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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
ANA GLÓRIA BARBOSA BEZERRA DE SOUSA LIMA
EXTRATOS PROTEICOS DE Plasmodium falciparum INDUZEM HEMÓLISE
DE ERITRÓCITOS HUMANOS VIA SISTEMA COMPLEMENTO
NATAL
2018
ANA GLÓRIA BARBOSA BEZERRA DE SOUSA LIMA
EXTRATOS PROTEICOS DE Plasmodium falciparum INDUZEM HEMÓLISE
DE ERITRÓCITOS HUMANOS VIA SISTEMA COMPLEMENTO
NATAL
2018
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de
Mestre em Ciências Biológicas.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto
CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Marcelo de Sousa da Silva
ANA GLÓRIA BARBOSA BEZERRA DE SOUSA LIMA
EXTRATOS PROTEICOS DE Plasmodium falciparum INDUZEM HEMÓLISE
DE ERITRÓCITOS HUMANOS VIA SISTEMA COMPLEMENTO
Aprovada em: 26/02/2018
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________
Prof. Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto
(Presidente – Departamento de Microbiologia e Parasitologia/UFRN)
__________________________________________
Prof. Dr. Marcelo de Sousa da Silva
(Interno – Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas/UFRN)
__________________________________________
Profª. Drª. Lílian Giotto Zaros de Medeiros
(Interno – Departamento de Microbiologia e Parasitologia/UFRN)
__________________________________________
Profª. Drª. Valeska Santana de Sena Pereira
(Externo – Faculdade Maurício de Nassau)
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de
Mestre em Ciências Biológicas.
AGRADECIMENTOS
Ao Deus da minha vida, que me guiou e me sustentou em todo tempo até aqui, me
dando a oportunidade de obter uma qualificação profissional e experiências pessoais
transformadoras.
À minha família pelo apoio e amor incondicionais, especialmente meus pais que
sempre investiram no meu futuro, me estimulando a nunca deixar de estudar; e meu
amado esposo, que foi literalmente uma coluna para mim durante esta trajetória, me dando
suporte, sendo compreensivo nos momentos dos quais se fez necessário abrir mão, me
dando ânimo nas horas mais difíceis e me fazendo lembrar de que eu seria capaz de
concluir esta etapa.
Aos meus orientadores, professores Valter e Marcelo, por toda a ajuda nessa
caminhada, pelas conversas e ideias desafiadoras que me impulsionaram a ter ainda mais
paixão pela ciência e pela pesquisa, apesar dos inúmeros fatores limitantes da atual
situação do pesquisador no nosso país.
Aos meus colegas do Laboratório de Biologia da Malária e Toxoplasmose,
especialmente ao time Malária, pela parceria não apenas nos experimentos, mas no dia-
a-dia, tornando-o mais leve e feliz. Agradeço também aos parceiros do Laboratório de
Imunoparasitologia, minha segunda casa, onde me senti igualmente acolhida, como
também aos laboratórios que sempre deram suporte em alguma necessidade: Laboratório
de Helmintologia, Laboratório de aulas práticas da Parasitologia, Laboratório de
Biotecnologia de Polímeros Naturais, Laboratório de Química e Função de Proteínas
Bioativas (do qual fiz parte durante a graduação) e LabMulti (da Faculdade de Farmácia).
Aos professores das bancas de qualificação e defesa pelas excelentes
contribuições para o aprimoramento do trabalho, como também aos demais mestres que
fizeram parte desta trajetória de dois anos de mestrado.
Aos funcionários, sejam eles administrativos ou de serviços gerais, pela simpatia
e ajuda sempre que foi preciso.
Às agências de fomento pelo suporte financeiro para a realização deste estudo e à
minha querida UFRN, da qual já faço parte há seis anos, onde vivi momentos tristes e
felizes, derrotas e vitórias, incertezas e convicções, elementos estes que contribuíram para
o meu crescimento como pessoa e profissional. Espero que não nos larguemos tão cedo!
“Na corrida dessa vida é preciso entender que você vai rastejar, que vai cair, vai sofrer e a vida
vai lhe ensinar que se aprende a caminhar e só depois vai correr. A vida... a vida é uma corrida
que não se corre sozinho. Que vencer não é chegar, é aproveitar o caminho. Sentindo o cheiro
das flores e aprendendo com as dores causadas por cada espinho.
Pare, não tenha pressa! Não carece acelerar. A vida já é tão curta! É preciso aproveitar essa
estranha corrida, que a chegada é a partida… e ninguém pode evitar. Por isso é que o caminho
tem que ser aproveitado, deixando pela estrada algo bom para ser lembrado. Vivendo uma vida
plena, fazendo valer a pena, cada passo que foi dado.
Aí sim, lá na chegada, onde o fim é evidente, é que a gente percebe que foi tudo de repente e
aprende na despedida, que o sentido dessa vida é sempre seguir em frente.”
A corrida da vida – Bráulio Bessa
RESUMO
A maioria dos casos de malária grave humana é atribuída a infecções por Plasmodium
falciparum, considerada o mais agressivo devido à hipóxia tecidual resultante de vários
fatores, entre eles a anemia severa. Nesse sentido, este estudo avaliou o grau de hemólise
mediada pelo sistema complemento em eritrócitos humanos sensibilizados com extratos
proteicos de P. falciparum, através de ensaios hemolíticos autólogos in vitro, no intuito
de estabelecer relações entre esta atividade e suas implicações para a patogênese da
malária complicada. Os eritrócitos tratados com EBPf com a concentração mínima de
0.06 ug/mL foram hemolisados em cerca de 60% quando em presença do complemento,
enquanto que na ausência deste o efeito foi reduzido para menos de 20%, indicando a sua
participação. Nas hemácias do doador com traço falciforme (HbAS), houve uma pequena
redução da hemólise em relação às hemácias normais, sugerindo uma imunoreatividade
diferencial neste caso. Em comparação com o tratamento com a neuraminidase, os perfis
de ação hemolítica foram similares aos obtidos com o EBPf, indicando que o P.
falciparum provavelmente possui proteases com ação semelhante a esta enzima, clivando
proteínas sialisadas na superfície da célula-alvo e valendo-se de vias alternativas de
invasão sob determinadas condições. O gel de SDS-PAGE corado com nitrato de prata
revelou um perfil de degração proteica equivalente entre os tratamentos dos eritrócitos
com EBPf e neuraminidase, reforçando esta hipótese. Além disso, as proteases do parasito
podem ser capazes de degradar estruturas proteicas da superfície eritrocitária como
glicoforina A, enquanto outras são preservadas, como a aquaporina 1, podendo contribuir
para a patogênese da doença. O ensaio de dose-resposta demonstrou uma redução da
atividade hemolítica apenas a partir da concentração de 0.03 ug/mL, indicando que a
elevada parasitemia não é fator estritamente crucial para a ativação do complemento,
tratando-se, provavelmente, de um fenômeno biológico potencializado por outros fatores
envolvidos no processo infeccioso. Desta forma, concluiu-se que extratos proteicos de P.
falciparum induzem hemólise em eritrócitos humanos via complemento, sendo este um
dos prováveis mecanismos responsáveis pela geração de um processo inflamatório
exacerbado e perda da homeostasia do indivíduo.
Palavras-chave: Plasmodium falciparum; malária; sistema complemento;
imunopatogênese; hemólise.
ABSTRACT
Most cases of severe human malaria are due to Plasmodium falciparum infections,
considered the most aggressive due to tissue hypoxia resulting from several factors,
including severe anemia. In this sense, this study evaluated the degree of hemolysis
mediated by the complement system in human erythrocytes sensitized with protein
extracts of P. falciparum through in vitro autologous hemolytic assays in order to
establish relationships between this activity and its implications for the pathogenesis of
complicated malaria. Erythrocytes treated with EBPf with the minimum concentration of
0.06 μg/ml were hemolyzed in about 60% when in the presence of the complement;
whereas in the absence, the effect was reduced to less than 20%, indicating it’s
participation. In cells donor with sickle cell trait (HbAS), there was a small reduction in
hemolysis compared to normal red blood cells, suggesting a differential immunoreactivity
in this case. In contrast to the treatment with neuraminidase, the hemolytic action profiles
were similar to those obtained with EBPf, indicating that P. falciparum probably has
proteases with a similar action to this enzyme, cleaving proteins sialisated on the surface
of the target cell, using invasion alternatives pathways under certain conditions. The SDS-
PAGE gel stained with silver nitrate revealed an equivalent protein degradation profile
between erythrocyte treatments with EBPf and neuraminidase, reinforcing this
hypothesis. In addition, parasite’s proteases may be able to degrade erythrocyte surface
protein structures such as glycophorin A, while others are preserved, such as aquaporin
1, and may contribute to the immunopathogenesis of the disease. The dose-response assay
demonstrated a reduction in hemolytic activity only at the concentration of 0.03 μg/mL,
indicating that the high parasitemia is not a strictly crucial factor for complement
activation, probably due to a potentiated biological phenomenon by other factors involved
in the infectious process. Thus, it was concluded that P. falciparum protein extract induce
haemolysis in human erythrocytes via complement, being this one of the mechanisms
responsible for the generation of an exacerbated inflammatory process and loss of the
individual’s homeostasis.
Key-words: Plasmodium falciparum; malaria; complement system;
immunopathogenesis; hemolysis.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ciclo de vida de Plasmodium, agente etiológico da malária.............................17
Figura 2. Estágios assexuados do ciclo eritrocitário do cultivo de P. falciparum..........18
Figura 3. Ligantes de invasão do parasito (determinantes de parasitas) e receptores de
eritrócitos humanos (determinantes do hospedeiro) ........................................................20
Figura 4. Principais vias de ativação do complemento....................................................24
Figura 5. Metodologia utilizada no estudo......................................................................30
Figura 6. Procedimento da sensibilização dos eritrócitos humanos a 2,5% com
neuraminidase e EBPf......................................................................................................35
Figura 7. Esquema do ensaio hemolítico autólogo realizado em placa de
microtitulação..................................................................................................................36
Figura 8. Teste de hemólise utilizando diferentes volumes de tampão de lise e eritrócitos
humanos a 2%, 2,5% e 5%..............................................................................................39
Figura 9. Perfil da curva padrão obtido pelo ensaio colorimétrico de Bradford............40
Figura 10. Perfil proteico em SDS-PAGE 10% de eritrócitos humanos utilizados no
cultivo de P. falciparum e de EBPf ................................................................................41
Figura 11. Atividade hemolítica em eritrócitos humanos normais 2,5% em VBS++
tratados com neuraminidase partindo da concentração de 1 μg/mL...............................41
Figura 12. Atividade hemolítica em eritrócitos humanos normais a 2,5% em VBS++
tratados com EBPf partindo da concentração de 1
μg/mL..............................................................................................................................42
Figura 13. Perfil hemolítico de eritrócitos humanos de doador heterozigoto para o traço
falciforme (HbAS) a 2,5% em VBS+ tratados com EBPf, partindo da concentração de 1
μg/Ml...............................................................................................................................43
Figura 14. Teste de dose-dependência com concentração inicial de 0,06 μg/mL de EBPf
para uso na sensibilização de eritrócitos humanos a 2,5% em VBS++...........................43
Figura 15. Perfil proteico dos sobrenadantes de eritrócitos humanos a 2,5% em VBS++
após diferentes intervalos de incubação (1h, 2h e 3h) com neuraminidase e
EBPf.................................................................................................................................44
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadro 1. Encontro das formas assexuadas de P. falciparum em gota espessa associado
a um dos critérios relacionados à malária grave..............................................................21
Quadro 2. Principais funções biológicas das proteínas regulatórias do
complemento...................................................................................................................25
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
WHO - World Health Organization (em português, OMS – Organização Mundial de
Saúde)
EBPf – Extrato Bruto de Plasmodium falciparum
NA - Neuraminidase
EBA – Erythrocyte binding antigen
Rh - Reticulocyte binding protein homologue
NA – neuraminidase
CR1/CD35 – complement receptor type 1 (receptor do complemento tipo 1)
CM – cerebral malaria (malária cerebral)
SMA – severe malarial anemia (anemia malárica severa)
PfEMP-1 - P. falciparum Erythocyte Membrane Protein-1
CP – classical pathway (via clássica)
AP – alternative pathway (via alternativa)
MAC – membrane attack complex (complexo de ataque à membrana)
TCC – terminal complemente complex (complexo terminal do complemento)
DAF/CD55 – decay aceleration fator (fator de aceleração do decaimento)
CD59 - protectina
IgG – imunoglobulina G
ICs – imunocomplexos
PBS - phosphate buffered saline (tampão fosfato salino)
BSA – bovine serum albumin
SDS - sodium dodecyl sulfate (dodecil sulfato de sódio)
PAGE - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (eletroforese em gel de poliacrilamida)
VBS++ - Veronal-buffered saline with Mg + Ca (tampão veronal salino com Mg + Ca)
SHN – soro humano normal
SHI – soro humano inativado
HbAS –heterozigoto para traço falciforme
HbAA – homozigoto para traço falciforme
Rpm – rotações por minuto
ANOVA – análise de variância
KDa – kilodalton
TNF-𝑎 - fator de necrose tumoral
IFN-γ - interferon-gama
ICAM-1 - Intercellular Adhesion Molecule 1 (molécula de adesão intercelular 1)
GPA – glicophorin A (glicoforina A)
SA – sialic acid (ácido siálico)
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................15
1.1. Biologia de Plasmodium.........................................................................................16
1.2. Interação parasito-hospedeiro..............................................................................19
1.3. Malária grave causada por P. falciparum............................................................21
1.4. O sistema complemento no contexto da imunopatogênese da malária.............23
2. JUSTIFICATIVA......................................................................................................28
3. OBJETIVOS..............................................................................................................29
4. MATERIAIS E MÉTODOS.....................................................................................30
4.1. Cultivo de Plasmodium falciparum 3D7....................................................30
4.2. Teste de hemólise utilizando tampão de lise.............................................31
4.3. Extração de proteínas da cultura de P. falciparum 3D7..........................31
4.4. Determinação da concentração de proteínas............................................31
4.5. Eletroforese em gel de poliacrilamida.......................................................32
4.6. Ensaio hemolítico autólogo.........................................................................33
4.6.1. Obtenção dos eritrócitos e soro humanos...................................33
4.6.2. Sensibilização dos eritrócitos com extrato bruto de P. falciparum
e neuraminidase......................................................................................34
4.6.3. Avaliação do efeito hemolítico mediado pelo complemento.......35
4.7. Ensaio de dose-dependência.......................................................................36
4.8. Cinética de degradação proteica de eritrócitos humanos a 2,5% tratados
com EBPf e neuraminidase................................................................................37
4.9. Análise estatística........................................................................................38
5. RESULTADOS...............................................................................................39
5.1. Teste de hemólise.............................................................................39
5.2. Dosagem de proteínas de EBPf pelo método de Bradford............40
5.3. SDS-PAGE 10% corado com azul de Coomassie..........................40
5.4. Ensaios hemolíticos autólogos.........................................................41
5.5. Ensaio de dose-dependência............................................................43
5.6. Perfil de degradação proteica de eritrócitos tratados com EBPf
e neuraminidase......................................................................................44
6. DISCUSSÃO...............................................................................................................45
7. CONCLUSÕES..........................................................................................................52
8. PERSPECTIVAS DO ESTUDO...............................................................................53
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................54
15
1. INTRODUÇÃO
O combate às doenças infecciosas, embora ainda limitado, é alvo de crescente
interesse, sendo a procura por novos alvos terapêuticos uma das principais
estratégias adotadas a fim de controlar doenças provocadas por agentes
patogênicos. Entretanto, isto se mostra extremamente desafiador, uma vez que
exige um profundo conhecimento de todo o processo de infecção, dos agentes
etiológicos, das bases moleculares da interação parasito-hospedeiro e da resposta
imune frente à infecção (MIOTO et al., 2012; MONTEIRO, 2015).
Nesse sentido, a malária tem sido o foco de muitos estudos, uma vez que
continua a ser uma das parasitoses mais importantes do mundo. Caracteriza-se
como uma doença parasitária de caráter febril e agudo, com prevalência nas áreas
tropicais e subtropicais, apresentando alta morbidade e mortalidade (WHO, 2017).
A sua transmissão se dá principalmente através da picada do mosquito fêmea
pertencente ao gênero Anopheles, hospedeiro definitivo, quando este encontra-se
infectado por protozoários apicomplexos do gênero Plasmodium e os inocula no
homem, hospedeiro intermediário, podendo ocorrer também de forma secundária
por transfusões de sangue, compartilhamento de agulhas e seringas ou ainda de
forma congênita.
Além disso, o parasito sofre diferenciação várias vezes durante o processo
infeccioso, com mudanças antigênicas a cada esquizogonia (PASTERNAK et al.,
2009; FRENCH; CHEN, 2013; ZHU et al., 2017)., o que pode lhe conferir
resistência, sendo este um dos principais entraves do tratamento (ALY et al.,
2009).
Das mais de 150 espécies conhecidas de Plasmodium, destacam-se seis pelo
fato de parasitarem os seres humanos. São elas: P. falciparum, P. vivax, P.
malariae, P. ovale, P. knowlesi e, mais recentemente, P. simium, que até então era
conhecida apenas por parasitar macacos, mas que teve sua capacidade de infecção
em humanos comprovada no ano de 2017 (BRASIL et al., 2017).
Segundo a OMS, foram registrados cerca de 216 milhões de casos de malária
em 2016, e as regiões das Américas e da África representaram quase 70% dos
países que apresentaram um aumento de mais de 20% em 2016 comparado com
2015. A porcentagem mais alta foi na Região das Américas (36%), onde a
incidência da malária aumentou em 2013, principalmente no Brasil e na
16
Venezuela (WHO, 2017). A elevação dessa incidência deve-se, principalmente, à
adaptação do parasito às mudanças climáticas e aos vetores emergentes, além da
resistência que tem sido demonstrada aos inseticidas e aos antimaláricos
comumente utilizados, dificultando respectivamente o controle vetorial e o
tratamento de pacientes (GOMES et al., 2011; PEREIRA, 2016; WHO, 2017).
No Brasil, o maior número de casos concentra-se na região da Amazônia legal
(composta pelos Estados do Acre, Amapá, Amazonas, Maranhão, Mato Grosso,
Pará, Rondônia, Roraima e Tocantins), considerada área endêmica, e a espécie
predominante é P. vivax, que normalmente gera formas menos complicadas da
doença, parasitando preferencialmente reticulócitos, embora já tenham sido
notificados casos de malária grave associada a esta espécie (ALENCAR FILHO
et al., 2014; MEIBALAN; MARTI, 2017). No entanto, P. falciparum permanece
sendo o alvo de muitos estudos devido à sua elevada patogenicidade, podendo
gerar quadros clínicos graves como a malária cerebral, angústia pulmonar aguda,
malária placentária, anemia severa e outras complicações associadas, incluindo
falência de órgãos, sepse e morte (CHASSAIGNE et al., 2001; DANKWA et al.,
2017; WHO, 2017).
O grupo mais afetado consiste em crianças na faixa etária dos anos iniciais,
mulheres grávidas, adultos não-imunes e imunodeprimidos, cuja infecção pode
levar à letalidade (MARIOTTI-FERRANDIZ et al., 2016). A cada ano, são
notificadas aproximadamente 429 mil mortes, sendo 92% das ocorrências destas
mortes na África Subsaariana (WHO, 2017). Diante disso, constata-se que esta
parasitose permanece sendo um problema de saúde pública global, apesar dos
inúmeros esforços no intuito de combatê-la, não apenas em locais endêmicos, mas
também em áreas não endêmicas, onde o crescente número de casos de malária
importados é preocupante e, geralmente, são fatais (COSTA et al., 2013).
1.1. Biologia de Plasmodium
Os parasitos do gênero Plasmodium têm um ciclo de vida complexo e
heteroxeno, que se divide entre a fase sexuada (esporogonia) no mosquito,
hospedeiro definitivo, e a fase assexuada (esquizogonia) no homem, hospedeiro
intermediário (figura 1). A transmissão ocorre quando o vetor invertebrado
inocula no homem formas infectantes do protozoário (esporozoítos) durante o
17
repasto sanguíneo, que se desenvolvem nos hepatócitos, liberando na corrente
sanguínea milhares de merozoítos em vesículas merossomais que invadirão os
eritrócitos, dando início à fase responsável pela sintomatologia da malária,
caracterizada por febre, mal-estar, cefaléia, cansaço e mialgia (MINISTÉRIO DA
SAÚDE, 2017).
O período que diz respeito a esta intensa reprodução assexuada no interior das
hemácias, rompedo-as ao final do processo, coincide com os episódios paroxísticos
de febre, que variam de acordo com a espécie de Plasmodium infectante. Para P.
knowlesi são 24 horas; para P. falciparum (figura 2) e P. vivax são 48 horas (por
isso dá-se o nome febre terçã) e 72 horas para P. malariae (febre quartã) (WHO,
2017).
Figura 1. Ciclo de vida de Plasmodium, agente etiológico da malária.
Fonte: CDC, 2018 (adaptado). Disponível em: http://www.cdc.gov/malaria/index.html.
18
A) Anel ou trofozoíto imaturo (fase jovem), B) trofozoíto maduro, C) esquizonte (fase madura) e
D) merozoítos sendo liberados para o meio extracelular.
Fonte: A autora.
Além disso, este rompimento irá liberar, juntamente com os merozoítos
recém-formados, metabólitos do parasito, como a hemozoína (pigmento malárico),
oriundo da degradação da hemoglobina dentro do vacúolo parasitóforo, obtendo os
aminoácidos necessários para auxiliar sua maturação, uma vez que não são capazes
de produzir bases púricas a partir do novo (SHERMAN, 1977; BARROS et al.,
2012; GAZZINELLI et al., 2014; SCHMIDT et al., 2015). Ultimamente, o interesse
acerca da hemozoína tem aumentado, uma vez que tem se mostrado importante para
o diagnóstico, desenvolvimento de fármacos antimaláricos e participação na
ativação da resposta imune, recrutando macrófagos e estimulando a liberação de
citocinas pró-inflamatórias (BARROS et al., 2012; PEREIRA, 2016; HIKARO,
2016).
A fim de dar continuidade à sua replicação, os merozoítos liberados necessitam
invadir novas hemácias, e este processo envolve a interação complexa e dinâmica
entre múltiplos receptores do hospedeiro e ligantes do parasito (PERSSON et al.,
2008; COSTA et al., 2013).
Figura 2. Estágios assexuados do ciclo eritrocitário do cultivo de P. falciparum.
19
1.2. Interação parasito-hospedeiro
Nesta fase, a superfície do merozoíto é revestida por uma capa ou envoltório
glicoproteico, com a parte glicídica voltada para o seu interior, com propriedades
adesivas que proporcionam a captura do eritrócito que irá parasitar (BOYLE et al.
2014). Porém, a penetração só será efetiva se o parasito sofrer uma reorientação
apical do seu ponto de aderência, formando assim junções entre a sua membrana
e a da célula hospedeira, culminando com a endocitose nos eritrócitos, que
envolve a formação de um vacúolo parasitóforo (DEANS et al., 2007; COWMAN
et al. 2012).
Apesar da base molecular desses processos não ser totalmente compreendida
ainda, algumas moléculas participantes tanto do Plasmodium quanto das hemácias
já foram identificadas. Em relação aos determinantes do parasito, comumente são
representados por duas família de genes: antígenos de ligação aos eritrócitos
(EBA-175, EBA-140 e EBA-181) e homólogos da proteína de ligação aos
reticulócitos (Rh1, Rh2a, Rh2b e Rh4) (COWMAN et al., 2017).
Os antígenos eritrocitários são estruturas macromoleculares localizadas na
superfície extracelular da membrana eritrocitária, que apresentam ampla
diversidade estrutural e funcional. Podem exercer diversas funções como
transportadores, receptores de moléculas de adesão, enzimáticas, e controladores
do complemento (ALENCAR FILHO et al., 2014; BIRYUKOV et al., 2016).
Dentre os receptores celulares dos eritrócitos registrados como pontos de
entrada para P. falciparum, o grupo proteico das glicoforinas foi o pioneiro por se
ligarem exclusivamente a membros da família PfEBA (CHEN et al., 1998). Tem
sido demonstrado que esta espécie também se utiliza do receptor do complemento
tipo 1 (CR1) para invadir as hemácias, e a adesina do parasito, PfRh4, é
responsável por se ligar diretamente a esta molécula para mediar uma invasão
bem-sucedida (figura 3) como uma via alternativa às glicoforinas (SPADAFORA
et al., 2010; REILING et al., 2012; BEI; DURAISINGH, 2012; SCHMIDT et al.,
2015).
20
GPA - glicoforina A; GPB - glicoforina B; GPC, glicoforina C; CR1 - receptor do complemento
tipo 1. Fonte: BEI; DURAISINGH, 2012 (adaptado).
As vias de invasão têm sido identificadas através da análise da entrada de
merozoítos em eritrócitos tratados com enzimas que removem receptores
específicos de membrana, tais como a neuraminidase, a tripsina e a quimotripsina
(DOLAN et al., 1994; DEANS et al., 2007). A neuraminidase atua clivando ácido
sialico da superfície dos eritrócitos, presente em receptores importantes como as
glicoforinas. Testar a capacidade de um isolado de parasita em invadir eritrócitos
tratados com neuraminidase pode definir se o isolado é dependente ou
independente de receptores sialisados para invadir a hemácia (DEANS et al.,
2007; DANKWA et al., 2017). Dankwa e colaboradores (2017) demonstraram que
as vias envolvendo os ligantes de invasão EBA e Rh1 são dependentes do ácido
siálico, enquanto que as demais não são.
Convencionou-se que P. falciparum pode ser subdividido em cepas
dependentes de ácido siálico que invadem eritrócitos tratados com neuraminidase
(NA) em um nível reduzido e cepas independentes de ácido siálico que são
capazes de invadir hemácias tratadas com NA em um nível superior via CR1 e o
ligante de merozoíto PfRh4 (BIRYUKOV et al., 2016). O CR1 é uma proteína
imunoreguladora encontrada na superfície do eritrócito e em uma variedade de
leucócitos, e suas funções incluem controle da ativação do complemento e da
Figura 3. Ligantes de invasão do parasito (determinantes de parasitas) e receptores de eritrócitos
humanos (determinantes do hospedeiro).
21
depuração de imunocomplexos (COCKBURN et al., 2004; BONIFÁCIO;
NOVARETTI, 2009). Nos glóbulos vermelhos, os níveis de CR1 variam entre
indivíduos na faixa de 50-1.200 moléculas por célula (ROWE et al., 2002).
A habilidade apresentada pelo P. falciparum em reconhecer diferentes
receptores da célula hospedeira permite com que a invasão possa ocorrer por uma
gama de vias alternativas com igual eficiência (BOYLE et al., 2014), ao contrário
de P. vivax, que requer o receptor de antígeno Duffy. Esta plasticidade favorece a
adaptabilidade aos polimorfismos das hemácias e pode atuar ainda como um
mecanismo de evasão imunológica (KUSS et al., 2011; HARVEY et al., 2012).
Tal característica provavelmente é decorrente de uma co-evolução com o
organismo humano ao longo de milhares de anos que contribuiu também para a
virulência desta espécie (GAUR et al., 2004; BOWYER et al., 2015).
1.3. Malária grave causada por P. falciparum
As infecções por P. falciparum, considerada como a espécie mais patogênica,
na ausência de um diagnóstico precoce e tratamento adequado, podem evoluir para
forma complicada, denominada malária grave (QUEIROZ et al., 2008), com
critérios definidos segundo a Organização Mundial de Saúde (Quadro 1).
Quadro 1. Encontro das formas assexuadas de P. falciparum em gota espessa
associado a um dos critérios relacionados à malária grave.
Fonte: DAY et al., 1999 apud QUEIROZ et al., 2008).
22
Este quadro caracteriza-se por ser uma doença multifatorial dependente de
questões relacionadas tanto ao parasito, quanto ao hospedeiro. Pode acarretar em
malária cerebral (MC), anemia grave, insuficiência renal aguda, edema pulmonar,
hipoglicemia, colapso circulatório, acidose metabólica, coma e morte. Entretanto, os
pacientes que sobrevivem apresentam danos neurológicos graves e irreversíveis
(MILLER et al., 2002 apud QUEIROZ et al., 2008).
Sabe-se que a invasão de eritrócitos é central para a patogênese da malária
(HALDAR; MOHANDAS et al., 2010; SAETEAR et al., 2015). Ao invadir as
hemácias, o parasito provoca uma série de modificações na superfície dessas células,
remodelando sua morfologia e alterando suas características para causar a aderência
(ALENCAR FILHO et al., 2014; COWMAN et al., 2017; SISQUELLA et al., 2017).
A proteína de membrana PfEMP-1 (do inglês P. falciparum Erythocyte Membrane
Protein-1) é apontada como um dos principais ligantes antigênicos envolvidos no
processo de citoadesão, fenômeno que contribui para a gravidade da doença
(BARROS et al., 2012).
Expressas na fase eritrocítica, PfEMP1 são proteínas que formam associações com
os “knobs”, protrusões eletrodensas na superfície dos eritrócitos infectados que
apresentam elementos estruturais característicos, desempenhando um papel
importante na citoadesividade entre os eritrócitos infectados e não-infectados,
formando estruturas chamadas de rosetas, e também atuam na ligação com vários
receptores endoteliais e sequestro dessas células para a microvasculatura de órgãos
como o cérebro, caracterizando um quadro de malária cerebral (PASTERNAK;
DZIKOWSKI, 2009 apud BARROS et al., 2012; ALENCAR FILHO et al., 2014).
A expressão de PfEMP1 torna o parasito visível ao sistema imune do hospedeiro,
mediando uma resposta anticorpo-dependente. No entanto, algumas sub-populações
dos parasitos podem expressá-lo de forma diferencial como mecanismo de evasão
imune, conseguindo fazer com que a infecção persista. Esse processo é conhecido
como variação antigênica e é típico de infecções por P. falciparum (BARROS et al.,
2012), sendo considerado como o principal fator de vilurência desta espécie (SMITH
et al., 1995; KIRCHGATTER, 2001 apud BARROS et al., 2012; FRECH, CHEN,
2013; ZHU et al. 2017).
23
A infecção por Plasmodium apresenta consequências severas e potencialmente
letais para o estado metabólico do hospedeiro humano (OLSZEWSKI et al., 2009). No
caso da malária induzida por P. falciparum, os principais eventos fisiopatológicos
que ocorrem durante a infecção são: a rápida proliferação de parasitos, culminando
com a lise maciça de eritrócitos e estimulando a liberação de citocinas pró-
inflamatórias, somadas ao dano isquêmico oriundo do sequestro de eritrócitos
parasitados para a microvasculatura, provocando perda da função da barreira
endotelial e desregulação endotelial (MACKINTOSH et al., 2004 apud OLSZEWSKI
et al., 2009; GAZZINELLI et al., 2014).
A partir dos danos causados pela infecção do Plasmodium, uma cascata
inflamatória bem organizada de modificações humorais e celulares dentro do tecido
vascularizado é iniciada (COSTA et al., 2013). Quando regulados, estes fatores
imunológicos atuam com a finalidade de combater o patógeno e manter um ambiente
homeostático normal. No entanto, quando há um descontrole, também podem
provocar efeitos deletérios no hospedeiro, perdendo sua função protetora original
(TROVOADA et al., 2014). Frente a isso, ultimamente muitos estudos têm buscado
avaliar a participação do sistema imunitário em tais efeitos, uma vez que a patologia
de muitas doenças parasitárias pode estar relacionada a uma desregulação da resposta
imune (OLSZEWSKI et al., 2009; LISZEWSKI; ATKINSON, 2015).
1.4. O sistema complemento no contexto da imunopatogênese da malária
As modificações causadas na superfície de eritrócitos infectados e a liberação de
produtos parasitários após a lise celular fazem com que o sistema de defesa ative uma
variedade de sistemas mediadores da resposta imune, incluindo o sistema
complemento (PHANUPHAK et al., 1985). Este é um dos principais mecanismos da
resposta imune inata, iniciado frente a vários agentes infecciosos. Composto por um
complexo de proteínas solúveis e de membrana, seu processo de ativação caracteriza-
se por clivagens sequenciais de alguns precursores zimogênicos que, em sequência,
catalisam a ativação de outras proenzimas numa espécie de “cascata” (BIRYUKOV
et al., 2014; BAJIC et al. 2015).
Um elemento chave desta cascata é a formação das C3 convertases, enzima
responsável pela degradação de C3, formando fragmentos efetores como C3a, uma
24
potente anafilotoxina, e C3b, que pode se ligar a superfícies celulares a fim de
facilitar a fagocitose por macrófagos e eliminação esplênica de células parasitadas
(YAMAMOTO et al., 2001).
Três diferentes vias são conhecidas por ativar a cascata do complemento: a via
clássica (CP), a via alternativa (AP) e a via das lectinas (MBLP) (figura 4). Todas
elas são iniciadas por fatores diferentes do patógeno, porém convergem em um ponto
comum para formar o complexo de ataque à membrana (MAC) ou complexo terminal
do complemento (TCC), responsável por formar poros na membrana, causando um
desequilíbrio osmótico e a lise celular (ROESTENBERG et al., 2007; BIRYUKOV
et al., 2014; ABBAS et al., 2015).
Figura 4. Principais vias de ativação do complemento: a via clássica, a via das lectinas
de ligação à manose, e a via alternativa.
IgM - imunoglobulina M; IgG - imunoglobulina G; CR1/CD35 - receptor do complemento
tipo 1; DAF/CD55 - fator de aceleração do decaimento; CD59 - protectina.
Fonte: BIRYUKOV et al., 2014 (adaptado).
25
Sob certas condições fisiológicas, os eritrócitos encontram-se protegidos da
ativação do complemento pela presença de várias proteínas presentes no plasma ou
nas superfícies celulares, como o receptor do complemento tipo 1 (CR1), protectina
(CD59) e fator de aceleração do decaimento (DAF). Estas proteínas são importantes
para proteger as hemácias do dano mediado pelo complemento e controlar a ativação
da cascata (quadro 2) (ALEGRETTI et al., 2009; SILVER et al., 2010).
Quadro 2. Principais funções biológicas das proteínas regulatórias do complemento.
Fonte: ALEGRETTI et al., 2009 (adaptado).
A perda gradual desses reguladores contribui para a remoção de hemáceas
seinescentes (ARESE et al., 2005). No entanto, alterações que causem desequilíbrio
na ativação desta resposta, potencializando-a, pode acarretar em efeitos deletérios
para o organismo. Pacientes com malária associada à infecção por P. falciparum
mostraram altos índices de componentes plasmáticos de ativação do complemento,
tanto pela via clássica, como pela alternativa (WENISCH et al., 1997; KIM et al.,
2014). Deficiências ou alterações destas proteínas regulatórias têm sido associadas à
malária grave (COCKBURN et al., 2004; STOUTE et al., 2005; SARMA; WARD,
2011).
26
Vários mecanismos têm sido propostos para explicar a patogênese, ainda não
completamente elucidada, da anemia malárica severa (SMA) em infecções por P.
falciparum, sendo esta uma das principais complicações fatais observadas em grupos
de risco (CARVALHO et al., 2006; DESRUISSEAUX et al., 2010). O grau da perda
de eritrócitos não pode ser explicado apenas pela destruição por P. falciparum após
este deixar o interior da célula, estando, portanto, relacionada a outros fatores
envolvidos no processo infeccioso (WOODRUFF et al., 1979; PRICE et al., 2001;
BIRYUKOV et al., 2014).
A anemia hemolítica pode ser classificada como: 1) intraglobulares ou intrínsecas,
quando o defeito está no eritrócito, na sua membrana ou em seu conteúdo, sendo
geralmente hereditária; como é o caso das hemoglobinopatias, anomalias de
membrana ou enzimopatias; 2) extraglobulares ou extrínsecas, quando a causa da
hemólise constitui uma agressão ao eritrócito, sendo, portanto, adquiridas
(OLIVEIRA et al., 2006).
Tem sido relatado que a sobrevivência de eritrócitos não-infectados é diminuída
durante a infecção por P. falciparum (HIKARO et al., 2016), e um modelo
matemático revelou que, para cada eritrócito infectado, há 8,5 eritrócitos não-
infectados destruídos durante a infecção malárica (JAKEMAN et al., 1999 apud
BIRYUKOV et al., 2014). Concomitantemente, ocorre disfunção da medula óssea e
eritropoiese ineficaz, que juntamente contribuem para este quadro (PIERCE et al.,
2009; DASARI et al., 2014). Estudos indicam a forte participação de componentes
imunológicos tanto em seres humanos, quanto em modelos experimentais (DE
SOUZA & RILEY, 2002 apud CARVALHO, 2006).
Existem evidências de que a regulação alterada do complemento pode
desempenhar um papel na patogênese da SMA. Eritrócitos de crianças com SMA
apresentaram maior deposição superficial de IgG e adquiriram deficiências das
proteínas reguladoras do complemento, como CR1 e DAF (STOUTE et al., 2003;
SARMA et al., 2011). Estas características estão associadas ao aumento da deposição
de C3b em eritrócitos durante a infecção malárica (WAITUMBI et al., 2000;
ODHIAMBO et al., 2008; SCHMIDT et al., 2015).
Essas alterações na expressão de proteínas regulatórias do complemento nos
eritrócitos têm sido confirmadas por outros grupos (MAHAJAN et al., 2011;
THOMAS et al., 2012) e mudanças semelhantes foram vistas em células B e em
27
monócitos e macrófagos de crianças com SMA (FERNANDEZ-ARIAS et al., 2013
apud BIRYUKOV et al., 2014; GAZZINELLI et al., 2014). Outros estudos com
infecção por P. falciparum demonstraram uma ativação significativa do
complemento nos estágios pré-clínicos e iniciais da malária, com o aumento da
formação do MAC (ROESTENBERG et al., 2007; RAMOS-SUMMERFORD;
BARNUM, 2014).
28
2. JUSTIFICATIVA
Nos casos de malária grave causada por P. falciparum, a anemia severa é um dos
principais responsáveis pela mortalidade em grupos de risco. Este quadro anêmico é
oriundo de vários fatores, dentre eles: aplasia da medula óssea, sequestro de hemácias
parasitadas e não-parasitadas, destruição de eritrócitos pela rápida multiplicação do
parasito e ainda por mecanismos imunes, como os mediados pelo sistema complemento.
Entretanto, a participação do complemento no processo hemolítico durante a infecção
pelo P. falciparum em pacientes não está completamente elucidada.
Neste contexto, o presente estudo buscou avaliar a ativação direta do sistema
complemento ao interagir com eritrócitos humanos sensibilizados com proteínas de P.
falciparum, apontando possíveis mecanismos resultantes desta interação que poderiam
contribuir para a imunopatogênese da malária complicada. Levando em consideração a
alta prevalência e o grau de severidade que esta doença pode atingir, o estudo destes
mecanismos pode indicar potenciais estratégias terapêuticas, como o uso de moléculas
capazes de controlar a ativação do complemento, visando a redução da morbimortalidade
desta parasitose.
29
3. OBJETIVOS
O presente estudo teve como objetivo geral avaliar a atividade hemolítica, mediada
pelo sistema complemento, em eritrócitos humanos tratados com extratos proteicos de
Plasmodium falciparum e suas possíveis implicações para patogênese da malária
grave, seguindo os seguintes objetivos específicos:
1. Verificar se o complemento possui efeito hemolítico em eritrócitos normais e
com traço falciforme (HbAS) sensibilizados com antígenos de P. falciparum;
2. Comparar a susceptibilidade hemolítica de eritrócitos humanos normais e com
traço falciforme;
3. Investigar se a ação hemolítica mediada pelo complemento é dependente de
ácido siálico.
30
4. MATERIAIS E MÉTODOS
A fim de contemplar os objetivos propostos, a metodologia utilizada neste
estudo seguiu as etapas conforme esquematizado na figura abaixo (figura 5).
Figura 5. Metodologia utilizada no estudo.
4.1. Cultivo de Plasmodium falciparum 3D7
A cepa 3D7 de Plasmodium falciparum, classificada por estudo anteriores
como independente de ácido siálico (AWANDARE et al., 2011), foi cultivada
seguindo a metodologia descrita por Trager e Jensen (1976), com adaptações
sugeridas por Andrade-Neto e colaboradores (2007). Os eritrócitos humanos do
tipo A+ ou O+ utilizados foram coletados de voluntários (Comitê de Ética em
Pesquisa (CEP) da UFRN sob o nº 1.314.667/2015) e os parasitos, mantidos em
cultura contínua usando meio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich) suplementado com
10% de Albumax I (Gibco) sob condições de baixo nível de oxigênio (5% de
oxigênio, 5% de dióxido de carbono e 90% de nitrogênio), a 37º C.
31
4.2. Teste de hemólise utilizando tampão de lise
A fim de otimizar a extração de proteínas do cultivo de P. falciparum, foi
realizado um teste de hemólise inicial utilizando eritrócitos humanos em VBS+ a
2%, 2,5% e 5% e diferentes volumes de tampão de lise (120mM de cloreto de
sódio [NaCl, Sigma-Aldrich], 50mM de tris-HCL [Trizma, Sigma-Aldrich] e
0,5% de NP-40 [Biochemika, EU], pH 7,8) incubados por 1h a 37° C,
centrifugados a 1.500 rpm por 5 minutos a 4° C. Em uma placa de microtitulação,
o sobrenadante foi lido a 405 nm e medida a sua absorbância a fim de estabelecer
o volume de tampão que provoca menos hemólise, dando assim prosseguimento
às extrações e eliminando a interferência no grau deste efeito nos ensaios
hemolíticos autólogos posteriores.
4.3. Extração de proteínas da cultura de P. falciparum 3D7
A extração de proteínas totais foi feita utilizando a metodologia adaptada de
Costa e colaboradores (2013). Partindo de observações de esfregaços realizados a
partir da cultura, ao atingir a fase esquizogônica de crescimento e parasitemia
mínima de 5%, a cultura de P. falciparum foi centrifugada a 5.000 rpm por 5
minutos à temperatura ambiente, e o sobrenadante foi descartado. O pellet foi
lavado com PBS gelado na proporção de 1:1 e centrifugado sob as mesmas
condições anteriores. Após isso, os eritrócitos foram lisados com saponina 0,2%
em PBS (v/v) e incubado por 20 minutos a 37º C. Em seguida, a mistura foi
centrifugada a 10.000 rpm a 4º por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e o
precipitado, submetido a sucessivas lavagens com PBS gelado. Ao final, os
parasitos foram lisados adicionando-se tampão de lise e a amostra foi
homogeneizada no vórtex e centrifugada por 2 minutos a 9.000 rpm e 5º C. O
precipitado foi ressuspendido com PBS e denominou-se como extrato bruto de
Plasmodium falciparum (EBPf), armazenado a -20º C para posterior utilização.
4.4 Determinação da concentração de proteínas
A concentração das proteínas foi determinada através do ensaio colorimétrico
com base no método de Bradford (1976), utilizando-se como padrão a albumina
sérica bovina (bovine serum albumin - BSA, Sigma-Aldrich). Foram aplicadas em
duplicata, numa placa de microtitulação de 96 poços, 10 ul de diferentes
32
concentrações da solução estoque de BSA diluída em solução salina, com o
objetivo de estabelecer uma curva padrão. A cada poço foram adicionados 200 μl
do reagente de Bradford (Quick Start™ Bradford 1× Dye Reagent, Bio-Rad,
EUA) mais 10 μl de cada padrão aos respetivos poços. O padrão 0 μg.ml-1,
consistindo somente em solução salina, corresponde ao branco da curva.
O extrato, semelhantemente aos padrões, foi testado em duplicata, tendo sido
adicionados 10 μl da amostra nos primeiros poços e realizadas diluições seriadas,
às quais se aplicou igualmente 200 μl do reagente de Bradford, tendo como branco
o PBS. Após 5 min de incubação à temperatura ambiente, foi efetuada a leitura
das absorbâncias no comprimento de onda de 595 nm, inferindo-se a concentração
de EBPf por meio das densidades óticas (D.O.) da reta de regressão linear.
4.5. Eletroforese em gel de poliacrilamida
A fim de avaliar a eficácia da extração, foram aplicados em SDS-PAGE 10%,
volumes crescentes (40, 30, 15 e 5 μl) de alíquotas de eritrócitos parasitados
utilizados na cultura de P. falciparum e de EBPf, permitindo a diferenciação de
proteínas dos eritrócitos e do parasito. Esta técnica, desenvolvida pelo químico
Arne Tiselius, separa as proteínas de acordo com seu peso molecular (kDa).
Inicialmente, foram preparados 8 mL de uma solução que, após
polimerização, compôs o gel corrida, consistindo em 4,1 mL de água destilada;
3,3 mL de acrilamida (30% acrilamiada (m/v) (Sigma-Aldrich) e 0,8% Bis-
Acrilamida (v/v) (Sigma-Aldrich); 2,5 mL de 1,5 M Tris-HCl (Trizma - Sigma-
Aldrich); 100 μl de dodecil sulfato de sódio (SDS, Sodium dodecyl sulfate)
(Sigma-Aldrich) a 10% (m/v); 50 μl de Persulfato de amônia (Sigma-Aldrich) e 5
μl de tetrametiletilenodiamina (TEMED, Sigma-Aldrich). Para o gel de
empacotamento ou de separação, foram utilizado 2 mL de gel de uma solução
constituída por 2,5 mL água destilada, 450 μL de acrilamida (30% acrilamida
(m/v) (Sigma-Aldrich) e 0,8% bis-Acrilamida (v/v) (Sigma-Aldrich); 333 μL de
Tris-HCl 0,6 M (Trizma - Sigma-Aldrich); 100 μL de SDS (Sigma-Aldrich) a 10%
(m/v); 50 μl de solução saturada de persulfato de amónia e 5 μl de TEMED
(Sigma-Aldrich).
As amostras foram diluídas em tampão de amostra para SDS-PAGE em
proporção de 1:1 para aplicação no gel. Este tampão é constituído por 3,55 mL de
33
água destilada, 1,25 mL de 0,5M Tris-HCl a pH 6,8, 2,5 mL de glicerol (Sigma-
Aldrich), 2 mL de SDS 10% (m/v) (Sigma-Aldrich), 200 μl de azul de bromofenol
0,5% (m/v) (Sigma-Aldrich) e 50 μl de beta-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich).
Após a diluição, as amostras foram fervidas à temperatura de +100ºC durante
cinco minutos.
Uma vez aplicadas as amostras, os géis foram posteriormente submersos num
tampão condutor de corrente, constituído por 25 M de Tris, 0,19 M de glicina
(Sigma-Aldrich) e 0,1% de SDS e submetidos a uma corrente elétrica constante
de 100 V, durante aproximadamente 1,5 h, até a frente de corrida se aproximar do
seu limite inferior. Em seguida foi efetuada a coloração dos géis com o corante
azul de Coomassie (Coomassie Brilliant Blue R-250, Bio-Rad, EUA) durante 20
min, após o qual se procedeu à sua descoloração com uma solução composta por
10% de metanol e 5% de ácido acético glacial.
4.6. Ensaio hemolítico autólogo
4.6.1. Obtenção dos eritrócitos e soro humanos
Seguindo, com adaptações, a metodologia proposta por Monteiro (2015),
inicialmente foram coletados 10 mL de sangue de indivíduos saudáveis e de um
indivíduo portador do traço falciforme (a fim de avaliar a influência desta
característica genética sobre o grau de hemólise), do qual 5 mL de cada um foi
instantaneamente diluído em 5 mL de solução anticoagulante Alsever (8,4g de
cloreto de sódio, 41 g de D-glucose, 16 g de citrato de sódio e 1,1g de ácido
cítrico num volume final de 200 mL com água destilada) para a obtenção de
eritrócitos. O restante foi incubado a +37ºC durante 30 min, e em seguida a +4ºC,
durante 30 min. Terminados os períodos de incubação, que visaram a retração
do coágulo, os tubos contendo os sangues foram centrifugados a 1.500 rpm
durante 10 min a 4°C para a obtenção do soro humano, fonte de proteínas do
sistema complemento. O volume total de soro obtido foi aliquotado em tubos
eppendorfs e conservado a -20ºC até à sua utilização. Em cada ensaio, utilizou-
se soro e eritrócitos humanos provenientes do mesmo indivíduo, dado o seu
caráter autólogo.
34
Para a inativação do sistema complemento, após o descongelamento do soro,
foi feita a sua incubação a uma temperatura de 56ºC durante 60 min. Para a
obtenção de um concentrado de eritrócitos humanos, a solução de Alsever
contendo eritrócitos humanos foi incubada a +4ºC durante 8 h. A conservação
dos eritrócitos a +4ºC não excedeu o período máximo de uma semana.
Para a realização dos ensaios de sensibilização dos eritrócitos humanos (Eh)
pela neuraminidase e pelo EBPf, foi utilizada uma solução de eritrócitos
humanos a 2,5%. A sua preparação consistiu em sucessivas lavagens do
concentrado de eritrócitos em tampão VBS++, a 1.500 rpm e 4ºC durante 10
min, a fim de obter um sobrenadante límpido, eliminando assim qualquer
vestígio de hemólise e reduzido possíveis interferências.
4.6.2 Sensibilização dos eritrócitos com extrato bruto de P. falciparum e
neuraminidase
Com a finalidade de verificar a susceptibilidade dos eritrócitos à hemólise pelo
contato direto com EBPf e neuraminidase, o ensaio hemolítico foi constituído
por uma parte de Eh a 2,5% e uma parte de tampão VBS++ (1:1) contendo
diferentes concentrações de EBPf ou neuraminidase, separadamente. No intuito
de se estabelecer uma padronização do ensaio hemolítico, utilizou-se
inicialmente a neuraminidase, uma enzima de caráter conhecido, para o
tratamento dos eritrócitos. As concentrações foram realizadas em diluições
seriadas a partir da solução de VBS, partindo da concentração de 1 ug/mL da
enzima até uma concentração de 0,06 ug/mL.
Posteriormente, a uma parte de VBS contendo diferentes concentrações da
neuraminidase, adicionou-se uma outra parte de eritrócitos humanos a 2,5% a
cada tubo e incubados por 1h a 37°C, tendo após isso sido lavados por três vezes
e o precipitado, ressuspendido com VBS++ (figura 6), sempre observando se
havia sinais de hemólise nos tubos eppendorfs utilizados, como alterações na
coloração do sobrenadante para tons avermelhados. Para o EBPf, procedeu-se
da mesma forma. Em ambas as situações, os eritrócitos foram misturados com
apenas uma parte de VBS, sendo considerado o controle negativo da reação.
35
4.6.3. Avaliação do efeito hemolítico mediado pelo complemento
Considerando que os eritrócitos não foram lisados após a sensibilização,
em seguida avaliou-se a ocorrência de um possível efeito hemolítico mediado pelo
complemento em eritrócitos humanos tratados com EbPf e neuraminidase na
presença de soro humano em um sistema autólogo. Em uma placa de
microtitulação, foram aplicadas quatro diferentes condições envolvendo os Eh
2,5% sensibilizados:
1) 100 ul de Eh 2,5% (v/v) sensibilizados incubados com 100 ul de VBS++;
2) 100 ul de Eh 2,5% (v/v) sensibilizados incubados com soro humano normal
(diluído 1/ 2 em VBS v/v);
3) 100 ul de Eh 2,5% (v/v) sensibilizados incubados com soro humano
inativado (diluído 1/ 2 em VBS v/v);
4) 100 ul de Eh 2,5% (v/v) sensibilizados incubados com 100 ul de água
destilada.
Figura 6. Procedimento da sensibilização dos eritrócitos humanos a 2,5% com
neuraminidase e EBPf.
Fonte: MONTEIRO, 2015 (metodologia adaptada).
36
Os ensaios hemolíticos foram realizados em diferentes concentrações de
EBPf e neuraminadase e realizados em duplicata para cada concentração de
tratamento, como no esquema abaixo (figura 7).
Figura 7. Esquema do ensaio hemolítico autólogo realizado em placa de
microtitulação.
Fonte: MONTEIRO, 2015 (metodologia adaptada).
Após o preparo das reações, a placa foi incubada por 1h a 37°C e centrifugada
a 1.500 rpm, por 5 minutos a 4º C, transferindo-se 150 ul de cada sobrenadante
para uma nova placa de microtitulação para posterior leitura da absorbância em
um comprimento de onda de 405 nm para determinar a atividade hemolítica pela
concentração de hemoglobina no sobrenadante após a centrifugação do sistema.
Os ensaios de sensibilização dos eritrócitos humanos com neuraminidase e
EBPf e de avaliação do efeito do complemento nos eritrócitos tratados foram
realizados duas vezes a fim de verificar a reprodutibilidade dos resultados.
4.7. Ensaio de dose-dependência
Visando avaliar se o efeito hemolítico observado frente ao tratamento com
EBPf possuía um perfil de dose-resposta, os eritrócitos humanos a 2,5% em
VBS++ foram incubados com diferentes concentrações de EBPf, partindo de 0,06
μg/mL, concentração mínima utilizada no ensaio hemolítico autólogo, e postos
em reação com o soro para avaliação do efeito hemolítico através de leitura do
sobrenadante a 405 nm.
37
4.8. Cinética de degradação proteica de eritrócitos humanos a 2,5%
tratados com EBPf e neuraminidase
No intuito de obter o perfil proteico de eritrócitos humanos a 2,5% pós-
tratamento com o EBPf e neuraminidase, a solução de Eh 2,5% foi incubada com
a concentração mínima de tratamento na qual foi observada hemólise no ensaio
hemolítico autólogo, em três intervalos de tempo distintos (1h, 2h e 3h), a 37°C,
para observação do grau de degradação proteica, tendo Eh a 2,5% incubados
apenas com tampão VBS++ como controle. Findos os períodos de incubação, os
tubos foram centrifugados a 1.500 rpm, por 10 min a 4°C, coletados os seus
sobrenadantes e aliquotados para serem armazenados a -20° C até a sua utilização.
Posteriormente, os sobrenadantes foram analisados por SDS-PAGE, de acordo
com a metodologia descrita anteriormente - item 4.5 desta seção. Apenas EBPf
foi aplicado separadamente a título de comparação. Entretanto, o gel de
poliacrilamida foi impregnado utilizando a técnica de coloração com nitrato de
prata (Nitrato de prata, Sigma-Aldrich), dada a sensibilidade do mesmo para
revelação de bandas proteicas.
Resumidamente, o gel foi submerso em 200 mL de uma solução fixadora
contendo 100 ml de etanol, 24 mL de ácido acético, 100 μL de formaldeído 37%
e água destilada num período overnight. Posteriormente, foram feitas sucessivas
lavagens durante 3h, com 1h cada, em uma solução de lavagem composta por 100
mL de etanol e 100 mL de água destilada. Feito isso, foi realizado um tratamento
prévio com 1% de tiossulfato de sódio por três intervalos de 20 segundos, lavando-
se após com água destilada por igual período.
A próxima etapa foi colocar o gel por 1h em contato com o corante, cuja
preparação consistiu em 0,4g de nitrato de prata, 150 μL de formaldeído 37%,
completando com água destilada para um volume final de 200 mL, sucedida por
nova lavagem com água destilada ao final da coloração. 200 mL da solução
reveladora, contendo 6g de carbonato do sódio, 50 μL de formaldeído 37%, 50 μL
de tiossulfato de sódio 2% e água destilada, foram postos em conjunto com o gel
até aparecerem bandas proteicas, seguido por lavagens repetidas com água
destilada, paragem da reação com 100 mL de etanol, 24 mL de ácido acético e
água destilada (volume final da solução sendo 200 mL) por 10 minutos, sucedidos
38
por novas lavagens com água destilada e, por último, armazenado em 200 mL de
solução de preservação (100 mL de etanol, 20 mL de glicerol e água destilada).
4.9. Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas utilizando o Software GraphPad
Prism 7 (LaJolla, CA), aplicando-se a ANOVA One-way e os resultados foram
considerados significativos a um valor de p < 0,05. As barras de erro indicadas
foram baseadas em valores obtidos a partir das médias.
39
5. RESULTADOS
3.1. Teste de hemólise
Ao se incubar diferentes diluições de tampão de lise (0,5% NP-40, 120
mM NaCl, 50 mM Tris–HCl pH 7.8) – de 20 ul a 1,2 ul - com eritrócitos
humanos lavados com tampão VBS++ em diferentes concentrações – 2%, 2,5%
e 5% - (figura 8) a fim de determinar o volume ótimo de tampão de lise a ser
utilizado nas extrações de proteínas e reduzir a interferência desta solução
sobre a hemólise a ser observada nos ensaios hemolítico autólogos posteriores,
além de definir a concentração de hemácias para o prosseguimento destes
ensaios. O volume selecionado foi 2,5 μL e a concentração de eritrócitos, 2,5%.
Eh - eritrócitos humanos; VBS+, tampão veronal salino com Mg + Ca. Os eritrócitos foram
incubados por 1h a 37° C e centrifugados a 1.500 rpm por 5 minutos a 4° C e o sobrenadante foi
lido a 405 nm.
Figura 8. Teste de hemólise utilizando diferentes volumes de tampão de lise (20 - 1,2
μL) e eritrócitos humanos a 2%, 2,5% e 5% em tampão VBS++.
40
3.2. Dosagem de proteínas de EBPf pelo método de Bradford
A curva padrão, na qual utilizou-se a albumina sérica bovina (BSA),
demonstrou o perfil abaixo (figura 9), permitindo aferir a concentração de
proteínas total do extrato bruto de P. falciparum (EBPf) em um valor final de
5 μg/mL.
3.3. SDS-PAGE 10% corado com azul de Coomassie
No intuito de avaliar a eficácia da extração proteica, alíquotas de eritrócitos
utilizados no cultivo de P. falciparum e de EBPf foram submetidas a corrida
eletroforética para análise do perfil proteico, a partir do qual observaram-se
bandas isoladas do extrato em relação ao concentrado de hemácias, indicando
que a extração se mostrou satisfatória (figura 10).
Figura 9. Perfil da curva padrão obtido pelo ensaio colorimétrico de Bradford
(leitura a 595 nm).
EBPf: 5 ug/mL
41
Figura 10. Perfil proteico em SDS-PAGE 10% de eritrócitos humanos utilizados
no cultivo de P. falciparum e de EBPf (volumes crescentes de 40, 30, 15 e 5 μL).
Técnica de coloração por azul de Coomassie.
3.4. Ensaios hemolíticos autólogos
Inicialmente, os eritrócitos foram tratados com a enzima neuraminidase
em dferentes concentrações (1 μg/mL – 0,06 μg/mL) a fim de se obter uma
padronização do ensaio hemolítico autólogo e o efeito observado foi
comparado com o das proteases do EBPf. Na presença das proteínas do
complemento, as hemácias sensibilizadas com a neuraminidase apresentaram
hemólise variando entre 50% e 80% (figura 11).
Figura 11. Atividade hemolítica em eritrócitos humanos normais 2,5% em VBS+
tratados com neuraminidase partindo da concentração de 1 μg/mL.
VBS+, tampão veronal salino com Mg + Ca (controle negativo); SHN, soro humano
normal; H20, água destilada (controle positivo).
42
O mesmo efeito foi avaliado frente à sensibilização dos eritrócitos com EBPf,
que apresentou um perfil de atividade hemolítica semelhante ao tratamento
com a neuraminidase (figura 12A). A partir da redução significativa do grau de
hemólise quando o soro foi inativado, foi possível demonstrar que este efeito é
dependente da ação do complemento (figura 12B)
Figura 12. Atividade hemolítica em eritrócitos humanos normais a 2,5% em VBS+ tratados com
EBPf partindo da concentração de 1 μg/mL.
A) na presença de proteínas do complemento; B) na ausência de complemento ativo. VBS+, tampão veronal
salino com Mg + Ca (controle negativo); SHN, soro humano normal; SHI, soro humano inativado; H20,
água destilada (controle positivo); EBPf, extrato bruto de P. falciparum.
Este mesmo ensaio também foi realizado utilizando hemácias de doador
com traço falciforme (HbAS), a fim de avaliar a influência desta característica
genética sobre a hemólise mediada pelo complemento, na qual se observou
uma pequena redução com amplitude variando entre 20% a 40% (figura 13).
A B
43
Figura 13. Perfil hemolítico de eritrócitos humanos de doador heterozigoto para o traço
falciforme (HbAS) a 2,5% em VBS+ tratados com EBPf, partindo da concentração de 1 μg/mL.
3.5. Ensaio de dose-dependência
Partindo-se da menor concentração onde foi observada atividade hemolítica
(0,06 μg/mL) nos ensaios anteriores, houve uma redução significativa apenas a partir
da concentração de 0,01 μg/mL, com queda de aproximadamente 50% (figura 14).
VBS+, tampão veronal salino com Mg + Ca (controle negativo); SHN, soro humano
normal; H20, água destilada (controle positivo).
Figura 14. Teste de dose-dependência com concentração inicial de 0,06 μg/mL de EBPf
para uso na sensibilização de eritrócitos humanos a 2,5% em VBS++.
44
3.6. Perfil de degradação proteica de eritrócitos tratados com EBPf e
neuraminidase
A partir dos sobrenadantes f recolhidos após centrifugação e aplicados em
SDS-PAGE utilizando a coloração por nitrato de prata para revelação das bandas
proteica, observou-se que a partir do intervalo inicial de 1h já houve degradação
de proteínas quando comparados aos eritrócitos incubados apenas com VBS, e os
perfis proteicos apresentados pelos tratamentos com neuraminidase e EBPf foram
semelhantes (figura 15).
Figura 15. Perfil proteico dos sobrenadantes de eritrócitos humanos a 2,5% em
VBS++ após diferentes intervalos de incubação (1h, 2h e 3h) com neuraminidase e
EBPf .
Técnica de coloração por nitrato de prata. M - marcador de massa molecular (24-165 kDa);
1 - sobrenadante de eritrócitos a 2,5% em VBS++; 2 – EBPf, extrato bruto de P. falciparum;
3 – após 1h de incubação com neuraminidase (NA); 4 – 2h de incubação com NA; 5 - 3h
de incubação com NA 6 – 1h de incubação com EBPf ; 7 - 2h de incubação com EBPf ; 8
- 3h de incubação com EBPf .
1 2 3 4 5 6 7 8 M
45
4. DISCUSSÃO
O dilema que envolve se os mecanismos dos parasitas ou os mecanismos do
hospedeiro são mais relevantes no desenvolvimento da malária grave tem sido um forte
objeto de discussão nos últimos tempos. Alguns estudiosos sustentam que fatores
relacionados ao parasito são mais preponderantes; outros, que aqueles associados ao
sistema imune do hospedeiro têm mais influência sobre a patogênese desta doença.
Tem se estabelecido que as manifestações clínicas desta doença podem estar
atribuídas a uma consequência da inflamação sistêmica provocada pelo parasito
(HIKARO, 2016). Sabe-se que o sistema complemento é ativado durante a malária,
entretanto cada vez mais evidências têm colocado em questão até que ponto isto realmente
beneficia o hospedeiro frente à infecção. Por isso, qualquer esforço para erradicar a
malária do mundo exige uma melhor compreensão da resposta imune inata à infecção
(GAZZINELLI et al., 2014).
Ao compararmos os perfis de atividade hemolítica nos eritrócitos tratados com
neuraminidase (NA) e extrato bruto de P. falciparum (EBPf), pôde-se constatar que há
uma similaridade entre eles. A neuraminidase cliva resíduos de ácido siálico presentes
nas glicoforinas, receptores da superfície de eritrócitos, provavelmente fazendo com que
fiquem suscetíveis à ação do complemento. Logo, é possível que o P. falciparum tenha
proteases com ação similar à neuraminidase, causando esta mesma condição nos
eritrócitos tratados, e que poderiam proporcionar meios de invasão alternativos.
Awandare e colaboradores (2011) relataram que um número significativo de cepas
selvagens e de laboratório de P. falciparum (incluindo 3D7, utilizada neste trabalho), têm
demonstrado a capacidade de invadir eritrócitos nos quais o ácido siálico (SA) foi
removido após tratamento com neuraminidase, indicando a existência de uma ou mais
vias de invasão independentes de SA. Nossas investigações sugerem que P. falciparum
pode assumir um fenótipo de invasão diferencial conduzida pela estimulação antigênica
em um ambiente inflamatório, como relatado em outros estudos (BLANC et al., 2016;
SELLAU et al., 2016).
O receptor do complemento tipo 1 (CR1/CD35) foi apontado como o principal
candidato a receptor resistente à ação proteolítica das sialidases, podendo mediar a via de
invasão em eritrócitos independente de SA por P. falciparum (THAM et al., 2010;
AWANDARE et al., 2011). Outro estudo também descreveu que a hemozoína promove
a opsonização e liberação de hemácias com níveis mais elevados de CR1, que contribui
46
para uma liberação eficiente de ICs em grande quantidade durante a infecção. Portanto,
ele estaria atuando como um potencial estimulador do aumento da destruição dessas
células (PAWLUCZKOWYCZ et al., 2007; DASARI et al., 2014). Além disso, foi
demonstrada uma correlação entre o nível de expressão de CR1 e o grau de invasão de P.
falciparum, especialmente em células tratadas com neuraminidase, o que é consistente
com um papel do CR1 como um receptor no ausência de ácido siálico (SPADAFORA et
al., 2010; BROWN et al., 2015).
BIRYUKOV e colaboradores (2016) sugeriram que P. falciparum pode ser capaz
de explorar a condição opsonizante da deposição de complemento na superfície do
merozoíto que o permite ligar-se a CR1 e invadir através desta via de invasão. Ao
contrário de outros agentes patogênicos, a opsonização de merozoítos pode facilitar a
ligação às células-alvo, as hemácias (KENNEDY et al., 2016). Recentemente, foi relatado
que o regulador do complemento de fase fluida, chamado fator H, pode se ligar a
eritrócitos não-infectados e a merozoítos (POUW et al., 2015; ROSA et al., 2016).
Este fator atua acelerando a degradação da AP (via alternativa) convertase e como
cofator para a clivagem de C3b. Como o CR1 também é capaz de se ligar ao C3b
(NILSSON et al., 2011), a atividade do fator H pode levar ao acúmulo desta molécula na
superfície do merozoíto e melhorar a ligação ao CR1 (POUW et al., 2015; ROSA et al.,
2016). Duas famílias de ligantes do parasito podem estar envolvidas nestas vias de
invasão: EBA e Rh. O receptor ao qual o EBA se liga foi caracterizado como sensível à
neuraminidase, e as PfRhs atuam principalmente através de vias independentes de SA,
provavelmente aderindo ao CR1 (THAM et al., 2010).
Apesar de P. falciparum possuir uma grande variedade de vias de invasão, nem
todas são utilizadas ao mesmo tempo, podendo uma das vias se tornar predominante em
relação a outra em determinadas situações, o que lhe permite invadir eficientemente
diversos receptores em eritrócitos hospedeiros que abrigam diferentes polimorfismos
(DANKWA et al., 2017). Os isolados de laboratório de P. falciparum mostraram ser
capazes de mudar de uma via de invasão para outra, dando ao parasita a capacidade de se
adaptar a mudanças no ambiente da célula hospedeira ou, ainda, como mecanismo de
evasão imune (KUSS et al., 2011).
Outra cepa de P. falciparum, W2mef, dependente do ácido siálico, pode ser
selecionada para invadir por uma via independente de ácido siálico em eritrócitos tratados
com neuraminidase, demonstrando que esses parasitas possuem uma ampla plasticidade
47
fenotípica, fato este que pode contribuir para a sua virulência (DOLAN et al., 1990;
DURAISINGH et al., 2003; DeSIMONE et al., 2009).
No presente estudo, por meio dos ensaios hemolíticos autólogos in vitro,
demonstrou-se que a atividade hemolítica foi mediada pelo complemento, pois quando o
soro foi inibido, este efeito foi semelhante ao controle negativo. Além disso, ao
realizarmos o teste de hemólise inicial com o tampão de lise, pudemos excluir a
possibilidade da interferência deste fator sobre esse efeito.
Também foi constatado que apenas o tratamento com o EBPf não é suficiente para
provocar hemólise (vide tratamento das hemácias sensibilizadas com os antígenos de P.
falciparum e incubadas em tampão VBS++), sendo necessário haver a interação com as
proteínas do complemento (SHN) para a ocorrência do efeito hemolítico, destacando a
importância da participação deste mecanismo imune no processo. Os eritrócitos do
doador heterozigoto para a hemoglobina S (HbAS) – ou com traço falciforme -
apresentaram uma pequena redução da atividade hemolítica, demonstrando que essa
hemoglobinopatia lhes propicia uma reatividade imunológica diferenciada (SILVA et al.,
2002).
Alguns trabalhos mostraram que este genótipo está fortemente associado à
proteção contra a malária severa provocada pelo parasita P. falciparum (AIDOO et al.,
2002; CARTER et al., 2002; AYI et al., 2004; WILLIAMS et al., 2006; apud
MACHADO et al., 2010). Cholera e colaboradores (2008) verificaram que a adesão ao
endotélio e a células do sistem imunitário foi consideravelmente reduzida em relação aos
eritrócitos parasitados de pacientes homozigotos, tendo esta redução sido atribuída a
alterações no PfEMP-1. Em áreas endêmicas de malária, indivíduos heterozigotos são
protegidos da infecção, apresentando vantagens seletivas sobre indivíduos HbAA
(MIOTO et al., 2012).
Portanto, a interação do soro de indivíduos saudáveis com seus eritrócitos
sensibilizados com EBPf fez com que estes ficassem suscetíveis à ação desse mecanismo
inato. Quando em contato com o parasito, os eritrócitos são capazes de controlar a sua
ativação através do uso de reguladores vinculados às suas proteínas de membrana, e, dessa
forma, estimulam apenas quantidades restritas de produtos de ativação do complexo de
ataque à membrana (MAC) – também conhecido como complexo terminal do
complemento (TCC) - (ROESTENBERG et al., 2007). Contudo, com a destruição do
eritrócito parasitado, são liberados produtos de degradação e metabólitos do parasito,
48
estimulando ainda mais a ação do complemento, e os eritrócitos perdem esta capacidade
de controlar a lise mediada por ele (BIRYUKOV et al., 2016).
Modelos in vivo e in vitro reforçam esta ideia, nos quais foram demonstradas
evidências da ativação do complemento em infecções por P. falciparum. Pacientes com
malária complicada mostraram altos índices de ativação do complemento tanto pela via
clássica, quanto pela via alternativa (WENISCH et al., 1997; GOKA et al., 2001;
ROESTENBERG et al., 2007). Deficiências adquiridas ou herdadas das proteínas
reguladoras do complemento foram implicadas na patogênese de algumas formas de
anemia hemolítica (ATKINSON et al., 2006). De modo semelhente, a deficiência destas
proteínas ligadas à superfície celular de eritrócitos parasitados e não-parasitados têm sido
associadas à malária grave (STOUTE et al., 2003; COCKBURN et al., 2004). No
contexto da infecção malárica, foi demonstrado que eritrócitos de crianças com malária
grave são deficientes em CD35 e CD55 que, juntamente com o aumento nos níveis de
imunocomplexos, provavelmente as coloca em maior risco para o desenvolvimento de
anemia malária grave (WAITUMBI et al., 2000; STOUTE et al., 2003).
Além disso, a produção de anafilatoxinas pode potencializar a resposta
inflamatória (ROESTENBERG et al., 2007). Estudos utilizando um modelo de malária
cerebral (CM) experimental mostrou que camundongos deficientes em receptores de C5a
têm resistência parcial a desenvolver a doença e níveis reduzidos do fator de necrose
tumoral (TNF-𝑎) e interferon-gama (IFN-γ) (KIM et al., 2014), fato que foi reforçando
em humanos através de evidências recentes de que os pacientes com CM apresentam
níveis mais elevados de C5a do que pacientes com malária não-complicada (KIM et al.,
2014).
Foi mostrado que o MAC pode trabalhar sinergicamente com TNF-α para
aumentar a expressão de receptores endoteliais, como ICAM-1 (KILGORE et al., 1995),
fundamental para o sequestro de eritrócitos parasitados (TURNER et al., 1994). Assim,
o possível papel do complemento na patogênese da malária grave envolve a deposição de
ICs contendo antígenos de plasmódio na microvasculatura cerebral que, por sua vez, pode
ativar C5 levando à formação de MAC/TCC, o que resulta em um processo hemolítico
descontrolado e regulação positiva de ICAM-1 e consequente aumento do sequestro de
eritrócitos parasitados. Conjuntamente, a formação de imunocomplexos (ICs) contendo
49
merozoítos ou antígenos circulantes ativa a via clássica das cascata do complemento
(STOUTE et al., 2003; BIRYUKOV et al., 2014).
Através do ensaio de dose-dependência, foi observado que o a hemólise ainda
era bastante elevada mesmo em baixas concentrações. Esse efeito foi observado em
ensaios anteriores, indicando que o nível de parasitemia não é o único fator responsável
pela grau de anemia, uma vez que estudos mostratram que a destruição de eritrócitos
parasitados representa menos de 10% da perda destas células durante a infecção (PRICE
et al., 2001). Logo, este fato não se deve apenas aos efeitos do próprio parasito, o que
pode explicar o porquê da alta parasitemia não estar necessariamente relacionada ao grau
da anemia (EVANS et al., 2006).
Três tipos de mecanismos, não excludentes, foram sugeridos para explicar o
desenvolvimento de uma anemia, de forma não-relacionada ao grau de parasitemia,
durante a malária: 1) o aumento da destruição de eritrócitos não-infectados, 2) remoção
por células fagocíticas de hemácias infectadas ou alteradas e o 3) déficit na eritropoiese
(HIKARO, 2016). A liberação de hemozoína durante a ruptura de eritrócidos infectados
foi proposta como um ativador da via alternativa do complemento, levando à deposição
de C3b na superfície de eritrócitos adjacentes (PAWLUCZKOWYCZ et al., 2007).
Ainda, estudos preliminares indicaram o papel imunomodulador da hemozoína
associado à alteração na expressão de citocinas pró e anti-inflamatórias (RILEY et al.,
2006; URBAN; TODRYK, 2006 apud BARROS et al., 2012). Há evidências de que a
deposição de proteínas regulatórias deficientes do complemento em eritrócitos de
crianças com AGM aumentam a susceptibilidade de eritrócitos não-infectados para a
fagocitose (KORIR et al., 2014).
Este fato é reforçado por um estudo realizado por Dasari e colaboradores
(2014), no qual puderam constatar que produtos parasitários lançados na circulação
durante a ruptura dos eritrócitos parasitados tornam-se fortemente revestidos com C3-
convertases. Quando essas partículas entram em contato com os eritrócitos, estes ficam
sujeitos a ataques de componentes do complemento, que são então depositados em sua
superfície, promovendo a fagocitose dependente de C3 por macrófagos, favorecendo a
compreensão do porquê das hemácias não-infectadas terem seu período de vida reduzido
em pacientes com malária grave. Por isso, a deposição do complemento pareceu muitas
vezes se estender às hemácias adjacentes não-parasitadas.
50
Desse modo, a destruição de eritrócitos não-infectados provavelmente contribui
de forma significativa para o desenvolvimento da SMA, fenômeno este que poderia
explicar os resultados observados nos ensaios hemolíticos, uma vez que não ocorreu
invasão, mas sim uma sensibilização dos eritrócitos com proteínas e metabólitos do
parasito, entre eles a hemozoína, oriundos da lise mecânica dos esquizontes durante a
etapa de extração.
Existe uma ampla evidência de que a ativação do complemento desempenha um
papel na destruição desregulada de eritrócitos levando à anemia grave na malária (SMA)
(ALBUQUERQUE et al., 2011). Estudos mostraram que crianças com SMA têm uma
maior atividade hemolítica mediada pelo complemento, bem como um aumento da
presença de fragmentos efetores como C3a, C4a e C5a e níveis elevados de ICs, que
podem ativar a via clássica, em comparação com crianças com malária não-complicada,
indicando a ativação excessiva do complemento (STOUTE et al., 2003; NYAKOE et al.,
2009). Além disso, os eritrócitos de crianças com anemia malárica grave apresentaram
um aumento na deposição de C3b e dimunição na capacidade de regular a ativação do
complemento, que provavelmente os tornam mais suscetíveis à destruição por
macrófagos no fígado e baço (BIRYUKOV et al., 2014).
Ao analisarmos o gel corado com nitrato de prata, pode-se notar que houve um
certo grau de similaridade dos perfis de degradação proteica nos tratamentos com
neuraminidade e EBPf, reforçando a ideia de que, provavelmente, P. falciparum se utiliza
de proteases para invadir os eritrócitos por vias independentes de SA. Entretanto, o extrato
do parasito mostrou uma ação proteolítica mais rápida já desde a incubação após 1h. Isso
pode ser explicado pelo fato da neuraminidase clivar apenas ácido siálico, enquanto que
no extrato há uma variedade de proteínas com os mais diversos mecanismos de ação. O
ácido siálico presente nas glicoforinas aumenta a ligação do fator H, um cofator que atua
na degradação de C3b, e que pode limitar a ativação da via alternativa. Estas proteases
possivelmente clivam o ácido siálico da superfície das glicoforinas, favorecendo assim a
ativação da via alternativa e a indução da lise dos eritrócitos tratados mediado pelo
complemento (TAMBOURGI et al., 2002).
A concentração de glicoforina A (GPA) nos eritrócitos é responsável por 80% da
carga negativa destas células em função da sua constituição bioquímica composta de
ácido siálico e carboidratos terminais, criando uma superfície celular negativa. Essa
51
eletronegatividade é responsável por causar repulsão entre as hemácias, ajudando a
minimizar a interação célula-célula e prevenindo a aglomeração eritrocitária
(TAMBOURGI et al., 2002; PINTO et al., 2010). O peso molecular de GPA é de 16 kDa
(MURADOR et al., 2007), e não foi visualizada no gel nenhuma banda proteica
correspondente a esta faixa. Isso nos leva a crer que, provavelmente, este receptor foi
degradado durante o tratamento com EBPf e trazendo isto para uma situação prática, ao
clivá-lo, P. falciparum seria capaz de alterar o nível de repulsão eritrocitária, favorecendo
fenômenos associados à malária grave como a citoadesão e formação de rosetas.
Por outro lado, foi observada uma região conservada de aproximadamente 28 kDa
em todos os intervalos de tratamento. A proteína eritrocitária descrita com esta
característica é a Aquaporina-1 ((BERNHARDT et al., 2003) pertencente ao grupo das
Aquaporinas, proteínas integrais de membrana que formam poros nesta estrutura das
células, conduzindo seletivamente o fluxo de moléculas de água para o meio externo e
interno (ALBERTS et al., 2017). Esta proteína foi o primeiro canal aquoso de membrana
de eritrócitos humanos a ser identificado, além de ser homóloga à proteína intrínseca
marjoritária (MIP), que atua na comunicação intracelular (BERNHARDT et al., 2003).
A presença destes canais aumenta a permeabilidade das membranas à agua, e este fato
poderia estar sendo explorado pelo parasito para favorecer a susceptibilidade das
hemácias ao processo de lise, uma vez que é necessário haver um desequilíbrio osmótico
para que ocorra o rompimento da célula.
Compreender a linha tênue entre os efeitos patogênicos e protetores do sistema
complemento pode fornecer subsídios para otimizar seu efeito deletério sob o hospedeiro
durante a infecção por P. falciparum e/ou inibir especificamente os mecanismos que
contribuem para a patogênese da malária grave (WASSMER et al., 2016). Frente aos
desafios encontrados para o desenvolvimento de estratégias eficientes contra a malária, o
presente estudo forneceu mais informações acerca dos possíveis mecanismos
imunológicos envolvidos na patogênese da malária grave, reforçando a idéia de que o
complemento pode estar sofrendo uma modulação pelo parasito, além de indicar que o
parasito pode ter desenvolvido uma plasticidade de invasão que lhe permite persistir no
organismo mesmo em frente a fatores limitantes do hospedeiro. Estas interações podem
se mostrar como promissores alvos terapêuticos através do uso de reguladores da cascata
do complemento e inibidores de vias de invasão, contribuindo para a redução da
morbidade e mortalidade desta parasitose.
52
5. CONCLUSÕES
A partir dos resultados obtidos neste estudo, pode-se concluir que:
1. O sistema complemento possui efeito hemolítico em eritrócitos normais e
com traço falciforme mesmo em baixas concentrações de antígenos de P.
falciparum, podendo contribuir para a anemia e para a malária grave;
2. Eritrócitos com traço falciforme sensibilizados com antígenos de P.
falciparum são mais resistentes à hemólise mediada pelo complemento em
comparação a eritrócitos normais;
3. A similaridade dos perfis de degradação proteica nos eritrócitos tratados
com neuraminidase e EBPf sugere que P. falciparum utiliza proteases,
provavelmente sialidases, para invadir as células-alvo por vias
independentes de ácido siálico sob condições inflamatórias exacerbadas.
53
6. PERSPECTIVAS DO ESTUDO
Considerando que muitos patógenos usam várias estratégias simultâneas para
evadir o complemento, esperamos ver novas interações entre os plasmódios e a cascata
do complemento no futuro. Essas informações podem contribuir para a descoberta de
métodos diagnósticos adicionais e potenciais tratamentos alternativos envolvendo o uso
de inibidores do complemento em pacientes com malária grave, mas são necessários mais
estudos acerca do processo de invasão de parasitas em um ambiente de complemento
ativo no intuito de desenvolver uma melhor compreensão das implicações biológicas da
interação entre seus componentes e moléculas específicas de P. falciparum.
Nesse sentido, pretende-se realizar ensaios in vivo para complementar o que foi
observado in vitro, utilizando um modelo de malária experimental com cepas de P.
berghei: uma que não induz malária grave (P. berghei NK) e outra que gera este quadro
(P. berghei ANKA). Estas cepas são comumente empregadas em estudos com
camundongos C57BL-6 e apresentam semelhanças com a infecção por P. falciparum em
humanos. Feito o inóculo das cepas, a partir do soro que seria extraído dos animais, seria
feita uma dosagem através de ELISA, ensaio imunoenzimático, utilizando anticorpos
marcadores para proteínas do complemento a fim de verificar se há mais ou menos
expressão destas moléculas nos grupos observados, incluindo um grupo controle,
comparando-os.
Outra abordagem interessante seria a realização de uma citometria de fluxo
utilizando eritrócitos parasitados e não-parasitados, no intuito de analisar alguns
parâmetros como atividade enzimática, alterações na permeabilidade da membrana,
expressão de proteínas (como CR1 e glicoforinas, como também o ácido siálico associado
a esta família) e antígenos ligados à membrana, podendo fornecer dados adicionais acerca
da interação parasito-hospedeiro, os mecanismos que potencializam a ativação da cascata
do complemento e as possíveis implicações para a patogênese da malária.
54
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ALBUQUERQUE, M. I. S. Cytoadherence capabilities of Plasmodium berghei ANKA
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