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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
COMBINACIÓN DE TOXINAS Cry DE Bacillus thuringiensis CON UN BACULOVIRUS PARA EL DESARROLLO DE UN BIOINSECTICIDA DE
AMPLIO ESPECTRO
TESIS
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE
MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
PRESENTA
Q.F.B. NADIA DIANA GUIDO CIRA
REYNOSA, TAMS NOVIEMBRE 2012
INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
COMBINACIÓN DE TOXINAS Cry DE Bacillus thuringiensis CON UN BACULOVIRUS PARA EL DESARROLLO DE UN BIOINSECTICIDA DE
AMPLIO ESPECTRO
TESIS
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE
MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
PRESENTA
Q.F.B. NADIA DIANA GUIDO CIRA
REYNOSA, TAMS NOVIEBRE 2012
AGRADECIMIENTOS
A Dios ya que sin el nada es posible.
A mi esposo Esteban.
A mis padres Lucy y Mario.
A mis hermanos Leslye, Jaime y Mario.
A mis compañeros y amigos de generación ya que en hechos siempre encontré apoyo.
Al Centro de Biotecnología Genómica y a todo su personal académico y docente.
Al laboratorio de Biotecnología Ambiental a la Dr. Ninfa, Maribel, Jesús y Alejandro
con quienes siempre pude contar.
Al la Dra. Patricia Tamez Guerra del Laboratorio de Inmunología y Virología,
responsable de la Unidad de Formulación de Biológicos de la Universidad Autónoma de
Nuevo León, a su equipo de trabajo y especialmente a su alumno de maestría Alonso.
Por el apoyo brindado durante mi estancia.
Al fondo del Consejo Nacional para la Ciencia y Tecnología.
Al fondo del Programa Institucional para la Formación de Investigadores.
A todos los profesores que compartieron conmigo sus conocimientos.
DEDICATORIA
La conclusión de este trabajo representa para mí la suma de esfuerzos de todas
las personas importantes en mi vida que aun sin darse cuenta me apoyaban.
Por ello es para mí un honor dedicar este trabajo a:
A cinco personas maravillosas a las que espero no defraudar mi familia y a un
esposo recién desempacado que como el mismo lo dijo representa el viento bajo mis
alas.
A mi cuarteto peludo Toto, Miguel, Camila e Hilda.
A mis amigos Lola, Paty, Beto, Alex, Willy, Cristina e Irais que se
convirtieron en mis mejores amigos durante estos 2 años.
A mi mamaofe que aunque la perdí siempre la recordare.
i
INDICE
LISTA DE CUADROS………………………………………………………...………...v
LISTA DE FIGURAS…………………………………………………………………...vi
ABREVIATURAS…………………………………………………………………...…vii
RESUMEN……………………………………………………………………….…….viii
ABSTRACT……………………………………………………………………………...x
INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………..1
ANTECEDENTES……………………………………………………………………….2
Control de plagas…………………………………………………………………..2
Manejo Integrado de Plagas (MIP)………...………………………………………3
Control biológico…………………………………………………………………..3
Bacillus thuringiensis……………………………………………………………...4
Características generales…………………………………………………….4
Descubrimiento……………………………………………………………...5
Clasificación………………………………………………………...……….5
Hábitat……………………………………………………………………….7
Genoma de B. thuringiensis…………………………………………………7
Factores de patogenenicidad de B. thuringiensis…………………………....7
Producción de δ- endotoxinas o toxinas Cry en B. thuringiensis……..…….8
Clasificación de las toxinas Cry o δ-endotoxinas…………………………...8
Patogenicidad de B. thuringiensis…………………………………..……….9
Configuración de las toxinas Cry…………………………………………..10
Mecanismo de acción de las toxinas Cry o δ-endotoxinas…………………11
Patogénesis de las larvas infectadas con B. thuringiensis………………….11
Resistencia de los insectos a B. thuringiensis……………………………...12
Bioseguridad de B. thuringiensis…………………………………………..12
ii
Importancia de B. thuringiensis en el mercado de los insecticidas………...13
Baculovirus…………………………………………………………………….....14
Descubrimiento………………………………………………………….…14
Clasificación………………………………………………………………..14
Genoma de los baculovirus………………………………………..……….15
Estructura de los baculovirus………………………………………………15
Patogénesis de los baculovirus……………………………………………..16
Mecanismo de infección de los baculovirus……………………………….16
Patogénesis de las larvas infectadas con baculovirus……………………...17
Bioseguridad de los baculovirus…………………………………………...17
Baculovirus en el mercado insecticida……………………………………..18
Baculovirus recombinantes como bioinsecticidas………………………....18
Bioinsecticidas microbianos……………………………………………………...20
Formulaciones bioinsecticidas………………………..................................21
Clasificación de las formulaciones…………………………………………22
Combinaciones bioinsecticidas…………………………………………….23
Ventajas y desventajas del uso de los bioinsecticidas……………………...23
Cultivos de importancia económica en el estado de Tamaulipas………………...24
Soya………………………………………………………………………...24
Sorgo…………………………………………………………………….....25
Maíz……………………………………………………………………...…25
Spodoptera exigua Hübner (Lepidoptera: Noctuidae) plaga de soya……...25
Cultivos que ataca……………………...…………………………….25
Ciclo biológico………………………………………………..……..26
Spodoptera frugiperda J.E Smith (Lepidoptera: Noctuidae) plaga de sorgo y maíz……………………………………………………………………...…26
Cultivos que ataca……………………………………………………26
Ciclo biológico……………………………………………………....26
iii
JUSTIFICACIÓN……………………………………………………………………….28
HIPÓTESIS……………………………………………………………………………..30
OBJETIVO GENERAL………………………………………………………………...31
OBJETIVOS ESPECIFICOS…………………………………………………………...31
MARERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………………32
Extracción de DNA plasmídico de B. thuringiensis………………………..…….32
Detección de los genes cry1, cry2 y cry9………...………………………..……..33
Obtención del complejo espora-cristal mediante la técnica de co-precipitación lactosa-acetona (Dulmage, 1970)…………………………………………..…….34 Bioensayos de toxicidad de B. thuringiensis contra larvas de lepidópteros…...…35 Cultivo de baculovirus en larvas, extracción y conteo de los cuerpos de oclusión (OBs) (Galán-Wong et al, 2003)……………………………………………...….36 Identificación de los baculovirus (Aquesolok, 2011)…………………………….37
Purificación de los poliedros……………………………………………..…….…37
Extracción del DNA viral…………………………………………………..…….37 Reacción en cadena de la polimerasa (Modificado de Woo, 2001)…………...….38 Purificación de los productos de PCR………………………………..…………..38 Reacción de secuenciación……………………………………………….………39 Ensayos de mortalidad con los baculovirus…………………………………...….39 Elaboración del bioinsecticida…………………………………………………....39
Combinación de entomopatógenos…………………………………...……39 Elaboración de formulados granulares para bioensayos de preferencia alimenticia…………………………………………………………….……40 Bioensayos de preferencia alimenticia………………………………..……41 Solución base……………………………………………………………....45 Evaluación de la actividad tóxica de la solución base en larvas neonatas de S. exigua y S. frugiperda…………………………………………………...45
iv
Elaboración de los formulados bioinsecticidas………………………..…...45
Determinación de la actividad tóxica de los formulados bioinsecticidas a nivel invernadero (Modificado de Tamez-Guerra, 2002)…………….……46
RESULTADOS…………………………………………………………………………47
Selección de cepas de B. thuringiensis…………………………….……………..47
Bioensayos de mortalidad en larvas neonatas de S. exigua y S. frugiperda. Utilizando cepas de B. thuringiensis……………………………………….49
Determinación de la concentración letal media (CL50) de la cepa HD-133..52
Selección de baculovirus…………………………………………………………52
Identificación de los baculovirus por medio de secuenciación y comparación de los fragmentos del gen poliedrina mediante la herramienta BLAST…...52
Bioensayos de mortalidad de baculovirus…………………………….……52
Determinación de la CL50 de los baculovirus SeMNPV y SfMNPV………52
Elaboración del bioinsecticida……………………………………………………54
Combinación de entomopatógenos……………………….………………..54
Bioensayos de preferencia alimenticia……………………………………..54
Evaluación de la actividad toxica de la solución base en larvas neonatas de S. exigua y S. frugiperda…………………………………………………...57
Elaboración de los formulados bioinsecticidas……………………….……57
Determinación de la actividad toxica de los formulados bioinsecticidas a nivel invernadero......…………………………………………………….....57
DISCUSIONES…………………………………………………………………………65
CONCLUSIONES……………………………………………………………...……….72
PERSECTIVAS………………………………………………………………...……….73
REFERENCIAS………………………………………………………………………...74
v
LISTA DE CUADROS
CUADRO PÁGINA
1. Diferentes tipos de organismos usados como agentes de control biológico……..4
2. Serovariedades de B. thuringiensis………………………………………...……..6
3. Ejemplos de baculovirus modificados mediante la introducción de un gen
foráneo utilizados como bioinsecticidas……………………………...…………19
4. Clasificación de las formulaciones insecticidas……………………...…………22
5. Secuencia de iniciadores para los genes cry1,2 y 9…………………………..…33
6. Programa de amplificación para el gen polihedrina……………………...……..38
7. Partes deshidratadas de las plantas utilizadas como fagoestimulantes……….…40
8. Formulados fagoestimulantes y controles utilizados para los bioensayos de
preferencia alimenticia………………………………………………………….41
9. Confrontaciones de 2 alternativas para los bioensayos de preferencia alimenticia
en larvas neonatas de S. exigua…………………………………………………43
10. Confrontaciones de 2 alternativas para los bioensayos de preferencia alimenticia
en larvas neonatas de S. frugiperda……………………………………..………44
11. Bioensayo de preferencia alimenticia de 2 alternativas en larvas neonatas de S.
exigua……...........................................................................................................55
12. Bioensayos de preferencia alimentaria de 2 alternativas en larvas neonatas de S.
frugiperda……………………………………………………………….………56
13. Ingredientes utilizados en las formulaciones bioinsecticidas para S. exigua
aplicadas en hojas de soya……………………………………………..………..60
14. Ingredientes utilizados en las formulaciones bioinsecticidas para S. frugiperda
aplicadas en hojas de maíz y sorgo……………………………………...………62
vi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA PÁGINA
1. Fotografía de un cultivo de Bacillus thuringiensis teñido con tinción Gram……..5
2. Cuerpos de oclusión vistos al microscopio óptico………………………………14
3. Fotografía que muestra la disposición de los formulados granulares de acuerdo al
método de dos alternativas…………………………………………………..…..42
4. Detección del gen cry 1 en cepas de Bacillus thuringiensis……………………..47
5. Detección del gen cry 2 en cepas de Bacillus thuringiensis……………………..48
6. Detección del gen cry 9 en cepas de Bacillus thuringiensis……………………..48
7. Mortalidad de larvas neonatas de Spodoptera exigua tratadas con dos
concentraciones del complejo espora-cristal de diferentes cepas de Bacillus
thuringiensis a los 7 días de exposición………………………………………....50
8. Mortalidad de larvas neonatas de Spodoptera frugiperda tratadas con dos
diferentes concentraciones del complejo espora-cristal de cepas diferentes de
Bacillus thuringiensis a los 7 días de exposición…………………………..……51
9. Detección del gen de la polihedrina………………………………………...…...53
10. Mortalidad de larvas neonatas de Spodoptera exigua y Spodoptera frugiperda
expuestas a la solución base durante 7 días……………………………………...60
11. Mortalidad los 7 días de larvas neonatas de Spodoptera exigua con 24 h de
exposición a las formulaciones…………………………………………………..61
12. Mortalidad a los 7 días de larvas neonatas de Spodoptera frugiperda con 24 h de
exposición a las formulaciones en hojas de maíz………………………………..63
13. Mortalidad a los 7 días de larvas neonatas de Spodoptera frugiperda con 24 h de
exposición a las formulaciones en hojas de sorgo……………………………….64
vii
ABREVIATURAS
ALP Fosfatasa alcalina
APN N-amipeptidasa
CP Polvo para contacto directo
CTP Caldo triptosa fosfato
FAO Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura
NPV Nucleopoliedrovirus
GM Genéticamente modificados
GPI Glicosilfosfatil- inosintol
GRV Granulovirus
MIP Manejo integro de plagas
MNPV Multiple nucleopoliedrovirus
OBs Cuerpos de oclusión
ODV Viriones derivados ocluidos
OD Emulsión
OF Suspensión concentrada en aceite
SC Suspensión concentrada
SDS Dodecil sulfato de sodio
serovar Serovariedad
SNPV Simple nucleopoliedrovirus
SU Suspensión
VB Viriones brotados
WG Gránulos dispensables en agua
WP Polvo humectable
viii
RESUMEN
La combinación de entomopatógenos tiene como principal característica disminuir las
desventajas que por sí solos presentan estos, cuando son aplicados como bioinsecticidas,
por ello en este trabajo se realizó una combinación de entomopatógenos aunada a una
formulación, teniendo como objetivo principal, obtener un bioinsecticida aplicable en
diferentes cultivos de interés agrícola como son: soya sorgo y maíz, para controlar
plagas de los mismos (S exigua y S. frugiperda).
Por lo anterior en los bioensayos toxicidad de B. thuringiensis se escogió a la cepa HD-
133 por su mortalidad en ambas plagas y los baculovirus empleados fueron SeMNPV
para S. exigua y SfMNPV para S. frugiperda, se determino la CL50 para cada uno de los
patógenos y las CL50 obtenidas se probaron experimentalmente la combinación
resultante causó una mortalidad del 98.52%. Estos experimentos mostraron que en la
combinación de los entomopatógenos existe un efecto de sinergismo de las mortalidades
dadas por cada uno individualmente.
Para realizarla la formulación insecticida se empleó aceite de soya comercial como
adherente, Tween 20® como emulsificante, agua y por medio de bioensayos de
preferencia alimenticia se determinó que el fagoestimulante preferido por ambas plagas
fue la hoja de soya seca, a esos ingredientes se les añadieron concentraciones de los
ingredientes activos. Para S.exigua se emplearon 400, 500 y 600 µg/ml del complejo
espora cristal (HD-133) y 5x103, 5x104 y 5x105 OBs de SeMNPV y para S. frugiperda se
usaron 700, 850 y 1200 µg/ml del complejo espora- cristal y 5x106, 5x107 y 2.5x108
OBs de SfMNPV, se probaron las concentraciones por separado y combinadas para cada
plaga colocndose en hojas de soya para S. exigua y en hojas de maíz y sorgo para S.
frugiperda.
En S. exigua las formulaciones con las combinaciones de principios activos, presentaron
un sinergismo al elevar las mortalidades que habían presentado los entomopatógenos por
si solos, en el caso de la última combinación de 600 µg/ml con 5x105 OBS no se pudo
medir el sinergismo ya que presento una mortalidad del 72% igual a la presentada por
SeMNPV a la misma concentración sin el complejo espora-cristal de HD-133
ix
En S. frugiperda las formulaciones utilizadas para las hojas de maíz y sorgo fueron las
mismas por ello los resultados fueron semejantes, lo que indica que el tipo de planta no
es un factor que afecte la formulación. En las formulaciones que contienen los
combinados de los principios activos, la variación más clara se presentó en la
formulación 700µg/ml con 5x106 OBs con un 28% en maíz y un 40% de mortalidad en
sorgo, las restantes combinaciones no variaron en sorgo ni en maíz con un 100% de
mortalidad.
Con este trabajo se obtuvo un formulado aplicable en tres diferentes plantas con
diferentes entomopatógenos como principio activo, llegando a la conclusión final de que
la combinación de B. thuringiensis con SeMNPV o SfMNPV presento un efecto
acumulativo de las mortalidades cuando son combinados las CL50 sin formulación pero
cuando se realizaron las formulaciones a otras concentraciones se observo un efecto
antagónico.
x
ABSTRACT
The main objective to the combination of entomopathogenics is to decrease the
disadvantages of these when they are applied as bioinsecticides. Therefore a
combination of entomopathogenic agents coupled to a formulation was obtain. This new
biopesticide can be applied to economically importants crops such as maize, sorghum
and soybean to control S. exigua and S. frugiperda.
In toxicity bioassays the B. thuringiensis HD-133 strain and the baculoviruses SeMNPV
for S. exigua and SfMNPV for S.frugiperda were selected. The LC50 was determined for
each of the pathogens and the LC50 was used to prepare the combined formulation. The
combined formulation exhibit a mortality of 98.52%. These experiments showed that the
combination of entomopathogenic causes a cumulative mortality effect.
To prepare the insecticide formulation an inert solution ws prepared containing
commercial soybean oil as adherent, Tween 20® as emulsifier, water and
phagostimulant determined previously by feeding preference bioassays. The feeding
stimiulant preferred by both insects was dried soyben leaf. The active ingredients were
use in the formulations in S. exigua 400, 500 and 600 µg/ml of spore-crystal complex
(HD-133) and 5x103, 5x104 and 5x105 OBs of SeMNPV and for S. frugiperda were used
700, 850 and 1200 mg/ml of the spore-crystal complex and 5x106, 5x107 and 2.5x108
OBs SfMNPV, all concentrations were tested separately and combined for each pest, in
soybean leaves for S. exigua and in leaves of maize and sorghum for S. frugiperda.
For S. exigua, formulations containing both entomopathogens showed synergistic
activity In the case of the combination of 600µg/ml with 5x105 OBs, synergism
measurement became difficult as it exhibited 72% mortality equal to that presented by
the same concentration SeMNPV without the spore-crystal complex of HD-133.
In S. frugiperda the formulations used for maize leaves and sorghum were the same, so
the results are similar in both plants, only the formulations containing the combination
of active principles with 5x106 700µg/ml OBs showed one clearer variation in the
xi
formulation in maize with 28% and 40% mortality in sorghum, the others formulations
combinations remaining unchanged in sorghum or corn, with 100% mortality.
This work present an applicable formulated in three different plants with different entomopathogenic as active ingredient, leading to the final conclusion that the combination of B. thuringiensis with SeMNPV or SfMNPV has cumulative effect mortalities when they were combined.
1
INTRODUCIÓN
Hoy en día y desde su invención la principal forma de combate de plagas agrícolas es
con el uso de insecticidas químicos, sin embargo la utilización de estos ha traído consigo
una serie de consecuencias que han provocado la búsqueda de alternativas para
disminuir estos daños e incluso eliminarlos.
Con lo anterior surge una serie de investigaciones enfocadas al uso de recursos naturales
utilizados para el control de plagas llamado control biológico. Esta estrategia contempla
el empleo de los enemigos naturales de las plagas (entomopatógenos, depredadores o
parasitoides), desarrollándose así formulaciones exitosas a base de entomopatógenos y la
liberación controlada de depredadores en campo, sin embargo estas estrategas presentan
la principal desventaja de ser dirigidos únicamente contra una plaga en específico.
Por lo anterior el objetivo principal del siguiente trabajo fue realizar una combinación de
B. thuringiensis con baculovirus (SeMNPV y SfMNPV) que permita el control de dos
plagas (S. exigua y S. frugiperda) causantes de daño en tres cultivos de interés
económico maíz, sorgo y soya, mediante el desarrollo de una formulación a base de
ingredientes naturales: agua corriente, aceite de soya como acarreador, hoja deshidratada
de soya como fagoestimulante, azúcar como agente adherente y un aceite hidrogenado
poliglicosilado Tween 20® que funciona como emulsificador, todos estos ingredientes
con la finalidad de potenciar la actividad insecticida de los ingredientes activos (B.
thuringiensis, SeMNPV y SfMNPV).
Para comprobar la eficiencia de la formulación insecticida se realizaron bioensayos de
laboratorio e invernadero con diferentes concentraciones de los ingredientes activos,
reportándose los porcentajes de mortalidad e identificando la concentración adecuada de
cada uno de los entomopatógenos para cada una de las plagas, así se combinaron para
crear una sola formulación aplicable en los tres cultivos siendo eficaz para ambas plagas.
2
ANTECEDENTES
Control de plagas.
En la historia de la agricultura, el hombre siempre ha dado importancia a otras especies
de la naturaleza que ayudan o dificultan la producción agrícola. Entre estas especies se
encuentran los insectos ya que son los primeros en colonizar los campos de cultivo
recién sembrados y en muchas de las ocasiones, sobrepasan el umbral tolerado por los
agricultores convirtiéndose en una plaga (Alomar., 2005).
Desde su invención los insecticidas químicos han representado la principal alternativa
para el control de numerosas plagas (Rosas-García., 2008), su uso se ha propago sin
tomar en cuenta los efectos adversos de éstos como: el desarrollo de resistencia en las
plagas, surgimiento de plagas secundarias, así como el ataque a organismos no blanco y
daños al medio ambiente y otros organismos (Rosas-García y De Luna-Santillana.,
2006).
Después de la Segunda Guerra mundial la revolución verde proporcionó grandes
ventajas a la agricultura mediante el uso de agroquímicos y fertilizantes, que dieron una
alta producción en los cultivos. El resultado fue un decremento de las poblaciones de
insectos y en consecuencia, los insecticidas químicos fueron más populares debido a su
acción residual y su amplio espectro de toxicidad. Sin embargo el uso indiscriminado de
estos compuestos provocó que en 1950 reaparecieran las plagas, debido a la eliminación
de los enemigos naturales de éstas y el surgimiento de poblaciones resistentes a los
insecticidas, además de los daños al medio ambiente (Rosas-García, 2009).
Esto permitió la investigación y la detonación de una nueva forma eficaz de combatir
plagas sin causar daños al medio ambiente: el Manejo Integrado de Plagas, que
contempla el uso de distintas estrategias para el control de las mismas (Knaak et al.,
2010).
3
Manejo Integrado de Plagas (MIP).
El concepto de Manejo Integrado de Plagas (MIP) fue desarrollado entre los años de
1950 y 1960 para dirigir o solucionar los problemas agrícolas causados por el uso de
químicos de amplio espectro (Li et al., 2001).
Según la organización de las naciones unidas para la agricultura y alimentación (FAO,
2012), El MIP es una metodología que emplea todos los procedimientos aceptables
desde el punto de vista económico, ecológico y toxicológico para mantener las
poblaciones de organismos nocivos por debajo del umbral económico, aprovechando en
la mayor medida posible, los factores naturales que limitan la propagación de dichos
organismos. Por lo tanto el MIP tiene como objetivo proteger al máximo las cosechas, al
menor costo y con el mínimo riesgo al hombre, sus agroecosistemas, los ecosistemas, y
la biosfera (Romero, 2004).
Dentro del MIP existen diferentes métodos para el control de plagas entre ellos se
encuentran: el control cultural, biológico, etológico, mecánico, físico, químico y
genético. Todos estos se realizan con la finalidad de mantener las poblaciones de plagas
a un nivel en el cual no causen un daño económico (Cañedo et al., 2011).
Control biológico.
Las estrategias de control biológico son mencionadas en antiguos escritos de estudiosos
chinos y egipcios. Una de las historias relata la práctica de los jardineros de varios
faraones egipcios, que mantenían colecciones de bacterias para usarlas contra insectos,
que atacaban y devastaban los jardines de las casas y de las tumbas de los faraones
(Ibrahim et al., 2010).
El control biológico consiste en la represión de las plagas mediante sus enemigos
naturales o controladores biológicos, como pueden ser parasitoides, depredadores o
entomopatógenos (Cuadro 1). Los parasitoides son aquellos insectos que viven dentro
del cuerpo del insecto plaga (hospedero), del cual se alimentan progresivamente hasta
matarlo. Los depredadores son aquellos insectos que se alimentan rápidamente de la
4
plaga (presa) hasta causarle la muerte (Cañedo et al., 2011). La palabra entomopatógeno
se deriva de dos palabras griegas “entomon” que significa insecto y “genes” que
significa daño, por lo tanto el significado etiológico de microorganismos
entomopatógenos es microorganismos que dañan a los insectos. Estos microorganismos
pueden ser hongos, bacterias, virus y nemátodos entre otros (Cuadro 1) (Sandhu et al.,
2012)
Cuadro 1. Diferentes tipos de organismos usados como agentes de control biológico.
Clasificación Agente Acción biológica
Parasitoides Trichogramma chilonis, Epiricania
melanoleuca
Viven y se alimentan
interna o externamente
en el hospedero
Depredadores
Chysoperla carnea, Cryptolaemus
montrouzieri
Insectos que matan y
devoran a su presa
Microorganismos
entomopatógenos
Bacillus thuringuiensis, especies de
hongos como Trichoderma,
Nomuraea, Paecilomyces, Verticilium,
Metarhizium, Beauveria y virus como
Baculovirus.
Causan enfermedades
en los insectos
hospederos
Bacillus thuringuiensis.
Características generales.
Bacillus thuringiensis es un bacilo gram positivo, de flagelación perítrica, que mide de 3
a 5 µm de largo por 1 a 1.2 µm de ancho. Es un microorganismo anaerobio facultativo,
quimioorganotrofo, posee la característica de desarrollar esporas de resistencia
elipsoidales. Los distintos aislamientos de B. thuringiensis presentan en general
características bioquímicas comunes como: la capacidad de fermentar glucosa, fructosa,
5
trealosa, maltosa, ribosa y de hidrolizar gelatina, almidón, glucógeno, esculina y N-
acetil-glucosamina (Sauka y Benintende, 2008).
Descubrimiento
La Era de B. thuringiensis como entomopatógeno usado en el control de plagas inició en
Japón en 1902 cuando Shigetane Ishiwata, aisló un bacilo causante de una infección que
podía propagarse a gran velocidad entre una colonia de gusanos de seda (Bombix mori).
Posteriormente en 1911 Berlier en Alemania, aisló una bacteria de larvas enfermas
(Anagasta küehniella o Epihestia küehniella), y notó que en la bacteria además de la
espora típica (Fig. 1) había un segundo cuerpo denominado “Restkörper” o cuerpo
parasporal. A este aislado lo denominó B. thuringiensis, por Turingia (Thüringen),
nombre del sitio donde fue aislado (Ibrahim et al., 2010).
Figura 1. Fotografía de un cultivo de Bacillus thuringiensis teñido con tinción Gram, donde se observa la formación de espora.
Clasificación.
B. thuringiensis pertenece a la familia Bacillaceae y se ubica dentro del grupo 1 del
género Bacillus; que incluye a Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus mycoides,
así como también a los más recientemente descritos Bacillus pseudomycoides y Bacillus
weihenstephanensis (Ochoa y Arrivillaga, 2009).
Adicionalmente por serologia B. thuringiensis se clasifica en 84 serovariedades de
acuerdo con el antigeno flagelar H (Cuadro 2).
6
Cuadro 2. Serovariedades de B. thuringiensis. (Sauka y Benintende, 2008).
Antigeno
H
Serovar Antigeno
H
Serovar Antigeno
H
Serovar
1 thuringiensis 19 tochigiensis 44 higo
2 finitimus 20a, 20b yunnanensis 45 roskildiensis
3a, 3c alesti 20ª,20c pondicheriensis 46 chanpaisis
3a, 3b, 3c kurstaki 21 colmeri 47 wratislaviensis
3a, 3d sumiyoshiensis 22 shandongiensis 48 balearica
3a, 3d, 3e fukuokaensis 23 japonensis 49 muju
4a, 4b sotto 24a, 24b neoleonensis 50 navarrensis
4a, 4c kenyae 24a, 24c novosibirsk 51 xiaguangiensis
5a, 5b galleriae 25 coreanensis 52 kim
5a, 5c canadensis 26 silo 53 asturiensis
6 entomocidus 27 mexicannensis 54 poloniensis
7 aizawai 28a, 28b monterrey 55 palmanyolensis
8a, 8b morrisoni 28a, 38b jegathensan 56 rongseni
8a, 8c ostriniae 29 amagiensis 57 pirenaica
8a, 8d nigeriensis 30 medellin 58 argentinensis
9 tolworthi 31 touchini 59 iberica
10a, 10b darmstadiensis 32 cameroun 60 pingluonsis
10a, 10c londrina 33 leesis 61 sylvestriensis
11ª, 11b toumanoffi 34 konkukian 62 zhaodongensis
11ª, 11c kyushuesis 35 seoulensis 63 bolivia
12 thompsoni 36 malaysiensis 64 azorensis
13 pakistani 37 andaluciensis 65 pulsiensis
14 israelensis 38 oswaldocruzi 66 graciosencis
15 dakota 39 brasiliensis 67 vazensis
16 indiana 40 huazhongensis 68 thailandensis
17 tohokuensis 41 sooncheon 69 pahangi
18a, 18b kumamotoensis 42 jinhongiensis 70 sinensis
18a, 18c yosso 43 guiyangiensis 71 jordanica
7
Hábitat.
B. thuringiensis es una bacteria cosmopolita, distribuida alrededor del mundo, aunque se
encuentra presente en suelo (su principal reservorio), se puede encontrar en la superficie
de plantas, insectos muertos y granos almacenados (Karnataka, 2009).
Genoma de B. thuringiensis.
Las cepas de B. thuringiensis presentan un genoma de 2.4 a 5.7 millones de pb, la
mayoría de los aislados presentan varios elementos extra cromosomales, algunos de
ellos lineales y otros circulares (Schnepf et al., 1998).
Factores de patogenicidad de B. thuringiensis.
Heimpel, consideró tres exotoxinas (β, α y γ en orden de importancia) y una endotoxina
(δ) producidas por B. thuringiensis. La exotoxina β, conocida también como
thuringiensina, es soluble en agua, termoestable y dializable; su estructura química es un
derivado fosforilado del nucleotido de adenina. Se han encontrado varios tipos de β-
exotoxinas aunque éstas no son producidas por todas las cepas de B. thuringiensis. Su
producción se asocia con algunos serotipos como H1, H4, H8, H9 y H10. Las exotoxinas
α y γ se consideran fosfolipasas C y lecitinasas, respectivamente (Fernández-Larrea,
2002).
Existen diferentes tipos de endotoxinas y éstas se conocen como δ-endotoxinas o toxinas
Cry (derivado del inglés “crystal”), debido a la forma de cristal que presentan. Muchas
de estas proteínas han causado toxicidad hacia diversos insectos. Sus pesos moleculares
varían entre 72 y 135 kDa, se desnaturalizan por el calor y son solubles en condiciones
alcalinas (Fernández-Larrea, 2002).
Adicionalmente se ha descrito un cristal proteico más pequeño de 28 kDa que presenta
baja toxicidad en mosquitos y sólo lo producen las variedades, kyushiensis, morrisoni,
israelensis, darmstadiensis, codificado por el gen cyt (Fernández-Larrea, 2002).
8
Producción de δ-endotoxinas o toxinas Cry en B. thuringiensis.
Las células de B. thuringiensis después de la fase de crecimiento exponencial producen
una espora y sintetiza cuerpos microscópicos que adquiere la forma de cristal, de
diferentes formas como bipiramidal, esférica, romboidal, cuboidal e irregular, también
llamados cuerpo parasporal, los cuales esta constituidos por una variedad de proteínas
llamadas δ endotoxinas o Cry y Cyt (Ochoa y Arrivillaga, 2009, Vázquez-Pineda et al.,
2012).
Los genes cry que codifican estas δ-endotoxinas o toxinas Cry residen en
megaplasmidos conjugables (Ochoa y Arrivillaga, 2009). Existen 2 mecanismos por los
cuales B. thuringiensis regula a los genes cry para la producción de toxinas Cry, estas
rutas se presentan en respuesta a la falta de nutrientes.
1. Esporulación dependiente de los genes cry.
El desarrollo del proceso de esporulación es regulado temporalmente por seis factores
sigma (σ H, σ F, σ E, σ G y σ K) que se unen a la RNA polimerasa, determinando qué los
genes promotores se reconozcan. Existen mapeados dos sitios de inicio, definidos como
promotores usados subsecuentemente BtI y BtII (Agaisse y Lereclus, 1995).
2. Esporulación no dependiente de los genes cry.
Se ha observado que el promotor del gen cryIIIA es débil pero se expresa durante el
estado vegetativo de la célula. Así la activación del gen cryIIIA no es regulada por los
genes que inician la esporulación, por lo que es regulada más bien por algunos factores
que afectan la expresión durante la transición de la fase de crecimiento exponencial a la
fase estacionaria (Agaisse y Lereclus, 1995).
Clasificación de las toxinas Cry o δ-endotoxinas.
Las toxinas Cry o δ-endotoxinas fueron anteriormente clasificadas de acuerdo al orden
de insecto contra el que eran tóxicas, así los genes cry I codificaban proteínas tóxicas
9
contra lepidópteros, los genes cry II contra lepidópteros y dípteros, los genes cry III
contra coleópteros y los cry IV contra dípteros.
Sin embargo con el descubrimiento de nuevas cepas que no cabían en esta clasificación
Crickmore et al en 1998, propusieron una nueva clasificación basándose en la
comparación de la secuencia primaria de aminoácidos de las toxinas, de acuerdo a esta
clasificación existen 4 limites verticales de clasificación, así el nombre dado a una
toxina dependera de la localización del nodo donde entra la secuencia de la toxina y de
acuerdo a los limites del árbol, en el límite 1 se le asigna un número arábigo, en el límite
2 una letra mayúscula, en el límite 3 una letra minúscula y en el límite 4 se le asigna otro
numero arábigo, en la construcción de estos límites los autores reflejaron una relación
evolutiva entre las toxinas, por lo que las proteínas que tienen en común el límite 1 a
menudo afectan el mismo orden de insectos, si tiene segundo y cuarto limite diferente
puede estar alterada la potencia insecticida y los organismos blanco dentro del mismo
orden y en cuarto límite las diferencias se dan por mutaciones dispersas (Crickmore et
al., 1998).
Patogenicidad de B. thuringiensis. Las toxinas Cry o δ-endotoxinas son inocuas para los humanos, vertebrados y plantas y
completamente biodegradables, por lo tanto B. thuringiensis es una alternativa viable
para el control de insectos plagas en la agricultura así como para el control de vectores
de enfermedades humanas (Bravo et al., 2007).
Se ha determinado que las cepas de B. thuringiensis que producen toxinas Cry 2, Cry 4,
Cry 10, Cry 11, Cry 16, Cry 17 y Cry 19 son generalmente descritas como tóxicas contra
dípteros mientras que las Cry 1, Cry 9 y Cry 2 son efectivas contra lepidópteros. Además
las cepas de B. thuringiensis serovariedad israelensis produce proteínas citoliticas (Cyt)
que tienen actividad específica contra dípteros (Gobatto et al., 2010).
Lo anterior se deriva de los múltiples bioensayos que se han realizado a las toxinas Cry
ya que 125 de los 174 holotipos conocidos se han probado en aproximadamente 1700
bioensayos contra 163 especies: 49 toxinas no se han probado contra todas las especies,
10
59 se han probado con 71 especies de lepidópteros en 1182 bioensayos, 53 toxinas
fueron probadas con 23 especies de dípteros en 233 bioensayos y 47 fueron probadas
contra 39 especies de coleópteros en 190 bioensayos (Van Frankenhuyzen, 2009).
Configuración de las toxinas Cry.
Las toxinas Cry son globulares, están compuestas de tres dominios estructurales
conectados, los dominios se encuentran organizados entre ellas con un alto grado de
similitud lo que sugiere un modo de acción común en la familia de proteínas Cry (Bravo
et al., 2007).
El dominio I es una región conservada en el amino terminal que se extiende hasta el
residuo 290, está comprendido de siete hélices α que forman un haz, con una hélice α 5
central rodeada por las otras 6 hélices anfipáticas, se cree que este dominio es
responsable de la inserción de la toxina en la membrana, y así la formación del poro
(Guerrero et al., 2004).
El dominio II consiste de tres láminas-β anti paralelas que exponen un bucle, este
dominio se extiende entre los residuos 291 y 500, es hipervariable y probablemente sea
el responsable de la unión a los receptores de las células del epitelio intestinal del
insecto. La variabilidad de este dominio se hace notar en una revisión hecha por Bravo
en 1997 donde se investigaron las relaciones filogenéticas de las δ-endotoxinas y sus
dominios funcionales y se encontró que existe el más bajo grado de similitud en el
dominio II (Guerrero et al., 2004; Bravo et al., 2007)
El dominio III es como un sándwich de laminas-β, se extiende desde el residuo 501
hasta el extremo carboxilo, este dominio une a los otros dos y probablemente interviene
en el enrollamiento de la proteína y en el cambio conformacional que permite la
inserción del dominio I en la membrana epitelial (Guerrero et al., 2004; Bravo et al.,
2007).
11
Mecanismo de acción de las toxinas Cry o δ-endotoxinas.
Las toxinas Cry son pro-toxinas, son aproximadamente 2 veces más grandes que las
toxinas funcionales y necesitan un procesamiento que las modifique, esto sucede en el
intestino medio del insecto cuando son ingeridas por este (Roh et al., 2007).
Las esporas de B. thuringiensis son ingeridas por los insectos, cuando ingresan al
intestino medio, el pH alcalino solubiliza los cristales permitiendo que las enzimas
proteolíticas remuevan porciones del amino y carboxilo terminal quedando una toxina
funcional de tamaño más pequeño que se une a los receptores de la membrana de las
células epiteliales con borde de cepillo del intestino medio (Bravo et al., 2007).
Al menos cuatro tipos diferentes de receptores son descritos para las toxinas Cry , estos
receptores son: proteínas unidas a cadherinas (CADR), glicosilfosfatidil-inositol (GPI)
anclado a N-aminopeptidasa (APN), un GPI anclado a una fosfatasa alcalina (ALP) y un
glicoconjugado de 270 kDa (Gómez et al., 2007).
Así la toxina se inserta dentro de la membrana, y esto conduce a la formación de un poro
que causa lisis celular permitiendo la aparición de grandes desgarraduras en la
membrana y la liberación del contenido intestinal.
Patogénesis de las larvas infectadas con B. thuringiensis.
La inserción de toxina en la célula provoca un descenso en el pH intestinal y aumento
paralelo del pH de la hemolinfa, propiciando las condiciones para la germinación de las
esporas. Subsecuentemente todas las células nerviosas que están en contacto con la
hemolinfa y que carecen de vainas de mielina se inhiben, surge así una parálisis, primero
en el intestino y después de manera general. Al cabo de un periodo de 24 h a 7 días,
según la especie del insecto, su estado fisiológico y la dosis consumida, las larvas que
han permanecido paralizadas mueren por inanición, deshidratación o septicemia (Ruiz-
Herrera, 1997).
12
Resistencia de los insectos a B. thuringiensis.
Hasta el momento existen pocos informes de resistencia a B. thuringiensis. Dos
ejemplos son Plutella xylostella en repollo en Asia y Plodia interpunctella, plaga de
productos almacenados. En el laboratorio se ha demostrado la posibilidad de que el
insecto desarrolle resistencia al uso continuo de B. thuringiensis (Fernández-Larrea,
2002).
Sin embargo es importante señalar que los resultados de laboratorio no pueden
extrapolarse a las condiciones de campo, porque las condiciones ambientales y la
presión de selección natural juegan un papel importante. Además de las medidas
preventivas que se han estado tomando para evitar la resistencia a B. thuringiensis en
campo como: uso del MIP, dosis altas de toxinas, las mezclas de semillas (transgénicos
y no transformadas), mezclas de toxinas, y la rotación o alternancia de las toxinas de B.
thuringiensis (Lacey et al., 2001).
Bioseguridad de B. thuringiensis.
B. thuringiensis se utiliza como bioinsecticida debido a sus cualidades tóxicas para
algunos órdenes de insectos plagas, pero sobre todo por la seguridad ambiental que
representa y lo anterior está respaldado por los casi 50 años de uso como bioinsecticida y
por las pruebas que se han realizado de toxicidad de las esporas vía oral y subcutánea en
roedores (Bishop et al., 1999).
Por otro lado los estudios realizados de persistencia en campo de acuerdo con Rojas-
Ruiz et al., 2010, al analizar la interacción entre células vegetativas (no esporuladas) de
B. thuringiensis contra 11 microorganismos nativos del suelo, muestran que el desarrollo
de B. thuringiensis es afectado por siete de los 11 microorganismos de suelo evaluados.
Esto sugiere que el suelo es un ambiente poco apropiado para la multiplicación celular
de B. thuringiensis por un posible antagonismo microbiano lo que lo convierte en un
microorganismo seguro para ser utilizado en campo debido a su baja persistencia en
campo cuando es introducido como agente externo.
13
Importancia de B. thuringiensis en el mercado de los insecticidas.
El primer bioinsecticida fue formulado a base de B. thuringiensis en 1938 en Francia
llamado “Sporeine” y desde entonces hasta ahora ha aumentado la investigación y
desarrollo de productos en base en esta bacteria (Brar et al., 2006).
Debido a sus cualidades B. thuringiensis ocupa el 97% del mercado de los
bioinsecticidas en el mundo. El primer registro que se tienen de uso de B. thuringiensis
fue en Hungría a finales de 1920 y en Yugoslavia en 1930, para el control del gusano
europeo de maíz Ostrinia nubilatis (Rosas-García, 2008) y para 1958 su uso se había
extendido a los Estados Unidos y a partir de los años 80 B. thuringiensis se convirtió en
un plaguicida de interés mundial (Feitelson et al., 1992).
El hallazgo más importante a nivel comercial lo realizó Dulmage, quien en 1968
recuperó un aislado de B. thuringiensis de 20-200 veces más potente que todas las cepas
conocidas hasta entonces, al cual denominó HD-1.
Las toxinas B. thuringiensis se utilizan actualmente en los Estados Unidos, Europa,
Argentina y México como agentes de control biológico para numerosos insectos y otros
invertebrados plaga como: ácaros, nematodos, platelmintos y protozoarios que afectan
los cultivos de maíz, papa, tomate, sorgo, arroz, café, granos, caña de azúcar, entre otros
(Ochoa y Arrivillaga, 2009).
El uso de B. thuringiensis no solo se limita a los formulados bioinsecticidas, si no que
gracias a las nuevas tecnologías se han logrado introducir genes de esta bacteria en
diversos cultivos conocidos como “genéticamente modificados o GM (genetically
modified)”. A mediados de 1990 se comercializaron los primeros cultivos transgénicos
entre los que se encuentran el maíz, el algodón y la papa que expresan los genes cry. En
el 2010, 148 millones de Ha fueron sembradas con cultivos GM en 29 países
representando el 10% del total de Ha cultivadas en el mundo. El valor solo de las
14
semillas se calcula $11.2 miles de millos de dólares y el valor comercial de los cultivos
se calcula en $150 miles de millones de dólares por año (Gatehouse et al., 2011).
Baculovirus.
Descubrimiento.
La historia del descubrimiento de los baculovirus está íntimamente ligada a la industria
de la seda, debido al hallazgo de enfermedades que afectaban a los gusanos de seda,
posteriormente con el advenimiento del microscopio óptico, a mediados de 1880 se
observó una característica en una de las enfermedades que atacaban a estos insectos, la
presencia de cuerpos de oclusión (OBs) (oclusion body) (Fig. 2). Estos tenían
comúnmente la forma de poliedros, por lo que se empezaron a llamar a las enfermedades
relacionadas con estas estructuras “poliedrosis”. Con el microscopio electrónico se
demostró que existían partículas infecciosas dentro de los poliedros, viriones en forma
de varilla (Rohrmann, 2008).
Figura 2. Cuerpos de oclusión vistos al microscopio óptico.
Clasificación de los baculovirus.
La familia Baculoviridae inicialmente fue clasificada en dos géneros:
nucleopoliedrovirus (NPVs) y granulovirus (GRVs) de acuerdo al número viriones
15
dentro de los OBs, los GVs contiene un virion y en raras ocasiones dos, mientras que los
nucleopoliedrovirus contiene múltiples viriones (Wang et al., 2011) y a su vez se
subclasificaron en nucleopoliedrovirus simple (SNPV) y nucleopoliedrovirus múltiple
(MNPV) dependiendo del número de nucleocapsides embebidas en una envoltura
membranosa (Szewezyk et al., 2006).
Actualmente la familia de los baculovirus fue reclasificada en 4 géneros de acuerdo a
sus características biológicas y estructurales; genero Alphabaculovirus (NPVs)
específicos de lepidópteros, genero Betabaculovirus (GVs) específicos de lepidópteros,
género Gammabaculovirus (NPVs) específicos de himenópteros y genero
Deltabaculovirus (NPVs) específicos de dípteros. (Caballero et al., 2009, Arif et al.,
2011).
Genoma de los baculovirus.
Los baculovirus son virus específicos de artrópodos. El genoma viral circular de los
baculovirus mide de 80 hasta 200 Kb de longitud. El baculovirus más ampliamente
estudiado es el nucleopoliedrovirus de Autographa californica (AcMNPV) (Miele et al.,
2011).
El primer genoma de baculovirus fue reportado en 1994 (Harrison, 2009), a partir de ese
momento más y más genomas de baculovirus son secuenciados y hasta junio del 2012 se
encontraban disponibles 53 secuencias completas de genomas en el GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/GenomesGroup.cgi?taxid=10442).
Estructura de los baculovirus.
Una característica distintiva que presentan todos los baculovirus es que sus viriones
están característicamente incluidos dentro de una matriz proteica llamado poliedro o
cuerpo de inclusión (OBs). Esta envoltura proteica inmoviliza a los viriones dentro de
ella permitiendo que permanezcan viables por largos periodos de tiempo, ya que los
protege de las temperaturas extremas y la luz UV (Caballero et al., 2009).
16
La principal proteína que forma los OBs es la polihedrina/granulina (polihedrina en
NPVs y granulina en GVs). La región que codifica estas proteínas es una de las más
conservadas en los baculovirus y está compuesta de aproximadamente 250 aminoácidos.
(Rohrmann, 2008).
En los baculovirus se presentan 2 tipos de viriones de acuerdo a la etapa de infección en
la que se encuentren, los viriones derivados ocluidos (ODV) estos se presentan cuando
los cuerpos de oclusión son diluidos en el intestino medio del insecto, al iniciar la
infección y los viriones brotados (VB) son los que se propagan en la célula. La mayor
diferencia entre los ODV y VB son sus envolturas (Thumbi et al., 2011).
Patogénesis de los baculovirus.
Estos virus se encuentran naturalmente entre las poblaciones de insectos y son capaces
de causar una alta mortalidad. Los principales órdenes de insectos en las que se ha
reportado patogenicidad de los baculovirus son: coleóptera, díptera, himenóptera,
neuróptera, siphonaptera, thysanuria y trichoptera (Laviña et al., 2001).
Mecanismo de infección de los baculovirus.
Los OBs ingeridos por vía oral por el insecto se solubilizan debido al medio alcalino en
el mesenterio de la larva liberando ODV. Estos atraviesan la membrana peritrófica (capa
que separa el epitelio del intestino medio del bolo alimenticio en el lumen del intestino
medio) a través de sus poros naturales. La membrana del virión se fusiona con la
membrana de la célula epitelial y las nuevas nucleocápsides desnudas atraviesan el
citoplasma y se dirigen al núcleo donde se produce una primera replicación del DNA
viral. Alternadamente algunas nucleocápsides atraviesan el citoplasma, y sin pasar por el
núcleo, se dirigen a la zona basal. Las nucleocápsides atraviesan la membrana celular
formando BVs que pasan a la cavidad hemocélica através de las traqueolas, evitando la
17
membrana basal. En el hemocele, los BVs llevan a cabo la segunda fase del proceso
infecta a las células de los órganos y tejidos por endocitosis. Las nucleocápsides forman
de nuevo BVs favoreciendo la dispersión de la infección. Alternativamente forman
viriones y OBs completos, en una fase más avanzada del proceso infeccioso, se
acumulan en la célula y finalmente causan su lisis liberando los OBs al medio
(Chikhalya et al., 2009, Passarelli, 2012).
Patogénesis de las larvas infectadas con baculovirus.
En las primeras etapas de la infección los síntomas típicos de los insectos son: pérdida
del apetito, aclaramiento de la epidermis debido al acumulo de virus en el núcleo de la
célula o tejido adiposo (Batista-Alves, 1998).
En la etapa tardía de la infección antes de la muerte, las larvas infectadas se cuelgan en
una posición elevada de la planta y ocurre la licuefacción del tejido gracias a la actividad
de una quitinasa y proteasas unidas a catepsinas codificadas por el virus. Este
comportamiento facilita la diseminación de un gran número de OBs en el ambiente
(Laviña et al., 2001).
Bioseguridad de los baculovirus.
La capacidad de infección de los virus está determinada por la habilidad que tienen para
entrar a las células del organismo blanco, replicarse y liberar nuevas partículas
infecciosas. En el caso de los baculovirus, éstos entran en el intestino medio del insecto
hospedero y debido a las condiciones alcalinas de éste, es seguro que los ODVs se
fusionen con las células del insecto y así logren entrar al interior y replicarse por lo que
en organismos que no presentan estas condiciones alcalinos intestinales no se podrá
llevar a cabo este primer paso.
El segundo paso de infección para algunos virus es la fusión con la célula dada por
receptores, en el caso de los baculovirus no es así ya que no existen receptores celulares,
por lo que podría existir un riesgo para organismos no blanco, sin embargo en los
estudios ya realizados se han expresado genes de baculovirus en células de mamíferos
con promotores humanos y de ratón y se demostró que aunque los baculovirus lograran
18
entrar a las células de mamíferos y los genes fueran expresados, el DNA de los
baculovirus no es transcrito de manera competente por lo que no se lleva a cabo la
infección (Thiem, 1997).
Baculovirus en el mercado insecticida.
Aunque el mercado de los bioinsecticidas está mayormente representado por bacterias,
los virus han demostrado ser importantes agentes de control biológico y de éstos destaca
la familia Baculoviridae, considerados como excelentes candidatos para el control de
insectos plaga, principalmente porque son altamente específicos, es decir, solo infectan a
insectos; son seguros ya que no tienen efectos negativos en plantas, mamíferos o
insectos no blanco y no tienen efectos negativos para el medio ambiente ya que son
biodegradables y forman parte de los factores abióticos en la naturaleza (Rincón e Ibarra
2011)
Los baculovirus ya han demostrado su potencial, un ejemplo palpable es el caso de
Brasil donde el uso de virus es una realidad en cultivos de soya, maíz y yuca tratados
con AgMNPV, SfMNPV y EeGRV (Erinnyis ello granulovirus) respectivamente, de
hecho Brasil posee el mayor programa mundial de uso de virus contra A. gemmatalis
desarrollado desde 1977, que le ha proporcionado no solo ventajas ecológicas por el uso
de virus sino también reducción de aproximadamente un 70% de los costos comparado
con los plaguicidas químicos (Szewczyk et al., 2006).
Otro caso es el de SPOD-X® un producto comercial a base de SeMNPV altamente
específico y con una alta patogenicidad natural para el hospedero que es una plaga
polífaga de muchos cultivos. A partir de un aislado en Florida, el producto se utilizó
exitosamente en los Países Bajos, EUA y Tailandia (Williams, 2002).
Baculovirus recombinantes como bioinsecticidas.
Una de las desventajas de los baculovirus como bioinsecticidas es el largo periodo de
infección y muerte del hospedero, permitiendo que la larva cause un grave daño al
cultivo antes de su muerte, es por ello que se han buscado otras alternativas para el
mejoramiento de la patogenicidad de los baculovirus (Batista, 1998), llevando al
desarrollo de baculovirus recombinantes que expresan genes foráneos que codifican
19
productos tóxicos para los insectos (Cuadro 3), que generalmente buscan alterar su ciclo
de vida o reducir la alimentación del insecto.
El primer gen foráneo introducido en un baculovirus codifica para un neuropéptido, una
hormona diurética que reduce el volumen de la hemolinfa incrementando el porcentaje
de muerte por baculovirus en un 20%, también se han utilizado genes codificantes de
toxinas provenientes de ácaros y escorpiones, la primera proveniente de ácaros produce
parálisis incrementando la muerte en un 30 a 40% al igual que la de escorpión que
también causa temblores corporales y arqueamiento dorsal en las larvas, además es
interesante resaltar que su blanco es el canal de sodio considerado también el blanco de
los piretroides (químicos usados como insecticidas) (Maeda, 1995).
Cuadro 3. Ejemplos de baculovirus modificados mediante la introducción de un gen foráneo utilizados como bioinsecticidas.
Gen foráneo introducido
en un baculovirus.
Virus
modificado
Gen foráneo introducido en
un baculovirus
Virus
modificado
B. thuringiensis
δ-endotoxina
AcMNPV Toxina I de B. eupeus AcMNPV
Esterasa hormona juvenil AcMNPV Neurotoxina AaIT de A.
australis
AcMNPV
Delección del gen egt AcMNPV Gen de la neurotoxina TxP-I
de Pymotes tritici
AcMNPV
Proteína de maíz URF-13 AcMNPV Gen de la hormona de
eclosión de Manduca sexta
AcMNPV
Hormona ptth Agelenopsis
aperta toxina µ-Aga-IV
AcMNPV Hormona diurética BmNPV
Gen potenciador TnGV AcMNPV Neurotoxina AaIT de A.
australis
HearSNPV
Tomado y modificado de del Del Rincón-Castro and Ibarra, 2006.
Así como la construcción de virus recombinantes más patógenos es un gran avance para
la ciencia, también existen consideraciones que se deben de tener en cuenta, tales como,
si estas modificaciones genéticas afectan a los virus y a sus hospederos, la supervivencia
20
de los virus en el medio ambiente, el efecto de estos virus en otros organismos y la
posibilidad de transferir los genes de virus modificados por recombinación a los virus
silvestres del ecosistema de tipo salvaje (Batista, 1998).
Por lo que no sólo se ha trabajado en los baculovirus para potenciar su virulencia sino
también en aspectos de seguridad que permitan su liberación en campo, sobre todo en lo
que respecta a los virus recombinantes con los que se han hecho estudios para verificar
su seguridad, un ejemplo de esto es un proyecto en el cual se alimentaron avispas con
larvas muertas por baculovirus que expresaban toxinas de escorpión o ácaro, y se
detectaron niveles de las toxinas en las avispas, sin embargo no se encontraron efectos
en el crecimiento o en el comportamiento social de éstas (Maeda, 1995).
En otra investigación se tomó en cuenta una de las características de los baculovirus, su
envoltura proteica llamada poliedra que incrementa su persistencia en campo fuera del
hospedero y que podría ser percibida como una característica de riesgo si el baculovirus
incluyera genes foráneos, la estrategia que se utilizó fue la co-oclusión, en la que los
virus fueron modificados sin la capacidad de sintetizar la envoltura proteica y estos virus
se co-ocluyeron en poliedros de virus sin ningún tipo de manipulación genética, así el
virus modificado no pudo permanecer viable en el medio ambiente fuera de hospedero
(Cory and Hails, 1997).
Bioinsecticidas microbianos.
Al tratarse de microorganismos utilizados como bioinsecticidas las condiciones, el
comportamiento y sus interacciones pueden ser variables en campo (Cory y Hails,
1997), por lo cual se les debe proporcionar un microambiente adecuado, esto se
constituye utilizando sustancias o compuestos que en conjunto con el microorganismo
crean una formulación, es decir una combinación correcta de materiales más un
ingrediente activo (responsable de la acción insecticida) que juntos formen un producto
(Rosas-García, 2008) y que cumplan con las funciones de proporcionar estabilidad al
microorganismo durante su almacenamiento, ayudar en la manipulación y aplicación del
producto, proteger contra factores del medio ambiente adversos y potenciar la actividad
de los agentes de control biológico en campo (Brar et al., 2006).
21
Por lo anterior se han realizado esfuerzos para mejorar la efectividad en campo de los
bioinsecticidas y estos avances tienden a enfatizar el uso de materiales y métodos
específicos, para alcanzar el efecto deseado, mediante el estudio de la conducta de los
insectos y sus hábitos (alimentarios, nicho de alimentación, ciclo de vida), el hábitat en
donde se aplicará el bioinsecticida (follaje, suelo, agua) , el patógeno que se va a utilizar
(tipo, características, mecanismos de reproducción), y modo de acción de éste (oral, por
contacto), la reología de los materiales técnicos (viscosidad, tamaño de partícula,
densidad), la forma de aplicación del bioinsecticida (aérea o terrestre) y la tasa de
aplicación (Rosas-García y De Luna-Santillana, 2006).
Formulaciones bioinsecticidas.
Las formulaciones se componen de un ingrediente activo que puede ser un
microorganismo o espora, acarreadores, a menudo un material inerte usado como
transportador y liberador y coadyuvantes compuestos que ayudan o protegen al
ingrediente activo como: adherentes, fagoestimulantes y protectores solares (Hynes and
Boyetchko, 2006).
Soporte o matriz: son compuestos inertes que acarrean al ingrediente activo. De los que
ya se conoce su efectividad son almidón de maíz, maíz quebrado, arcilla, salvado de
trigo, harina de maíz nixtamalizada.
Fagoestimulantes. Se pueden definir como ingredientes que mejoran la palatabilidad o
gusto de los insectos por su consumo los bioinsecticidas. La importancia de éstos radica
en que ayudan al consumo de dosis letales de los bioinsecticidas ya que se ha observado
que algunas larvas dejan de comer después de ingerir el ingrediente activo lo que
provoca bajos porcentajes de mortalidad (Castillejos et al., 2002, Rosas-García et al.,
2009).
Protectores solares. La radiación solar (rayos UV) es un importante factor que afecta la
estabilidad y durabilidad de los entomopatógenos en campo. Diferentes sustancias tales
como Rojo Congo, Negro Búfalo, celulosa, carbón, polvo de aluminio, oxido de
aluminio y algunos otros han sido usados para proteger a los microorganismos de la
radiación solar (Rosas-García, 2006).
22
Clasificación de las formulaciones.
Los insecticidas de forma general sean químicos o biológicos se encuentran disponibles
en formulaciones líquidas o secas, los diversos tipos de formulaciones se observan en el
Cuadro 4 (De Faria and Wraight, 2007)
Cuadro 4. Clasificación de las formulaciones insecticidas.
Tipo de formulación Descripción
Polvo humectable
(WP)
Formulación en polvo que se aplica como suspensión después
de dispersarla en agua.
Granular (GR) Formulación compuesta por sólidos de un tamaño definido,
lista para usarse
Cebo (RB) Es una formulación diseñada para atraer al insecto
Gránulos dispersables
en agua (WG)
Esta formulación consiste en gránulos que se van a desintegrar
y dispersar en agua.
Polvo para contacto
directo (CP)
Formulaciones en polvo que se aplican de forma directa.
Suspensión
concentrada (SC)
Es una suspensión estable que contiene el ingrediente activo,
de forma concentrada y se debe diluir en agua antes de su uso
Suspensión
concentrada en aceite
(OF)
Es una suspensión estable que contiene el ingrediente activo,
de forma concentrada en aceite y se debe diluir algún liquido
orgánico antes de su uso
Suspensión (SU) para
ultra bajo volumen
(ULV)
Es una suspensión lista para usarse que se aplica con equipo de
ultra bajo volumen
Emulsión (OD) Es una solución del ingrediente activo en un líquido inmiscible
en agua, a menudo contienen emulsificantes para que sea
dispersada la formulación al ser diluida en agua.
23
Combinaciones bioinsecticidas.
En algunas ocasiones los investigadores han buscado sustancias que ayuden a
incrementar la mortalidad causada por los agentes de control biológico ya sea con
sustancias químicas o con la combinación con otros entomopatógenos. Ente las
sustancias que se han utilizado se encuentra el ácido bórico (H3BO3) utilizado para el
control de hormigas y cucarachas en combinación con B, thuringiensis. En varios
baculovirus el uso de esta sustancia incremento su virulencia reflejado en la mortalidad
de los insectos o en la disminución del tiempo de mortalidad de estos (Cisneros et al.,
2002).
Otros químicos que potencializan la actividad insecticida son los abrillantadores ópticos.
Estos compuestos en un principio se utilizaron como protectores UV demostrando una
eficacia hasta de un 100%. Adicionalmente se observó que cuando se combinaban con el
MNPV de Lymantria dispar ocurría un aumento de la patogenicidad de hasta 2000 veces
(Dougherty et al., 1996)
La combinación con otros compuestos como el caso del Spinosad®, una neurotóxina
derivada de Saccharopolyspora spinosa que se utiliza como bioinsecticida, con SfMNPV
no produjo ningún cambio favorable (Méndez et al., 2002)
De acuerdo al microorganismo empleado como entomopatógeno, los materiales o
ingredientes y las metodologías de la formulación cambian, ya que lo que se busca es
brindar las mejores condiciones para que el microorganismo ejerza su función
insecticida, aquí radica la importancia de elegir una combinación adecuada de
ingredientes para hacer una única formulación.
Ventajas y desventajas del uso de los Bioinsecticidas.
El uso de microorganismos como agentes de control biológico representan tanto ventajas
como desventajas, a continuación se presenta las principales:
Ventajas.
Tienen un estrecho rango de hospederos, no presentan patogenicidad cruzada con
insectos no blanco, algunos tienen la capacidad de persistir en el ambiente, se pueden
24
modificar genéticamente, especialmente para incrementar su eficiencia, se pueden
producir localmente y su producción in vivo o in vitro requiere de baja inversión
económica, no generan respuesta inmunogénica (alergias) a las personas que los
manipulan para su aplicación, pueden ser aplicados usando técnicas convencionales y no
crean problemas asociados con residuos (Fernández-Larrea, 2002).
Desventajas. El estrecho rango de hospederos de la mayoría de los entomopatógenos puede
representar una desventaja para la aplicación en diferentes cultivos con diversas plagas.
B. thuringuiensis y los baculovirus son entomopatógenos que deben ser ingeridos, por lo
que los barrenadores pueden evitar consumir una dosis letal al penetrar a la planta, por
otra parte la dosis letal de estos agentes de control depende del estadio larvario y en
etapas maduras la susceptibilidad disminuye considerablemente. Otros factores
importantes que producen desventajas para los bioinsecticidas son las condiciones
ambientales, como la radiación solar (300-380 nm) que inactiva las proteínas Cry por la
destrucción del triptófano y la lluvia que puede lavar los productos de las plantas o
diluirlos provocando baja permanencia en campo (Navon, 2000).
Cultivos de importancia económica en el estado de Tamaulipas.
Soya.
En México, la producción de oleaginosas es deficiente, por lo que se importan grandes
cantidades de soya para satisfacer la demanda de la industria que abastece de aceite y
proteína vegetal el mercado nacional. Desde 1999, la soya se produce bajo condiciones
de temporal, lo que ha causado reducción en la superficie sembrada y cosechada así
como en la productividad y rentabilidad del cultivo (Maldonado-Moreno et al., 2009).
Tamaulipas aporta al año 52,600 toneladas de soya a la producción nacional, cuya cifra
representa un 58.45% de la cosecha anual alcanza en el estado, actividad que genera
riqueza para tres mil 500 productores dedicados al establecimiento de esta oleaginosa
25
(http://www.hoytamaulipas.net/notas/19474/Tamaulipas-uno-de-principales-
productores-de-soya.html).
Sorgo.
Durante el ciclo otoño - invierno 2010/2011, se alcanzó una producción de alrededor de
1, 850,000 toneladas, con lo que se obtuvo la producción promedio de Tamaulipas de los
últimos años y representó el 47% del valor de la producción agrícola anual en la entidad
(SAGARPA, 2011).
Maíz.
El maíz es el cultivo más importante en México por la superficie sembrada, el valor de la
producción y la ocupación que provee al 20% de la población económicamente activa.
En Tamaulipas durante el periodo de 2003-2008 en el ciclo agrícola de otoño-invierno
bajo condiciones de riego, se sembraron 93,629 Ha de maíz que representan el 38.76%
de la superficie sembrada anualmente en el estado. El norte de Tamaulipas es la región
más importante para la siembra de maíz ya que en el mismo periodo de otoño-invierno
se sembraron cada año 65,580 Ha con un rendimiento medio de grano de 5.26 t/Ha que
representan el 70.04% de la superficie sembrada con este cultivo, en cambio en la región
centro del estado se sembró el 17.33% que equivale a 16,226 Ha con un rendimiento de
4.45 t/Ha, mientras que en la zona sur se sembró el restante 12.63% (SIACON 2009).
Spodoptera exigua Hübner (Lepidoptera: Noctuidae) plaga de la soya.
Spodoptera exigua Hübner o gusano soldado, es una especie polífaga originaria del
sureste asiático que actualmente se encuentra distribuida por todas las regiones
subtropicales y templadas del mundo y es especialmente abundante en América Central
y del Norte, África, Australia, y el sur de Asia y Europa (Caballero et al., 2009).
Cultivos que ataca.
Algunos de los cultivos que ataca el gusano soldado son los siguientes: alfalfa, manzana,
algodón, lino, yute, cacahuate, uva, maíz, arroz, soya, té, tabaco, cucurbitáceas, fresa,
papa y camote (Avisar et al., 2009)
26
Ciclo biológico.
El adulto es una palomilla de color gris oscuro; las alas anteriores son de color café
grisáceo con una mancha pálida en el margen medio frontal; las alas posteriores son
blancas con el margen anterior oscuro. La hembra oviposita en masas irregulares de 60 a
80 huevecillos, que cubre con una secreción salival y escamas de su cuerpo; la eclosión
ocurre de los tres a los cinco días. La larva pasa por cinco estadios y varía en su
coloración, pero generalmente son de color verde pálido y cabeza verde oscuro o café
con rayas oscuras longitudinales; mide más de 5 cm cuando está completamente
desarrollada. Las larvas se alimentan aproximadamente durante tres semanas y
posteriormente inician su pupación en el suelo que dura 7 días hasta la emergencia del
adulto. Las larvas se alimentan de las hojas y en ocasiones de las vainas, las cuales
muerden o agujeran, provocando su caída. Su presencia se detecta fácilmente por una
especie de “telaraña” que la larva forma en el follaje. Este insecto aparece en cualquier
época del año, aunque las poblaciones más altas se presentan en septiembre y octubre en
soya (Maldonado-Moreno et al., 2007).
Spodoptera frugiperda (J.E Smith) (Lepidóptera: Noctuidae) plaga de sorgo y maíz.
S. frugiperda Smith o gusano cogollero, es una de las principales plagas de plantas que
presentan cogollo, entre ellas el maíz y el sorgo, en regiones tropicales y subtropicales
de América. El daño causado por esta plaga puede ocasionar una reducción en la
producción, la cual puede llegar desde un 20% hasta la pérdida total del cultivo si la
plaga ataca en periodos cercanos a la floración (Del Rincón-Castro et al., 2006).
Cultivos que ataca.
La alfalfa, maíz, sorgo, algodón, cacahuate, cártamo, soya, remolacha azucarera, tabaco,
nabo, espárrago, frijol, remolacha, brócoli, repollo, coliflor, apio, garbanzo, maíz,
berenjena, lechuga, cebolla, chícharo, pimiento, patata, rábano, espinaca, tomate y
camote (Avisar et al., 2009).
27
Ciclo biológico.
Las larvas de S. frugiperda presentan 5 diferentes estadios, caracterizados por el tamaño
de la cápsula cefálica (Villa-Castoreña y Catalán-Valencia, 2004).
Las hembras tienen alas traseras de color blancuzco, mientras que los machos tienen
figuras irregulares llamativas en las alas delanteras, y las traseras son blancas. Las
hembras depositan los huevecillos tanto en el haz como en el envés de las hojas, estos
son puestos en varios grupos o masas cubiertas por segregaciones del aparato bucal y
escamas de su cuerpo que sirven como protección contra algunos enemigos naturales o
factores ambientales adversos. Las larvas al nacer se alimentan del corion, más tarde se
trasladan a diferentes partes de la planta o a las vecinas, evitando así la competencia por
el alimento y el canibalismo. Su color varía según el alimento pero en general son
oscuras con tres rayas pálidas estrechas y longitudinales; en el dorso se distingue una
banda negruzca más ancha hacia el costado y otra parecida pero amarillenta más abajo,
en la parte frontal de la cabeza se distingue una "Y" blanca invertida. A partir del tercer
estadío se introducen en el cogollo, causando el mayor daño a la planta. La fase de pupa
se desarrolla en el suelo y el insecto está en reposo de 8 a 10 días enseguida emerge el
adulto o mariposa (Bautista-Martínez, 2006).
28
JUSTIFICACION.
Desde siempre el uso de insecticidas químicos ha sido la manera principal de combatir
plagas en campos de cultivo, sin embargo se han propuesto alternativas como los
bioinsecticidas para sustituirlos, principalmente por la alta especificidad de los
organismos entomopatógenos utilizados con este fin, es decir dañan una plaga especifica
sin causar daño a otras poblaciones de insectos o mamíferos.
Sin embargo en un cultivo determinado en el que se presentan diversas plagas, la
especificidad representaría una desventaja para los agricultores ya que la aplicación de
un sólo bioinsecticida a base de un sólo microorganismo pudiera no ser capaz de
controlar las diversas plagas, sin embargo el uso combinado de varios entomopatógenos
ampliaría su rango de control, manteniendo la especificidad de cada uno.
Aún en plagas polífagas, el comportamiento alimenticio y los efectos de la planta
hospedera pueden influir en la susceptibilidad de la plaga al entomopatógeno. Un
ejemplo de lo anterior sucedió en Tailandia donde se logró un perfecto control de S.
exigua en chícharo y uva, mientras que en col rizada y cebollín no se obtuvieron buenos
resultados con la misma dosis de SeMNPV (Williams, 2002). Por lo que se debe de tener
en consideración el hecho de que los entomopatógenos son microorganismos que
necesitan de condiciones específicas para poder cumplir su función y así superar algunas
desventajas debido al microambiente al que se enfrentan en campo como: baja
persistencia en el medio ambiente, prácticas precisas de aplicación, susceptibilidad de
las larvas (Bravo et al., 2011).
Por lo tanto el desarrollo de productos bioinsecticidas debe contemplar ingredientes, que
proporcionen las condiciones necesarias requeridas por los microorganismos
entomopatógenos, para que lleven a cabo una acción efectiva de control biológico sin
importar las diferencias entre cultivos cuando se trate de plagas polífagas, además de
mejorar otras cualidades.
29
B. thuringiensis es el entomopatógeno que acapara el mayor porcentaje del mercado de
los bioinsecticidas. Su uso para el control de lepidópteros está bien documentado, y se
sabe qué cepas contienen los genes cry 1, 2 y 9 que son específicos contra este orden de
insectos.
Por otra parte existe un amplio conocimiento del uso de los baculovirus como agentes de
control biológico, sin embargo éstos presentan un rango de hospederos limitado a
especies relacionadas de lepidópteros, por lo que su uso como bioinsecticida no ha sido
tan notable, sin embargo una excepción formidable ha sido el virus de la poliedrosis
nuclear de Anticarsia gemmatalis (AgNPV), cuyo programa fue implementado en Brasil
en la década de los ochenta y actualmente más de 2,000,000 hectáreas de soya son
tratadas (Szewczyk et al., 2006).
Por lo anterior expuesto, la obtención de un bioinsecticida combinando estos dos
entomopatógenos en una formulación adecuada, puede cubrir el control de diferentes
lepidópteros que atacan cultivos de importancia económica como la soya, el sorgo y el
maíz a través de un solo producto de amplio espectro y con la consecuente disminución
de los riesgos de contaminación ambiental.
30
HIPOTESIS
La combinación adecuada de cepas tóxicas de Bacillus thuringiensis y de cepas de
baculovirus potencia la acción insecticida de estos agentes contra diversos lepidópteros.
31
OBJETIVO GENERAL
Desarrollar un bioinsecticida de amplio espectro para el control de lepidópteros en maíz,
soya y sorgo.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
• Seleccionar una o varias cepas de Bacillus thuringiensis tóxicas contra
lepidópteros.
• Seleccionar una o varias cepas de baculovirus activas contra lepidópteros.
• Elaboración del bioinsecticida.
• Evaluación del bioinsecticida a nivel de laboratorio e invernadero.
32
MATERIALES Y MÉTODOS
Extracción de DNA plasmídico de B. thuringiensis (Reyes-Ramírez, 2005).
A partir de un cultivo bacteriano inoculado en caldo nutritivo (BD Bioxon ®) de 12 a 15
h de crecimiento se centrifugaron 50 ml a 13000 rpm por 15 min a 4°C (centrifuga
Becman coulter® Allegra 6R, Palo Alto, CA). El sobrenadante se eliminó y la pastilla
formada se resuspendio en 1 ml de TES frío (Tris-base 30 Mm, EDTA 5 mM, NaCl 50
mM, pH 8.0) se centrifugó dos veces en las mismas condiciones, y se descartó el
sobrenadante. Las células obtenidas se resuspendieron en 500µl de solución TES-
sacarosa al 20% (20% de sacarosa en TES) conteniendo lisozima (Research Organics,
Inc.) a una concentración de 3 mg/ml y RNAsa (US Biological®) a una concentración de
0.01 mg/ml. La suspensión se incubó a 37°C durante 90 min en un agitador térmico
(Eppendorf Brinxmann Instruments, Inc., Westbury, NY.) hasta observar la formación
de protoplastos (de 50 a 80%) en un microscopio de contraste de fases (Leica® ATC
2000, Buffalo, NY). A la suspensión de protoplastos se adicionaron 500 µl de SDS al
8% en TES, se mezcló por inversión suavemente y se dejó incubar a 68°C, durante 15
min. Se adicionaron 500µl de solución de acetato de sodio 3M, pH 4.8 y se incubó a -
20°C, por 30 min. La suspensión se centrifugó a 13000 rpm a 4°C por 20 min, y se
recuperó el sobrenadante, descartando el precipitado. Al sobrenadante se le agregaron
dos volúmenes de etanol absoluto y se incubó toda la noche a -20°C. Para recuperar el
DNA, el sobrenadante se centrifugó a 13000 rpm a 4°C, por 20 min, posteriormente se
lavó la pastilla con etanol al 70% y se recuperó como en el paso anterior. Se secó la
pastilla y se resuspendio en 50 µl de TE (Tris HCl 10 mM, EDTA 0.1 mM, pH 8.0).
Para visualizar el DNA plasmídico se preparó un gel de agarosa (Invitrogen ®) al 1% en
buffer TBE 1X. Una vez gelificado se colocó en una cámara de electroforesis horizontal
Mini Sub Cell (Modelo MGU-102T, Westbury, NY). Se colocó 1 µl de muestra con 2 µl
de buffer de carga (xilencinol, bromofenol en glicerol al 30% (Sambrook and Russell,
2001) y Syber Gold® a una concentración final de 1X, como marcador de masa
molecular se utilizó el DNA del fago Lamda (Biolabs, Inc.) a una concentración de 500
ng/ml se cargó en los pocillos del gel mezclado con 2 µl de buffer de carga. La
33
electroforesis se llevó a cabo a 80 V durante 1 h. Una vez terminado el tiempo de
corrimiento el gel fue visualizado con luz UV en un fotodocumentador acoplado con el
programa Kodak Molecular Imaging Software (Versión 5. 0).
Detección de los genes cry1, cry2 y cry9.
La identificación de los genes cry1, 2 y 9 se realizó utilizando la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR). A un tubo de reacción de PCR de 200µl se agregaron 250 ng de
DNA plasmídico, 0.2 µM de los dNTP´s (Bioline USA, Inc), 1µg/ml del iniciador
antisentido (cry I-, cry 2- y cry 9-) y 1µg/ml del iniciador sentido (cryI+, cry 2+ y cry 9+)
(Cuadro 5), 1.5 mM de MgCl2, 1.25 U/ml de Taq polimerasa (Sigma-Aldrich®), para un
volumen final de 25 µl. La amplificación se llevó a cabo en un termociclador (Gene
Amp® PCR system 9700, Nolwalk Connecticut), con un programa de 35 ciclos, una
desnaturalización inicial a 94ºC por 2 min, y un ciclo constante de desnaturalización a
94ºC por 30 s, un alineamiento a 52ºC para cry 1, 50°C para cry2 y 62°C para cry 9 por
45 s, una extensión a 72ºC por 30 s y un paso de extensión adicional a72ºC por 7 min
(Masson et al, 1998).
Cuadro 5. Secuencia de iniciadores para los genes cry 1, 2 y 9.
Gen
Nombre
Secuencia
Tamaño
esperado en pb
cry 1 I(+) 5’-TRACRHTDDBDGTATTAGAT-3’ 700pb
I(−) 5’-MDATYTCTAKRTCTTGACTA-3’
cry 2 II(+) 5′-TAAAGAAAGTGGGGAGTCTT3′ 1700
II(−) 5′-AACTCCATCGTTATTTGTAG-3′
cry 9 Un9(d) 5’-CGGTGTTACTATTAGCGAGGGCGG-3´ 351-354
Un9(r) 5´-GTTTGAGCCGCTTCACAGCAAATCC-3´
Los productos de PCR se observaron en un gel de agarosa preparado al 1% en
amortiguador TAE 1X, utilizando 10 µl de los productos de amplificación mezclados
34
con 2µl del buffer de carga antes mencionado, se utilizó el marcador de peso molecular
de 1kb (Promega®) mezclándose 1µl de éste con 2µl del buffer de carga. La
electroforesis se corrió por 1 h a 80 V y se observó el gel en el fotodocumentador con
luz UV.
Obtención del complejo espora-cristal mediante la técnica de co-precipitación
lactosa-acetona (Dulmage, 1970).
Se obtuvo el complejo espora-cristal de las cepas de B. thuringiensis que presentaron los
genes cry 1, cry2, y/o cry9, de la siguiente manera:
Las cepas se activaron durante 18 h en tubos con agar inclinado (pH 7.0).
Posteriormente se tomaron varias asadas para inocular en 50 ml de caldo triptosa fosfato
(CTP) (Difco™) contenido en matraces de 250 ml, los matraces se mantuvieron en
agitación a 200 rpm, (incubadora con agitación; Lab Line®, Melrose Park IL) a 30ºC
por 18 h. Del medio CTP se tomó 1 ml, el cual se inoculó en 100 ml de medio a base de
melaza (melaza 20 g/l, harina de soya 20 g/l, líquido de remojo de maíz 10 g/l y
carbonato de calcio 1 g/l) a pH de 7.0-7.2, realizándose por triplicado para cada cepa y
se mantuvieron en agitación a 200 rpm a 30ºC.
Los cultivos se monitorearon hasta observar un 80% de esporulación, en este punto se
detuvo la fermentación y se ajustó el pH del medio a 7.0.
Para la recuperación del complejo espora-cristal, el medio de cultivo se sometió a
centrifugación a 10,000 rpm (Beckman Coulter™ Avanti J-301,Pasadena, California)
durante 30 min y se determinó el peso del precipitado mediante la siguiente ecuación:
PP= P2-P1 donde; P1 (peso 1) corresponde al peso del bote más el medio de cultivo, P2
(peso 2) corresponde al peso del precipitado en el bote, descartando el sobrenadante y
PP (peso del precipitado) corresponde al peso del precipitado obtenido de la diferencia
de los pesos.
35
Para obtener el volumen de lactosa al 5% necesario para la co-precipitación el PP se
multiplicó por un factor de 1.71 y al volumen obtenido de lactosa se le sumó el PP. De
esta manera, se obtuvo el volumen total, esta cantidad se multiplicó por un factor de 3.34
para obtener el volumen de acetona. El precipitado se colocó en un vaso de precipitado
con los volúmenes de lactosa y acetona en agitación durante 30 min. Se dejó reposar por
10 min y toda la mezcla se filtró en un matraz Kitasato utilizando papel Whatman #1, el
precipitado se lavó con tres volúmenes de acetona. El filtrado se dejó secar y se molió
finamente con un mortero y se guardó en frascos herméticos hasta su utilización.
Bioensayos de toxicidad de B. thuringiensis contra larvas de lepidópteros.
Una vez obtenido el complejo espora-cristal de cada una de las cepas de B. thuringiensis
elegidas por su contenido génico, se realizaron bioensayos en el laboratorio para
verificar si las cepas mostraban algún efecto tóxico contra larvas neonatas de S.
frugiperda y S. exigua proporcionadas por el área de cría de insectos del laboratorio de
Biotecnología Ambiental del Centro de Biotecnología Genómica del Instituto
Politécnico Nacional.
Para los ensayos se utilizó una concentración baja de 50 µg/ml y una concentración alta
de 500 µg/ml del complejo espora-cristal de B. thuringiensis. Se preparó una solución
stock utilizando 250 mg del complejo y se aforó a un volumen de 50 ml con agua
destilada para obtener una solución concentrada de 5000 µg/ml. De la solución stock se
tomaron 12.5 ml los cuales se incorporaron a 112.5 ml de dieta para obtener una
concentración de 500 µg/ml de dieta y 1.25 ml más 11.25 ml de agua destilada se
incorporaron a 112.5 ml de dieta para obtener la concentración de 50 µg/ml del complejo
espora-cristal. Se utilizaron vasos de plástico SOLO® de 30 ml de capacidad a las que se
les agregaron 5 ml de dieta artificial con las diferentes concentraciones. Posteriormente
en ellos se colocó una larva neonata, se cerraron con tapas de plástico y se colocaron en
bolsas de papel incubándose a temperatura ambiente, por cada concentración se
realizaron 3 repeticiones de 25 larvas cada una. Como control se utilizaron vasos con
36
dieta sin el complejo espora-cristal de B. thuringiensis y se registró el porcentaje de
mortalidad al término de 7 días para determinar la cepa con una toxicidad mayor.
Cultivo de baculovirus en larvas, extracción y conteo de los cuerpos de oclusión
(OBs) (Galán-Wong et al., 2003).
Se seleccionaron larvas de 3er y 4o estadio de S. exigua y S. frugiperda como hospederos
de SeMNPV y SfMNPV respectivamente (suspensión de baculovirus obtenidos del
Laboratorio de Inmunología y Virología, Unidad de Formulación de Biológicos de la
Universidad Autónoma de Nuevo León). Se colocaron 5 ml de dieta artificial en vasos
de plástico de 30 ml de capacidad y se dejaron secar. Posteriormente se contaminó la
superficie de la dieta con una suspensión de cuerpos de oclusión a una concentración de
1x106 OBs, expandiendo los cuerpos de oclusión por todo la superficie de la dieta con
una pipeta Pasteur invertida.
Las larvas se alimentaron con la dieta contaminada durante 7 días a 27°C en una cámara
climática (Thermo Scientific Precision 818®, Bohemia NY), de esta manera se infectaron
las larvas con los baculovirus. A partir del quinto día se monitorearon las larvas para
detectar la característica de licuefacción del tejido infectado por baculovirus. Las larvas
muertas e infectadas se congelaron a -20°C para facilitar su manipulación y evitar
derrames de los OBs debido a la licuefacción del tejido. Posteriormente las larvas se
tomaron con pinzas incluyendo la dieta y se procedió a la separación del tejido y restos
de dieta de los OBs como se menciona a continuación: las larvas que se tomaron, se
colocaron en un tubo Falcón de 15 ml, y se mezclaron con 1-2 ml de agua destilada por
larva, en un vortex (Genie 2® G-560, Bohemia NY) a máxima velocidad hasta
homogenizar la mezcla. Con este procedimiento el tejido infectado se deshace con
agitación, el tejido no infectado se mantiene firme. Posteriormente se filtró la mezcla
utilizando una gasa estéril de 10 cm x 10 cm doblada en 4 partes en forma de cono y
colocada sobre la boca de cada tubo. Este procedimiento se hizo por duplicado para
eliminar todos los restos de las larvas sin infección y esta mezcla se almacenó en tubos
Falcón cerrados a -20°C hasta su uso en los bioensayos.
37
Para conocer el número de cuerpos de oclusión obtenidos, se realizó el conteo en una
cámara de Neubauer.
Identificación de los baculovirus (Aquesolok, 2011).
Purificación de los poliedros.
En un tubo Falcón se agrego 1 ml de la mezcla de larvas muertas en agua estéril más 5
ml de SDS al 0.1%. La mezcla se homogenizó durante 1 min con un vortex a máxima
velocidad y luego la mezcla se centrifugó a 6000 rpm durante 5 min. Los precipitados
resultantes se separaron y se resuspendieron en 1 ml de SDS al 0.1% y se volvieron a
centrifugar a 6000 rpm durante 5 min. Finalmente, los OBs obtenidos en el precipitado
se resuspendieron en 1 volumen de agua miliQ estéril.
Para corroborar la purificación de los OB se hizo una observación al microscopio a 40X
y finalmente se almacenaron a 4°C hasta su uso posterior.
Extracción del DNA viral.
La extracción del DNA se realizó a partir de los OBs purificados.
A partir de una suspensión de 100µl de OBs purificados, se le añadieron 100µl de
Na2CO3 0.5 M, 50 ml de SDS al 10% y 250µl de agua miliQ estéril, la mezcla se incubó
durante 10 min a 60 °C, permitiendo la ruptura de la matriz proteica de los OBs y la
liberación de los viriones al medio. Posteriormente se recuperó el sobrenadante mediante
centrifugación a 6000 rpm durante 5 min, y se incubó con 500 µg/ml de proteinasa K
(Promega®) durante 45 min a 50°C para romper las envolturas de los viriones. El DNA
se extrajo utilizando fenol/cloroformo mediante tres pasos, los dos primeros con fenol y
el último con cloroformo. En cada uno de los pasos se agitó la mezcla suavemente para
homogeneizarla y se centrifugó a 13000 rpm por 5 min, recuperando la fase acuosa. Los
restos de OB fueron precipitados añadiendo 1/10 volúmenes de acetato de sodio 3M (pH
5.2) y 2.5 volúmenes de etanol frio al 100% centrifugandose a 6000 rpm eliminando el
sobrenadante.
38
Enseguida se dejó secar la pastilla de DNA manteniendo el tubo invertido por
aproximadamente 1 h. El DNA se resuspendio en 50µl de TE (Tris/EDTA) al 1% y se
mantuvo a -20°C hasta su uso.
Reacción en cadena de la polimerasa.
Para la identificación de los nucleopoliedrovirus por medio de PCR se utilizaron las
siguientes condiciones de amplificación. En un tubo de reacción se colocaron 5 µl del
DNA extraído anteriormente con 5µl de Buffer 1X (con MgCl2 1.5 mM), 4 µl MgCl2 1.5
mM, 2 µl dNTPs 200 µM, 2.5 µl de los iniciadores sentido (5’-
AAYCARAARYTNACNYTNTTYAARGARAT-3’) y antisentido (5’-
CCNAYRTANACDATDGGYTTRTARAARTT-3’) 0.5 µM (Woo, 2001). y 1 U de Taq
polimerasa, en un volumen final de 25 µl. La amplificación se llevó a cabo con un
programa de 36 ciclos definido en el Cuadro 6.
Cuadro 6. Programa de amplificación para el gen poliedrina.
Programa Proceso Temperatura Tiempo
Desnaturalización inicial 94°C 10 min
34 ciclos
Desnaturalización 94°C 1 min
Alineamiento 42°C 1 min
Extensión 72°C 2 min
Extensión final 72°C 10 min
Para visualizar la amplificación se colocaron 5µl del producto de PCR con 2µl de buffer
de carga, se mezcló y se colocó en un gel de agarosa 1%, con amortiguador TAE 1%. La
electroforesis se corrió a 80 V por espacio de 1 h.
Purificación de los productos de PCR.
Se tomaron directamente 5µl del producto de PCR y se agregaron 2µl de ExoSap-IT®
(Affimetryx®, USB® products, Santa Clara CA) la mezcla se incubó a 37°C/15 min y
después a 80°C/15 min. De esta reacción se utilizaron 5µl del producto purificado para
la reacción de secuenciación.
39
Reacción de secuenciación.
La reacción de secuenciación se realizó por medio del kit de secuenciación de ABI
PRISM® Big Dye® Terminator V3.1 (Applied Biosystem™ Foster City CA) y la
purificación de los fragmentos secuenciados con Big Dye® XTerminator (Applied
Biosystem™, Foster City CA).
Los fragmentos se editaron en el programa Chromas versión 2.33 y se compararon en la
base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) mediante la
herramienta Basic Local Alignment and Search Tool (BLAST).
Ensayos de mortalidad con los baculovirus.
Para los bioensayos de mortalidad con los baculovirus ya se conocía que estos virus son
patógenos para cada especie de insecto así el SeMNPV afecta a S. exigua y SfMNPV a S.
frugiperda, por lo que, se seleccionaron dos concentraciones una alta y una baja, en el
caso de SeMNPV se probaron1x102 y 1x105 para S. frugiperda fueron de 1x102 y 1x106,
los bioensayos se realizaron de la siguiente forma se colocaron 5 ml de dieta artificial en
vasos y se dejaron secar, posteriormente se contaminó la superficie de la dieta con una
suspensión las concentraciones de los OBs, expandiendo los cuerpos de oclusión por
toda la superficie de la dieta con una pipeta Pasteur invertida, como control se utilizo
agua corriente que se esparció de igual forma en la dieta se hicieron 3 repeticiones para
cada concentración de 25 larvas cada una. Los bioensayos se guardaron en bolsas de
papel incubadas a temperatura ambiente y a los 7 días se reporto la mortalidad.
En base a los resultados de estas concentraciones se establecieron seis concentraciones
para obtener un total de ocho concentraciones más y se determino la CL50.
Elaboración del bioinsecticida.
Combinación de los entomopatógenos.
Para probar si la combinación de los entomopatógenos causaba un aumento en la
mortalidad de las plagas se realizó la combinación de la CL50 de una de las cepas
40
bacterianas y cada uno de los virus por separado. El bioensayo se realizó de acuerdo a lo
descrito previamente.
Elaboración de formulados granulares para bioensayos de preferencia alimenticia.
Se ha comprobado que el uso de un fagoestimulante en los bioinsecticidas favorece el
consumo de la concentración letal del entomopatógeno empleado ya que proporciona
palatabilidad a los insectos, por lo anterior se realizaron bioensayos de preferencia
alimenticia para identificar al fagoestimulante preferido para cada una de las plagas
tratadas. Para ello se elaboraron formulado granulares a base de Capsul® (almidón de
maíz modificado) como agente encapsulante y gelatina porcina como polímero
adherente, mezclados con fagoestimulantes naturales provenientes de partes secas de
plantas de maíz, soya y sorgo. Las diversas partes de las plantas que se muestran en el
Cuadro 7, se deshidrataron en un horno de tiro forzado (Shel-Lab® FX5, Cornelius
Oregón) a 50°C por 24 h y después se molieron en un mortero hasta obtener un polvo
fino.
Cuadro 7. Partes deshidratadas de las plantas utilizadas como fagoestimulantes.
Parte de la planta Maíz Soya Sorgo
Hoja X X X
Grano X X X
Aceite --- X ---
Olote X --- ---
Los formulados de Capsul®+gelatina porcina se elaboraron mezclando los polímeros a
razón de 1:1. Los fagoestimulantes previamente preparados, se agregaron al 4% a la
mezcla anterior con 25 ml de agua destilada. Cada mezcla colocada en un molde de
aluminio, se incorporó con una espátula hasta la apariencia de sólido con forma
granulosa. Posteriormente se desecaron en un horno de tiro forzado a 40°C -45°C por 24
h. Una vez desecadas se molieron con un mortero y se pasaron a través de una criba con
malla del # 6 para eliminar las partículas más grandes y hacer uniforme el tamaño de los
gránulos. Los gránulos obtenidos se almacenaron en botes de plástico a temperatura
41
ambiente para su uso posterior. Los formulados obtenidos y los controles utilizados en
los bioensayos se muestran en el Cuadro 8.
Cuadro 8. Formulados fagoestimulantes y controles utilizados para los bioensayos de preferencia alimenticia.
Bioensayos de preferencia alimenticia.
Los bioensayos de preferencia alimenticia se realizaron por el método de dos
alternativas descrito por Bartelt et al., 1990, para el cual se elaboraron formulados
granulares sin entomopatógenos.
Para el bioensayo se utilizaron cajas Petri desechables de 5cm de diámetro (60x15mm)
con el fondo cubierto con una mezcla de pasta de parís (Dap®) y carbón activado (CTR
scientific™) en proporción 15:1. En cada caja se depositaron en sitios opuestos 0.2 g de
gránulos a comparar (Fig. 3). Como control se utilizaron partes frescas de plantas de
maíz, sorgo y soya respectivamente, las confrontaciones para cada una de las plagas se
presentan en los Cuadros 9 y 10. Se realizaron 5 repeticiones por cada comparación, en
cada repetición se transfirieron 10 larvas de 2 días de edad respectivamente de S. exigua
Formulación Fagoestimulantes Soporte
Capsul ®
Adherente
Gelatina
Abreviatura
1 Olote X X CGO
2 Aceite de soya X X CGAS
3 Semilla de soya X X CGSS
4 Semilla de sorgo X X CGSG
5 Semilla de maíz X X CGSM
6 Hoja de soya X X CGHS
7 Hoja de sorgo X X CGHS
8 Hoja de maíz X X CGHM
Testigos (-)
C1 Hoja fresca de soya
C2 Hoja fresca de maíz
C3 Hoja fresca de sorgo
42
y S. frugiperda, a las cuales se les permitió alimentarse durante 16 h a 28°C en completa
oscuridad, al término de este periodo las cajas de Petri se congelaron a -20°C por 16
horas y el número de larvas sobre cada sitio se registró. Los resultados se analizaron
mediante el análisis no paramétrico de Mann-Whitney del paquete estadístico SPSS
15.0.
Figura 3. Fotografía que muestra la disposición de los formulados granulares de acuerdo al método de dos alternativas.
43
Cuadro 9. Confrontaciones de 2 alternativas para los bioensayos de preferencia alimenticia en larvas neonatas de S. exigua.
Confrontaciones
CGO CGAS CGSS CGSSG CGHS CGHSG CGHM C1
CGO * * * * * * *
CGAS * * * * * *
CGSS * * * * *
CGSSG * * * *
CGHS * * *
CGHSG * *
CGHM *
C1
44
Cuadro 10. Confrontaciones de 2 alternativas para los bioensayos de preferencia alimenticia en larvas neonatas de S. frugiperda.
Confrontaciones.
CGM CGAS CGSS CGSSG CGHS CGHSG C2 C3
CMO * * * * * * *
CGAS * * * * * *
CGSS * * * * *
CGSSG * * * *
CGHS * * *
CGHSG * *
C2 *
C3
45
Solución base.
Con el fagoestimulante seleccionado de los bioensayos de preferencia alimenticia se
elaboro una solución base que contenía: aceite de soya al 1.25%(Consentido®), 25µl de
Tween 20® (Bio Basic, Inc.), fagoestimulante al 0.02% en 100 ml de agua corriente esta
solución base se probó por si sola para observar el efecto que producía en las larvas
neonatas de S. exigua y S. frugiperda mediante ensayos de laboratorio para evaluarla sin
principios activos. Los bioensayos se realizaron como se describe a continuación.
Evaluación de la actividad toxica de la solución base en larvas neonatas de S.
exigua y S. frugiperda
Se realizaron bioensayos de laboratorio para determinar el efecto por si solo de la
solución base en larvas neonatas de S. exigua y S, frugiperda, los bioensayos se
elaboraron de la siguiente manera, en vasos con dieta artificial seca se agregaron 30µl de
la solución base y con una pipeta Pasteur se extendió la solución en la superficie de la
dieta se dejo secar por 45 min, se coloco una larva por cada vaso se cerraron y se
colocaron en bolsas de papel, se realizaron tres repeticiones de 25 larvas cada una y
como control se utilizó agua corriente vertida sobre la superficie de la dieta al igual que
la solución base. Los vasos se incubaron a temperatura ambiente y al cabo de 7 días se
reportaron las mortalidades.
Elaboración de los formulados bioinsecticidas.
Posteriormente a la solución base se le adicionaron los principios activos de B.
thuringiensis, y OBs de SeMNPV y SfMNPV en diferentes concentraciones solos o
combinados. Como controles para los bioensayos de mortalidad de los formulados se
utilizó agua corriente, la solución base sin principios activos y 2 formulados comerciales
Lepitur® a base de B. thuringiensis (serovariedad, kurstaki) y uno bioinsecticida
artesanal producido por el INIFAP a base de AgMNPV.
46
Determinación de la actividad tóxica de los formulados bioinsecticidas a nivel
invernadero (Modificado de Tamez-Guerra, 2002).
Se realizaron bioensayos para determinar la actividad tóxica del formulado de B.
thuringiensis y baculovirus, para ello se utilizaron ‘ensayos de alimentación en hoja”
utilizando hojas de maíz, soya y sorgo, de plantas cultivadas en invernadero de 1 mes de
edad. Las hojas fueron enjuagadas con agua de la llave antes de su uso. Se cortaron
rectángulos de las hojas de 2 x 3 cm. y se prepararon cinco vasos por cada formulado a
probar incluyendo los controles (antes mencionados). Los formulados se prepararon
utilizando 100 ml para cada formulado de la solución base a la cual se le adicionaron las
cantidades necesarias de los principios activos de B. thuringiensis, y OBs de SeMNPV y
SfMNPV hasta obtener diferentes concentraciones solos o combinados (las
concentraciones se modificaron de acuerdo a lo reportado por, Williams et al, 2002 para
los baculovirus y Tamez-Guerra et al., 1998 para B. thuringiensis), se mezclaron
vigorosamente cada una de las formulaciones, en los cuadros 10 y 11 se muestran el
contenido completo de cada una de las formulaciones. Las hojas cortadas se sumergieron
en éstas hasta quedar empapadas por aproximadamente 15 s y colocadas posteriormente
de forma individual en vasos de plástico con el fondo cubierto con papel filtro Whatman
# 1. En cada uno de los vasos se colocaron 20 larvas neonatas, se taparon y se pusieron
en bolsas de papel. Los vasos se incubaron a temperatura ambiente por 24 h dejando a
las larvas alimentarse de las hojas empapadas de los formulados, posteriormente se
seleccionaron cinco larvas sobrevivientes de cada vaso (25 larvas en total para cada
formulado) las cuales se transfirieron a vasos individuales que contenían dieta artificial y
se determinaron los porcentajes de mortalidad a los 7 días.
47
RESULTADOS
Selección de cepas de B. thuringiensis.
Mediante la detección de los genes cry 1, 2 y 9 por PCR, se seleccionaron las cepas por
su contenido génico para ser cultivadas y obtener el complejo espora-cristal. Los
resultados obtenidos se visualizan en las Figs. 4, 5 y 6 en donde se observa que la
mayoría de las cepas mostraron la presencia de los genes cry a excepción de la cepa
4D12 en la que no se detecto el gen cry 1, sin embargo si mostro la presencia de los
genes cry2 y cry 9 por lo cual se consideró como candidata a mostrar toxicidad hacia
lepidópteros. Por lo que la extracción del complejo espora-cristal se realizó para todas
las cepas y se procedió a los bioensayos de toxicidad.
Figura 4. Detección del gen cry 1 en cepas de Bacillus thuringiensis. Carriles; 1, marcador molecular 1kb; 2, cepa HD-133; 3, cepa 4L1; 4, cepa 4D4; 5, cepa 4D12; 6, cepa 4G5; 7, cepa 4D1; 8, cepa 4I4; 9, control (premix de PCR sin DNA).
1 2 3 4 5 6 7 8 9
700pb
500pb
Fragmento
de700pb.
48
Figura 5. Detección del gen cry 2 en cepas de Bacillus thuringiensis. Carriles; 1, marcador molecular 1kb; 2, cepa HD-133; 3, cepa 4L1; 4, cepa 4D4; 5, cepa 4D12; 6, cepa 4G5; 7, cepa 4D1; 8, cepa 4I4; 9, control (premix de PCR sin DNA).
Figura 6. Detección del gen cry 9 en cepas de Bacillus thuringiensis. Carriles; 1, marcador molecular 1kb; 2, cepa HD-133; 3, cepa 4L1; 4, cepa 4D4; 5, cepa 4D12; 6, cepa 4G5; 7, cepa 4D1; 8, cepa 4I4; 9, control (premix de PCR sin DNA).
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 2 3 4 5 6 7 8 9
500pb
250pb
2000pb
1500pb
Fragmento
de 1700pb.
Fragmento
de 350pb.
49
Bioensayos de mortalidad en larvas neonatas de S. exigua y S. frugiperda.
Utilizando cepas de B. thuringiensis.
Como se puede notar en las Figs. 7 y 8 la cepa HD-133 causó una mayor toxicidad
reflejada en el porcentaje de mortalidad de las larvas neonatas tanto de S. exigua como
de S. frugiperda en ambas concentraciones del complejo espora-cristal.
En el caso de S. exigua (Fig. 7), las cepas que causaron un porcentaje de mortalidad alto,
fueron la cepa HD-133 que alcanzó el 100% a una concentración de 500 µg/ml y 84% a
una concentración de 50 µg/ml, seguida de la cepa 4I4 con mortalidades de 84% y 48%
respectivamente. Las cepas 4L1 y 4D1 mostraron mortalidades similares de entre 52-
54.6% a la concentración alta, pero muy diferentes a la concentración baja; 48% para
4L1 y 22% para 4D1. La cepa 4G5 causó 44% y 14% de mortalidad a las
concentraciones alta y baja respectivamente. Las cepas menos tóxicas fueron la 4D4 con
un 24.33% y 1.33% de mortalidad y la 4D12 con un 9.33% y 5% de mortalidad.
Para S. frugiperda la cepa HD-133 causó altos valores (92% y 56%), de mortalidad
comparada con todas las cepas. Con excepción de la cepa 4L1que en la concentración
alta causó una mortalidad del 84%, pero en la concentración baja solo alcanzó un 11%
de mortalidad. El resto de las cepas causaron mortalidades inferiores al 10% (Fig. 8).
Figura 7. Mortalidad de larvas neonatas de cristal de diferentes cepas de Bacillus
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Control 4D12 4D4
Mo
rta
lid
ad
Cepas de
Mortalidad de larvas neonatas de Spodoptera exigua tratadas con dos concentraciones del complejo esporaacillus thuringiensis a los 7 días de exposición.
4G5 4D1 4I4 4L1 HD133
Cepas de Bacillus thuringiensis.
Complejo espora
50µg/ml.
Complejo espora
500µg/ml.
50
dos concentraciones del complejo espora-
Complejo espora-cristal a una concentración de
Complejo espora-crista a una concentración de
Figura 8. Mortalidad de larvas neonatas de complejo espora-cristal de cepas diferentes de
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Control 4D12 4D4
Mo
rta
lid
ad
Cepas de
. Mortalidad de larvas neonatas de Spodoptera frugiperda tratadas con dos diferentes concentraciones del cristal de cepas diferentes de Bacillus thuringiensis a los 7
4G5 4D1 4I4 4L1 HD-133
Cepas de Bacillus thuringiensis.
Complejo espora
de 50 µg/ml
Complejo espora
de 500 µg/ml
51
dos diferentes concentraciones del a los 7 días de exposición
Complejo espora-cristal a una concentración
Complejo espora-cristal a una concentración
52
Determinación de la concentración letal media (CL50) de la cepa HD-133.
Una vez registrada la mortalidad causada por la concentración alta y baja del complejo
espora-cristal de las cepas, se escogió la cepa HD-133 por su toxicidad, y se
seleccionaron ocho concentraciones diferentes para determinar la CL50 de dicha cepa. En
el caso S. exigua las concentraciones fueron de 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200 y 500 µg/ml
y para S. frugiperda son 30, 50, 80, 100, 200, 300, 400 y 500 µg/ml. Los valores
arrojados fueron los siguientes para S. exigua la CL50 de la cepa es de 22.25 µg/ml del
complejo espora cristal de la cepa HD-133 y para S. frugiperda es de 60.51 µg/ml.
Selección de baculovirus.
Identificación de los baculovirus por medio de secuenciación y comparación de los
fragmentos del gen poliedrina mediante la herramienta BLAST.
La identificación preliminar que reconoce a los baculovirus se puede ver en la Fig. 9 ya
que junto con el virus comercial de AgMNPV, los virus analizados por PCR presentaron
una banda de aproximadamente 600 pb consistente con lo esperado al amplificar el gen
poliedrina, un gen que únicamente se encuentra en la familia de estos virus.
Posteriormente con la secuenciación de los fragmentos de la amplificación se muestra
que el fragmento de AgMNPV mostró un 98% de identidad máxima respecto al gen de la
poliedrina de AgMNPV (número de acceso Y17753.2) contenido en la base de datos del
GenBank, el fragmento de SeMNPV mostró un 99% de máxima identidad con respecto
al gen de la poliedrina de SeMNPV (número de acceso GO392064.1) y el fragmento de
SfMNPV un 97% con respecto al gen de la poliedrina de SfMNPV (número de acceso
GO923762.1).
1 2 3 4 5
53
Figura 9. Detección del gen de la poliedrina. Carril 1, marcador de peso molecular de
1kb, 2, AgMNPV, 3, SeMNPV, 4, SfMNPV, 5, control (premix de PCR)
Bioensayos de mortalidad de baculovirus.
Determinación de la CL50 de los baculovirus SeMNPV y SfMNPV.
Para la determinación de la CL50 se utilizaron ocho concentraciones diferentes en un
rango de 101 a 106 de los baculovirus, en el caso de S. exigua se utilizaron
concentraciones de 1x101, 5x101, 1x102, 5x102, 1x103, 5x103, 1x104 y 1x105 OBs de
SeMNPV y para S. frugiperda las concentraciones fueron de 1x102, 1x103, 5x103, 1x104,
5x104, 1x105, 5x105 y 1x106 OBs de SfMNPV. Los resultados arrojados fueron los
siguientes la CL50 de SeMNPV para larvas neonatas de S. exigua fue de 3.5x102 OBs y la
CL50 de SfMNPV para larvas neonatas de S. frugiperda fue de 4.9x104 OBs.
700pb
500pb
250pb
Fragmento
600pb
54
Elaboración del bioinsecticida.
Combinación de los entomopatógenos.
Después de obtener la CL50 calculadas por el programa estadístico para ambos insectos,
se combinaron las CL50 para cada plaga, para S. exigua se combino la CL50 de SeMNPV
y la de la cepa HD-133 obtenida para este organismo y para S. frugiperda se mezclo la
CL50 de SfMNPV y la obtenida de la cepa HD-133.
Ambas combinaciones resultaron en un aumento de la mortalidad de las plagas en S.
exigua se obtuvo un 88.23% mortalidad y en S. frugiperda un 98.52%. Observándose un
sinergismo entre la cepa HD-133 de B. thuringiensis y cada uno los baculovirus
SeMNPV o SfMNPV cuando se aplican combinados contra S. exigua o contra S.
frugiperda.
Bioensayos de preferencia alimenticia.
En el Cuadro 11 se presentan los resultados obtenidos de los bioensayos de preferencia
alimenticia para S. exigua, en los que eligió como su alimento preferido la hoja fresca de
soya, y como formulaciones preferidas en orden descendente, formulación cuyo
fagoestimulante fue la hoja seca de soya, la formulación de semilla de sorgo, la
formulación de hoja seca de maíz, las formulaciones de semilla de soya y hoja seca de
sorgo y por último no tuvo preferencia por los formulados con olote o aceite de soya.
La preferencia alimenticia de S. frugiperda se inclino hacia la hoja fresca de maíz y la
hoja fresca de sorgo en orden de preferencia al igual que la de S. exigua. Los formulados
granulares a base de las partes secas de estas plantas no fueron preferidos, quedando así
como su tercera elección. El formulado granular que contenía la hoja seca de soya como
fagoestimulante, seguido de la hoja seca de sorgo y la semilla de soya, dejando sin
preferencia a la semilla de maíz, aceite de soya y la semilla de sorgo (Cuadro 12).
Por lo anterior el fagoestimulante elegido para la formulación bioinsecticida fue la hoja
seca de soya, ya que fue elegido por ambas plagas.
55
Cuadro11. Bioensayo de preferencia alimenticia de 2 alternativas en larvas neonatas de S. exigua.
Comparación
Tratamientos P
No. Larvas CGO CGAS CGSS CGSSG CGHS CGHSG CGHM C Respuest
a Sin respuesta
1 14 12 NS 26 24 2 17 23 NS 40 10 3 10 35 ** 45 5 4 13 26 * 39 11 5 17 22 NS 39 11 6 13 20 ** 33 17 7 1 49 ** 50 0 8 7 24 ** 31 19 9 13 25 NS 38 12 10 7 26 * 33 17 11 5 31 ** 36 14 12 3 30 ** 33 17 13 0 47 ** 47 3 14 11 28 * 39 11 15 15 20 NS 35 15 16 17 15 NS 32 18 17 17 15 NS 32 18 18 0 49 ** 49 1 19 13 28 ** 41 9 20 15 19 NS 34 16 21 28 11 ** 40 10 22 3 43 ** 46 4 23 14 17 NS 31 19 24 20 4 ** 24 26 25 4 41 ** 45 5 26 14 14 NS 28 22 27 6 38 ** 44 6 28 5 45 ** 50 0
Para cada contraste el número total de larvas fue de 50. Los valores de P fueron obtenidos del análisis de Mann-Whitney. NS=no significativo, *P≤ 0.05, ** P≤ 0.01. Las claves de los tratamientos se refieren en el cuadro 8.
56
Cuadro 12. Bioensayos de preferencia alimentaria de 2 alternativas en larvas neonatas de S. frugiperda.
Comparación
Tratamientos P≤ 0.05
No. Larvas CGM CGAS CGGS CGGSG CGHS CGHSG C1 C2 Respuest
a Sin respuesta
1 23 11 NS 34 16 2 16 26 * 42 8 3 17 27 NS 44 6 4 18 22 NS 40 10 5 22 26 NS 48 2 6 4 37 ** 41 9 7 12 35 ** 47 3 8 2 7 NS 9 41 9 11 9 NS 20 30 10 6 31 ** 37 13 11 6 22 * 28 22 12 4 44 * 48 2 13 5 36 ** 41 9 14 12 10 NS 22 28 15 9 23 ** 32 18 16 7 22 NS 29 21 17 6 42 ** 48 2 18 10 40 ** 50 0 19 4 33 ** 37 13 20 4 23 ** 27 23 21 7 39 ** 46 4 22 11 38 ** 49 1 23 26 9 ** 35 15 24 3 47 ** 50 0 25 25 23 NS 48 2 26 2 48 ** 50 0 27 12 38 ** 50 0 28 23 11 NS 34 16
Para cada contraste el número total de larvas fue de 50. Los valores de P fueron obtenidos del análisis de Mann-Whitney. NS=no significativo, *P≤ 0.05, ** P≤ 0.01. Las claves de los formulados se refieren en el cuadro 8.
57
Evaluación de la actividad toxica de la solución base en larvas neonatas de S.
exigua y S. frugiperda.
La solución base causó en S. exigua una mortalidad del 23.60% y en S. frugiperda del
10.20% a los 7 días de exposición (Fig. 12).
Elaboración de los formulados bioinsecticidas.
El resultado de las diferentes formulaciones con diferentes concentraciones aplicado a S.
exigua en hojas de soya y a S. frugiperda en hojas de maíz y sorgo se encuentran
detallados en los cuadros 13 y 14, ahí se puede apreciar que se utilizaron
concentraciones mayores de principios activos en el caso de S. frugiperda (Cuadro 14)
debido a que presenta una mayor resistencia.
Determinación de la actividad toxica de los formulados bioinsecticidas a nivel
invernadero.
En los bioensayos de toxicidad con S. exigua en hoja de soya y la cepa HD-133 como
principio activo se obtuvo una baja mortalidad de las larvas (formulaciones 3, 4 y 5
Cuadro 13) (Fig.11). Por otra parte las formulaciones con SeMNPV a concentraciones
de 5x104 y 5x105 (formulaciones 3 y 4) causaron una mortalidad menor al 30%, pero
sorpresivamente la concentración 5x105 (formulación 5) causó una mortalidad del 72%,
en lo que respecta a las combinaciones de principios activos, las formulaciones 9 y 10
presentaron un sinergismo al elevar las mortalidades que habían presentado los
entomopatógenos por si solos, en el caso de la formulación 11 no se puede medir el
sinergismo ya que presenta una mortalidad del 72% igual a la presentada por SeMNPV a
la misma concentración sin el complejo espora-cristal de HD-133, sin embargo lo que sí
se puede apreciar en la formulación 12 que contiene las concentraciones bajas de
complejo espora-cristal y de SeMNPV además del virus de SfMNPV, es que este último
si causa una mortalidad en S. exigua ya en la combinación de los dos primeros la
mortalidad fue de un 48% y con el virus de SfMNPV subió a un 68%.
58
Las mortalidades de los productos comerciales fueron muy parecidas a las de la
formulación 9 con un 45.8% para Lepitur® y un 38% de mortalidad para el formulado
del INIFAP.
En S. frugiperda las formulaciones utilizadas para las hojas de maíz y sorgo fueron las
mismas (Cuadro14), de aquí que los resultados sean semejantes. En los formulados 3, 4
y 5 que solo contenían concentraciones del complejo espora-cristal las mortalidades
presentadas en maíz fueron de 12%, 20% y 40% (Fig.12) y en sorgo fueron de 4%, 16%
y 52% (Fig. 13), en los formulados 6, 7 y 8 solo con OBs de SfMNPV en maíz
presentaron una mortalidad igual en las tres formulaciones de un 88%, mientras que en
sorgo las mortalidades fueron de 80% para la primera y 88% para las dos últimas, en la
formulaciones que contienen los combinados de los principios activos la variación más
clara se presento en la formulación 9 con un 28% en maíz y un 40% de mortalidad en
sorgo, las formulaciones 10 y 11 no variaron en sorgo ni en maíz con un 100%
mortalidad, sin embargo en la formulación 12 que contienia las mismas concentraciones
bajas de SfMNPV y complejo espora-cristal de HD-133 de la formulación 9, además de
SeMNPV, se observa el mismo efecto que con S. exigua, el segundo virus si produjo un
efectoincrementando la mortalidad haciéndose evidente en el maíz de un 28% a un 60%
de mortalidad y en el sorgo ligeramente de un 40% a un 44% de mortalidad.
En los controles comerciales los formulaciones 13 y 14 la mortalidad fue igual en sorgo
y maíz siendo de un 48% y 40% respectivamente.
Figura 10. Mortalidad de larvas neonatas de durante 7 días.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Control
Mo
rta
lid
ad
.
. Mortalidad de larvas neonatas de Spodoptera exigua y Spodoptera frugiperda expuestas a la solución base
Spodoptera exigua Spodoptera frugiperda
Insectos tratados.
59
expuestas a la solución base
Spodoptera frugiperda
60
Cuadro 13. Ingredientes utilizados en las formulaciones bioinsecticidas para S. exigua aplicadas en hojas de soya.
N B. thuringiensis SeMNPV SfMNPV Solución Lepitur® INIFAP Agua
1 --- --- --- --- --- --- 100ml
2 --- --- --- 100ml --- --- ---
3 400µg/ml --- --- 100ml --- --- ---
4 500µg/ml --- --- 100ml --- --- ---
5 600µg/ml --- --- 100ml --- --- ---
6 --- 5x103 --- 100ml --- --- ---
7 --- 5x104 --- 100ml --- --- ---
8 --- 5x105 --- 100ml --- --- ---
9 400µg/ml 5x103 --- 100ml --- --- ---
10 500µg/ml 5x104 --- 100ml --- --- ---
11 600µg/ml 5x105 --- 100ml --- --- ---
12 400µg/ml 5x103 5x106 100ml --- --- ---
13 --- --- --- --- 0.5ml --- 100ml
14 --- --- --- --- --- 1.6x106 100ml
61
Figura 11. Mortalidad a los 7 días de larvas neonatas de Spodoptera exigua con 24 h de exposición a las formulaciones en soya. Las claves de los formulados se refieren en el cuadro 13.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Mo
rta
lid
ad
.
Formulados bioinsecticidas.
Controles
Formulados con HD-133Formulados con SeMNPVCombinaciones
Controles comerciales
62
Cuadro 14. Ingredientes utilizados en las formulaciones bioinsecticidas para S. frugiperda aplicadas en hojas de maíz y sorgo.
N B. thuringiensis. SfMNPV SeMNPV Solución base Lepitur® INIFAP Agua
1 --- --- --- --- --- --- 100ml
2 --- --- --- 100ml --- --- ---
3 700µg/ml --- --- 100ml --- --- ---
4 850µg/ml --- --- 100ml --- --- ---
5 1000µg/ml --- --- 100ml --- --- ---
6 --- 5x106 --- 100ml --- --- ---
7 --- 5x107 --- 100ml --- --- ---
8 --- 2.5x108 --- 100ml --- --- ---
9 700µg/ml 5x106 --- 100ml --- --- ---
10 850µg/ml 5x107 --- 100ml --- --- ---
11 1000µg/ml 2.5x108 --- 100ml --- --- ---
12 700µg/ml 5x106 5x106 100ml --- --- ---
13 --- --- --- --- 0.5ml --- 100ml
14 --- --- --- --- --- 1.6x106 100ml
Figura 12. Mortalidad a los 7 días de larvas neonatas de formulaciones en hojas de maíz. Las claves de los formulados se refieren en el cuadro 14.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
1 2 3 4 5
Mo
rta
lid
ad
.
. Mortalidad a los 7 días de larvas neonatas de Spodoptera frugiperda con 24 h de exposición a las Las claves de los formulados se refieren en el cuadro 14.
6 7 8 9 10 11 12 13 14
Formulaciones bioinsecticidas.
63
con 24 h de exposición a las
Controles
Formulados con HD-133
Formulados con SfMNPV
Formulados combinado
Controles comerciales
64
Figura 13. Mortalidad a los 7 días de larvas neonatas de Spodoptera frugiperda con 24 h de exposición a las formulaciones en hojas de sorgo. Las claves de los formulados se refieren en el cuadro 14
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Mo
rta
lid
ad
.
Formulaciones bioinsecticidas.
Controles
Formulados con complejoHD-133
Formulados conSeMNPV
Formulados combinados
Controles comerciales
65
DISCUSIONES
De acuerdo con Bravo et al., 1997, los genes cry 1, 2 y 9 producen proteínas Cry toxicas
contra lepidópteros, en el caso de S. exigua y S. frugiperda los genes cry 1C y cry 1D
son específicos (Knaak et al., 2008). En el presente estudio se realizo la búsqueda de los
genes cry 1, 2 y 9, en siete cepas de B. thuringiensis (HD-133, 4L1, 4D4, 4D12, 4G5,
4D1, 4I4). El gen cry 1 fue identificado en las cepas HD-133, 4L1, 4D4, 4D12, 4D1 y
4I4, los genes cry 2 y cry 9 se encontraron presentes en todas las cepas. No obstante la
presencia de dichos genes el porcentaje de mortalidad que se observó en larvas de S.
exigua tratadas con complejo espora-cristal de las cepas 4D12, 4D4 y 4G5 a una
concentración de 50µg/ml fue menor al 20% y a una concentración de 500 µg/ml fue
menor al 60% en 7 días de exposición. En el caso de S. frugiperda las cepas, 4D1 y 4I4
causaron una mortalidad menor a un 7% a una concentración de 500 µg/ml del complejo
espora-cristal y las cepas 4D4, 4D12, 4G5 no registraron mortalidad.
El caso de las cepas que contienen los 3 genes cry, pero que mostraron una baja
mortalidad, podría deberse a que se realizó un escrutinio únicamente del contenido
génico, pero no se midió la expresión de los genes, por lo que es posible que estos genes
no estén activos, tengan un actividad débil o en los insectos blancos empleados no se
haya llevado a cabo la activación completa de las proteínas Cry.
Artrust et al., 2008 utilizando el granulovirus de Phthorimaea operculella (PoGV) y la
bacteria B. thuringiensis serovariedad kurstaki por separado con diferentes tipos de
acarreadores en liquidas (suspensiones de agua) o formulaciones secas (tierra de
diatomeas, talco, arena de albañilería y arcilla caolín ), para el control de Phthorimaea
operculella, insecto que ataca a los tubérculos durante su almacenamiento, encontró que
el uso por separado de ambos entomopatógenos reporto un 100% de mortalidad en las
formulación liquida y en la formulación seca hecha con talco que contenía PoGV, en
cuanto a B. thuringiensis el uso de diferentes formulaciones no afecto el resultado de
mortalidad en aplicaciones antes de la infección de Phthorimaea operculella, mientras
66
que, post infección la formulación más efectiva fue la formulación liquida para ambos
entomopatógenos. Este estudio mostro que si bien el uso de diferentes formulaciones
pueden afectar el resultado de mortalidad, también las formulaciones liquidas que
contienen al baculovirus o B. thuringiensis dan un mejor resultado, por lo que la
formulación empleada por nosotros está respaldada, ya que es una formulación liquida
que no solo contiene agua como en el caso anterior sino que además posee una cantidad
de aceite que actúa como adherente, un fagoestimulante (hoja seca de soya) y un
dispersante (Tween 20®), además la aplicación de entomopatógenos en suspensión
acuosa disminuye la posibilidad de variabilidad de los bioensayos ya que se consigue
una cobertura homogénea en la superficie de exposición (Mamani, 2008)
Los aceites se han utilizado como insecticidas no solo por los compuestos químicos que
contienen, que actúan como repelentes como es el caso de los aceites esenciales (Koul et
al, 2008), sino también por la actividad insecticida que realizan por sí mismos como los
aceites vegetales (soya, maíz etc.). El modo de acción de estos no está bien definido, sin
embargo una de las teorías mas aceptadas señala que congestionan los espiráculos,
orificios por donde entra aire a los artrópodos provocando la muerte por sofocación
(Martin-López et al., 2004)
Nosotros usamos aceite de soya como adherente, pero además de cumplir esta función,
cuando se probo la solución base (Fig. 10), que contenía el aceite de soya, Tween 20® ,
fagoestimulante y agua, se comprobó que la solución base tuvo un efecto insecticida en
el caso de S exigua produciendo un 23.6% de mortalidad a los 7 días de exposición con
un control negativo que tuvo una mortalidad de 2.6%, en este caso no puede definirse si
la acción fuere provocada por el aceite de soya o por el el Tween 20® que también es un
aceite por qué no se probaron los ingredientes por separado, pero la cantidad empleada
de Tween 20® es de apenas del 0.025%, entonces hace probable que la actividad
insecticida sea del aceite de soya.
No obstante también existen artículos en los que se afirma que el uso de aceites en las
formulaciones no contribuye a la actividad insecticida como en lo reportado por Araque
y Peláez en 2009, ellos evaluaron la nicotina como insecticida contra Drosophila
67
melanogaster, en una emulsión hecha de aceite de girasol, Tween 20® como
emulsificador y la nicotina contenida en agua, lo que encontraron fue lo siguiente, en la
emulsión la actividad insecticida estaba dada únicamente por la fase acuosa que contenía
la molécula de nicotina, por lo que la emulsión no potencia a esta, este efecto fue
observado cuando la solución base se expuso a los insectos solo por 24 h ya que en el
caso de S. frugiperda en hojas sorgo solo hubo una diferencia de mortalidad del 2.4 %
en la exposición de 24 h a 7 días, lo cual lleva a la conclusión de que en S. frugiperda la
solución base en sí misma no tiene un capacidad insecticida.
El uso de fagoestimulantes para favorecer el consumo de los ingredientes activos está
bien documentado, cabe destacar que el gusto por los fagoestimulantes está determinado
por la experiencia previa de los insectos como lo señala Lasa et al., (2009). Por ello, la
importancia de utilizar derivados de las plantas (en este caso partes secas de maíz, soya
y sorgo) los cuales son el alimento natural de los insectos, ya que al aplicar el
bioinsecticida el insecto tendrá un sabor ya conocido y agradable, que favorecerá el
consumo del principio activo.
Existe una gran variedad de compuestos que se han utilizado como fagoestimulantes
entre ellos: el aceite vegetal, aceite de maíz, azúcar pulverizada, follaje de maíz
deshidratado, germen de trigo etc., y otros tantos comerciales, por ejemplo el Coax®
(Rosas-García, 2008), sin embargo no se había usado la hoja seca de soya como
fagoestimulantes en S. exigua ni en S. frugiperda y en este trabajo se probo que es
preferida en ambos insectos, incluso sobre partes secas de otras plantas (el maíz y
sorgo), aunque no supero la preferencia de los insectos por las hojas frescas de las
plantas que constituyen su alimento natural, de acuerdo con lo reportado por Rosas-
García y De Luna Santillana, (2004) es posible encontrar un fagoestimulante que sea
preferido incluso sobre su alimento natural.
El uso combinado de varios entomopatógenos en un bioinsecticida es importante como
una medida precautoria para evitar la resistencia, incluso si ya se presentara una
resistencia en campo a alguno de los entomopatógenos, está comprobado, que la
resistencia de un insecto hacia un patógeno no afectaría o provocaría una resistencia
68
hacia el otro, como lo describen Milks and Myers en 2003, en el estudio realizado por
ellos, investigaron si la resistencia que presentaba Trichoplusia ni a TnSNPV, podría
afectar la susceptibilidad a otros entomopatógenos, en el caso especifico de B.
thuringiensis serovariedad kurstaki, tambien observaron que la CL50 de B. thuringiensis
no se vio afectada a pesar que los insectos presentaran una resistencia hacia TnSNPV,
por ello en este trabajo se uso una combinación de entomopatógenos.
Entre las combinaciones de bioinsecticidas que ya se han probado se encuentran el uso
combinado de un entomopatógeno con una sustancia química como: la combinación B.
thuringiensis con acido bórico (H3BO3) (Khan, 2006) abrillantadores ópticos con
nucleopoliedrovirus (Dougherty et al., 1996) y combinaciones de dos entomopatógenos
como Saccharopolyspora spinosa con nucleopoliedrovirus (Morales et al., 1997;
Méndez et al., 2002), o con B. thuringiensis (Duchet et al., 2008). Sin embargo aunque
teóricamente estas deberían potenciar la actividad insecticida en algunos casos no ha
ocurrido así como en el caso de la última combinación mencionada.
En este trabajo la combinación de una cepa de B. thuringiensis con SeMNPV y SfMNPV
se realizo como organismos completos e intactos y solo formulados con ingredientes
naturales para favorecer su patogenicidad, obteniendo un aumento en la mortalidad al
combinar las CL50 de los entomopatógenos sin formular, lo que representa un efecto
acumulativo de las mortalidades individuales, llegando incluso a obtener una mortalidad
del 98.52% en el caso de S. frugiperda a los 7 días de exposición.
Cuando se probaron los formulados bioinsecticidas en soya para S. exigua y en maíz y
sorgo para S. frugiperda, se obtuvo nuevamente al igual que con solo las CL50 un efecto
acumulativo de las mortalidades, presentándose un sinergismo de los entomopatógenos
en los tres formulados donde fue combiado B. thuringiensis y SeMNPV en larvas de S.
exigua, mientras que en las combinaciones de S. frugiperda solo se observo este
fenómeno en 2 combinaciones, en los formulados 10 y 11, el estudio de Xiang-Li and
Li-Qui, (2011) donde desarrollaron una cepa recombinante de B. thuringiensis que
contenía la proteína P74 de un nucleopoliedrovirus, la función de esta proteína es unirse
al borde del cepillo de la membrana vesicular durante el proceso de infección primaria y
esta tiene como finalidad determinar el rango de hospederos. Utilizando esta proteína se
69
pretendía aumentar el rango de hospederos debido a su habilidad de fusión de membrana
por lo que mejoraría el mecanismo de fusión de membrana de las toxinas Cry. El
resultado fue la disminución de la CL50 en la cepa que contenía el gen p74 en
comparación con la silvestre, este trabajo demuestra que existen mecanismos por lo que
los baculovirus pueden potenciar el efecto toxico de B. thuringiensis, utilizando esta
proteína in vivo y por lo que podría ser este el mecanismo por el cual existe un efecto
sinérgico en las combinaciones, no obstante además de este trabajo existen reportes
tratados adelante, que demuestran que algunos baculovirus específicamente los (GVs)
actúan como potenciadores de otros entomopatógenos ya que codifican potenciadores
como las metaloproteasas, enzimas que atacan a la membrana peritrófica. Esta
membrana, protege a las células epiteliales del intestino medio de las condiciones
digestivas del medio por lo que cuando B. thuringiensis y los Baculovirus entran al
intestino medio esta membrana representa una barrera para los entomopatógenos ya que
deben atravesarla, entonces sí es atacada por las metaloproteasas se incrementa su
porosidad permitiendo que los viriones se filtren a través de ella, lo que favorecería la
entrada tanto de viriones como toxinas Cry produciendo un efecto sinérgico potenciado
por el granulovirus. En 2001 Granados et al., confirmo lo anterior utilizando una
combinación de productos comerciales a base de B. thuringiensis junto con Trichoplusia
ni Granulovirus (TnGV) logrando un incremento de la mortalidad, usando el virus como
potenciador, sin embargo en nuestro trabajo no utilizamos granulovirus sino un
nucleopoliedrovirus y en el caso de los nucleopoliedrovirus no se ha demostrado tal
actividad, de producción de metaloproteasas pero si se sabe lo descrito anteriormente por
Xiang-Li and Li-Qui, (2011) que existen proteínas como la P74 que podrían estar
favoreciendo el sinergismo.
Sin embargo, contrario a lo anterior en la combinación 9 que contenía las
concentraciones bajas de B. thuringiensis y SfMNPV aplicadas en S. frugiperda tanto en
sorgo como en maíz sucedió un efecto de antagonismo de los entomopatógenos ya que
disminuyo la mortalidad e incluso fue menor a la presentada por el virus a la misma
concentración sin combinar, el mismo fenómeno se presento en la formulación 12
aplicada en S. frugiperda, hecha con las mismas concentraciones de entomopatógenos
70
que el formulado 9 con la diferencia que contenía SeMNPV mostrando una mayor
disminución de la mortalidad que en la 9, estos resultados en los que se presenta un
antagonismo contrario al efecto de sinergismo mostrado anteriormente se podrían
explicar como un error en las formulaciones o un error en la manipulación de las larvas,
sin embargo este fenómeno fue anteriormente visto por Raymond et al., (2006) donde se
estudio si el uso de un nucleopoliedrovirus podría aumentar la resistencia hacia la toxina
Cry 1Ac en larvas Plutella Xylostella que ya eran resistentes a esta toxina. No obstante,
cuando se aplicaron conjuntamente B. thuringienesis y AcMNPV en bajas
concentraciones en larvas de P. xylostella susceptibles y resistentes a la toxina se
identifico un efecto antagonista, siendo el efecto antagónico más evidente en las larvas
susceptibles a la toxina, entonces de acuerdo con el anterior trabajo el efecto antagónico
podría deberse a que si ya existe un proceso toxico en el intestino, podría existir una
interferencia para otro entomopatógeno ya que en el caso del anterior trabajo y del
nuestro los entomopatógenos empleados tienen un mecanismo de entrada similar, y de
acuerdo con Raymond las larvas susceptibles a la toxina son en las que se evidencio
notoriamente el efecto antagónico, por otra parte, otro trabajo al respecto es el realizado
por Mamani, (2008) en su investigación, los efectos antagónicos de la combinación de
entomopatógenos se presentaron cuando la concentración de B. thuringiensis fue
proporcionalmente elevada en la mezcla con respecto a la del baculovirus que empleo
(PoGV) en base a la CL50 de cada uno y sólo cuando la concentración de B. thuringiensis
en la mezcla fue baja y la de PoGV proporcionalmente alta, pudo observar una
interacción independiente, lo que demuestra que la concentración de cada uno de los
entomopatógenos juega un papel fundamental para que exista un sinergismo o un
antagonismo, en nuestro trabajo cuando se emplearon las CL50 de los entomopatógenos
se presento un sinergismo sin embargo cuando se formularon las formulados
bioinsecticidas no se usaron las CL50, sino que se aumentaron las concentraciones muy
por encima de sus CL50 y fue aquí donde se observo en algunas combinaciones un
antagonismo.
S. frugiperda siendo una plaga polífaga, en la aplicación de las formulados se presento
una variable mas ya que se aplicaron en dos hojas de plantas diferentes en sorgo y maíz
71
no obstante la aplicación de los formulados en las 2 plantas no produjo una variación en
la mortalidad, mientras que reportes anteriores, en plagas con la misma característica no
presentaron buenos resultados al aplicar la misma formulación bioinsecticida en
diferentes plantas (Williams, 2002), por lo que nosotros probamos que al menos en S.
frugiperda el cambio de planta no afecta la mortalidad presentada por las
concentraciones de B thuringiensis y SfMNPV formulados por lo que al menos para S.
frugiperda nuestro formulado podría emplearse en diferentes cultivos.
72
CONCLUCIONES
La cepa HD-133 de B. thuringiensis presento la mayor toxicidad hacia S. exigua y S.
frugiperda. Ambas plagas comparten la preferencia alimenticia hacia el fagoestimulante
hecho de hoja seca de soya.
Las formulaciones liquidas representa una alternativa viable a las formulaciones en
polvo ya que presentan una variedad amplia de plantas en las que pueden ser aplicado.
La combinación de la cepa HD-133 con SeMNPV y SfMNPV provocan un efecto de
entomopatógenos aumenta la mortalidad de tanto de S. exigua como en S. frugiperda
solo a ciertas concentraciones.
Debido al pobre efecto de sinergismo presentado por los entomopatógenos no es
conveniente realizar un formulado con la combinación de estos entomopatógenos.
73
PERSPECTIVAS
Realizar pruebas de campo con el formulado bioinsecticida para determinar su acción en
condiciones naturales.
Realizar pruebas de almacenamiento del formulado para observar por cuánto tiempo
mantiene la patogenicidad de los principios activos y si estos no disminuyen su efecto
con el paso del tiempo
Probar la formulación insecticida aquí elaborada contra otras plagas que sean
susceptibles a los entomopatógenos utilizando este trabajo.
74
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