Upload
lamdat
View
213
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
UNESP –
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA
MEDICINA
Disciplina de Microbiologia Humana
AULAS PRÁTICAS DE BACTERIOLOGIA
2013
ÍNDICE
LEMBRETES IMPORTANTES ..................................................................................... 3
RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS .......................................................................... 3
MORFOLOGIA E COLORAÇÃO DA CÉLULA BACTERIANA................................ 4
MEIOS DE CULTURA E CONDIÇÕES FÍSICAS DE CULTIVO BACTERIANO .... 7
CONTROLE DE POPULAÇÕES BACTERIANAS ..................................................... 9
GENÉTICA BACTERIANA (CONJUGAÇÃO) ............ Error! Bookmark not defined.
DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE BACTERIANA A DROGAS ................... 15
STREPTOCOCCUS ..................................................................................................... 16
STAPHYLOCOCCUS .................................................................................................. 19
PSEUDOMONAS ......................................................................................................... 23
ENTEROBACTÉRIAS ................................................................................................. 25
3
LEMBRETES IMPORTANTES
1. Durante a permanência no laboratório de aulas práticas, é necessário o
uso de avental. Encerradas as atividades, o mesmo deve ser guardado em
uma sacola ou saco plástico, de modo a evitar possível contaminação do
ambiente fora do laboratório.
2. Não deixe seus pertences sobre as mesas onde os trabalhos práticos são
realizados.
3. Comunique imediatamente aos instrutores qualquer acidente
(derramamento de culturas sobre a bancada ou chão, ferimentos de
qualquer espécie, aspirações de culturas na boca, etc.).
4. Coloque sempre nos recipientes indicados o material contaminado.
5. Lave bem as mãos com desinfetante antes de deixar o laboratório.
6. Não é permitido o uso de chinelo, sandália ou qualquer outro calçado que
deixe os pés expostos.
RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS
Após o término de cada aula prática, o aluno deverá entregar relatório
individual da(s) atividade(s) do dia ao docente responsável pela mesma. No caso
da atividade ocupar o tempo de mais de uma aula, o relatório correspondente
deverá ser entregue ao final da última aula, sendo que o aluno que faltar em pelo
menos uma das aulas necessárias para sua conclusão, terá nota igual a zero em
seu relatório, mesmo que o entregue.
Os relatórios deverão ser simples e objetivos. Devem ser apresentados de
forma resumida, contendo o (s) objetivo (s), os procedimentos e os resultados dos
experimentos. Devem ser manuscritos e preferencialmente não ocuparem mais
que duas folhas.
4
MORFOLOGIA E COLORAÇÃO DA CÉLULA BACTERIANA
Nesta aula, será feita a observação de bactérias ao microscópio. Uma das
lâminas será corada pelos alunos, conforme roteiro abaixo. As demais já foram
coradas e estão prontas para a observação. Na observação das lâminas coradas
pelo método de Gram, as bactérias deverão ser classificadas quanto à coloração
(como Gram positiva ou negativa), o arranjo (agrupamento) e a morfologia (coco
ou bacilo). Além das lâminas coradas pelo método de Gram, será feita a
observação de uma lâmina contendo um esfregaço de escarro apresentando
bacilos álcool-ácido resistentes (que não se coram pelo método de Gram) e
corada pelo método de Ziehl-Neelsen.
Coloração de Bactérias pelo Método de Gram
1) Material
- Lâminas contendo o esfregaço de bactérias
- Bateria de Gram: violeta genciana (ou cristal violeta), lugol, álcool
95%, fucsina.
2) Técnica
a) Cobrir os esfregaços com a solução de violeta genciana. Esperar 1
minuto.
b) Escorrer a violeta genciana e cobrir os esfregaços com lugol.
Esperar 1 minuto.
c) Escorrer o lugol e descorar os esfregaços pelo álcool. Para isto,
deixe o álcool cair, gota a gota, sobre a lâmina, mantendo-a
inclinada. Considerar os esfregaços suficientemente descorados
quando o álcool não mais retirar o corante dos mesmos.
d) Lavar a lâmina em água corrente.
e) Cobrir os esfregaços com a solução de fucsina, esperar de 30
segundos a 1 minuto.
f) Lavar a lâmina em água corrente. Secar com auxílio de papel de
filtro.
g) Observar ao microscópio e desenhar.
5
Observar e Desenhar:
Lâmina B (Staphylococcus aureus)
Forma:________________
Gram: ________________
Lâmina A (Escherichia coli)
Forma:________________
Gram:_________________
Lâmina C (Streptococcus agalactiae)
Forma:________________
Gram: ________________
6
Lâmina E (Neisseria sp.)
Forma:________________
Gram:_________________
Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR)
(Mycobacterium tuberculosis)
Lâmina D (Bacillus cereus)
Forma:________________
Gram: ________________
7
MEIOS DE CULTURA E CONDIÇÕES FÍSICAS DE CULTIVO
BACTERIANO
A) Necessidades nutritivas de algumas bactérias
Material
- Cultura A (Escherichia coli)
- Cultura B (Staphylococcus aureus)
- Cultura C (Streptococcus agalactiae)
- Caldo sintético
- Caldo comum
- Caldo glicosado (caldo comum mais glicose)
- Alça de níquel cromo
Técnica
1. Semear cada uma das 3 culturas bacterianas nos diferentes meios.
2. Deixar na estufa a 37ºC até o dia seguinte.
3. Verificar a presença de crescimento (turvação do meio).
4. Anotar os resultados.
Cultura Crescimento em:
caldo sintético Caldo comum caldo glicosado
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Streptococcus agalactiae
8
B) Dependência do oxigênio para o crescimento bacteriano
Material
- Meio de Tiogel
- Caldo simples
- Cultura A (Escherichia coli)
- Cultura D (Pseudomonas aeruginosa)
- Cultura F (Clostridium sp.)
- Pipeta Pasteur
- Alça de níquel cromo
Técnica
Com a pipeta Pasteur, semear cada uma das culturas em tubos de tiogel.
Em seguida, semear a cultura F (Clostridium sp.), com alça de níquel
cromo, em caldo simples. Colocar todos os tubos na estufa. No dia
seguinte, observar os tubos, verificando, no meio de tiogel, a localização do
crescimento e, no caldo simples, se houve ou não crescimento.
Culturas Local de crescimento no meio de tiogel
Superfície Toda extensão Base do Meio
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
Clostridium sp.
9
CONTROLE DE POPULAÇÕES BACTERIANAS
A) Efeito de agentes físicos sobre as bactérias
Ação da temperatura, em função do tempo, sobre cultura bacteriana esporulada
ou não.
Material
- Cultura A em ágar inclinado (bactéria não esporulada)
- Cultura E em ágar inclinado (bactéria esporulada)
- Tubo contendo 1 ml da solução salina esterilizada
- Placas de Petri contendo ágar nutriente
- Banho-Maria a 60º C
- Alça de Níquel cromo
Técnica
1. Divida uma placa de ágar nutriente em 4 quadrantes, anotando diferentes
períodos de tempo em cada um: 0’, 5’, 10’ e 15’.
2. Coletar com a alça de níquel cromo, um pouco do crescimento da cultura A e
passar para o tubo contendo solução salina. Homogeneizar a suspensão.
3. Inocule (com a alça de níquel cromo) a suspensão no quadrante
correspondente ao tempo 0’.
4. Coloque o tubo com a suspensão em banho-maria a 60º C e, aos 10', 20' e 30',
retire amostras, inoculando-as nos respectivos quadrantes da placa de Petri
(proceda exatamente como no item 2).
5. Deixe a placa na estufa até o dia seguinte.
6. Fazer o mesmo com a cultura E
6. Observe a variação quantitativa de crescimento nos quadrantes em função do
tempo de aquecimento da cultura e anote os resultados (de + a ++++,
conforme a intensidade de crescimento).
Cultura Tempo de aquecimento
0’ 5’ 10’ 15’
Escherichia coli
Bacillus cereus
10
B) Efeito de agentes químicos (antisséptico para enxague bucal)
Material:
03 zaragatoas estéreis
Anti-séptico bucal de uso comercial
01 placa de ágar-nutriente
Procedimento:
1. Divida uma placa de ágar nutriente em 3 quadrantes, marcando A (antes
do tratamento), B (depois do primeiro tratamento) e C (depois do segundo
tratamento).
2. Friccionar uma zaragatoa estéril na mucosa da buchecha e semear no
quadrante A em zigue-zague.
3. Bochechar com parte do o anti-séptico bucal fornecido por 1 minuto.
4. Aguardar aproximadamente 3 minutos e repetir a coleta do material
semeando no quadrante B.
5. Bochechar novamente com o anti-séptico bucal por 1 minuto.
6. Aguardar 3 minutos e repetir a coleta do material semeando no quadrante
C.
7. Deixe a placa na estufa até o dia seguinte.
Resultados:
Fazer a leitura das placas, anotando o crescimento microbiano com cruzes
(de + a ++++) na tabela abaixo.
A B C
Crescimento
Microbiano
A (antes do tratamento),
B (depois do primeiro tratamento)
C (depois do segundo tratamento).
11
C) Efeito de agentes químicos sobre bactérias (álcool iodado a 0,1% de
acordo com o tempo)
Técnica
1. Umedeça uma zaragatoa em um tubo contendo salina. Após retirar o excesso
de salina, pressionando a zaragatoa contra a parede do tubo, esfregue-a
vigorosamente no dorso de uma das mãos;
2. Passe a zaragatoa em área correspondente à metade de uma placa com ágar
nutriente;
3. Umedeça uma segunda zaragatoa em álcool iodado a 0,1% e esfregue no
dorso da outra mão;
4. Aguarde 2 minutos para que haja ação do antisséptico;
5. Passe então, nessa área, uma terceira zaragatoa umedecida, tomando
cuidado para não ultrapassar a área higienizada. Inocule, passando a
zaragatoa na superfície da outra metade da placa com ágar nutriente;
6. Incube a placa na estufa, durante uma noite.
7. Observe a intensidade de crescimento anotando com sinal + na tabela abaixo.
Sem álcool-
iodado 0,1%
Com álcool-iodado
0,1%
Crescimento
Microbiano
12
GENÉTICA BACTERIANA
CONJUGAÇÃO
Material:
01 Placa de MacConkey contendo ácido nalidíxico (Nal), Cloranfenicol
(Clo), e 01 placa de ágar MacConkey contendo Nal + Clo
Culturas A (Escherichia coli C600, lac-) e B (Escherichia coli J53, lac+) em
meio líquido
01 tubo contendo 01 mL de caldo nutriente estéril
02 pipetas descartáveis e estéreis
Alça de níquel cromo
Procedimento:
1. Transfira para o tubo de ensaio contendo caldo nutriente estéril 1 mL da
cultura A e 1 mL da cultura B.
2. Incube a mistura a 37ºC durante aproximadamente 01 hora.
3. Após o período de incubação, semeie as amostras A, B e a mistura (M) nas
placas contendo meio seletivo MacConkey, com antibóticos (Nal + Clo), conforme
o esquema abaixo.
4. Para controle das culturas A e B, semeie cada uma das culturas recebidas
para essa aula prática em placas de ágar MacConkey contendo Nal e Clo
(separadamente), visando definir a capacidade das amostras em fermentar da
lactose e o perfil de resistência.
5. Incube as placas a 37ºC até o dia seguinte.
13
Resultados:
Registre os resultados obtidos na tabela abaixo:
Bactéria
Crescimento em ágar
MacConkey: Fermentação
da lactose
Padrão
de Resistência Nal Clo Nal + Clo
A
B
M
Nal (ácido nalidíxico, 50 g/mL), Clo (cloranfenicol, 50 g/mL )
Quais as hipóteses possíveis para explicar o ocorrido?
Como você poderia comprovar a sua hipótese utilizando métodos
moleculares?
14
Análise Molecular do Experimento de Conjugação
Eletroforese do DNA em gel de agarose das amostras A, B e da resultante da
mistura M
Atividade:
Identifique o perfil plasmidial de cada uma das amostras empregadas
nessa aula prática no gel apresentado acima.
Perfil
Plasmidial
Amostra
1
2
3
15
DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE BACTERIANA A DROGAS
Interpretação de Antibiograma pelo Método de Bauer e Kirby
Material
- Culturas bacterianas em Ágar Müeller-Hinton crescidas em contato com 5 discos
contendo drogas distintas
- Régua
- Tabela de referência
1. Com o auxílio da régua, medir o diâmetro do halo de inibição do crescimento.
2. Consultar a tabela de referência, para interpretar os resultados e anotar no
quadro abaixo.
Droga Concentração
(g/ml)
Diâmetro do halo de inibição do
crescimento
Interpretação*
1
2
3
4
5
* S = Sensível; R = Resistente; I = Intermediário.
16
STREPTOCOCCUS
EXERCÍCIOS
A) Observar placas de ágar sangue semeadas com as culturas C, D e E. Verificar
o tipo de hemólise.
Cultura Hemólise
C
D
E
B) Observar a coloração de Gram das culturas C e E.
Cultura C Cultura E
17
C) Prova da catalase.
Colocar sobre a cultura C (em caldo) e sobre uma cultura controle positivo
(Staphylococcus aureus) algumas gotas de água oxigenada. Verificar a reação e
anotar o resultado (Positivo = formação de bolhas).
Catalase
Cultura C
Staphylococcus aureus (Controle +)
D) Prova da bilesolubilidade
Princípio: Esta prova verifica a sensibilidade da bactéria à lise por sais biliares
Técnica: Adicionar 0,1 ml de uma solução a 10% de desoxicolato de sódio a 1
ml da cultura D. Incubar a 37o C e examinar após 15 minutos. Anotar o
resultado. Fazer o mesmo com a cultura E.
Leitura. Resultado positivo (suspensão solúvel) - a cultura fica transparente.
Resultado negativo (suspensão insolúvel) - a cultura permanece turva.
Cultura Bile-solubilidade
D
E
E) Prova de sensibilidade à bacitracina.
Princípio: O princípio desta prova baseia-se na inibição de crescimento do
Streptococcus pyogenes (-hemolítico, grupo A) frente a uma pequena
quantidade de bacitracina.
Técnica: Verificar se ocorre uma zona de inibição de crescimento ao redor do
disco de papel de filtro contendo bacitracina, colocado sobre a cultura C.
Leitura: sensível: existência de uma zona de inibição do crescimento.
resistente: ausência de zona de inibição de crescimento.
18
F) CAMP Teste
Princípio: A atividade da hemolisina do S. aureus é aumentada pela atividade
hemolítica do S. agalactiae (-hemolítico do grupo B).
Técnica: Verificar zona de hemólise, em placa de ágar sangue (feito c/ sangue
de carneiro), semeada com S. agalactiae e S. aureus.
Leitura: resultado - positivo: formação de uma zona de hemólise semelhante à
"ponta de flecha" na união das duas hemolisinas.
negativo: não formação de "ponta de flecha".
G) Identificação das culturas
Cultura C
Cultura D
Cultura E
19
STAPHYLOCOCCUS
A) Observar placas de ágar sangue semeadas com as culturas A e B. Descrever
as características das colônias e verificar hemólise.
Cultura Características das Colônias
Hemólise
A
B
B) Observar esfregaço da cultura A, corada pelo método de Gram e desenhar.
Observar ao microscópio e desenhar.
Cultura A
20
C) Prova da Catalase
Colocar sobre as culturas A e B e sobre uma cultura controle algumas gotas de
água oxigenada. Observar a reação e anotar o resultado.
Cultura Prova da Catalase
A
B
D) Prova da Coagulase
Princípio:
A coagulase é uma enzima bacteriana que age sobre o plasma sanguíneo.
Técnica:
Misturar 0,5 ml da cultura A com 0,25 ml de plasma citratado de sangue de coelho
a 1%. Incubar a 37oC e observar durante 4 horas. Fazer o mesmo com a cultura
B e anotar os resultados.
Resultado positivo - formação de coágulo.
negativo - suspensão inalterada
Cultura Prova da Coagulase
A
B
E) Compilação dos resultados e Identificação das culturas
Hemólise Catalase Coagulase Identificação
Cultura A
Cultura B
21
ESQUEMA DE IDENTIFICAÇÃO DOS GÊNEROS Staphylococcus e Micrococcus (família Micrococaceae)
Cocos Gram positivos Isolados ou agrupados
Catalase +
O OF
Micrococcus sp Staphylococcus sp
Coagulase
22
ESQUEMA DE IDENTIFICAÇÃO
Família: Streptococcaceae Gênero: Streptococcus
(cocos Gram positivos aos pares ou em cadeia)
Catalase (-)
Tipo de hemólise
Optoquina Bilesolubilidade Letalidade em camundongos Bacitracina
S R (+) (-) (+) (-) S* R*
S. pneumoniae S. -hemolítico S. pneumoniae S. -hemolítico S. pneumoniae S. -hemolítico S. pyogenes (g. A) Streptococcus (quaisquer dos grupos de Lancefield,
exceto o A)
S = sensível; R = resistente provas sorológicas
(grupos de Lancefield)
23
PSEUDOMONAS
1. Observar placa de ágar sangue semeada com Pseudomonas aeruginosa.
Descrever as características das colônias e verificar hemólise. Observar, também,
a pigmentação verde do crescimento em ágar simples – uma característica
peculiar da espécie.
Cultura Característica das colônias
P. aeruginosa
2. Corar, pelo método de Gram, esfregaço da cultura de Pseudomonas
aeruginosa. Observar ao microscópio e desenhar.
Pseudomonas aeruginosa
24
3. Teste de fermentação de Glicose
Observar uma cultura de Pseudomonas aeruginosa e uma de Escherichia
coli em caldo glicosado contendo vermelho fenol ou indicador andrade. Interpretar
a diferença de cor das culturas bacterianas e anotar os resultados na tabela
abaixo.
Cultura Cor da Meio Fermentação da Glicose
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
4. Prova da Citrocromo-oxidase
Fazer prova da citocromo-oxidase com a cultura de P. aeruginosa e com
uma cultura de Escherichia coli, para fins de comparação. Anotar o resultado.
Cultura Prova da citocromo-oxidase
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
25
ENTEROBACTÉRIAS
1. Observar a coloração das colônias das bactérias A, B e C cultivadas em placas
de ágar MacConkey e SS. Anotar os resultados da prova de lactose.
Cultura Coloração da colônia em
Lactose MacConkey SS
A
B
C
D
2. Interpretar crescimento das culturas A, B, C e D em meio de EPM, MILi e citrato
de Simmons (conforme orientação nas páginas 26 e 27) Anotar abaixo os
resultados (+ ou -) das provas para cada cultura.
Prova Cultura
A B C D
Citrato
Glicose
Gás
Urease
H2S
LTD*
Motilidade
Lisina
Indol
Lactose**
*LTD = L-triptofano desaminase
** Ver resultados nos meios de isolamento (item 1)
Comparando o perfil acima com o apresentado na tabela da página 28, identificar
cada uma das culturas.
Culturas: A________________________
B________________________
C________________________
D________________________
26
3. Reação sorológica para confirmação dos resultados de identificação
bioquímica.
Fazer reação de aglutinação em lâmina com as culturas B e C, utilizando os
soros anti - S. Flexneri e anti - Salmonella sp. Anotar os resultados (positivo ou
negativo).
Soro Cultura
B C
Anti - Shigella flexneri
Anti – Salmonella
27
28
29
Perfil Bioquímico e Motilidade de Algumas Enterobactérias
Prova E. coli Shigella
flexneri
Edwardsiella
tarda Salmonella
sp
Citrobacter
freundii
Klebsiella
pneumoniae
Enterobacterc
loacae Serratia
marcescens Proteus
mirabilis
Proteus
vulgaris
Morganella
morganii
Providencia
rettigeri
Citrato - - - + ou - + + + + + ou - + ou - - +
Glicose + + + + + + + + + + + +
Gás + ou - - + + + + + + ou - + + ou - + ou - + ou -
Urease - - - - + ou - + + ou - + ou - + ou - + + +
H2S - - + + + - - - + + - -
LTD* - - - - - - - - + + + +
Motilidade + ou - - + + + - + + + + + ou - +
Lisina + ou - - + + - + - + - - - -
Indol + + ou - + - - - - - - + + +
Lactose + - - - + ou - + + ou - - - - - -
*LTD = L-triptofano desaminase