UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR

INSTITUTO DE ESTUDOS COSTEIROS

FACULDADE DE ENGENHARIA DE PESCA

JOEL ARTUR RODRIGUES DIAS

SELEO DE PROBITICO NA AQUICULTURA

ORNAMENTAL DO ACAR BANDEIRA (Pterophyllum

scalare LIECHTENSTEIN, 1823)

BRAGANA

2014

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PAR

INSTITUTO DE ESTUDOS COSTEIROS

FACULDADE DE ENGENHARIA DE PESCA

JOEL ARTUR RODRIGUES DIAS

SELEO DE PROBITICO NA AQUICULTURA

ORNAMENTAL DO ACAR BANDEIRA (Pterophyllum

scalare LIECHTENSTEIN, 1823)

BRAGANA

2014

Trabalho de Concluso de Curso apresentado a

Faculdade de Engenharia de Pesca, da Universidade

Federal do Par, Instituto de Estudos Costeiros, como

requisito parcial para a obteno do Grau de Bacharel

em Engenharia de Pesca.

Orientador: Prof. Dr. Carlos Alberto Martins Cordeiro

UFPA Campus de Bragana

Co-Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Yudi Fujimoto

EMBRAPA Tabuleiros Costeiros

JOEL ARTUR RODRIGUES DIAS

SELEO DE PROBITICO NA AQUICULTURA

ORNAMENTAL DO ACAR BANDEIRA (Pterophyllum

scalare LIECHTENSTEIN, 1823)

Trabalho julgado para a obteno do grau de Bacharel em Engenheiro de Pesca do

Curso de Engenharia de Pesca da Universidade Federal do Par, Campus de Bragana.

DATA DE AVALIAO: 17 de Novembro de 2014

CONCEITO:

BANCA EXAMINADORA

Prof.. Dr. Cristiana Ramalho Maciel

IECOS/UFPA

Prof. Msc. Dioniso de Souza Sampaio

IECOS/UFPA

BRAGANA

2014

O xito do trabalho no se mede pelo caminho que

voc conquistou, mas sim pelas dificuldades que

superou em percorre-lo

Adaptado de Abraham Lincoln

Dedico este trabalho aos meus pais, Antnio

Lzaro Meireles Dias e ngela Maria

Rodrigues Dias, pelo apoio, carinho e

credibilidade durante essa caminhada, assim

como aos meus irmos Sileno Julho Rodrigues

Dias que sempre esteve presente em todos os

momentos de minha vida e ao meu irmo

Silvano Sandro Rodrigues Dias.

AGRADECIMENTOS

Por mais que eu no seja uma pessoa muito religiosa, acho que sou muito do

considerado aos olhos de Deus, aqum agradeo incondicionalmente e peo para que

todas as manhs ilumine meu caminho e conceda-me foras para nunca desistir dos

meus objetivos.

Ao Orientador Carlos Alberto Martins Cordeiro e Co-Orientador Rodrigo Yudi

Fujimoto por toda dedicao, amizade, disposio e confiana durante essa trajetria

que se concretiza na realizao de um sonho.

Aos companheiros de Laboratrio Bruna Palheta, Aline, Ryuller, Talita, Rud

Mendes, Henrique Malta, Marcela Gabay, Fabrcio Ramos, Micaelle, Josi, Las e

Debora. Aos amigos que contriburam para a realizao deste trabalho Valria Couto,

Natalino Sousa, Danielle e Arthur. Ao Laboratrio de Gentica Aplicada em especial a

Dr Grazielle Gomes, ao mestrando Raimundo Evereste pela dedicao, apoio e anlise

dos dados genticos, assim como a minha grande amiga Ivana Menezes.

Agradeo incondicionalmente ao Programa de educao tutorial PETpesca, pelas

oportunidades vividas, portas que abrimos e conhecimentos impares adquiridos sobre as

tutorias do Dr Rodrigo Fujimoto 2007/2011 e atual Dr Marileide Alves, que sempre

agiram com afinco para a continuao e xito do programa, assim como aos petianos.

Ao Laboratrio de Camares Marinhos da UFSC, em especial ao Dr Jos Luiz

Mourio, a mestranda Sheila e ps Doutoranda Gabriela, em terem me acolhido e

contribudo com muita ateno e dedicao ao andamento do trabalho.

A todos os lugares que tive oportunidade de estagiar e conhecer um pouco mais

de perto e exercer com afinco as atribuies que cabem ao profissional de Engenharia

de Pesca, Gomes da Costa em especial a Keyti e ao Ado, ao Oceanrio de Pernambuco

com o professor Ricardo, ao sr Robert do Piau, a Maria do Socorro da DNOCS Cear,

ao Blach de Tanguanika Cear, a empresa Poytara, ao sr Victor Uliana do Projeto

Arapaima em Belm, a AMASA ao Eng. De Alimentos Alessandro, ao Eng. De Pesca

Jos Geison da Secretaria de Pesca de Augusto Corra, dentre outros.

A minha excelentssima turma de Engenharia de Pesca 2010 e a turma de tcnico

em pesca 2009 do IFPA. E claro destinar esse singelo espao em agradecimento

aqueles que sempre me deram, apoio, raiva, felicidades, madrugadas em claro fazendo

trabalho, ajuda sempre que possvel no laboratrio, companheirismo, festas e cervejada,

a vocs meus Brothers Gerson Leandro, John Lennon e Diego Bazlio. Sem dvidas

incondicionalmente grato pela beno que Deus me concedeu em coloc-los nesse

captulo de minha vida.

Esse cantinho dedico, para ele, mais uma vez supracitado um parceiro que

somando ao pargrafo anterior tm extrema importncia nessa caminhada, pela sua

parceria, amizade, sinceridade e fidelidade, de uma amizade indescritvel, que alm de

me conceder extremas alegrias de confraternizao, tenho o seu apoio para anlise de

dados, discusso para concretizados e perspectivos trabalhos, nem sempre sai uma

concordncia 100%, mas isso ai quem manda ser inteligente, papo cabea. Caramba!

Como a vida nos surpreendeu nessa jornada, quanto pedra no caminho, retirar? No,

lapidar. E o tempo esta nos dando essa revira volta e como foi difcil sermos julgados

pelos nossos acertos e apedrejados pelos erros alheios hum... hum... Concluindo o

cara, meu amigo de faculdade e com certeza de trabalho, dele mesmo que estou

falando Higo Abe o famoso INHA.

Agradeo tambm com muito carinho, respeito e admirao s pessoas com

quem eu tive a oportunidade de conviver em alguns metros quadrados e adotado a

denominao de famlia. Agradeo sem sombras de dvidas a minha amigona,

Tamyres Barbosa (Tatah), uma menina extremamente iluminada, dedicada e amorosa,

praticamente a irmzinha que tive durante a graduao, assim como agradeo ao Breno

Silva (Gordinho), esse sim fez histria em Bragana e deixou muitas saudades, meu

irmozinho, como estou feliz por voc tambm est concretizando o seu sonho, desejo a

voc e toda a sua famlia muita paz, amor, sucesso e alegrias, voc sabe que cada um

tem um apelidinho especial e carinhoso que os batizei, mas no cabe para esse momento

citar (risos), te amo irmozo. Luciene (Luluh), Matheuzinho (Crazy Life) e ao meu

amigo Bruno Brito (misso).

Agradeo as amizades de Bragana, aos meus grandes amigos Wyller Mello,

Wallacy Mello e Allana Seixas, praticamente oito anos de amizade, vocs esto

concretizados em minha histria.

Aos meus pais Antnio Lzaro e ngela Maria por todo amor, carinho,

pacincia, dedicao, credibilidade e apoio que sempre me deram, para a consolidao

de meus objetivos, nem sempre concordando, mas apoiando as minhas tomadas de

decises. Ao meu grande irmozo Sileno Dias e Silvano Dias, minhas princesas

Clarina e Bia, minhas cunhadas Luciana e Rosa. E por fim a minha querida prima

Andrea Dias, a quem tenho grande amor, companheirismo e amizade e a toda aminha

famlia.

SUMRIO

CAPTULO I

1 INTRODUO GERAL: REVISO

BIBLIOGRFICA.........................................................................................................1

1.1 PISCICULTURA ORNAMENTAL.........................................................................1

1.2 ACAR BANDEIRA Pterophyllum scalare...........................................................2

1.3 PROBITICO NA AQUICULTURA......................................................................4

1.4 Enterococcus faecium...............................................................................................8

1.5 BACTERIOSE NA AQUICULTURA.....................................................................9

1.6 SELEO DE PROBITICOS in vitro................................................................10

2 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS...................................................................13

CAPTULO II

3 RESUMO...................................................................................................................27

3.1 ABSTRACT............................................................................................................28

4 INTRODUO.........................................................................................................29

5 OBJETIVO................................................................................................................32

5.1 OBJETIVO GERAL................................................................................................32

5.2 OBJETIVO ESPECFICO.......................................................................................32

6 MATERIAL E MTODOS.....................................................................................33

6.1 ISOLAMENTO DE BACTRIAS CIDO LCTICAS COM POTENCIAL

PROBTICO.................................................................................................................33

6.2 IDENTIFICAO DA ESPCIE...........................................................................34

6.3 SELEO in vitro...................................................................................................35

6.4 INIBIO DE PATGENOS................................................................................36

6.5 CINTICA DE CRESCIMENTO...........................................................................36

6.6 ANLISE ESTATSTICA......................................................................................37

7 RESULTADOS E DISCUSSO..............................................................................38

8 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

CAPTULO III

9 CONCLUSO...........................................................................................................70

9.1 CONSIDERAES FINAIS..................................................................................70

CAPTULO I

1 INTRODUO GERAL: REVISO BIBLIOGRFICA

1.1 PISCICULTURA ORNAMENTAL

A produo de espcies com potencial ornamental vem se destacando no

mercado aqucola mundial, sendo a modalidade apontada com crescimento de 14%

desde meados da dcada de 90, contribuindo com valores monetrios de

aproximadamente US$ 200 milhes em comercializao, sendo 60% deste capital

oriunda da economia de pases em desenvolvimento (FAO, 2007). Com o progresso da

atividade, diversos pases vm apontando grandes investimentos na cadeia produtiva

comercial das espcies, destacando os Estados Unidos, Japo, Unio Europeia e

Cingapura como os principais pases consumidores nesta rea (LIMA, 2003; PANN,

2008; CARDOSO & IGARASHI, 2009).

Os pases asiticos como principais produtores, enfatizando Cingapura com

produo de US$ 68,00 milhes em 2006 (AVA, 2007). Este comrcio desenvolvem

significativas tendncias que intensificam o seu sistema de produo, relacionando a

variabilidade das espcies, elevadas taxas de retorno e remunerao de capital, melhor

utilizao de espao e instalaes, podendo ser implantado positivamente em centros

urbanos, e atingir elevados valores de produtividade (PRANG, 2007).

Na Amrica do Sul os principais produtores no mercado ornamental so

Colmbia, Peru e Brasil, sendo o territrio brasileiro de grande reconhecimento pelo seu

potencial geogrfico, hdrico e climtico, que favorvel produo de diversas

espcies com potenciais a aquicultura, alm de possuir grande diversidade em sua

ictiofauna ornamental. O potencial produtivo aqucola nacional apontam para

progressivos avanos no setor, com Regies Norte (12,1%), Nordeste (2,1%), Sudeste

(13,2%), Sul (6,1%) e Centro-Oeste (1,3%), destacando como principais espcies

produzidas, as nativas da Bacia Amaznica (IBAMA, 2008; PANN, 2008; TORRES

et al., 2008).

No entanto, a pesca extrativista amaznica que vm contribuindo com dois a

trs milhes de dlares para a economia nacional, com taxa mdia de crescimento de

28,8% anualmente nas exportaes dentre os anos de 2002 a 2005 e US$ 3,9 milhes,

em 2007, comercializando aproximadamente 6,7 milhes destes organismos,

destacando-se o Par e Amazonas, (PANN, 2008; TORRES et al., 2008). Destes

estados, o Par, no ano de 2005, atingiu o ranking nacional de segundo maior produtor

de peixes ornamentais, oriundos do Rio Xingu e Rio Tapajs (TORRES et al., 2008).

O comrcio ornamental, principalmente s espcies nativas, encontra-se em

intensa expanso a nvel internacional, decorrentes da grande variabilidade dentre os

gneros e exuberncia dessa espcie (PRANG, 2007). Entretanto o Brasil apresenta-se

emergente na competitividade dos mercados externos, sendo de suma importncia o

apoio atividade e incentivos em tecnologias de reproduo, nutrio, manejo, gentica

e sanidade que preservem os estoques selvagens e aprimorem as tecnologias de

produo, visando estabelecer uma atividade social, produtiva, econmica e sustentvel

(SALES & JANSEM, 2003; GODINHO, 2007).

1.2 ACAR BANDEIRA Pterophyllum scalare

A espcie pertence famlia Cichlidae apresenta caractersticas fenotpicas

como; corpo triangular, perfil afilado, nadadeiras dorsal e anal longas e eretas,

nadadeira plvica fina e comprida e linha lateral interrompida (DIAS & CHELLAPA,

2003; LIMA, 2003). O acar bandeira, Pterophyllum scalare (LIECHTENSTEIN,

1823), uma espcie endmica da bacia Amaznica, com ampla distribuio,

encontrado nas guas continentais do Peru, Colmbia, Guianas e Brasil. Habita

ectonos dulccolas e lnticos de guas cidas e de baixa dureza, podendo atingir 15 cm

de comprimento. Na natureza so comumente encontrados em cardumes com

estabelecimento de hierarquias nas proximidades de troncos, razes e vegetao

submersa, servindo de abrigo e proteo contra predadores. Se alimentam de pequenos

crustceos, larvas de mosquito e vegetais, considerando-se uma espcie de hbito

alimentar onvoro-carnvora (CACHO et al., 1999; FUJIMOTO et al., 2006;

RODRIGUES & FERNANDES, 2006).

A maturidade sexual da espcie supracitada alcanada entre oito a doze meses

de idade, apontando para uma elevada complexidade em seu comportamento por

competio territorial, coorte, acasalamento e cuidado parental, sendo a atuao do

macho de grande importncia no cuidado da prole contra predadores, alm de adotarem

como caracterstica reprodutiva a monogamia serial. O dimorfismo sexual da espcie

pouco acentuado, possuindo o macho uma maior protuberncia na regio ceflica e a

fmea uma acentuada papila urogenital, que facilita a deposio dos vulos. Sua

reproduo ocorre quando o casal progenitor assepsia o substrato de desova com a boca,

seguido da fmea que pode expelir de 20 a 500 vulos, que so fecundados

posteriormente pelo macho, ficando a prole sobre o cuidado parental do casal dentre

duas a trs semanas, at o consumo do saco vitelnico e natao das larvas (DIAS &

CHELLAPA, 2003; CACHO et al., 2007; BALDISSEROTTO & GOMES, 2010).

As variedades de acar bandeira como: koi, marmorato, leopardo, ouro, preto,

fumaa e palhao, produzidas em sistemas de confinamento, so linhagens

geneticamente modificadas para fins ornamentais desenvolvidas por produtores da

Europa, Estados Unidos e sia a partir de matrizes selvagens da regio amaznica. Com

isso, apresentam valores monetrios de comercializao de at dez vezes mais elevados,

quando comparados aos exemplares naturais (RIBEIRO et al., 2009; VIDAL JNIOR,

2005; HULATA, 2001). O tamanho mnimo de comercializao do organismo de 2,5

cm de comprimento padro, entretanto indivduos de 4-6 cm, so mais atrativos para o

comrcio, consequente de seu perodo de engorda que varia entre trs a quatro meses

para alcanarem o tamanho adulto, apontando para valores monetrios variveis de

acordo com o tamanho do corpo e nadadeiras (VIDAL JNIOR, 2005).

Pesquisas realizadas com o ornamental utilizando dietas peletizadas ou

extrusadas melhoraram o desempenho e P. scalare quando comparados a alimentos

farelados RODRIGUES & FERNANDES (2006) e RIBEIRO et al. (2007), avaliaram as

exigncias proteicas do ornamental, encontrando resultados prximos a 32% de protena

bruta. RIBEIRO et al. (2007), ao analisarem o fornecimento de dietas isoenergticas

com 26 a 32% de PB e ZUANON et al. (2006) com nveis de protena de 34-46% de PB

na dieta de juvenis do acar bandeira, concluram que 32 e 34% de PB, respectivamente,

e 3.200 kcal de ED/kg de rao, atendem as necessidades nutricionais da espcie

(RIBEIRO et al., 2007). Comparando os sistemas de criao da espcie em mono e

policultivo com camaro-da-amaznia (Macrobrachium amazonicum, HELLER 1862),

obteve-se melhores resultados zootcnicos, quando comparados em sistema de criao

em aqurios (VASQUEZ, 2008). Avaliando as exigncias nutricionais de P. scalare,

com dois nveis de arraoamento e duas refeies ao dia concluiu que, o arraoamento

com 6% do peso vivo do animal, proporciona-o melhores resultados.

O ornamental amaznico P. scalare, uma das espcies mais criadas e

comercializadas em mbito nacional e internacional, justificada pela sua fcil

adaptao s condies de confinamento, boa expresso monetria de mercado, fcil

reproduo em cativeiro e boa aceitabilidade as raes industrializadas. Apesar de

grandes perdas de produo pouca tecnologia desenvolvida para a profilaxia e

tratamento de doenas ictiolgicas, sendo a falta de informao tcnica responsvel pela

intensificao da prtica errnea de tratamentos quimioterpicos e antibiticos, que

alm de no solucionar as enfermidades, causam degradao ao meio ambiente,

resistncia dos patgenos e intoxicao da espcie produzida, sendo de grande

importncia a profilaxia e o uso de tecnologias que sessem a presena de

microrganismos que comprometam a sanidade da espcie (FUJIMOTO et al., 2006;

DIAS, 2004; CARROLA et al., 2009).

1.3 PROBITICO NA AQUICULTURA

A definio utilizada para se classificar um probitico na aquicultura segue os

estudos de GASTESOUPE (1999), que resume o termo como micro-organismo vivo

que ao se inserir no sistema de criao coloniza a microbiota intestinal do hospedeiro,

beneficiando a sua sade e equilbrio homeosttico. Alm de contribuir para o

crescimento e melhorar a resposta imunolgica dos organismos produzidos, aponta para

benefcios na qualidade das variveis da gua, na decomposio da matria orgnica,

inibe a propagao de bactrias patgenas no meio de criao, incluindo tambm os

conceitos de biorremediao e biocontrole (MAEDA et al., 1997; GATESOUPE, 1999;

KESARCODI-WATSON et al., 2008).

A produo de alimentos funcionais cresce a taxas de 14% anualmente, valores

que se acentuam comparados produo de alimentos convencionais, que registram

ndices dentre 3% a 4% na produo mundial. A comercializao deste mercado a nvel

nacional aponta para 1% da produo total alimentcia no Brasil, sendo os probiticos

com aproximadamente 65% deste total. Sendo essa tecnologia quando aplicada na

cadeia produtiva das espcies aqucolas uma ferramenta eficaz e no invasiva, que

corrobora na restaurao da flora natural do intestino de seu hospedeiro (ROLFE, 2000;

GRANATO et al., 2010)

Tecnologias que aprimorem o uso de probiticos na produo de organismos

aquticos crescem progressivamente com a exigente demanda empresarial, na busca de

tcnicas mais saudveis no escalonamento produtivo da aquicultura (RAMIREZ et al.,

2013). Os probiticos so suplementos alimentares no digerveis, que alm de atuarem

positivamente no alimento suplementado, surtem efeitos benficos ao seu hospedeiro.

Quando inseridos so capazes de suportar as condies adversas fisiolgicas do

hospedeiro, como: resistir acidez estomacal, colonizar o intestino e resistir s

condies naturais e antrpicas do sistema de criao (GIBSON, 1999; LEE et al.,

1999).

Uma diversidade de micro-organismos pode ser utilizada como organismos

probiticos, sendo o principal grupo estudado os das bactrias cidas lcticas, (RINGO

& GASOUPE, 1998; RINGO et al., 2003). Estas so bactrias Gram positivas,

caracterizadas por possurem morfologia de bacilos e cocos, no esporuladas, inertes,

anaerbicas obrigatrias ou aerotolerantes e produtoras de cido lctico como

fundamental carboidrato durante o processo de fermentao (MELLO et al., 2013).

Essas bactrias apresentam caractersticas de grande interesse aplicao na criao

animal como: fcil multiplicao e resposta imune no especfica do hospedeiro,

pertencente microbiota endgena das espcies aquticas em produo (RINGO et al.,

2003; SALINAS et al., 2006; GATESOUPE, 2008; SOUZA et al., 2010).

O potencial das bactrias lcticas utilizadas como probiticos, referem-se a sua

resistncia no trato gastrointestinal, desempenharem caractersticas teraputicas,

profilticas e promotoras de crescimento, alm de apresentarem um carter seguro, no

havendo o risco de causar enfermidades, modular a resposta imunolgica do hospedeiro,

apropriadas caractersticas organolpticas, pertencer a microbiota natural do intestino do

animal, desempenhar efeito antagnico s bactrias patognicas, na adeso das clulas

epiteliais do intestino, desta forma produzindo defensinas e muco, que inibem o

crescimento patognico na superfcie da mucosa intestinal, tolerar a ao dos cidos

graxos e da bile, transmudar a lactose em cido lctico, reduzindo o pH do trato

gastrointestinal, produzir substncias antimicrobianas (bacteriocinase e perxido de

hidrognio) (OUWEHAND et al., 2002; SENOK et al., 2005; SALINAS et al., 2006;

BALCZAR et al, 2008; SOUZA et al., 2010; GATESOUPE, 2008; LEBEER et al.,

2010).

Inibindo desta forma o crescimento bacteriano patognico pela adeso aos stios

superficiais do epitlio intestinal, competio por nutrientes, de fcil manejo as

condies de armazenamento, ser resistente ao processamento de raes industriais, ser

agente modulador as respostas imunolgicas e contribuir no processo fagocitrio da

rao, proporcionando assim maior ganho de peso e resistncia ao animal (FULLER,

1989; VINE et al., 2006; SUGITA et al., 2007; BALCZAR et al., 2008; REGITANO

& LEAL, 2010; QINGHUI AI et al., 2011; FARIAS, 2012).

A aplicao de bactrias probiticas na nutrio animal pode contribuir

economicamente a cadeia produtiva pisccola, proporcionando menor converso

alimentar e melhores aproveitamentos de nutrientes e aminocidos fornecidos na rao,

tendo em vista que a protena de suma importncia para o crescimento do organismo,

porm esse composto acaba sendo o mais caro e nem tanto aproveitado, desse modo

induo de micro-organismos que facilitem a fagocitose de absoro e digestibilidade

da protena, fundamental reduo dos custos de produo (LIU et al., 2009;

GASTESOUPE, 2008).

As espcies utilizadas para produo de probiticos na criao de camaro

(GARRIQUES & AREVALO, 1995; MORIARTY, 1997) e peixes (SUZER et al.,

2008), esto catalogadas como: Lactobacillus acidophilus, L. amylovorus, L. casei, L.

crispatus, L. delbruechii, L. gallinarum, L. gasseri, L. johnssonii, L. paracasei, L.

plantarum, L reuteri, L. rhamnosus, L. bulgaricus, L. lactis, L. salivarius,

Bifidobacterium adolescentes, B. animalis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. lactis, B.

longum, Lactococcus lactis, Leuconstoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici,

Sporolactobacillus inulinus, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium,

Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus toyoi, Propionibacterium freudenreichii,

Saccharomyces cerevisiae e S. boulardii (GASTESOUPE, 2008; HOLZAPFEL, 2001).

As bactrias presentes na microbiota intestinal de organismos com

potencialidade aquicultura so apresentadas em seu maior volume por micro-

organismos gram positivo, catalase negativa, no esporulados, morfologia bacilos ou

cocos e produo de cido lctico na fermentao dos carboidratos. A maior gama de

gneros catalogados na literatura com potencial probitico se destacam os

Lactobacillos, Leuconostoc, Pediococcus e Wisella (VINE et al., 2006; MOURIO,

2012).

Os estudos de probiticos na piscicultura ornamental vm crescendo e

apontando para resultados cientficos significativos nos ndices zootcnicos,

imunolgicos e reduo na converso alimentar, quando comparados a animais nutridos

com rao basal utilizando a espcies Xiphophorus helleri Heckel, 1848 (Peixe Espada),

assim como para as espcies de Poecilia reticulata Peters, 1859 (Guppy), Poecilia

shenops Valenciennes, 1846 (Molinsia Negra) e Xiphophorus maculatus Gunther,

1866 (Plati) (GHOSH et al., 2007).

A reduo das bactrias que apresentam patogenicidade ao hospedeiro, podem

ser inibidas com a modificao da microbiota gastrointestinal do animal, fornecendo a

este suplementao alimentar e/ou exposio de bactrias probiticas no sistema de

criao (GOMEZ-GIL et al., 2000; RINGO et al., 2003; RAMIREZ et al., 2006;

VASEEHARAN, 2007; WANG, 2007; TSENG, 2009). Trabalhos comprovam a

modificao da microbiota intestinal com o fornecimento de bactrias probiticas como

suplemento alimentar ou na gua de criao (GULLIAN, 2004; VENKAT et al., 2004;

DIAS et al., 2007; JATOB et al., 2008; RENGPIPAT et al., 2008; DIAS et al., 2011).

A fauna microbiolgica do trato intestinal da espcie em produo, pode ser

apontado como um recurso natural e seguro, no esforo em inibir a proliferao dos

agentes patognicos nas pisciculturas (VAHJEN, et al., 2009). Essa estratgia est

relacionada tecnologia na suplementao das raes funcionais com probiticos, cuja

tcnica desenvolvida visando reduzir a colonizao bacteriana patognica, dos animais

confinados em empreendimentos aqucolas. Apontando como alternativa a adoo dos

antibiticos nos sistemas de criao, cujos atuam no balano microbitico intestinal,

reduzindo desta forma os micro-organismos benficos ao hospedeiro (GOMEZ-GIL et

al., 2000). Alm dos probiticos apontarem como potencialidade a ausncia na

produo de toxinas e resduos, que gerem resistncia ou contaminao ao bioma de

produo (MOURIO et al., 2012).

O perfil na fermentao da glicose, a velocidade de crescimento em distintas

temperaturas, a configurao na produo de cido lctico, a habilidade de crescimento

em solues salinas, assim como sua tolerncia frente acidez ou alcalinidade,

classificam as bactrias cido lcticas em distintos gneros (VAHJEN, et al., 2009).

Como pode ser visto na criao de peixes j existem comprovaes que a

utilizao de probiticos na alimentao dos animais pode melhorar a resistncia

imunolgica e contribuir para o seu bom desempenho (KUMAR et al., 2008; NAYAK,

2010). Compostos antimicrobianos com potencial probitico, apontam para xito no

combate a patogenicidade por bactrias, Li et al., (2006) ao utilizarem o probitico

Arthrobacter XE-7, inibiu o crescimento de Vibrio parahaemolyticus, Vibrio

anguillarum e Vibrio nereis.

Os probiticos alm de beneficiarem o desempenho do animal em produo,

podem agir de forma positiva na qualidade da gua, sendo as bactrias com esse

potencial, gram positivas, que em sistemas aqucolas podem atuar na converso da

matria orgnica em CO2 de forma mais eficaz, assim como minimizar o excesso de

carbono orgnico dissolvido no sistema de produo (DALMIN, 2001). No entanto o

uso dos probiticos na piscicultura ornamental, apesar de emergente, ainda so escassos

exigindo do meio tcnico cientfico maiores estudos afim de contribuir na viabilidade

desta tecnologia na sade animal e fornecer melhorias de viabilidade econmica,

otimizando as respostas ambientais e comerciais da cadeia produtiva aqucola.

1.4 Enterococcus faecium

A espcie Enterococcus faecium classificada como uma bactria cido lctica,

Gram positiva, com distribuio oblqua, no virulenta e no resiste a ao de

antibiticos relevantes, garantindo a sua segurana quando ingerida. Micro-organismo

esse encontrado na fauna microbiolgica intestinal de humanos e animais, assim

tambm como no solo, gua e alimentos fermentados (PIMENTEL, 2007;

BYAPPANAHALLI, 2012), com fundamental importncia na suplementao de

alimentos, produzindo bacteriocinas que inibem a ocorrncia de agentes patognicos no

hospedeiro e conferem as caractersticas organolpticas do produto suplementado,

sobrevivncia ao processo de estocagem e colonizao gastrointestinal nas espcies

produzidas (BHARDWAJ et al., 2008; PIMENTEL, 2012).

Entre a caracterizao das bactrias cida lctica, os gneros Lactobacillus (L.

reuteri, L. johnsonii, L. acidophilus, L. delbrueckii, L. helveticus, L. casei, L.

rhamnosus, L. salivarius, L. fermentum e L. plantarum,) e Bifidobacterium (B.

thermophilum, B. bifidum, , B. lactis, B. longum e B. breve) so mais relatadas, porm

trabalhos avaliando o potencial probitico de outras classes de micro-organimos menos

explorados, constatam o uso probitico na resposta profiltica, teraputica e de

desempenho em animais, como as espcies da variao Lactococcus lactis, Leuconstoc

mesenteroides, Pediococcus acidilactici, Sporolactobacillus inulinus, Streptococcus

thermophilus, Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium, utilizadas com fins

probiticos na produo animal e de compostos lcticos (JIN et al., 2000; SANDERS e

KLAENHAMMER, 2001; POLLMAN et al., 2005).

A incluso de Enterococcus faecium na rao animal corrobora na reduo da

gordura visceral, a partir de estmulos da ativao no sistema enzimtico heptico do

hospedeiro, capacidade de estimular resistncia sanitria e ganho de peso. A espcie

E. faecium denominada como micro-organismos colonizador permanente e/ou

transitrio, no aparelho digestivo animal (DUPRE et al., 2005; POLLMAN et al., 2005;

SIVIERI et al., 2007).

O micro-organismo se acentua dentre outras, pela sua rpida atividade

microbiolgica de crescimento e produo de compostos antimicrobianos, no combate a

flora patognica intestinal, reduzido tempo de duplicao, com reproduo de at trs

vezes mais intensa, elevada resistncia s condies cidas estomacais, com reduzida

capacidade de perda na densidade floral, quando veiculado na suplementao oral e

rpida adeso aos stios de ligao na parede intestinal do hospedeiro, expressiva

capacidade de auto-agregao, caracterstica essa de grande importncia para fins

probitico, pois a sua coagregao em um curto intervalo de tempo contribui a formao

da barreira fsica intestinal, impedindo a colonizao de agentes patognicos

(NALLAPAREDDY et al., 2000; LUND & EDLUND, 2001; KS et al., 2003).

Enterococcus faecium se destaca por apontar uma grande absoro intestinal dos

nutrientes e capacidade de colonizao no intestino do hospedeiro, a partir dos dias

iniciais de suplementao alimentar. Trabalhos utilizando E. faecium para uso

probitico, progridem linearmente na avaliao de diferentes cepas da espcie

suplementao alimentar (MARCIKOVA et al., 2004; POLLMAN et al., 2005;

VAHJEN et al., 2009).

Com satisfatrios resultados em distintas aplicaes, para variadas espcies

animais, Kinouchi (2006) e Sivieri et al. (2007), utilizando fmeas de camundongos

com tumores biologicamente induzidos, obtiveram reao anticarcinognica, nos

tratamentos de indivduos suplementados com E. faecium, na dieta. Assim como na

aquicultura Wang (2007), Merrifield et al. (2010), Kim et al. (2012) e Dias et al. (2007),

comprovam a eficcia probitica na suplementao alimentar de tilpias, linguados,

trutas e rs, utilizando Enterococcus faecium como promotor no desempenho

zootcnico e resistncia imunolgica s espcies.

1.5 BACTERIOSES NA AQUICULTURA

As bacterioses so enfermidades no sistema de produo animal responsveis

pelos incalculveis prejuzos econmicos, comprometendo a sade e comercializao

das espcies (CAMPOS, 2010). Com a expanso da produo aqucola, apontam para

limitaes em sua cadeia produtiva relacionadas aos aspectos sanitrios presentes pela

intensificao da atividade, ocasionadas pela elevada densidade de estocagem e

negligentes manejos, tornando o ambiente propcio ao surgimento de doenas nas

espcies produzidas. Sendo as principais causas dessas atribudas a deteriorao da

matria orgnica, resultado de um errneo manejo alimentar e produtivo,

comprometendo a qualidade da gua, estresse ocasionado pelo imprprio manejo de

transporte e produo, contribuindo a um ambiente susceptvel a proliferao dos

agentes oportunistas e patognicos (ALKAHEM, 1994; SAKAI, 1999; FUJIMOTO et

al, 2005).

Sistemas de produes aqucolas so vulnerveis as enfermidades e condies

ambientais. Apontando para surtos parasitrios como grandes entraves monetrios ao

produtor, podendo impactar na perda parcial ou total de seus recursos produzidos,

consequentes da intensa proliferao patognica bacteriana em curto espao de tempo

(FAO, 2012; PEIXOTO, 2012).

As bacterioses mais frequentes que comprometem significativamente a cadeia

produtiva da piscicultura continental, se destacam as Pseudomonas aeroginosa,

Streptococcus aureus, Enterococcus durans, Micrococcus luteus, Escherichia coli e

Aeromonas durans (MARTINS, 2008). Suas transmisses ocorrem de forma horizontal,

sendo os seus surtos associados s mudanas climticas, ambiente sanitrio produtivo

inadequado, negligentes formas de manejo e transporte (PAVANELLI, 1998; AUSTIN

& AUSTIN, 2007; DUNG, 2008).

Em implantaes aqucolas continentais so causadoras de leses ulcerativas na

derme, equimoses, hemorragias, exoftalmia, acmulo de secreo nos tecidos nos peixes

em confinamento, alm de grande causadoras de anemia, sesses nos rins e fgado,

baixa imunidade e estresse animal (KIROV et al., 2002).

Surtos parasitrios ocasionados por micro-organismos patognicos so

denominados como principais entraves na cadeia produtiva aqucola mundialmente,

neste senrio estas espcies, se encontram com alto grau patognico em ambientes

sanitrios de produo pisccola, principalmente as espcies continentais dulccolas

brasileiras, intervindo em drsticas perdas produtivas e comercializao de peixes

(ZMYSLOWSKA et al., 2009; CARVALHO et al., 2011).

Estes gneros so considerados de grande patogenicidade, tanto na produo

animal, quanto para humanos, micro-organismos gram positivo/negativo autctone da

fauna intestinal de peixes saudveis, porm organismos oportunistas, que em ambientes

sanitrios inapropriados e desequilbrio homeosttico do animal desempenham

patogenicidade na aquicultura, causadoras da septicemia hemorrgica bacteriana.

Apontando como diagnstico a ruptura dos vasos sanguneos, leses na epiderme,

descamao, hemorragias ao longo do corpo do animal, despigmentao corprea,

acentuado batimento opercular, anemia, natao errtica, exoftalmia, curvatura do corpo

e mortalidade (WOO e BRUNO; 2003; DUNG, 2008; SILVA et al., 2012). Espcies

classificadas mais vulnerveis nos empreendimentos aqucolas, capazes de produzirem

enzimas extracelulares e toxinas: citosinas, hemolisinas e proteases (MARTINS, 2000;

KOZINSKA, 2007).

1.6 SELEO DE PROBITICOS in vitro

A seleo de bactrias in vitro de grande importncia para atenderem as

premissas potencialidade probitica. Para isto Vine et al. (2004) ressalta, sendo

fundamental o isolamento de cepas pertencentes fauna intestinal do organismo em

produo e a realizao de ensaios in vitro que instiguem, a no patogenicidade do

micro-organismo, resistncia s aes fisiolgicas do animal, assim como aos efeitos

antrpicos e naturais do sistema de produo, como nas medidas profiltica com NaCl e

as oscilaes das variveis fsico-qumicas do ambiente, inibio de organismos

indesejveis, a partir de compostos inibitrios, e competio por espao e nutriente

microbiota patognica. Com o exposto, apontando como pr-requisito para maior

segurana alimentar animal e ao probitica, ao serem inseridas aos estudos in vivo.

Ensaios de tolerncias das cepas probiticas frente a concentraes salinas

condizem atividade osmtica da parede celular do procarioto, quando expostas aos

sais expelidos pela bile , medidas profilticas e desempenho dos animais em produo e

viabilidade produtiva das espcies continentais com organismos marinhos, apontando

relevante s anlises in vitro para a capacidade de difuso osmtica do probitico

(HILL, 1990; FABREGAT et al., 2006; RIBEIRO, 2011).

A atuao do suco gstrico no aparelho digestivo do animal intervm como

barreira enzimtica com escalas crticas de acidez e ao emulsificante dos sais biliares,

letal aos micro-organismos (HILL, 1990; MARTINS et al., 2005; NITHYA &

HALAMI, 2013). Assim como tambm a alcalinidade, podendo intervir tanto, no

sistema de produo animal, durante os processos de calagem, quanto fisiologia de seu

intestino posterior (MOMOYAMA, 2004; BALCZAR et al., 2008; VINATEA et al.,

2010).

A ao antagnica dos micro-organismos conceituada como uma zona de

inibio do crescimento formado no entorno de discos embebidos em cultura bacteriana

candidatas a probitico, frente a meios de crescimento bacteriano, semeados com

organismo patognicos (VASEEHARAN & RAMASAMY, 2003). A partir de sua

capacidade em produzir compostos como: cidos orgnicos e bacteriocinas, na inibio

de bactrias patognicas gram positivas e perxido de hidrognio, bem como a

produo de cidos orgnicos e cido actico no combate ao crescimento de procariotos

gram negativos (VSQUEZ et al., 2005; GILLOR et al., 2008).

Na avaliao do potencial de crescimento e tempo de duplicao do probitico,

so de grande importncia seus testes in vitro, para eventual viabilidade de produo,

manuteno na densidade microbiolgica intestinal para perspectivas anlise in vivo,

simulando a elevada capacidade em multiplicao para competir por espao e nutriente,

aos agentes patognicos no hospedeiro (VINE et al., 2004; SANZ, 2007; VELEZ et al.,

2007; VASILJEVIC & SHAH, 2008).

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CAPTULO II

3 RESUMO

A espcie Pterophyllum scalare aponta para expressivos valores monetrios em

comercializao, sendo exportada principalmente para os pases Europeus, Americanos

e Asiticos. Porm com a intensificao do sistema de produo animal, surtos

parasitolgicos, principalmente atribudos a bactrias patognicas, vm comprometendo

a cadeia produtiva ornamental. Para isso, como alternativa segura e eficaz de combate e

preveno a enfermidades, vm sendo adotado o uso de raes funcionais

suplementadas com imunoestimulantes prebiticos e/ou probiticos, que garantam

melhores valores de desempenho e resposta imunolgica a espcie em produo. Para a

eficcia de cepas probiticas, fundamental o seu isolamento e seleo do animal em

produo, exigindo uma srie de desafios in vitro que comprovem a sua eficcia,

resistindo s barreiras fisiolgicas e produtivas a aqucola ornamental do P. scalare. O

objetivo do trabalho foi isolar e selecionar in vitro cepas de micro-organismos cido

lctico de potencial uso probitico do acar bandeira (Pterophyllum scalare), realizando

uma srie de desafios in vitro fundamentada em mltiplas caractersticas. Definindo o

melhor idetipo, por artifcio das maiores mdias entres as cepas avaliadas frente aos

caracteres tolerncia ao NaCl (0,5: 1,0: 1,5: 2,0: 2,5 e 3%), pH (4, 5, 6, 8 e 9), sais

biliares (5%), halo de inibio contra seis patgenos continentais, velocidade mxima

de crescimento, contagem final de clulas viveis e das menores mdias para o tempo

de duplicao dos procariotos. De cinco cepas isoladas do trato gastrointestinal do

animal com potencial uso probitico, identificadas molecularmente como Enterococcus

faecium nomeadas nas variedades Probc 1, 2, 3, 4 e 5. Dentre as cepas avaliadas a todas

atenderam as premissas para uso probitico animal, com destaque para a variedade

Probc 4 que apontou melhores resultados.

Palavras-chave: Desempenho zootcnico, piscicultura, ornamental, sanidade.

3.1 ABSTRACT

The specie Pterophyllum scalare was point the signficants monetary values in

comercialization, being exported mainly to the Eurpean countries , americans and

asiatics. But with a intensification of a animal production system, pathologics outbreak,

mainly attribute to pathogenics bacteria, was compromising the ornamental production

chain. For this as safe and effective alternative to combat and prevent the diseases, have

been adopted using functional ration supplemented with probiotics immunostimulants

and/or probiotics, that ensure better values of performances and imunes response to

species production. To the effectiveness of probiotics strains, it is fundamental to their

isolation and selection of animal production, resisting physiological barriers to

productive and ornamental aquaculture of P. scalare . The objective of this research

was isolate and select in vitro micro-organism acid lactic of potential probiotic use for

acara-bandeira (Pterophyllum scalare), to carring a challenge series in vitro unfounded

in multiple characters. Defining the best ideotype, by artificie of biggest measure

between the strains to value in charge the tolerate characters to NaCl (0,5 ; 1,0; 1,5; 2,0;

2,5 and 3%), pH (4, 5, 6, 8 and 9) biliar salts (5%) halo of inhibition against six

continental pathogens, maximum velocity of growth, countdown to feasibles cells and

the smallest measures to the time of duplication of prochariotics. The five strains

isolated in the gastrointestinal tract animal with a potential use probiotics identified by

the molecules as Enterococcus faecium mentioned in varieties Probc 1,2,3,4 and 5.

Between the strains was valued to served the premise to the use of animal probiotic,

with prominent to the variety Probc 4 that was point better results.

Keyboards: Zootechnic performance, fishculture, ornamental, sanity.

4 INTRODUO

A produo de peixes com potencial ornamental cresce linearmente no mercado

internacional, apontando para valores monetrios de aproximadamente US$ 200

milhes em comercializao, com 60% deste capital oriundo da economia de pases em

desenvolvimento (FAO, 2007). Na Amrica Latina, o Brasil se destaca apresentando

grande variedade da ictiofauna ornamental proveniente de suas bacias hdricas

continentais, estando catalogadas mais de 2.500 espcies com distintos fentipos em

cores, tamanhos e formas. Entre essas regies destacam-se os Estados do Baixo

Amazonas, que contribuem para que o Pas ocupe a dcima oitava posio no ranking

dos pases exportadores de peixes ornamentais do mundo (ALBUQUERQUE-FILHO,

2003; GODINHO, 2007; CARDOSO e IGARASHI, 2009; RIBEIRO, 2009).

As espcies ornamentais nativas como o acar-bandeira (Pterophyllum scalare

Liechtenstein, 1823), acar-disco (Simphysodon aequifasciatus Pellegrin, 1904), apaiari

(Astronotus ocellatus Agassiz, 1831) e o cardinal (Paracheirodon axelrodi Schultz,

1956), esto classificadas entre as espcies de maior exportao comercial (CHAPMAN

et al., 2000; GODINHO, 2007). P. scalare um ornamental com grande potencial de

comrcio no mercado nacional e internacional, apontando para atrativas caractersticas

morfolgicas no mercado da aquariofilia e fcil adaptao aos diversos sistemas de

produo animal (LIMA, 2003; PRANG, 2007).

A intensificao dos sistemas de criao de peixes vem acarretando aumento de

enfermidades podendo ocasionar em mortalidades e consequentes prejuzos econmicos

cadeia produtiva (SAKAI, 1999). A responsabilidade por essa problemtica

atribuda principalmente s bactrias patognicas, de caracterstica oportunista a

ambientes sanitrios inadequados, alta densidade de estocagem, manejo alimentar

inapropriado, estresse animal, dentre outros fatores (ALKAHEM, 1994). Para prevenir e

combater as enfermidades bacterianas na piscicultura comumente so administrados

antibiticos, em sua maioria, de forma negligente e errnea, podendo fornecer

resistncia aos micro-organismos patognicos (VSQUEZ et al., 2005; DIAS et al.,

2011), alm do que em ambientes aqucolas esse efluente pode ser fonte de poluio

(BOYD e MASSAUNT, 1999).

Como medida alternativa ao uso de antibiticos nos ltimos anos vem sendo

adotado o fornecimento de raes funcionais suplementadas com imunoestimulantes,

prebiticos e/ou probiticos, aumentando os lucros e reduzindo os impactos ao corpo

hdrico. Essa estratgia produtiva aponta para a preveno de surtos de micro-

organismos patognicos no sistema de produo (OLIVEIRA et al., 2002).

Os probiticos so micro-organismos com potencialidades antagnicas aos

agentes patognicos, atravs da colonizao destes no trato digestivo do animal,

competindo desta forma por nutrientes e produzindo metablicos inibidores, aplicados

em diversas reas mdicas, na agricultura e na produo animal, tendo aplicao na

aquicultura a partir da dcada de 80, contribuindo significativamente na sanidade

animal, a partir do estmulo de seu sistema imunolgico (KOZASA, 1986; RAMIREZ,

2006; VINE et al., 2006; BALCAZR et al., 2008; GATESOUPE, 2008; TINH et al.,

2008).

Em produes aqucolas os probiticos so definidos como clulas microbianas

que ao serem inseridas no sistema de criao colonizam o trato digestrio dos animais,

contribuindo com o desempenho e resposta imune do animal atravs do estmulo

produtivo de vitaminas, cidos graxos de curta cadeia, minerais e lipdeos, alm de

melhorar o aproveitamento proteico, otimizando a digestibilidade e assimilao dos

nutrientes essenciais, ocasionado pelo aumento da viscosidade intestinal, melhorando,

com isso, o desempenho zootcnico do indivduo (GATESOUPE, 1999; SUGITA e

ITO, 2006; KESARCODI-WATSON et al., 2008; SOUZA et al., 2010).

Dentre os micro-organismos utilizados como probiticos, destacam-se as

bactrias cido lcticas, por apontarem fcil crescimento, produo de compostos

antimicrobianos (cido lctico, perxido de hidrognio, cidos orgnicos e bactericidas)

e estmulos resposta imune no especifica em seu hospedeiro (RINGO e

GATESOUPE, 1998; GATESOUPE, 2008).

A eficcia dos probiticos comprovada quando inseridos nos sistemas de

produo aqucola, de acordo com MORIARTY (1998), ao suplementar a dieta com

micro-organismos probiticos, obtendo melhorias nas variveis da gua e na sanidade

de espcies aquticas, assim como BOYD e MASSAUT (1999) comprovou seu efeito

biorremediador na decomposio da matria orgnica e na qualidade da gua na

aquicultura, promovendo reduo nas taxas de fsforo e dos compostos nitrogenados,

amnia, nitrito e nitrato.

Assim, o isolamento de bactrias com interesse probitico do trato

gastrointestinal da espcie em produo fundamental para a sua eficincia, porm este

processo est associado ao isolamento de centenas de micro-organismos para este fim,

entretanto a abundncia dessas bactrias inviabiliza a realizao de ensaios com todas as

cepas com este potencial, sendo a produo desse suplemento alimentar exige a

realizao de uma srie de desafios de seleo in vitro, para inibio de agentes

patognicos, conhecer a cintica de crescimento, a resistncia a sais biliares e os efeitos

naturais e antrpicos que possam estar presentes no sistema de produo animal (ALY

et al., 2008; BALCAZAR et al., 2008; EH-RHMAN et al., 2009).

Um micro-organismo que atenda as premissas de um probitico deve apontar

para o maior nmero de caractersticas especficas, que garantam a sua eficincia como:

no ser patognico, ausente de genes que resistam a antibiticos, tolerante aos sais

biliares e pH, aderncia mucosa intestinal, elevado crescimento e reproduo,

capacidade de colonizar a superfcie do epitlio intestinal, registro como aditivo

alimentar, boa atividade antagnica aos patgenos com grande expresso de surtos a

espcie produzida, especificidade ao hospedeiro, preferencialmente de origem autctone

do animal (MERRIFIELD, 2010).

Portanto, o objetivo deste trabalho isolar e selecionar in vitro cepas de

micro-organismos cido lcticos de potencial probitico do peixe ornamental

amaznico acar bandeira Pterophyllum scalare baseada em mltiplos desafios.

5 OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GERAL

Isolar e selecionar a bactria com potencial probitico, obtida do trato

gastrointestinal do peixe ornamental amaznico acar bandeira Pterophyllum scalare.

5.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Isolar bactrias cido lcticas do trato gastrointestinal do acar bandeira

Pterophyllum scalare;

Avaliar in vitro as cepas isoladas submetidas a desafios com NaCl, pH, sais

biliares, inibio de patgenos;

Cintica de crescimento; velocidade mxima de crescimento e tempo de

duplicao;

Identificar as cepas com potencial probitico.

6 MATERIAL E MTODOS

6.1 ISOLAMENTO DE BACTRIAS CIDO LCTICAS COM POTENCIAL

PROBTICO.

As cepas das bactrias com potencial probitico foram isoladas do trato

digestrio de dez juvenis saudveis do peixe ornamental amaznico acar-bandeira

Pterophyllum scalare, obtidos a partir de reproduo natural em cativeiro, com valores

zootcnicos de 38,77 0,58mm, 21,95 0,17 mm, 32,63 0,26 mm e 775,71 0,15

mg para comprimento total, comprimento padro, altura e peso, respectivamente,

mensurados com o auxlio de paqumetro e balana de preciso.

Os organismos foram submetidos a jejum de 24 horas, para esvaziamento

intestinal. Os peixes foram eutanasiados com seco na medula espinhal, desinfetados

externamente com soluo de lcool 70%, e eviscerados, realizando a exciso do

intestino do animal em condio estril, com peso de 0,1g, utilizando bisturi, tesoura e

placa de petri previamente esterilizados.

Aps coletado, o material foi macerado em soluo salina de NaCl a 2%,

utilizando gral e pistilo de porcelana, posteriormente transferidos para tubos Falcon

contendo 9 ml de meio de cultura em caldo para Lactobacillus Man Rogosa Sharpe

(MRS), meio exclusivo para o crescimento de bactrias lcticas, homogeneizado com

agitador de tubos vortex e incubados por 24 horas a 35C.

Aps incubada, a soluo foi novamente homogeneizada e semeada em placas

de petri com volume de 15 ml de meio de cultura agar Man Rogosa Sharpe (MRSA) em

duplicata, homogeneizadas com esferas de microprolas, contendo 10% de azul de

anilina como indicador de cepas probiticas (RAMIREZ et al. 2006) e incubadas por

um perodo de 48 horas a 35 C em estufa esterilizada. Os meios de cultura foram

elaborados em solues contendo gua destilada e concentraes de soluto coerente s

instrues do fabricante. Esterilizados em autoclave a temperatura de 120 C durante 20

minutos. Aps o processo, os meios de cultura foram transferidos para a capela de fluxo

laminar, at atingirem a temperatura ambiente, a seguir esterilizados com luz ultra

violeta por 20 minutos, para posteriormente serem semeadas as cepas em meios de

cultura em caldo e placa (BULLER, 2004).

As colnias de interesse (bacilos e cocos gram-positivas), foram isoladas por

esgotamento de estrias em meio agar MRS e avaliadas quanto produo de catalase,

descartando para as etapas de inibio in vitro as cepas catalase positivas (JATOB et

al., 2008).

Aps o isolamento em estrias as colnias desenvolvidas no meio de cultura

foram reconhecidas e classificadas utilizando o mtodo de Gram. As colnias com

relevncia para uso probitico, cocos e bacilos gram-positivas, foram semeadas em um

novo meio de cultura gar MRS para esgotamento em placa.

6.2 IDENTIFICAO DA ESPCIE

O material gentico para identificao das cepas, foi extrado de isolados puros

mantidos em meio semisslido, no Laboratrio de Probiticos da Universidade Federal

do Par. Onde cada cepa foi semeada com o auxlio de uma ala de platina estril em

meio caldo MRS com 10 ml, incubados a 35 C aps 24 horas de crescimento

bacteriano.

Para a extrao do DNA dos procariotos seguiu a metodologia de Sambrook et

al. (1989), adaptado por Jin (2006), sendo aps o cultivo das cepas, 1,4 ml de cada

cultura foi centrifugada a 12000g durante 2 minutos, sendo o pellet ressuspenso em 530

l de TE (100mM de Tris e 1 mM de EDTA), posteriormente adicionada um alquota de

28 l de dodecil sulfato de sdio (SDS) a 20%, e 2 l de proteinase K (2mg/ml).

Mantidas em estufa a 37 C por duas horas sem agitao, para posterior extrao,

utilizando 500l de feno/clorofrmio/lcool isoamlico (25:24:1). Em seguida o

sobrenadante foi retirados e 500l expelidos em um novo micro tbulo com capacidade

de 1,5 ml, adicionado 10 l de NaCl a 5 M, para uma concentrao final de 10 mM, no

precipitado com duplicata de etanol absoluto gelado. Aps esses procedimentos o DNA

foi congelado -20 C durante duas horas, para posterior centrifugao 12000g em

dez minutos, sendo o precipitado lavado com soluo de lcool a 70% e ressuspenso em

100 l de TE e tratado com 2 l de RNAse H (10 mg.ml-1

). Para posterior anlise de 4

l por eletroforese em gel de agarose a 1 % para quantificao.

A quantificao do DNA extrado foi realizada pela metodologia de

fluorescncia (SAMBROOK & RUSSEL, 2001). Uma vez quantificado o material

gentico das cepas de bactrias com potencial probitico, prosseguiu o processo de

amplificao dos genes selecionados para sequenciamento e posterior identificao dos

isolados do trato-gastrointestinal do acar bandeira. A regio foi isolada e amplificada

via PCR phenylalanyl-tRNA synthase (pheS), utilizando os seguintes iniciadores: pheS-

21-F (5' CAYCCNGCHCGYGAYATGC 3') e pheS-23-R (5'

GGRTGRACCATVCCNGCHCC 3'), eficaz para analise taxonmica de procariotos

cido lcticos (NAESER et al. (2007). Em seguida foi realizada a amplificao do

fragmento de DNA a partir da tcnica de Reao de Polimerizao em Cadeia (PCR).

As reaes foram conduzidas com um volume de 15 L, sendo 2,4 L de DNTPs (1,25

mM), 1,5 L de tampo (200 Mm Tris-Hcl- PH 8, 500 Mm KCl), 0,6 L de MgCl2 (50

Mm), 0,6 L de cada um dos iniciadores (50 ng/ L), aproximadamente 50 ng de DNA

molde, 0,1 L de Taq Polimerase (5 U/ L ) e gua ultrapura para completar o volume

da reao.

Aps o resultado de PCR o sequenciamento das amostras foi efetuado pelo

mtodo de dideoxiterninal (SANGER et al., 1977), no sequenciador automtico ABI

3500 XL, utilizando reagentes do kit BigDye (ABI Prism TM Dye Terminator Cycle

Sequencing Reading Raction PE Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). As

sequncias foram alinhadas e editadas com o auxlio do programa BioEdit (HALL,

1999).

Aps sequenciado o material gentico foi extrado em um arquivo individual

para cada cepas em formato FASTA, para leitura no programa Basic Local Alignment

Search Tool-BLAST. A identificao das cepas foi realizada inicialmente pela

comparao com sequncias depositadas no acervo mundial de sequncias GenBank

(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/), sendo a busca realizada com o algoritmo

MEGABLAST. Posteriormente, as relaes filogenticas foram estimadas com

construo de uma rvore de agrupamento de vizinhos, utilizando 1000 pseudo-rplicas

de booststrap, sendo estas anlises conduzidas no MEGA v. 6.05 (TAMURA et al.,

2013).

6.3 SELEO in vitro

Para os testes in vitro as cepas das bactrias com potencial probitico isoladas

foram semeadas em tubos Falcon esterilizados contendo volume de 9ml de meio de

cultura caldo MRS, produzidos com distintas concentraes salinas de (0, 0,5, 1,0, 1,5,

2,0, 2,5 e 3%), pH (4, 5, 6, 7, 8 e 9), sais biliares, 5% (p/v), semeados com um ml de

cultura crescida de cada cepa e conduzidas para estufa a 35 C durante o perodo de 24

horas com quatro repeties. Em seguida, realizou-se leitura de 1 (um) ml de cada

cultura em cubetas para anlises no espectrofotmetro a 630 nm de absorbncia. Sendo

a resposta de cada cepa isolada sobre distintas concentraes de NaCl, pH e sais biliares

definidas pelo percentual de reduo da absorbncia em comparao ao meio de cultura

controle com 0% de NaCl, pH (7) e sem adio de sais biliares.

6.4 INIBIO DE PATGENOS

A inibio de patgenos foi aplicada a capacidade antibacteriana das cepas cido

lcticas frente aos agentes patognicos, analisado pelo halo de inibio, denominado

pelo dimetro da zona inibitria das cepas probiticas (HJELM et al., 2004), realizado

pelo mtodo de Ramirez et al. (2006). Com isto as cepas cido lcteas crescidas em

tubos de ensaio com meio de cultura caldo MRS, mantidos por 24 horas incubadas em

estufa a 35C, posteriormente semeadas em placas de petri contendo meio de cultura

agar MRS e incubadas a 35C durante 48 horas.

Onde quatro discos com dimetro de 0,8 cm foram retirados de placa Agar com

cepas de bactrias cido lcticas e ento sobrepostas em meio de cultura Agar Triptona

de Soja (TSA), recm semeadas com os patgenos: Aeromona hydrophyla,

Pseudomonas aeroginosa, Enterococcus durans, Escherichia coli, Staphylococcus

aureus e Micrococcus luteus incubados a 30 C por 48 horas. A inibio do crescimento

dos patgenos foi determinada, pelo dimetro do halo de inibio de crescimento

bacteriano produzido nas extremidades do disco Agar MRS.

As bactrias utilizadas como probiticos apresentam como caracterstica a

competio por nutrientes e espao com os microrganismos patognicos do trato

gastrointestinal de seu hospedeiro, tornando de fundamental importncia uma elevada

taxa de crescimento da cepa utilizada para tal fim (KESARCODI-WATSON et al.,

2008; VINE et al., 2006).

6.5 CINTICA DE CRESCIMENTO

As anlises para determinarem a cintica de crescimento bacteriano foi realizada

a um intervalo de duas horas, retirando uma amostra de 1 ml do meio de cultura para

leitura em espectrofotmetro a 630 nm de absorbncia. Para anlise dos dados as

concentraes dos inculos foram convertidas para unidades formadoras de colnia

UFC/ml. Aps 24 horas de crescimento em meio de cultura lquido, uma alquota de

100 l de todos os frascos foram semeados em meio de cultura agar MRS, pela tcnica

de diluio seriada e inoculadas a 35 C durante 48 horas, para ento serem estimadas

as unidades formadoras de colnia UFC/ml.

Para estes resultados, foram calculadas a velocidade mxima de crescimento

(max) e tempo de duplicao (tdup) das respectivas cepas, seguindo a equao de

JATOB et al. (2008):

Velocidade mxima de crescimento;

Onde;

max = Velocidade mxima de crescimento

Z = Concentrao (UFC/ml)

Z0 = Concentrao inicial do inculo (UFC/ml)

dt = Tempo de cultivo (horas)

Tempo de duplicao;

Onde;

tdup = Tempo de duplicao (horas)

max = Velocidade mxima de crescimento.

6.6 ANLISE ESTATSTICA

As contagens microbiolgicas foram transformadas em log10(x+1), antes de

serem submetidas aos testes estatsticos. Sendo os dados obtidos em cada desafio

submetidos Anlise de Varincia (ANOVA), com significncia (p

7. RESULTADOS E DISCUSSO

A importncia na aquisio de um probitico deve seguir o isolamento de

bactrias endgenas intestinais do prprio hospedeiro, garantindo uma maior segurana

como suplemento alimentar, no patognica, habilidade em resistir ao dos sais

biliares, valores estremos de pH e proteases no aparelho digestivo do indivduo. Assim

como testes antagnicos, para comprovar a produo de compostos inibitrios na

competio por nutrientes, dos probiticos frente microbiota patognica (VINE et al.,

2004).

Identificao da espcie

Como resultado das cepas cido lcticas com potencial probitico isoladas do

trato intestinal do acar bandeira Pterophyllum scalare, de 16 morfotipos selecionados,

cinco apontaram catalase negativa e prosseguiram aos demais ensaios in vitro,

identificados molecularmente como Enterococcus faecium. Das variedades analisadas

todas apontaram para uma vasta variabilidade fenotpica, para todos os caracteres

avaliados neste trabalho.

Os resultados da comparao do sequenciamento molecular obtidos da

ferramenta BLAST do banco de dados GenBank, apontaram para os iniciadores

especficos ao gene pheS eficaz na amplificao dos nucleotdeos das amostras, sendo

possvel identificar a espcie trabalhada, com ntida leitura cromatogrfica e

similaridade de identidade igual a 100%, das cinco cepas, com amostras identificadas

como Enterococcus faecium, sendo que estes resultados corroboram com o filograma

(Fig. 1), onde existe um elevado suporte estatstico para o arranjo contendo sequncias

das cinco cepas, das analisadas e sequencias previamente identificadas com E. faecium.

No isolamento e seleo de cepas com potencial probitico estudos que ao

identificarem esses isolados de animais em produo, deparam-se com cepas de mesmas

espcie, porm com variedades distintas. Vieira et al. (2008) ao isolarem bactrias

probiticas da carcinocultura marinha, identificadas bioquimicamente com galerias API

50 CHL, como resposta a melhor cepa que suprisse o perfil probitico, a espcie

Lactobacillus plantarum com a variedade denominada L. plantarium 1, apresentou

melhor ndices de avaliao a seriados testes in vitro.

Figura1. Fenograma das cepas probiticas isoladas do acar bandeira com as sequncias

do gene pheS (aproximadamente 334 pares de base).

Assim como Roselet (2008) ao isolar e identificar molecularmente micro-

organismo com potencialidade probitica, verificou que uma espcie pode apresentar

comportamentos distintos frete a desafios in vitro. Dosta et al. (2012) ao isolar

diferentes morftipos com potencial probitico de juvenis de Pterophyllum scalare,

identificou molecularmente trs cepas que apontam melhores resultado de seleo in

vitro, utilizando o gene 16S, resultados que classificaram as cepas pertencentes ao

gnero Bacillus sp., com a variedade Bsp2 como melhor respostas as anlises, no

sendo possvel, averiguar agrupamento gentico de similaridade identificao

taxonmica de espcie.

Estudos comprovam a eficcia de Enterococcus faecium com uso probitico

como promotor do desempenho zootcnico, imunolgico e flora predominante no trato

gastrointestinal de animais (BENYACOUB , 2003; TARASOVA, 2010; SUN et al.,