Genética Molecular e Citogenética - Sebenta

Gentica Molecular e Citogentica (GMC) 2010/2011Ana Cristina Ribeiro Gomes

Gentica Molecular e Citogentica (2010-2011)

Ana Cristina Ribeiro Gomes

CITOGENTICA Teoria Cromossmica da HereditariedadeTeoria Cromossmica da Hereditariedade Citogentica rea da gentica que faz a ligao com a citologia. Cromossoma sede fsica das informaes hereditrias. Corresponde, assim, a um corpsculo corado (por definio). Os loci: Esto dispostos linearmente ao longo de cada cromossoma. De cromossomas diferentes, transmitem-se independentemente. Situados no mesmo cromossoma transmitem-se com um grau de dependncia mtua que resulta da sua maior ou menor vizinhana. Provas da Teoria Ncleo possui cromossomas, nos quais se encontra toda e qualquer informao hereditria de um indivduo. Ocorre a sobreposio dos postulados mendelianos com a teoria cromossmica da hereditariedade (grau de dependncia). O nmero de cromossomas corresponde ao nmero de grupos de ligao. O nmero e os tipos de cromossomas esto associados a uma determinada espcie, ou seja, existe uma correspondncia entre o caritipo, o nmero e os tipos de cromossomas associados a determinada espcie. Uma alterao ao nvel dos cromossomas implica alteraes fenotpicas. O fentipo de portadores de mutaes cromossmicas diferente do fentipo dos indivduos da mesma espcie. A transmisso ligada ao sexo corresponde transmisso feita atravs dos cromossomas sexuais.

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CITOGENTICA Cromatina e CromossomaMitose e Meiose Mitose: clulas de linha somtica. Diviso conservativa.4 3 2 1 0 G1 S G2 M DNA / NcleoMitose Fase G1 Fase S

A1 A2G1

A1 = A2 A 1 A2 A1 A1 A2 A 2 A1 A2

Meiose: clulas de linha germinativa. Diviso de variao (na profase I no necessrio Meiose I existem 2 o conhecimento das vrias fases, para esta disciplina).Em G1 encontramse clulas como oognias ou espermatognias.

4 3 2 1 0 G1 S M1

DNA / Ncleo

Fase G1

Fase S

Meiose I

Meiose II A1 A1 A2 A2

cpias das 2 cromtides, logo continua um diplide Meiose II - Haplide

A1homlogo

A1 A1

M2

A2 A1 A2 A1 A1 A2 A2A2 A2

Mitose No emparelhamento de homlogos No ocorrncia de entrecruzamentos Diviso de centrmeros em anafase Conservao

Meiose Sinapse dos cromossomas homlogos em Profase I Entrecruzamentos entre pares de homlogos Diviso de centrmeros apenas em anafase II Variao

Fases da Mitose Profase incio da condensao dos cromossomas. O ncleo desorganiza-se e a sntese proteica pra. Fora do ncleo, a rede de microtbulos que existia em interfase substituda pelo fuso mittico. Prometafase ruptura abrupta do invlucro nuclear, com o desaparecimento da lmina nuclear (fosforilao das laminas). Continuao da condensao dos cromossomas. Metafase cromossomas alinham-se no centro da clula, formando a placa equatorial. o momento onde h a condensao mxima dos cromossomas, e onde cada um dos cromatdios se liga a microtbulos plos opostos do fuso. Nesta fase existem foras bipolares equilibradas que mantm os cromossomas na placa equatorial. Anafase separao dos cromatdios que so arrastados para os plos. No fim desta fase inicia-se a citocinese. Anafase A encurtamento dos microtbulos do cinetocoro e movimento dos cromatdios para os plos; Anafase B afastamento dos plos provocada pelo alongamento dos microtbulos polares. Telofase invlucro nuclear reorganiza-se e os cromossomas comeam a descondensar-se.

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Fases da Meiose Profase I cromossomas duplicados comeam a condensar-se; incio da sinapse e ocorre o crossing-over; desaparecimento do complexo sinaptonmico; pontos de quiasmata visveis; bivalentes prontos para a metafase. Metafase I cromossomas homlogos alinham-se na placa equatorial, atravs dos pontos de quiasmata. Anafase I pares homlogos separam-se com os cromatdios ainda juntos. Ou seja, migram 2 cromatdios (1 cromossoma), com constituies diferentes, para cada um dos plos. Telofase I formam-se duas clulas-filhas, cada uma contendo 1 cromossoma do par de homlogos. Profase II no h replicao do DNA. uma fase que pode no ocorrer para no existirem grandes gastos de energia. Recondensao dos cromossomas. Metafase II cromossomas alinham-se na placa equatorial, atravs dos centrmeros. Cada par de cromatdios alinha-se na placa equatorial, de cada clula. Anafase II dividem-se os centrmeros e cada cromatdio, do mesmo cromossoma, migra separadamente para cada plo. Os cromatdios so separados, originando clulas com arranjos genticos diferentes devido ao crossing-over ocorrido na profase I. Telofase II concluso da diviso da clula. Originam-se 4 clulas-filhas. Existe a organizao nuclear de cada clula, originando-se 4 clulas com um ncleo que possui um nmero haplide de cromossomas. Meiose em Mamferos A meiose para a formao dos gmetas femininos e masculinos, constitui uma excepo ao processo de meiose normal. Os precursores dos espermatozides formam 4 espermtides, onde cada uma delas evolui para um espermatozide. Assim, este um processo de meiose normal pois de 1 clula, de 2n cromossomas, vo ser formadas 4 clulas, de n cromossomas, possuindo este mecanismo um alto rendimento. No entanto, nas fmeas (cuja meiose comea no estado embrionrio) durante a primeira diviso meitica, da sua oognese, formam-se duas clulas: uma delas constitui o primeiro glbulo polar (que pode sofrer mitose) e a outra constitui uma clula que vai continuar para a segunda diviso meitica. Essa clula ento vai passar pela segunda diviso meitica, originando um ocito II e o segundo glbulo polar (apenas quando ocorre a fecundao). Assim, na formao de gmetas femininos apenas se forma, no final, uma nica clula, que na realidade nunca chega realmente a ficar haplide (necessita da fecundao de um espermatozide para completar a meiose). Os glbulos polares acabam por degenerar.

Clula Precursora

1 ocito secundrio

Clula Precursora

4 espermatozides

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Cromatina Cromatina possui dois tipos consoante o seu grau de condensao, que tm como base a actividade de transcrio do mRNA. Eucromatina cromatina activa, descondensada, que corresponde s regies do genoma capazes de realizar transcrio. uma zona sensvel DNAse. Heterocromatina mantm o grau de condensao durante todo o ciclo celular. visvel no ncleo em interfase (crommeros heterocromatina na interfase que continua bastante condensada). As suas funes esto ainda mal estudadas, mas pensa-se que podero participar no emparelhamento, recombinao, segregao e, tambm, na estabilizao e proteco de certas regies cromossmicas. Na heterocromatina ainda se consideram outros dois tipos: Facultativa estado de condensao varivel em tipos diferentes de clulas e durante a fase precoce do desenvolvimento, ou seja, no est sempre ultracondensada. Pensa-se que poder ter origem em eucromatina que se inactivou. Os mamferos, pelo menos, at ao sexto ms de vida tm este tipo de heterocromatina. Constitutiva localizada em posies idnticas, nos cromossomas homlogos, de todas as clulas e de forma permanente, ou seja, aparece sempre ultraconcentrada. O DNA muito repetitivo e muito rico em adenina-timina. Dentro de uma mesma espcie este tipo de heterocromatina igual de indivduo para indivduo. Cromossoma Metafsico necessrio que os cromossomas estejam condensados, para os conseguirem estudar, uma vez que o momento onde os cromossomas no se encontram to repulsivos entre eles e a altura em que se encontram mais condensados. Desta forma, pode-se estudar a sua constituio, forma e anomalias que, eventualmente, possam surgir. O cromossoma metafsico possui uma forma muito tpica, constitudo por 2 cromtides, 1 centrmero (que se dividem longitudinalmente na Anafase) e 2 telmeros. Para alm de DNA, na sua constituio, possuem, tambm, algumas protenas cidas (muito raras) e algum RNA mensageiro.Cromossoma metafsico Fibrila mais pequena Enrolamento em protenas bsicas (histonas) ou cidas (raras)

Cromtides

Fibrila

Nucleossoma

Cadeia de DNA

Cromossoma conjunto de fibras de DNA com protenas, as quais se enrolam, por sucessivos empacotamentos / enrolamentos, sobre si mesmo. Estrutura Molecular do Centrmero O centrmero possui uma variao considervel conforme as espcies. Esta estrutura tem de possuir a capacidade de reconhecimento dos microtbulos para que consiga ocorrer a ascenso de material, para os plos. Cromossomas holocntricos sequncias centromricas dispersas ao longo do cromossoma (centrmero difuso), ou seja, possuem vrios pontos de ligao. Os microtbulos unem-se ao longo de todo o comprimento, de cada cromtide (fragmentao com raios X). 4



Centrmeros localizados com uma nica regio que se une aos microtbulos. Podem ser constitudos por centenas de Kb de DNA (centrmeros regionais) ou por um reduzido nmero de pares de bases (centrmeros pontuais). Os eucariotas superiores possuem regies centromricas que contm grandes quantidades de heterocromatina. Estrutura Molecular do Telmero Telmero extremidade de cada cromtide que est associada morte celular programada. So regies terminais do cromossoma que formam uma espcie de cpsula, porque contm sequncias especficas repetitivas (ricas em guanina). So importantes para determinar a vida da clula, pois decide quantas vezes se replica. O DNA telomrico nos vertebrados possui uma repetio em tandem de 5-TTAGGG-3. Em cada diviso celular, o telmero vai ficando mais pequeno o que induz a sua prpria morte, nas clulas normais, ocorrendo uma perda de 50 200 nucletidos / ciclo mittico. Isto ocorre pois a telomerase est ausente nas clulas somticas normais, no entanto, expressa a sua actividade em clulas tumorais. Assim, em clulas cancerosas a existncia de telomerase faz com que as extremidades, que se vo perdendo em cada ciclo, sejam acrescentadas pela mesma, impedindo que ocorra essa morte programada das clulas, permitindo a sua multiplicao indefinida. Tipos de Cromossomas Metafsicos Os cromossomas metafsicos classificam-se consiante a posio do centrmero em relao aos telmeros. Cromossoma metacntrico o centrmero encontra-se no centro do cromossoma (centrmero ao meio). Os braos do cromossoma possuem o mesmo tamanho. Cromossoma submetacntrico o centrmero encontra-se acima do centro do cromossoma, ou seja, est mais perto de uma das extremidades. O cromossoma possui 2 braos grandes mas de diferente tamanho entre si, sendo um dos braos mais curto que o outro. Cromossoma acrocntrico o centrmero encontra-se muito acima do centro do cromossoma, estando praticamente na sua extremidade. O cromossoma possui 1 brao mesmo muito pequeno (extremamente pequeno) e outro muito grande. Cromossoma telocntrico o centrmero constitui um dos centrmeros. O cromossoma s possui um brao, ou seja, o telmero e o centrmero constituem uma das extremidades do cromossoma.

Identificao de Cromossomas Metafsicos Existem tcnicas para as bandas escuras e claras, dos cromossomas, serem identificadas. Existe, ento, uma nomenclatura para reconhecer esses cromossomas. Simbologia: p (brao curto); q (brao longo). Banda as regies dividem-se em bandas. Quando o nmero de uma banda 0, ento essa regio constitui um marco. Marco local onde se dividem as regies, logo vai pertencer a 2 regies em simultneo, pois o limite de ambas. Podem ser telmeros, centrmeros, constries e, por vezes, certas bandas que so mais escuras e que se vem facilmente. Assim sendo, so os locais do cromossoma que se conseguem identificar com mais facilidade. 5



Regio espao de cromatina situado entre 2 bandas seguidas. As vrias regies distinguem-se em reunies internacionais. 8 q 2 4 . 2Nmero do cromossoma Sub-Banda Regio Banda Brao

O nmero de pares de cromossomas no est relacionado com a escala de evoluo, logo varia muito consoante espcies diferentes, e por vezes no mesmo grupo, podendo ser apresentados saltos devido a duplicaes do nmero de cromossomas, o que d origem a seres muito diferentes, que constituem uma nova espcie (hbridos que se tornam frteis). Cromossoma Y na sua maioria constitudo por heterocromatina no codificante: Cromossomas Sexuais Sistemas cromossmicos de determinao do sexo: XX (homozigtico), XY (heterozigtico) Drosophila, Mamferos; WZ (heterozigtico), WW (homozigtico) aves, alguns peixes, traa; XX (homozigtico), X0 (hemizigtico) muitas espcies de insectos. Cromossoma Y no Homem, constitudo por 2 regies pseudo-autossmicas (homlogas ao cromossoma X e que so importante no emparelhamento). Cromatina Sexual Estudando o sistema nervoso dos gatos, descobriu-se a cromatina sexual (Barr, 1949). Verificou-se que, no sexo feminino, aparecem estruturas (cromatina sexual / corpsculos de Barr). Desta forma, a investigao foi expandida a clulas sexuais. Esta cromatina sexual um tipo de heterocromatina facultativa. Hiptese de Lyon: Fmeas de mamferos mosaicos na expresso dos 2 cromossomas X. At cerca do 16 dia, os dois cromossomas X esto funcionais. A cerca do 16 dia ocorre a precipitao de 1 dos cromossomas X; Durante a gametognese ocorre a reactivao do cromossoma X condensado (heterocromatina facultativa). Na presena de 2 cromossomas X, ocorre a precipitao de determinadas zonas, que inactivam essas regies, e assim, apenas 1 cromossoma que se encontra activo. Os 2 cromossomas X apenas esto activos, em simultneo, no momento do zigoto. A escolha da inactivao aleatria, logo a precipitao feita tanto do X materno como do X paterno. Assim, haver clulas nas quais o X materno que est activo e outras nas quais o X paterno o activo. Exemplos: Hemofilia existe apenas metade da produo da protena, em mulheres heterozigticas (Hh apenas da protena antihemoflica esta protena suficiente para que se mantenha o equilbrio, promovendo assim a ausncia de mulheres hemoflicas). G-6-PD em cultura existem clones com produo de uma variante e outros clones com a produo da outra variante. Mula o cavalo e o burro possuem G-6-PD diferentes. Existem clones produzindo apenas a enzima tpica de uma das espcies, de cada vez. Este fenmeno de inactivao tambm acontece quando um indivduo possui 3 cromossomas sexuais, onde existem 2 corpsculos de Barr, favorecendo a concluso de que em todas as fmeas, apenas existe 1 nico cromossoma X activo, independentemente da situao cromossmica, desde que possua 2 ou mais cromossomas X. 6

Centrmero Heterocromatina



Quando apenas existe 1 cromossoma X (como nos gentipos X0, XY, XYY) no h formao de cromatina sexual. Lei de Ohno O cromossoma Y foi miniaturizado, variando apreciavelmente entre 2 espcies prximas evolutivamente. No entanto, a evoluo do cromossoma X tem sido muito mais conservativa, devido ao seu mecanismo de inactivao que o preservou intacto, ao longo da evoluo dos mamferos. Nem todo o cromossoma X permanece inactivo. Alguns genes localizados na extremidade do brao curto esto sempre activos. H portanto uma inactivao selectiva. Cromossoma Y O cromossoma Y (com poucas regies codificantes) possui o gene TDF no brao curto. TDF zona do cromossoma Y que bastante importante para o desenvolvimento do sexo masculino. Induz a produo de testosterona, que leva produo dos ductos Wolfianos, originando, assim, o desenvolvimento de um embrio do sexo masculino. Na ausncia do cromossoma Y, no existe o inibidor Mlleriano, e logo desenvolve-se um embrio do sexo feminino. Este gene constitui a nica diferena entre sexos, sendo a nica poro, muito pequena, que faz toda a diferena no desenvolvimento embrionrio. Quando no existe esta regio, no cromossoma Y, desenvolve-se um embrio do sexo feminino, por muito que o seu caritipo seja XY. Quando o X tem essa regio, desenvolve-se um embrio do sexo masculino, por muito que o seu caritipo seja XX. Cromossomas Politnicos (Gigantes) Os cromossomas politnicos so grandes em comprimento e espessura. Estes formamse quando as cromtides, em determinadas divises, no se separam totalmente, e vo sendo duplicadas sucessivamente, ou seja, no ocorre diviso celular nem nuclear completa. Cada cromossoma est fortemente ligado ao homlogo e o DNA replicado diversas vezes, excepto no centrmero e telmero. As bandas existentes so diferentes das bandas dos cromossomas humanos pois no necessitam de qualquer tipo de colorao para serem observadas. Correspondem, na realidade, a regies mais condensadas (escuras) e mais laxas de cromatina (clara). Forma-se, assim, um padro de bandas e inter-bandas (escuras e claras, respectivamente) devido forma como o DNA se encontra compactado e descompactado, ao longo de todo o seu comprimento. Constituem numerosas fibrilas (cromtides) at 2000 ciclos de endorreduplicao. O padro de bandas (alternncia de bandas) formado especfico para cada cromossoma, devido concentrao desigual de fibrilas de cromatina, ao longo de um cromossoma. Os puffs (zonas de dilatao associadas sntese de RNA) ou anis de Balbiani so expanses do cromossoma, comuns de se observar nas biopsias de determinados carcinomas, assim, os puffs esto associados activao gnica diferencial (sntese de RNA). Aparecem em glndulas de Drosophila, angiosprmicas, protozorios, dpteros e carcinomas.

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Cromossomas Plumosos Cromossomas plumosos muito activos na sntese de RNA. Quando a laada est exposta, significa que est a ocorrer a sua transcrio. Estes cromossomas so revestidos por complexos de RNA e protenas Formam-se quando a fibrila de cromatina sai e volta a entrar no cromossoma, formando uma laada. Esta estrutura contnua, logo permanece sempre intacta. Aparece em ncleos de ocitos I de vertebrados (anfbios) e invertebrados durante o prolongado estado de diplteno, e, ocasionalmente, em espermatcitos de Drosophila. As expanses da maioria dos crommeros em forma de laos, so muito ricas em RNA. Tcnicas de Observao de Cromossomas Metafsicos Tcnicas directas observam-se cromossomas a partir do tecido. Por exemplo, medula ssea, mucosa intestinal, endomtrio, neoplasias, testculo, ovrioEmparelhamento tpico dos cromossomas X e Y Humano Rato Humano

Tcnicas indirectas observam-se cromossomas a partir de uma cultura celular. Por exemplo, sangue perifrico, medula ssea, lquido amnitico, vilosidades do crion, pele, tumores slidos / lquidos Nesta tcnica a quantidade do caritipo muito maior, logo mais definida. As culturas tm de ser feitas em meios asspticos.Linfcito Estudo dos crossing-over (pontos de quiasmata)

Estudo dos crossing-over (pontos de quiasmata) Ampliado

Resduo slido (tumor) fibroblastos que se dividem do fragmento inicial pele

Resduo slido (tumor) fibroblastos que se dividem do fragmento inicial mnio

Mtodos de Colorao das Bandas Houve uma evoluo desde os mtodos que englobavam coloraes uniformes ao longo de todo o cromossoma, para tcnicas cuja colorao induz uma alternncia de bandas. Este desenvolvimento fez com que seja mais simples a realizao de determinados diagnsticos, pelo que muito mais fcil o seu estudo. Mtodos diferenciais alternncia de regies claras com regies escuras. Mtodos selectivos marcao de regies especficas, com corantes fluorescentes. Mtodos de Colorao das Bandas Bandas G Bandas G nome proveniente do nome Giemsa, que o corante utilizado. Esta tcnica consegue, atravs da utilizao de enzimas proteolticas, provocar a alternncia de bandas claras e escuras, quando este corante diludo. Faz com que as bandas correspondam disposio das protenas, formando bandas positivas ou negativas. Bandas positivas bandas mais escuras, ricas em adenina-timina. Bandas negativas bandas mais claras. Enzimas proteolticas: Distribuio de protenas; Bandas positivas histonas ricas em arg e protenas ricas em grupos dissulfitos Bandas negativas protenas ricas em grupos sulfidril.

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muito utilizado na deteco de anomalias, como por exemplo mutaes. Permitindo observar os prottipos dos caritipos das espcies. Nesta tcnica, os cromossomas so sujeitos a um aquecimento moderado ou a uma breve protelise, e corados com Giemsa. Mtodos de Colorao das Bandas Bandas Q Quinacrina corante florescente: Zonas mais brilhantes 75% adenina-timina; Zonas brilhantes mais de 5% de guanina-citocina. Mtodos de Colorao das Bandas Bandas R Bandas R nome vem da palavra reverse. Esta tcnica baseia-se na desnaturao, da cromatina, a altas temperaturas. Quando se colocam numa soluo alcalina, sofrem uma renaturao de apenas algumas partes do cromossoma, logo considera-se a ocorrncia de uma renaturao selectiva. Correspondem a bandas inversas das bandas G, pois as bandas G claras so bandas R escuras, enquanto as bandas G escuras so bandas R claras. Assim, constituem bandas complementares das bandas G, e aparecem em conjunto nas legendas dos prottipos dos caritipos. Os cromossomas so tratados com uma soluo alcalina, a quente, e coradas com Giemsa. Formam barras claras, ricas em guanina-citosina. Mtodos de Colorao das Bandas Bandas C Este um tipo de tecnologia que no faz aparecer uma forma de bandas contnua em todo o cromossoma. Na realidade faz com que determinadas zonas do cromossoma apaream mais evidenciadas. Assim, no se estuda o caritipo de um indivduo, mas estudam-se determinadas zonas que se pretendem analisar. Nesta tcnica h uma desnaturao, com tratamento alcalino, ocorrendo, posteriormente, a renaturao das sequncias mais repetitivas. Bandas C o seu nome vem de centrmero. Evidencia, por exemplo, a heterocromatina constitutiva.Anomalia 1 centrmero com posio correcta e o outro centrmero diferente Cromossomas onde existe grande quantidade de heterocromatina na regio centromrica (caso humano)

Mtodos de Colorao das Bandas Bandas NOR Bandas NOR o seu nome vem de nucleolo organizing region. Existem determinadas regies da cromatina que esto relacionadas com o nuclolo, ou seja, no produzem protenas mas so as responsveis pela produo de 2 tipos de RNA ribossmico. Utiliza-se um tampo a elevadas temperaturas e adiciona-se nitrato de prata que vai precipitar determinadas regies. Depositam-se em zonas dos cromossomas acrocnctricos, que produzem RNA ribossmico. So ento estas as zonas que se evidenciam. As protenas associadas ao DNA ribossmico, no nuclolo (RNA ribossmico 18s e 28s) so abundantes, nos braos curtos dos cromossomas. 9



Mtodos de Colorao das Bandas Bandas SCE Bandas SCE o seu nome provem de sister cromatide Exchange. So necessrios 2 ciclo mittitos para que seja evidenciada a imagem. Assim, BrdU (droga que bloqueia a metafase) aps 2 ciclo consecutivos a competir com a timina: 2 BrdU cromtide clara; BrdU + Timina cromtide escura. Este corante um composto que compete com a timina aquando da fase S, em cultura celular. Produz uma imagem do crossing-over, permite ento visualizar o entrecruzamento (cruzamento entre cromtides irms), atravs da identificao de 1 cromtide clara e 1 cromtide escura. possvel que ocorra raramente um aumento do crossing-over mittico, devido a um mutagnico associado.2 Ciclo de diviso celular Adio de BrdU 2 Ciclo de diviso celular Banda Banda escura clara

Adio de BrdU

1 Ciclo de diviso celular

2 cromtides BrdU do mesmo cromossoma RECOMBINAO MITTICA:

Mtodos de Colorao das Bandas Bandas Alta Resoluo Esta tcnica permite aumentar, em bandas, a resoluo de um cromossoma. Assim, consegue-se distinguir um maior nmero de bandas e tambm de sub-bandas, pois esticamse os cromossomas. A coquicina pra a metafase, logo deixa de existir a diviso celular. A coquicina deixa de ser til perante o metatraxato (droga), que bloqueia a fase do novo material gentico. Esta diviso interrompida numa profase tardia ou metafase precoce (desde que seja bem conhecido o tempo desde a fase S at metafase) onde os cromossomas esto compactados o suficiente para se verem, mas no to compactados para que possam aparecer esticados (em alta resoluo). Assim, passam-se de 300 bandas para 1000 bandas a observar, devido ao bloqueio da fase S pelo metatraxato, ficando cerca de 50% dos cromossomas em prometafase. Isto possvel por se ter uma cultura sincronizada, onde todas as clulas se encontram na mesma fase. Esta tcnica constitui uma vantagem quando se tem pouco material cromossmico. Pode ser importante no estudo de cancros. Mtodos de Colorao das Bandas Anticorpos Marcados Anti-5 metilcitosina e anti-centromricos. A base desta tcnica est no mecanismo de ligao dos anticorpos aos antignios. Permite detectar uma protena especfica numa cultura / extracto de protenas, hibridadas por anticorpos (sonda), no qual o primrio detecta a protena e o secundrio (que est marcado) detecta o anticorpo primrio, servindo, desta forma, para tornar o sinal de deteco mais forte.

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Mtodos de Colorao das Bandas Enzimas de Restrio Enzimas de restrio / Endonucleases enzimas que fragmentam o DNA por hidrlise em locais especficos. Reconhecem uma dada sequncia de nucleotdios / regies especficas, fragmentando o DNA sempre que essa mesma sequncia encontrada. Locais de restrio nucleotdios que as enzimas de restrio reconhecem, cortando o DNA nessa mesma sequncia. A mesma enzima de restrio corta sempre perante a mesma sequncia de nucleotdios em qualquer DNA. No entanto, no mesmo organismo, cortam no mesmo local, originando sempre o mesmo conjunto de fragmentos, mas noutro indivduo diferente originam fragmentos diferentes, pois cortam em regies diferentes. Ocorre a quebra se estiver presente a regio especfica, logo no ocorre a quebra se no estiver essa mesma regio especfica presente. O DNA nessas regies especficas adquire uma determinada cor. Mtodos de Colorao das Bandas Hibridizao in situ Hibridao in situ envolve hibridao de um fragmento de cido nucleico a uma preparao cromossmica de DNA desnaturado ou a uma seco de tecido de RNA. Deteco de sequncias de cidos nucleicos, atravs de sondas de DNA/RNA. As sondas hibridizam directamente com determinadas regies de cromossoma, originando uma fluorescncia, nessa mesma regio. Esta tcnica importante na anlise da presena, ou ausncia, de cromossomas em interfase. FISH (fluorescence in situ hybridization) tcnica citogentica utilizada para detectar e localizar a presena ou ausncia de uma sequncia de DNA especfica ou um cromossoma. Mtodos de Colorao das Bandas Pintura Cromossmica (Chromosome Painting) Cromossomas provenientes de vrias clulas (suspenso) so divididos em funo do seu tamanho. H a hibridao com sondas de DNA ligadas a fluorocromos. Estes fluorocromos so especficos para determinadas sequncias, podendo, desta forma, permitir a observao de anomalias cromossmicas, devido presena de uma cor indesejada na anlise. Ocorre a extraco de DNA (que tem de ser purificado pela extraco de protenas e sua desnaturao), atravs da primeira mquina, que corresponde a um determinado cromossoma, adicionando-se um corante flurescente. Hibridizao deste DNA com cromossomas parcialmente desnaturados. A colocao dos cromossomas na mquina com os 24 tubos (para os 22 autossomas + X + Y) faz com que os cromossomas se distribuam por esses mesmos tubos (cromossoma 1 no tubo 1, cromossoma 2 no tubo 2, ). Permite a abertura dos cromossomas parcialmente desnaturados (cadeias abertas), obtendo-se homlogos com cores diferentes.

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CITOGENTICA Mutaes Cromossmicas Numricas e de EstruturaVariao no Nmero de Cromossomas Euploidia nmero mltiplo de cromossomas, do conjunto monoplide. Caritipo com n cromossomas ou mltiplos de n cromossomas: Monoploidia n cromossomas; Diploidia 2n cromossomas; Triploidia 3n cromossomas (os triplides so normalmente estreis). 2n n cromossomas (se os triplides so frteis pode haver cruzamento de gmetas); Tetraploidia 4n cromossomas; Poliploidia duplicao dos cromossomas sem subsequente diviso nuclear. Pode ocorrer devido a uma deficincia na anafase ou a uma endomitose. Origina clulas multinucleadas. Auto descendentes de um cruzamento intra-especfico, ou seja, de indivduos da mesma espcie. um cruzamento de indivduos cujos gmetas so da mesma espcie. Desta forma, todas as guarnies cromossmicas so iguais Alo descendentes de um cruzamento inter-especfico, ou seja, de indivduos de espcies diferentes. Estes descendentes chamam-se de hbridos. um cruzamento de indivduos cujos gmetas so provenientes de espcies diferentes. Desta forma, nenhum cromossoma tem homlogo. Haplide com metade do nmero de cromossomas inicial. Euploidias Monoploidias As monoploidias so as euploidias mais simples a nvel cromossmico. Podem ser: Espontneas abelhas, formigas e vespas machos. Artificiais: o Plntulas que surgem a partir de gros de plen, sendo portanto monoplides. Ocorre a diploidizao com colquicina (linhas puras). o A fertilizao com espcies diferentes leva eliminao dos cromossomas de uma das espcies, por incompatibilidade gentica, ocorrendo o desenvolvimento de um monoplide. Euploidias Monoploidias (Criao de Monoplides Artificiais) Esta tcnica til em processos de seleco de caractersticas favorveis (plantas), para a posterior criao de plantas diplides puras que sejam homozigticas, para uma determinada caracterstica: os fentipos observados so o resultado directo da constituio gentica destes indivduos (uma s cpia para cada gene), evitando-se os efeitos de possvel interaco entre alelos.Plantas diplides Anteras em cultura celular Produto meitico das clulas Crescimento de embrites haplides Haplides plantados Plantas monoplides

Formam-se embrites e no embries, os quais possuem uma resistncia muito mais baixa que uma planta diplide. Um dos processos de produo de plantas monoplides atravs de uma cultura de clulas haplides. Neste caso, os gros de plen so colocados em meios de cultura (agar) juntamente com algumas hormonas. O crescimento destas clulas d origem a tecidos e, posteriormente, a plntulas haplides.

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Normal Mitose num monoplide, n = 3 Com colquicina por uma diviso celular

2 clulas monoplides 1 clula diplide

Clulas monoplides podem ser transformadas em diplides atravs da aplicao da colquicina. Esta substncia impede a formao do fuso acromtico duplicando, assim, o nmero de cromossomas. realizada, ento, uma mitose no acabada (duas clulas que se unem com a informao gentica de 2 monoplides). Estas clulas podem proliferar e dar origem a tecidos diplides.Plantas monoplides sensveis Clulas somticas em cultura, num meio selectivo Crescimento de uma plntula resistente Planta monoplide resistente (estril) Colquicina Planta diplide resistente (frtil)

A colquicina no permite a polimerizao do centro acromtico, mas induz a duplicao, logo vai originar a fertilidade. O meio selectivo garante que apenas as clulas resistentes a determinado factor selectivo so aquelas capazes de se proliferar. Consegue-se ento de uma certa forma, manipular determinado nmero de cromossomas, para a planta ser mais rentvel. Conseguindo-se induzir a diploidia (atravs da colquicina, que interrompe a mitose). Este processo em nada est relacionado com o processo de formao dos organismos geneticamente modificados. As plantas monoplides podem ser utilizadas em programas de mutao-seleco utilizando tcnicas de microbiologia. Uma populao de clulas monoplides isolada e as paredes celulares so destrudas enzimaticamente, sendo posteriormente sujeitas a um tratamento com um agente mutagnico. So em seguida colocadas num meio selectivo de cultura que apenas permite o crescimento do fentipo desejado (exemplo, a resistncia a determinada substncia txica como um herbicida). Atravs do tratamento com colquicina as plntulas monoplides so transformadas em plantas diplides (frteis). Euploidias Triploidias Formam-se / originam-se atravs de: Tetraplide Diplide (um tetraplide, normalmente, produz gmetas diplides); Reteno do segundo glbulo polar, que normalmente seria expulso (exemplo colquicina, choques trmicos / presso).

Ocorre esterilidade (que normalmente est associada a triplides), pois a probabilidade de se formarem gmetas no normais muito baixa. Os trs cromossomas vo ser divididos em 2 combinaes diferentes: trivalente ou univalente e bivalente. Interrompe-se a meiose para ser retido o glbulo polar.

1 Glbulo Polar 2 Glbulo Polar

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Euploidias Tetraploidias Interessantes para a produo de diplides, pois do cruzamento entre tetraplides e diplides surge uma descendncia consideravelmente diplide, o que pode ser de interesse. Espontaneamente, onde 2n desenvolve-se para 4n. Induzidos (exemplo colquicina, choques trmicos / presso). Ocorre a produo, ou no, de gmetas equilibrados.

Euploidias Alopoliploidias Um indivduo de 4n cromossomas que se cruza com uma das espcies originais, origina um alotriplide estril (por ser um hbrido e por ser tetraplide). Este novo tipo de ser vivo pode ser bastante rentvel. Especiao processo evolutivo pela qual as espcies vivas se formam. Pode constituir uma transformao gradual de uma espcie noutra ou pela diviso de uma espcie em duas. Pode ser induzida artificialmente atravs de cruzamentos seleccionados. Hibridizao celular fuso de protoplastos. Ginognese processo muito raro, no qual existe a possibilidade de produo de seres vivos sem a necessidade da informao gentica masculina, ou seja, origina-se um indivduo apenas a partir da informao gentica feminina. Origina seres com um grau de homozigotia elevadssimo, o que bastante perigoso para a variabilidade dessas espcies. No nada semelhante ao processo de partenognese (sem formao de gmetas), pois h a formao do gmeta feminino que origina as novas fmeas. A informao provm toda do gmeta feminino, o espermatozide apenas contribui com o centrossoma.

Espcies Originais

O burro que nasceu de um burro coxo e de uma me mula, que por sua vez era filha de um burro e de uma gua (hbrida) deita por terra tudo o que foi estudado sobre a infertilidade dos hbridos inter-especficos. Neste caso, houve provavelmente uma meiose que conseguiu chegar at ao fim, na hbrida (descendente do cruzamento inter-especfico de um burro com uma gua), originando um gmeta feminino que s possua a informao da espcie burro. Esse gmeta conseguiu ser fecundado por um espermatozide de um burro. Este fenmeno algo muitssimo raro, sendo necessrio muita coincidncia e sorte para que acontea.

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Variao no Nmero Aneuploidia Aneuploidia mudana de parte do nmero monoplide herdado (no disjuno). Caritipo com cromossomas a mais ou a menos: Nulissomia (n-1) cromossomas, (2n-2) cromossomas perda de um par de cromossomas homlogos; Monossomia (2n-1) cromossomas, (3n-2) cromossomas perda de um cromossoma; Dissomia (3n-1) cromossomas, (n+1) cromossomas ; Trissomia (n+2) cromossomas, (2n+1) cromossomas um cromossoma extra; Tetrassomia (n+3) cromossomas, (2n+2) cromossomas Variao no Nmero Aneuploidia (Causas)

No disjuno em meiose I

No disjuno em meiose II

Sndrome de Down fruto de no disjuno meitica em meiose I ou meiose II, normalmente por parte da me (erros devido aos vulos serem velhos numa gravidez tardia). A idade materna com maior nmero de nascimentos por volta dos 35 anos. medida que a idade da me aumenta, a frequncia de meioses erradas, tambm, aumenta.

No disjuno na primeira diviso do zigoto (mitoses)

Se a probabilidade das clulas se dividirem for a mesma, o indivduo torna-se um mosaico (por vezes a capacidade das clulas de se dividir fica comprometida). 15



No disjuno na segunda diviso do zigoto

Estes mosaicos resultam em indivduos que podem ter uma doena com menor gravidade. Gmetas Trissomia A: n (50%); n + A (50%) ou n + 2A; n A (muito mais raro). Monossomia A: n (50%); n A (50%). Tetrassomia A: n + A (100%) ou n + 3A; n A ou n + 2A; n. Dupla trissomia (A e B):3A 3A 3B 2B 1B 0B 3B 2B 0A 1B 0B

Mais comum3A

ou3B 2B

2A 1B 0B 3B 2B

1A 1B 0B

1

2

1

Variao na Estrutura Deleco falta de material gentico. Exciso de uma poro de um cromossoma, ou seja, perda no material cromossmico. Esto associadas a grandes incapacidades: Terminal perda de material gentico, numa das extremidades telomricas do cromossoma. A extremidade (2) possui bastante instabilidade porque no tem a regio cromossmica telomrica caracterstica. O segmento (1) acaba por desaparecer ao longo das divises celulares porque no tem centrmero e por isso no tem como se ligar ao fuso acromtico. Este segmento (1) costuma conter DNA nobre pelo que a sua perda implica o desaparecimento de informao importante. O cromossoma no tem telmero e procura ligar-se a outro material gentico (instabilidade). Intersticial perda de material gentico, no meio de uma sequncia cromossmica. O segmento (1) acaba por desaparecer (pelas mesmas razes que o segmento na deleco terminal), se no englobar o centrmero, levando a alteraes fenotpicas. Provoca uma funo deficiente nos tecidos que contm este material gentico, podendo ditar a infertilidade.

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Duplicao pode ocorrer devido a um erro na Fase S ou no emparelhamento dos cromossomas durante a meiose. Duplicao de uma poro de um cromossoma, ou seja, h repetio de uma poro de cromossoma. Fornecem uma informao gentica complementar, potencialmente capaz de assumir novas funes. Quanto maior for o nmero de repeties e a sequncia repetida, maior pode ser o grau de gravidade de certa doena. Inverso inverso de uma poro de um cromossoma, ou seja, h uma rotao, de um segmento cromossmico, em relao posio normal, sem alterar a sua localizao no cromossoma. Quando a inverso no ocorre a meio de uma sequncia de um gene estrutural (zona no codificante), no ocorre nenhuma consequncia malfica, ou seja, o cromossoma continua funcional em termos somticos. Estas rupturas em genes estruturais so as mais raras. No h perda nem ganho de material gentico. Pericntrica tipo de inverso que envolve o centrmero. Com este tipo de inverso, h na mesma o emparelhamento das cadeias.

Paracntrica tipo de inverso que no envolve o centrmero. Causa maiores problemas.

Translocao troca de uma poro de um cromossoma por outra poro de outro cromossoma. Ocorre entre 2 cromossomas diferentes e no homlogos: Simples translocao em apenas 1 cromossoma. o mesmo que insero, de um cromossoma para o outro.

Recproca troca de segmentos entre 2 cromossomas no homlogos, ou seja, de um cromossoma para o outro e desse cromossoma para o primeiro. A sequncia translocada pode conter o centrmero (ficando um dos cromossomas com 2 centrmeros e o outro cromossoma sem qualquer cromossoma, aps a translocao: este fenmeno cria uma anomalia cromossmica secundria, pois a separao do cromossoma com 2 centrmeros provoca uma deficincia na informao gentica das 2 clulas originadas) ou no conter o centrmero (cada um dos cromossomas fica com 1 centrmero aps a translocao).

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Robertsoneana pode estender-se a qualquer espcie, tanto animal como vegetal. Ocorre quando, em cromossomas acrocntricos, h uma ruptura na regio do centrmero, ou acima do mesmo. Estes 2 cromossomas vo, ento, sofrer uma tendncia para se unir. Ou seja, vai ocorrer a fuso dos braos longos de ambos os cromossomas, sem os braos curtos que se perdem. Esta ruptura no possui precursores fenotpicos, uma vez que os braos curtos no codificam, praticamente, informao e os braos longos continuam a ser transcritos normalmente. No entanto existem repercusses graves a nvel meitico. suficiente para o equilbrio gentico. Os braos curtos podem persistir e formar um cromossoma marcador, ou ento podem degenerar e desaparecer. Isocromossoma ocorre quando existe a duplicao de toda a cromatina, em cromossomas. H uma diviso do centrmero horizontal, em vez de ser vertical. Esta anomalia pode ocorrer em qualquer tipo de cromossoma, formando-se, no fim, 2 cromossomas metacntricos, por excelncia (1 s dos genes do brao curto e outro s de genes do brao longo). Sem problemas meiticos mas com problemas a nvel celular.

Anel cromossoma com forma de um crculo. um cromossoma normal no qual, por um motivo qualquer, surge uma ruptura, e as suas extremidades unem-se, ou seja, ocorre a juno de duas partes cromossmicas que sofrem deleces terminais. As implicaes dependem do local onde ocorrem as rupturas, ou seja, existem reflexos fenotpicos quando a ruptura ocorre em locais codificantes importantes. Em termos meiticos possui uma grande influncia. Estes anis formados possuem na mesma um centrmero.

Meiose Por vezes, ocorre toro das duas cadeias, formando anis entrelaados, que quando se puxam os centrmeros, para migrarem para plos opostos, ocorre algures uma ruptura do cromossoma, que pode levar a uma perda de material gentico importante, e formao de um supercromossoma. Importncia em Termos Evolutivos A inverso (pericntrica e paracntrica) e a translocao (simples, recproca e robertsoneana) so as variaes mais importantes a nvel evolutivo, pois favorecem a evoluo (vantagem evolutiva). De seguida est a deleco (terminal e intersticial) e a duplicao, pois a probabilidade de ocorrer um indivduo de fentipo normal e muito inferior. Em ltimo lugar, como variaes menos importantes ao nvel evolutivo, aparece o isocromossoma e o anel, pois ambos provocam anomalias na estrutura, as quais podem ser mais ou menos graves, consoante as rupturas que ocorram. 18

Gentica Molecular e Citogentica (2010-2011) Variao na Estrutura Deleco


Para que os genes B e F se aproximem, e emparelhem correctamente, a cadeia normal de DNA (verde), tende a formar uma ansa. Pode ocorrer uma ligao (a tracejado) devido grande proximidade entre as extremidades das ansas. Estas ligaes vo levar formao de um microcromossoma circular e sem centrmero (CDE), que tende a desaparecer. Assim, o cromossoma homlogo faz uma ansa para que exista emparelhamento. A duplicao destes pares de cromossomas (CDE em anel e ABF linear) pode levar sua duplicao e formao de mais 1 cromossoma de cada um deles. As ansas tambm podem formar cromossomas em anel sem centrmero, provocando uma deleco no homlogo. Variao na Estrutura Duplicao Este mecanismo inverso ao mecanismo da deleco, no entanto a predisposio de ambos semelhante. Assim, pode formar, na mesma, um microcromossoma (3 4) juntamente com o cromossoma linear (1 2 3 4 5), mas ao contrrio do anterior, a perda desse microcromossoma, no provoca implicaes, uma vez que os genes perdidos (3 4) deixam uma cpia no cromossoma linear, pois foi duplicado. Assim, o fragmento duplicado forma a ansa, e se ocorrer a deleco dessa ansa, tornase uma vantagem selectiva, pois a duplicao eliminada. Esta perda constitui uma mais-valia para o cromossoma, pois elimina os genes em duplicado, quase que anulando a variao do cromossoma. Variao na Estrutura Inverso Paracntrica

InterfaseExiste grande probabilidade de ocorrer crossing-over Crossing-over Cromossoma normal (vermelho) faz uma ansa e o cromossoma invertido (azul) faz um looping Com crossing-over o resultado catastrfico (ocorrem deleces e duplicaes)

Sinapse Anafase I Segmentos C, D e F revertem por ruptura em dois pontos. O cromossoma sofre por mudanas radicais, de forma a conseguir emparelhar os segmentos correspondentes. Em termos fenotpicos, so indivduos normais, mas o grande problema ocorre na meiose. Pois no fim, vo ser obtidos cromossomas muito diversos e anormais, possuindo, por exemplo, 2 centrmeros no mesmo cromossoma, nenhum centrmeros ou com duplicaes.

Sem crossing-over o indivduo comporta-se normalmente pois est l todo o seu material gentico

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Produtos de um duplo cruzamento (recombinao dupla) numa zona invertida, envolvendo diferentes combinaes de cromtides existem 2 pontos de quiasmata na ansa, logo vo originar cromossomas 100% anormais: Com recombinao dupla entre 2 cromtides: GMETAS50% Normal 50% Anormais No problemtico

Com dupla recombinao entre 3 cromtides: GMETAS Com dupla recombinao entre 4 cromtides: GMETAS100% Anormais Pior caso 25% Normal 75% Anormais Muito grave

Variao na Estrutura Inverso Pericntrica O centrmero aparece na regio da ansa. menos prejudicial que a situao quando o centrmero est fora da ansa / inverso, pois assim no existe o perigo de se formarem cromossomas com 2 centrmeros, na meiose. A posio do centrmero atenua a gravidade da situao (se todos os cromossomas tm um centrmero cada, o caso muito menos grave). Recombinao: GMETAS Recombinao dupla: GMETASNormal Com crossing-over Com inverso Com crossing-over e inverso Normal Modificado Normal Com inverso

Variao na Estrutura Translocao Simples (Insero) Emparelhamento A origem de uma ansa no gene inserido provoca a origem de uma ansa na sequncia que emparelha com esse gene. Os cromossomas emparelham desta forma pois o gene Y forma uma ansa para que todo o cromossoma normal (azul escuro) consiga emparelhar normalmente. Os genes X e Z vo emparelhar em forma de V para o lado oposto do plano. Esta forma de emparelhamento faz com que seja possvel formar um cromossoma em anel apenas com o gene Y. Este tipo de transcrio no leva, normalmente, condio de infertilidade mas em alguns casos pode levar a um estado de sub-fertilidade, pois a meiose estagna em determinada fase de diviso, no prosseguindo mais. 20



Variao na Estrutura Translocao Recproca O mecanismo semelhante ao da translocao simples, mas ocorre a formao de 2 ansas. As ansas formam-se devido necessidade do cromossoma (azul escuro) emparelhar correctamente. Como no caso anterior, pode originar algumas clulas com sub-fertilidade, ou seja, originar clulas que parem a sua meiose, nunca a concluindo. No entanto, em alguns casos (raros) podem levar infertilidade. A seleco natural consegue identificar, seleccionar e eliminar estes casos. Emparelhamento Envolvendo os telmeros dos dois pares ocorre um emparelhamento num sentido perfeito (neste nvel), de regio a regio: Existem 3 modos de segregao dos cromossomas (para se formarem gmetas), para este caso (consoante as linhas a tracejado). Nas vrias clulas onde ocorre a meiose podem estar a ocorrer as diversas segregaes, pois no obrigatrio todas as clulas (com este erro) em meiose, de um indivduo, estarem / possurem o mesmo tipo de segregao.

Assim os 3 tipos de segregao so: Adjacente 1 para plos opostos vo centrmeros homlogos; Adjacente 2 para o mesmo plo vo centrmeros homlogos; Alterna a melhor segregao pois origina um gmeta equilibrado j que tem todo o material gentico e apenas a estrutura cromossmica trocada. Segregaes:

Adjacente 1 cromossomas II e III para um dos plos, e cromossomas I e IV para o outro plo.

Adjacente 2 cromossomas I e III para um dos plos, e cromossomas II e IV para o outro plo.

Alterna cromossomas III e IV para um dos plos, e cromossomas I e II para o outro plo.

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Gentica Molecular e Citogentica (2010-2011) Resumindo:Gmetas Dissomia parcial do 2 Nulissomia parcial do 7 2;7 Trissomia parcial do 2 Monossomia parcial do 7 Nulissomia parcial do 2 Dissomia parcial do 7 2;7 Monossomia parcial do 2 Trissomia parcial do 7 Dissomia parcial do 2 Nulissomia parcial do 7 2;7 Trissomia parcial do 2 Monossomia parcial do 7


Nulissomia parcial do 2 Dissomia parcial do 7 2;7 Trissomia parcial do 2 Monossomia parcial do 7

Normal 2;7 Normal

Equilibrado 2;7 Equilibrado

Gmetas

Zigotos

O resultado pode levar formao de um indivduo normal, equilibrado ou com alteraes cromossmicas, considerando o seu cruzamento com indivduos normais. Gmeta equilibrado no um gmeta normal, mas um gmeta que no tem duplicaes ou falta de material gentico. Ou seja, uma clula que apresenta um equilbrio de material gentico, que embora fora do local correcto, possui toda a informao gentica respectiva. O problema deste gmeta ocorrer no incio da fase germinativa ou do zigoto. Variao na Estrutura Translocao Robertsoneana

Segregaes segue o mesmo mecanismo que a translocao recproca. Pode ento ocorrer de 3 formas diferentes (adjacente 1, adjacente 2 e alterna): Adjacente 1 cromossomas II e III para um dos plos, e cromossoma I para o outro plo. Adjacente 2 cromossomas I e III para um dos plos, e cromossoma II para o outro plo. Alterna cromossoma III para um dos plos, e cromossomas I e II para o outro plo.

Esta trissomia 21 no total, pois o que ocorre a presena de 3 braos longos do cromossoma 21. Leva a situaes inviveis vida mas tambm, a outras situaes perfeitamente aceitveis. Por definio de translocao robertsoniana, so os braos longos os translocados entre os 2 cromossomas. 22

Gentica Molecular e Citogentica (2010-2011) Variao na Estrutura Isocromossoma


O prprio cromossoma emparelha-se sobre si mesmo, ou seja, dobra-se sobre o seu prprio centrmero e emparelha.

Variao na Estrutura Anel Aquando da duplicao do seu material gentico e da meiose I, h uma grande predisposio para as cadeias se entrelaarem, levando a uma ruptura, algures, durante a ascenso do cromossoma para os plos opostos. Origina 2 anis completamente desproporcionais.Entrecruzamento meitico

Pode ento ocorrer a juno dos 2 anis rompendo num ponto qualquer, e na anafase ocorrer um ganho de um dos plos e perda do outro plo.

CITOGENTICA Organizao e Evoluo CromossmicasTrissomia 21 Sndrome de Down O aparecimento da doena possui uma relao com a idade materna. Caractersticas: dimetro cerebral Antero posterior diminudo (braquicefalia); fissuras palpebrais oblquas; distncia interpupilar aumentada; estrabismo convergente; implantao baixa das orelhas; lngua hipertrofiada; pescoo curto e largo; cardiopatia congnita; ps e mos curtos e largos / sulco palmar; baixa estatura; baixo QI; os rapazes so estreis mas as raparigas no. Esperana mdia de vida menor. Trissomia 13 Sndrome de Patau Incidncia de cerca 1/4600 (no conta com os abortamentos. Caractersticas: micocefalia; microftalmia; lbio leporino (espordica fissura do palato); anomalias oculares; tronco deformado; mos e dedos flexionados; cardiopatia congnita; malformaes renais e cerebrais. Cerca de 40% dos indivduos morrem entre o primeiro ms e o primeiro ano.

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Gentica Molecular e Citogentica (2010-2011) Trissomia 18 Sndrome de Edwards


Incidncia de cerca 1/6700. Caractersticas: baixo peso (inferior a 2,5 quilogramas); implantao baixa das orelhas; microretrognatismo; crnio alongado no sentido anteroposterior; pele laxa e abundante no pescoo; plvis estreita; cardiopatia congnita; malformaes renais; atraso mental marcado. Cerca de 70% dos indivduos morrem entre o primeiro e o dcimo anos, pelo que possui uma elevada mortalidade. Monossomia X Sndrome de Turner nica monossomia compatvel com a vida. Incidncia de cerca 0,3/1000. Caractersticas: meninas eternas; atraso no desenvolvimento (permanece infantil); pterigium coli (prega no pescoo); trax alargado; amenorreia primria (no tem ovrios mas tem tero, logo so estreis); ausncia de caracteres sexuais secundrios; rgos genitais internos imaturos e sem epitlio germinativo. Como possuem tero, podem ter filhos no biolgicos por implantao de um embrio. Existem tratamentos para alguns casos, como administrar suplementos hormonais o que permite o desenvolvimento de caracteres sexuais. Trissomia X Anomalias nos cromossomas sexuais so bem toleradas nos mamferos. Incidncia de cerca 1/1000. Por vezes, as mulheres formadas podem ser frteis. Caractersticas: amenorreia secundria; hipoplasia dos lbios vaginais; frequentes alteraes neuro-psquicas; ciclos menstruais irregulares. Por vezes so frteis tendo grande probabilidade de terem filhos normais.

Sndrome de Klinefelter 47, XXY Incidncia de cerca 1,4/1000. Caractersticas: hbito eunucide; ginecomastia; hipogonadismo (gnadas pequenas) que afecta os caracteres sexuais secundrios e a funo testicular; plo pbico de implantao horizontal; azoospermia em mais de 95% dos casos; diminuio dos nveis de testosterona; elevao dos nveis das hormonas folculo-estimulantes (FSH) e luteoestimulantes (LH); indivduos estreis mas no impotentes que apresentam uma mistura de caractersticas masculinas e femininas. 24

Gentica Molecular e Citogentica (2010-2011) 47, XYY


Sndrome da super-masculinidade. Incidncia de cerca 1/2000. Caractersticas: estatura elevada; ginecomastia; sub-fertilidade; pnis de dimenses reduzidas; por vezes ligeiro atraso mental; indivduos com comportamentos agressivos.

Origem das Alteraes Sexuais

Sndrome do Miar do Gato Ausncia do Brao Curto5p-

Deleco de uma regio do brao curto do cromossoma 5. Os recm nascidos possuem um choro semelhante ao mio de um gato (da o nome da doena). Origina crianas com bastantes defeitos de qualidade de vida. Caractersticas: baixo peso ao nascimento; microcefalia; estrabismo; atraso psicomotor marcado; possvel associao de malformaes renais e cardacas.

18 p- (Deleco do Brao Curto do Cromossoma 18) Ocorre a deleco de uma regio do brao curto do cromossoma 18. Caractersticas: atraso mental acentuado; microcefalia; lbio leporino (esta fenda labial por vezes pode passar para o palato originando uma fenda palatina); pavilhes auriculares mal-formados. X Frgil Origina-se devido a uma constrio na parte distal (Xq27), ou seja, ocorre um estrangulamento na parte distal do brao longo do cromossoma X. Caractersticas: baixo QI (50-60); mulheres com macro-orquidia; testa larga; palato muito arqueado.

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CITOGENTICA Reproduo Humana AssistidaEstudo do Casal Em qualquer dificuldade de fertilidade que exista num casal, deve-se colocar a hiptese de se tratar de um problema cromossmico, num ou em ambos os indivduos do casal, logo o estudo do seu caritipo importante para a despistagem de anomalias cromossmicas que causem essa mesma infertilidade. Para alm deste estudo do caritipo, existem outros com base citogentica que averiguam a causa de tais problemas frteis. Diagnstico Gentico Pr-Implantao (DGPI) um estudo de um conjunto de clulas do embrio, aps a fertilizao in vitro, e antes da implantao no tero, para se concluir se pode ser implantado, ou no. O conjunto de clulas implantado se no existir qualquer problema cromossmico. Assim, realizado no incio da gestao, quando ainda no se formou o feto, o que permite averiguar se h, ou no, alguma anomalia cromossmica nesse conjunto de clulas, sendo uma alternativa ao diagnstico pr-natal. Isto apenas se faz quando o casal considerado de risco. Por isso, considera-se que o casal j foi estudado e esta anlise faz-se mediante a sua condio. Principalmente, nos casos onde existe um risco de descendncia com doena gentica: Membro da famlia afectado / portador; Descendente afectado; Abortamento recorrente pode ser devido a anomalias cromossmicas muito grandes e inviveis vida. Este acontecimento, na mulher, aparece como um perodo menstrual; Mulher com idade superior a 35 anos considera-se que h uma probabilidade acrescida de ocorrer a no-disjuno de cromossomas, na meiose. Esta justificao polmica; Trs ou mais insucessos de fertilizao in vitro discutvel pois o insucesso pode ser devido a erros humanos de implantao. As clulas da granulosa, por possurem ncleo, podem intervir no diagnstico gentico de pr-implantao. Processo de Fertilizao In Vitro So necessrios exames preliminares ao casal. Ocorre a estimulao de ovcitos, num nmero superior a nove. ICSI no contaminao. Bipsia Estudo do primeiro e segundo glbulos polares. O estudo dos glbulos polares apenas d informao sobre a me e nunca sobre o pai, mas consegue-se aperceber o que se passa dentro do ocito (considerado quase como um espelho do interior do ocito). A bipsia feita a partir de um a dois blastmeros (embries com 8 a 12 clulas), ao terceiro dia, ou ento a partir de clulas da trofoectoderme de blastocistos, ao quinto dia.

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Abertura da Zona Pelcida necessrio que exista um buraco na zona pelcida para que a pipeta penetre dentro do ocito e recolha as clulas. Para tal, utilizam-se algumas tcnicas / solues que dissolvem a regio em contacto: Soluo cida de Tyrod (pH 2,2); Laser; Disseco parcial microcirurgia. Pegam-se em pipetas para segurar o ocito, e com muita calma e vagar vo sendo retiradas clulas, sucessivamente, at se fazer um buraco na camada. Para que esta abertura seja feita, os ocitos necessitam de se encontrar num meio especial, sem clcio (Ca2+) e magnsio (Mg2+) Diagnstico Unicelular A clula retirada a que vai ser estudada atravs de mtodos citogenticos. FISH - tcnica citogentica utilizada para detectar e localizar a presena ou ausncia de uma sequncia de DNA especfica ou um cromossoma. Possibilita o estudo a determinados cromossomas problemticos atravs da hibridizao in situ. Permite identificar anomalias cromossmicas: Nmero; Translocaes (recprocas, inseres e robertsoneanas); Reconhecimento de XX e XY em Portugal ilegal a utilizao deste mtodo para serem implantadas as clulas apenas de um dos sexos por deciso de determinado casal. Este apenas se realiza no caso de existir na famlia alguma doena que esteja associada a qualquer um dos sexos. So estudados, principalmente, os cromossomas 13, 16, 18, X, Y. Sondas: Sequncias repetitivas ou sondas -satlite; Sondas loci especficas; Pintura cromossmica. Atravs das cores originadas, sabe-se o nmero de cromossomas iguais, existente naquele caritipo. Existem 6 cpias do cromossoma azul, 5 cpias do cromossoma verde, e 2 cpias dos cromossomas a vermelho e a amarelo, o que se traduz em graves erros cromossmicos. As 5 e 6 cpias do mesmo cromossoma provavelmente sero devidas a uma no-disjuno mittica ps-zigticas. Transferncia de Embries Ocorre no quarto ou quinto dia aps a puno folicular. Taxa de gravidez clnica em DGPI 22,4 %.

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GENTICA BIOQUMICA Erros Inatos de MetabolismoGentica Bioqumica Captulo importante que estuda processos bioqumicos dos metabolismos celulares e os relaciona com defeitos bioqumicos, que se traduzem na transcrio. Constitui a ponte com a gentica molecular. Erros Inatos de Metabolismo Corresponde a uma incapacidade hereditria de realizar uma determinada tarefa metablica. produzida por mutaes recessivas. Erros inatos erros que nascem com uma pessoa e que so inerentes ao metabolismo.

GENTICA BIOQUMICA Hiptese um Gene uma EnzimaHiptese um Gene uma Enzima Trabalhos com Neurospora. Mutantes dependentes da adio de arginina: Os processos bioqumicos, que ocorrem no organismo, so geneticamente determinados; As vias bioqumicas podem ser analisadas como um conjunto de passos discretos, cada um mediado por uma enzima; Cada enzima normalmente codificada por um gene. um gene uma enzima um gene responsvel pela produo de uma enzima. Esta hiptese, considerada por 2 bilogos (Beadle e Tatum) chegou a uma concluso, numa altura onde a gentica j estava estabelecida. Concluiu-se, ento, que um gene codificava uma enzima, e sem esta enzima no seriam iniciados determinados processos bioqumicos. Na actualidade, sabe-se que no bem assim, mas muito semelhante a essa hiptese, pois apesar de uma enzima ser um polipeptdeo, existem enzimas que so codificadas por vrios genes e no apenas um. Logo foi desenvolvida a hiptese um gene um polipeptdeo.

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Gentica Molecular e Citogentica (2010-2011) Experincia Elaborada por Beadle e TatumConidios mutagenizados (Raios X) Cruzamento com tipos selvagens de tipos sexuais opostos


Tipo selvagem

Corpos frutferos

Ascsporos microscpicos so dissecados e transferidos um por um para tubos de cultura

Tubos de meio completo inoculados com um nico ascsporo. Tubos de meio mnimo (com poucos nutrientes) sem crescimento. Identificao de um mutante nutricional. Concluram que haveria algo no tubo de meio completo favorvel ao desenvolvimento do fungo. Os esporos crescidos em meio completo so ento inoculados em meio mnimo, com diferentes meios suplementares: Meio mnimo controlo. Meio mnimo com aminocidos com crescimento. Obtiveram-se resultados importantes, pois nuns tubos havia o desenvolvimento do fungos, mas noutros tubos, isso no se verificava. Meio mnimo com vitaminas sem crescimento; Meio completo controlo. Para se averiguar que aminocido intervinha no crescimento do fungo, foram feitos vrios testes de meio mnimo com 1 aminocido de cada vez (glicina, alzinina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilanina, prolina, arginina, lisina, cido glutmico, cido aspartico, glutamina, asparagina, serina, treonina, cisteina). A repetio desta experincia n vezes levou concluso de que h uma dependncia da adio de arginina: ARG1 desenvolvimento com ARG, CITR ou ORN; ARG2 desenvolvimento com ARG ou CITR; ARG3 desenvolvimento com ARG.Precursor X ORN Y CITR Z ARG

ARG1 deficincia da enzima X; ARG2 deficincia da enzima Y; ARG3 deficincia da enzima Z. Esta sequncia metablica foi a razo de terem chegado hiptese um gene uma enzima.

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GENTICA BIOQUMICA Cadeias MetablicasProcesso Metablico Num processo metablico to pequeno podem estar associados diversos erros, que levam a vrias alteraes fenotpicas.

Estrutura das Protenas Protenas sequncias de aminocidos com uma estrutura muito mais complexa e diversificada que o DNA, ou seja, so polmeros de aminocidos em cadeia linear. Diferentes nveis da estrutura de uma protena: Estrutura primria sequncia linear de aminocidos, ou seja, a sequncia de aminocidos da cadeia polipeptdica. Estrutura secundria formao de cadeias alfa e beta atravs de pontes de hidrognio. H uma organizao localizada em partes da cadeia polipeptdica, estabilizada por pontes de hidrognio. Estrutura terciria estrutura tridimensional. A conformao global da cadeia polipeptdica (arranjo tridimensional) estabilizada por pontes de hidrognio, ligaes inicas, interaces hidrofbicas e pontes de dissulfito. Estrutura quaternria ligao de vrias cadeias polipetdicas. O nmero e posio das subunidades de protenas multimricas so estabilizados por pontes de hidrognio, ligaes inicas, interaces hidrofbicas e pontes de dissulfito. Modelo da Relao Gentipo Fentipo As caractersticas de um organismo so determinadas pelo fentipo das suas partes, que por sua vez so determinadas pelo fentipo das clulas que o constituem. O fentipo de uma clula determinado pelos processos bioqumicos controlados por enzimas que catalisam as reaces metablicas. As funes de uma enzima dependem da sua estrutura tridimensional, que por sua vez depende da sequncia linear dos aminocidos. As enzimas presentes numa clula, bem como as protenas estruturais, so determinadas pelo gentipo dessa clula. Os genes determinam a sequncia linear de aminocidos na cadeia polipeptdica e, consequentemente, da protena. Assim, os genes determinam os fentipos, a qualquer nvel.

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Protenas Isoenzimas formas similares e funcionais de enzimas, que podem ser produzidas por loci diferentes ou por alelos diferentes do mesmo locus. Aloenzimas um subconjunto das isoenzimas, que so variantes de polipeptdeos representando diferentes alternativas allicas do mesmo locus. So duas protenas do mesmo locus que produzem enzimas diferentes, mas com a mesma funo (exemplo: peptidades (PEP), esterases (EST), adenosina deaminase (ADA), creatinina quinase (CK), isocitrato dehidrogenase(IDH), etc). Protenas plasmticas e dos glbulos vermelhos (exemplo: albumina (ALB), transferrina (TF), -hemoglobina, -hemoglobina, etc). Protenas monomricas possui uma cadeia polipeptdica. Considera-se apenas 1 subunidade. Protenas multimricas possui mais que uma cadeia polipeptdica. Consideram-se 2 subunuidades. Subunidades: Homomricas idnticas na sequncia de aminocidos; Heteromricas no idnticas na sequncia de aminocidos.Monmero L1 L2 Dmero L1 L1 L1 L2 L2 L2 Trmero L1 L1 L1 L1 L1 L2 L1 L2 L2 L2 L2 L2 Tetrmero L1 L1 L1 L1 L1 L1 L1 L2 L1 L1 L2 L2 L1 L2 L2 L2 L2 L2 L2 L2

Hommero Hetermero Hommero

Electroforese Electroforese mtodo de separao baseado nas diferenas de carga. Electroforese de protenas utilizado na classificao dos aminocidos: Hidrofbicos pouco solveis, no tm grupos polares; Polares possuem grupos polares, com elevada solubilidade: o Neutros no so ionizveis; o Positivos comportam-se como bases e so ionizveis, podendo ficar carregados positivamente (lisina e arginina, histidina); o Negativos comportam-se como cidos e so ionizveis, podendo ficar negativamente carregados (cido asprtico, cido glutmico). Electroforese de Protenas Mtodo ConvencionalHomozigtico Monmero Heterozigtico Homozigtico

Dmero

Trmero

Geralmente realizadas em matriz de amido ou agarose. Sistemas electroforticos contnuos, a pH constante. Por vezes, apresentam pouca resoluo nas bandas dos diferentes alelos, principalmente quando a diferena de carga entre eles muito pequena. As bandas difundem-se e ficam arredondadas. Perfis electroforticos

Tetrmero

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Electroforese de Protenas Focagem Isoelctrica Mtodo altamente resolvente no qual as protenas so separadas na presena de um gradiente de pH. As protenas migram de acordo com o seu ponto isoelctrico (PI). Baseada na utilizao de substncias sintticas de carcter anfotrico que se designam por anflitos. Os anflitos diferem muito ligeiramente no seu ponto isoelctrico. Matriz de separao em gel (poliacrilamida ou agarose). Os anflitos criam um gradiente de pH no gel. Utilizam-se solues de elctrodos (cido para o nodo e base para o ctodo). Permite a separao de alelos com diferenas muito pequenas de pH, at 0,02 unidades de pH. Mtodos de Deteco Directos colorao de protenas. Indirectos deteco funcional, imunolgico ou por marcadores (radioactivos, fluorescentes, fosforescentes). Hemoglobina Possui 4 cadeias polipeptdicas: 2 cadeias de 141 aminocidos e 2 cadeias de 146 de aminocidos, codificadas por loci diferentes (cadeias codificadas no cromossoma 16 e cadeias codificadas no cromossoma 11). Hemoglobina A na posio 6 da cadeia existe cido glutmico. Hemoglobina B na posio 6 da cadeia existe valina (causa da anemia falciforme). Segregao do tipo mendeliano: Hopkin-2 HbS anomalia na cadeia ; HbS + Hopkins-2 HbS Hopkins-2 anomalia na cadeia . Alterao aminoacdica envolvida na formao da hemoglobina S, no Homem, responsvel pela anemia falciforme (posio 6 da cadeia ):

Algumas substituies aminoacdicas encontradas na hemoglobina humana. Cada mutao, que resulta na mudana do aminocido indicado, provoca uma doena.

Arquitectura das protenas chave da funo do gene. Mutao substituio de um ou mais aminocidos: Protena no funcional; Protena funcional.

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GENTICA BIOQUMICA Colinearidade entre Gene e ProtenaColinearidade do Gene e Protena A estrutura das protenas est codificada na sequncia linear de nucleotdeos no DNA. De facto: a alterao de um par de nucleotdeos responsvel pela modificao de um aminocido na protena; a recombinao intragnica (seja a nvel de intres ou exes) pode tambm levar modificao da estrutura da protina. Interpretao Molecular de uma Doena Condicionada por um Gene Dominante Gene A protena anormal e txica. Gene a protena normal. DNA Estrutura normal com tendncia deposio em certos rgos : Protena o AA e Aa deposio. Estrutura normal : DNA a o aa no deposio. Protenaa

A A

Interpretao Molecular de uma Doena Condicionada por um Gene Recessivo

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GENTICA MOLECULAR Estrutura e Organizao do Material GenticoElectroforese As diferentes mobilidades electroforticas de uma determinada protena podem ser explicadas atravs de mecanismos genticos, isto , por mutaes (formas allicas do mesmo gene). A electroforese possibilitou o conhecimento da variabilidade e da diferenciao gentica, mesmo da que no se traduzia em alteraes visveis do fentipo (variabilidade neutral). Assim, os organismos podem ser considerados mais variveis do que inicialmente se acreditava. Atravs da electroforese de protenas (gentica bioqumica) iniciaram-se os primeiros trabalhos de diferenciao gentica, relaes filogenticas, gentica populacional, gentica forense, etc Polimorfismo, frequncias allicas e frequncias genotpicas: Representao esquemtica da separao electrofortica de uma protena com 2 alelos comuns, A e B. AA, AB e BB correspondem aos gentipos observados nos 10 indivduos estudados. ; ; . Da leitura deste gel, podem ser determinadas as frequncias genotpicas e allicas: Frequncias allicas: Frequncias genotpicas: ; ; ; . . A electroforese permitiu realizar estudos sobre os recursos genticos animais e vegetais, possibilitando a anlise de vrios loci, localizadas em diferentes cromossomas. No entanto, a variao gentica que detectada pela anlise das protenas representa apenas uma pequena proporo da realmente existente nas espcies, devido: maioria dos aminocidos serem neutros; a mutaes que no provocam substituies de aminocidos; e a variaes para o mesmo aminocido. Para alm disso, existe uma certa dificuldade na obteno e preservao das amostras e na obteno de tcnicas padronizadas em diferentes laboratrios. Bases Moleculares da Hereditariedade O suporte material que contm os genes (material gentico) deveria apresentar um conjunto importante de propriedades: Replicao perpetuao do material gentico; Armazenamento de informao atravs de uma linguagem e lxico qumicos que funcionassem como uma reposio de todas as caractersticas hereditrias Expresso da informao base do conceito fluxo de informao dentro da clula; Alterao mutacional fonte da variabilidade inter-individual. Genes Os genes ao longo da histria: 1866 Mendel prope a existncia de factores de hereditariedade. 1902 Sutton relaciona os factores de Mendel com os cromossomas. 1909 Ludvig aplica o termo genes pela primeira vez referindo-se aos factores de hereditariedade. 34



Os genes esto localizados nos cromossomas, os quais possuem como componentes estruturais, protenas e DNA. Definio possvel de gene unidade fsica, funcional e bsica da hereditariedade, que contm e transfere informao de gerao para gerao. Molecularmente, e numa aproximao simples, pode ser considerada como uma sequncia de nucletidos que codifica uma protena ou um RNA. DNA como Suporte da Informao Gentica Os genes considerados os factores hereditrios descritos por Mendel que estavam associados a caracteres especficos, mas cuja natureza fsica era desconhecida (em 1953). A teoria um gene uma enzima, postulava que os genes controlavam a estrutura das protenas. As investigaes de Griffith e Avery apontavam para o facto de o DNA ser o material gentico. Todas as experincias demonstravam que as clulas bacterianas que expressavam um determinado fentipo podiam ser transformadas em clulas com outro fentipo e que o agente transformador era o DNA. Assim, como concluso, averigua-se que o material gentico o DNA. Estrutura do DNA A descoberta da estrutura em dupla hlice: Chargaff conclui que no DNA, o total de timina era sempre igual ao total de adenina, e o total de citosina era sempre igual ao de guanina, no entanto a quantidade de adenina com timina, no era igual guanina com citosina, e a razo variava de espcie para espcie. Rosalind Franklin obteve fotos raio-X de DNA, que mostravam o DNA como uma molcula longa e helicoidal. Os dados de raios X mostravam que o DNA era uma molcula longa e helicoidal (Franklin). No entanto, dos trabalho de Chargaff conclui-se que: O total de nucletidos pirimidina (timina e citosina) era sempre igual ao total de nucletidos purina (adenina e guanina), em todos os organismos estudados, apesar de a razo variar de organismo para organismo. O total de timina era sempre igual ao total de adenina, e o total d citosina era sempre igual ao de guanina. No entanto, a quantidade de adenina mais timina no necessariamente igual a guanina mais citosina e esta razo variava de espcie para espcie. Assim: ; ; e . Cada cadeia de DNA um longo polmero. Os monmeros so os nucletidos. Nas cadeias anti-paralelas existe complementaridade de bases. Nucletidos constitudos por uma pentose, uma base e um grupo fosfato. No DNA ou RNA a pentose est associada a um s fosfato, no entanto os nucletidos celulares livres podem conter 2 / 3 fosfatos (ADP, ATP). Nucleosdeo = Base + Pentose; Nucletido = Nucleosdeo + Fosfato. Pentose:

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Gentica Molecular e Citogentica (2010-2011) Bases: Purinas 2 anis:


Pirimidinas 1 anel:

Nucletidos: Nucletidos purinas 2 anis:

Nucletidos pirimidinas 1 anel:

Cadeia de cidos nucleicos numa cadeia, 2 nucletidos esto unidos por uma ligao fosfodister. Uma molcula de DNA possui 2 cadeia unidas por pontes de hidrognio entre bases. As cadeias so antiparalelas, logo tm polaridade oposta. As cadeias tm orientao / polaridade: Extremidade 5 grupo fosfato (PO4) livre; Extremidade 3 grupo hidroxil (OH) livre. Regras de emparelhamento entre bases determinam que as duas cadeias sejam complementares. Adenina e timina ligam-se segundo 2 pontes de hidrognio, enquanto guanina e citosina ligam-se atravs de 3 pontes de hidrognio. Baseando-se nestas pistas, Watson e Crick propuseram uma estrutura de dupla hlice para o DNA: Cada hlice uma cadeia de nucleotdeos ligados por pontes fosfodisteres, nos quais o grupo fosfato forma uma ponte com o grupo hidrxido (OH). Cada cadeia tem uma polaridade: uma extremidade 5 do grupo fosfato e a outra 3 do grupo hidrxido. As cadeias da hlice de DNA so complementares e esto unidas por ligaes de pontes de hidrognio entre as bases. As ligaes so muito especficas e apenas existem entre: adenina timina e entre guanina citosina (mais fortes por terem as 3 pontes de hidrognio). Dogma Central da Biologia MolecularReplicao

DNA

Transcrio

RNA

Traduo

Protena

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O diagrama (proposto por Crick) sumaria o processo bsico de transferncia unidireccional de informao numa clula. O fluxo de informao DNA protena, no tem retorno, pois o cdigo de DNA convertido em protena mas no pode ser desconvertido. Algumas descobertas posteriores no coincidiram com este Dogma: O RNA pode sofrer replicao em alguns vrus e plantas; O RNA viral, atravs de uma enzima denominada transcriptase reversa, pode ser transcrito em DNA; O DNA pode directamente traduzir protenas especficas sem passar pelo processo de transcrio, porm o processo ainda no est bem claro.

Os retrovrus (HIV) usam a enzima transcriptase reversa para, dentro de uma clula hospedeira, sintetizar DNA tendo como molde o seu prprio material gentico RNA. O RNA ultrapassa muito o papel de mero intermedirio que sugeria a formulao inicial do dogma central. A sua importante funo no controlo da expresso gnica tem vindo a ser cada vez mais evidenciada. Replicao do DNA manuteno da informao gentica. Existem 3 modelos possveis de replicao: b. Dispersivo: c. Conservativo: b. Semi-conservativo:

Replicao do DNA: Duplicao semi-conservativa; Cada uma das cadeias actua como molde para uma nova cadeia, originando assim 2 duplas hlices; Cada molcula de DNA contm uma cadeia nova e outra antiga.

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GENTICA MOLECULAR Replicao, Transcrio e TraduoTransferncia de Informao Existem 3 processos de transferncia de informao: Replicao; Transcrio; Traduo.

Replicao do DNA Manuteno da informao Gentica O processo de replicao do DNA muito conservado, pois basicamente o mesmo, desde Escherichia coli, em qualquer mamfero. No entanto, nos mamferos a complexidade maior, o que se reflecte no aumento do nmero de polimerases ou de outros componentes proteicos intervenientes no processo. Replico unidade de replicao. Forquilha durante a duplicao, as cadeias vo-se separando, formando uma forquilha de duplicao onde so adicionados nucleotdios livres, formando, por complementaridade, a nova cadeia. Processo de replicao do DNA: Cromossoma circular: Bactrias (procariotas) possuem um nico cromossoma circular. A replicao ocorre apenas a partir de um ponto de origem da replicao e ocorre nos 2 sentidos, at regio terminus (TER). So necessrios cerca de 40 minutos para completar a replicao, que ocorre a cerca de 1000 pares de base / segundo. Ori incio da replicao. So regies ricas e Ats. Cromossoma linear: Eucariotas mltiplos pontos de origem de replicao, onde o processo pode ocorrer em simultneo. A clula de um mamfero pode conter entre 50 000 100 000 replices, unidades de replicao (cada uma com 40 200 Kb). O ciclo de replicao varia entre 1 hora / 4 horas a 24 horas. Polimerases Polimerases catalisam a ligao de nucletidos livres a uma cadeia de DNA. Procariotas: Polimerase I preenchimento de pequenos segmentos de DNA (replicao e reparao); actividade exonuclesica. Polimerase II enzima de reparao. Polimerase III funo principal durante o processo de replicao; elevada processividade; actividade exonuclesica.

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Eucariotas: Polimerase incio da replicao; baixa processividade; actividade primase. Polimerase enzima de reparao. Polimerase funo principal durante o processo de replicao; elevada processividade; actividade exonuclesica. Polimerase enzima de reparao. Polimerase - funo principal durante o processo de replicao do DNA mitocondrial; elevada processividade; actividade exonuclesica. As polimerases actuam sempre na direco 5 3. Apenas conseguem catalisar a ligao entre um 5-PO4 de um nucletido livre com 3OH de um nucletido j inserido numa cadeia. Processo de Replicao

Incio da replicao as polimerases no conseguem iniciar a sntese de novo a partir de um molde de cadeia simples. Precisam de um grupo 3OH livre ao qual possam adicionar um dNTP. Este grupo 3OH livre designa-se por primer, que sintetizado por uma primase, que A outra cadeia uma polimerase de RNA. parental permanece em cadeia simples. Replicao contnua (leading strand). Sntese progride no sentido da replication fork. Replicao descontnua com formao de fregmentos Okazaki (Lagging strand). Em cada fragmento a sntese processase no sentido contrrio ao movimento da forquilha de replicao mas, no global, o crescimento da nova cadeia acompanha a direco da abertura das cadeias. Fragmentos Okazaki: Procariotas cerca de 1500 pares de bases. Eucariotas cerca de 150 pares de bases.

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Ana Cristina Ribeiro GomesLeading strand obedece ligao global

A enzima DNA polimerase adiciona nucletidos DNA ao RNA primer.

A enzima DNA polimerase inspecciona (proofreads) as bases adicionadas e substitui os nucletidos incorrectos.

Sntese da leading strand continua na direco 5 3.

Lagging strand no obedece ligao global

Sntese descontnua produz fragmentos de Okazaki.


Sntese descontnua produz de 5 para 3 segmentos de DNA (fragmentos de Okazaki).


Actividade exonuclesica da polimerase de DNA remove RNA primers.

Actividade polimersica da polimerase de DNA preenche os gaps. Ligase forma ligaes no esqueleto acar-fosfato.

Leading strand cadeia contnua. Lagging strand cadeia descontnua. Fragmentos de Okasaki RNA primer juntamente com DNA. Fragmentos de Okazaki Aps a sntese de um fragmento de Okasaki, fica um gap na extremidade 3. O segmento de Okasaki adjacente tem em 5 um primer de RNA. Esta sequncia removida e o gap preenchido, ambas pela polimerase I. a ligao fosfodister final entre 2 fragmentos de Okasaki formada pela ligase de DNA.Concluso da sntese de fragmentos de Okasaki forma um intervalo entre o fragmento de Okasaki e o RNA primer precedente na lagging strand DNA polimerase I aumenta o fragmento Okasaki enquanto a actividade da exonuclease 5' 3' remove o RNA primer. Resulta num movimento do intervalo ao longo da lagging strand DNA polimerase I dissocia aps a extenso do fragmento Okasaki. A DNA ligase liga-se ao intervalo DNA ligase cataliza a formao de ligaes fosfodister, enquanto fecha o intervalo, creando uma lagging strand contnua. A enzima ento dissocia-se do DNA

Intervenientes no Processo de Replicao Incio da replicao protenas iniciadoras da replicao que quebram pontes de hidrognio no local de iniciao. Topoisomerases iniciam o processo de desdobramento do DNA quebrando uma das cadeias do DNA. Em consequncia, o DNA liberta-se da tenso na hlice no estado de super-enrolamento. Girase topoisomerase que actua sobre o estado de super-enrolamento do DNA.

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Helicases ajudam a desdobrar o DNA de cadeia dupla, depois de eliminado o estado de super-enrolamento. Single strand binding proteins (SSB) estabilizam o DNA de cadeia simples. Inibidores da girase de DNA inibidores da replicao bacteriana e tm actividade antibitica. Replicao em Eucariotas e Procariotas Cromossomas circulares Procariotas:

Cromossomas lineares Eucariotas:

Replicao no Fim dos Telmeros Na extermidade dos cromossomas (telmeros) h um problema com a replicao do DNA. Na leading strand a cadeia nova pode crescer at ao final, no entanto, o gap que fica aps a remoo dos primers de RNA no consegue ser preenchido. Em consequncia os cromossomas encurtam em cada ciclo de replicao. Estrutura dos telmeros:

O encurtamento dos telmeros pode funcionar como um relgico mittico que contabiliza o nmero de divises e limita o fim da proliferao celular sinalizando a entrada em senescncia, levando apoptose (processo natural de morte das clulas). Modelo da telomerase representado como um complexo ribonucleoproteco (RNA + protenas) com actividade de transcriptase reversa. A telomerase no se expressa na maioria das clulas somticas, mas apresenta nveis reduzidos em clulas estaminais e est activa em clulas germinativas. Nas clulas cancergenas, a telomerase est activa expresso de telomerase mantm os telmeros com o comprimento compatvel com a proliferao celular, atravs da adio de sequncias telomricas de repetio. Assim, a clula cancergema torna-se imortal. 41

Gentica Molecular e Citogentica (2010-2011) Transcrio


Passagem da informao gentica contida no DNA dos cromossomas no ncleo para o citoplasma, onde se encontram os ribossomas. O RNA processado no ncleo mas depois transportado para o citoplasma.

RNA cido Ribonucleico Os produtos iniciais de todos os genes so os cidos ribonucleicos (RNA). O RNA similar ao DNA, com excepo da molcula de acar ser a ribose (em vez de desoxirribose), ter a base uracilo em vez de timina e ser uma molcula de cadeia simples em vez de dupla. O RNA produzido por um processo que se baseia numa cpia do DNA (processo de transcrio sntese de RNA). Tipos de RNA RNA informativo: mRNA (RNA mensageiro) intermedirio no processo de descodificao dos genes em cadeias de polipeptdeos. Apresenta diferenas entre procariotas e eucariotas. RNA funcional nunca traduzido em polipeptdeos, possuindo funo ao nvel do RNA. Existem 2 tipos de RNA funcional (tRNA e rRNA) e mais outros 2 tipos nos eucariotas (snRNA e scRNA): tRNA (RNA de transferncia) molcula que transporta os aminocidos para o mRNA durante a sntese proteica. rRNA (RNA ribossmico) forma os ribossomas em conjunto com umas protenas especficas, so as mquinas usadas na sntese de protenas. snRNA (RNA nuclear pequeno) faz parte do processo de splicing no ncleo. scNA (RNA citoplasmtico pequeno) trfico das protenas na clula. Processo de Transcrio A transcrio catalizada por uma enzima, a RNA polimerase, e segue regras similares replicao. Apenas uma cadeia de DNA usada como molde para a transcrio de um dado gene. O RNA sintetizado na direco 5 3, ou seja, um novo nucletido encaixa sempre a extremidade 5 (do RNA) na extremidade 3 (do DNA) de um nucletido de uma cadeia em crescimento. Novos nucletidos apenas podem ser adicionados extremidade 3 de uma cadeia; Na extremidade 5 de uma nova cadeia de RNA (com 3 grupos fosfato livres) a polimerse de RNA no consegue adicionar nucletidos. Uma cadeia de RNA tem a mesma orientao que a cadeia de DNA que no usada como molde: Cadeia de DNA molde antisense; Outra cadeia de DNA sense.

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Ana Cristina Ribeiro Gomes Na polimerizao do RNA, nucletidos novos so sempre adicionados na extremidade 3 da molcula em crescimento. A RNA polimerase move-se a partir da extremidade 3 do molde do DNA, e o RNA forma-se na direco 5 para 3.

Passos Bsicos do Processo de Transcrio

Incio

Alongamento

Terminao

Transcrio em Procariotas Nos procariotas, existe um nico tipo de RNA polimerase que transcreve todos os tipos de RNA. . A adio da subunidade sigma permite, ento, a iniciao no local promotor.Quando um promotor encontrado, a holoenzima e o promotor formam um complexo fechado Mudana conformacional para um complexo aberto, produz uma bolha de transcrio no local de iniciao. Um pequeno RNA sintetizado A subunidade dissociase da enzima core e a RNA polimerase elimina o promotor. Protenas Acessrio, incluindo NusA, ligam-se polimerase

Holoenzima RNA polimerase liga-se no especificamente ao DNA

A holoenzima conduz a uma procura por um promotor

No necessrio um primer para iniciar a sntese de RNA. Quando o factor se liberta da holoenzima, ocorre a ligao de um factor de alongamento (NusA) essencial para a progresso da sntese da cadeia de RNA.

Closed complex = polimerase + + regio promotora. Open complex = polimerase + NusA + cadeia separada. Iniciao regio do DNA que d o sinal de iniciao da transcrio (promotores). Quando a transcrio inicia, o complexo sai. Elongao: O RNA sempre sintetizado de 5 para 3. Logo aps a iniciao o factor dissocia-se da RNA polimerase. Terminao a RNA polimerase reconhece sinais de terminao de 2 tipos. Diferentes factores sigma reconhecem e so especficos de diferentes promotores. Transcrio em Eucariotas 3 tipos de RNA polimerase: RNA polimerase I sintetiza o rRNA. RNA polimerase II sintetiza o mRNA. RNA polimerase III sintetiza o tRNA e pequenas molculas de RNA nuclear e citoplasmtico. 43



Em funo do que necessitam, diferentes clulas transcrevem diferentes segmentos de DNA, designados unidades de transcrio. Unidade de transcrio unidades discretas, espaadas irregularmente no DNA, que consistem em genes e bases flanqueadoras que regulam a sua expresso. No esto presentes no produto proteico. Nestes organismos, apenas uma fraco mnima do DNA total transcrita. Expresso gentica nos eucariotas o RNA processado no ncleo mas depois +e transportado para o citoplasma. Promotores nos Eucariotas Sequncias de DNA localizadas a montante de um gene que sinalizam o incio de transcrio. So reconhecidas por factores proteicos especficos (factores de transcrio) que a se ligam despoletando a organizao da maquinaria de transcrio. TATA box heptanucleotdeo composto por adeninas e timinas (TATATAA ou variantes) presente na maioria dos genes que levam produo de mRNA. Mutaes nesta sequncia diminuem a eficincia do promotor e, consequentemente, a taxa de transcrio do gene. A maioria das mutaes no impede o incio da transcrio mas muitas alteram o ponto de partida do processo. CAAT box geralmente, a sequncia com mais peso na eficincia do promotor. Cada gene tem o seu promotor. A complexidade dos promotores eucariotas muito varivel: Silencers sequncias que reprimem a actividade transcricional de um gene. Unidade de transcrio simples encontrada em eucariotas unicelulares (simples) como leveduras. Enhancers sequncias que aumentam a actividade transcricional de um gene. Podem localizar-se nas regies reguladoras 3 ou 5, ou nos intres. Mdulos complesxos de controlo d

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Genética Molecular e Citogenética - Sebenta