Introdução à Bioquímica - biocristalografia.df.ibilce ... · Introdução à Bioquímica ... e de primeira ordem em relação a [B] ... concentração de um reatante em relação

DraDra. . FernandaFernanda CanduriCanduriLaboratórioLaboratório de de SistemasSistemas BioMolecularesBioMoleculares..DepartamentoDepartamento de de FísicaFísica. UNESP. UNESPSãoSão José do Rio José do Rio PretoPreto. SP.. SP.

LaboratórioLaboratório de de SistemasSistemas BioMolecularesBioMoleculares. . DepartamentoDepartamento de de FísicaFísica. . CâmpusCâmpus Rio Rio PretoPreto..www.www.biocristalografiabiocristalografia..dfdf..ibilceibilce..unespunesp..brbr

IntroduçãoIntrodução à à BioquímicaBioquímica

EnzimasEnzimas

EnzimasEnzimas

!! CatáliseCatálise

!! CinéticaCinética enzimáticaenzimática

!! InibiçãoInibição enzimáticaenzimática

!! RegulaçãoRegulação

“Toda enzima é uma proteína, mas nem todaproteína é uma enzima”


InformaçõesInformações geraisgerais

1.1. As As enzimasenzimas tem um tem um enormeenorme poderpoder catalíticocatalítico

2.2. SãoSão altamentealtamente específicasespecíficas

3.3. A A formaçãoformação de um de um complexocomplexo enzimaenzima--substratosubstrato é o é o primeiroprimeiro passopasso nana catálise enzimáticacatálise enzimática

4.4. As As enzimasenzimas aceleramaceleram reaçõesreações, , estabilizandoestabilizando estadosestadosde de transiçãotransição

5.5. A A atividadeatividade catalíticacatalítica de de muitasmuitas enzimasenzimas sãosãoreguladasreguladas..


CaracterísticasCaracterísticas geraisgerais!! As As enzimasenzimas sãosão catalisadorescatalisadores de de reaçõesreações biológicasbiológicas

!! DiferemDiferem dos dos catalisadorescatalisadores químicosquímicos emem váriosvários aspectosaspectos::

1.1. VelocidadeVelocidade de de reaçãoreação maismais rápidasrápidas –– de 10de 1066 a 10a 101212 vezesvezesmaioresmaiores

2.2. CondiçõesCondições reacionaisreacionais maismais brandasbrandas –– temperaturastemperaturasinferioresinferiores a 100a 100ooC, C, pressãopressão atmosféricaatmosférica e pH e pH quasequase neutroneutro

3.3. MaiorMaior especifidadeespecifidade dada reaçãoreação –– imensamenteimensamente maiormaior do do quequecatalisadorescatalisadores químicosquímicos emem relaçãorelação à à identidadeidentidade dos dos seusseussubstratossubstratos ((reagentesreagentes) e dos ) e dos seusseus produtosprodutos

4.4. CapacidadeCapacidade de de regulaçãoregulação –– a a atividadeatividade catalíticacatalítica podepode variarvariaremem respostaresposta àsàs concentraçõesconcentrações de de outrasoutras substânciassubstâncias


NomenclaturaNomenclatura

!! As As enzimasenzimas sãosão comumentecomumente denominadasdenominadasadicionandoadicionando--se o se o sufixosufixo ––asease aoao nomenome do do substratosubstrato, , ouou a a umauma expressãoexpressão queque descrevadescreva suasuaaçãoação catalíticacatalítica

Ex.: Ex.: ureaseurease "" catalisacatalisa a a hidrhidróóliselise dada ururééiaia

áálcoollcool desidrogenasedesidrogenase "" catalisacatalisa a a oxidaoxidaçãçãoo de de áálcooislcoois emem seusseus aldealdeíídosdos


ClassificaçãoClassificação!! As As enzimasenzimas foramforam classificadasclassificadas de de acordoacordo com a com a

naturezanatureza dada reaçãoreação químicaquímica queque catalisamcatalisam

1. Oxido-redutases (reações de oxidação-redução ou transferência de elétrons)

2. Transferases (transferem grupos funcionais como amina, fosfato, acil, carboxil)

3. Hidrolases (reações de hidrólise de ligação covalente)

4. Liases (catalisam a quebra de ligações covalentes e a remoção de moléculas de água, amônia e gás carbônico)

5. Isomerases (reações de interconversão entre isômeros óticos ou geométricos)

6. Ligases (catalisam reações de formação de novas moléculas a partir da ligação entre duas pré-existentes, sempre às custas de energia)

!! A A União InternacinalUnião Internacinal de de BioquímicaBioquímica e e BiologiaBiologia Molecular Molecular (IUBMB) (IUBMB) adotouadotou um um esquemaesquema de de classificação funcional classificação funcional sistemáticasistemática e de e de nomenclaturanomenclatura

!! Para Para cada enzima são atribuídos dois nomescada enzima são atribuídos dois nomes –– nome nome alternativoalternativo e e nome sistemáticonome sistemático –– e um e um númeronúmero de de classificaçãoclassificação de de quatro subdivisõesquatro subdivisões

ExemploExemplo::

CarboxipeptidaseCarboxipeptidase A (A (nomenome recomendadorecomendado))

PeptidilPeptidil--LL--aminoácidoaminoácido--hidrolasehidrolase ((nomenome sistemáticosistemático))

EC 3.4.17.1EC 3.4.17.1 (no. de (no. de classificaçãoclassificação), ), sendosendo EC “enzyme EC “enzyme comissioncomission””

Os Os númerosnúmeros representamrepresentam a a classeclasse, , subclassesubclasse, sub, sub--subclassesubclasse, e , e seuseunúmeronúmero de de sériesérie

EspecificidadeEspecificidade dos dos substratossubstratos

!! ComplementaridadeComplementaridade geométricageométrica

!! ComplementaridadeComplementaridade eletrônicaeletrônica

!! MudançasMudanças conformacionais (conformacionais (ajusteajuste induzidoinduzido))

ModeloModelo chavechave--fechadurafechadura dada funçãofunção enzimáticaenzimática


Complementaridade geométrica e eletrônica

Ajuste induzido


PresençaPresença de de cofatorescofatores e e coenzimascoenzimas

!! CofatoresCofatores:: CuCu2+2+, Fe, Fe2+2+, Zn, Zn2+2+

CdCd2+2+ e Hge Hg2+ 2+ -- efeitoefeito tóxicotóxico

Um Um exemploexemplo enzimaenzima--cofatorcofator cataliticamentecataliticamente ativoativo é é chamadochamado de de holoenzimaholoenzima..

A A proteínaproteína enzimaticamenteenzimaticamente inativainativa resultanteresultante dada remoçãoremoçãodo do cofatorcofator dada holoenzimaholoenzima é é chamadachamada de de apoenzimaapoenzima

apoenzimaapoenzima + + cofator cofator ↔↔ holoenzimaholoenzima ((ativaativa))


!! CoenzimasCoenzimas: : NADNAD++ ((nicotinamidanicotinamida adeninaadeninadinucleotídeodinucleotídeo) ) –– associamassociam--se se temporariamentetemporariamente (co(co--substratosubstrato))

Muitas vitaminasMuitas vitaminas sãosão precursorasprecursoras das das coenzimascoenzimas..MuitosMuitos organismosorganismos nãonão conseguemconseguem sintetizarsintetizar certascertasporçõesporções das das coenzimascoenzimas essenciaisessenciais. . TaisTais substânciassubstânciasdevemdevem estarestar presentespresentes nana dietadieta dessesdesses organismosorganismos ––sãosão as as vitaminasvitaminas..

!! GruposGrupos prostéticosprostéticos –– associamassociam--se se permanentementepermanentemente ((ligaçãoligação covalentecovalente))Ex: Ex: grupamentogrupamento hemeheme


EnergiaEnergia de de ativaçãoativação e e coordenadascoordenadas de de reaçãoreação

!! Grande Grande parteparte do do nossonosso conhecimentoconhecimento sobresobre o o modomodocomocomo as as enzimasenzimas catalisamcatalisam reaçõesreações químicasquímicas é é provenienteproveniente dada teoriateoria do do estadoestado de de transiçãotransição –– 19301930

!! ConsiderandoConsiderando umauma reaçãoreação bimolecular bimolecular envolvendoenvolvendo 3 3 átomosátomos::

HHAA––HHBB + H+ HCC "" HHAA + + HHBB––HHCC

HHCC devedeve aproximaraproximar--se se dada molmolééculacula diatdiatôômicamica HHAA--HHBB de de modo modo que exista que exista um um complexo instável complexo instável de de elevada energia elevada energia

representado por representado por HHAA……HHBB

……HHCC


O O pontoponto de de mais alta energiamais alta energia éé chamadochamado de de estadoestadode de transitransiçãçãoo do do sistemasistema..


Os reagentes se aproximam ao longo de uma rota de Os reagentes se aproximam ao longo de uma rota de energia livre mínima energia livre mínima -- as as coordenadas de reaçãocoordenadas de reação desses desses

reagentesreagentes

!! Caso os átomos no sistema reacional sejam de tipos Caso os átomos no sistema reacional sejam de tipos diferentesdiferentes

A + B A + B "" X X "" P + QP + Qem que A e B sem que A e B sãão os reagentes, P e Q so os reagentes, P e Q sãão os produtos e o os produtos e X representa o estado de transiX representa o estado de transiçãçãoo

∆∆G, a energia livre do estado de transiG, a energia livre do estado de transiçãção subtrao subtraíída da da da energia livre dos reagentes energia livre dos reagentes éé a a energia livre de ativaenergia livre de ativaçãçãoo

A concentraA concentraçãção do estado de transio do estado de transiçãção o éé pequena (10pequena (10--1313 a a 1010--1414s)s)


A decomposição do estado de transição em produtos é A decomposição do estado de transição em produtos é postulada como sendo o processo determinante da postulada como sendo o processo determinante da

velocidade da reação totalvelocidade da reação total


!! Quanto maior for o valor de Quanto maior for o valor de ∆∆G, menor será a velocidade G, menor será a velocidade da reaçãoda reação

!! menor será o no. de moléculas de reagentes com menor será o no. de moléculas de reagentes com energia térmica suficiente para alcançar a energia livre energia térmica suficiente para alcançar a energia livre do estado de transiçãodo estado de transição

!! Os Os catalisadores catalisadores atuam reduzindo a energia livre do atuam reduzindo a energia livre do estado de transição da reação catalisada. estado de transição da reação catalisada.

!! A diferença entre os valores de A diferença entre os valores de ∆∆G de uma reação nãoG de uma reação não--catalisada e de uma reação catalisada indica a eficiência catalisada e de uma reação catalisada indica a eficiência do catalisador.do catalisador.


!! Um catalisador Um catalisador reduzreduz a barreira de energia livre na a barreira de energia livre na mesma proporção tanto para a reação direta como para mesma proporção tanto para a reação direta como para a reversa.a reversa.

!! A probabilidade de a reação ocorrer em uma ou outra A probabilidade de a reação ocorrer em uma ou outra direção depende somente da diferença de energia livre direção depende somente da diferença de energia livre entre os reagentes e produtos.entre os reagentes e produtos.

!! Se Se ∆∆GGreaçãoreação < 0, a reação ocorrerá espontaneamente dos < 0, a reação ocorrerá espontaneamente dos reagentes em direção aos produtos; sereagentes em direção aos produtos; se ∆∆GGreaçãoreação > 0, a > 0, a reação reversa ocorrerá de modo espontâneoreação reversa ocorrerá de modo espontâneo


MecanismosMecanismos catalíticoscatalíticos

1.1. catálisecatálise ácidoácido--basebase2.2. catálisecatálise covalentecovalente –– formaçãoformação transitóriatransitória de de

umauma ligaçãoligação covalentecovalente entreentre o o catalisadorcatalisador e o e o substratosubstrato

3.3. CatáliseCatálise porpor íonsíons metálicosmetálicos –– metaloenzimasmetaloenzimas. Os . Os íonsíons metálicosmetálicos participamparticipam de de processosprocessoscatalíticoscatalíticos de de trêstrês maneirasmaneiras::

(a)(a) ligamligam--se se aoao substratosubstrato(b)(b) MediamMediam reaçõesreações de de oxidaçãooxidação--reduçãoredução(c)(c) EstabilizamEstabilizam eletrostaticamenteeletrostaticamente, , ouou protegemprotegem cargascargas

negativasnegativas


4. 4. CatáliseCatálise eletrostáticaeletrostática –– exclusãoexclusão de de umaumamoléculamolécula de de águaágua do do sítiosítio ativoativo quandoquando o o substratosubstrato se se ligaliga. . As As interaçõesinterações eletrostáticaseletrostáticassãosão muitomuito maismais fortes do fortes do queque emem soluçõessoluçõesaquosasaquosas

5. 5. EfeitoEfeito de de proximidadeproximidade e e orientaçãoorientação6. 6. CatáliseCatálise porpor ligaçãoligação preferencialpreferencial do do estadoestado de de

transiçãotransição –– enzimasenzimas tensionamtensionam mecanicamentemecanicamenteseusseus substratossubstratos emem direçãodireção aoao estadoestado de de transiçãotransição pelospelos seusseus sítiossítios de de ligaçãoligação


RNase A – exemplo de reação enzimática mediada pela catálise ácido-básica

CinéticaCinética de de reaçãoreação

!! CinéticaCinética químicaquímica

ReaçãoReação de de estequiometriaestequiometria globalglobal

A A "" PP

ProcessosProcessos molecularesmoleculares simplessimples

A A "" II11 "" II22 "" PP

sendosendo II11 e Ie I22 intermadiintermadiááriosrios dada reareaçãçãoo


!! A A velocidadevelocidade de de umauma reaçãoreação é é proporcionalproporcional à à frequênciafrequência nana qualqual as as moléculasmoléculas reatantesreatantescolidemcolidem..

!! A A constanteconstante de de proporcionalidadeproporcionalidade é a é a constanteconstantede de velocidadevelocidade (k)(k)

!! Para a Para a reaçãoreação A A "" P, a P, a velocidadevelocidade (v) de (v) de formaformaçãçãoo do do produtoproduto éé

V = d[P]/V = d[P]/dtdt = d[A]/= d[A]/dtdt = k[A]= k[A]A A velocidadevelocidade dada reaçãoreação é é proporcionalproporcional à à concentraçãoconcentração do do reatantereatante, , emem qualquerqualquer pontopontono tempo.no tempo.


!! ReaçãoReação de de primeiraprimeira ordemordem –– unimolecularunimolecularA A "" PP

considerandoconsiderando a a reareaçãçãoo2A 2A "" PP

!! ReaReaçãçãoo de de segundasegunda ordemordem –– bimolecularbimolecularSuaSua velocidadevelocidade instantâneainstantânea éé

V = d[A]/V = d[A]/dtdt = k[A]= k[A]22

A A velocidadevelocidade dada reaçãoreação é é proporcionalproporcional aoao quadradoquadradodada concentraçãoconcentração de A, e k tem de A, e k tem unidadesunidades de Mde M--11.s.s--11


ConsiderandoConsiderando a a reação reação

A + B A + B "" PP

!! TambémTambém é é reaçãoreação de de segundasegunda ordemordem, com , com umaumavelocidadevelocidade instantâneainstantânea

V = d[A]/V = d[A]/dtdt = = --d[B]/d[B]/dtdt = k[A][B]= k[A][B]

!! ConsideradaConsiderada de de primeiraprimeira ordemordem emem relaçãorelação a [A] a [A] e de e de primeiraprimeira ordemordem emem relaçãorelação a [B]a [B]


EquaçõesEquações de de velocidadevelocidade

!! DescreveDescreve o o processoprocesso de de umauma reaçãoreação emem funçãofunçãodo tempo e do tempo e podepode ser ser derivadaderivada de de equaçõesequações quequedescrevemdescrevem a a velocidadevelocidade instantâneainstantânea dada reaçãoreação

!! SendoSendo assimassim, a , a equaçãoequação de de velocidadevelocidade de de primeiraprimeira ordemordem é é obtidaobtida a a partirpartir dada equaçãoequação

v = d[P]/v = d[P]/dtdt = = --d[A]/d[A]/dtdt = k[A]= k[A]

RearranjandoRearranjando,,

d[A]/[A] = d d[A]/[A] = d lnln[A] = [A] = --k k dtdt


IntegrandoIntegrando entreentre osos limiteslimites de [A]de [A]00 atéaté [A], a [A], a concentraçãoconcentração no tempo tno tempo t

resultaresulta ememlnln[A] = [A] = lnln[A][A]00 ––ktkt

ouou o o antilogaritmoantilogaritmo de ambos de ambos osos ladoslados dada equaçãoequação

[A] = [A][A] = [A]00 ee--ktkt


∫ ∫−=][

][ 00

]ln[A

A

tdtkAd

!! A A reaçãoreação de de primeiraprimeira ordemordem resultaresulta ememumauma linhalinha cujacuja inclinaçãoinclinação seráserá ––kk


CaracterísticaCaracterística dada reaçãoreação de de primeiraprimeira ordemordem

!! O tempo O tempo parapara a a decomposiçãodecomposição de de metademetade do do reatantereatante inicialmenteinicialmente presentepresente ((meiomeio tempo) ttempo) t1/21/2

é é umauma constanteconstante e e independeindepende dada concentraçãoconcentraçãoinicialinicial do do reatantereatante

!! SubstituindoSubstituindo, [A] = [A], [A] = [A]00/2, /2, quandoquando t=tt=t1/21/2

lnln ([A]([A]00/2/[A]/2/[A]00) = kt) = kt1/21/2

tt1/21/2 = = lnln 2/k = 0,69/k2/k = 0,69/k


Para Para umauma reaçãoreação de de segundasegunda ordemordem com um com um únicoúnicotipotipo de de reatantereatante, 2A , 2A "" PP

A A variaçãovariação dada [A] com o tempo é [A] com o tempo é diferentediferente dada anterior.anterior.se v = d[A]/se v = d[A]/dtdt = k[A]= k[A]22

EntãoEntão, ,

de de maneiramaneira queque 1/[A] = 1/[A]1/[A] = 1/[A]00 + + ktkté é umauma equaçãoequação linear linear emem termostermos de 1/[A] e t.de 1/[A] e t.

O O meiomeio tempo é tempo é expressoexpresso porpor tt1/21/2 = 1/k[A]= 1/k[A]00

E E dependedepende dada concentraçãoconcentração inicialinicial do do reatantereatante


∫ ∫−=−][

][ 020 ][

][A

A

tdtk

AAd

Para Para determinardeterminar a a constanteconstante de de velocidadevelocidade parapara a a reaçãoreação A + B A + B "" PP, , éé maismais ffáácilcil aumentaraumentar a a concentraconcentraçãçãoo de um de um reatantereatante emem relarelaçãção ao outroo ao outroquandoquando [B] >> [A],[B] >> [A], a [B] a [B] nnããoo éé significantementesignificantementealteradaalterada durantedurante a a reareaçãçãoo

A A velocidadevelocidade dada reareaçãçãoo dependedepende de [A],de [A], queque éélimitantelimitante

AssimAssim, a , a reareaçãçãoo pareceparece ser de ser de primeiraprimeira ordemordem ememrelarelaçãçãoo a [A] a [A] ((reareaçãçãoo de pseudo de pseudo primeiraprimeira ordemordem))


CinéticaCinética enzimáticaenzimática!! As As enzimasenzimas catalisamcatalisam umauma enormeenorme variedadevariedade de de reaçõesreações

usandousando difierentesdifierentes combinaçõescombinações dos dos seisseis mecanismosmecanismoscatalíticoscatalíticos básicosbásicos::

1.1. CatáliseCatálise ácidoácido--básicabásica

2.2. CatáliseCatálise covalentecovalente

3.3. CatáliseCatálise porpor íonsíons metálicosmetálicos

4.4. CatáliseCatálise eletrostáticaeletrostática

5.5. CatáliseCatálise porpor meiomeio de de efeitosefeitos de de proximidadeproximidade e e orientaçãoorientação

6.6. CatáliseCatálise porpor ligaçãoligação preferencialpreferencial do do estadoestado de de transiçãotransição


!! AlgumasAlgumas enzimasenzimas atuamatuam somentesomente emem umauma únicaúnicamoléculamolécula de de substratosubstrato

!! OutrasOutras atuamatuam emem duasduas ouou maismais moléculasmoléculasdiferentesdiferentes, , cujacuja ordemordem de de ligaçãoligação podepode ouou nãonão ser ser obrigatóriaobrigatória

!! O O inícioinício dos dos estudosestudos sobresobre cinéticacinética enzimáticaenzimática foifoiemem 1902, 1902, porpor Adrian BrownAdrian Brown

!! EleEle investigouinvestigou as as velocidadesvelocidades de de hidrólisehidrólise dadasacarosesacarose pelapela enzimaenzima ββ--frutofuranosidasefrutofuranosidase de de levedurasleveduras..

SACAROSE + HSACAROSE + H22O O "" GLICOSE + FRUTOSEGLICOSE + FRUTOSE


QuandoQuando [[sacarosesacarose] >> [] >> [enzimaenzima], a ], a velocidadevelocidade de de reaçãoreação tornatorna--se se independenteindependente dada concentraçãoconcentração

!! Adrian Brown Adrian Brown propôspropôs entãoentão queque a a reaçãoreação global é global é compostacompostaporpor duasduas reaçõesreações elementareselementares, , nasnas quaisquais o o substratosubstrato forma forma um um complexocomplexo com a com a enzimaenzima, , queque se se decompõedecompõe emem produtoprodutoe e enzimaenzima

k1 k2k1 k2E + S E + S ↔ ↔ ES ES "" P + EP + E

KK--11

!! QuandoQuando a a concentraçãoconcentração de de substratosubstrato for for altaalta o o suficientesuficienteparapara converter converter completamentecompletamente a a enzimaenzima nana suasua forma ES, a forma ES, a segundasegunda etapaetapa dada reaçãoreação tornatorna--se se limitantelimitante dada velocidadevelocidade..

!! A A velocidadevelocidade dada reaçãoreação global global nãonão iráirá variarvariar com o com o aumentoaumento[S][S]

CadaCada reaçãoreação elementarelementar descritadescrita é é caracterizadacaracterizada porpor umauma constanteconstante de de velocidadevelocidade: k: k11 e ke k--11 parapara a a reaçãoreação diretadireta e e reversareversa dada formaçãoformação do do complexocomplexo ESES

!! KK22 parapara a a decomposiçãodecomposição de ES de ES emem P, a P, a segundasegundareaçãoreação

!! A A segundasegunda reaçãoreação é é irreversívelirreversível


KK--11


A A equaçãoequação de de MichaelisMichaelis--MentenMenten

!! EmEm um um esquemaesquema cinéticocinético complexocomplexo, a , a velocidadevelocidadede de formaçãoformação de de produtosprodutos podepode ser ser expressaexpressa comocomoo o resultadoresultado dada multiplicaçãomultiplicação dada constanteconstante de de velocidadevelocidade dada reaçãoreação aoao formarformar produtosprodutos e a e a concentraçãoconcentração do do seuseu intermediáriointermediário imediatamenteimediatamenteanterior.anterior.

!! A A expressãoexpressão geralgeral parapara a a velocidadevelocidade dada reaçãoreação


KK--11

É É portantoportanto,,v = d[P] / v = d[P] / dtdt = k= k2 2 [ES][ES]

VelocidadeVelocidade global global dada produçãoprodução de ESde ES

!! DiferençaDiferença entreentre as as velocidadesvelocidades das das reaçõesreações elementareselementares queque levamlevam à à suasuaformaçãoformação e das e das queque resultamresultam no no seuseuconsumoconsumo::

d[ES] / d[ES] / dtdt = k= k11 [E][S] [E][S] –– kk--11 [ES] [ES] –– kk22 [ES][ES]

!! EssaEssa equaçãoequação nãonão podepode ser ser integradaintegrada semsemconsideraçõesconsiderações queque a a simplifiquemsimplifiquem..


1. 1. ConsideraçãoConsideração de de queque a a reaçãoreação estáestá emem equilíbrioequilíbrio

1913 1913 –– LeonorLeonor MichaelisMichaelis e Maud e Maud MentenMenten supuseramsupuseramqueque kk11 >> k>> k22, de , de maneiramaneira queque a a primeiraprimeira etapaetapadada reaçãoreação alcancealcance o o equilíbrioequilíbrio

KKss = k= k--11/k/k11 = [S][E] / [ES]= [S][E] / [ES]

ondeonde KKss é a é a constanteconstante de de dissociaçãodissociação dada primeiraprimeiraetapaetapa dada reaçãoreação

O O complexocomplexo enzimaenzima--substratosubstrato ESES é é conhecido comoconhecido comoo o complexocomplexo de de MichaelisMichaelis


2. 2. PostuladoPostulado dada reaçãoreação no no estadoestado estacionárioestacionário, , tendotendoassimassim um valor um valor constanteconstante

d[ES] / d[ES] / dtdt = 0= 0

As As quantidadesquantidades [ES] e [E] [ES] e [E] nãonão sãosão diretamentediretamente mensuráveismensuráveis, , com com exceçãoexceção dada concentraçãoconcentração dada enzimaenzima,,

[E][E]TT = [E] + [ES]= [E] + [ES]

QueQue podepode ser ser facilmentefacilmente determinadadeterminada

A A equaçãoequação de de velocidadevelocidade podepode entãoentão ser ser derivadaderivada


A A equaçãoequação d[ES] / d[ES] / dtdt = k= k11 [S][E] [S][E] –– kk--11 [ES] [ES] –– kk22 [ES] é [ES] é combinadacombinada com com d[ES] / d[ES] / dtdt = 0= 0


ProduzindoProduzindo::

KK11 [E][S] = [E][S] = kk--11[ES] + [ES] + kk22[ES][ES]

se [E] = [E]se [E] = [E]TT –– [ES], [ES], rearranjandorearranjando,,

([E]([E]TT –– [ES]) [S][ES]) [S] / [ES] = / [ES] = kk--11 + k+ k22 / k/ k11

A A constanteconstante de de MichaelisMichaelis (K(KMM) é ) é definidadefinida comocomo

KKMM = k= k--11 + k+ k22 / k/ k11

EntãoEntão,,KKMM [ES] = [ES] = ([E]([E]TT –– [ES]) [S][ES]) [S]


ResolvendoResolvendo parapara [ES],[ES],

[ES] = [E][ES] = [E]TT [S] / K[S] / KMM + [S]+ [S]

A A expressãoexpressão parapara a a velocidadevelocidade inicialinicial (v(v00) ) dada reaçãoreação, , a a velocidadevelocidade

v = d[P] / v = d[P] / dtdt = k= k22 [ES] [ES] emem t=0t=0

tornatorna--sese

vv00 = (d[P] / = (d[P] / dtdt))t=0t=0 = k= k22 [ES][ES] = k= k22 [E][E]TT[S] / K[S] / KMM + [S]+ [S]

[E][E]TT e [S] e [S] sãosão quantidadesquantidades mensuráveismensuráveis..


!! O O usouso dada velocidadevelocidade inicialinicial minimizaminimiza fatoresfatorescomplicadorescomplicadores comocomo osos efeitosefeitos de de reaçõesreaçõesreversíveisreversíveis, e a , e a inativaçãoinativação progressivaprogressiva dada enzimaenzima

!! A A velocidadevelocidade máximamáxima, , VVmáxmáx ocorreocorre a a elevadaselevadasconcentraçõesconcentrações de de substratosubstrato, , nana qualqual a a enzimaenzimaestáestá saturadasaturada, , ouou sejaseja, , inteiramenteinteiramente nana forma forma ESES

VVmáxmáx = k= k22 [E][E]TT


CombinandoCombinando as as equaçõesequações,,

vv00 = d[P] / = d[P] / dtdt = k= k22 [ES] e [ES] e VVmáxmáx = = kk22 [E][E]TT

e e

vv00 = k= k22 [ES] = [ES] = kk22 [E][E]TT[S] / K[S] / KMM + [S],+ [S],

obtemobtem--sese

vv00 = = VVmáxmáx [S] / K[S] / KMM + [S]+ [S]

EssaEssa expressãoexpressão ((eqeq. de . de MichaelisMichaelis--MentenMenten) é a ) é a equaçãoequação básicabásica dada cinéticacinética enzímáticaenzímática

ElaEla descrevedescreve umauma hipérbolehipérbole retangularretangular


! A ! A funçãofunção de de saturaçãosaturação parapara a a ligaçãoligação de Ode O22 à à mioglobinamioglobina tem a tem a mesmamesma forma forma algébricaalgébrica


SignificânciaSignificância dada constanteconstante de de MichaelisMichaelis

!! KKMM –– definiçãodefinição operacionaloperacional simplessimples

quandoquando [S] = K[S] = KMM,,

a a equaçãoequação vv00 = = VVmáxmáx [S] / K[S] / KMM + [S]+ [S]

tornatorna--sese vv00 = = VVmáxmáx / 2/ 2

De De modomodo queque::

KKMM é a é a concentraçãoconcentração de de substratosubstrato nana qualqual a a velocidadevelocidade dada reaçãoreação correspondecorresponde à à metademetade dadavelocidadevelocidade máximamáxima


Se a Se a enzimaenzima tivertiver valor valor pequenopequeno de Kde KMM, , elaela atingiráatingiráa a máximamáxima eficiênciaeficiência catalíticacatalítica emem baixasbaixas [S][S]

!! KKMM é é únicoúnico parapara cadacada enzimaenzima--substratosubstrato

!! A magnitude do KA magnitude do KMM variavaria bastantebastante com a com a identidadeidentidade dada enzimaenzima e a e a naturezanatureza do do substratosubstrato

!! É É tambémtambém umauma funçãofunção dada temperaturatemperatura e do pH.e do pH.


EnzimaEnzimaEnzimaEnzima SubstratoSubstratoSubstratoSubstrato KKKKm m m m (mM)(mM)(mM)(mM)

Catalase H2O2 25

Hoxoquinase GlicoseFrutose

0,151,5

Quimiotripsina N-benzoltirosinamidaN-formiltirosinamidaN-acetiltirosianamidaGliciltirosinamida

2,512,0

32122

Anidrase carbônica HCO3- 9,0

Glutamato desidrogenase Glutamatoα-cetoglutaratoNH4

+

NADoxNADred

0,122,057

0,0250,018

Aspartato amininotransferase

Aspartatoα-cetoglutaratoOxalacetatoGlutamato

0,90,1

0,044,0

KKcatcat / K/ KMM é é umauma medidamedida dada eficiênciaeficiênciacatalíticacatalítica

!! KKcatcat ((constanteconstante catalíticacatalítica) de ) de umauma enzimaenzima podepodeser ser definidadefinida comocomo::

KKcatcat = = VVmáxmáx / [E]/ [E]TT

NúmeroNúmero de de reciclagemreciclagem de de umauma enzima enzima ""representarepresenta o o no. de no. de processosprocessos reacionaisreacionais quequecadacada ssíítiotio ativoativo catalisacatalisa porpor unidadeunidade de tempo.de tempo.

PelaPela eqeq. . VVmáxmáx = k= k22 [E][E]TT

um um sistemasistema simples simples comocomo o o modelomodelo de de reaçãoreação de de MichaelisMichaelis--MentenMenten, , kkcatcat = k= k22

!! QuandoQuando [S] << K[S] << KMM, , poucopouco ES é ES é formadoformado..ConsequentementeConsequentemente,,

[E] ~ [E][E] ~ [E]TT

entãoentão, se, se vv00 = k= k22 [E][E]T T [S] / K[S] / KMM + [S] ,+ [S] ,A A eqeq. se . se reduzreduz aa

vv00 ~ (k~ (k22 / K/ KMM) [E]) [E]T T [S] ~ ([S] ~ (kkcatcat [E][S] / K[E][S] / KMM))

HáHá um um limitelimite máximomáximo parapara o valor de o valor de kkcatcat / K/ KMM

EleEle nãonão podepode ser ser maiormaior do do queque kk11

A A decomposiçãodecomposição de de ESES emem E + PE + P nãonão podepode ocorrerocorrermaismais frequentementefrequentemente do do queque o o encontroencontro de de EE e e SS parapara formarformar ESES

EnzimasEnzimas maismais eficienteseficientes tem tem valoresvalores de de kkcatcat /K/KMM próximospróximos aoao limitelimite parapara reaçõesreaçõescontroladascontroladas porpor difusãodifusão de 10de 1088 a 10a 1099 MM--11ss--11

!! EstasEstas enzimasenzimas catalisamcatalisam umauma reaçãoreaçãoquasequase todastodas as as vezesvezes queque encontramencontram umaumamoléculamolécula de de substratosubstrato

AtingemAtingem um um estadoestado de de perfeiçãoperfeição catalíticacatalítica


AnáliseAnálise dos dados dos dados cinéticoscinéticos

!! HáHá váriosvários métodosmétodos parapara determinardeterminar osos valoresvalores dos dos parâmetrosparâmetros dada eqeq. de . de MichaelisMichaelis--MentenMenten ((VVmáxmáx e Ke KMM))

!! Para Para valoresvalores elevadoselevados de [S], a de [S], a velocidadevelocidade inicialinicial vv00

aproximaaproxima--se de se de VVmáxmáx

!! É É muitomuito difícildifícil determinardeterminar VVmáxmáx com com precisãoprecisão a a partirpartir do do gráficográfico de vde v00 versus [S]. O valor de versus [S]. O valor de VVmáxmáx é é subestimadosubestimado

!! Um Um métodométodo maismais adequadoadequado foifoi formuladoformulado porpor Hans Hans LineweaverLineweaver e Dean Burk e Dean Burk "" usamusam o o inversoinverso dada eqeq. de . de MMMM


!! A A eqeq. de . de MichaelisMichaelis--MentenMenten

vv00 = = VVmáxmáx [S] / K[S] / KMM + [S]+ [S]

!! a a eqeq. de . de LineweaverLineweaver--BurkBurk

1 / v1 / v00 = (K= (KMM / / VVmáxmáx) 1 / [S] + 1 / ) 1 / [S] + 1 / VVmáxmáx

é é umauma eqeq. linear . linear nana forma de 1/ vforma de 1/ v00 e 1 / [S]e 1 / [S]NecessitaNecessita--se se trabalhartrabalhar com com umauma faixafaixa de [S] de [S] entreentre

~0,5 K~0,5 KMM atéaté ~5 K~5 KMM

DesvantagemDesvantagem: : PontosPontos comprimidoscomprimidos à à esquerdaesquerda do do gráficográfico


Valores pequenosValores pequenos de [S] de [S] "" pequenos erros empequenos erros em vv00, , e e grandes erros emgrandes erros em 1 / v1 / v00 "" desviosdesvios de Kde KMM e e VVmmááxx

A A cinéticacinética emem estadoestado estacionárioestacionário nãonão podepodeestabelecerestabelecer um um mecanismomecanismo de de reaçãoreação semsem

ambiguidadeambiguidade!! EstaEsta cinéticacinética fornecefornece informaçõesinformações sobresobre as as

velocidadesvelocidades de de formaçãoformação e e decomposiçãodecomposição de ESde ES!! MasMas nãonão esclareceesclarece sobresobre a a naturezanatureza de ESde ES!! A A reaçãoreação podepode ocorrerocorrer porpor meiomeio de de váriosvários estadosestados

intermediáriosintermediários

E + S E + S ↔ ↔ ES ES ↔ ↔ EX EX ↔ ↔ EP EP ↔ ↔ E + PE + P

ououE + S E + S ↔ ↔ ES ES ↔ ↔ EX EX ouou EY EY ↔ ↔ EP EP ↔ ↔ E + PE + P

““caixacaixa pretapreta!”!”

ReaçõesReações bissubstratobissubstrato

!! ReaçõesReações enzimáticasenzimáticas queque requeremrequerem múltiplosmúltiplossubstratossubstratos e e formamformam múltiplosmúltiplos produtosprodutos

!! ReaçõesReações do do tipotipoE E

A + B A + B ↔ ↔ P + QP + Q

sãosão responsáveisresponsáveis porpor ~60% das ~60% das reaçõesreações bioquímicasbioquímicasconhecidasconhecidas..

ReaçõesReações de de transferasetransferaseEE

P P -- XX + B + B ↔ ↔ P + B P + B -- XXLaboratórioLaboratório de de SistemasSistemas BioMolecularesBioMoleculares. . DepartamentoDepartamento de de FísicaFísica. . CâmpusCâmpus Rio Rio PretoPreto..

www.www.biocristalografiabiocristalografia..dfdf..ibilceibilce..unespunesp..brbr

ReaçõesReações sequenciaissequenciais

!! MecanismoMecanismo ordenadoordenado!! MecanismoMecanismo aleatórioaleatório

!! ReaçõesReações de de pinguepingue--ponguepongueReaçõesReações de de transferênciatransferência de de gruposgrupos, , nasnas quaisquaisum um ouou maismais produtosprodutos sãosão liberadosliberados antes antes quequetodostodos osos substratossubstratos tenhamtenham sidosido adicionadosadicionados

InibiçãoInibição enzimáticaenzimática

!! MuitasMuitas substânciassubstâncias alteramalteram a a atividadeatividade de de umaumaenzimaenzima associandoassociando--se se reversivelmentereversivelmente a a elaela, , influenciandoinfluenciando a a ligaçãoligação do do substratosubstrato e/e/ouou seuseuno. de no. de reciclagemreciclagem..

!! As As substânciassubstâncias queque reduzemreduzem a a atividadeatividade de de umaumaenzimaenzima sãosão conhecidasconhecidas comocomo inibidoresinibidores

!! Grande Grande parteparte do arsenal do arsenal farmacêuticofarmacêutico modernomodernoé é constituídoconstituído porpor inibidoresinibidores enzimáticosenzimáticos


Os Os inibidoresinibidores atuamatuam atravésatravés de de umauma variedadevariedade de de mecanismosmecanismos

!! AlgunsAlguns sãosão substânciassubstâncias queque se se assemelhamassemelhamestruturalmenteestruturalmente aosaos substratossubstratos dada enzimaenzima, , masmasnãonão reagemreagem, , ouou reagemreagem muitomuito lentamentelentamente

!! EstasEstas substânciassubstâncias sãosão usadasusadas parapara investigarinvestigar a a naturezanatureza químicaquímica ouou conformacional do conformacional do sítiosítioativoativo dada enzimaenzima parapara tentartentar elucidarelucidar seuseumecanismomecanismo catalíticocatalítico

!! OutrosOutros inibidoresinibidores afetamafetam a a atividadeatividade catalíticacatalíticasemsem interferirinterferir nana ligaçãoligação do do substratosubstrato

!! MuitosMuitos realizamrealizam ambos ambos osos processosprocessos


InibiçãoInibição competitivacompetitiva

!! UmaUma substânciasubstância queque compete compete diretamentediretamentecom o com o substratosubstrato normal normal pelopelo sítiosítio de de ligaçãoligação de de umauma enzimaenzima é um é um inibidorinibidorcompetitivocompetitivo

!! EsseEsse inibidorinibidor é é semelhantesemelhante aoao substratosubstrato, , masmas diferedifere--se dele se dele porpor nãonão poderpoder reagirreagircomocomo eleele


!! O O modelo geral paramodelo geral para a a inibição competitivainibição competitiva é é dado dado pelo esquemapelo esquema de de reação reação

KK11 KK22

E + S E + S ↔↔ ES ES "" P + EP + E++ K K --11

II↓↑↓↑ KKII

EI + S EI + S "" NNÃÃO HO HÁÁ REAREAÇÃÇÃOO

NesteNeste casocaso, presume, presume--se se queque I (I (inibidorinibidor) ) ligaliga--se se reversivelmentereversivelmente à à enzimaenzima e e estáestá emem equilíbrioequilíbrio com com

elaela

KKII = [E][I] / [EI]= [E][I] / [EI]

e EI (e EI (complexocomplexo enzimaenzima--inibidorinibidor) é ) é cataliticamentecataliticamenteinativoinativo

Um Um inibidorinibidor competitivocompetitivo reduzreduz a a concentraçãoconcentração de de enzimaenzima livrelivre disponíveldisponível parapara a a ligaçãoligação do do substratosubstrato


A A eqeq. de MM . de MM parapara umauma reaçãoreação inibidainibida competitivamentecompetitivamentetem um tem um termotermo adicionaladicional queque se se refererefere à à fraçãofração de [E]de [E]TT quequeligaliga a I a I parapara formarformar EI([E]EI([E]TT + [ES] + [EI])+ [ES] + [EI])

vv00 = = VVmáxmáx [S] / [S] / ααKKMM + [S]+ [S]

É a É a eqeq. de MM . de MM modificadamodificada porpor um um fatorfator αα, , definidodefinido comocomoαα = 1 + [I] / k= 1 + [I] / k11

a é a é umauma funçãofunção dada concentraçãoconcentração do do inibidorinibidor e e suasuaafinidadeafinidade pelapela enzimaenzima, , nãonão podepode ser ser menormenor do do queque 1.1.

UmaUma concentraçãoconcentração de de substratosubstrato infinitamente grandeinfinitamente grande podepodesobrepujarsobrepujar osos efeitosefeitos do do inibidorinibidor


A A presençapresença de I de I fazfaz com com queque a [S] a [S] pareça mais pareça mais diluídadiluída do do que realmenteque realmente é.é.


KI KI podepode ser ser medidomedido!! O O rearranjorearranjo dada eqeq. v. v00 = = VVmáxmáx [S] / [S] / ααKKMM + [S]+ [S]

nana forma dos forma dos duplosduplos recíprocosrecíprocos resultaresulta emem1/v1/v00 = (= (ααKKMM / / VVmáxmáx) 1 / [S] + 1 / ) 1 / [S] + 1 / VVmáxmáx

O gráfico O gráfico desta equação desta equação é linear e tem é linear e tem uma uma inclinação de inclinação de ααKKMM / / VVmáxmáx

O KO KII pode ser calculado pela determinação de valores de pode ser calculado pela determinação de valores de ααem diferentes concentrações de inibidor para uma enzima em diferentes concentrações de inibidor para uma enzima

de Kde KMM conhecidoconhecido

!! A comparação dos valores de KA comparação dos valores de KII de inibidores competitivos de inibidores competitivos com diferentes estruturas pode fornecer informações sobre com diferentes estruturas pode fornecer informações sobre as propriedades de ligação do sítio ativo de uma enzima e as propriedades de ligação do sítio ativo de uma enzima e do seu mecanismo catalítico.do seu mecanismo catalítico.

!! Os estudos de inibição competitiva também são utilizados Os estudos de inibição competitiva também são utilizados para determinar a afinidade de análogos do estado de para determinar a afinidade de análogos do estado de transição pelo sítio ativo de uma enzimatransição pelo sítio ativo de uma enzima

!! O estudo de inibidores é o carroO estudo de inibidores é o carro--chefe do desenvolvimento chefe do desenvolvimento de drogasde drogas


Inibição nãoInibição não--competitivacompetitiva

!! O inibidor ligaO inibidor liga--se diretamente ao complexo enzimase diretamente ao complexo enzima--substrato, mas não à enzima livresubstrato, mas não à enzima livre

KK11 KK22

E + S E + S ↔↔ ES ES "" P + EP + EK K ––1 1 ++

II↓↑↓↑ K´KÍI

ESI ESI "" NNÃÃO HO HÁÁ REAREAÇÃÇÃOO

Neste caso, a etapa de ligação do inibidor tem a constante Neste caso, a etapa de ligação do inibidor tem a constante de dissociaçãode dissociação

K´KÍ I = [ES][I] / [ESI]= [ES][I] / [ESI]


O inibidor nãoO inibidor não--competitivo não se assemelha ao substrato. competitivo não se assemelha ao substrato. Ele provavelmente distorce o sítio ativo, fazendo com que a Ele provavelmente distorce o sítio ativo, fazendo com que a

enzima seja enzima seja cataliticamente cataliticamente inativa.inativa.

O gráfico consiste em linhas paralelas com inclinação de O gráfico consiste em linhas paralelas com inclinação de KKMM / / VVmáxmáx. Tanto K. Tanto KMM como como VVmáx máx são menoressão menores

O inibidor afeta a função catalítica da enzima, mas O inibidor afeta a função catalítica da enzima, mas não sua ligação pelo substrato.não sua ligação pelo substrato.

Portanto, só é significativa em enzimas com Portanto, só é significativa em enzimas com múltiplos substratosmúltiplos substratos


Inibição MistaInibição Mista

Se tanto a enzima como o complexo enzimaSe tanto a enzima como o complexo enzima--substrato substrato ligarem o inibidor,ligarem o inibidor,

KK11 KK22

E + S E + S ↔↔ ES ES "" P + EP + E++ K K ––1 1 ++II II

↓↑↓↑ KKII ↓↑↓↑ K´KÍI

EIEI ESI ESI "" NNÃÃO HO HÁÁ REAREAÇÃÇÃOO


Este inibidor ligaEste inibidor liga--se aos sítios enzimáticos que se aos sítios enzimáticos que participam tanto da ligação do substrato, como da participam tanto da ligação do substrato, como da

catálisecatálise

!! As constantes de dissociaçãoAs constantes de dissociação

KKII = [E][I] / [EI] e K´= [E][I] / [EI] e KÍI = [ES][I] / [ESI]= [ES][I] / [ESI]

não são necessariamente equivalentesnão são necessariamente equivalentesOs valores de KOs valores de KMM e e VVmáxmáx são modulados pela presença do são modulados pela presença do

inibidor.inibidor.

Tem características de ambos inibidores, competitivos e Tem características de ambos inibidores, competitivos e nãonão--competitivoscompetitivos


No gráfico, as linhas para diferentes valores de [I] cruzamNo gráfico, as linhas para diferentes valores de [I] cruzam--se à esquerda do eixo 1/vse à esquerda do eixo 1/v00..

Quando kQuando kII=k´=kÍI((αα==αα´), a ´), a interseção é no interseção é no eixo 1/[S]eixo 1/[S]


A inibição mista é uma característica importante na cinética A inibição mista é uma característica importante na cinética de enzimas de enzimas multissubstratosmultissubstratos

!! A inativação irreversível assemelhaA inativação irreversível assemelha--se à inibição se à inibição não competitiva.não competitiva.

!! O inibidor será um O inibidor será um inativadorinativador!! Os Os inativadores inativadores reduzem o nível efetivo da [E]reduzem o nível efetivo da [E]TT

e portanto e portanto VVmáxmáx para todos os valores de [S] para todos os valores de [S] sem alterar Ksem alterar KMM


RegulaçãoRegulação dada atividadeatividade enzimáticaenzimática

!! Um Um organismoorganismo devedeve poderpoder regular as regular as atividadesatividades catalíticascatalíticas das das suassuas enzimasenzimas, a , a fimfim de de coordenarcoordenar seusseus processosprocessosmetabólicosmetabólicos, responder , responder àsàs mudançasmudanças do do meiomeio, , crescercrescer e e diferenciardiferenciar--sese


FormasFormas de de regulaçãoregulação dada atividadeatividadeenzimáticaenzimática

1. 1. ControleControle dada disponibilidadedisponibilidade dada enzimaenzima!! VelocidadeVelocidade de de síntesesíntese e e degradaçãodegradação

2. 2. ControleControle dada atividadeatividade dada enzimaenzima!! AlteraçõesAlterações estruturaisestruturais influenciaminfluenciam nana afinidadeafinidade dada

ligaçãoligação do do substratosubstrato!! LigaçãoLigação de de pequenaspequenas moléculasmoléculas –– efeitosefeitos alostéricosalostéricos

EnzimasEnzimas alostéricas alostéricas sãosão amplamenteamplamente distribuídasdistribuídas nananaturezanatureza e e tendemtendem a a ocuparocupar posiçõesposições chaveschaves nanaregulaçãoregulação nasnas rotasrotas metabólicasmetabólicasSãoSão proteínasproteínas simétricassimétricas queque contémcontém subunidadessubunidades

!! Fosforilação Fosforilação ouou desfosforilaçãodesfosforilação de de resíduosresíduos específicosespecíficos

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