit comercial o el método de saponina/chelex.

Los iniciadores para la PCR diagnóstica fueron diseñados de tal manera que cada pareja

amplifica un único tipo de ADN, es decir ADN genómico silvestre (de aquí en adelante,

genómico), ADN del plásmido no integrado (de aquí en adelante, episomal) o ADN genómico

integrado (de aquí en adelante, integración). Todos los procedimientos mencionados

previamente también se realizaron en los cultivos control, los cuales se produjeron para

verificar que en caso de obtener un “knock out”, los efectos observados fueran producto del

silenciamiento específico y no de la técnica per se.

4.4.2.2 Evaluación de parásitos MyoA-KO y MyoA-C

4.4.2.2.1 PCR diagnóstica

La primera PCR diagnóstica para detectar integración en los parásitos de los cultivos MyoA-

KO y MyoA-C se realizó 10 días después de observar parásitos en el cultivo; el resultado fue

negativo para integración. La siguiente PCR se hizo 21 días después cuando los cultivos


tuvieron parasitemias cercanas al 2% y en esta ocasión se obtuvo una banda a la altura

esperada para la integración 5' y la integración 3' en el cultivo “knock-out” (figura 4-40) y en

el cultivo control. A la par con estas señales, también se observó una banda para ADNg y para

ADN episomal (ADNe), las cuales fueron más intensas que las de la integración.

Como se mencionó antes, cuando la recombinación homóloga ocurre, el plásmido pHH1

queda insertado en el genoma, flanqueado por los dos fragmentos del gen endógeno

interrumpido. Así, la integración 5’ puede ser monitoreada por PCR usando un iniciador

sentido sobre la secuencia del gen endógeno y un iniciador anti-sentido sobre la secuencia

del plásmido pHH1, mientras que la integración 3’ puede ser monitoreada por PCR usando un

iniciador sentido sobre la secuencia del plasmido pHH1 y un iniciador anti-sentido sobre la

secuencia del gen endógeno

Figura 4-40. PCR diagnóstica para comprobar integración en el cultivo MyoA-KO

El constructo pHH1-MyoAKO se integró en el genoma del parásito como se aprecia en los dos geles del

centro de la figura, los cuales corresponden a la integración 5’ y 3’; sin embargo, también se observa

señal para ADNg y ADN episomal (gel de la izquierda y de la derecha, respectivamente), lo que sugiere

que una parte de la población de parásitos no integró el plásmido en su genoma pero logran sobrevivir

en el cultivo con medio de selección ya que albergan el plásmido recombinante como un episoma. La

plantilla utilizada en los carriles AKO fue el ADN extraído de los cultivos MyoA-KO y en los carriles 3D7

fue ADN extraído a partir de cultivos de la cepa silvestre 3D7. En la parte superior de cada gel se

describe la PCR diagnóstica a la cual corresponde el gel, el tamaño en pb del producto amplificado y el

nombre de los iniciadores utilizados.

Los amplicones obtenidos a partir del ADN del cultivo MyoA-KO con los iniciadores A y D

(integración 5'-fragmento de 982 pb) y C y Z (integración 3'-fragmento de 906 pb), se

clonaron en el vector pGEM-T easy y se secuenciaron para verificar la integración (Macrogen,

INTEGRACION 5

982 pbIniciadores A y D

MW H2O AKO 3D7

1500

1000

500

1500

1000

500

INTEGRACION 3´906 pb

C y Z

MW H2O AKO 3D7

1000

500

ADNg977 pb

A y Z

MW H2O AKO 3D7

ADN episomal911 pb

C y D

1000

500

MW H2O AKO 3D7 pHH1

-AKO



Korea). Estos clones se denominaron respectivamente clon AD y clon CZ. El alineamiento de

las secuencias de los clones contra la secuencia teórica esperada A-D (la cual está constituida

por una parte del gen pfmyo-a, un codon de parada, la secuencia de la enzima de restricción

XhoI y parte del segmento PbDT del vector pHH1) y C-Z (constituida por una parte del

segmento Cam del vector pHH1, la secuencia de la enzima de restricción BglII y parte del

extremo 3' del gen pfmyo) tuvo un porcentaje de identidad del 99,7% y 80,6%

respectivamente (Anexo E). Estos resultados evidencian sin lugar a dudas la integración del

constructo pHH1-AKO en el gen pfmyo-a.

Mes a mes se realizaron PCRs para detectar integración, el rastreo de los parásitos del sexto

mes (con WR99210) fue positivo para integración, aunque las bandas obtenidas en el sexto

mes fueron muy tenues. Este mes corresponde al último ciclo con WR99210, momento en el

cual los cultivos fueron congelados. Posteriormente, estos parásitos fueron descongelados y

mantenidos en cultivo por cinco meses bajo ciclos mensuales de presión y ausencia de

medicamento, con el propósito de enriquecer la población de transfectantes y eliminar los

parásitos con episomas. Esta fase de selección se volvió a realizar teniendo en cuenta que en

el cultivo predominaban los parásitos silvestres, sobre la población de transfectantes. El

seguimiento por PCR de estos cultivos tuvo el mismo comportamiento de los primeros

parásitos, es decir, en algunas PCR hubo amplificación exitosa para integración y en otras no

y siempre hubo amplificación cuando se analizaron las otras formas (ADNe y ADNg). Para

mejorar la sensibilidad del rastreo de las integraciones 5’ y 3’ se diseñó una PCR semi-

anidada (Anexo A) y todos los ADN obtenidos durante los 5 meses de cultivo se analizaron

usando esa técnica. Todas las amplificaciones fueron exitosas, lo cual apoya la idea del escaso

número de parásitos con integración en el cultivo, ya que fue necesario el uso de una

metodología más sensible que pudiera detectar esta población minoritaria.

Simultáneamente, se decidió explorar cual podría ser la proporción de parásitos integrados

frente a las demás poblaciones de parásitos, teniendo en mente que si era demasiado baja, un

ensayo de clonación por dilución límite fracasaría. La estrategia usada fue realizar una curva

de calibración con el clon AD y sobre ésta interpolar la señal obtenida a partir de un ADN de

concentración conocida proveniente del cultivo MyoA-KO. Se calculó el tamaño y la masa del

plásmido recombinante (clon AD), el cual fue de 4002 pb y 4,386192 x 10-9 ng


respectivamente, y se prepararon las diluciones estimadas con valores que estuvieron entre

1 y 1x104 copias del plásmido.

Figura 4-41. Estimación de la proporción de parásitos con integración en el cultivo MyoA-KO

En la figura 4-41 se puede apreciar que la intensidad de la señal correspondiente a 100 ng de

ADN proveniente de un cultivo MyoA-KO (flecha roja) tiene la misma intensidad que la señal

del clon AD correspondiente a 156 copias (flecha negra). Teniendo en cuenta que la masa de

un genoma de P. falciparum es de 2,50477 x 10-5 ng (25 fg) podemos decir que en 100 ng de

ADN hay alrededor de 3.992.378 genomas. De lo anterior se concluye que en el cultivo MyoA-

KO se tiene aproximadamente 1 parásito que integró el constructo por cada 25592 parásitos

que no tuvieron integración. Estas cifras indicaron que la clonación por dilución límite no era

una opción viable.

4.4.2.2.2 Ensayos RT-PCR y WB

Aunque se quería explorar si el gen pfmyo-a se transcribe y si la proteína se expresa en

parásitos MyoA-KO, los resultados previos mostraron que en este cultivo los parásitos con

integración constituyen una población minoritaria frente a los parásitos silvestres. Al realizar

RT-PCR y WB, evidentemente no hubo diferencia alguna entre el cultivo KO y el cultivo

silvestre al analizar el transcrito pfmyo-a y la expresión de la proteína PfMyoA.

1500

1000

500

MW 1e4 5e3 2500 1250 625 H2O

MW 312 156 76 50ng 100ng H2O

1500

1000

500

Número de copias Número de copias en 100 ng

Genomas de

P.falciparum

3.992.378

De acuerdo con la intensidad de las

bandas mostradas en el gel, la intensidad

de la banda correspondiente a 156 copias

es muy similar a la señal obtenida a partir

de 100 ng de ADNg del cultivo MyoA-KO,

así 156 copias del clon AD están en

3.992.378 parásitos, entonces por cada

25.592 parásitos silvestres hay 1 parásito

integrado



Figura 4-42. RT-PCR y WB sobre cultivo MyoA-KO

A. RT-PCR con iniciadores que amplifican una parte del dominio de cabeza, la flecha negra señala la

banda obtenida a partir de ADNc proveniente de parásitos MyoA-KO; ADNc de 3D7 se usó como

control. B. WB con anti-MyoA, la flecha negra señala la banda correspondiente a PfMyoA tanto en la

cepa silvestre como en parásitos MyoA-KO.

En cuanto al cultivo MyoA-C, también se presentaron fluctuaciones en la positividad de la

PCR diagnóstica durante los 3 ciclos de selección; sin embargo, a partir del tercer ciclo sin

WR99210, y de ahí en adelante, todos los rastreos con PCR convencional fueron positivos

para integración 5’ y 3’ con señales muy fuertes (figura 4-43). La señal para el gen endógeno

fue muy tenue y la señal para el ADN episomal fue intensa, resultados que en conjunto

indican que la mayoría de parásitos presentes en el cultivo integraron el constructo control y

que estos parásitos además albergan el plásmido como un episoma. La presencia de

integración en los cultivos MyoA-C demuestra que la metodología realizada a lo largo de todo

el proceso de obtención de los parásitos “knock-out” fue adecuada, ya que hubo integración

del plásmido en el genoma del parásito y dicha integración no lo afectó.

ADNc: 1427 pb - ADNg: 1811pbIniciadores para MyoA (D. cabeza)

2000150012001000

23

MW 3D7 AKO 3D7 AKO

MyoA100

70

55

40

35

A. B.

ADNc


Figura 4-43. PCR diagnóstica para comprobar integración en el cultivo MyoA-C

El constructo pHH1-MyoAC se integró en el genoma del parásito como se aprecia en los carriles AC de

las PCR realizadas con los iniciadores A-D y C-W; se observa una señal muy tenue para ADNg y una

muy intensa para ADN episomal. Estos resultados sugieren que la gran mayoría de parásitos

integraron el plásmido en su genoma. ADNg, ADN genómico. ADNe, ADN episomal.

4.4.2.3 Evaluación de parásitos MyoB-KO y MyoB-C

4.4.2.3.1 PCR diagnóstica

La primera PCR diagnóstica para detectar integración en los parásitos MyoB-C y MyoB-KO

fue negativa y se realizó a los 22 y a los 16 días (respectivamente) después de observar las

primeras formas asexuales en cultivo. Para MyoB-KO, la primera PCR positiva para

integración se evidenció en parásitos recolectados durante el segundo ciclo sin WR99210 y

de ahí en adelante se mantuvo positiva. Interesantemente, no se observó señal para ADN

genómico, mientras que para el ADN episomal se obtuvo una banda intensa (figura 4-44). A

diferencia de los parásitos MyoA-KO, el rastreo de la integración en los parásitos MyoB-KO

siempre se hizo mediante una sola ronda de amplificación, obteniéndose siempre bandas

intensas.

1500

1000

500

24

ADNg Integración Integración ADNe5’ 3’

Controles Negativos 1272pb 1246 pb 1120 pb 1178 pbA-W A-D C-W C-D A-W A-D C-W C-D H20 H20 H20 H20 L AC 3D7 AC 3D7 AC 3D7 AC 3D7



Figura 4-44. PCR diagnóstica para comprobar integración en el cultivo MyoB-KO

El constructo pHH1-MyoBKO se integró en el genoma del parásito como se aprecia en los carriles BKO

de las PCR Y-D y C-B correspondientes a la integración 5’ y 3’, respectivamente; no se observa señal

para ADNg, mientras que la señal para el ADNe es muy intensa. Estos resultados sugieren que la

totalidad de los parásitos integraron el plásmido en su genoma. ADNg, ADN genómico. ADNe, ADN

episomal.

Para los parásitos MyoB-C, inicialmente se observaron fluctuaciones en la positividad de la

PCR para integración, es decir algunas veces fue positiva y otras negativa. A partir del tercer

ciclo con WR99210, la PCR siempre fue positiva para integración 5’ y 3’. Al igual que los

parásitos MyoB-KO, la banda obtenida en la PCR para ADN episomal fue intensa y no se

detectó señal para ADNg (figura 4-45). Estos resultados sugieren que el constructo se integró

en la mayoría de parásitos y que el plásmido recombinante permanece dentro de éstos.

pb

1500

1000

500

ADNg Integración Integración ADNepisomal

1198pb 5’ 1071pb 3’ 1242pb 1115pb

Y-B Y-D C-B C-D Y-B Y-D C-B C-D H20 H20 H20 H20 L BKO 3D7 BKO 3D7 BKO 3D7 BKO 3D7


Figura 4-45. PCR diagnóstica para comprobar integración en el cultivo MyoB-C

El constructo pHH1-MyoBC se integró en el genoma del parásito como se aprecia en los carriles BC de

las PCR E-D y C-G correspondientes a la integración 5’ y 3’, respectivamente; no se observa señal para

ADNg, mientras que la señal para el ADNe es muy intensa. Estos resultados sugieren que la totalidad

de los parásitos integraron el plásmido en su genoma. ADNg, ADN genómico. ADNe, ADN episomal.

4.4.2.3.2 Ensayos adicionales de PCR

Para confirmar los resultados previos de la PCR diagnóstica (los cuales indicaban que no

había parásitos silvestres), se hizo una PCR con mayor cantidad de plantilla, seguida de una

PCR semianidada. Para esto, 50 y 100 ng de ADN fueron usados en una primera reacción de

PCR, cuyos productos fueron usados como plantilla en una segunda reacción de

amplificación. En el panel izquierdo de la figura 4-46 se muestra que al usar los iniciadores Y-

B, aparece una señal muy tenue en el carril donde se usaron 100 ng de ADN, mientras que no

hay señal en el carril donde se usaron 50 ng. Con el amplicon obtenido en esta PCR se hizo

una PCR semi-anidada utilizando un iniciador que se ubica dentro de la secuencia

amplificada (H2F-B) (Anexo F), resultado que se muestra en el panel derecho de la figura 4-

46, en donde se aprecia amplificación en el tamaño esperado. Estos resultados ponen de

manifiesto que en el cultivo MyoB-KO existe una pequeña población de parásitos silvestres,

pero la gran mayoría de parásitos integraron el constructo.

1500

1000

500

ADNg Integración Integración ADNe

5’ 3’1294pb 1211pb 1184pb 1101pb

E-G E-D C-G C-D E-G E-D C-G C-DH20 H20 H20 H20 L BC 3D7 BC 3D7 BC 3D7 BC 3D7

25



Figura 4-46. PCR semi-anidada para

comprobar ausencia de parásitos

silvestres (ADNg) en el cultivo MyoB-

KO

PCR Universal con 50 y 100 ng de

plantilla (ADN de parásitos MyoB-KO): se

observa una banda muy tenue en el carril

de 100 ng. PCR semianidada usando

como plantilla el amplicón obtenido en la

PCR universal: se observa señal para

Pfmyo-b endógeno, sugiriendo la

presencia de una población minoritaria

de parásitos silvestres (parásitos donde

no hubo recombinación).

4.4.2.3.3 Ensayos RT-PCR (retrotranscripción reversa-PCR)

Para establecer si el gen truncado pfmyo-b presente en los parásitos que integraron el

constructo “knock-out” se transcribe, se hizo RT-PCR a partir del ARNm extraído del cultivo

MyoB-KO. Como control de la RT-PCR se utilizó ARNm proveniente de cultivos MyoB-C y de

parásitos P. falciparum cepa 3D7. Se utilizaron dos parejas de iniciadores, una que amplifica

un segmento del gen que codifica parte del dominio de cabeza de PfMyoB (H1F-H1R) y otra,

que amplifica un fragmento del gen que codifica la parte final del dominio de cabeza y el

dominio de cola (E-Tail) (Anexo F). En la figura 4-47 se presentan los resultados de la PCR

para ambas parejas de iniciadores, en los cuales se aprecia una banda tenue en el carril del

“knock-out” y señales intensas tanto en el control del “knock-out” como en la cepa 3D7.

Nótese que en ambas PCR la señal para MyoB-KO es tenue y no se observan diferencias en su

intensidad.

La señal tenue observada en el cultivo “knock-out” sugiere que el gen se transcribe; sin

embargo, hay que tener en cuenta, por un lado, la presencia de una población minoritaria de

parásitos silvestres en el cultivo y por otro, el tipo de ADN que puede amplificar cada pareja

de iniciadores. La pareja H1F-H1R amplifica ADNg y ADN de los parásitos donde hubo

integración (parásitos MyoB-KO), mientras que la pareja E-Tail solo puede amplificar ADNg

(Anexo F). Siendo similar la intensidad de la señal en ambas PCR, este resultado sugiere que

la amplificación observada proviene de la misma plantilla, es decir del ADNg de los parásitos


que no integraron el constructo. Así, si realmente el gen truncado se transcribiera se

esperaría ver una señal fuerte con la primera pareja de iniciadores, ya que ésta dispondría de

otra plantilla (ADN de parásitos MyoB-KO). En conjunto estos resultados sugieren que el gen

truncado no se transcribe y que la leve señal observada en el carril BKO proviene de la

población minoritaria de parásitos que conservan el gen endógeno sin alteraciones. Sin

embargo, para poder tener absoluta certeza de si el gen truncado se transcribe o no, es

necesario obtener líneas clonales donde todos los parásitos tengan el mismo genoma.

Figura 4-47. RT-PCR sobre cultivo MyoB-KO con iniciadores para amplificar pfmyo-b

A partir de ADNc proveniente de parásitos MyoB-KO, MyoB-C y 3D7 se hizo RT-PCR con dos parejas de

iniciadores distintas que amplifican diferentes regiones del gen PfMyoB. En ambas PCR se observa una

señal tenue en el carril donde se cargaron los parásitos “knock-out”.

Para corroborar que la señal tenue previamente obtenida en la RT-PCR no tenía que ver con

la calidad del ADNc, se amplificaron otros genes como hrp2 y gap50. Los resultados para

ambos genes muestran bandas de igual intensidad para todos los ADNc probados (figura 4-

48). Este resultado confirma que la señal tenue obtenida para los parásitos MyoB-KO no es

un artefacto ni se debe a mala calidad de la plantilla.

26

ADNc ADNcL H2O BKO BC 3D7 H2O L BKO BC 3D7

Iniciadores B-cabeza Iniciadores B-cola1039 pb 656pb

1500

1000

500

15001000

500



Figura 4-48. RT-PCR sobre cultivo MyoB-KO con iniciadores para amplificar los genes hrp2 y

gap50

RT-PCR con iniciadores para amplificar el gen hrp2 (gel de la izquierda) y el gen gap50 (gel de la

derecha), usando como plantilla ADNc proveniente de parásitos MyoA-KO, MyoB-KO, MyoB-C y 3D7.

En el último carril se colocó ADNg de la cepa 3D7.

Con base en los resultados de la PCR diagnóstica y la RT-PCR, los cuales evidencian la

presencia de una población minoritaria de parásitos silvestres en el cultivo MyoB-KO, con el

propósito de eliminar aquellos parásitos que no integraron el constructo o que no lo

albergaron como un episoma, los parásitos fueron cultivados en adelante e

ininterrumpidamente en presencia de medio con WR99210. A partir de este nuevo cultivo,

permanentemente presionado con el medicamento, se hizo extracción de ADN y ARNm y se

volvieron a hacer los dos ensayos. Para la PCR se utilizaron los mismos iniciadores

(cebadores de la PCR diagnóstica) y para la RT-PCR además de la pareja 1 (H1F-H1R), se

utilizó otra que amplifica un fragmento similar, pero que se ubica un poco más abajo en la

secuencia de PfMyoB (H2F-H2R). Al igual que los iniciadores denominados B cola, esta

segunda pareja no puede amplificar el “knock-out”, pues el gen está truncado y el cebador

antisentido ya no encuentra un segmento complementario para anillarse. En la figura 4-49A

se observa la ausencia de señal para ADNg en la PCR semi-anidada, al igual que la ausencia de

señal en la RT-PCR (figura 4-49B). Estos resultados permiten afirmar que la adición continua

e ininterrumpida del antifolato eliminó la población de parásitos silvestres y que el gen

pfmyo-b truncado no se transcribe.

ADNc ADNg ADNc ADNgH2O L AKO BKO BC 3D7 3D7 H2O L AKO BKO BC 3D7 3D7

hrp2 - 816 pb gap50 - 468 pb

1500

1000

500

1500

1000

500


Figura 4-49. PCR diagnóstica y RT-PCR sobre parásitos MyoB-KO

PCR y RT-PCR usando ADNg y ADNc a partir de parásitos MyoB-KO cultivados con medio completo

adicionado con WR99210 ininterrumpidamente. A. Para la PCR semi-anidada se usó como plantilla el

posible amplificado de la PCR denominada ADN genómico carril BKO y como control de la

amplificación ADNg de la cepa 3D7. No se observó señal en ninguno de los carriles de la PCR semi-

anidada, en los cuales se utilizaron diferentes volúmenes de plantilla (entre 0,5 y 5 µL). B. En la RT-

PCR no se observa señal de amplificación en los carriles BKO con ninguna de las dos parejas de

iniciadores usadas. Como control de la reacción se utilizó ADNc de parásitos MyoB-C, en los cuales se

genera una copia funcional del gen pfmyo-b luego de la integración del constructo y ADNc de la cepa

silvestre 3D7.

4.4.2.3.4 Ensayos de WB

Para comprobar que la integración del constructo en el gen endógeno causó el silenciamiento

del gen y por tanto no hay expresión de PfMyoB, se hicieron ensayos WB sobre extractos

proteicos del parásito en estadio de esquizonte con el anticuerpo anti-MyoB P2 y revelado

con quimioluminiscencia. Como control se utilizaron parásitos silvestres cepa 3D7. En la

figura 4-50 se muestran los resultados del WB donde claramente se observa señal a la altura

esperada para PfMyoB en los parásitos silvestres y ausencia de señal en los parásitos “knock-

out”.

Los resultados hasta aquí presentados permiten afirmar que se produjo la integración del

constructo “knock-out” pHH1-BKO en el parásito y que esta integración causó el

silenciamiento del gen, lo cual provocó la no expresión de la proteína, es decir se obtuvieron

parásitos P. falciparum “knock-out” para el gen de la miosina B.

Integración3´

1242 pb

30002000150012001000

500

ADN Genómico1198 pb

Integración5´

1071 pb

5 2 1 0,5 M 0,5 1 CN (µl)

ADN genómico

BKO

ADNg3D7

M 3D7 CN BKO M 3D7 CN BKO M 3D7 CN BKO

RT-PCR

PCR universal

Iniciadores H2F-B 1176 pb

ADNc ADNc

H2O BKO BC 3D7 M H2O BKO BC

PCR semi-anidada

Iniciadores IniciadoresH1F-H1R H2F-H2R1039 pb 934 pb

1500

1000

500

A.

B.



Figura 4-50. WB para comprobar ausencia de expresión de PfMyoB en parásitos MyoB-KO

WB sobre extractos de parásitos 3D7 (silvestre) y MyoB-KO con anti-MTIP P2. En el carril de los

parásitos “knock-out” no se observa señal, mientas que en el carril de los parásitos silvestres la señal es

intensa. La gráfica inferior muestra la región que reconoce el anticuerpo, la cual no está presente en

PfMyoB de los parásitos noqueados.

4.4.2.4 Evaluación del comportamiento de los parásitos MyoB-KO en cultivo

Parásitos MyoB-KO y MyoB-C fueron mantenidos en cultivo a un hematocrito del 2% por 7

días consecutivos sin adición de glóbulos rojos y alimentándolos diariamente con medio de

selección. Todos los días se hicieron extendidos de los cultivos, recuento de las parasitemias

y observación minuciosa de la morfología de los parásitos. Con los datos de los recuentos de

cada cultivo se estimó el porcentaje de invasión en cada ciclo, interpretado como el número

de anillos encontrados después de la invasión con respecto al número de esquizontes y

trofozoitos maduros vistos el día anterior. En la figura 4-51a se muestra el comportamiento

de la invasión en el cultivo “knock-out” y control y se observa que en ambos fue similar y que

no hubo diferencias significativas, lo que sugiere que el silenciamiento del gen pfmyo-b no

altera el proceso de invasión. Interesantemente, se observó que en el cultivo MyoB-KO un

número importante de parásitos en estadio de anillo no logró pasar al estadio de trofozoito y

BKO 3D7 MW

kDa

130

100

70

55

40

MW 3D7 BKO 3D7 BKO

Extracto BKO: 35 µg/carrilExtracto 3D7: 35 µg/carril

Myo B

1 aa ATG 597 Stop prematuro 801

MyoB-KO

Anti-MyoBP2 (conejo)Dirigido contra péptido 720-733 aa

B


esta disminución paulatina de los parásitos redujo notablemente la parasitemia durante los 7

días de cultivo (figura 4-51b).

Figura 4-51. Comportamiento de parásitos MyoB-KO y MyoB-C durante el proceso de invasión y

de maduración

En las figuras A y B se muestra el comportamiento de los parásitos durante tres ciclos de

invasión. Los datos corresponden a tres experimentos independientes.

Los parásitos que no lograron avanzar a trofozoítos experimentaron cambios en su

morfología tornándose pequeños y poco a poco se compactaron (figura 4-52). En todos los

recuentos del cultivo “knock-out” el número de trofozoitos siempre fue menor comparado

con el número de anillos del día anterior. Estos resultados preliminares parecen indicar que

la deficiencia de PfMyoB afecta el crecimiento del parásito causándole la muerte pero no

afecta al parásito que está próximo a invadir.

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

BKO BCNú

me

ro d

e v

ece

s q

ue

in

va

dió

el

cu

ltiv

o

Comparación entre el número de veces que invadió el cultivo

MyoB-KO versus el cultivo

MyoB-Control

0

20

40

60

80

100

120

BKO BC

Po

rce

nta

je

Porcentaje de maduraciónB.A.




Figura 4-52. Morfología de los parásitos MyoB-C y MyoB-KO en cultivo

En el panel superior de imágenes se muestra la morfología de parásitos en estadio de anillos

(0-30 horas), en el panel central parásitos en estadio de esquizonte maduros (44-48 horas) y

en el panel inferior parásitos en estadio de trofozoíto (32-40 h). En los 3 paneles la fila

superior corresponde a parásitos MyoB-C (fila superior) mientras que la/las fila(s) inferior

corresponde a parásitos MyoB-KO. Estos parásitos fueron mantenidos en cultivo con medio

completo suplementado con WR99210.

4.4.2.5 Localización de MTIP en parásitos MyoB-KO

Para explorar si la ausencia de PfMyoB conlleva a algún cambio en la localización de MTIP, se

realizaron ensayos de IF con anti-MTIP ratón y anti-MTIP conejo en parásitos “knock-out” y

parásitos silvestres 3D7. En la figura 4-53 se presentan las imágenes de la IF sobre

esquizontes MyoB-KO y esquizontes de la cepa 3D7 y se observó que MTIP se localiza en la

periferia de los merozoítos bordeando el cuerpo de los mismos y que este patrón es igual en

parásitos “knock-out” y en parásitos silvestres.



Esquizontes de P. falciparum procedentes de un cultivo MyoB-KO


Esquizontes de P. falciparum procedentes de un cultivo silvestre (cepa 3D7)

Figura 4-53. IF con anticuerpo anti-MTIP sobre esquizontes de P.falciparum

En el panel superior se muestran esquizontes de parásitos MyoB-KO y en el panel inferior parásitos

silvestres 3D7

4.4.3 Discusión

Con el fin de explorar el posible papel funcional de PfMyoB en el proceso de invasión del

merozoíto al eritrocito, se utilizó la genética reversa para intentar silenciar los genes pfmyo-

a y pfmyo-b mediante recombinación homóloga sencilla utilizando el plásmido de

transfección pHH1. Los resultados obtenidos en este trabajo evidenciaron que el gen pfmyo-

a no es un gen refractario a la deleción genética, sino que puede sufrir eventos de

recombinación homóloga, como se demostró por la integración del constructo control y del

constructo “knock-out” en el gen endógeno. Sin embargo, y a la luz de la evidencia

experimental obtenida, se observó que los parásitos transfectados con el constructo “knock-



out” se comportaron distinto a los parásitos transfectados con el constructo control, mientras

que en el primer cultivo los parásitos con integración fueron escasos (PCR positiva para

integración 5’ y 3’ intermitente y con bandas débiles), en el segundo los parásitos con

integración fueron abundantes (PCR positiva para integración 5’ y 3’ todo el tiempo con

bandas intensas). Es importante al analizar este resultado tener en mente que a lo largo de

todo el proceso de transfección pudo ocurrir un problema técnico con el procedimiento de

electroporación y manejo de cultivos que provocara daño al parásito; sin embargo, este

aspecto pierde validez ya que se usó un constructo control que se procesó bajo las mismas

condiciones del constructo “knock-out”; en estos cultivos la población de parásitos MyoA-C

fue la más abundante con señales muy fuertes para integración 5’ y 3’ y con un población

minoritaria de parásitos silvestres. Estos cultivos crecieron normalmente y los parásitos no

mostraron cambios en su morfología. Con base en los resultados obtenidos se propone que la

alteración que sufre el gen pfmyo-a causa un efecto perjudicial sobre el parásito (muy pocos

parásitos integrados y muchos parásitos silvestres con episoma); sin embargo, no es posible

establecer si el efecto es nocivo (afecta al parásito sin causarle la muerte) o es letal (mata al

parásito). Se sugieren dos posibles hipótesis para tratar de explicar qué ocurrió con los

parásitos que integraron el constructo “knock-out”: 1) los parásitos PfMyoA-KO continúan

invadiendo pero con una eficiencia mucho menor, por lo tanto las nuevas generaciones de

parásitos con integración es muy baja y no incrementa con el tiempo y 2) Una vez el

constructo “knock-out” se integra en el gen blanco los parásitos mueren; sin embargo,

teniendo en cuenta que los parásitos mantienen el plásmido replicando episomalmente, en

éstos es posible que se lleven a cabo nuevos eventos de integración generando una PCR

positiva para integración 5’ y 3’ con fluctuaciones de la positividad en el tiempo. En este caso

la inmensa mayoría de los parásitos presentes en cultivo son parásitos silvestres con

episoma, ya que la integración del constructo es letal para el parásito.

El vector utilizado en este trabajo está diseñado para hacer recombinación homóloga sencilla

con el gen endógeno y de esta forma truncar el gen. Sin embargo, esta metodología tiene dos

desventajas, una es la integración del esqueleto del plásmido en la copia cromosomal de la

secuencia blanco y dos, debido a que el ADN que se integra viene desde un plásmido circular,

todas las poblaciones de parásitos en las que hay integración exitosa, contienen tanto

parásitos con el plásmido integrado como parásitos con el plásmido como un episoma

(Gardiner et al., 2003). Lo anterior implica que si la integración confiere un fenotipo nocivo,


aunque no letal, es imposible separar parásitos con formas integradas del plásmido, de

parásitos que únicamente alberguen el plásmido como un episoma, ya que estos últimos

crecerán mucho más rápido que las formas integradas (Crabb, 2002). Debido a las

limitaciones del sistema usado, no es posible establecer con certeza cuál es el efecto que

causa la integración del constructo “knock-out”, es decir si es nocivo o si es letal, y en ninguno

de los dos casos sería posible obtener una línea clonal, ya que en el primer caso, dependiendo

de lo severo que resulte el defecto, la población “knock out” crecerá muy lentamente con

respecto a una población silvestre con episoma, lo que conlleva a la generación de

poblaciones de parásitos con enormes diferencias en la proporción de cada una de ellas en

cultivo. Por otro lado, si la alteración del gen es letal, no será posible obtener una población

de parásitos vivos que tengan el gen pfmyo-a truncado.

Aunque con la estrategia utilizada sólo se pueden generar parásitos “knock-out” de genes que

no sean indispensables para el parásito, los resultados obtenidos no nos permiten concluir

que el gen pfmyo-a es un gen esencial para el parásito. Para poder establecer lo anterior es

necesario utilizar otro tipo de metodología, como podría ser un sistema condicional que

permita la generación eficiente de mutantes “knock-out” condicionales en los que se pueda

estudiar claramente el fenotipo sin tener la expresión de fondo del gen endógeno (Collins et

al., 2013).

Conocer con exactitud el efecto del silenciamiento del gen pfmyo-a, permitiría sugerir la

existencia en Plasmodium de un “glideosoma” alterno con una miosina distinta a PfMyoA. La

obtención de parásitos noqueados para pfmyo-a ayudaría a establecer si en ausencia de

MyoA, ésta puede ser reemplazada por PfMyoB a través de un mecanismo diferente al del

“glideosoma” tradicional, teniendo en cuenta que ésta no interactúa con MTIP y que de

acuerdo con Yusuf y colaboradores, MyoB utiliza otra cadena liviana (Yusuf et al., 2015).

Adicionalmente, la localización de MTIP no se alteró en parásitos “knock-out” para pfmyo-b,

reforzando la idea que estas dos proteínas no interactúan. Sin embargo, no se descartaría la

posibilidad que PfMyoB pueda reemplazar a PfMyoA, teniendo en cuenta que los resultados

de estudios in sílico e in vitro de Hernández y colaboradores mostraron que PfMyoB puede

unirse a MTIP (Hernández et al., 2017; Hernández et al., 2018).

Con respecto al gen pfmyo-b, tanto el constructo control como el constructo “knock-out” se

integraron en el gen endógeno mediante recombinación homóloga. La integración del

constructo pHH1-BKO en el genoma del parásito fue estable, es decir una vez se detectó se



mantuvo por periodos tan largos como 12 meses, y a diferencia de la integración del

constructo pHH1-AKO su rastreo se hizo mediante PCR convencional, obteniéndose siempre

bandas intensas. Además, a diferencia de los cultivos MyoA-KO, en los MyoB-KO no se detectó

ADN genómico cuando los cultivos fueron mantenidos con medio adicionado con WR99210,

lo cual sugiere que la población total de parásitos integró el plásmido. Para establecer si

luego de la integración del constructo “knock-out” el gen pfmyo-b endógeno fue silenciado, se

hicieron ensayos RT-PCR para establecer si el gen se transcribe y ensayos WB para

determinar si la proteína se expresa. Ambos ensayos evidenciaron respectivamente que el

gen no se transcribe y que la proteína no se expresa, resultados que permiten afirmar que el

gen pfmyo-b fue silenciado y que se lograron obtener parásitos P. falciparum “knock-out” de

MyoB. Para explorar sobre la función de PfMyoB, cultivos MyoB-KO y MyoB-C se crecieron en

presencia de WR99210 durante 7 días y se observó que en los parásitos MyoB-KO la mayoría

de anillos no logran avanzar al estadio de trofozoíto y que los pocos que avanzaron y llegaron

a esquizonte, aparentemente contienen merozoítos sanos con capacidad para invadir nuevos

glóbulos rojos en un proceso de invasión normal. La ausencia de PfMyoB produjo grandes

efectos en la maduración del parásito causándole la muerte y aunque se evidenció una

reducción significativa de la parasitemia con respecto al cultivo control, no se observó el

mismo efecto que en el caso de MyoA-KO. Estas observaciones sugieren que la miosina B no

está involucrada en el proceso de invasión sino en el desarrollo del parásito, específicamente

en el paso de anillo a trofozoíto. En conjunto estos hallazgos sugieren que PfMyoB puede

estar siendo reemplazada por otra miosina que compensa su función y por lo tanto pfmyo-b

no sería un gen esencial para el parásito.

La transfección de parásitos Plasmodium falciparum solo se ha logrado con la introducción de

ADNp circular no digerido y hasta ahora no se conocen las razones de este requerimiento. En

términos generales, una vez los plásmidos ingresan a la célula blanco y bajo presión de

selección, éstos replican episomalmente como concatámeros que segregan inestablemente,

para posteriormente integrarse en el genoma del parásito por recombinación con las

secuencias blanco. Aunque la replicación de los plásmidos parece ser eficiente, estas formas

no se segregan igualmente entre todos los merozoitos hijos, por lo tanto los plásmidos

episomales se pierden en algunos parásitos, generando parásitos silvestres, cuando el


medicamento se retira (Crabb 2002). En este trabajo los parásitos de los 4 cultivos (A-KO, A-

C, B-KO y B-C) siempre mostraron la presencia de abundantes episomas, aún después de los

diferentes periodos de ausencia de presión con WR99210. O`Donnell y col. (2001) reportaron

que los plásmidos transfectados pueden cambiar a formas replicantes estables (SRF), las

cuales son mantenidas episomalmente en la ausencia de medicamento. Un SRF es un

concatámero grande constituido por al menos 9 plásmidos organizados en un arreglo cabeza

a cola. Aunque los autores sugieren que la formación de estos particulares concatámeros se

presenta especialmente cuando la integración del constructo no se produce, es probable que

los plásmidos de los 4 cultivos hayan adoptado esta nueva conformación y esto explicaría su

presencia abundante y duradera aun en ausencia de medicamento. Aunque la formación de

estas estructuras es posible, es necesario obtener evidencia experimental que nos permita

corroborar la formación de éstas.

Aunque no se mencionó en el texto, previo a los resultados reportados en este trabajo se

realizaron transfecciones mediante electroporación de glóbulos rojos infectados con

parásitos en estadio de anillos. Este procedimiento no funcionó como se corroboró luego de

mantener cultivos post- transfección por alrededor de 50 días, en los cuales nunca

aparecieron parásitos. La introducción de ADN exógeno mediante el método de eritrocitos

precargados fue muy eficiente, como se pudo comprobar en este estudio y como ha sido

reportado por Hasenkamp y col. (2013) y Deitsch y col. (2001), quienes aseguran que el éxito

radica en evitar la aplicación de pulsos eléctricos a los glóbulos rojos parasitados. Con este

método se ha visto que la eficiencia de la transfección mejora alrededor de 180 veces.

4.5 Identificación de potenciales motivos funcionales en PfMyoB usando herramientas informáticas

4.5.1 Métodos

4.5.1.1 Búsqueda de motivos IQ sobre PfMyoB con modelos ocultos de Markov (HMM)

Se tomaron 57 secuencias de motivos IQ (PFAM: PF00612) de Apicomplexa desde la base de

datos de PFAM, y se construyó el modelo HMM mediante la herramienta bioinformática HMM

3.0. Para refinar el modelo de búsqueda, se incluyeron también 70 secuencias de motivos IQ



pertenecientes a la base de datos: Calmodulina Target Database

(http://calcium.uhnres.utoronto.ca/ctdb/ctdb/).

4.5.1.2 Búsqueda de motivos IQ sobre PfMyoB con expresiones regulares

A partir del patrón IQ, [FILV]Qxxx[RK]Gxxx[RK], reportado por Rhoads y Friedberg (1997),

se hizo la comparación manual de cada una de las posiciones utilizando como punto de

referencia los cambios observados en los alineamientos de 70 secuencias de motivos IQ de la

base de datos “Calmodulina Target Database”

(http://calcium.uhnres.utoronto.ca/ctdb/ctdb/) y los alineamientos de 84 secuencias

pertenecientes a los 6 motivos IQ de las miosinas clase V de algunos organismos eucariotas

(Terrak et al., 2005).

4.5.2 Resultados

4.5.2.1 Búsqueda de motivos IQ sobre PfMyoB con HMM

La búsqueda identificó cinco motivos IQ en la miosina C (PfMyoC) y 2 motivos IQ en la

miosina F (PfMyoF). En la tabla 4-3 se muestran las secuencias de los motivos IQ encontrados

con el modelo HMM (desde la posición 915 hasta la posición 1052 en PfMyoC y desde la

posición 1297 hasta la posición 1381 en PfMyoF), así como los señalados por las interfaces

SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/) y MyHits (http://myhits.isb-sib.ch/). Se puede

ver que el modelo HMM construido identifica (al igual que las anteriores interfaces de

búsqueda) motivos IQ en dos de las seis miosinas de P. falciparum; sin embargo, encuentra

un motivo IQ adicional en PfMyoC y otro en PfMyoF. Para PfMyoB no se encontró ningún

motivo IQ con esta herramienta.


Miosinas Secuencias IQ identificadas

Con HMM Con SMART y MyHits

PfMyoC

IQKNYKTYTQK

IQSHIRRYLMV

IQATWKAYKEH

IQLKWKSILAR

IQRWFRNRLNI

IQKNYKTYTQK

IQSHIRRYLMV

IQATWKAYKEH

IQLKWKSILAR

PfMyoF IQKNYRTYILR

IQRAFKKYMKK

IQKNYRTYILR

Tabla 4-3. Motivos IQ identificados en las miosinas de Plasmodium falciparum con el modelo

HMM

Secuencias de motivos IQ encontradas en las miosinas C y F con el modelo HMM construido y con las

interfaces de búsqueda de dominios y motivos. En negrilla se indica el motivo IQ adicional encontrado

con el perfil construido.

4.5.2.2 Búsqueda de motivos IQ sobre PfMyoB con expresiones regulares

A partir del patrón IQ, [FILV]Qxxx[RK]Gxxx[RK], reportado por Rhoads y Friedberg (1997),

se hizo la comparación manual de cada una de las posiciones utilizando como punto de

referencia los cambios observados en los alineamientos de 70 secuencias de motivos IQ de la

base de datos de “Calmodulina Target. Database”

(http://calcium.uhnres.utoronto.ca/ctdb/ctdb/) y los alineamientos de 84 secuencias

pertenecientes a los 6 motivos IQ de las miosinas clase V de algunos organismos eucariotas

(Terrak et al., 2005). Inicialmente los cambios de aminoácidos encontrados en las posiciones

1, 6 y 11 de los alineamientos fueron tomados en cuenta para la construcción de la expresión

regular. Adicionalmente, las posiciones 1 y 11 de la expresión regular se complementaron

con algunos aminoácidos variables que el HMM había identificado, y con residuos

pertenecientes a los de motivos IQ de la miosina A de P. falciparum y T. gondii. Finalmente,

con la expresión regular generada se hizo la búsqueda de motivos IQ en las miosinas de P.

falciparum, utilizando ScanProsite desde la interface de PROSITE

(http://prosite.expasy.org/) y desde un entorno no gráfico con un script específico de

búsqueda (scan_for_matches -p patron <Secuencias\mioPlasmodium.txt). Con el fin de

constatar la veracidad del modelo de búsqueda, se utilizó este mismo patrón para identificar

motivos IQ conocidos en las miosinas de T. gondii.



La búsqueda con la expresión regular [FLIVMAC]-Q-X(3)-[RK]-[GAKMQRSTVLND]-X(3)-

[RKVFQLTSADHI] sobre las miosinas de P. falciparum, identificó 17 motivos IQ, de los cuales

solo cinco habían sido identificados anteriormente por las interfaces de búsqueda de

dominios y motivos. En otras palabras, la búsqueda con la expresión regular generada

identificó motivos IQ que para el momento en que se hizo el análisis no habían sido

reportados para las miosinas del parásito. En la tabla 4-4 aparecen motivos IQ encontrados

con las diferentes metodologías de búsqueda.

Miosinas de P. falciparum

Interfaces de búsqueda

Modelo HMM Expresión regular

PfMyoA - - IQ1: VQAHIRKKMVA

PfMyoB - - IQ1: AQAYFRKYKYI

PfMyoC IQ1: IQKNYKTYTQK

IQ2: IQSHIRRYLMV

IQ3: IQATWKAYKEH

IQ4: IQLKWKSILAR

IQ1: IQKNYKTYTQK

IQ2: IQSHIRRYLMV

IQ3: IQATWKAYKEH

IQ4: IQLKWKSILAR

IQ5: IQRWFRNRLNI

IQ1: IQKNYKTYTQK

IQ2: IQSHIRRYLMV

IQ3: IQATWKAYKEH

IQ4: IQLKWKSILAR

IQ5: IQRWFRNRLNI

IQ6: IQNSNKKNQQI

PfMyoD - - IQ1: IQGDEKKKEIR

IQ2: IQSDEKNVPTT

IQ3: LQNKDKTINKL

PfMyoE - - IQ1: VQKKKKKKKRR

IQ2: AQNKNKKYNIL

PfMyoF IQ1: IQKNYRTYILR

IQ1: IQKNYRTYILR

IQ2: IQRAFKKYMKK

IQ1: IQKNYRTYILR

IQ2: IQRAFKKYMKK

IQ3: IQCVYKYWLHI

IQ4: FQKYFKQRVKA

Tabla 4-4. Motivos IQ encontrados con tres estrategias de búsqueda

En negrilla se muestran los motivos IQ encontrados con el modelo HMM creado y la expresión regular

construida


4.5.3 Discusión

Los motivos IQ generalmente forman una alfa hélice anfipática conformada por 20

aminoácidos que conserva un patrón específico (Rhoads y Friedberg, 1997). Sin embargo, en

las miosinas de P. falciparum ese patrón se restringió a solo tres posiciones: la posición 1 con

un aminoácido hidrofóbico, la posición 2 con una glutamina (Q) y la posición 6 con un

aminoácido básico. Estos resultados son similares a los descritos en los estudios de

cristalografía realizados al complejo de la miosina Myo2p (miosina clase V de Saccharomyces

cerevisiae) y la cadena liviana MLc1p, en donde se señalan cinco posiciones esenciales para

reconocer un motivo IQ: 1, 2, 6, 7 y 11 (Bähler y Rhoads, 2002). A pesar de que la posición 11

es una de las que se considera como criterio para señalar un motivo IQ, nuestros resultados

mostraron que este residuo fue el que presentó mayor variación en todas las potenciales

secuencias IQ de las miosinas de P. falciparum.

Notablemente, uno de los motivos IQ identificados por la expresión regular en PfMyoA,

coincidió con la región que interactúa directamente con MTIP en el complejo PfMyoA-MTIP

descrito por cristalografía (Bosch et al., 2007) y en el modelo de docking reportado en 2017

(Hernández et al., 2017). Para PfMyoB, el motivo IQ identificado por la expresión regular

coincidió con la región que interactúa con MTIP en los ensayos de docking (Hernández et al.,

2017). Estos resultados juntos refuerzan la idea que los motivos encontrados con la

expresión regular, pueden en efecto ser IQs funcionales.

5 Discusión general

Plasmodium falciparum posee tres miosinas que pertenecen a la clase XIV y dentro de éstas,

la miosina A y la miosina B comparten numerosas similitudes como ser las miosinas de

menor tamaño, compartir estructuras similares (Hernández et al., 2017), no poseer dominio

de cola y expresar la proteína en los merozoitos presentes en esquizontes tardíos y en

merozoitos libres (Chaparro et al., 2003). Estas semejanzas entre PfMyoB y PfMyoA, esta

última involucrada en la movilidad “gliding” y en la invasión del eritrocito (Pinder et al.,1998;

Jones et al., 2006), sugieren una potencial intervención de PfMyoB en el proceso de invasión.

Adicionalmente, siendo Plasmodium un organismo intracelular obligado, la invasión de

células hospederas es un proceso vital para el parásito, por lo cual no sería insólito que

Plasmodium tuviera dos miosinas funcionalmente redundantes o complementarias, situación

que ya ha sido descrita en Toxoplasma (Frenal et al., 2014; Graindorge et al., 2016).

En T. gondii además del típico glideosoma conducido por TgMyoA (glideosoma-MyoA), se

identificaron dos glideosomas adicionales conducidos por otras miosinas de la clase XIV, las

cuales exhibieron la misma organización y compartieron algunos componentes comunes del

glideosoma-MyoA, pero su distribución espacial fue distinta y restringida a zonas específicas

del parásito. Así, el glideosoma-TgMyoA se localizó en la periferia del parásito en la parte

central del ICM, el glideosoma-TgMyoC en el polo basal (Frénal et al., 2014) y el glideosoma-

TgMyoH en el polo apical, específicamente en el conoide (Graindorge et al., 2016). El

silenciamiento génico de estas miosinas permitió establecer la redundancia funcional

existente entre estas proteínas durante la invasión, así la deleción de TgMyoA (Andenmatten

et al., 2013) condujo a la relocalización de TgMyoC a lo largo de la película, proporcionando

evidencia que TgMyoC puede parcialmente reemplazar a TgMyoA. La deleción de TgMyoC

produjo una caída importante de la invasión (Frénal et al., 2014) y la deleción simultánea de

TgMyoA/B/C (Egarter et al., 2014) fue letal para T. gondii. Lo anterior demostró que TgMyoA

y TgMyoC pueden complementarse una a otra (Frénal et al., 2014). En cuanto al glideosoma

122 Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su posible papel en la


conducido por TgMyoH, esta miosina es necesaria para el desplazamiento de la unión móvil

desde el polo apical hasta el polo basal del parásito. TgMyoH se localiza en el extremo apical

de los taquizoitos y es esencial, es decir, la deleción de este gen conlleva a la muerte del

parásito. Esta miosina es responsable de iniciar la locomoción “gliding” en el conoide

(Graindorge et al., 2016). A diferencia de T. gondii, hasta el momento no se ha reportado en P.

falciparum la presencia de glideosomas distintos al glideosoma-PfMyoA. Sin embargo, las tres

miosinas de la clase XIV, es decir las miosinas involucradas en el “gliding”, presentan

localizaciones celulares distintas (Wall et al., 2019). Aunque la inmensa mayoría del

conocimiento generado en torno a la función de las miosinas en Apicomplexas proviene de

los estudios realizados en T. gondii, no necesariamente los hallazgos encontrados en este

parásito pueden ser extrapolados en Plasmodium.

Para explorar la hipótesis de la redundancia funcional o la complementariedad entre PfMyoB

y PfMyoA, se produjeron parásitos “knock-out” para el gen pfmyo-b. En estos parásitos se

abolió la expresión de PfMyoB, lo cual indicó que esta miosina no es esencial para la

supervivencia del parásito. Este mismo hallazgo fue reportado recientemente por Wall y

colaboradores, quienes lograron recuperar parásitos luego del silenciamiento del gen, los

cuales tuvieron un desarrollo normal (Wall et al., 2019). En nuestro estudio, la ausencia de

esta proteína causó alteraciones en el desarrollo del parásito, las cuales fueron evidentes

durante el paso de anillo a trofozoito. Estos parásitos tuvieron una morfología distinta a los

parásitos control, evidenciándose una reducción significativa en el número de parásitos en

estadio de anillo que logra avanzar a trofozoito. En cuanto al estadio de trofozoitos tardíos y

esquizontes no se observaron cambios morfológicos ni diferencias en el porcentaje de

invasión entre los parásitos control y los “knock-out”. Los hallazgos encontrados sugieren que

PfMyoB no está involucrada en el proceso de invasión al glóbulo rojo, con lo cual esta miosina

no tendría una función similar, complementaria o redundante con PfMyoA.

El silenciamiento de PfMyoB no produjo cambios en la localización de MTIP y al evaluar

interacción entre estas dos proteínas mediante IP en parásitos silvestres, no se detectó

interacción. Yusuf y colaboradores reportaron que PfMyoB no interactúa con MTIP y en

cambio interactúa con otra cadena liviana denominada MLC-B (Myosin Light Chain-B) (Yusuf

et al., 2015). Aunque nuestros resultados mostraron que PfMyoB no interactúa con MTIP,

Discusión general 123

esta interpretación debe hacerse con cautela ya que es relevante considerar la presencia de

dos motivos IQ en PfMyoB, los cuales le permiten interactuar in vitro con MTIP (Hernández et

al., 2017; Hernández et al., 2018) y la abundancia de PfMyoA respecto a PfMyoB (Yusuf et al.,

2015).

La localización discreta de PfMyoB en el extremo apical de las formas invasivas de P.

falciparum es muy parecida a la localización de TgMyoH en T. gondi y esta similitud llevó a

pensar que PfMyoB podría tener una función similar, es decir ser el motor que provee la

fuerza para conducir el “gliding” en la zona apical del merozoito, mientras que PfMyoA sería

el motor del “glideosoma” presente en la periferia de los merozoitos. Con base en los

resultados obtenidos en este trabajo, PfMyoB no parece estar implicada en el proceso de

invasión y a diferencia de TgMyoH, PfMyoB no es una miosina esencial.

A pesar del cuerpo de evidencia presentado, el cual nos llevó a sugerir que PfMyoB no

participa en la invasión al eritrocito, es de suma importancia generar parásitos MyoA “knock-

out” para comprobar estas interpretaciones. Solo así, se podría establecer claramente el

papel de PfMyoB y su posible redundancia funcional con PfMyoA. En la actualidad, el estado

del arte respecto al efecto del silenciamiento del gen pfmyo-a en Plasmodium ha permitido

establecer que MyoA tiene un papel esencial en la movilidad “gliding” de ooquinetes de P.

berguei (Siden-Kiamos et al., 2011); sin embargo, aun no hay estudios en P. falciparum y no

se sabe cómo la ausencia de MyoA afecta la invasión de eritrocitos. Para ahondar sobre el rol

funcional de PfMyoB se intentó generar parásitos MyoA “knock-out”, usando el mismo

sistema utilizado para PfMyoB, el cual solo permite la generación de parásitos “knock-out” de

genes que al ser silenciados no causen efectos letales al parásito. A pesar de este

condicionamiento, se logró la integración del constructo MyoA “knock-out” en el gen

endógeno pfmyo-a; sin embargo, no fue posible recuperar esta población de parásitos y por

lo tanto no se logró comprobar si efectivamente se interrumpió la transcripción del gen

pfmyo-a y si se abolió la expresión de la proteína. Hasta la fecha no se ha publicado

información relacionada con el uso exitoso en Plasmodium falciparum de sistemas de

silenciamiento génico que permitan generar mutantes “knock-out” condicionales para MyoA,

a partir de los cuales se pueda obtener una línea clonal para análisis fenotípico y así

determinar el papel de PfMyoA durante la invasión y el “gliding”. Esto deja ver las dificultades

técnicas inherentes al trabajo con Plasmodium falciparum, lo cual está muy relacionado con



las bajas eficiencias de transfección (10-5 - 10-6) y con el periodo de replicación del plásmido

episomal y la recombinación (Meissner et al., 2007).

6 Conclusiones

Se determinaron las condiciones de tiempo, temperatura y sistema bacteriano en las cuales

se obtiene la mayor expresión de las proteínas recombinantes GST-GAP451-204, GST-MTIP1-204,

GST-GAP5026-175, GST-MyoA227-476 y His-MyoB357-502.

Se produjeron 4 anticuerpos contra las proteínas del “glideosoma”: MyoA, MTIP, GAP45 y

GAP50, a partir de las recombinantes generadas. Estos anticuerpos reconocieron las

proteínas de forma específica y fueron utilizados en diferentes tipos de ensayos como WB, IF

e IP.

MTIP interactúa con MyoA, como ya ha sido previamente reportado, pero evidenció no

interactuar con MyoB, lo cual sugiere que esta miosina no hace parte del “glideosoma” –

MyoA.

El estudio de la proteína MyoB resultó ser un gran desafío. De los múltiples intentos

realizados para producir un anticuerpo anti-MyoB, sólo a partir de un péptido sintético, se

logró obtener el anticuerpo, el cual permitió detectar a la proteína en extractos del parásito y

establecer la localización apical de la misma.

No fue posible identificar proteínas que interactúan con PfMyoB ya que el anticuerpo anti-

MyoB no tuvo la capacidad de inmunoprecipitar PfMyoB, por lo tanto no fue útil en ensayos

de inmunoprecipitación.

El silenciamiento génico (“knock-out”) de PfMyoB no tuvo efecto aparente sobre la invasión

del parásito al eritrocito; sin embargo, el parásito sufrió daños importantes, los cuales se

evidencian en un retraso del crecimiento en el paso del estadio de anillo a trofozoíto y

posiblemente la muerte del parásito. A pesar de la ausencia de PfMyoB, los parásitos logran

sobrevivir aunque en menor proporción respecto a parásitos control y esto parece indicar

que PfMyoB no es un gen esencial para la supervivencia de los estadíos intraeritrocíticos de

P. falciparum y que posiblemente su función esta siendo compensada por otra proteína.



El silenciamiento génico (“knock-out”) de pfmyo-a afectó de manera importante la

supervivencia de los parásitos “knock-out”, ya que al parecer les causó la muerte. Este

hallazgo lleva a pensar que PfMyoA es esencial para la fisiología del parásito.

Se construyó un modelo HMM y una expresión regular, estrategias que permitieron identificar

motivos IQ que no habían sido encontrados antes por las interfaces de búsqueda de dominios

y motivos en las miosinas de P. falciparum.

7 Anexos

A. Anexo. Secuencias de Iniciadores

Iniciadores usados en capítulo de proteínas recombinantes

Letra de color verde en la secuencia del iniciador, corresponde al sitio de restricción de la enzima

BamHI; letra de color rojo, corresponde al sitio de restricción de la enzima NotI; letra de color fucsia

corresponde al sitio de restricción de la enzima XhoI; S es iniciador sentido; AS es iniciador

antisentido; subrayado en S corresponde al codón de inicio, subrayado en AS corresponde al codón de

parada



Iniciadores usados con los vectores pGEM-T easy, pET15b y pGEX

Iniciadores para generación de constructos “knock-out” y control de pfmyo-a y pfmyo-b

Anexo A. Secuencias de Iniciadores 129

Iniciadores para PCR diagnóstica en el caso de pfmyo-a

Iniciador para PCR diagnóstica: PCR semi-anidada en el caso de pfmyo-a

Iniciador Secuencia 5’-3’ Forma detectada Tamaño esperado

An (S) ATTAACATTACTAACGAAATGCTTC Integración 5’ An y D: 886 pb

Svenja (S) CCAATAGATAAAATTTGTAGAG Integración 3’ Svenja-Z: 1013 pb C y Z: 906 pb

S: iniciador sentido



Iniciadores para PCR diagnóstica en el caso de pfmyo-b

Iniciadores para PCR semi-anidada y RT-PCR en el caso de pfmyo-b

Iniciador Secuencia 5’-3’ Tamaño esperado

H2F (S) GGTGGTAAATCTAATTGTAG H2F y B: 1176 pb

Tail (AS) TTATTCGTGTTCCTTAATAT E y Tail: 1076 pb

H1F (S) ATGGTGAATAAAATCAACGA 1039 pb

H1R (AS) CCAAAAGTAACAACCCTGACA

S: iniciador sentido; AS: iniciador antisentido

B. Anexo. Mapas de vectores

Vector de clonación

Vector Características Resistencia a

antibiótico Casa

comercial

pGEM®- T easy

Este es un vector linealizado que en sus extremos presenta una timidina 3´-terminal. Contiene los promotores T7 y SP6 ARN polimerasa flanqueando la región de clonación múltiple, la cual se ubica dentro de la región codificante del α-péptido de la enzima β-galactosidasa. La inactivación del α-péptido por inserción del fragmento a clonar permite la identificación de colonias recombinantes por tamizaje azul/blanco sobre placas de agar indicadoras.

Ampicilina Promega

Mapa del vector pGEM®-T easy y principales características



Vectores de expresión

Vector Características Tag Tamaño del tag

Resistencia a antibiótico

Casa comercial

pGEX-4T2 El gen clonado se inserta corriente abajo del gen GST. Promotor tac, represor lac Iq

GST ~27 kDa Ampicilina GE Healthcare

pET15b

El gen clonado se inserta corriente abajo de 6 codones CAT. Promotor T7, represor lac Iq

6 His ~840 Da Ampicilina Novagen

Mapa del vector pGEX-4T 2 (proteínas de fusión GST) mostrando el marco de lectura y las

principales características

Anexo B. Mapa de vectores 133

Mapa del vector pET15b (proteínas de fusión 6xHis) y principales características



Vector para recombinación homóloga

Vector Características Tipo de

recombinación Resistencia

a antibiótico Cassette de

selección Casa

comercial

pHH1

El gen hdhfr está bajo el control del promotor de la CaM de P. falciparum

Sencilla Ampicilina

Gen humano que codifica para una DHFR mutada

Donado por S. Muller (a partir de A. Cowman)

Mapa del vector pHH1

C. Anexo. Secuencia de las proteínas recombinantes

Las proteínas GAP45 y MTIP fueron expresadas en su totalidad, mientras que para PfMyoA, PfMyoB y

GAP50 se expresó un fragmento de la proteína. Las regiones expresadas de las cinco proteínas se

muestran en letra de color púrpura y negrilla. Al principio de cada secuencia se muestra el número

total de aa de cada proteína y el número total de aa de la recombinante.

PfMyoA 818aa GST-MyoA227-476: 250 aa MAVTNEEIKTASKIVRRVSNVEAFDKSGSVFKGYQIWTDISPTIENDPNIMFVKCVVQQGSKKEKLTVVQIDPPGTGTPY

DIDPTHAWNCNSQVDPMSFGDIGLLNHTNIPCVLDFLKHRYLKNQIYTTAVPLIVAINPYKDLGNTTNEWIRRYRDTADH

TKLPPHVFTCAREALSNLHGVNKSQTIIVSGESGAGKTEATKQIMRYFASSKSGNMDLRIQTAIMAANPVLEAFGNAKTI

RNNNSSRFGRFMQLVISHEGGIRYGSVVAFLLEKSRIITQDDNERSYHIFYQFLKGANSTMKSKFGLKGVTEYKLLNPNS

TEVSGVDDVKDFEEVIESLKNMELSESDIEVIFSIVAGILTLGNVRLIEKQEAGLSDAAAIMDEDMGVFNKACELMYLDP

ELIKREILIKVTVAGGTKIEGRWNKNDAEVLKSSLCKAMYEKLFLWIIRHLNSRIEPEGGFKTFMGMLDIFGFEVFKNNS

LEQLFINITNEMLQKNFVDIVFERESKLYKDEGISTAELKYTSNKEVINVLCEKGKSVLSYLEDQCLAPGGTDEKFVSSC

ATNLKENNKFTPAKVASNKNFIIQHTIGPIQYCAESFLLKNKDVLRGDLVEVIKDSPNPIVQQLFEGQVIEKGKIAKGSL

IGSQFLNQLTSLMNLINSTEPHFIRCIKPNENKKPLEWCEPKILIQLHALSILEALVLRQLGYSYRRTFEEFLYQYKFVD

IAAAEDSSVENQNKCVNILKLSGLSESMYKIGKSMVFLKQEGAKILTKIQREKLVEWENCVSVIEAAILKHKYKQKVNKN

IPSLLRVQAHIRKKMVAQ PfMyoB 801 aa His-MyoB357-502: 146 aa MVNKINELNNYFRINSTFINKSENESENFYVWTYKSPNVDLYPDLVFFKCQVLNINGDNYEVKEISPETNSVYTVKKEHL

FNCNNMVNINSHRLNDMVHQNSAEVLNTLALRYEKNYIYTIAEPMLISVNPYQVIDTDMNEYKNKSTDLLPPHVYTYAKD

AMLDFINTKNSQSIIISGESGSGKTEASKLVIKFYLSGVREDNDISKTLWDSNFILEAFGNAKTVKNNNSSRYGKYIKIQ

LDENQNIVSSSIEIFLLEKIRVVSQEPDERCYHIFYEILKGMNDEMKKKYKIKSEEDYKYISNKSINIPEIDDAKDFENL

MISFDKMKMSDLKDDLFLTLSGLLLLGNIQFNGIEKGGKSNCSELDDENLEVVNEASELLGIDYESLKNSLVITEKSIAN

QKIEIPLSIEESLSICRSISKDIYNKIFEYITKRINNFLNNNKELENFIGILDIFGFEIFVKNSLEQLLINIANEEIHNI

YLFVVYEKESNLYKKEGIIIESVKYTNNESIIDLLRGKTSIISILEDNCLAPGKKDESIVSVYTNKFSKNEHYSVCKKNI

TESFVIKHTVSDVTYSISNFISKNKDILSPNILKLLKVSNNKLIQNLYDDAEVTDSLGRKNLITYKYLENLKKICSYLKS

TNIYFIKCIKPNETKEKNNFNPKKVYPQLFSLSIVETLNIKYFFQYKYTFASFLSYYQYLDIAVSNDSSLDEKTKVTMLL

ERNFDKDSYKVGHTMVFLKKEAVHKIRDIINSNLKCYRNLCCITSALIMKIKKKRIVEENIKNLQLAQAYFRKYKYIKEH

E PfGAP50 396aa GST-GAP5026-175: 150 aa MNYCKTTFHIFFFVLFFITIYEIKCQLRFASLGDWGKDTKGQILNAKYFKQFIKNERVTFIVSPGSNFIDGVKGLNDPAW

KNLYEDVYSEEKGDMYMPFFTVLGTRDWTGNYNAQLLKGQGIYIEKNGETSIEKDADATNYPKWIMPNYWYHYFTHFTVS

SGPSIVKTGHKDLAAAFIFIDTWVLSSNFPYKKIHEKAWNDLKSQLSVAKKIADFIIVVGDQPIYSSGYSRGSSYLAYYL

LPLLKDAEVDLYISGHDNNMEVIEDNDMAHITCGSGSMSQGKSGMKNSKSLFFSSDIGFCVHELSNNGIVTKFVSSKKGE

VIYTHKLNIKKKKTLDKVNALQHFAALPNVELTDVPSSGPMGNKDTFVRVVGTIGILIGSVIVFIGASSFLSKNMK PfGAP45 204 aa GST-GAP451-204: 204 aa MGNKCSRSKVKEPKRKDIDELAERENLKKQSEEIIEEKPEEVVEQVEETHEEPLEQEQELDEQKIEEEEEEPEQVPKEEI

DYATQENKSFEEKHLEDLERSNSDIYSESQKFDNASDKLETGTQLTLSTEATGAVQQITKLSEPAHEESIYFTYRSVTPC

DMNKLDETAKVFSRRCGCDLGERHDENACKICRKIDLSDTPLLS

PfMTIP 204 aa GST-MTIP1-204: 204 aa MKQECNVCYFNLPDPESTLGPYDNELNYFTWGPGFEYEPEPQRKPLSIEESFENSEESEESVADIQQLEEKVDESDVRIY

FNEKSSGGKISIDNASYNARKLGLAPSSIDEKKIKELYGDNLTYEQYLEYLSICVHDKDNVEELIKMFAHFDNNCTGYLT

KSQMKNILTTWGDALTDQEAIDALNAFSSEDNIDYKLFCEDILQ

D. Anexo. Secuenciación de los fragmentos clonados en vector de expresión

Secuenciación del fragmento GAP451-204 clonado en el vector de expresión pGEX 4 T2. ATG

corresponde al codon de inicio de gap45 y TAA corresponde al codón de parada de la traducción. En

letra verde y roja se muestran las secuencias de las enzimas de restricción BamHI y NotI.

ARNm/Gap45 corresponde a la secuencia teórica y Secuenciación a la secuencia reportada por la

compañia

ARNm/Gap45 -----------------------ATGGGAAATAAATGTTCAAGAAGCAAAGTAAAGGAAC

Secuenciación CGGATCTGGTTCCGCGTGGATCCATGGGAAATAAATGTTCAAGAAGCAAAGTAAAGGAAC

*************************************

ARNm/Gap45 CCAAACGTAAAGATATTGATGAATTAGCTGAACGTGAAAATTTAAAAAAACAATCTGAAG

Secuenciación CCAAACGTAAAGATATTGATGAATTAGCTGAACGTGAAAATTTAAAAAAACAATCTGAAG

************************************************************

ARNm/Gap45 AAATAATTGAAGAAAAACCAGAAGAAGTTGTTGAGCAAGTAGAAGAAACACATGAAGAAC

Secuenciación AAATAATTGAAGAAAAACCAGAAGAAGTTGTTGAGCAAGTAGAAGAAACACATGAAGAAC

************************************************************

ARNm/Gap45 CTCTTGAACAAGAACAGGAACTGGATGAACAGAAAATAGAAGAAGAAGAAGAAGAACCTG

Secuenciación CTCTTGAACAAGAACAGGAACTGGATGAACAGAAAATAGAAGAAGAAGAAGAAGAACCTG

************************************************************

ARNm/Gap45 AACAAGTACCAAAAGAAGAAATAGATTATGCAACTCAAGAAAATAAATCATTTGAAGAAA

Secuenciación AACAAGTACCAAAAGAAGAAATAGATTATGCAACTCAAGAAAATAAATCATTTGAAGAAA

************************************************************

ARNm/Gap45 AACATTTAGAAGATTTAGAAAGATCTAATTCAGATATTTATTCAGAATCTCAAAAATTTG

Secuenciación AACATTTAGAAGATTTAGAAAGATCTAATTCAGATATTTATTCAGAATCTCAAAAATTTG

************************************************************

ARNm/Gap45 ATAATGCTAGTGATAAATTAGAAACAGGAACTCAATTAACCTTATCTACTGAAGCCACTG

Secuenciación ATAATGCTAGTGATAAATTAGAAACAGGAACTCAATTAACCTTATCTACTGAAGCCACTG

************************************************************

ARNm/Gap45 GTGCCGTACAACAAATAACTAAATTAAGTGAACCCGCCCATGAAGAAAGTATATATTTTA

Secuenciación GTGCCGTACAACAAATAACTAAATTAAGTGAACCCGCCCATGAAGAAAGTATATATTTTA

************************************************************

ARNm/Gap45 CTTATAGATCTGTAACACCTTGTGATATGAATAAACTCGATGAAACCGCTAAAGTTTTTT

Secuenciación CTTATAGATCTGTAACACCTTGTGATATGAATAAACTCGATGAAACCGCTAAAGTTTTTT

************************************************************

ARNm/Gap45 CAAGAAGATGTGGATGTGATCTTGGTGAACGTCATGATGAAAATGCATGTAAAATTTGTA

Secuenciación CAAGAAGATGTGGATGTGATCTTGGTGAACGTCATGATGAAAATGCATGTAAAATTTGTA

************************************************************

ARNm/Gap45 GAAAAATTGATTTATCCGATACACCTTTATTGAGCTAA----------------------

Secuenciación GAAAAATTGATTTATCCGATACACCTTTATTGAGCTAAGCGGCCGCATCGTGACTGACTG

**************************************

E. Anexo. Secuenciación del clon AD y CZ

Alineamiento clon A-D

Secuenciación del producto de PCR obtenido en la PCR diagnóstica para integración 5’ sobre ADNg de

cultivos MyoA-KO. El primer resaltado azul corresponde a la secuencia del iniciador A y el último a la

secuencia del iniciador D. TAA corresponde al codón prematuro que fue insertado en la secuencia del

constructo “knock-out” para MyoA.



Alineamiento clon CZ

Secuenciación del producto de PCR obtenido en la PCR diagnóstica para integración 3’ sobre ADNg de

cultivos MyoA-KO. El primer resaltado verde corresponde a la secuencia del iniciador C y el último a la

secuencia del iniciador Z. AGATCT corresponde a la secuencia del sitio de reconocimiento de la enzima

BglII.

F. Anexo. Ubicación de iniciadores utilizados en RT-PCR (PfMyoB-KO)

G. Anexo. Publicaciones y eventos Publicación No. 1

Guerra ÁP, Calvo EP, Wasserman M, Chaparro-Olaya J. Production of recombinant proteins

from Plasmodium falciparum in Escherichia coli. Biomedica. 2016; 36(0):97-108. doi:

10.7705/biomedica.v36i3.3011

https://www.revistabiomedica.org/index.php/biomedica/article/view/3011/3063

Publicación No. 2: en proceso

Actualmente se está escribiendo un manuscrito con los resultados del “knock-out” del gen

pfmyo-b.

https://www.revistabiomedica.org/index.php/biomedica/article/view/3011/3063



Evento científico: Primer congreso colombiano de Bioquímica y Biología Molecular,

2014

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Estudio de la miosina B de Plasmodium falciparum y su