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FRANKLIN GERÔNIMO BISPO SANTOS
ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO-MOLECULAR E DE FATORES DE VIRULÊNCIA DE Staphylococcus aureus ASSOCIADOS À MASTITE
BOVINA EM PROPRIEDADES DE EXPLORAÇÃO LEITEIRA DOS ESTADOS DE SÃO PAULO E PERNAMBUCO
Tese apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências (Microbiologia).
FRANKLIN GERÔNIMO BISPO SANTOS
ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO-MOLECULAR E DE FATORES DE
VIRULÊNCIA DE Staphylococcus aureus ASSOCIADOS À MASTITE BOVINA EM PROPRIEDADES DE EXPLORAÇÃO LEITEIRA
DOS ESTADOS DE SÃO PAULO E PERNAMBUCO
São Paulo
2009
Tese apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.
Área de concentração: Microbiologia
Orientador: Prof. Dr. Elizabeth Oliveira da Costa Freitas Guimarães
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
______________________________________________________________________________________________________________
Candidato(a): Franklin Gerônimo Bispo Santos.
Título da Tese: Estudo epidemiológico molecular e de fatores de virulência de Staphylococcus aureus associados à mastite bovina em propriedades de exploração leiteira dos estados de São Paulo e Pernambuco .
Orientador(a): Elizabeth Oliveira da Costa Freitas Guimarães.
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado, em sessão pública realizada a ................./................./................., considerou
( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)
Examinador(a): Assinatura: ............................................................................................... Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................
Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................ Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................
Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................
Presidente: Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................
DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP) Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo
reprodução não autorizada pelo autor
Santos, Franklin Gerônimo Bispo.
Estudo epidemiológico molecular e de fatores de virulência de Staphylococcus aureus associados à mastite bovina em propriedades de exploração leiteira dos estados de São Paulo e Pernambuco / Franklin Gerônimo Bispo Santos. -- São Paulo, 2009.
Orientador: Elizabeth Oliveira da Costa Freitas Guimarães. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Departamento de Microbiologia. Área de concentração: Microbiologia. Linha de pesquisa: Mastite. Versão do título para o inglês: Molecular epidemiology and virulence factors of Staphylococcus aureus associated to bovine mastitis in dairy herds from São Paulo and Pernambuco state . Descritores: 1. Mastite bovina 2. S. aureus 3. Portador 4. Epidemiologia Molecular 5. PFGE e PCR 6. Biofilme I. Guimarães, Elizabeth Oliveira da Costa Freitas II. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-Graduação em Microbiologia III. Título.
ICB/SBIB0105/2009
A Deus e a todos os espíritosde luz que me acompanharamnesta jornada, pela íntimacerteza da escolha do ofícioda docência e pesquisa comoobjetivo de dedicação destavida. Ofereço.
Aos meus pais, Floracy eJosé Augusto, às minhas irmãs, Lívia e Michelle e à Tia Eulália pelo amor, carinho e apoio constantes ao longo de toda minha vida.Dedico.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Floracy e José Augusto, às minhas irmãs Lívia e Michelle e à
Tia Eulália, pelo amor, luta, dedicação, cumplicidade e compreensão;
Aos meus sobrinhos Wesley, Vitória, João e Mariana por fazerem me sentir
um tio amado e orgulhoso, mesmo estando sempre tão distante;
À Profa. Dra. Ana Lúcia Figueiredo Porto, do Departamento de Morfologia e
Fisiologia Animal da Universidade Federal Rural de Pernambuco, pelo despertar no
caminho da Ciência e por guiar-me com carinho e segurança nos primeiros passos
da carreira de pesquisador;
À Profa. Dra. Elizabeth Oliveira da Costa Freitas Guimarães, pela orientação
na condução da tese, pelos exemplos de excelência no ofício da docência e por toda
uma vida dedicada à pesquisa em glândula mamária e produção leiteira;
À Profa. Dra. Irma Nelly Gutierrez Rivera e a todos do Laboratório de Ecologia
Microbiana Molecular do ICB/USP pela acolhida, amizade, confiança, convívio diário
e por terem sido fundamentais à execução da tese;
À Profa. Dra. Agnes Marie Sá Figueiredo e a todos do Laboratório de Biologia
Molecular Bacteriana do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da
Universidade Federal do Rio de Janeiro, pelos valorosos ensinamentos, acolhida e
apoio nas atividades de pesquisa sobre biofilme;
À Profa. Dra. Elsa Masae Mamizuka e à Lara Mendes de Almeida, do
Laboratório de Referência Nacional em Fagotipagem de Staphylococcus aureus da
FCF/USP, pelo indispensável apoio à tipagem molecular;
À Dra. Priscilla Anne Melville e ao Prof. Dr. Nilson Roberti Benites, do
Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal da FMVZ/USP,
pela amizade e apoio nos exames microbiológicos;
À Dra. Juliana Rodrigues Pozzi Arcaro e a todos os pesquisadores do Setor
de Bovinocultura de Leite do Instituto de Zootecnia de Nova Odessa-SP, pelo auxílio
nas coletas e processamento das lactoculturas;
À Dra. Carla Lopes de Mendonça e a todos da Clínica de Bovinos da
Universidade Federal Rural de Pernambuco pela acolhida e apoio à pesquisa de
campo;
À Profa. Dra. Maria José de Sena, Pró-Reitora de Ensino de Graduação da
Universidade Federal Rural de Pernambuco, pelos fortes laços de amizade e
admiração e pelo inestimável apoio à condução dos experimentos em Pernambuco;
Ao Dr. Afonso Aurélio Perez de Carvalho, do Instituto de Zootecnia de
Pindamonhangaba-SP, pelo indispensável apoio às coletas de campo;
À Profa. Dra. Renata Fernandes Rabello, do Instituto Biomédico da
Universidade Federal Fluminense, pelo auxílio nas análises dos perfis de PFGE e na
construção do dendrograma;
Ao Prof. Dr. Paulo José Silva Valença, Faculdade de Letras da Universidade
Federal de Alagoas, pela amizade e inestimável apoio na revisão da tese;
Aos pesquisadores do Núcleo de Apoio à Pesquisa em Glândula Mamária e
Produção Leiteira (Napgama) da USP, particularmente aos amigos Cristiana
Mármore, Felício Garino e Roberto Raia, pelo auxílio nas coletas de campo;
A Maria José de Jesus Carvalho, Eva Aparecida da Silva Oliveira e Renata
Maria dos Santos, da Biblioteca do ICB/USP, pela presteza, simpatia e excelência
no atendimento prestado à comunidade acadêmica;
A Alice Shimabuku, Celso e Luciana, da Seção de Pós-Graduação do
ICB/USP, exemplos de eficiência, atenção e simpatia;
Aos amigos que surgiram ao longo desta jornada, em especial à Ana Márcia
Sá Guimarães (Pocahontas), Aricelma Leite, Christiane Prosser, Liliana Rocha,
Maria do Carmo Daulísio, Mariela Burbano, Rairlene Costa, Rochester Novais,
Rogério Queiroz e Verônica de Franco Rennó (Ursa), pela acolhida, ombro amigo,
palavras de conforto, cumplicidade e por todos os momentos que compartilhamos;
Aos amigos-irmãos Rodrigo Souto Maior e Samara Mello, por todo o carinho,
torcida, encorajamento e por se fazerem tão espiritualmente presentes, mesmo que
distantes geograficamente;
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(Processo 480226/2004-0) e ao Napgama/USP, pelo suporte financeiro que
possibilitou a execução do projeto de tese;
A todos que cruzaram meu caminho nesta jornada e que trouxeram consigo
ensinamentos que me transformaram em alguém melhor que outrora.
A vida é construída nos sonhos
e concretizada no amor.
(Chico Xavier)
Estudo realizado com o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
Processo n° 04/09253-0
RESUMO
Santos FGB. Estudo epidemiológico molecular e de fatores de virulência de
Staphylococcus aureus associados à mastite bovina em propriedades de exploração
leiteira dos estados de São Paulo e Pernambuco [Tese]. São Paulo: Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2009.
Um total de 2060 glândulas mamárias de 525 fêmeas em lactação de 11 rebanhos
de São Paulo e Pernambuco foi submetido à triagem para diagnóstico de mastite
clínica, subclínica e estágio de portador. Foram realizados CCS e lactocultura de
todas as glândulas. No acompanhamento do estágio de portador, glândulas
negativas às provas de triagem infectadas por S. aureus foram submetidas em dias
subsequentes ao exame clínico, lactocultura e CCS por 16 dias. Foi realizada
análise microbiológica de material de insufladores, pele do úbere, mãos e fossas
nasais de ordenhadores. O total de 107 S. aureus isolados foi submetido à PFGE,
PCR do gene icaA e avaliação da produção de biofilme glicose-induzido in vitro. Em
96 destes, pesquisou-se por PCR os genes coa e spa. A ocorrência de mastite
subclínica variou de 9,7% a 81,5% entre os rebanhos. A diferença de mastite
subclínica entre fazendas de Pernambuco e São Paulo foi significante (P< 0,0001).
PFGE identificou 31 perfis genéticos, agrupados em 12 linhagens, a partir dos 107
isolados. As linhagens evidenciadas foram: LE (64,5%), LA (15,9%), LI (5,6%) e
outras nove (14%). Entre os isolados de leite houve predomínio de LE (P < 0,0001)
em relação às demais. Isolados a partir de casos de mastite clínica, subclínica e de
glândulas assintomáticas pertenceram à mesma linhagem (LA e LE). O grupo LE
apresentou ampla distribuição geográfica, isto é, em 6 rebanhos de ambas as
regiões e LA restringiu-se a três fazendas de Pernambuco. Em relação aos perfis
genéticos, 87,1% foram detectados exclusivamente em um rebanho, 9,7% em dois e
3,2% em quatro. Três a sete diferentes perfis, agrupados em uma a quatro
linhagens, foram diagnosticados em cada uma das fazendas. A PFGE mostrou
maior poder discriminatório (D=0,86). As técnicas de PCR do gene coa, PCR-RFLP
do gene coa e PCR do gene spa distinguiram, respectivamente: quatro perfis
genéticos (D=0,18), quatro (D=0,26) e seis (D=0,56). Todas as 96 amostras de S.
aureus submetidas à PCR para pesquisa dos fatores de virulência (coagulase e
proteína A) amplificaram os genes. O gene icaA foi detectado nas 107 amostras. S.
aureus produtores de biofilme corresponderam a 69,2% dos isolados e 30,8% não
produziram. A PFGE detectou três agrupamentos genéticos que apresentaram
relação com o fenótipo de produção de biofilme, sendo LE 94,5% das amostras
produtoras, concentradas no agrupamento II. Entre os isolados de leite, 76,9%
produziram filme biológico. Excetuado um isolado de fossa nasal de ordenhador, os
demais 11 de origem extramamária não produziram biofilme. Não foi detectada
correlação entre produção de biofilme e CCS. Isolados de origem humana e animal
constituíram populações geneticamente distintas. Isolados de mesmo perfil genético
de insufladores e do leite refletem o eventual papel do equipamento de ordenha
como possível via de transmissão na mastite, assim como a pele do úbere. Houve
isolamento sucessivo do perfil E1 por 16 dias de glândulas assintomáticas,
caracterizando o estágio de portador. S. aureus isolados de quartos portadores
majoritariamente produziram biofilme, demonstrando maior capacidade de
persistência e disseminação como fonte de infecção.
Palavras-chave: mastite bovina, S. aureus, portador, epidemiologia molecular, PFGE
e PCR, biofilme.
ABSTRACT
Santos FGB. Molecular epidemiology and virulence factors of Staphylococcus aureus
associated to bovine mastitis in dairy herds from São Paulo and Pernambuco state.
[PhD Thesis]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São
Paulo; 2009.
Two thousand and sixty mammary glands from 525 lactating cows of eleven dairy
herds from São Paulo and Pernambuco were submitted to clinical, subclinical
mastitis cases and carrier status detection by screening tests. All the samples were
submitted to SCC and microbiological tests. In the carrier status follow up, the
screening test negative glands were submitted to clinical examination, SCC and milk
culture during at least 16 days. In parallel, milking machine, udder skin, milker�s
nostrils swabs were collected and submitted to microbiological examination. A total of
107 S. aureus isolates was analyzed by PFGE, PCR spa gene and in vitro glucose-
induced biofilm production. From these, 96 isolates were submitted to PCR of the
coa and spa genes. The subclinical mastits occurrence ranged from 9.7% to 81.5%
among the herds. It was observed a significant difference (P< 0.0001) between
subclinical mastitis occurrence in São Paulo and Pernambuco states. From the 107
isolates, PFGE identified 31 pulsotypes grouped in 12 lineages. Lineages identified
were: LE (64.5%), LA (15.9%), LI (5.6%) and, nine others (14%). Among the milk
isolates there was predominance of LE (P < 0.0001) in relation to the others. A same
pulsotype of LA and LE lineages was isolated from clinical and, subclinical mastitis
as well as from asymptomatic carrier glands. The LE group was widely spread, i. e. in
6 herds from both states while LA was isolated from three herds only in Pernambuco
state. Eighty-seven percent of the pulsotypes were only detected on single herds,
9.7% in two and, 3.2% in four different herds. In a same herd, three up to seven
different pulsotypes, grouped in one to four lineages, were detected. PFGE showed
higher discriminatory power (D=0.86). PCR coa gene, RFLP coa gene and PCR spa
gene distinguished, respectively four amplicons (D=0.18), four (D=0.26) and six
(D=0.56). All the 96 S. aureus isolates submitted to PCR for virulence factors
(coagulase and protein A) search amplified the genes. IcaA gene was detected in all
the 107 S. aureus strains and, 69,2% of them produced in vitro glucose-induced
biofilm. PFGE detected three genetic clusters related to biofilm production
phenotype, being 94.5% LE grouped in the cluster II. It was not detected any
correlation between SCC and biofilm production. Just one from the eleven
extramammary origin isolated, 76.9% of the milk isolates and, 99% of the S. aureus
isolated from carriers produced biofilm. Strains from human and animal origin were
genetically different. Few isolates from milk, milking machine and udder skin showed
similar pulsotype, suggesting a potential role as a transmission route in mastitis
epidemiological chain. The successive isolation during more than 16 days of a same
pulsotype (E1) from the asymptomatic glands characterized the carrier status. The
capability to produce biofilm demonstrated by the majority of the S. aureus isolated
from asymptomatic mammary glands showed their potential as infection source.
Keywords: bovine mastitis, S. aureus, carrier status, molecular epidemiology, PFGE
and PCR, biofilm.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Perfis genéticos representativos de 107 amostras de S. aureus avaliadas utilizando a técnica de PFGE, obtidos pelo software Bionumerics, e isoladas a partir de glândulas mamárias portadoras assintomáticas, casos clínicos e subclínicos de mastite bovina, pele do úbere, equipamento de ordenha mecânica e fossas nasais de ordenhadores em oito diferentes fazendas leiteiras localizadas nos estados de São Paulo e Pernambuco. 2009.
Figura 2 CCS no leite de glândulas mamárias infectadas com S.aureus pertencentes às linhagens LA, LE, LI e outras linhagens (LB, LD, LF, LJ e LL) em rebanhos de São Paulo e Pernambuco. 2009.
Figura 3 Macrorrestrição do DNA cromossomal obtido utilizando a técnica de PFGE em 10 amostras de S. aureus isoladas durante o acompanhamento de quartos mamários portadores assintomáticos por 16 dias na propriedade de exploração leiteira A, localizada no estado de São Paulo. Linhas M: Lambda Ladder PFGE Marker; Linha C: S. aureus ATCC 6538; Linhas 1-3 (animal 5925 respectivamente nos dias zero, 1 e 4); Linhas 4-6 (animal 5911 nos dias zero, 1 e 2); Linhas 7-10 (animal 6067 nos dias zero, 9 e 16). 2009.
Figura 4 Perfis genéticos representativos de 96 amostras de S. aureus genotipadas utilizando o método de PCR do gene coa. Linhas 1-4: perfis do gene coa; Linhas M: marcador de peso molecular de (1kb DNA Ladder). 2009.
Figura 5 Perfis de restrição representativos de 96 amostras de S. aureus submetidas à PCR-RFLP do gene coa utilizando a endonuclease AluI. Linhas I-VI: perfis de RFLP do gene coa; Linhas M: Marcador de peso molecular Gene Ruler 50 pb DNA Ladder. 2009.
Figura 6 Perfis genéticos representativos de 96 amostras de S. aureus submetidas à PCR do gene spa. Linhas 1-6: perfis do gene spa; Linhas M: Marcador de peso molecular Gene Ruler 50 pb DNA Ladder. 2009.
pág. 55 pág. 60 pág. 72 pág. 73 pág. 75 pág. 76
Figura 7 Representação hierárquica das relações genéticas entre os perfis gerados pela técnica de PFGE e a expressão fenotípica da produção in vitro de biofilme glicose-induzido de 107 amostras de S. aureus isoladas de diversas origens; o número de isolados que representam cada perfil genético é indicado entre parênteses e os agrupamentos genéticos são indicados com a numeração I, II e III. 2009.
Figura 8 Comparação entre a capacidade de produção de biofilme de S. aureus isolados a partir do leite de glândulas mamárias bovinas procedentes de rebanhos de São Paulo e Pernambuco. Linhagens de PFGE: LE (coluna A), LA (coluna B), LI (coluna C) e outras (LB, LD, LF, LJ e LL) (coluna D). 2009.
Figura 9 Análise de correlação entre capacidade de produção de biofilme e CCS entre linhagens de S. aureus isolados de glândulas mamárias de bovinos leiteiros provenientes de rebanhos de São Paulo e Pernambuco. 2009.
Figura 10 Produtos de PCR em ensaio para avaliação do genótipo
icaA em 13 amostras de S. aureus isoladas de casos de mastite bovina. Linha M: 100 pb DNA Ladder; Linha 01: cepa BMB 9393, isolado representativo do Clone Epidêmico Brasileiro, utilizada como controle positivo (amplicom de 701 pb); Linhas 02-14: amostras de S. aureus; Linha15: água Milli-Q estéril + mix PCR utilizada como controle negativo. 2009.
pág. 81 pág. 86 pág. 88 pág. 93
LISTA DE TABELAS
Tabela1 Ocorrência de mastite clínica, subclínica, portadores assintomáticos e negativos em quartos mamários de bovinos leiteiros procedentes de rebanhos de Pernambuco e São Paulo. 2009.
Tabela 2 Glândulas mamárias com isolamento de Staphylococcus aureus a partir de vacas em lactação provenientes de rebanhos leiteiros de Pernambuco e São Paulo. 2009.
Tabela 3 Distribuição de linhagens e perfis genéticos de PFGE de 107 amostras de S. aureus isoladas em dois estados brasileiros. 2009.
Tabela 4 Análise de 95 glândulas mamárias infectadas com S. aureus quanto à frequência de ocorrência das diferentes linhagens LA, LE, LI e outras (LB, LD, LF, LJ e LL). São Paulo e Pernambuco. 2009.
Tabela 5 CCS no leite de 95 glândulas mamárias infectadas com S.aureus pertencentes às linhagens LA, LE, LI e outras (LB, LD, LF, LJ e LL) em rebanhos de São Paulo e Pernambuco. 2009.
Tabela 6 CCS de amostras de leite de glândulas mamárias infectadas por S. aureus da linhagem E procedentes de rebanhos bovinos leiteiros de São Paulo e de Pernambuco. 2009.
Tabela 7 Análise de CCS de amostras de leite procedentes de glândulas mamárias infectadas com S. aureus pertencentes aos perfis genéticos E1 (São Paulo) e E10 (Pernambuco). 2009.
Tabela 8 Perfil quantitativo e classificação quanto à produção in vitro de biofilme glicose-induzido das linhagens de S. aureus isoladas a partir do leite de bovinos procedentes dos estados de São Paulo e Pernambuco. 2009.
pág. 52 pág. 53 pág. 56 pág. 58 pág. 59 pág. 64 pág. 65 pág. 82
Tabela 9 Comparação entre as capacidades de produção in vitro de filme biológico de linhagens de S. aureus isoladas do leite de glândulas mamárias bovinas procedentes de rebanhos de São Paulo e Pernambuco. 2009.
pág. 85
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Distribuição de linhagens e perfis genéticos obtidos utilizando a técnica de PFGE em 55 amostras de S. aureus isoladas a partir de diversas origens em quatro fazendas do estado de São Paulo. 2009.
Quadro 2 Distribuição de linhagens e perfis genéticos utilizando a técnica de PFGE em 52 amostras de S. aureus isoladas a partir de diversas origens em quatro fazendas do estado de Pernambuco. 2009.
Quadro 3 Portadores de S. aureus em rebanhos leiteiros de São Paulo e Pernambuco em relação aos perfis genéticos de PGFE detectados, intervalo de tempo de persistência do mesmo perfil no quarto mamário e número vezes em que foi isolado. 2009.
Quadro 4 Perfis de PCR e PCR-RFLP do gene coa obtidos a partir da genotipagem de 96 amostras de S. aureus isoladas de diversas origens. 2009.
Quadro 5 Relação entre linhagens de PFGE, perfis de PCR do gene coa, PCR-RFLP do gene coa e PCR do gene spa em 96 amostras de S. aureus. 2009.
pág. 61 pág. 62 pág. 71 pág. 74 pág. 79
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATCC American Type Culture Collection
Bap proteína de superfície envolvida na formação do biofilme
BMB Laboratório de Biologia Molecular Bacteriana - Instituto de
Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de
Janeiro
CCS contagem de células somáticas
CLMS microscopia de varredura confocal a laser
CMT California Mastitis Test
coa gene que codifica a produção da enzima coagulase
DO densidade óptica
ELISA Enzyme linked immuno sorbent assay
Fnbp A-B proteínas de ligação à fibronectina
icaA gene presente no operon icaADBC
icaADBC operon que codifica proteínas envolvidas na síntese do polissacarídeo
constituinte do biofilme
icaB gene presente no operon icaADBC
icaC gene presente no operon icaADBC
icaD gene presente no operon icaADBC
Ig imunoglobulina
kDa quilodalton
MLEE análise do perfil eletroforético de isoenzimas
MLST análise de seqüências de regiões de genes de isoenzimas
MSCRAMM componentes da superfície microbiana que reconhecem as moléculas
adesivas da matriz
NaCl cloreto de sódio
PCR reação em cadeia da polimerase
PFGE eletroforese em gel de campo pulsado
pH potencial hidrogeniônico
PIA adesina polissacarídica intercelular
PNSG poli-N-sucinil β-1,6 glucosamina
PS/A antígeno capsular denominado polissacarídeo/adesina
RAPD tipagem pelo polimorfismo do DNA amplificado aleatoriamente
RFLP polimorfismo de comprimento dos fragmentos de restrição
SasG proteína G de superfície de S. aureus
spa gene que codifica a região Xr da proteína A
TSA Tryptic Soy Agar
TSB Tryptic Soy Broth
TSST-1 toxina-1 da síndrome do choque tóxico
UPGMA unweighted pair group method using arithmetic averages, utilizado para
geração de um dendrograma
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA 25 2 OBJETIVOS 39
3 MATERIAL E MÉTODOS 41 3.1 Amostragem do rebanho 41 3.2 Diagnóstico clínico da mastite e colheita do material biológico 41
3.3 Contagem eletrônica de células somáticas 42 3.4 Lactocultura e cultura dos suabes 42 3.5 Caracterização bioquímica dos isolados de Staphylococcus spp 43 3.6 Eletroforese em Gel de Campo Pulsado 43
3.6.1 Análise do DNA cromossômico utilizando PFGE 43 3.6.2 Digestão do DNA cromossômico pela enzima de restrição SmaI 44 3.6.3 Eletroforese de campo pulsado 45 3.6.4 Análise e interpretação dos resultados da PFGE 46
3.7 Teste de formação de biofilme in vitro induzido por glicose 46 3.8 Extração do DNA genômico para os ensaios baseados em PCR 48 3.9 Ensaio de PCR para a amplificação do gene icaA 48 3.10 PCR-RFLP do gene da coagulase 49
3.11 Ensaio de PCR para pesquisa do gene que codifica a região 50 X da proteína A
3.12 Determinação do índice numérico de discriminação (D) 51 3.13 Análises estatísticas 51
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 52 4.1 Isolamento de S. aureus, ocorrência da mastite e do 52
estágio de portador por propriedade leiteira 4.2 Genotipagem de isolados de S. aureus utilizando a 54
técnica de PFGE
pág.
4.3 Genotipagem de amostras de S. aureus isoladas 73
utilizando as técnicas de PCR do gene coa, PCR-RFLP do gene coa e PCR do gene spa
4.4 Teste de formação in vitro de biofilme glicose- 79 induzido sob condições estáticas
4.5 Ensaio de PCR para a pesquisa de gene icaA 92 relacionado à produção de biofilme em S. aureus
5 CONCLUSÕES 96
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 99 ANEXO 121
25
1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA
A mastite é considerada a principal enfermidade dos animais destinados à
produção leiteira, por sua elevada freqüência, pelos aspectos econômicos a ela
relacionados - tanto pela diminuição da produção quanto pelo menor rendimento dos
derivados lácteos para a indústria de laticínios - e pelos aspectos associados à
Saúde Pública, uma vez que o leite pode veicular microrganismos patogênicos,
toxinas e resíduos de antimicrobianos (Langoni, 2007).
Essa afecção é uma reação inflamatória da glândula mamária de etiologia
infecciosa, traumática, metabólica, fisiológica, alérgica ou psicológica. Entretanto, a
mastite infecciosa é considerada a mais importante, por não ser autolimitante e por
poder eventualmente evoluir para um quadro de septicemia (Costa, 2003).
Para estabelecer uma infecção, o agente etiológico deve ultrapassar a porção
terminal do teto, pois a integridade do teto é a primeira linha de defesa (Nickerson,
1993). Após a penetração, o microrganismo se multiplica no canal galactóforo e
atinge a cisterna do teto, onde se multiplica ativamente e se distribui pelo
parênquima mamário (Langoni, 2007). A segunda linha de defesa é o sistema
imunológico que inclui leucócitos nos ductos do teto e na glândula (White et al.,
1980; Harmon e Heald, 1982). Observa-se imediatamente grande aporte de
leucócitos polimorfonucleares, particularmente neutrófilos, como resposta do sistema
imune. O processo inflamatório intensifica e se observa leve alcalinização da
secreção láctea em virtude do extravasamento de líquido celular e íons, a exemplo
de carbonato de sódio e cloretos. Ocorrem então, em virtude da grande
multiplicação bacteriana: acidificação do leite, produção de toxinas, danos teciduais
e presença de secreção purulenta e sangue no leite (Langoni, 2007).
As alterações provocadas pela mastite no tecido mamário não se refletem
somente na produção do leite, mas também nas características físico-químicas, com
alteração de seus componentes principais. A mastite interfere na composição do
leite pela ação de lipases leucocitárias e, em decorrência, a concentração de
gordura no leite proveniente de quartos mamários com elevada contagem de células
somáticas (CCS) tende a diminuir (Harmon, 1994; Brito e Dias, 1998). De modo
geral, o teor de gordura no leite pode variar de 2,2% a 4,0%, percentual fortemente
26
influenciado pela genética do animal e fatores ambientais. Em animais com mastite,
porém, estes valores sofrem decréscimo de 10% (Costa et al., 2006). Recentemente,
vários autores também verificaram que as concentrações de caseína, lactose e
sólidos totais apresentam relação inversamente proporcional à CCS no leite (Bueno
et al., 2005; Costa et al., 2006).
Paralelamente, ocorrem alterações na contagem de células somáticas que
variam em função da etiologia e da virulência do agente etiológico envolvido no
processo infeccioso (Radostits et al., 2002). As células somáticas compreeendem a
maioria das células do sistema imune da glândula mamária, na proporção de 80%
nos quartos mamários hígidos e 99% nos quartos com mastite. Tais células são
constituintes do mecanismo de defesa natural e incluem linfócitos, macrófagos,
leucócitos polimorfonucleares e algumas células epiteliais (Sordillo et al., 1997; Pillai
et al., 2001; Schukken et al., 2003).
Clinicamente, as mastites podem ser classificadas como clínicas quando
apresentam alterações macroscópicas no leite e/ou no úbere. A severidade da
mastite clínica pode variar desde uma manifestação clínica subaguda até uma
mastite clínica superaguda, na qual ocorre sintomatologia sistêmica, com elevação
da temperatura corporal, desidratação, inapetência, sendo possível, em alguns
casos resultar em óbito (Chafer, 2006). De sintomatologia não tão evidente, a
mastite subclínica se caracteriza pela diminuição da produção leiteira, sem que
sejam observados sinais visíveis do processo inflamatório na glândula mamária ou
no leite (Costa, 2002).
O diagnóstico da mastite clínica é realizado a partir do exame criterioso da
glândula mamária e da observação de alterações macroscópicas nos primeiros jatos
de leite, utilizando-se a caneca de fundo negro ou prova de Tamis. A mastite
subclínica, por sua vez, pode ser diagnosticada pelo California Mastitis Test (CMT) e
pela CCS (Langoni, 2007).
O CMT é capaz de detectar a ocorrência de mastite subclínica pela elevação
do número de células somáticas na secreção láctea, particularmente leucócitos
polimorfonucleares. De cada quarto mamário coleta-se alíquota de 2 mL de leite e
adiciona-se igual volume do detergente aniônico (alquil-lauril sulfato de sódio +
púrpura de bromocresol). Este reagente emulsifica os lipídios das membranas dos
leucócitos presentes no leite e libera o material genético (DNA) das células,
27
produzindo viscosidade proporcional ao número de células presentes no leite e
categorizada em diferentes escores, de acordo com a intensidade do processo
inflamatório (Radostits et al., 1994; Thiers et al., 1999).
Por sua vez, a CCS é um método moderno de diagnóstico da mastite,
internacionalmente aceito como critério de avaliação da sanidade da glândula
mamária (Middleton et al., 2002; Zecconi et al., 2005; Zecconi et al., 2006). A CCS
eletrônica é realizada por citometria de fluxo com auxílio de equipamentos como
Somacount IBC (Bentley Instruments Inc.) (Langoni, 2000).
As infecções intramamárias apresentam elevada freqüência nos rebanhos
leiteiros. Costa et al. (1995) avaliaram o nível de mastite clínica e subclínica em São
Paulo e em Minas Gerais na ordem de 17,45% e 71,56%, respectivamente. Em
Pernambuco, Mota et al. (1999) demonstraram que o índice de mastite subclínica
em alguns rebanhos leiteiros pode chegar até 80% dos quartos mamários, na
dependência do tipo de exploração leiteira. Recentemente, Pereira et al. (2007)
observaram índices de mastite subclínica em Minas Gerais que variaram de 18,63%
a 89,70%, com 54,83% dos rebanhos analisados apresentando taxas superiores a
50%, sendo que em 19,35% os índices foram superiores a 70%. Paralelamente,
Ribeiro et al. (2007) monitoraram unidades de produção leiteira no Rio Grande do
Sul e diagnosticaram mastite subclínica e clínica em, respectivamente, 31,17% e
1,22% dos quartos mamários avaliados.
Classicamente, os principais agentes etiológicos da mastite foram agrupados
quanto à origem e modo de transmissão em contagiosos ou ambientais. Os
patógenos considerados ambientais são mais precisamente descritos como
microrganismos oportunistas, ubiquitários, não adaptados à sobrevivência no interior
do hospedeiro e presentes no ar, cama (free stall, por exemplo), água e fezes. São
patógenos causadores de mastite ambiental: Streptococcus uberis, membros da
família Enterobacteriaceae - principalmente Escherichia coli, Klebsiella sp e Serratia
sp - Pseudomonas sp e outros microrganismos ubiquitários, a exemplo de fungos -
principalmente leveduras e algas aclorofiladas (Prototheca sp) (Bradley, 2002;
Costa, 2003).
Os patógenos contagiosos são microrganismos particularmente adaptados à
sobrevivência no hospedeiro, especialmente na glândula mamária. Eles são capazes
de estabelecer infecções subclínicas que se manifestam tipicamente pela elevação
28
na CCS dos quartos mamários infectados e são transmitidos principalmente durante
a ordenha (Bradley, 2002; Costa, 2003). Microrganismos do gênero Staphylococcus
estão entre os mais freqüentemente isolados em amostras de leite provenientes de
vacas com mastite contagiosa, sendo S. aureus espécie de elevada ocorrência
(Costa et al., 1986).
Staphylococcus aureus é um coco Gram-positivo, catalase negativa, produtor
de coagulase. O gênero Staphylococcus faz parte da família Staphylococcaceae que
inclui também os gêneros Gamella, Macrococcus e Salinococcus (Garrity, 2006).
Todas as espécies do gênero Staphylococcus são produtoras da enzima catalase e
se reproduzem por fissão binária em todos os planos espaciais. A divisão celular em
vários planos espaciais resulta num agrupamento de células bacterianas em
conformações que lembram cachos de uvas, característica especialmente evidente
em células cultivadas in vitro e observadas por microscopia óptica (Trabulsi et al.,
2004).
As espécies do gênero Staphylococcus são anaeróbias facultativas,
conseguem crescer em meios hipertônicos (em concentrações de até 15% de NaCl),
num variado espectro de pHs (de 4,2 a 9,3) e em temperaturas entre 7° C e 48,5 °C
(Le Loir et al., 2003). Quanto ao habitat, as espécies deste gênero encontram-se
amplamente distribuídas no ambiente e como microbiota autóctone de seres
humanos e animais (Kloos e Bannerman, 1999).
S. aureus é um microrganismo de grande importância clínica para humanos,
uma vez que é causa comum de diversos processos infecciosos que variam desde
infecções cutâneas crônicas relativamente benignas, até infecções humanas
potencialmente fatais. As infecções cutâneas incluem foliculite simples e impetigo,
assim como furúnculos e carbúnculos, que afetam o tecido subcutâneo e produzem
sintomas sistêmicos como febre. S. aureus é frequentemente isolado de feridas
cirúrgicas infectadas que podem representar focos para desenvolvimento de
infecções sistêmicas, assim como é a causa de broncopneumonias e pneumonias
nosocomiais, bacteremias, meningites e peritonites, entre outras afecções (Koneman
et al., 2001).
Algumas cepas de S. aureus produzem toxinas responsáveis por intoxicações
alimentares (algumas enterotoxinas), pela síndrome do choque tóxico (TSST-1 e
algumas enterotoxinas) e pela síndrome da pele escaldada (toxinas exfoliativas).
29
Resistência múltipla a agentes antimicrobianos tem sido observada entre isolados
desse microrganismo, principalmente entre aqueles responsáveis por infecções
nosocomiais (Salyers e Whitt, 2002). No Brasil já foram detectadas amostras de
Staphylococcus produtoras de enterotoxinas isoladas de casos de mastite bovina.
Brabes et al. (1999) avaliaram 87 isolados de casos de mastite procedentes de
propriedades leiteiras de São Paulo e Minas Gerais e identificaram 18% (16/87) dos
isolados como produtores de pelo menos uma enterotoxina, sendo S. aureus 10
(62,5%), S. sciuri 5 (31,25%) e S. chromogenes 1 (6,25%). Dentre estes 16 isolados
produtores de enterotoxina, 6 (37,5%) produziram mais que uma toxina
simultaneamente.
S. aureus também é um importante agente etiológico de infecções em animais
domésticos de companhia e de animais destinados à produção de alimentos
(Aarestrup et al., 2000; Zadoks et al., 2000). Esse microrganismo constitui-se no
agente bacteriano mais comumente isolado de casos de mastite bovina, sendo
apontado pela International Dairy Federation como patógeno principal (Langoni,
1999). No Brasil, estudo conduzido por Brito et al. (1999) em propriedades de
exploração leiteira do estado de Minas Gerais detectou S. aureus em 19,2% das
amostras de leite de quartos mamários de vacas em lactação. Rabello et al. (2003),
por sua vez, obtiveram o isolamento deste patógeno em 5,5% a 79,4% dos quartos
mamários avaliados no estado do Rio de Janeiro, dependendo da propriedade
analisada. Mais recentemente, estudo conduzido por Gomes et al. (2007) em 21.721
amostras de secreção láctea procedentes do estado do Rio Grande do Sul
identificou a presença de S. aureus em 29,2% dos isolados, enquanto que Hartman
et al. (2007) isolaram esse microrganismo em 11,8% dos casos de mastite
diagnosticados no estado de São Paulo.
A prevalência de mastite por S. aureus em rebanhos leiteiros ocorre devido à
sua alta infectividade associada a fatores de virulência que conferem ao
microrganismo a capacidade de se instalar no parênquima mamário, formar
microabscessos, resistir à fagocitose e sobreviver no interior de fagócitos,
restringindo, dessa forma, o acesso dos agentes antimicrobianos, mesmo quando
administrados em concentrações terapêuticas (Araújo e Andrioli, 1996).
A antibioticoterapia, por sua vez, visa auxiliar as defesas do hospedeiro
eliminando patógenos (Erskine et al., 1993). O sucesso terapêutico pode ser medido
30
tanto pela redução dos sintomas clínicos da mastite (cura clínica) quanto pela
eliminação do patógeno (cura microbiológica), porém a eficácia de um tratamento é
obtida quando se observa simultaneamente cura clínica e microbiológica (Costa,
2002).
A administração intramamária de antibióticos é o método mais
freqüentemente utilizado no tratamento da mastite bovina (Costa, 2002). O
tratamento imediato dos casos de mastite clínica e o tratamento no período seco dos
casos subclínicos estão entre as medidas mais frequentemente recomendadas no
controle das mastites. Adicionalmente, várias outras medidas devem ser levadas em
consideração quando da implementação de protocolos de controle da enfermidade,
como lavagem e secagem dos tetos antes da ordenha, manutenção regular dos
equipamentos de ordenha mecânica, antissepsia pós-ordenha, descarte das fêmeas
com infecção crônica e ordenha no final para as vacas infectadas (Philpot, 1984; Gill
et al., 1990; Morin, 1993; Degraves e Fetrow, 1993; Kirk et al., 1994; Costa et al.,
2003).
Na mastite contagiosa, a transmissão de S. aureus ocorre, principalmente,
durante a ordenha. A prevalência da mastite por esse patógeno se deve à sua
dispersão por várias vias de transmissão e fontes de infecção na propriedade
leiteira, como equipamentos de ordenha, ração animal, cama e materiais da baia,
pele bovina e humana, vacas cronicamente infectadas e glândulas mamárias de
portadoras assintomáticas, além de outros animais da fazenda (Costa et al., 1994;
Roberson et al., 1994, Zecconi e Piccinini, 1999; Radostits et al., 2002; Zadoks et al.,
2002).
As estratégias de controle das mastites baseiam-se em medidas preventivas,
tratamento imediato dos casos clínicos e tratamento no período seco de casos
subclínicos, sendo o portador um elemento que não é usualmente considerado
(Costa et al., 1992; Costa et al., 1994). O estágio de portador na mastite infecciosa é
caracterizado pela ocorrência de quartos mamários destituídos de sintomatologia,
embora estejam infectados, alberguem o microrganismo na glândula mamária e o
disseminem pelo leite. Esses quartos mamários não apresentam reações positivas
aos testes diagnósticos que detectam a presença do processo inflamatório (como
CMT, condutibilidade elétrica e CCS entre outros), porém mostram-se positivos aos
exames microbiológicos, caracterizando-se como uma fonte de infecção,
31
principalmente em relação aos agentes contagiosos como Staphylococcus spp
(Costa et al., 2001; Costa et al., 2005; Bispo et al., 2008; Santos et al., 2008a,b).
Protocolos de controle da mastite causada por S. aureus têm apresentado
sucesso relativamente limitado, provavelmente pelo conhecimento insuficiente sobre
os fatores de virulência relacionados ao processo de infecção e sobre a importância
das diferentes vias de transmissão, fontes de infecção, vetores e mecanismos de
dispersão (Struelens et al., 1992).
A maioria dos fatores de virulência de S. aureus não é requerida para o
crescimento e multiplicação do microrganismo e é frequentemente codificada por
elementos genéticos acessórios, tais como plasmídeos, profagos e ilhas de
patogenicidade (Kuroda et al., 2001). O carreamento por elementos genéticos
acessórios implica na distribuição de genes de virulência entre cepas de
Staphylococcus, causando uma distribuição não uniforme de determinantes
genéticos de virulência entre as cepas. Há várias linhagens de S. aureus que
apresentam combinações específicas de genes que conferem uma habilidade
significativamente aumentada de causar infecções (Booth et al., 2001). Dentre os diversos potenciais fatores de virulência descritos até o momento
para S. aureus, a produção de biofilme constitui um aspecto relativamente pouco
estudado em amostras procedentes de casos de mastite bovina. O biofilme consiste
em comunidades de células bacterianas envolvidas por uma matriz polissacarídica
produzida pelas bactérias que permanecem aderentes a superfícies inertes ou vivas.
A formação do biofilme parece ocorrer em duas etapas: adesão da bactéria a uma
superfície e adesão intercelular, formando múltiplas camadas de células bacterianas
(Götz, 2002).
Dois importantes componentes de superfície têm sido implicados na formação
do biofilme por S. aureus. Um destes componentes depende da presença do operon
icaADBC, que codifica proteínas envolvidas na síntese do polissacarídeo de matriz
poli-N-sucinil β-1,6 glucosamina (PNSG). Este polissacarídeo está envolvido na
ligação entre as células bacterianas. Proteínas também estão envolvidas na
formação de biofilme em S. aureus (O�Neil et al., 2007). Dentre estas proteínas, a
Bap foi associada à formação de filme biológico em amostras de S. aureus isoladas
de mastite bovina. Tal proteína parece promover a ligação primária às superfícies.
Outras proteínas que, como a Bap, pertencem ao grupo, as chamadas MSCRAMMs
32
(componentes da superfície microbiana que reconhecem as moléculas adesivas da
matriz) também têm sido associadas à formação do biofilme em S. aureus de origem
humana (O�Neil et al., 2007). Dentre tais proteínas podemos citar as proteínas de
ligação à fibronectina de S. aureus (FnbpA e B) (O�Neil et al., 2008), a proteína G de
superfície de S. aureus (SasG) (Corrigan et al., 2007) e a proteína A (Merino et al.,
2008).
Há um consenso de que o biofilme contribua para a persistência bacteriana
em sítios infecciosos ou para infecções crônicas, pois dificulta a ação dos
mecanismos de defesa do hospedeiro e dos agentes antimicrobianos. Além disso, o
biofilme confere maior capacidade de ligação dos microrganismos às diferentes
superfícies, a exemplo de biomateriais utilizados em cirurgias, favorecendo o
desenvolvimento de determinadas infecções (Cramton et al., 1999; Cucarella et al.,
2001).
Em infecção experimental de glândulas mamárias de ovinos, amostras de S.
aureus foram capazes de produzir biofilme e apresentaram maior capacidade de
colonização quando comparadas a variantes não produtoras deste material (Baselga
et al., 1993). O papel do biofilme na aderência de amostras de S. aureus isoladas de
mastite bovina também foi observado em cultura de células, o que fornece
evidências de seu possível papel na colonização da glândula mamária. A adesão de
S. aureus ao epitélio glandular mamário é considerada a primeira etapa crítica na
patogênese da mastite (Aguilar et al., 2001; Vasudevan et al., 2003).
A maioria das cepas de S. aureus causadoras de mastite é circundada por
uma camada de biofilme que auxilia a colonização do microrganismo e sua
aderência ao epitélio da glândula mamária (Aguilar et al., 2001). A susceptibilidade
reduzida aos antibióticos em S. aureus isolados de mastite também foi associada à
formação de biofilme e atribuída à redução tanto da difusão dos antibióticos através
da matriz de biofilme como da atividade metabólica da bactéria dentro dessa matriz
(Amorena et al., 1999).
Foi sugerido inicialmente que a formação de biofilme ocorreria por um
processo mediado por um antígeno capsular denominado polissacarídeo/adesina
(PS/A), no qual o S. aureus inicialmente adere a uma superfície, multiplica-se e
forma uma multicamada de biofilme que é associada à produção de adesina
polissacarídica intercelular (PIA). O operon de adesão intercelular (icaADBC)
33
constituído pelos genes icaA, icaD, icaB e icaC, codifica as proteínas mediadoras da
síntese de PIA e PS/A (Cramton et al., 1999). Os genes icaA e icaD exercem
importante papel na formação do biofilme em S. aureus e Staphylococcus
epidermidis. O gene icaA codifica a N-acetilglicosaminiltransferase, enzima envolvida
na síntese de N-acetilglicosamina (Arciola et al., 2001a). Além disso, o gene icaD
influi consideravelmente na expressão máxima da N-acetilglicosaminiltransferase,
levando à expressão fenotípica do polissacarídeo capsular (Gerke et al., 1998).
Entretanto, biofilme independente do operon ica foi descrito em amostras de S.
aureus (O�Neil et al., 2007). A ação de proteases foi capaz de eliminar totalmente o
biofilme produzido em mutantes nocautes em ica, apontando assim um papel
essencial para as proteínas de superfície estafilocócica neste processo (O�Neil et al.,
2007; Coelho et al., 2008).
S. aureus produz vários potenciais fatores de virulência, inclusive proteínas de
superfície celular ancoradas na parede celular, com propriedades de ligação a
diferentes proteínas do hospedeiro. Dentre estas, a proteína A, uma molécula de
42 kDa que, apresentando-se sob as formas secretada e associada à membrana,
interage com ampla variedade de imunoglobulinas humanas e animais (El Sayed et
al., 2006)
As propriedades de ligação da proteína A à imunoglobulina G (IgG) decorrem
da presença de cinco (em algumas cepas, quatro) unidades repetidas (A-E), cada
uma com habilidade de mediar ligação à porção Fc de diferentes subclasses de IgG
de mamíferos (Navarre e Schneewind, 1999). Além disso, cada uma das unidades
repetidas apresenta afinidade pela porção Fab da IgG, que é responsável pelo
reconhecimento antigênico, de forma não antigênico-específica (Boyle, 1990).
A proteína A encontra-se ligada ao glicopeptídeo da parede celular e pode ser
liberada para o meio durante o crescimento. Essa proteína atua como fator de
virulência, interferindo na opsonização e na ingestão pelos leucócitos
polimorfonucleares, ativando o complemento e estimulando reações de
hipersensibilidade dos tipos imediato e tardio. A proteína A é imunogênica e nos
indivíduos com infecções graves causadas por S. aureus são formados anticorpos
dirigidos contra ela. A presença dessa proteína em S. aureus constitui a base das
provas de coaglutinação utilizadas em laboratórios clínicos para identificação de
34
microrganismos (a exemplo de gonococos) e detecção de antígenos bacterianos em
líquidos corpóreos (Koneman et al., 2001).
Estudos realizados por Peterson et al. (1977) e Gemmell et al. (1991)
indicaram que a expressão da proteína A na superfície bacteriana torna o
microrganismo menos susceptível à fagocitose na presença do soro humano,
possivelmente como resultado da propriedade de ligação da proteína A à porção Fc
da IgG. Entretanto, na presença de soro deficiente de IgG, a expressão da proteína
A apresentou efeito oposto, pois aumentou a susceptibilidade da bactéria à
fagocitose (Peterson et al., 1977).
O efeito da proteína A sobre o complemento foi investigada em vários estudos
(Spika et al., 1981; Kozlowski et al., 1996). Kozlowski et al. (1996) mostraram que a
propriedade de ligação da proteína A à porção Fab da IgG medeia a ativação do
sistema complemento pela via clássica, permitindo uma possível explicação para a
observação realizada por Peterson et al. (1977), o qual havia sugerido que o
aumento da susceptibilidade à fagocitose por S. aureus que expressa a proteína A
em meio deficiente de IgG poderia resultar da interação entre a proteína A e a IgM.
Vários estudos relataram que a proteína A ativa linfócitos B (Forsgren et al.,
1976; Lipsky, 1990). A proteína A ligada à parede celular induziu sozinha a ativação
dos linfócitos B, enquanto a proteína A solúvel foi inativa neste aspecto ou
necessitou do auxílio de linfócitos T (Lipsky, 1990; Schuurman et al., 1980). Além
disso, Ringden e Rynnel (1978), Schuurman et al. (1980) e Romagnani et al. (1984)
observaram que a proteína A solúvel aumentou a atividade mitogênica dos linfócitos
T, embora esta propriedade tenha sido atribuída por outros pesquisadores à
contaminação da proteína A solúvel disponibilizada comercialmente com
enterotoxinas estafilocócicas (Schrezenmeier e Fleischer, 1987; Das e Langone,
1989).
A tipagem epidemiológica utilizando a proteína A constitui um método
baseado na diversidade do gene spa que codifica a região Xr da proteína A (Frénay
et al., 1994). Enquanto a porção N-terminal da proteína A encontra-se envolvida na
ligação com a porção Fc da IgG, o domínio C-terminal, associado à ligação com a
parede celular, contém a região Xr, constituída por sequências repetitivas em
tandem formadas por oito unidades de aminoácidos (Uhlén et al., 1984; Guss et al.,
1984). O número de unidades repetitivas na região Xr varia entre as amostras de S.
35
aureus, podendo ser determinado pela amplificação do DNA dessa região pela
técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) (Kobayashi et al., 1999).
A coagulase é um produto extracelular dos isolados de S. aureus que
apresenta a propriedade de coagular o plasma de diferentes espécies. Esta
característica constitui o principal critério utilizado pelos laboratórios de microbiologia
clínica na identificação de S. aureus isolados de infecções (Goh et al., 1992).
A coagulase se liga à protrombina formando um complexo denominado
estafilotrombina, que pode clivar o fibrinogênio, potencializando a formação do
coágulo. Nenhuma atividade enzimática foi associada à coagulase, sendo a ligação
à protrombina suficiente para a expressão da clivagem do fibrinogênio (Hempker et
al., 1975). A coagulase também pode se ligar ao fibrinogênio e, em virtude desta
propriedade, sugeriu-se que esta atividade era responsável pela agregação de S.
aureus ao plasma (Jeljaszewicz et al., 1983). Entretanto, estudos moleculares
indicaram que a coagulase não é um fator de agregação. Ambas as propriedades de
ligação da coagulase são localizadas em dois sítios distintos da proteína. A região
N-terminal contém o sítio de ligação à protrombina e a região C-terminal apresenta o
sitio de ligação ao fibrinogênio (McDevitt et al., 1992).
Várias formas sorológicas da coagulase baseadas na neutralização cruzada
da atividade de coagulação foram descritas. As sequências de DNA de três
sorotipos foram determinadas (Kaida et al., 1987; Kaida et al., 1989; Phonimdaeng
et al., 1990) e a análise da sequência do gene coa mostrou que a região N-terminal
apresentou-se variável (aproximadamente 50% de identidade entre as três
sequências) e que houve uma região central altamente conservada (identidade
superior a 90%). A região C-terminal mostrou-se composta de repetições em tandem
de 27 aminoácidos e cada uma das sequências publicadas apresentou número
diferente de repetições. A amplificação das repetições, seguida pela digestão com a
endonuclease de restrição AluI, produziu padrões de bandas, indicando que este
achado poderia ser utilizado para diferenciar isolados (Goh et al., 1992; Hookey et
al., 1998; Schwartzkopf et al., 1994).
Desde então, esta característica tem sido utilizada para subtipar S. aureus de
origem humana e bovina. O método da tipagem pelo gene da coagulase (coa)
mostrou-se simples, específico, reprodutível, de fácil interpretação e discriminatório
36
(Goh et al., 1992; Annemüller et al., 1999; Lange et al., 1999; Raimundo et al., 1999;
Shopsin et al., 2000; Schlegelova et al., 2003; Guler et al., 2005; Saei et al., 2009).
Sob o ponto de vista epidemiológico, é importante determinar a origem dos
microrganismos envolvidos na etiologia da doença e, em virtude da existência de
diversos clones de S. aureus, os isolados devem ser tipados a fim de se estabelecer
fontes e rotas de distribuição do patógeno na população (Struelens et al., 1992).
O objetivo dos estudos de genotipagem é fornecer evidências laboratoriais de
que agentes etiológicos epidemiologicamente relacionados, ou seja, coletados
durante um período determinado de tempo e em uma área geográfica específica,
também seriam geneticamente relacionados e, assim, representariam uma mesma
cepa que se disseminou (Tenover et al., 1995). Em relação à mastite bovina, a
caracterização da diversidade genética dos S. aureus isolados de rebanhos leiteiros
é fundamental para uma melhor compreensão do padrão de dispersão do patógeno.
Tais informações poderão auxiliar na elaboração de estratégias mais eficientes que
visem à redução dos casos de infecção, uma vez que a partir dos perfis moleculares
é possível inferir relações genéticas existentes entre os diferentes clones, detectar o
fluxo gênico e traçar rotas de dispersão da infecção no rebanho (Kapur et al., 1995).
O cromossomo se constitui no componente fundamental da identidade celular
e, portanto, representa item indispensável à análise de relações genéticas entre
isolados. Uma abordagem frequentemente utilizada para esta finalidade tem sido a
digestão do DNA cromossomal com enzimas de restrição, a qual resulta em uma
série de fragmentos de diversos tamanhos que forma diferentes padrões quando
analisados por eletroforese em gel de agarose. Diferenças nesses padrões são
denominadas de polimorfismos de comprimento dos fragmentos de restrição
(RFLPs) (Singh et al., 2006).
As enzimas utilizadas para clivar frequentemente o DNA reconhecem vários
sítios presentes no cromossomo bacteriano, resultando em vários fragmentos de
bandas. Recentemente, enzimas de restrição que clivam o cromossomo menos
frequentemente têm sido utilizadas. Os fragmentos de DNA resultantes são
excessivamente grandes para serem separados por eletroforese convencional e, em
virtude deste aspecto, métodos alternativos denominados de eletroforese em gel de
campo pulsado (PFGE) têm sido empregados para superar este obstáculo (Schwartz
37
et al., 1983; Schwartz e Cantor, 1984; Carle et al., 1986; Sambrook et al., 1989;
Finney, 1993; Ausubel et al., 1994; Chang e Chui, 1998).
Métodos moleculares estão sendo desenvolvidos e têm sido utilizados na
identificação e comparação de S. aureus em estudos epidemiológicos (Gürtler e
Barrie, 1995; Hookey et al., 1998; Lange et al., 1999; Su et al., 1999; van Leeuwen
et al., 1999; Pereira et al., 2002; Zadoks et al., 2002). Dentre esses métodos, a
análise de macrorrestrição do DNA cromossômico e separação dos fragmentos pela
técnica de PFGE é, por sua vez, a ferramenta de tipagem de maior poder
discriminatório para S. aureus e um bom método para se estabelecerem relações
clonais em estudos epidemiológico-moleculares (Tenover et al., 1995; Zadoks et al.,
2002; Sommerhäuser et al., 2003). A sensibilidade do método de PFGE é tão
elevada que simples mutações ou rearranjos podem ser muitas vezes detectados
(Hall, 1994).
Na PFGE, padrões de restrição de genomas bacterianos completos são
analisados e comparados. O cromossomo bacteriano é digerido por uma
endonuclease de restrição de corte raro, com o objetivo de produzir um número
moderado de fragmentos de DNA. Para proteger o DNA bacteriano de danos
mecânicos, os microrganismos são imobilizados pela mistura da suspensão
bacteriana em agarose fundida antes da lise celular. Os blocos contendo DNA
purificado e digerido são inseridos em géis de agarose e os fragmentos de DNA
separados por eletroforese em campo pulsado, no qual a orientação do campo
elétrico sofre alternância (Lukinmaa et al., 2004). Na eletroforese convencional,
moléculas de DNA com tamanho superior a 40-50 kb não migram eficientemente em
géis de agarose. Através da mudança periódica da direção do campo elétrico no
qual o DNA é separado, a PFGE permite a separação de fragmentos superiores a
1000 kbp de comprimento (Singh et al., 2006).
Para interpretar os padrões de restrição gerados pela PFGE e transformá-los
em informação epidemiologicamente útil, o microbiologista deve compreender como
comparar padrões e como eventos genéticos aleatórios podem alterá-los (Singh et
al., 2006). Critérios propostos por Tenover et al. (1995) têm sido frequentemente
utilizados na interpretação de padrões de restrição gerados pela PFGE, a fim de
determinar relações genéticas entre isolados. De acordo com estas diretrizes,
isolados que apresentam o mesmo perfil de PFGE são considerados indistinguíveis.
38
Isolados que sofreram um único evento genético apresentam de uma a três bandas
de diferença e são considerados provavelmente relacionados. Isolados que diferem
por quatro a seis bandas (geradas por dois eventos genéticos independentes) são
considerados possivelmente relacionados. Por fim, consideram-se não relacionados
aqueles que diferem em mais de seis bandas.
Faz-se necessário destacar que tais critérios são aplicáveis apenas à análise
de um pequeno conjunto de isolados obtidos em estudos epidemiológicos de surtos
nosocomiais ou em comunidades, durante um período relativamente curto de tempo
(um a três meses) (Tenover et al., 1995), onde presumivelmente, a variabilidade
genética é limitada (Olive e Bean, 1999). Estes critérios não são aplicáveis ao
estudo de grandes coleções bacterianas de microrganismos coletados em períodos
superiores a um ano (Tenover et al., 1995).
Frequentemente, análises de padrões de PFGE são efetuadas utilizando-se
softwares como BioNumerics. Rementeria et al. (2001) compararam resultados de
três softwares com a análise visual e observaram que cada método produziu
resultados aceitáveis. Enquanto a análise visual de um pequeno número de perfis
genotípicos pode ser realizada, os softwares apresentam capacidade de
normalização dos perfis obtidos em diferentes géis e de estocagem dos dados em
bancos de dados, permitindo comparação de vários perfis no decorrer do tempo. A
maioria dos programas de análise também contém algoritmos que permitem realizar
análises filogenéticas, proporcionando a detecção da evolução da amostra analisada
e das relações ancestrais entre os isolados (Dice, 1945; Fitch e Margoliash, 1967;
Backeljau et al., 1996; Jorgensen et al., 1996). Geralmente, amostras são
consideradas idênticas se mostrarem 100% de similaridade e são consideradas
clonalmente relacionadas se apresentarem similaridade superior a 80%. O
dendrograma ilustra relações filogenéticas e proporciona uma representação visual
de linhagens, similaridades e diferenças genéticas entre grupos (Singh et al., 2006).
39
2 OBJETIVOS
Geral:
Realizar estudo epidemiológico e de alguns fatores de virulência de
Staphylococcus aureus associados à mastite bovina utilizando ferramentas
moleculares.
Específicos:
- Isolar e caracterizar bioquimicamente S. aureus do leite de glândulas
mamparias, pele do úbere, equipamento de ordenha mecânica, mãos e cavidade
nasal de ordenhadores;
- Estimar a ocorrência dos processos inflamatórios da glândula mamária de
natureza clínica e subclínica causados por S. aureus;
- Avaliar a ocorrência de quartos mamários portadores assintomáticos de S.
aureus;
- Subtipar isolados de S. aureus utilizando as técnicas de Eletroforese em Gel
de Campo Pulsado e PCR de genes que codificam fatores de virulência (coagulase
e proteína A);
- Avaliar a correlação entre linhagens e perfis de PFGE dos isolados de S.
aureus com a intensidade do processo inflamatório aferida pela CCS;
- Estudar a distribuição dos perfis genéticos de S. aureus dentro e entre
rebanhos avaliados em São Paulo e Pernambuco a partir da genotipagem obtida
pela PFGE;
40
- Verificar a relação genética entre S. aureus isolados do leite de glândulas
mamárias, pele do úbere, insufladores do equipamento de ordenha mecânica, mãos
e fossas nasais de ordenhadores;
- Caracterizar o estágio de portador assintomático de S. aureus utilizando a
técnica de PFGE;
- Analisar a correlação entre a habilidade de produção de biofilme e a resposta
inflamatória aferida pela CCS em quartos mamários infectados por diferentes
linhagens de S. aureus;
- Verificar a presença do gene icaA envolvido na formação de biofilme e a
habilidade de produção de filme biológico glicose-induzido in vitro nos isolados de S.
aureus.
41
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Amostragem do rebanho
Foram analisadas sete fazendas de exploração leiteira localizadas no estado
de Pernambuco (designadas de 1 a 7) e quatro localizadas no estado de São Paulo
(designadas A, B, F e P).
3.2 Diagnóstico clínico da mastite e colheita do material biológico
Foram examinadas 525 fêmeas em lactação, num período de dois anos,
perfazendo um total de 2060 quartos mamários funcionais submetidos aos testes de
Tamis para diagnóstico de mastite clínica e ao CMT, segundo Schalm e Noorlander
(1957), para o diagnóstico da mastite subclínica. Após a triagem, com teste de
Tamis, os animais foram submetidos ao exame clínico da glândula mamária pela
inspeção e palpação, segundo Rosemberger (1991).
As amostras de secreção láctea foram colhidas dos quartos mamários de
todos os animais submetidos aos testes de triagem (teste de Tamis e CMT), no
volume de 10 mL, em frascos com tampa rosqueável, esterilizados e previamente
identificados com o número do animal e do quarto mamário, após limpeza do úbere,
secagem com papel toalha e anti-sepsia do óstio do teto com álcool 70ºGL.
Paralelamente, nas fazendas de São Paulo e Pernambuco também foram colhidas e
enviadas, respectivamente, à Clínica do Leite da Escola Superior de Agricultura Luiz
de Queiroz (ESALQ/USP) e ao Laboratório do Leite do Programa de Gerenciamento
de Rebanhos Leiteiros do Nordeste (UFRPE), amostras individuais de 25 mL de leite
de todos os quartos mamários para realização da CCS.
Para a detecção e acompanhamento do estágio de portador assintomático, os
quartos mamários negativos às provas de triagem, porém positivos ao isolamento de
S. aureus ao primeiro exame microbiológico, foram submetidos diariamente ao
42
exame clínico da glândula mamária, provas de triagem, coleta da secreção láctea
para exame microbiológico e CCS durante 16 dias.
Materiais dos conjuntos de ordenhadeiras mecânicas (insufladores), pele do
úbere, mãos e fossas nasais de ordenhadores foram colhidos individualmente em
suabes estéreis e inoculados em meio de Stuart Copan (Copan Italia S.A., Brescia,
Brescia, Itália). Todo o material biológico foi transportado sob refrigeração em caixas
isotérmicas para análise microbiológica.
3.3 Contagem eletrônica de células somáticas
A CCS foi realizada por citometria de fluxo em equipamento Somacount IBC
Bentley (Bentley Instruments Inc., Chaska, Minnesota, EUA).
3.4 Lactocultura e cultura dos suabes
Alíquotas de 10 µL de leite foram semeadas em placas de ágar Columbia
Difco (Difco, Sparks, Maryland, EUA) acrescido de sangue desfibrinado de carneiro
5% (v/v), incubadas em aerobiose em estufa bacteriológica a 37 ºC e analisadas
após 24 e 48 h.
Os suabes dos conjuntos de ordenhadeiras mecânicas, pele do úbere bovino,
fossas nasais e pele das mãos de ordenhadores foram cultivados nos meios
seletivos Baird-Parker Agar e Mannitol Salt Agar Merck (Merck S. A., Darmstadt,
Darmstadt, Alemanha).
Após a incubação em aerobiose em estufa bacteriológica a 37 ºC por 24 e 48
horas, foram registradas as características de crescimento das colônias em ágar
sangue, como produção de hemólise e pigmento, tipo de desenvolvimento e
pigmentação das colônias nos meios seletivos, observando-se também os
caracteres morfotintoriais utilizando a técnica de coloração de Gram.
43
3.5 Caracterização bioquímica dos isolados de Staphylococcus spp
A caracterização fenotípica foi realizada utilizando-se as provas da produção
de coagulase livre Laborclin (Laborclin Produtos para Laboratórios LTDA., Pinhais,
Paraná, Brasil), acetoína (VP) (Merck) e fermentação dos carboidratos: maltose,
frutose, sacarose, lactose, manitol, manose, rafinose, trealose, celobiose, xilose e
arabinose Vetec (Vetec Química Fina Ltda., Rio de Janeiro, Brasil). As técnicas de
identificação foram realizadas de acordo com Murray et al. (1999) e as amostras
foram classificadas segundo o Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Krieg e
Holt, 1994).
3.6 Eletroforese em Gel de Campo Pulsado 3.6.1 Análise do DNA cromossômico utilizando PFGE
A análise do DNA cromossômico foi realizada por meio da técnica de PFGE
descrita por Pfaller et al. (1993).
Amostras de S. aureus isoladas de glândulas mamárias portadoras
assintomáticas, casos de mastite clínica ou subclínica, pele do úbere, equipamento
de ordenha mecânica e fossas nasais de ordenhadores foram semeadas em Ágar
Columbia (Difco) acrescido de 5% (v/v) de sangue desfibrinado de carneiro e
incubadas em estufa bacteriológica durante 24 h a 37 °C. Após esse período, uma
única colônia isolada foi repicada em tubos estéreis com tampa rosqueável contendo
10 mL de Tryptic Soy Broth (Difco) e incubados durante 18 h a 37°C sob agitação
orbital de 180 rpm. Em seguida, os tubos foram centrifugados a 4000 rpm durante 5
min e o sobrenadante descartado. O sedimento foi lavado três vezes (3x) com
solução salina 0,9% (p/v) sob as mesmas condições descritas anteriormente e, após
a segunda lavagem, a suspensão foi transferida para um tubo de centrífuga
44
previamente pesado. A suspensão foi novamente centrifugada a 6500 rpm por 60 s
e todo sobrenadante foi retirado com auxílio de uma pipeta.
O sedimento foi pesado e ressuspendido em 50 mM de EDTA (pH 8,0) na
concentração final de 1 mg/µL. Desta suspensão, 10 µL foram transferidos para um
tubo de microcentrífuga com 400 µL de tampão EC previamente aquecido a 50 °C,
adicionados de 450 µL de agarose Low Melting Sigma (Sigma-Aldrich Inc., Saint
Louis, Missouri, EUA) 2% (p/v) e 20 µL de lisostafina (1 mg/mL) (Sigma-Aldrich),
previamente aquecidos. Esta mistura foi rapidamente transferida para os moldes de
preparação dos blocos de agarose, que foram mantidos sob refrigeração a 5 °C
durante 30 minutos. Em seguida os blocos foram transferidos para uma placa de
microdiluição contendo 2 mL de tampão EC e incubados por 7 horas a 37 °C. Após a
incubação, os blocos foram lavados 3x com 2 mL de tampão CHEF TE e, a seguir,
novamente incubados por 12 h em 2 mL de tampão ES adicionados de 100 µL de
Proteinase K na concentração de 20 mg/mL Promega (Promega Corporation,
Madison, Wisconsin, EUA). Em seguida, os blocos foram lavados 5x com 2 mL de
tampão CHEF TE, com intervalos de 1 h entre as lavagens e armazenados nesta
solução até serem submetidos à digestão enzimática e eletroforese. Em virtude de
contaminação, foram excluídos desse experimento os quatro isolados de S. aureus
procedentes das fazendas 1, 5 e 7 do estado de Pernambuco. A cepa S. aureus
ATCC 6538 foi utilizada como controle da PFGE.
3.6.2 Digestão do DNA cromossômico pela enzima de restrição SmaI
Para o tratamento com a enzima de restrição, metade de um bloco de
agarose de cada amostra foi transferida para um novo recipiente contendo 300 µL
de tampão DNS. O tampão foi substituído e os blocos incubados durante 1 hora à
temperatura ambiente. Esse processo foi repetido 4x. Após este período, o tampão
DNS foi substituído por 200 µL do tampão da enzima de restrição previamente
diluídos e os blocos incubados por 1 h à temperatura ambiente. Em seguida o
tampão foi descartado e novamente adicionaram-se 200 µL de tampão acrescido de
40 U da enzima SmaI Fermentas (Fermentas International Inc., Burlington, Ontario,
45
Canadá). Os blocos foram então incubados durante 12 h a 30 °C. Quando não
utilizados imediatamente, os blocos foram conservados sob refrigeração a 5 °C após
bloqueio da reação pela adição de 200 µL de tampão TBE 1x.
3.6.3 Eletroforese de campo pulsado
Os blocos de agarose contendo os fragmentos de DNA da bactéria foram
colocados nas canaletas do gel e fixados com agarose previamente fundida (1% de
agarose em 120 mL de TBE 0,5x). Em seguida o gel de corrida foi adicionado ao
sistema e a corrida de eletroforese foi programada e executada utilizando o
equipamento CHEF DR III Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, Califórnia,
EUA). Como marcador de peso molecular foi utilizado o Lambda Ladder PFG Marker
New England BioLabs (New England BioLabs Inc., Ipswich, Massachusetts, EUA).
Para obter-se maior separação dos fragmentos de DNA e permitir-se melhor
visualização dos resultados ao compararem-se diversos padrões eletroforéticos, a
duração do tempo de pulso foi aumentada gradativamente durante a corrida �switch
time ramping�. A eletroforese foi realizada com intervalos de tempo de pulso de 1 a
30 segundos, que em geral permite a melhor separação dos fragmentos de DNA
cromossômico de S. aureus quando este é clivado com SmaI. A apresentação do
programa de eletroforese empregado encontra-se abaixo:
Eletroforese
Bloco 1 (Tempo de corrida de 12 horas)
Voltagem de 6,0 volts/cm;
Ângulo de 120°;
Tempo de pulso inicial de 1 segundo e final de 5 segundos;
Temperatura de 14 °C.
46
Bloco 2 (Tempo de corrida de 12 horas)
Voltagem de 6,0 volts/cm;
Ângulo de 120°;
Tempo de pulso inicial de 15 segundos e final de 30 segundos;
Temperatura de 14 °C.
3.6.4 Análise e interpretação dos resultados da PFGE
Padrões de restrição que não apresentaram banda alguma de diferença foram
considerados como mesmo padrão; padrões com até três bandas de diferença como
subtipos e aqueles com quatro ou mais diferenças como tipos diferentes (Tenover et
al., 1994). Cepas que não apresentaram diferença nos padrões de restrição e não
mais que três bandas de diferença foram agrupadas numa mesma linhagem de S.
aureus (Booth et al., 2001).
O grau de homologia entre as amostras tipadas foi determinado pelo
coeficiente de Dice (Dice, 1945) e a correlação dos agrupamentos foi calculada por
UPGMA. Para o agrupamento dos perfis genéticos e representação hierárquica das
ligações entre os isolados, o dendrograma foi construído com otimização e
tolerância de 1%, utilizando-se o software Bionumerics versão 5.0 Applied Maths
(Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Oost-Vlaanderen, Bélgica).
3.7 Teste de formação de biofilme in vitro induzido por glicose
Os experimentos para avaliação da formação de biofilme pelas amostras de
S. aureus foram conduzidos utilizando-se microplacas estéreis de poliestireno inerte,
de fundo chato, contendo 96 poços Nunc (Thermo Fisher Scientific, Roskilde,
Roskilde, Dinamarca). Este método foi utilizado por permitir triagem de um número
relativamente grande de amostras, conforme recomendado por Cassat et al. (2007).
47
Inicialmente, as amostras de S. aureus foram cultivadas em Tryptic Soy Agar
(Difco) a 37 °C durante 24 h. Para o preparo do inóculo foram repicadas
aproximadamente 3 colônias em 2 mL de TSB (Difco) suplementado com glicose,
para uma concentração final de 1,0% (TSB glicosado). A cultura foi incubada a 37 °C
sob agitação durante 18 h. Após este período, as culturas foram diluídas (1:100) em
TSB glicosado (Amaral et al., 2005).
Posteriormente, uma alíquota de 200 µL da cultura diluída foi aplicada em
cada poço da placa, a qual foi incubada a 37 °C por 20 horas. A densidade óptica
(DO) da cultura foi determinada a 540 ηm utilizando-se um leitor de ELISA
microplate reader Model 550 (Bio-Rad). Após a retirada do sobrenadante, foram
realizadas gentilmente duas lavagens com solução salina estéril (para remoção total
das células planctônicas) e posterior fixação do biofilme a 75 °C por 1 h.
Após este período, foram aplicados 200 µL de solução de cristal violeta para
coloração de Gram em cada poço da microplaca e, a seguir, realizadas duas
lavagens com água destilada estéril para retirada do excesso do corante. As placas
foram submetidas à secagem em forno a 65 °C, por aproximadamente 40 min, antes
da leitura da DO540 ηm do biofilme corado (Amaral et al., 2005). Em virtude de
contaminação, foram excluídas deste experimento as amostras de S. aureus
procedentes das fazendas 1, 5 e 7 do estado de Pernambuco. Como controles
positivo e negativo foram utilizadas, respectivamente, as cepas de S. epidermidis
BMB9393, fortemente produtora de biofilme, e Streptococcus pyogenes ATCC
75194, não produtora de biofilme.
O seguinte cálculo foi realizado para se estabelecer uma unidade de biofilme:
Para a classificação das amostras de S. aureus quanto à produção de
biofilme, os seguintes critérios foram utilizados: UB da amostra inferior a 2 vezes o
valor da UB do S. pyogenes, a amostra foi considerada não produtora de biofilme;
UB entre > 2 a 4 vezes o valor da UB do S. pyogenes, a amostra foi considerada
fracamente produtora; UB entre > 4 a 8 vezes, a amostra foi considerada
moderadamente produtora e, acima de 8 vezes, fortemente produtora. As amostras
de S. aureus consideradas não produtoras de biofilme ao primeiro teste foram
Unidade de biofilme (UB) = DO do biofilme
DO do crescimento
48
reavaliadas em outro ensaio completamente independente, cada um contendo duas
repetições para cada amostra. Para a definição dos critérios de interpretação como
não produtora, fraca, moderada ou forte, o método foi anteriormente validado em
ensaios utilizando microscopia de varredura confocal a laser (CLMS) por Coelho et
al. (2008)
3.8 Extração do DNA genômico para os ensaios baseados em PCR
A extração do DNA genômico das amostras de S. aureus, assim como da
amostra controle-positivo utilizada, foi realizada de acordo com Maniatis et al.
(1989), exceto que as células foram incubadas a 60 ºC por 20 minutos com 10 µg de
lisozima (Sigma-Aldrich) e 50 µg de proteinase K (Promega) para a lise da parede
celular. Em virtude de contaminação, foram excluídas dos ensaios baseados em
PCR as amostras de S. aureus procedentes das fazendas 1, 5 e 7 do estado de
Pernambuco, como referido anteriormente.
Após a extração, o DNA genômico foi ressuspendido em 10 µL de água
deionizada estéril e quantificado por meio de eletroforese em gel de agarose ultra
pura 1% (m/v) Invitrogen (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Califórnia, EUA) em
tampão TBE 0,5x (Tris-borato 0,089 M; ácido bórico 0,089 M; EDTA, 0,002 M) a 120
V, comparando-se com a quantidade padrão de DNA do fago λ clivado com enzima
de restrição HindIII (marcador) (Invitrogen). Após a migração, o DNA foi corado em
solução aquosa de brometo de etídeo (15 mg/mL), observado e fotografado em
transiluminador de luz ultravioleta (UV).
3.9 Ensaio de PCR para a amplificação do gene icaA
Para as reações de PCR, foram utilizados os seguintes primers descritos por
Cruz (2008): icaAF (TCA AGG GGG ACA CGA AGT AT) e icaAR (GAT TCT CCT
CCTC TC TGC CA). A reação foi preparada para um volume final de 25 µL por tubo,
49
compreendendo: 5 µL de 5x Green GoTaq Reaction Buffer (1,5 mM de MgCl2); 2 µL
de dNTP 2,5 µM, 0,125 µL de GoTaq DNA polimerase (Promega), 1,0 µL de cada
um dos primers 10 µM IDT (Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, Iowa, EUA)
e 5,0 µL de DNA genômico. A cepa de S. aureus BMB9393 foi utilizada como
controle positivo para a presença do gene icaA. Como controle da reação utilizou-se
água milli-Q estéril no lugar de DNA.
As amplificações foram realizadas em termociclador, obedecendo-se a uma
desnaturação inicial de 94 °C por 4 min, seguida de 30 ciclos térmicos de 94 °C por
30 s, 55 °C por 30 s, 72 °C por 1 min, finalizando-se com uma extensão final de 72
°C por 4 min. Os produtos das amplificações foram analisados por eletroforese em
géis de agarose ultra pura 1,5% (Invitrogen), corados com brometo de etídio (10
mg/mL) por 15 minutos, visualizados e fotografados em transiluminador de UV. O
marcador de peso molecular 100pb DNA Ladder (Invitrogen) foi utilizado como
padrão para o cálculo do tamanho dos fragmentos amplificados.
3.10 PCR-RFLP do gene da coagulase
A tipagem do gene coa foi realizada de acordo com Goh et al. (1992) e
Santos et al. (2003). A região 3�-terminal do gene coa foi amplificada utilizando-se os
seguintes primers específicos COAG2-CGA GAC CAA GAT TCA ACA AG e
COAG3-AAA GAA AAC CAC TCA CAT CA descritos por Goh et al. (1992).
As reações de amplificação foram preparadas para um volume final de 25 µL,
contendo: 5 µL de 5x Colorless GoTaq Reaction Buffer (1,5 mM de MgCl2), 1 µL de
dNTP 2,5 µM, 0,125 µL de GoTaq DNA polimerase (Promega, Madison, WI, EUA),
1,0 µL de cada um dos primers 10 µM (Invitrogen) e 5,0 µL de DNA genômico.
Nesse experimento foi utilizada como controle positivo a cepa de S. aureus ATCC
25923. Como controle da reação utilizou-se água milli-Q estéril no lugar de DNA.
As amplificações foram realizadas em termociclador, obedecendo-se a uma
desnaturação inicial de 94 °C por 2 min, seguida de 30 ciclos térmicos de 94 °C por
30 s, 62 °C por 2 min, 72 °C por 4 min, finalizando-se com uma extensão final de 72
°C por 7 min. Os produtos de PCR (amplicons) foram separados por eletroforese em
50
gel de agarose ultra pura 1,5% (m/v) (Invitrogen), utilizando-se um marcador de peso
molecular de (1 kb DNA Ladder) (Promega) para calcular o tamanho dos amplicons.
Em seguida, os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o Illustra
GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit GE (GE Healthcare UK Limited, Little
Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido), de acordo com as recomendações do
fabricante e a clivagem dos amplicons foi realizada. 10 µL do produto da PCR
purificada foram digeridos a 37 ºC, em banho-maria, durante 18 horas com 10 U da
enzima de restrição AluI (New England BioLabs), de acordo as recomendações do
fabricante. Os fragmentos resultantes da PCR-RFLP foram separados por
eletroforese em gel de agarose ultra pura 3,0% (m/v) (Invitrogen), corados com
brometo de etídeo (15 mg/mL), visualizados e fotografados em transiluminador de
UV. O marcador de peso molecular Gene Ruler 50 pb DNA Ladder (Fermentas) foi
utilizado como referência para o cálculo do tamanho dos amplicons.
3.11 Ensaio de PCR para pesquisa do gene que codifica a região X da proteína A
A amplificação da região X do gene spa seguiu as recomendações de Frénay
et al. (1996), incluindo os oligonucleotídeos SPAX1 (5´-CAA GCA CCA AAA GAG
GAA-3´) e SPAX2 (5´-CAC CAG GTT TAA CGA CAT-3`). A PCR foi realizada pela
adição de 5 µL do DNA genômico a uma mistura contendo 1,0 µL de cada primer (10
mM) (IDT), 5 µL de 5x Green GoTaq Reaction Buffer (1,5 mM de MgCl2), 2 µL de
dNTP 2,5 µM, 0,125 µL de GoTaq DNA polimerase (Promega), para um volume final
de 25 µL. Nesse experimento foi utilizada como controle positivo a cepa de S.
aureus ATCC 25923. Como controle da reação utilizou-se água milli-Q estéril no
lugar de DNA.
O programa para a PCR do gene spa incluiu desnaturação inicial a 94 ºC por
4 minutos, 35 ciclos de desnaturação por 1 min a 94 ºC, anelamento por 1 min a
60ºC e extensão por 1 min a 72 ºC, seguido de uma extensão final por 5 min a
72 ºC. Os amplicons foram separados eletroforeticamente em géis de agarose ultra
pura 3,0% (m/v) (Invitrogen). O marcador de peso molecular Gene Ruler 50 pb DNA
51
Ladder (Fermentas) foi utilizado como padrão para a verificação do tamanho dos
amplicons.
3.12 Determinação do índice numérico de discriminação (D)
O poder discriminatório dos diferentes métodos de tipagem foi determinado de
acordo com o índice numérico descrito por Hunter e Gaston (1988). O valor de D
indica a probabilidade que dois isolados selecionados aleatoriamente da população-
teste sejam classificados em diferentes grupos de tipagem. A fórmula abaixo foi
utilizada para o cálculo dos valores D:
-1)
Nesta fórmula, s= número total de diferentes tipos, = número de isolados
representando cada tipo e N = número de isolados dentro da população-teste.
3.13 Análises estatísticas
A análise estatítica foi realizada utilizando o software GraphPad InStat versão
3.0 (GraphPad Sotware, San Diego, CA, EUA) para Windows 95. O valor nominal de
P para significância estatística foi de 0,05. Nas diferentes análises foram utilizados e
o teste exato de Fischer, Mann-Whitney e Kruskal-Wallis.
52
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Isolamento de S. aureus, ocorrência da mastite e do estágio de portador por propriedade leiteira
Em relação à ocorrência de mastite clínica, foi observado que a maioria dos
rebanhos estudados encontrou-se dentro do considerado internacionalmente como
aceitável, isto é, inferior a 3% (Costa, 1998), à exceção das fazendas 2 de
Pernambuco e B de São Paulo que apresentaram, respectivamente, 3,6% e 3,4% de
casos clínicos (Tabela 1).
Tabela1- Ocorrência de mastite clínica, subclínica, portadores assintomáticos e negativos em quartos
mamários de bovinos leiteiros procedentes de rebanhos de Pernambuco e São Paulo. 2009.
Portador3 Clínica1 Subclínica2 Assintomático
Negativos4 Total
N.º % N.º % N.º % N.º % N.º % Fazenda 1 0 - 7 15,9 9 20,5 28 63,6 44 5,4 Fazenda 2 2 3,6 28 50 13 23,2 13 23,2 56 6,9 Fazenda 3 2 0,9 56 25,1 74 33,2 91 40,8 223 27,3 Fazenda 4 2 2,3 34 38,6 5 5,7 47 53,4 88 10,8 Fazenda 5 0 - 7 9,7 35 48,6 30 41,7 72 8,8 Fazenda 6 2 0,8 162 63 35 13,6 58 22,6 257 31,5 Fazenda 7 0 0 12 15,8 34 44,7 30 39,5 76 9,3 Total PE 8 1 306 37,5* 205 25,1 297 36,4 816 100 Fazenda A 5 1 387 81,5 20 4,2 63 13,3 475 38,2 Fazenda B 3 3,4 28 31,5 23 25,8 35 39,3 89 7,1 Fazenda F 0 - 151 34 13 2,9 280 63,1 444 35,7 Fazenda P 5 2,1 143 60,6 19 8,1 69 29,2 236 19
Total SP 13 1 709 57* 75 6 447 35,9 1244 100 1Clínica = quartos mamários com alterações visíveis na glândula mamária e/ou no leite e exame microbiológico positivo; 2subclínica = CMT positivo, ausência de alterações visíveis na glândula mamária e/ou no leite e exame microbiológico positivo; 3portador = CMT negativo e exame microbiológico positivo; Negativos = CMT negativo e exame microbiológico negativo. * P< 0,0001, teste exato de Fisher.
53
Os dados de Pernambuco e São Paulo reunidos na Tabela 1 mostraram que
em relação à ocorrência de mastite subclínica houve ampla variação entre os
rebanhos, sendo o mais baixo na Fazenda 5 (9,7%) e o mais alto na Fazenda A
(81,5%). Foi detectada diferença significativa na ocorrência de mastite subclínica
entre os rebanhos de Pernambuco e São Paulo (P< 0,0001, teste exato de Fisher).
Na Fazenda B (Tabela 1) observou-se nível de mastite subclínica
relativamente baixo (31,5%), porém o de portador (25,8%) foi o mais alto entre as
propriedades de São Paulo. Paralelamente, na Fazenda 5 (Tabela 1) também se
pode observar o mais baixo nível de mastite subclínica entre as propriedades de
Pernambuco (9,7%), registrando-se, porém, o mais alto nível de portadores
assintomáticos (48,6%). Tais resultados assinalam a possibilidade do
recrudescimento do problema de mastite em ambas as propriedades com elevação
de novos casos subclínicos e mesmo novos casos clínicos.
De acordo com a Tabela 2, são observados elevados índices de isolamento
de S. aureus, classificado como um dos principais patógenos de mastite contagiosa,
sinalizando que a transmissão deva ocorrer principalmente durante a ordenha,
conforme já descrito por vários pesquisadores (Costa et al., 1995; Sommerhäuser et
al., 2003; Cabral et al., 2004; Sabour et al., 2004; Langoni, 2007).
Tabela 2- Glândulas mamárias com isolamento de Staphylococcus aureus a partir de vacas em lactação provenientes de rebanhos leiteiros de Pernambuco e São Paulo. 2009.
Clínica Subclínica Portador Total n.º % n.º % n.º % n.º %
Fazenda 1 0 - 0 - 1 100 1 1 Fazenda 2 0 - 5 100 0 - 5 5,2 Fazenda 3 0 - 15 78,9 4 21,1 19 19,6 Fazenda 4 0 - 7 100 0 - 7 7,2 Fazenda 5 0 - 0 - 1 100 1 1 Fazenda 6 1 1,6 58 93,6 3 4,8 62 63,9 Fazenda 7 0 - 2 100 0 - 2 2,1 Total PE 1 1 87 89,7 9 9,3 97 100
Fazenda A 2 1,7 102 89,5 10 8,8 114 82,6 Fazenda B 0 - 8 72,7 3 27,3 11 8 Fazenda F 0 - 3 100 0 0 3 2,2 Fazenda P 0 - 10 100 0 0 10 7,2 Total SP 2 1,4 123 89,1 13 9,4 138 100
Total PE e SP 3 1,3 210 89,3 22 9,4 235 100
54
Observou-se, pelos dados da Tabela 2, que S. aureus foram, na maioria dos
casos, isolados de processos de mastite subclínica nos rebanhos estudados, mesmo
quando o percentual de isolamento deste agente no rebanho foi baixo (Fazendas 2,
3, 4, 5, 6, 7, A, B, F e P). Em alguns desses rebanhos, S. aureus só foram isolados
do leite de casos de mastite subclínica (Fazendas 2, 4, 7, F e P). Na fazenda 3
obteve-se isolamento de S. aureus em 78,9% de casos de mastite subclínica,
enquanto na fazenda 6 se isolou este agente em 93,6% de casos de mastite
subclínica. Ainda de acordo com a Tabela 2, nas Fazendas 3 e 6 o isolamento de S.
aureus correspondeu, respectivamente, a 19,6% e 63,9% do total de S. aureus
isolados dos rebanhos de Pernambuco. Em relação às fazendas de São Paulo,
verificou-se a ocorrência de mastite sublínica por S. aureus em 89,5% das glândulas
mamárias avaliadas, sendo que, a partir do leite, 82,6% dos isolados de S. aureus
corresponderam à Fazenda A. Esses dados sugerem a ocorrência de surto na
Fazenda 6 de Pernambuco e Fazenda A de São Paulo. A elevada frequência de
isolamento de S. aureus de casos de mastite subclínica sugere a ocorrência de
surtos em duas das fazendas avaliadas, respectivamente, a Fazenda 6 de
Pernambuco e na Fazenda A de São Paulo.
4.2 Genotipagem de isolados de S. aureus utilizando a técnica de PFGE
Na análise de macrorrestrição do DNA cromossomal por meio da técnica de
PFGE foram gerados mais de oito fragmentos em cada uma das 107 amostras de S.
aureus avaliadas, a partir das quais foram identificados 31 diferentes perfis
genéticos (Figura 1), posteriormente agrupados em 12 diferentes linhagens (Tabela
3). Os perfis genéticos mais freqüentemente isolados foram respectivamente: E1
(31,8%) (34/107) e E10 (14,0%). Paralelamente, os perfis genéticos A2, A3, A8, B,
C, E3, E6-E9, E11, F2, F3, G, H, J e L compreenderam apenas uma única amostra
de S. aureus cada um (0,90%) (Figura 1, Tabela 3).
55
Dice (Opt:1.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]PFGE
100
8060
90.9
81.8
90.9
95.7
93.1
92.1
87.3
84
78.1
72.8
94.1
90.4
94.1
89
94.1
85
94.1
94.1
91.2
82.6
67.5
81.8
95.7
85.1
73.5
61.9
66.7
58.9
46
40.6
PFGE
Figura 1- Perfis genéticos representativos de 107 amostras de S. aureus avaliadas utilizando a técnica de PFGE, obtidos pelo software Bionumerics, e isoladas a partir de glândulas mamárias portadoras assintomáticas, casos clínicos e subclínicos de mastite bovina, pele do úbere, equipamento de ordenha mecânica e fossas nasais de ordenhadores em oito diferentes fazendas leiteiras localizadas nos estados de São Paulo e Pernambuco. 2009.
A2 B C A3 A4 A5 A6 A1 A7 A8 D E2 E3 E4 E5 E1 E6 E7 E8 E9 E10E11G H F1 F2 F3 I J K L
56
Tabela 3- Distribuição de linhagens e perfis genéticos de PFGE de 107 amostras de S. aureus isoladas em dois estados brasileiros. 2009.
Linhagem Perfil Distribuição* dos perfis em: de De São Paulo Pernambuco Total
PFGE PFGE N° % N° % N° % LA A1 � � 4 7,7 4 3,7
A2 � � 1 1,9 1 0,9 A3 � � 1 1,9 1 0,9 A4 � � 2 3,8 2 1,9 A5 � � 3 5,8 3 2,8 A6 � � 2 3,8 2 1,9 A7 � � 3 5,8 3 2,8 A8 � � 1 1,9 1 0,9
LB B � � 1 1,9 1 0,9 LC C � � 1 1,9 1 0,9 LD D � � 2 3,8 2 1,9 LE E1 32 58,2 2 3,8 34 31,8
E2 � � 3 5,8 3 2,8 E3 1 1,8 � � 1 0,9 E4 3 5,5 6 11,5 9 8,4 E5 � � 2 3,8 2 1,9 E6 1 1,8 � � 1 0,9 E7 1 1,8 � � 1 0,9 E8 1 1,8 � � 1 0,9 E9 1 1,8 � � 1 0,9 E10 1 1,8 14 26,9 15 14 E11 1 1,8 � � 1 0,9
LF F1 � � 2 3,8 2 1,9 F2 1 1,8 � � 1 0,9 F3 1 1,8 � � 1 0,9
LG G 1 1,8 � � 1 0,9 LH H � � 1 1,9 1 0,9 LI I 6 10,9 � � 6 5,6 LJ J 1 1,8 � � 1 0,9 LK K 3 5,5 � � 3 2,8 LL L � � 1 1,9 1 0,9 Total 55 100 52 100 107 100
* Um traço (�) indica que não houve isolamento de um dado perfil nesta região.
Os resultados do presente estudo concordam com os achados de Cabral et
al. (2004) que examinaram 87 amostras de S. aureus isoladas de casos de mastite
subclínica bovina em 23 diferentes fazendas localizadas em Bauru e Sorocaba. A
tipagem destas amostras por meio da técnica de PFGE agrupou os 87 isolados em
26 diferentes perfis genéticos, classificados em 9 diferentes linhagens. Similarmente,
57
estudo conduzido em 58 rebanhos localizados em três diferentes regiões do Canadá
identificou 29 diferentes perfis de PFGE, agrupados em seis linhagens, a partir de
um conjunto de 288 amostras de S. aureus (Sabour et al., 2004). Em estudo
realizado no estado do Rio de Janeiro, Rabello et al. (2005) identificaram, por sua
vez, 40 diferentes perfis genéticos, agrupados em 16 linhagens, entre 107 amostras
de S. aureus isoladas de casos de mastite subclínica procedentes de nove rebanhos
leiteiros.
No estudo realizado por Sabour et al. (2004), a linhagem de S. aureus
predominante foi observada em 61,8% de todos os isolados coletados nas três
províncias, enquanto a segunda linhagem mais prevalente foi diagnosticada em
26,4% de todos os isolados e também encontrada nas três províncias. Outras quatro
linhagens compreenderam 11,8% de todos os isolados e foram observadas em
apenas uma ou duas províncias. Similarmente, Cabral et al. (2004) observaram que
duas linhagens de S. aureus foram mais prevalentes, ocorrendo em 19 (82,6%) de
23 fazendas avaliadas, enquanto outras sete linhagens foram isoladas
esporadicamente. Rabello et al. (2005), por sua vez, também observaram que uma
linhagem representou 54,2% dos isolados de casos de mastite subclínica avaliados
em seis das nove fazendas avaliadas. Os resultados obtidos por esses autores
sugeriram que S. aureus não apenas foram transmitidos entre vacas numa fazenda,
mas também disseminaram entre fazendas e diferentes regiões.
Resultados semelhantes foram obtidos no presente estudo, em que a
linhagem LE foi observada em 64,5% (69/107) de todas as amostras de S. aureus
avaliadas, LA foi diagnosticada em 15,9% (17/107), LI em 5,6% (06/107), enquanto
as demais nove linhagens (LB, LC, LD, LF, LG, LH, LJ, LK e LL) foram distribuídas
entre 14% (15/107) das amostras (Tabela 3). Paralelamente, considerando-se
apenas as amostras de S. aureus isoladas a partir de leite, verificou-se maior
disseminação de cepas pertencentes à linhagem LE, que correspondeu a 72,6% dos
isolados desta origem, freqüência significantemente maior (P < 0,0001) em relação
tanto às linhagens LA e LI, quanto em relação às demais linhagens (Tabela 4).
58
Tabela 4- Análise de 95 glândulas mamárias infectadas com S. aureus quanto à frequência de ocorrência das diferentes linhagens LA, LE, LI e outras (LB, LD, LF, LJ e LL). São Paulo e Pernambuco. 2009.
Linhagens de PFGE N°. %
LA 13 13,7 a,b,c
LE 69 72,6 a
LI 6 6,3 a,b,d
Outras 7 7,4 a,b,c,d Total 95 100
Teste de Fischer aP < 0,0001 entre a linhagem LE e as linhagens LA, LI e outras; bP = 0,1453 entre as linhagens LA e LI; cP = 0,2367 entre a linhagem LA e outras; dP = 1,0000 entre a linhagem LI e outras.
As células somáticas compreendem, em sua maioria, células do sistema
imune (80% em quartos não infectados e 99% em quartos infectados) (Sordillo et al.,
1997). Essas células fazem parte do mecanismo de defesa natural e incluem
linfócitos, macrófagos, células polimorfonucleares e algumas células epiteliais (Pillai
et al., 2001). As células somáticas são, portanto, um reflexo da resposta inflamatória
a uma infecção intramamária ou a um desafio do sistema imune. A CCS é
frequentemente utilizada para distinguir entre quartos infectados e não infectados,
uma vez que geralmente há concordância entre a infecção e a resposta inflamatória
aferida por uma CCS elevada (Schukken et al., 2003).
Dados apresentados na Tabela 5 e ilustrados pela Figura 2 mostram que não
foram detectadas diferenças estatisticamente significantes nos níveis de CCS entre
amostras de leite procedentes de glândulas mamárias infectadas por S. aureus
pertencentes a diferentes linhagens de PGFE, isto é, a mediana e a média de CCS
entre as linhagens LA, LE, LI e outras linhagens (LB, LD, LF, LJ e LL) não diferiram
significantemente. Paralelamente, os resultados apresentados nos Quadros 1 e 2
indicam que amostras isoladas a partir de diferentes graus de intensidade do
processo inflamatório ou de glândulas assintomáticas pertenceram à mesma
linhagem (LA e LE). Tais associações são raramente mostradas uma vez que a
maioria dos estudos está focada apenas em S. aureus isolados de casos clínicos ou
subclínicos (Swartz et al., 1985; Lam et al., 1996; Lange et al., 1999) ou não contém
59
informações sobre o histórico clínico das amostras (Aarestrup et al., 1995; Fitzgerald
et al., 1997; Su et al., 1999).
Os resultados do presente estudo divergem das observações de Zadoks et al.
(2000) que indicaram ocorrência de associações entre diferentes linhagens de PFGE
e a severidade do processo inflamatório aferida pela CCS. Vale ressaltar que os
mesmos autores enfatizaram que as associações entre achados clínicos da mastite,
linhagens, tipos binários e provas específicas no sistema de tipagem binária obtidas
foram meramente especulativas e apontaram a necessidade de mais estudos.
Recentemente, Haveri et al. (2005) verificaram associação entre uma linhagem e a
ocorrência de sintomas clínicos severos, inclusive altas CCS, porém mostrando alta
sensibilidade à antibioticoterapia.
Tabela 5- CCS no leite de 95 glândulas mamárias infectadas com S.aureus pertencentes às
linhagens LA, LE, LI e outras (LB, LD, LF, LJ e LL) em rebanhos de São Paulo e Pernambuco. 2009.
CCS (x103 células/mL) Linhagens
Mediana Média Máximo Mínimo
LA 237 1179 9708 5
LE 609 1324 8774 2
LI 1678 1890 3451 232
Outras 741 2008 5792 72
P= 0,1840, diferença considerada não siginificante. Kruskal-Wallis Test (não paramétrica ANOVA)
60
CCS no leite: pulsotipo A (coluna A), E (col B), I (COLC), outros(B,D, F, J, L (col D) SP e PE.2009.Mean and Standard Error
ColumnA B C D
2.8002.6002.4002.2002.0001.8001.6001.4001.2001.000
800600400200
0
Figura 2- CCS no leite de glândulas mamárias infectadas com S.aureus pertencentes às linhagens LA, LE, LI e outras linhagens (LB, LD, LF, LJ e LL) em rebanhos de São Paulo e Pernambuco. 2009.
Em relação à distribuição geográfica, o grupo predominante (LE) encontrou-se
amplamente distribuído em 75% (06/08) dos rebanhos avaliados em ambos os
estados. Adicionalmente, o grupo LF também foi identificado em S. aureus
procedentes de fazendas de ambas as regiões (Quadros 1 e 2). Paralelamente, o
segundo grupo mais frequente (LA) foi observado exclusivamente no estado de
Pernambuco, na ordem de 75% (03/04) das fazendas cujas amostras de S. aureus
foram analisadas por meio de técnicas moleculares (Quadro 1).
Similarmente ao observado por Cabral et al. (2004), a técnica de PFGE
revelou no presente estudo uma prevalência desproporcional de dois grupos de S.
aureus (LE e LA), indicando que algumas linhagens apresentam capacidade de
causar e disseminar a infecção e que um limitado número de clones parece ser
responsável pelos casos de mastite bovina em várias fazendas. Na Argentina, um
limitado número de clones definidos pelo uso combinado de PFGE e ribotipagem
automatizada também foi encontrado disperso em localidades geograficamente
distantes. A cepa mais prevalente de S. aureus foi observada amplamente
distribuída no país e restrita a fazendas próximas; o segundo tipo mais prevalente foi
também amplamente distribuído em rebanhos localizados em diferentes regiões
geográficas (Buzolla et al., 2001).
61
Quadro 1- Distribuição de linhagens e perfis genéticos obtidos utilizando a técnica de PFGE em 55 amostras de S. aureus isoladas a partir de diversas origens em quatro fazendas do estado de São Paulo. 2009.
Linhagem Perfil Número Fazenda Origem de de de do
PFGE PFGE Isolados Isolamento LE E1 32 A e B portador/mastite subclínica/mastite clínica
E3 1 B mastite subclínica E4 3 A mastite subclínica E6 1 B mastite subclínica E7 1 B mastite subclínica E8 1 B mastite subclínica E9 1 B mastite subclínica E10 1 P mastite subclínica E11 1 B mastite subclínica
LF F2 1 A mastite subclínica F3 1 F insuflador
LG G 1 F fossas nasais de ordenhador LI I 6 P e F mastite subclínica LJ J 1 P mastite subclínica LK K 3 F fossas nasais de ordenhador
Estudo realizado por Fitzgerald et al. (1997) mostrou que poucos clones
especializados foram responsáveis por casos de mastite bovina e que estes clones
apresentaram ampla distribuição geográfica. Em relação a este aspecto, pode-se
especular que isolados com genótipos idênticos podem apresentar características
que conferem vantagem sobre outras cepas para sobreviver no ambiente, colonizar
o úbere bovino e/ou causar doença clinicamente detectável (Buzolla et al., 2001).
62
Quadro 2- Distribuição de linhagens e perfis genéticos utilizando a técnica de PFGE em 52 amostras de S. aureus isoladas a partir de diversas origens em quatro fazendas do estado de Pernambuco. 2009.
Linhagem Perfil Número Fazenda Origem de de de do
PFGE PFGE Isolados Isolamento LA A1 4 3 portador/mastite subclínica/pele do úbere
A2 1 4 mastite subclínica A3 1 2 mastite clínica A4 2 4 mastite subclínica/insuflador A5 3 3 portador/mastite subclínica/pele do úbere A6 2 3 mastite subclínica A7 3 3 portador/mastite subclínica/pele do úbere A8 1 3 mastite subclínica
LB B 1 6 mastite subclínica LC C 1 4 insuflador LD D 2 3 mastite subclínica/pele do úbere LE E1 2 2 e 4 mastite subclínica/mastite clínica
E2 3 4 portador/mastite subclínica E4 6 6 portador/mastite subclínica E5 2 2 portador/mastite clínica E10 14 6 portador/mastite subclínica/mastite clínica
LF F1 2 6 mastite subclínica LH H 1 3 fossas nasais de ordenhador LL L 1 6 portador
Neste estudo, apesar de duas linhagens (LE e LF) terem sido diagnosticadas
nas duas diferentes regiões avaliadas, as linhagens LA, LB, LC, LD, LH e LL foram
observadas somente no estado de Pernambuco (Quadro 1), enquanto os grupos LG,
LI, LJ e LK foram diagnosticados apenas em São Paulo (Quadro 2). Paralelamente,
a análise dos padrões de restrição obtidos pela PFGE revelou uma considerável
heterogeneidade genética entre os isolados de S. aureus. Quanto à distribuição
entre os rebanhos, 87,1% dos perfis genéticos foram detectados exclusivamente em
um rebanho, 9,7% (perfis E4, E10 e I) em dois rebanhos e 3,2% (perfil E1) em
quatro rebanhos (Quadros 1 e 2). Estes resultados sugerem que a variação
geográfica das fazendas pode também apresentar associação com a formação de
populações distintas de S. aureus sob o ponto de vista da epidemiologia da
enfermidade.
Em relação a esse aspecto, experimentos conduzidos por Middleton et al.
(2002), utilizando a mesma técnica de tipagem, mostraram que 82% dos perfis
63
genéticos foram isolados unicamente em um rebanho, enquanto 12% ocorreram em
dois rebanhos, 1% em três rebanhos e 5% foram observados em mais de três
rebanhos. Os resultados obtidos no presente estudo também corroboram os
achados obtidos por Joo et al. (2001), os quais observaram que 66% dos perfis
genéticos de S. aureus isolados de casos de mastite na Coréia ocorreram num único
rebanho, 27% em dois rebanhos, 8% em três rebanhos e que nenhum perfil genético
foi observado em mais de três rebanhos.
Entretanto, os resultados deste estudo contrastam com os achados obtidos
por Zadoks et al. (2002) que indicaram que a maioria dos fagotipos, pulsotipos e
tipos binários de S. aureus foram encontrados em vários rebanhos. Similarmente,
várias cepas e clones de S. aureus foram identificados � sendo comuns a vários
rebanhos, regiões, países e continentes � em estudos baseados em fagotipagem
(Mackie et al., 1987), ribotipagem (Rivas et al., 1997), análise do perfil eletroforético
de isoenzimas (MLEE) (Kapur et al., 1995; Fitzgerald et al., 1997), tipagem pelo
polimorfismo do DNA amplificado aleatoriamente (RAPD) (Fitzgerald et al., 1997),
PFGE (Sordelli et al., 2000; Zadoks et al., 2000; Buzzola et al., 2001), tipagem pelo
gene da coagulase (Mullarky et al., 2001) e tipagem binária (Zadoks et al., 2000).
Paralelamente, os resultados do presente estudo também indicaram
considerável multiplicidade de clones de S. aureus dentro dos rebanhos, uma vez
que três a sete diferentes perfis genéticos, agrupados em uma a quatro linhagens,
foram diagnosticados em cada uma das fazendas analisadas. De acordo com o
Quadro 1, foram observadas as seguintes linhagens em rebanhos localizados em
São Paulo: Fazenda A (LE e LF), fazenda B (LE), fazenda F (LF, LG, LI e LK) e
fazenda P (LE, LI e LJ). Semelhantemente, segundo o Quadro 2, as seguintes
linhagens foram identificadas em propriedades leiteiras de Pernambuco: fazenda 2
(LA e LE), fazenda 3 (LA, LD e LH), fazenda 4 (LA, LC e LE) e fazenda 6 (LB, LE, LF
e LL). Estes resultados corroboram os achados de Fitzgerald et al. (1997) que
aplicaram várias técnicas de tipagem molecular em estudo epidemiológico de S.
aureus e inferiram que há multiplicidade de perfis clonais dentro de um mesmo
rebanho. Neste mesmo contexto, Sabour et al. (2004) analisaram padrões de
restrição gerados por PFGE e revelaram uma razoável heterogeneidade genética
entre isolados de S. aureus. Houve rebanhos (41,4%) com dois, três e até quatro
64
tipos presentes, sendo o mesmo também detectado por outros pesquisadores
(Matthews et al.,1992; Kapur et al., 1995; Rabello et al., 2005).
Na fazenda A, localizada no estado de São Paulo, 88,6% (31/35) das
amostras de S. aureus isoladas a partir de leite pertenceram ao perfil E1.
Similarmente, no rebanho 6 procedente de Pernambuco, o perfil E10 foi isolado em
56% (14/25) das amostras isoladas de leite (Quadros 1 e 2). Adicionalmente, na
Tabela 6 observa-se que a média e a mediana das CCS das amostras de leite das
glândulas mamárias infectadas com a linhagem LE de S. aureus procedentes de
rebanhos de Pernambuco foram estatisticamente superiores às observadas em
amostras de leite de rebanhos de São Paulo a partir das quais também se isolou a
mesma linhagem. Os altos valores de desvio padrão estão plenamente coerentes
em decorrência da presença de glândulas mamárias infectadas por S. aureus, com
mastite (casos clínicos e subclínicos) ou sem mastite (portadores assintomáticos).
Tabela 6- CCS de amostras de leite de glândulas mamárias infectadas por S. aureus da linhagem E
procedentes de rebanhos bovinos leiteiros de São Paulo e de Pernambuco. 2009.
CCS (x103 células/mL)
São Paulo Pernambuco Média 685,21* 2319,7*
Mediana 425,50* 1107,0 * Desvio padrão 887,72 2826,5
Erro padrão 136,98 543,95 Mínimo 2 9 Máximo 4872 8774
*P = 0,0152 (Teste de Mann-Whitney).
Por outro lado, foram verificadas diferenças estatisticamente significantes (P =
0,0009) ao se analisar a CCS das amostras de leite procedentes de glândulas
infectadas por amostras da mesma linhagem (LE), porém pertencentes a diferentes
perfis genéticos: E1, predominante entre os isolados de São Paulo, e E10, mais
freqüentemente isolado nos rebanhos de Pernambuco (Tabela 7). Os resultados
demonstraram que a média e a mediana da CCS nas amostras de leite provenientes
de quartos mamários infectados pelo perfil E10 foram superiores às produzidas por
E1. Similarmente, os resultados expressos na Tabela 6 indicam que a média e a
mediana da CCS das amostras de leite procedentes de quartos mamários infectados
por S. aureus da linhagem E em Pernambuco foram superiores às produzidas por
65
perfis genéticos da mesma linhagem em São Paulo. Justificam-se esses resultados
ao considerar-se o predomínio de E10 entre os perfis da linhagem E nos rebanhos
de Pernambuco, que se mostrou superior para elidir resposta inflamatória, quando
comparado a E1, perfil genético predominante entre os isolados da linhagem E nos
rebanhos de São Paulo.
Tabela 7- Análise de CCS de amostras de leite procedentes de glândulas mamárias infectadas com
S. aureus pertencentes aos perfis genéticos E1 (São Paulo) e E10 (Pernambuco). 2009.
CCS (x103 células/mL) E1 E10 Média 669,12* 2948,4* Mediana 280,50* 1935,5* Desvio padrão 1149,2 3075,7 Erro padrão 197,09 822,02 Mínimo 2 33 Máximo 4872 8774
* P = 0,0009 (teste de Mann-Whitney).
Nas fazendas A (São Paulo) e 6 (Pernambuco), a predominância de um perfil
genético particular de S. aureus no rebanho indicou ausência de qualquer medida de
controle durante a ordenha, conforme também assinalado por Sommerhäuser et al.
(2003). Esses pesquisadores também verificaram em análises epidemiológico-
moleculares realizadas durante implantação de programa de controle de mastite
que, em três fazendas, amostras de S. aureus pertenceram a um perfil genético
predominante e exclusivo do rebanho. Em dois desses rebanhos, ambos os perfis
genéticos predominantes foram considerados responsáveis por significativo aumento
dos casos de mastite, quando comparados aos demais perfis e demonstraram
rápida capacidade de disseminação de um perfil genético predominante de S.
aureus em rebanhos leiteiros.
A importância da identificação do perfil genético do agente etiológico pode ser
enfatizada pelos achados de Smith et al. (1998) os quais indicaram que uma cepa
de S. aureus emergente poderia ser facilmente transmitida dentro de um rebanho
com excelente higiene de ordenha para tornar-se a cepa dominante causadora de
mastite. Em virtude da rápida transmissão e do aumento na CCS, a cepa emergente
seria presumivelmente mais patogênica. De fato, resultados in vitro sugerem que
66
certos tipos de S. aureus isolados de casos de mastite são mais ou menos virulentos
que outros (Su et al., 2000; Zadoks et al., 2000).
Nesse sentido, achados relatados por Joo et al. (2001) também sugeriram
que um rebanho tende a apresentar uma cepa predominante e que esta tende a ser
única no rebanho. Esses achados poderiam relacionar-se ao controle da mastite por
S. aureus. O controle desta enfermidade pode ser realizado em parte pela adoção
de práticas de higiene na ordenha e de antibioticoterapia (Neave et al., 1969) e por
vacinação, descarte e segregação de vacas infectadas (Fox e Gay, 1993). Sugere-
se, portanto, que atenção especial poderia ser dispensada às vacas infectadas com
a cepa predominante, selecionando-as especificamente para tratamento,
segregação ou descarte. O desenvolvimento de vacinas autógenas para S. aureus,
a partir da cepa predominante também poderia ser útil na prevenção de novas
infecções. Alternativamente, estudos adicionais poderiam ser conduzidos no sentido
de identificar fatores patogênicos que possibilitam a transmissão e manutenção das
cepas predominantes de S. aureus. Esses achados poderiam ter potencial utilização
na identificação e produção de antígenos específicos para o desenvolvimento de
vacinas.
As glândulas mamárias de vacas infectadas constituem a principal fonte de
infecção a partir da qual S. aureus é transmitido a outras vacas no rebanho e,
consequentemente, a prevenção da transmissão do patógeno de uma vaca à outra
reduz a incidência da mastite (Neave et al., 1969). Paralelamente, infecções
originadas de fontes exógenas à glândula mamária podem contribuir para a
complexidade do controle da infecção. Há várias fontes de S. aureus no rebanho,
incluindo equipamento de ordenha, pele bovina e humana (Fox et al., 1991;
Roberson et al., 1994). A pele do teto tem sido implicada como uma importante fonte
para infecções intramamárias (Roberson et al., 1994) enquanto que a transmissão
de humanos a bovinos também tem sido proposta (Swartz et al., 1985).
Neste estudo, amostras de S. aureus isoladas a partir da pele do úbere
pertenceram à mesma linhagem (LA e LD) e inclusive ao mesmo perfil genético (A1,
A5, A7 e D) de isolados obtidos a partir de glândulas mamárias portadoras
assintomáticas e/ou de casos de mastite (Quadro 2). Esses resultados indicam,
portanto, a existência de uma linhagem comum presente na microbiota indígena da
pele do teto dos animais e no leite proveniente de glândulas mamárias com mastite
67
clínica e subclínica, bem como em glândulas mamárias portadoras assintomáticas
(Santos et al., 2008a).
A técnica de PFGE tem sido utilizada na tentativa de se diferenciar S. aureus
isolados de bovinos hígidos daqueles que são predominantemente isolados do leite.
A associação entre o local do isolamento e a cepa é altamente significante sob o
ponto de vista epidemiológico. Nesse sentido, Zadoks et al. (2002) realizaram estudo
epidemiológico-molecular da mastite bovina causada por S. aureus e concluíram que
a pele do teto não é uma fonte importante para as infecções intramamárias bovinas.
Outros estudos utilizando as técnicas de PFGE e a análise de sequencias de regiões
de genes de isoenzimas (MLST) demonstraram que os S. aureus isolados do leite
pertenceram a clones diferentes daqueles isolados da pele do teto (Booth et al.,
2001; Smith et al., 2005b). Os resultados obtidos por estes pesquisadores, utilizando
técnicas mais discriminativas, contrastam com conclusões de estudos anteriores que
se basearam em fagotipagem de S. aureus (Fox et al., 1991) ou em análises
quantitativas de dados bacteriológicos (Roberson et al., 1994).
Larsen et al. (2000) utilizaram ferramentas moleculares como a ribotipagem
na análise de 625 amostras de S. aureus procedentes de casos de mastite e lesões
de pele bovina e afirmaram que dentro de rebanhos houve uma correspondência
íntima entre ribotipos e fagotipos de S. aureus. Adicionalmente, estudo conduzido
por Middleton et al. (2002) registrou que a maioria das cepas de S. aureus
causadora de mastite foi isolada a partir do corpo das novilhas e das glândulas
mamárias em lactação. Em outro estudo, Roberson et al. (1998) examinaram o
papel da pele do teto como fonte de infecções no período pré-parto utilizando
fagotipagem. Os resultados do referido estudo mostraram que a pele do teto foi
considerada uma fonte possível de infecção, porém métodos genotípicos não foram
utilizados para a confirmação desses resultados.
Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que amostras de S. aureus
isoladas a partir de equipamento de ordenha mecânica, pele do úbere, glândulas
mamárias portadoras assintomáticas e de casos de mastite bovina pertenceram à
mesma linhagem (Quadros 1 e 2: linhagens LA e LF). Desse modo, as linhas de
ordenha são locais de intenso manejo que podem atuar como via de transmissão
entre o patógeno e a glândula mamária. Entretanto, segundo Zadoks et al. (2002)
embora os insufladores possam estar contaminados com a microbiota da pele do
68
teto ou do úbere, a transmissão da microbiota da pele para a glândula mamária e
vice-versa não é freqüente.
Os equipamentos de ordenha mecânica são importantes fômites para a
transmissão de S. aureus em rebanhos leiteiros, sendo que limpeza e desinfecção
reduziriam a contaminação com a bactéria (Fox et al., 1991). Zadoks et al. (2002)
analisaram S. aureus utilizando PFGE e revelaram que as linhas podem estar
contaminadas com a bactéria proveniente da pele ou do leite. Estes fômites (os
insufladores dos equipamentos de ordenha mecânica) podem transmitir S. aureus da
pele e do leite. De modo similar, Smith et al. (2005b) identificaram perfis genéticos
de S. aureus presentes em casos de mastite e entre os isolados de equipamento de
ordenha e indicaram os insufladores como potenciais vias de transmissão.
De acordo com Vandenbergh et al. (1999), os indivíduos da espécie humana
distribuem-se entre portadores persistentes, portadores intermitentes e não
portadores em relação à colonização de S. aureus. O portador persistente é
caracterizado por isolamento uniforme e constante de S. aureus, enquanto no
portador intermitente o isolamento é ocasional, menos freqüente. O portador
persistente também tende a resultar na detecção de um menor número de genótipos
do que nos intermitentes. Os humanos não portadores são aqueles a partir dos
quais S. aureus nunca foi isolado.
Neste estudo, os isolados de S. aureus de origem humana (Quadro 1: LG e
LH; Quadro 2: LH) não apresentaram relação genética com os isolados de origem
animal. Apesar do número limitado de amostras, estes resultados corroboram os
achados de Lopes et al. (1990), Kapur et al. (1995) e Larsen et al. (2000) que
demonstraram que cepas de S. aureus de origem humana e bovina constituem, em
geral, subpopulações distintas e que, na prática, apenas uma parte das espécies de
S. aureus causa mastite bovina.
Fox et al. (1991) isolaram amostras de S. aureus com fagotipo similar das
mãos de ordenhadores e de casos de mastite bovina e sugeriram que as mãos do
pessoal de ordenha exercem um importante papel na distribuição da mastite por S.
aureus dentro do rebanho. Matos et al. (1991) também isolaram S. aureus das mãos
de ordenhadores. Dados obtidos por Zadoks et al. (2002) indicaram que amostras de
S. aureus isoladas a partir de pele humana apresentaram o mesmo perfil molecular
dos isolados de pele bovina, mas diferiram dos isolados de casos de mastite bovina.
69
Esses autores obtiveram S. aureus isolados da pele humana utilizando suabes das
mãos dos ordenhadores antes do procedimento de ordenha, sendo improvável,
portanto, que os resultados tenham influência de contaminação das mãos durante a
ordenha.
Smith et al. (2005a), por sua vez, identificaram perfis genéticos de S. aureus
idênticos nas mãos dos ordenhadores e na pele do teto e sugeriram que as mãos do
pessoal de ordenha podem transmitir S. aureus da pele do teto para a glândula
mamária e, portanto, ser importante via de transmissão na mastite. Mais
recentemente, Rabello et al. (2007), utilizando PFGE e MLST, analisaram amostras
de S. aureus isoladas de humanos e de casos de mastite e afirmaram que
importantes complexos clonais associados às infecções de S. aureus em humanos
em todo o mundo, inclusive no Brasil, foram isolados de vacas em seis rebanhos
localizados em cinco municípios do estado do Rio de Janeiro. Amostras de S.
aureus isolados de casos de mastite bovina pertencentes a complexos clonais
associados às infecções em humanos também foram observadas em outros estudos
(Smith et al., 2005a,b), incluindo cepas de S. aureus meticilina-resistentes (Kwon et
al., 2005). Estes achados, portanto, indicaram a possibilidade de transmissão de
cepas entre humanos e bovinos/produtos lácteos, embora isso não pareça ser um
evento freqüente (Zadoks et al., 2000; Lee, 2003).
Achados obtidos por Larsen et al. (2000) mostraram que um determinado
perfil genético de S. aureus foi isolado a partir dos ordenhadores e de poucos casos
de mastite bovina. Nesse mesmo estudo, esses pesquisadores incluíram 100
amostras de S. aureus procedentes de carreadores humanos hígidos e mostraram
que as cepas isoladas a partir dos ordenhadores foram mais similares a estas do
que às amostras de S. aureus isoladas de casos de mastite ou de lesões da pele de
bovinos. Baseados nesses resultados, os pesquisadores afirmaram que, embora o
portador humano de S. aureus possa exercer um papel como fonte de infecções
intramamárias bovinas, a colonização de ordenhadores por S. aureus não constitui
importante fonte de infecção para a mastite, uma vez que os perfis genéticos
predominantemente isolados de casos de mastite e de ordenhadores constituíram
diferentes populações do microrganismo. Uma explicação para essa afirmação
reside no fenômeno da especificidade do hospedeiro e da enfermidade entre clones
70
bacterianos o qual já foi descrito para uma ampla variedade de bactérias
patogênicas (Selander e Musser, 1990).
Um aspecto relevante sob o ponto de vista epidemiológico e geralmente não
considerado na elaboração de protocolos de profilaxia e controle da mastite
contagiosa é o estágio de portador assintomático (Costa et al., 1993; Costa et al.,
1994; Costa et al., 2005). O estágio de portador em mastite refere-se a glândulas
mamárias destituídas de quaisquer sintomatologias e sem alterações detectáveis
pelos diversos métodos qualitativos e quantitativos, a exemplo respectivamente, da
reação de CMT e da CCS, porém positivas à lactocultura (Costa et al., 2005).
Resultados apresentados por Santos et al. (2008b) mostraram que 31
amostras caracterizadas como S. aureus, isoladas a partir de glândulas mamárias
negativas ao CMT e com CCS < 200.000 células/mL amplificaram o gene coa na
reação de PCR. A amplificação por PCR do gene coa destes isolados revelou um
único tamanho de fragmento de 800 pb. Além disso, resultados obtidos por Santos
et al. (2007) utilizando a técnica de PFGE em 10 das 31 amostras de S. aureus
isoladas durante o acompanhamento de quartos mamários assintomáticos
forneceram evidências epidemiológico-moleculares que sugeriram fortemente o
diagnóstico definitivo do estágio de portador assintomático da mastite bovina
causada por este patógeno por até nove dias. Recentemente, Santos et al. (2008c)
mostraram que isolados de S. aureus procedentes de casos de mastite clínica e
subclínica também apresentaram perfil genético similar ao de amostras obtidas a
partir de glândulas mamárias portadoras assintomáticas (Quadros 1 e 2).
Neste estudo, o diagnóstico do estágio de portador assintomático foi
caracterizado (Quadro 3, Figura 3). Verificou-se que houve o isolamento do mesmo
perfil genético da mesma glândula mamária por intervalo de tempo de até 19 dias
(1/12), 16 dias (3/12), sendo que em 6/12 glândulas mamárias acompanhadas o
mesmo perfil genético persistiu por até seis dias. Ressalte-se que o perfil genético
E1 foi predominantemente isolado das glândulas assintomáticas acompanhadas, o
que foi coerente com os demais resultados obtidos no presente estudo, em que esse
perfil apresentou maior freqüência de ocorrência em relação aos demais.
71
Quadro 3- Portadores* de S. aureus em rebanhos leiteiros de São Paulo e Pernambuco em relação aos perfis genéticos de PGFE detectados, intervalo de tempo de persistência do mesmo perfil no quarto mamário e número vezes em que foi isolado. 2009.
Intervalo de dias
1o. 4o. 6o. 7o. 9o. 14o. 16o. 19o.
No animal / quarto N°
Isolamentos 5925 PD (419 ) E1 E1 E1 E1 ---- ---- ---- ---- 4 5911 PD (403) E1 - E1 E1 ---- ---- ---- ---- 4 6178 AD (445) E1 E1 E1 E1 E1 ---- E1 E1 7 6067 AD (453) ---- ---- E1 E1 ---- E1 ---- ---- 3 6067 PE (454) E1 E1 E1 E1 ---- ---- ---- ---- 4 6278 AD (459) E1 E1 E1 ---- ---- ---- ---- ---- 3 2097 PD (463) E1 ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- 1 6270 AD (480) E1 ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- 1 6270 PE (481) E1 ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- 1 6339 PD (488) E1 ---- ---- ---- ---- ---- ---- ---- 1
194P A1 ---- ---- ---- ---- ---- A1 ---- 2 504P E10 ---- ---- ---- ---- ---- E10 ---- 2
*Portadores = quartos mamários negativos nos testes de Tamis, CMT e CCS inferior a 200 x 103 células/mL.
O portador assintomático constitui importante fonte de infecção que
compromete o controle de mastite caso não seja detectado e considerado com a
devida atenção durante o estabelecimento de um programa de controle em
rebanhos leiteiros. Costa et al. (1993) diagnosticaram a permanência no estágio de
portador por um período de 16 dias em estudo realizado em rebanho leiteiro de São
Paulo. Até o momento, entretanto, dispunha-se de escassa literatura científica
(Costa et al., 1993; Costa et al., 1994; Costa et al., 2005), fazendo-se necessária a
caracterização do perfil genético dos isolados por meio de técnicas moleculares que
permitissem tanto constatar a persistência do mesmo perfil genético de S. aureus na
glândula mamária, quanto dirimir eventuais questionamentos sobre a possível
ocorrência de reinfecções causadas por diferentes clones, contrariando a hipótese
de persistência.
72
Figura 3- Macrorrestrição do DNA cromossomal obtido utilizando a técnica de PFGE em 10 amostras de S. aureus isoladas durante o acompanhamento de quartos mamários portadores assintomáticos por 16 dias na propriedade de exploração leiteira A, localizada no estado de São Paulo. Linhas M: Lambda Ladder PFGE Marker; Linha C: S. aureus ATCC 6538; Linhas 1-3 (animal 5925 respectivamente nos dias zero, 1 e 4); Linhas 4-6 (animal 5911 nos dias zero, 1 e 2); Linhas 7-10 (animal 6067 nos dias zero, 9 e 16). 2009.
Pelos resultados obtidos no presente estudo verificou-se que, dentre os nove
quartos mamários avaliados, quatro pertenciam a dois animais, ou seja, dois
diferentes quartos de uma mesma fêmea bovina, o que sugere que a relação
parasita x hospedeiro representa importante aspecto a ser amplamente estudado no
contexto dos portadores dos patógenos de mastite. O reduzido número de glândulas
mamárias portadoras acompanhadas neste estudo não permite, entretanto, uma
análise mais exata destes fatores, porém alerta sobre pontos a serem elucidados em
estudos futuros. Outro aspecto que merece ser ressaltado é a ocorrência do estágio
de portador principalmente em uma das propriedades leiteiras onde se detectou
surto de mastite causado por S. aureus pertencente ao perfil genético E1.
M C 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 M
73
4.3 Genotipagem de amostras de S. aureus isoladas utilizando as técnicas
de PCR do gene coa, PCR-RFLP do gene coa e PCR do gene spa
Neste estudo, 96 amostras de S. aureus genotipadas pela PFGE foram
também submetidas à tipagem molecular por meio das técnicas de PCR do gene
coa, PCR-RFLP do gene coa e PCR da região X do gene spa, com a finalidade de
comparar e avaliar o poder discriminatório das diferentes técnicas.
A tipagem do gene da coagulase é considerada um método simples,
suficientemente reprodutível, específico, de fácil interpretação e discriminatório para
utilização em estudos de genotipagem de S. aureus isolados de diferentes fontes
(Goh et al., 1992; Raimundo et al., 1999; Schlegelová et al., 2003). Neste sentido, a
PCR do gene coa realizada com os oligonucleotídeos descritos por Goh et al. (1992)
produziu quatro diferentes amplicons com tamanhos entre 650 pb - 1000 pb (Figura
4, Quadro 4). Excetuando-se o controle negativo (mistura da PCR + água milliQ
estéril), todas as 96 amostras de S. aureus avaliadas produziram um único produto
de PCR.
Figura 4- Perfis genéticos representativos de 96 amostras de S. aureus genotipadas utilizando o método de PCR do gene coa. Linhas 1-4: perfis do gene coa; Linhas M: marcador de peso molecular de (1 kb DNA Ladder). 2009.
M 1 2 3 4 M
74
A razão para o polimorfismo entre amostras de S. aureus observado na
Figura 4 não é clara, parecendo ocorrer devido a mutações, como inserções e
deleções, pelas quais uma porção da região 3�-terminal do gene coa é deletada ou
diferentes nucleotídeos são inseridos, ocorrendo, por conseguinte, alterações no
tamanho do gene coa e, provavelmente, nas propriedades antigênicas da enzima
coagulase. Essa região do gene da coagulase pode ter papel importante na variação
antigênica e no seu escape do efeito inibitório dos agentes anticoagulase (Saei et
al., 2009). Alguns relatos indicaram que anticorpos e fatores não relacionados aos
anticorpos podem neutralizar a atividade da coagulase e, por conseguinte,
aumentam a resistência contra infecções estafilocócicas (Tager e Hales, 1948;
Duthie e Lorenz, 1952; Stutzenberger e San Clemente, 1967).
Posteriormente, a adição da endonuclease de restrição AluI aos produtos de
PCR do gene coa permitiu distinguir seis diferentes perfis de RFLP (Quadro 4 e
Figura 5). A grande maioria das amostras (80,2%; 77/96) pertenceu ao perfil I,
enquanto que 7,4% (7/96) foram agrupadas no perfil II, 3,1% (3/96) ao perfil V e
1,0% (1/96) a cada um dos perfis III, IV e VI (Quadro 5). De acordo com Mullarky et
al. (2001) e Moon et al. (2007), a predominância de um número particular de cepas
de S. aureus pode ser resultado do aumento da resistência dessas amostras à
resposta imune do hospedeiro, quando comparadas ao comportamento de cepas
com genótipos raros.
Quadro 4- Perfis de PCR e PCR-RFLP do gene coa obtidos a partir da genotipagem de 96 amostras
de S. aureus isoladas de diversas origens. 2009.
Perfil Produto Perfil da Produtos do de RFLP do Da
gene coa PCR (pb) gene coa RFLP (pb) 1 650 VI 410-160-80 2 740 V 410-230-80 3 800 III 490-230-80 3 800 IV 410-230-160 4 1000 I 490-340-170 4 1000 II 490-170-80
Os resultados do presente estudo corroboram os de outros pesquisadores
que utilizaram os mesmos oligonucleotídeos descritos por Goh et al. (1992).
Raimundo et al. (1999) observaram apenas seis coagulotipos entre 151 amostras de
S. aureus isoladas de sete fazendas, com 73% dos isolados pertencendo ao perfil
75
predominante e 15% ao segundo perfil mais frequentemente isolado. Schlegelová et
al. (2003), por sua vez, identificaram 10 diferentes perfis de RFLP entre 86 amostras
de S. aureus analisadas, sendo o perfil predominante diagnosticado em 83,3% dos
isolados de casos de mastite. Por outro lado, Karahan e Çetinkaya (2007) obtiveram
23 diferentes perfis de restrição de RFLP entre 161 amostras de S. aureus
avaliadas, com 68,9% dos isolados agrupados em quatro perfis de restrição
predominantes.
Figura 5- Perfis de restrição representativos de 96 amostras de S. aureus submetidas à PCR-RFLP do gene coa utilizando a endonuclease AluI. Linhas I-VI: perfis de RFLP do gene coa; Linhas M: Marcador de peso molecular Gene Ruler 50 pb DNA Ladder. 2009.
Paralelamente, 6,3% (6/96) dos isolados de S. aureus avaliados neste estudo
não foram tipados pela técnica de PCR-RFLP do gene coa (Quadro 5), pois a
endonuclease de restrição AluI, utilizada em estudos anteriores para gerar perfis de
RFLP do gene coa de S. aureus (Raimundo et al.,1999; Schlegelová et al., 2003;
Karahan e Çetinkaya, 2007; Saei et al., 2009), não digeriu todos os produtos de
PCR. Este achado mostra que não há sítio de restrição para esta enzima na região
variável do gene coa destes isolados. Uma possível explicação para este achado
reside na existência de alterações genéticas na região polimórfica repetitiva do gene
coa que ocorreram devido a pontos de mutação. Phonimdaeng et al. (1990)
demonstraram que as repetições individuais diferem em pontos de mutação e, como
consequência, na presença ou ausência de sítios de restrição para a enzima AluI.
A região X do gene spa consiste de números variáveis de pequenas unidades
repetitivas de 21-27 pb, apresentando a maioria delas 24 pb (Frénay et al., 1996). A
M I II III IV V VI M
76
amplificação por PCR dessa região e posterior análise do número de unidades
repetitivas provou ser um método disponível para diferenciação de S. aureus de
origem humana e bovina (Frénay et al., 1996; van Belkum et al., 1997; Lange et al.,
1999; Cabral et al., 2004). Por meio dessa técnica, seis (06) diferentes tamanhos de
amplicons foram observados neste estudo (Figura 6: Linhas 1-6). De acordo com
Frénay et al. (1996) os amplicons de 100 pb (P1), 180 pb (P2), 200 pb (P3), 220 pb
(P4), 270 pb (P5) e 310 pb (P6) corresponderam, respectivamente, a duas, cinco,
seis, sete, nove e 11 unidades repetitivas. O perfil predominante (P1) foi observado
em 60 amostras (62,5%), enquanto P4 abrangeu 21 (21,9%) dos isolados.
Paralelamente, P2, P3, P5 e P6 foram observados em, respectivamente, seis
(6,3%), uma (1,0%), cinco (5,2%) e três (3,1%) amostras de S. aureus avaliadas
(Quadro 5).
Ao utilizarem os mesmos oligonucleotídeos descritos por Frénay et al. (1996),
Cabral et al. (2004) identificaram nove diferentes perfis de S. aureus entre 87
amostras avaliadas, sendo que os dois perfis mais freqüentes corresponderam,
respectivamente, a duas e dez unidades repetitivas e foram observados em 41,3% e
40,2% dos isolados. Anteriormente, Lange et al. (1999) identificaram sete diferentes
amplicons, com predominância de seis unidades repetitivas, entre 66 amostras de S.
aureus analisadas. Mais recentemente, El-Sayed et al. (2006) identificaram sete
diferente perfis genéticos do gene spa, com predominância de duas e três unidades
repetitivas, entre 41 amostras de S. aureus.
Figura 6- Perfis genéticos representativos de 96 amostras de S. aureus submetidas à PCR do gene spa. Linhas 1-6: perfis do gene spa; Linhas M: Marcador de peso molecular Gene Ruler 50 pb DNA Ladder. 2009.
M 1 2 3 4 5 6 M
77
Nos últimos anos, vários técnicas moleculares têm sido utilizadas para
identificar e comparar perfis moleculares de S. aureus, tais como a PFGE (Buzzola
et al., 2001; Zadoks et al., 2002; Cabral et al., 2004; Rabello et al., 2005; Aires-de-
Sousa et al., 2007), análise do perfil eletroforético de isoenzimas (MLEE) (Kapur et
al., 1995; Enright et al., 2000), MLST (Enright et al., 2000; Rabello et al., 2007; Aires-
de-Sousa et al., 2007), tipagem do gene spa (Lange et al., 1999; Sommerhäuser et
al., 2003; El-Sayed et al., 2006) e tipagem do gene coa (Lange et al., 1999;
Sommerhäuser et al., 2003; Saei et al., 2009).
Embora existam muitos diferentes métodos de tipagem de S. aureus, nem
todos são igualmente efetivos quanto à capacidade discriminatória (Lange et al.,
1999). O poder discriminatório de um método de tipagem refere-se à sua habilidade
de distinguir entre isolados não relacionados, sendo determinado pelo número de
perfis definidos pelo método-teste e pelas freqüências relativas destes perfis (Hunter
e Gaston, 1988). A determinação do poder discriminatório de um método é
importante, uma vez que alguns métodos tendem a agrupar microrganismos em um
pequeno número de grupos, enquanto outros dividem coleções de isolados em
vários pequenos agrupamentos, frequentemente subdividindo grupos de isolados
epidemiologicamente relacionados (Tenover et al., 1994).
No presente estudo, a PFGE produziu o maior número de diferentes perfis
genéticos (31) e provou ter maior poder discriminatório quando comparada aos
demais métodos de tipagem. Esta técnica apresentou índice discriminatório (D) de
0,86, enquanto as técnicas de PCR do gene coa, PCR-RFLP do gene coa e PCR da
região X do gene spa mostraram, respectivamente, valores de D de 0,18, 0,26 e
0,56. Adicionalmente, a análise comparativa dos três diferentes métodos de tipagem
por PCR (Quadro 5) subdividiu os 96 isolados de S. aureus em 12 diferentes grupos.
Isso resultou num valor de D de 0,62, ainda inferior ao valor de D gerado pela PFGE
(0,86). Esta observação confirmou que a análise de macrorrestrição do DNA
cromossomal pela técnica de PFGE é o método de tipagem de maior poder
discriminatório para S. aureus, corroborando com o verificado por outros autores
(Struelens et al., 1992; Hookey et al., 1998; Lange et al., 1999).
Por outro lado, em relação aos resultados gerados pelos diferentes métodos
de tipagem utilizados no presente estudo, de acordo com o Quadro 5, observou-se
relação entre os perfis gerados pelas técnicas baseadas em PCR e as linhagens
78
obtidas pela técnica de PFGE. As três principais linhagens de PFGE (LE, LA e LI),
que abrangeram 86,5% (83/96) dos isolados de S. aureus, foram formadas, em sua
grande maioria, por um mesmo perfil genético obtido pelas técnicas baseadas em
PCR. Esses resultados corroboram os de Lange et al. (1999). Esses pesquisadores
mostraram que isolados que agruparam intimamente próximos, frequentemente
apresentaram padrões dos genes coa e spa idênticos.
A técnica de PFGE é reconhecida como a técnica mais discriminatória de
tipagem de S. aureus (Struelens et al., 1992; Hookey et al., 1998), porém
caracteriza-se como demorada e laboriosa, além de requerer materiais e
equipamentos de custo elevado para condução dos experimentos e avaliação dos
resultados. Em virtude do exposto, Lange et al. (1999) avaliaram diferentes métodos
de tipagem de S. aureus e sugeriram que a utilização conjunta de vários métodos
baseados em PCR pode representar uma alternativa de genotipagem em
laboratórios de diagnóstico que dispõem de infra-estrutura e recursos limitados.
Ainda de acordo com estes autores, os métodos de tipagem baseados em PCR
podem ser utilizados para diferentes finalidades diagnósticas e geram resultados de
fácil interpretação.
No presente estudo, isolados de S. aureus foram facilmente diferenciados
pelos tamanhos dos amplicons dos genes spa e coa, entretanto, os achados obtidos
sugerem que essas técnicas, mesmo quando utilizadas conjuntamente, não
representaram uma alternativa de tipagem à de PFGE.
79
Quadro 5- Relação entre linhagens de PFGE, perfis de PCR do gene coa, PCR-RFLP do gene coa e
PCR do gene spa em 96 amostras de S. aureus. 2009.
Linhagem Perfil Número Perfil Perfil da Perfil De de de do RFLP do do
PFGE PFGE amostras gene coa gene coa gene spa LA A1 4 4 I 4
A2 1 4 I 4 A3 1 4 I 4 A4 2 4 I 4 A5 3 4 I 4 A6 2 4 I 4 A7 3 4 I 4 A8 1 4 I 4
LB B 1 4 I 5 LC C 1 4 I 4 LD D 2 4 I 6 LE E1 34 4 I 1
E2 3 4 I 1 E3 1 4 I 1 E4 9 4 I 1 E6 1 4 I 1 E7 1 4 II 1 E8 1 4 NT* 1 E9 1 4 NT 1 E10 8 4 I 1 E11 1 4 NT 1
LF F1 2 2 V 4 LG G 1 3 IV 3 LH H 1 2 V 4 LI I 6 4 II 2 LJ J 1 3 III 6 LK K 3 2 NT 5 LL L 1 1 VI 5
* Perfil não-tipável.
4.4 Teste de formação in vitro de biofilme glicose-induzido sob condições estáticas
Os resultados do presente estudo permitiram a detecção de três
agrupamentos genéticos gerados por PFGE que apresentaram relação com o
80
fenótipo de produção de biofilme, conforme ilustrado pela representação hierárquica
da Figura 7. Foram utilizados os seguintes critérios para classificação das amostras
de S. aureus avaliadas: amostras não-produtoras (x ≤ 0,146); fracamente produtoras
(0,147 ≤ x ≤ 0,291); produtoras moderadas (0,292 ≤ x ≤ 0,583) e fortemente
produtoras (x ≥ 0,584). Neste sentido, 69,2% (74/107) das amostras de S. aureus
avaliadas foram classificadas como produtoras de biofilme, enquanto 30,8% (33/107)
dos isolados não o produziram. Estes parâmetros foram obtidos levando-se em
consideração o valor de 0,073 da UB da cepa de S. pyogenes utilizada como
controle-negativo.
Desta forma, o cluster I foi composto por 19,6% (21/107) das amostras de S.
aureus submetidas ao ensaio para verificação da produção in vitro de biofilme
glicose-induzido (linhagens LA-LD). À exceção da amostra de perfil genético A2,
caracterizada como fracamente produtora, os demais isolados do cluster não
produziram filme biológico. Paralelamente, o cluster II, composto exclusivamente por
perfis genéticos produtores de biofilme pertencentes à linhagem LE, abrangeu
64,5% (69/107) das amostras. O cluster III, por sua vez, foi formado por 5,6%
(6/107) de S. aureus estudados e, excetuada a amostra da linhagem LG,
caracterizada como fortemente produtora, todos os demais isolados das linhagens
LF e LH não produziram filme biológico.
81
Dice (Opt:1.00%) (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]PFGE
100
9590858075706560555045
90.9
81.8
90.9
95.7
93.1
92.1
87.3
84
78.1
72.8
94.1
90.4
94.1
89
94.1
85
94.1
94.1
91.2
82.6
67.5
81.8
95.7
85.1
73.5
61.9
66.7
58.9
46
40.6
Figura 7- Representação hierárquica das relações genéticas entre os perfis gerados pela técnica de PFGE e a expressão fenotípica da produção in vitro de biofilme glicose-induzido de 107 amostras de S. aureus isoladas de diversas origens; o número de isolados que representam cada perfil genético é indicado entre parênteses e os agrupamentos genéticos são indicados com a numeração I, II e III. 2009.
Por sua vez, não pertenceram aos clusters 10,3% (11/107) dos isolados,
observando-se, entre estes, predomínio de cepas não produtoras de filme biológico,
na ordem de 72,7% (8/11). S. aureus pertencentes ao perfil genético I (linhagem LI)
apresentaram fenótipo de produção de biofilme in vitro variável. A maioria das
A2 (01) B (01) C (01) A3 (01) A4 (02) A5 (03) A6 (02) A1 (04) A7 (03) A8 (01) D (02) E2 (03) E3 (01) E4 (09) E5 (02) E1 (34) E6 (01) E7 (01) E8 (01) E9 (01) E10(15) E11(01) G (01) H (01) F1 (02) F2 (01) F3 (01) I (06) J (01) K (03) L (01)
I
II
III
82
amostras desta linhagem (4/6) não produziu filme biológico, ao passo que dois
isolados foram caracterizados como fracamente produtores. A cepa pertencente à
linhagem LJ foi classificada como moderadamente produtora, enquanto as amostras
pertencentes às linhagens LK e LL não produziram biofilme (Figura 7).
De acordo com a Tabela 8, pode-se observar que 76,9% (73/95) das
amostras de S. aureus isoladas a partir de amostras de leite produziram filme
biológico glicose-induzido in vitro sob condições estáticas, enquanto 23,1% (22/95)
não produziram. Dentre as amostras produtoras de biofilme, 57,9% (55/95) foram
consideradas fortemente produtoras, 13,7% (13/95) produziram biofilme
moderadamente e 5,3% (5/95) produziram fracamente filme biológico.
Tabela 8- Perfil quantitativo e classificação quanto à produção in vitro de biofilme glicose-induzido das
linhagens de S. aureus isoladas a partir do leite de bovinos procedentes dos estados de São Paulo e Pernambuco. 2009.
Produção de Linhagem de PFGE Biofilme LE LA LI Outras* Total
No. % No. % No. % No. % No. % Forte 55 79,7 0 0 0 0 0 0 55 57,9 Moderado 12 17,4 0 0 0 0 1 14,3 13 13,7 Fraca 2 2,9 1 7,7 2 33,3 0 0 5 5,3 Não Produtora 0 0 12 92,3 4 66,7 6 85,7 22 23,1 Total 69 71,6 13 13,2 6 6,3 7 7,4 95 100
* Inclui LB, LD, LF, LJ e LL.
Resultados similares aos obtidos neste estudo foram relatados por
Vasudevan et al. (2003) e Fox et al. (2005) que relataram, respectivamente, 68,6% e
41,4% de amostras produtoras de biofilme entre S. aureus isolados a partir do leite.
Entretanto, os resultados do presente estudo divergem do comportamento fenotípico
exibido por amostras clínicas de S. aureus isoladas de humanos no Brasil, uma vez
que a grande maioria das amostras (cerca de 75%) foi classificada como fracamente
produtora (Souza et al. 2009). Os resultados do presente estudo indicam, portanto,
que amostras associadas à mastite tendem a apresentar elevada produção de
biofilme, sugerindo uma provável relação entre a ocorrência de mastite bovina e tal
fator de virulência. Entretanto, outros fatores devem estar relacionados à ocorrência
de mastite bovina, uma vez que amostras não produtoras de biofilme puderam ser
isoladas de tais processos. Também é possível que, apesar de algumas amostras
83
bovinas não terem sido capazes de produzir biofilme in vitro, o filme biológico possa
ter sido produzido in vivo.
Como verificado pela observação da Figura 7, considerando-se apenas S.
aureus isolados a partir de amostras de leite, 94,5% (69/73) das amostras
produtoras de biofilme foram agrupadas no cluster II. Todas estas amostras
pertenceram à linhagem LE - grupo predominante e amplamente distribuído nos
rebanhos de ambos os estados avaliados - e foram agrupadas com 82,6% de
similaridade, sendo a maioria (79,7%) classificada como fortemente produtora de
filme biológico (Tabela 8). Em relação aos demais quatro isolados, uma única
amostra pertenceu ao cluster I (perfil genético A2) e outras três amostras de S.
aureus (4,1%) não foram agrupadas em nenhum dos clusters (duas amostras do
perfil I e outra do perfil J) (Figura 7).
Quanto às amostras de S. aureus não produtoras de biofilme isoladas do leite,
63,6% (14/22) agruparam-se no cluster I. Todas as amostras de S. aureus
pertencentes à linhagem LA - segundo grupo de maior freqüência e observado
exclusivamente no estado de Pernambuco - agruparam-se nesse cluster com 78,1%
de similaridade. Excetuada a amostra pertencente ao perfil A2, os demais 12
isolados de amostras de leite pertencentes a essa linhagem foram classificados
como não produtores de biofilme. Outros dois isolados de amostras de leite não
produtores de filme biológico pertencentes às linhagens LB e LD também foram
agrupados no cluster I. Adicionalmente, 13,6% (3/22) das amostras de S. aureus
reuniram-se no cluster III (linhagem LF: perfis genéticos F1 e F2) e 22,8% (5/22) não
pertenceram a agrupamento algum (quatro isolados de LI e um de LL) (Figura 7,
Quadros 1 e 2).
Os resultados obtidos no presente estudo corroboram os de Fox et al. (2005),
que também verificaram a tendência de isolados caracterizados como produtores de
biofilme agruparem-se em linhagens de PFGE. De acordo com esses autores, foi
agrupada em duas linhagens aproximadamente metade das 221 amostras de S.
aureus procedentes de 45 rebanhos dos Estados Unidos submetidas à avaliação da
produção de biofilme glicose-induzido in vitro. Uma dessas linhagens incluiu a
maioria das produtoras de biofilme, sem apresentar qualquer isolado não produtor,
característica também observada na linhagem LE deste estudo. Fox et al. (2005)
também observaram que a outra linhagem principal, por sua vez, abrangeu tanto
84
amostras produtoras quanto não produtoras de biofilme, a exemplo tanto da
linhagem LI deste estudo, que abrangeu duas amostras produtoras e quatro não
produtoras de filme biológico, quanto da linhagem LA, que conteve um isolado de S.
aureus produtor de biofilme (perfil genético A2), apesar de ser formada
predominantemente por amostras não produtoras de biofilme.
À exceção da amostra de S. aureus isolada a partir da fossa nasal de
ordenhador (linhagem LG), todos os demais 11 isolados a partir da pele do úbere
bovino, insufladores e fossas nasais de ordenhadores (Quadros 1 e 2) não
produziram biofilme glicose-induzido in vitro, distribuindo-se amplamente entre os
clusters I e III e os perfis que não se agruparam (Figura 7). Apesar do reduzido
número de amostras, estes resultados corroboram com os de Fox et al. (2005).
Segundo esses autores, respectivamente, 24,7% e 14,7% das amostras de S.
aureus isoladas de pele do úbere e equipamento de ordenha mecânica produziram
biofilme. Ainda segundo os autores, a produção de biofilme constitui um fator de
risco para a infecção, já que as amostras de S. aureus isoladas a partir de leite,
quando comparadas a isolados de fontes extramamárias (pele do teto e linhas de
ordenha mecânica), apresentam-se mais relacionadas à produção de biofilme,
No presente estudo, um resultado interessante foi o fato de que, entre os
isolados de S. aureus provenientes dos equipamentos de ordenha mecânica
nenhum foi caracterizado como produtor de biofilme, pois a produção de filme
biológico figura como um importante fator de virulência em infecções estafilocócicas
associadas a catéteres intravenosos (Götz, 2002). Entretanto, as ordenhadeiras
mecânicas são, em geral, vigorosamente lavadas e sanitizadas pelo menos duas
vezes ao dia ou até mais freqüentemente. Nesse sentido, pode-se sugerir que a
lavagem freqüente do equipamento de ordenha mecânica com um detergente,
seguida de sanitização, possa prevenir o estabelecimento da colonização por S.
aureus. Nessas condições, não haveria vantagem seletiva alguma entre um clone de
S. aureus produtor de biofilme e outro não produtor. Pode-se também sugerir que
alguns S. aureus associados às ordenhadeiras mecânicas sejam colonizadores
transitórios daquele equipamento (Fox et al., 2005). Nesse sentido, estudos
anteriores demonstraram que S. aureus isolados de equipamento de ordenha
mecânica podem igualmente ser procedentes do leite ou da microbiota autóctone da
pele do úbere (Zadoks et al., 2002).
85
Na Tabela 9, ilustrada pela Figura 8, foram comparadas as capacidades de
produção de biofilme entre as linhagens de S. aureus mais frequentemente isoladas
a partir do leite de glândulas mamárias de bovinos dos rebanhos estudados em São
Paulo e Pernambuco (LE, LA e LI) com aquelas isoladas em menor freqüência,
reunidas sob a designação de outras linhagens (LB, LD, LF, LJ, LL). Conforme os
resultados da Tabela 9, ilustrados pela Figura 8, os isolados da linhagem LE
produziram significantemente mais biofilme (P < 0,001) que as demais linhagens
(LA, LI e outras).
Fox et al. (2005) mostraram que uma linhagem de PFGE, isolada a partir do
leite em cinco rebanhos, apresentou altos valores de biofilme (proporção de isolados
biofilme-positivos e valores de absorbância), quando comparada a outras linhagens.
Neste mesmo estudo, outras três linhagens de PFGE apresentaram valores de
absorbância significativamente superiores aos de outras linhagens no ensaio de
verificação da produção in vitro de filme biológico.
Tabela 9- Comparação entre as capacidades de produção in vitro de filme biológico de linhagens de
S. aureus isoladas do leite de glândulas mamárias bovinas procedentes de rebanhos de São Paulo e Pernambuco. 2009.
Produção de Linhagem de PFGE Biofilme LE LA LI Outras*
Média 2,188a,b 0,08177a 0,1317b 0,1596c Mediana 2,231 0,07a 0,1065 0,113 Erro Padrão 0,188 0,01533 0,03027 0,04392 Desvio Padrão 1,48 0,05527 0,07414 0,1162
*Outras linhagens (LB, LD, LF, LJ e LL). a,b,c P < 0,001, diferenças extremamente significantes. Kruskal-Wallis Test (Nonparametric ANOVA)
86
Linhagem E (coluna A), A (coluna E) ,Linh I(col C, outras Linh.(col D) S. aureus qprodução biofilmeMean and Standard Error
ColumnA B C D
2
1
Figura 8- Comparação entre a capacidade de produção de biofilme de S. aureus isolados a partir do leite de glândulas mamárias bovinas procedentes de rebanhos de São Paulo e Pernambuco. Linhagens de PFGE: LE (coluna A), LA (coluna B), LI (coluna C) e outras (LB, LD, LF, LJ e LL) (coluna D). 2009.
Várias infecções crônicas são associadas ao crescimento bacteriano sob a
forma de colônias aderentes envolvidas por uma ampla matriz exopolissacarídica,
constituindo um biofilme (Costerton et al., 1995; Costerton et al., 1999; Donlan,
2000). Em virtude do seu tamanho agregado, biofilmes não são susceptíveis à
fagocitose pelos macrófagos e tornam-se resistentes a alguns antibióticos (Amorena
et al., 1999; Monzon et al., 2001; Monzon et al., 2002).
A formação de biofilme requer tanto a adesão bacteriana às superfícies
sólidas promovida por proteínas de superfície, quanto o desenvolvimento de
multicamadas bacterianas e seu encerramento em uma extensa matriz
exopolissacarídica ou protéica (Baselga et al., 1993; Cucarella et al., 2001; Fox et
al., 2005; Lasa e Penades, 2006; Latasa et al., 2006; Melchior et al., 2006b;
Clutterbuck et al., 2007; O�Neill et al., 2007; Rohde et al., 2007). Essas estruturas
dificultam a ação das células fagocíticas procedentes do sistema imune e de
compostos antimicrobianos e liberam células planctônicas a partir de camadas
exteriores, permitindo a persistência de infecções bacterianas (Baselga et al., 1993;
Cucarella et al., 2001; Vasudevan et al., 2003; Fox et al., 2005; Cerca et al., 2006;
87
Chambers et al., 2006; Frank e Patel, 2006; Harraghy et al., 2006; Melchior et al.,
2006a,b; Clutterbuck et al., 2007).
Essas características parecem conferir a amostras de S. aureus responsáveis
por casos de mastite, com a habilidade de formação de biofilme, a capacidade de
aderir ao epitélio secretor glandular com maior eficiência e colonizá-lo, assim como
também a de estabelecer infecções persistentes (Baselga et al., 1993; Cifrian et al.,
1994; Aguilar et al., 2001; Arciola et al., 2001a; Cucarella et al., 2001; Vasudevan et
al., 2003; Fox et al., 2005; Melchior et al., 2006b). Isso justificaria a maior
infectividade e a maior capacidade de dispersão, inter e intra-rebanhos,
determinando verdadeiros surtos, como os observados na Fazenda A, de São Paulo,
e na fazenda 6, de Pernambuco, com relação, respectivamente, ao perfil genético
E1 e ao E10.
Maior capacidade de produção de biofilme, entretanto, não significa maior
patogenicidade, uma vez que, em relação à intensidade do processo inflamatório
avaliada pela CCS não foram observadas diferenças estatisticamente significantes
em relação às linhagens estudadas (Tabela 5, Figura 2). Por outro lado, foram
verificadas diferenças significantes (P = 0,0009) ao se analisar a CCS de amostras
de leite procedentes de glândulas infectadas por diferentes perfis genéticos (E1 e
E10) pertencentes à mesma linhagem (LE), em que E10 apresentou maior
capacidade de determinar processo inflamatório (Tabela 7).
Paralelamente, quando foi avaliada a eventual correlação entre produção de
biofilme e a CCS de glândulas infectadas por diferentes linhagens de PFGE, pela
análise de regressão linear (ANOVA) não se detectou correlação (Coeficiente (r) =
0,1374; r2 = 0,01889) conforme mostra a Figura 9, o que ilustra plenamente a
assertiva anterior.
88
Forte4.5004.0003.5003.0002.5002.0001.5001.0005000
não
prod
utor
a
9.000
8.000
7.000
6.000
5.000
4.000
3.000
2.000
1.000
0
-1.000
Coeficiente de Correlação (r) = 0,1374. r2 = 0,01889. P = 0,4383, considerado não significante. Pela análise de regressão linear (ANOVA) não foi detectada correlação entre CCS e produção de Biofilme.
Figura 9- Análise de correlação entre capacidade de produção de biofilme e CCS entre linhagens de S. aureus isolados de glândulas mamárias de bovinos leiteiros provenientes de rebanhos de São Paulo e Pernambuco. 2009.
Ao descreverem a relação entre doença, presença do lócus ica e virulência,
vários estudos (Arciola et al., 2001b; Cho et al., 2002; Vandecasteele et al., 2003a,
b; Ziebuhr et al., 1997) têm indicado que amostras bacterianas produtoras de
biofilme são mais frequentemente relacionadas a infecções clínicas que amostras
não produtoras de biofilme. Entretanto, no tocante à mastite, Cucarella et al. (2004)
observaram que quando a infecção é associada a amostras de S. aureus produtoras
de biofilme, a severidade da mastite diminui, porém a capacidade de colonização da
glândula mamária aumenta. Por isso, a formação de biofilme pode constituir uma
importante vantagem seletiva para amostras produtoras (Fox et al., 2005),
permitindo a persistência bacteriana no úbere (Baselga et al., 1993; Cucarella et al.,
2001) em virtude da forte aderência intramamária, apesar das forças que surgem
durante a ordenha (Cucarella et al., 2001).
Os resultados do presente estudo permitiram caracterizar o diagnóstico do
estágio de portador assintomático de S. aureus, bem como evidenciá-lo como fonte
de infecção potencial em rebanhos leiteiros que buscam controlar ou mesmo
89
erradicar as mastites causadas pelo microrganismo. Outras implicações da
ocorrência do estágio de portador em mastite decorrem dos riscos à saúde do
consumidor representados pela veiculação deste agente etiológico, em virtude da
capacidade de produção de enterotoxinas e da resistência aos antimicrobianos.
Os resultados deste estudo também indicam que vacas com baixa CCS
(<200x103 células/mL) representam uma fonte de infecção da bactéria com
capacidade de formar filme biológico, uma vez que a maioria das amostras de S.
aureus isoladas de glândulas mamárias portadoras assintomáticas pertenceu ao
perfil genético E1 (Quadro 3), o qual foi composto predominantemente por cepas
classificadas como fortemente produtoras de biofilme. Essas características
permitem, portanto, a persistência de isolados de baixa patogenicidade primária no
rebanho e impossibilitam a erradicação de S. aureus em rebanhos que utilizam a
CCS como ferramenta de diagnóstico.
A produção de biofilme, conforme exposto anteriormente, confere a S. aureus
maior capacidade de adesão aos tecidos mamários e maior persistência na glândula
mamária. Entretanto, embora o estágio de portador de S. aureus seja caracterizado
por perfil genético com maior capacidade de persistência na glândula mamária -
provavelmente relacionada à forte capacidade de produção de biofilme e menor
virulência -, é possível também aventar a hipótese de que tal ocorrência possa
residir na capacidade de resistência do hospedeiro à evolução do processo em
decorrência de suas características genéticas e/ou imunológicas.
Com relação a esse aspecto, Cucarella et al. (2004) observaram que os
valores de CCS de 13,5% dos animais infectados com S. aureus (ica+, bap+) e 22%
dos animais infectados com isolados (ica+, bap-) foram tão baixos que nenhuma
evidência foi obtida com base no diagnóstico por CCS (<200x103 células/mL). Estes
resultados indicaram, portanto, a existência de vacas naturalmente infectadas com
S. aureus produtores de biofilme que não poderiam ser identificadas como animais
infectados por métodos indiretos clássicos como CCS. Este problema foi
demonstrado pelo isolamento do mesmo tipo clonal de S. aureus em duas ordenhas
consecutivas do mesmo animal. Ainda segundo Cucarella et al. (2004), esta situação
causou importantes consequências na produção de leite do rebanho, pois o controle
da mastite inadvertidamente permitiu a incorreta classificação das vacas como não-
infectadas, quando de fato elas eram infectadas com S. aureus produtores de
90
biofilme. Esses microrganismos permaneceram não detectados no úbere e as vacas
infectadas não foram submetidas à terapia antimicrobiana, permitindo-se a
distribuição e persistência da mastite no rebanho com consequentes perdas na
produção. A baixa CCS associada à alta capacidade de colonização da glândula
mamária por alguns isolados ica e bap positivos também sugere reduzida produção
de toxinas durante essas infecções, uma vez ser amplamente aceito que a infecção
da glândula mamária por cepas altamente toxigênicas promove a migração de
neutrófilos para o lúmen alveolar, elevando consequentemente a CCS no leite e a
severidade da mastite.
Cucarella et al. (2004) também concluíram que S. aureus produtores de
biofilme podem ser incapazes de causar inflamação significante (aporte de
neutrófilos para o leite superior a 200x103 células/mL). Entretanto, os resultados
obtidos no presente estudo mostraram que isolados pertencentes ao perfil genético
E1, fortemente produtores de biofilme, determinaram não apenas o estágio de
portador assintomático, como referido anteriormente, mas também causaram
manifestações clínicas e subclínicas, caracterizadas por elevadas CCS (Quadros 1 e
2).
De acordo com os resultados deste estudo, o fato de os quartos mamários
portadores assintomáticos serem predominantemente infectados por S. aureus
fortemente produtores de biofilme (Quadro 3: perfis E1 e E10), embora explique
plenamente a persistência destes perfis genéticos nas glândulas mamárias, por
outro lado reforça a tese de que a produção de biofilme não corresponde a uma
maior patogenicidade. Tais observações demonstram a necessidade da realização
de mais estudos sobre outros potenciais fatores de virulência associados à
patogenia da mastite causada por este microrganismo.
Considera-se pelos resultados obtidos no presente estudo que as amostras
de S. aureus pertencentes à linhagem LI constituiriam material excelente para este
tipo de avaliação, uma vez que elas foram caracterizadas como não produtoras ou
fracamente produtoras de biofilme, porém isoladas a partir de glândulas mamárias
com mastite subclínica e altas CCS (mediana de 1678x103 células/mL de leite, de
acordo com a Tabela 5). Além disso, o fato de S. aureus ser caracterizado como
forte produtor de biofilme também não exclui a capacidade de produzir
manifestações clínicas, uma vez que entre três glândulas mamárias, dentre as
91
quatro com mastite clínica observadas neste estudo, estavam infectadas com S.
aureus pertencentes ao perfil genético E1, sendo dois fortemente produtores de
biofilme e um de produção moderada. A quarta glândula mamária com mastite
clínica estava infectada por perfil genético A3, não produtor de biofilme, com CCS
igual a 9798x103 células/mL.
De fato, a habilidade do S. aureus de causar doenças em seres humanos e
animais tem sido atribuída à capacidade de esse microrganismo produzir uma
variedade de potenciais fatores de virulência, os quais variam entre as diferentes
cepas. Provavelmente, algumas combinações de determinados fatores sejam mais
importantes do que outras na patogênese de diferentes processos infecciosos ou de
estágios destes processos, assim como em infecções em diferentes espécies de
hospedeiro. A virulência do S. aureus depende, portanto, de fatores como produção
de exotoxinas, proteínas de superfície e exopolissacarídeos (Aguilar et al., 2001).
Nesse sentido, Cabral et al. (2004), utilizando a técnica de PFGE,
genotiparam 87 amostras de S. aureus isoladas de casos de mastite e avaliaram,
por meio de PCR, a presença de genes codificadores de proteínas de superfície,
exoproteínas e três classes de genes agr. Os resultados obtidos pelos
pesquisadores sugeriram que algumas linhagens de S. aureus possuem uma
combinação de genes que a elas conferem a propensão para causar e disseminar a
infecção. Recentemente, Rabello (2007), utilizando a PCR, avaliou 227 amostras de
S. aureus isoladas de mastite bovina quanto à presença de quarenta e dois genes
de virulência. Todas as amostras avaliadas apresentaram o gene icaA. Além disso,
grande parte das amostras apresentou genes para hemolisinas, leucotoxinas,
adesinas e cápsula e em 35,7% dos S. aureus foram detectados pelo menos um dos
genes que codificam a produção de toxinas superantígenos. Rabello (2007),
entretanto, apesar de ter pesquisado a presença de genes relacionados à produção
de filme biológico não avaliou a expressão fenotípica de produção de biofilme.
92
4.5 Ensaio de PCR para a pesquisa do gene icaA relacionado à produção de
biofilme em S. aureus
No presente estudo, todas as 107 amostras de S. aureus avaliadas no ensaio
de produção de biofilme in vitro, inclusive a amostra utilizada como controle-positivo,
foram avaliadas no ensaio de PCR e amplificaram o fragmento esperado de 701 pb
referente ao gene icaA (Cruz, 2008). Na Figura 10 estão apresentadas 13 das 107
amostras de S. aureus avaliadas em gel de eletroforese, oriundas de casos de
mastite nas Fazendas A, B e P do estado de São Paulo. Se esses resultados, por
um lado, corroboram os de Cramtom et al. (1999), Fowler et al. (2001) e Moore e
Lindsay (2001) � que, utilizando PCR e técnicas de hibridização, detectaram o lócus
ica em todas as amostras de S. aureus�, divergem, por outro, dos relatos de Arciola
et al. (2001a), Cucarella et al. (2004) e Melchior et al. (2009) que identificaram o
lócus ica em, respectivamente, 61%, 94,36% e 74% das amostras de S. aureus
avaliadas.
A análise da relação entre o genótipo ica e a formação de biofilme utilizando
diferentes métodos tem gerado resultados contraditórios por diferentes grupos de
pesquisa. Cramtom et al. (1999) e Fowler et al. (2001) caracterizaram 25 amostras
de S. aureus que foram positivas à pesquisa do lócus ica utilizando-se PCR. Apenas
quatro destes isolados foram considerados produtores de filme biológico no ensaio
em placa de cultura de tecidos, enquanto a maioria dos isolados foram biofilme-
negativos. Desse modo, uma vez que a formação de biofilme sobre placas de cultura
de tecido parece ser susceptível a condições in vitro, uma combinação de métodos
fenotípicos e genotípicos deve ser empregada para a pesquisa de formação de
biofilme em isolados de S. aureus (Fox et al., 2005). De acordo com O�Gara (2007), o lócus ica é o mais bem compreendido
mecanismo de formação de biofilme em estafilococos e é encontrado na maioria dos
isolados clínicos procedentes de humanos e de mastite bovina. Entretanto, a
detecção deste elemento genético nas amostras de S. aureus nem sempre é
acompanhada pela expressão fenotípica de filme biológico sob condições in vitro
(Cramtom et al., 1999). Vasudevan et al. (2003) relataram que 24 das 35 amostras
de S. aureus isoladas de casos de mastite produziram biofilme in vitro, apesar de
93
todos os 35 isolados terem apresentado os genes icaA e icaD. Similarmente, em
estudo conduzido por Knobloch et al. (2002), detectou-se por PCR o gene icaA em
todas as 128 amostras de S. aureus avaliadas, entretanto, no ensaio para
verificação da produção in vitro de biofilme glicose-induzido em placa de cultura de
tecidos, apenas 49 (38,3%) das amostras avaliadas foram consideradas produtoras
de filme biológico. No presente estudo, 69,2% (74/107) das amostras de S. aureus
avaliadas foram classificadas como produtoras de biofilme. Segundo Vasudevan et
al. (2003), a presença do lócus ica em todos os isolados de S. aureus procedentes
de casos de mastite confirma seu potencial papel como fator de virulência na
patogênese da mastite em ruminantes.
Figura 10- Produtos de PCR em ensaio para avaliação do genótipo icaA em 13 amostras de S. aureus isoladas de casos de mastite bovina. Linha M: 100 pb DNA Ladder; Linha 01: cepa BMB 9393, isolado representativo do Clone Epidêmico Brasileiro, utilizada como controle positivo (amplicom de 701 pb); Linhas 02-14: amostras de S. aureus; Linha15: água Milli-Q estéril + mix PCR utilizada como controle negativo. 2009.
Cramtom et al. (1999) observaram que amostras de S. aureus, apesar de
possuírem o lócus ica, podem falhar quanto à produção de biofilme in vitro. Esses
autores também observaram que a formação de biofilme sobre superfícies inertes é
altamente sensível às condições de crescimento. Anteriormente, Baselga et al.
M 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15
700 pb
94
(1993) e Christensen et al. (1987) haviam sugerido que a expressão fenotípica da
formação de biofilme é altamente sensível a condições in vitro. Em virtude do
exposto, Cramtom et al. (1999) sugeriram que falhas na produção de biofilme in vitro
por amostras de S. aureus que possuem o lócus ica poderiam ocorrer devido a
pontos de mutação no lócus e/ou a fatores ainda não identificados que regulam
negativamente a produção de adesina polissacarídica intercelular (PIA) ou que
influenciam a formação de biofilme. Um ano mais tarde, Mack et al. (2000)
descreveram a existência de três loci que exercem influência regulatória direta ou
indireta sobre a expressão de genes que codificam a síntese de PIA em nível de
transcrição.
Sabe-se atualmente que a produção de biofilme é influenciada pela presença
de glicose, ferro, Ca2+, Mn2+ e EDTA, assim como pelo pH, osmolaridade,
temperatura e concentrações de oxigênio e carbono (Beeken et al., 2003; Arrizubieta
et al., 2004; Brouillette et al., 2005; Johnson et al., 2005; Karaolis et al., 2005;
Melchior et al., 2006b).
Também tem sido mostrado que a expressão do operon icaADBC constitui
fator altamente variável, modulado por mecanismos genéticos, a exemplo da
variação de fase (Ziebuhr et al., 1999). O fenômeno da variação de fase foi descrito
inicialmente por Baselga et al. (1993) em S. aureus isolados de casos de mastite.
Este estudo descreveu diferenças entre S. aureus produtores e não produtores de
biofilme cultivados em placas de Ágar Vermelho do Congo. Com repiques
sucessivos foi possível converter amostras não produtoras de filme biológico em
produtoras e vice-versa. Amostras de S. aureus produtoras de biofilme mostraram
capacidade de colonização significativamente aumentada, enquanto isolados não
produtores produziram sintomas agudos. Os mecanismos e a regulação da
produção de biofilme não eram conhecidos na ocasião, porém a relevância clínica
dessas diferenças foi evidente.
Vários pesquisadores têm sugerido que a expressão variável da formação de
biofilme contribui para a adaptação da bactéria a mudanças de condição ambiental e
possivelmente também para evasão do sistema imune do hospedeiro (Ziebuhr et al.,
1999; Rachid et al., 2000; Ziebuhr et al., 2000). Nesse contexto, a patogênese da
mastite, onde sintomas clínicos são frequentemente precedidos e seguidos por
manifestação subclínica, é muito similar aos sintomas descritos em doenças
95
infecciosas em humanos e associados à produção de biofilme pelo agente
etiológico. A variação de fase, entre crescimento planctônico e em biofilme, é
causada por adaptação genética e apresenta bactérias menos invasivas e menos
susceptíveis aos mecanismos de defesa do hospedeiro e à intervenção terapêutica
(Melchior et al., 2006b).
Diferentes modelos de formação de filme biológico bacteriano sugerem que a
geração de variantes biofilme-negativos é importante para o desligamento de
unidades de células bacterianas de um agregado e para a manutenção da estrutura
do biofilme, assim como para a evasão do sistema imune do hospedeiro (Costerton
et al., 1995). Variantes biofilme-negativos podem disseminar-se por novos habitats e
um possível retorno ao fenótipo de produção de biofilme em estágio tardio da
infecção pode torná-las capazes de formar novos biofilmes. Dessa forma, tal
mecanismo pode contribuir para o desenvolvimento de infecções crônicas (Cho et
al., 2002).
Outro importante aspecto que vale a pena ser mencionado é o fato de que
uma amostra de S. aureus caracterizada como não produtora in vitro de biofilme,
pode produzi-lo sob condições in vivo. Quanto a este aspecto, McKenney et al.
(1999) observaram alta expressão da adesina polissacarídica capsular (PS/A) in vivo
quando comparada a condições in vitro e sugeriram, portanto, que a expressão
fenotípica do lócus ica varia também nestas condições.
96
5 CONCLUSÕES
A técnica de PFGE apresenta maior poder discriminatório quando comparada
às demais técnicas de tipagem baseadas em PCR, mesmo quando utilizadas
conjuntamente, o que a ratifica como a técnica considerada padrão-ouro. Por ela
observou-se considerável multiplicidade de clones de S. aureus dentro dos
rebanhos, uma vez que foram diagnosticados três a sete diferentes perfis genéticos,
agrupados em uma a quatro linhagens, em cada uma das fazendas analisadas.
Algumas das linhagens de S. aureus evidenciadas por PFGE apresentaram
ampla distribuição geográfica, considerando-se os rebanhos e as regiões estudadas.
Entre as diferentes linhagens de S. aureus detectadas, um pequeno número foi
responsável pela maioria dos casos de mastite. A linhagem (LE) caracterizou-se
como predominante e amplamente disseminada tanto entre rebanhos localizados na
mesma região, quanto em regiões geograficamente distintas.
Não foi detectada correlação entre linhagens de PFGE e CCS. Ao se
compararem os dois perfis genéticos, pertencentes à linhagem predominante, com
maior freqüência de isolamento, observou-se diferença quanto à capacidade de elidir
o processo inflamatório aferido pela CCS.
Ao se analisar um mesmo perfil genético de S. aureus, verificou-se que este
foi isolado a partir de diferentes intensidades do processo inflamatório - mastite
clínica e subclínica � e a partir do leite de glândulas portadoras assintomáticas.
Esses fatos permitiram concluir que, em relação à mastite por S. aureus, a
intensidade do processo inflamatório não está restrita aos fatores de virulência
próprios do patógeno, mas também, como verificado em outras afecções, à
interação parasita � hospedeiro.
O isolamento de S. aureus pertencente ao mesmo perfil genético em
insufladores e a partir de amostras de leite reflete o papel do equipamento de
ordenha como possível via de transmissão na mastite bovina no rebanho. O mesmo
pode ser inferido em relação à pele do úbere.
97
Isolados de S. aureus de origem humana e animal constituíram populações
geneticamente distintas, portanto, no presente estudo, não se obteve evidências de
transmissão cruzada a partir de portadores humanos.
Caracterizou-se o estágio de portador assintomático de S. aureus na mastite
bovina com base em evidências epidemiológico-moleculares, uma vez que houve
sucessivo e repetido isolamento de um mesmo perfil genético (E1) da mesma
glândula mamária por intervalo de tempo prolongado.
Observou-se multiplicidade de perfis dos genes que codificam a produção de
coagulase e proteína A entre as amostras de S. aureus avaliadas.
A análise de produção in vitro de biofilme glicose-induzido permitiu que
fossem evidenciados três agrupamentos genéticos gerados por PFGE que
apresentaram relação com o fenótipo da produção de biofilme, sendo que cerca de
g95% das amostras produtoras de biofilme pertenceram à linhagem LE e se
concentraram num mesmo agrupamento (cluster II).
Não foi detectada correlação entre produção de biofilme e a CCS de
glândulas infectadas por diferentes linhagens de PFGE.
A presença do lócus ica em todos os isolados de S. aureus procedentes de
casos de mastite confirma seu potencial papel como fator de virulência na
patogênese da mastite em bovinos.
A habilidade de formação de biofilme confere maior capacidade de aderir-se
com eficiência ao epitélio secretor glandular, de colonizá-lo, assim como de
estabelecer infecções persistentes, o que justificaria a maior infectividade e maior
capacidade de dispersão, inter e intrarrebanhos, determinando verdadeiros surtos
como verificado pelo perfil E1 em uma das fazendas estudadas.
98
A constatação de que quartos mamários portadores assintomáticos foram
predominantemente infectados por S. aureus fortemente produtores de biofilme,
justifica plenamente a persistência desses perfis genéticos nas glândulas mamárias
e reforça a tese de que a produção de biofilme não confere uma maior
patogenicidade. Há, portanto, necessidade da realização de estudos sobre outros
fatores de virulência associados à patogenia da mastite causada por este
microrganismo.
Glândulas mamárias portadoras assintomáticas representam importante fonte
de infecção de S. aureus com capacidade de formar filme biológico e permitem a
persistência do patógeno no rebanho, impossibilitando sua erradicação em fazendas
onde se utiliza CMT e CCS como ferramentas de diagnóstico e controle de mastite.
99
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121
ANEXO Soluções de trabalho
Tampão EC
Tris 6 mM, pH 7,5 1,5 mL de Tris 1 M, pH 8,0
1,5 mL de Tris 1 M, pH 7,0
NaCl 1M 29,22 g de NaCl
EDTA 100 mM, pH 7,5 5 mL de EDTA 0,5 M, pH 8,0
Brij 58 0,5% 2,5g de Brij 58 (acetil éter de
polioxietileno 20)
Desoxicolato de sódio 0,2% 1 g de desoxicolato de sódio
Sarcosil 0,5% 2,5 g de N-lauril sarcosil de sódio
Ajustar o pH para 7,5
Completar o volume para 500 mL com água Milli-Q estéril.
Esterilizar por filtração.
Tampão ES
EDTA 0,4 M, pH 9,3 40 mL de EDTA 0,625 M, pH 9,3
Sarcosil 1% 10 mL de sarcosil 5%
Preparar no momento de uso em quantidade suficiente.
Esterilizar por filtração.
Tampão CHEF TE
Tris 0,1 M, pH 7,5 2,5 mL de Tris 1 M, pH 8,0
2,5 mL de Tris 1 M, pH 7,0
EDTA 0,1 M, pH 7,5 5 mL de EDTA 0,5M, pH 8,0
5 mL de EDTA 0,5M, pH 7,0 Completar o volume para 500 mL com água Milli-Q estéril.
Esterilizar por filtração.
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Tampão DNS
Tris 0,1 M, pH 8,0 5 mL de Tris 1M, pH 8,0
MgCl2 5 mM 250 µL de MgCl2 1 M
Completar o volume para 50 mL com água Milli-Q estéril.
Preparar no momento do uso. Esterilizar por filtração.
