UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO

AVALIAÇÃO COMPARATIVA DO NÚMERO DE MASTÓCITOS NA

MUSCULAR CIRCULAR DO ESÔFAGO E DO CÓLON DE

CHAGÁSICOS CRÔNICOS COM E SEM MEGA

SIMONE WANDERLEY PINHEIRO

Uberaba, MG, 2006

SIMONE WANDERLEY PINHEIRO

AVALIAÇÃO COMPARATIVA DO NÚMERO DE MASTÓCITOS NA

MUSCULAR CIRCULAR DO ESÔFAGO E DO CÓLON DE

CHAGÁSICOS CRÔNICOS COM E SEM MEGA

Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Patologia, área de concentração: Patologia Geral, da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, como requisito parcial para obtenção do Título de Doutora.

ORIENTADORA: Profa. Sheila Jorge Adad

Dezembro, 2006

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INTRODUÇÃO E LITERATURA

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A doença de Chagas é causada pelo protozoário flagelado, Trypanosoma cruzi,

prevalente na América do Sul, tendo como uma de suas lesões básicas a resposta

inflamatória (CHAGAS, 1909, 1916; CHAPADEIRO, 1967; PRATA, 1994; EKSI et al.,

1996; KIRCHHOFF, 1996; LOPES et al., 2000; PRATA, 2001; ENGMAN, LEON, 2002).

A fase aguda da doença ocorre na infância (CHAGAS, 1909) ou pode ser inaparente e, na

fase crônica, cardiopatia, megaesôfago e/ou megacólon podem aparecer 30 a 40 anos mais

tarde como manifestações da fase crônica da doença (CHAGAS, 1916).

Para AMORIM, MARIN-NETO (1995) a função patogenética da destruição dos

nervos intrínsecos do coração decorrente da doença é controversa, enquanto para

KÖBERLE (1968) e REZENDE, RASSI (1983) o envolvimento do sistema nervoso

entérico parece ser essencial na patogênese das desordens gastrointestinais. KÖBERLE

(1968a, 1968b) e KÖBERLE et al (1983) descrevem como fator imprescindível e

determinante para o aparecimento das manifestações digestivas na doença de Chagas a

redução quantitativa dos neurônios dos componentes parassimpático do sistema nervoso

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autônomo intramural (teoria parassimpaticopriva). Os plexos intramurais por estarem

localizados na parede das vísceras, são as estruturas mais atingidas, em virtude do

parasitismo das camadas musculares vizinhas (KÖBERLE, 1968a, 1968b; ADAD, 1996;

REZENDE, MOREIRA, 2000). Aparentemente todas as vísceras ocas podem ser afetadas

pelo processo de denervação (KÖBERLE, 1957), envolvendo os plexos submucoso e

mientérico (KÖBERLE, 1968a, b; ADAD 1989, 1996; ADAD et al. 1991, 1992, 1997a,

1997b, 2001).

TAFURI, MARIA e LOPES (1971) descrevem que a maioria dos autores

brasileiros admite que, à exceção de raros casos de doenças congênitas, o megaesôfago e o

megacólon são de etiologia chagásica e que as lesões do plexo mientérico constituem o

substrato da alteração da motilidade ou, mais precisamente, dos reflexos peristálticos

intrínsecos e extrínsecos, especialmente do esôfago e do cólon. As anormalidades

encontradas no sistema nervoso entérico são degenerações e redução no número de

neurônios intrínsecos (KÖBERLE, NADOR,1955; ADAD, 1989, 1996; ADAD et al.,

1991, 2001) .

Segundo KÖBERLE (1958, 1961); BETARELLO, PINOTTI, HABR-GAMA

(1983) o principal fator patogenético, senão exclusivo da esofagopatia chagásica, é a

denervação; todavia, há dados na literatura que parecem questionar esse ponto de vista,

pois esôfagos de calibre normal podem não apresentar um único neurônio (ANDRADE,

ANDRADE, 1979; ADAD et al., 1992). Entretanto, existem freqüentes alterações na

camada muscular, tais como miosite e fibrose, tanto no esôfago (TAFURI, RASO, 1983;

ADAD, 1989; ADAD et al., 1991) quanto no cólon (TAFURI, RASO, 1983; ADAD,

1996; PINHEIRO, 2000; PINHEIRO et al., 2003), que poderiam contribuir para a

patogênese dos megas chagásicos.

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A fase crônica da doença de Chagas caracteriza-se por alterações da secreção,

motilidade, absorção e nos casos mais grave pelos megas (TAFURI, 1987; REZENDE,

1979; REZENDE, LUQUETTI 1994; LOPES et al., 2000). Estes, relativamente freqüentes

no Brasil e em alguns da América Latina, constituem a única manifestação digestiva dessa

doença passível de diagnóstico anatomopatológico (LOPES et al., 2000).

Observa-se no tubo digestório, desde o esôfago até o reto, quatro camadas distintas:

mucosa, submucosa, muscular própria e serosa ou adventícia. As principais diferenças

entre os segmentos estão na mucosa, que apresenta epitélios de revestimento adequados às

funções (BAILEY, 1973; STERNBERG, 1997). A submucosa exibe variações ao longo do

trato gastrintestinal, especialmente quanto à presença de glândulas. A muscular externa ou

própria é composta por duas camadas: uma circular (interna) e outra longitudinal (externa)

(BAILEY, 1973; FURNESS, COSTA, 1980; GABELLA, 1990; STERNBERG, 1997).

ADAD (1989, 1996) e ETCHEBEHERE (2001) analisaram os gânglios do esôfago

e do cólon e concluiram que os gânglios do esôfago são vascularizados e, os do cólon,

avasculares, o que pode ter importância na patogênese das esofagopatias e colopatias que

cursam com ganglionite e denervação, como a doença de Chagas e a acalásia idiopática.

Ganglionite é freqüente no esôfago mesmo em não chagásicos, sem qualquer doença

manifesta no tubo digestório.

À macroscopia, o esôfago dos pacientes com a doença de Chagas, pode apresentar

diâmetro aumentado proporcionalmente ao grau evolutivo da afecção (REZENDE,

MOREIRA, 2000). O órgão mostra graus variados de dilatação, espessamento em virtude

da acentuada hipertrofia da túnica muscular (ADAD, 1989,1996) especialmente da camada

circular, que se torna mais espessa que a camada longitudinal (KOBERLE, 1960), a ponto

de alguns considerarem que há mesmo um componente de hiperplasia (PEREIRA,

GONÇALVES, 1958). Há espessamento também, por vezes considerável, da muscular da

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mucosa; o epitélio esofágico fica também espessado e mostra paraceratose, ou mesmo

ortoceratinização (ADAD, 1989; ANDRADE, 2000). Para WYCHULIS, WOOLAM,

ANDERSEN (1971) essas alterações hiperplásicas, ou mesmo displásicas, do epitélio

esofágico assumem importância porque tem sido demonstrada uma freqüência aumentada

de até 7 vezes, de carcinoma do esôfago em portadores de megaesôfago idiopático.

REZENDE, ROSA, VAZ (1985) descrevem que o carcinoma do esôfago também tem sido

registrado com maior freqüência em portadores de megaesôfago chagásico. ADAD et al.

(1999) em revisão da literatura destacam que tratam-se em geral de carcinomas

epidermóides, porém, relatam ter tido um caso de paciente com megaesôfago chagásico

com leiomiosarcoma de esôfago.

Ao exame microscópico, encontram-se focos inflamatórios com predomínio de

linfócitos, menor número de macrófagos e raros plasmócitos que se associam com a

destruição das miocélulas (ADAD, 1989; ADAD et al., 1991). Em alguns casos são vistos

granulomas; porém, parasitas raramente são encontrados (KÖBERLE, 1968a, 1968b,

ADAD, 1989; ADAD et al., 1991).

Os estudos ultra-estruturais nos megas chagásicos (TAFURI et al., 1971; TAFURI,

1974) confirmaram as observações da microscopia de luz comum e acrescentaram outras.

Com relação às alterações nas células musculares e nos componentes do interstício no

megaesôfago chagásico, TAFURI et al. (1971) e TAFURI (1974), descreveram que, na

maioria das vezes, essas células estavam muito afastadas umas das outras por alargamento

do espaço intercelular, ocupado por substância amorfa eletrodensa e finamente granulosa,

contendo, eventualmente, fibrilas colágenas orientadas em diversos sentidos.

Segundo TAFURI, RASO (1983), no megaesôfago chagásico observa-se fibrose,

ora focal que poderia representar uma seqüela de miosite e estaria associada com infiltrado

de mastócitos, ora fibrose intersticial difusa que não mostraria relação topográfica com a

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inflamação. Admitem que a explicação desta fibrilopoiese difusa é difícil e levantam duas

hipóteses: 1) que resultaria da estruturação da substância fundamental por enzimas

circulantes, provenientes de fibroblastos distantes da área de fibrose ou 2) estaria

relacionada com a mastocitose presente na doença de Chagas experimental e humana.

ANDRADE, ANDRADE (1979), analisando a fibrose miocárdica, admitem,

também que a fibrose focal poderia decorrer de cicatrização dos focos inflamatórios

relacionados com a presença de mastócitos, todavia ressaltam que a patogenia da fibrose

intersticial difusa não está esclarecida. Esses autores levantam a possibilidade de que a

organização do edema intersticial crônico, a ação de um anticorpo que atue nas membranas

musculares, interstício e vasos, ou a liberação de linfocinas fibrosantes poderiam estar

envolvidas.

Do ponto de vista macroscópico, TAFURI, RASO (1983) e LOPES et al. (2000),

caracterizam o megacólon como uma dilatação permanente do cólon, acompanhada ou não

de espessamento da parede e alongamento da alça, não provocada por obstrução mecânica.

KOBERLE (1968a) e OKUMURA (1983) acrescentam a hipertrofia da parede, mas não

referem ser a dilatação permanente. ADAD (1996) propõe que os termos espessamento ou

hipertrofia da parede sejam substituídos por aumento da massa muscular.

Microscopicamente, as alterações mais características e constantes do megacólon

chagásico são as dos plexos nervosos intramurais e das musculares (KÖBERLE, 1968a;

KÖBERLE et al., 1983; TAFURI, RASO, 1983; NOGUEIRA, 1996; ADAD, 1996;

LOPES et al., 2000; ADAD et al., 2001). São representadas por ganglionite,

periganglionite, neurite, perineurite, denervação e fenômenos degenerativos dos

neurônios, ocorrendo, por vezes, destruição completa de alguns gânglios, mais

freqüentemente no plexo mientérico. Segundo KÖBERLE (1968a, 1968b) o grau de

denervação necessário para o aparecimento de megacólon seria em torno de 50-55%,

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enquanto que para o megaesôfago seria necessário 90-95%. Esses dados foram

confirmados por ADAD (1989, 1996), embora no caso do megacólon seja necessário

realizar correção da contagem devido à hipertrofia neuronal (ADAD, 1996; ADAD et al.,

2001). Observa-se, na túnica muscular do megacólon chagásico, miosite de intensidade

variável, com degeneração e necrose de miocélulas e ainda fibrose, focal ou difusa, direta

ou indiretamente relacionada com os focos de miosite (TAFURI, RASO, 1983).

KISS (1972) analisou as células musculares no megacólon "adquirido" e

descreveu aumento do número de pontos de íntimo contato entre as miocélulas,

vacuolização citoplasmática, dilatação do retículo endoplasmático e desorganização de

miofilamentos.

O infiltrado inflamatório é constituído predominantemente por linfócitos

(ROCHA et al., 1981; TAFURI, RASO, 1983; LOPES et al., 2000; ADAD, 1996), em

especial por linfócitos T (NOGUEIRA, 1996; ADAD, 1996). Em geral, há número

menor de linfócitos B, plasmócitos, eosinófilos, macrófagos, mastócitos e neutrófilos

(ROCHA et al., 1981; LOPES et al., 2000; ADAD, 1996). A população de linfócitos T é

representada tanto por células CD4+ quanto CD8+, que segundo ADAD (1996), não seria

possível estimar, sem estudo quantitativo, o tipo predominante. LEMOS (1998) realizou

análise quantitativa de subpopulações de linfócitos T no sangue periférico de portadores

de megacólon chagásico e mostrou um maior número de CD4+ em relação às células

CD8+, numa razão que variou de 1,1 a 1,2.

Focos de miosite foram identificados por ADAD (1996) no cólon em 100% dos

chagásicos com mega, quando analisados cortes subseriados de três regiões (transição

reto-sigmóide, porção média do sigmóide e transição descendente-sigmóide), assim como

fibrose, freqüentemente moderada ou intensa, na túnica muscular. No grupo sem

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megacólon detectou miosite, assim como fibrose discreta, somente em 20% dos casos.

Em nenhum controle (não chagásico), encontrou miosite e/ou fibrose (ADAD, 1996).

Segundo TAFURI, RASO (1983), excepcionalmente a miosite é do tipo

granulomatoso. Entretanto, no material de ADAD (1996), miosite granulomatosa foi vista

em até 52,9% dos casos de megacólon, talvez por avaliar 30 cortes subseriados de anéis

intestinais completos de 3 regiões. No grupo de chagásicos sem megacólon, esta autora

não identificou miosite granulomatosa.

ADAD (1996) refere que as alterações vistas no megacólon chagásico, tais

como focos de miosite, fibrose e aumento da área da muscular, foram freqüentes tanto na

porção média quanto na distal do sigmóide; todavia, a denervação foi mais intensa na

região distal (transição reto-sigmóide), em relação à porção média do sigmóide e, nesta,

em relação à parte proximal da alça (transição descendente-sigmóide). Essa autora

classificou a fibrose no megacólon como de substituição (em geral focal), quando a

neoformação conjuntiva parecia substituir miocélulas e denominou-a de endomisial

quando havia aumento do conjuntivo entre as miocélulas (freqüentemente difusa), a qual

fora chamada de intersticial por TAFURI, RASO (1983).

Os mastócitos são células residentes no tecido conjuntivo, particularmente

associadas aos vasos sanguíneos, nervos e ductos glandulares, nas proximidades de

superfícies com interface para o meio externo (METCALFE et al., 1997; BERTON et al.,

2000), que apresentam grânulos citoplasmáticos metacromáticos. São células capazes de

secretar numerosos mediadores inflamatórios em resposta à agressão do tecido e podem

estar envolvidos em processos fibróticos (BERTON et al., 2000) e imunológicos (GALLI

et al., 1984). Essas células possuem receptores de membrana de alta afinidade para

imunoglobulina E (DVORAK et al., 1983), através dos quais podem estabelecer, em

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presença de ligantes multivalentes, pontes que levam à sua ativação e à conseqüente

liberação do conteúdo dos grânulos.

Os mastócitos são derivados da “stem cell” da medula óssea (KITAMURA,

MIYOSHI, 1978; KITAMURA et al., 1981; SCHARADER et al., 1981; NAKAHATA et

al., 1982; KANAKURA et al., 1988) e para sobreviverem dependem de fatores sobre as

células tronco (METCALFE et al., 1997).

Os mastócitos contêm e liberam várias substâncias como histamina, proteases

neutras (LEVI-SCHAFFER, RUBINCHICK, 1995), fatores quimiotáticos

(SIRAGANIAN, 1988), heparina (uma glicosaminoglicana sulfatada responsável pela

metacromasia) (JORPES, 1937; HOLMGREN, WILANDER, 1937), serotonina, citocinas

como as interleucinas 4, 5, 6, fator de necrose tumoral-alfa (OKAYAMA et al., 1995),

interleucina 13 (KATZ et al., 1995) e mediadores inflamatórios: prostaglandina D2,

leucotrienos C, D, E e fator de ativação das plaquetas.

Os mastócitos quando ativados liberam um espectro de mediadores que iniciam

e modulam a reação de hipersensibilidade tipo-imediata. A expressão de proteases neutras

dos mastócitos, marcador específico dessas células, é regulada por vários fatores de

crescimento. Os mastócitos humanos, assim como em roedores, são conhecidos por

produzirem citocinas que modulam a produção de imunoglobulina E e inflamação

(SCHWARTZ, 1993).

Os mastócitos expressam uma variedade de aspectos fenotípicos nos tecidos,

determinados pelo ambiente local. Retirada dos fatores de crescimento necessários resulta

na apoptose de mastócitos. Os mastócitos parecem ser altamente relacionados com

múltiplas funções biológicas críticas. São ativados por diversos estímulos, tanto receptor de

classe dependente de imunoglobulina E, quanto independente de imunoglobulina E.

Ativação através de diversos receptores leva a distintas vias de sinalização. Ativação dos

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mastócitos pode também ser seguida pela síntese de quimiocinas e citocinas, cuja secreção,

que ocorre horas depois, pode contribuir para inflamação crônica. Funções biológicas dos

mastócitos parecem incluir um papel na imunidade natural, envolvimento em mecanismos

de defesa do hospedeiro contra manifestações por parasitos, imunomodulação do sistema

imune, tecido de reparação e angiogênese (METCALFE et al.,1997).

O aumento do número de mastócitos é visto em uma variedade de doenças

fibrosantes (STEAD et al., 1990), ou proliferativas como na fibrose pulmonar (HUNT et

al., 1992; PESCI et al., 1993; BJERMER et al., 1988), fibrose hepática (ARMBRUST et

al., 1997; MURATA et al., 1973), neurofibromatose e psoríase (SCHULMAN, 1993;

GRUBER, KAPLAN , 1993; ROTHER et al., 1990), esclerodermia (HAWSKINS et al.,

1985; NISHIOKA et al., 1987; CHANEZ et al., 1993), quelóide (CRAIG et al., 1986) e

em doenças associadas com neovascularização como artrite reumatóide (CRISP et al.,

1984; MALONE et al., 1987), diabete melito (NORRBY et al., 1990), hemangioma

(GLOWACKI et al., 1982) e outros tipos de tumores ( MENINGER, ZETTER, 1992).

Muitas substâncias produzidas pelos mastócitos tem o potencial de afetar o

tecido conjuntivo. A histamina tem demonstrado estímulo para crescimento de

fibroblastos e aumento da síntese de colágeno tanto in vivo (SANDBERG, 1962) quanto

in vitro (NORRBY, 1973). Heparina e histamina agem juntas podendo influenciar a

formação de cicatriz (CLAMAN, 1993). Heparina tem demonstrado também influência

no crescimento de fibroblastos e aumento da síntese de colágeno (FERRAO, MASON,

1993; YAMASHITA et al., 1992). A triptase dos mastócitos humanos induz proliferação

de fibroblastos in vitro (RUOSS et al., 1991) e também é um fator fibrogênico capaz de

estimular a síntese de RNA mensageiro e a quimiotaxia (GRUBER et al.,1997; CAIRNS,

WALLS, 1997). Diversas citocinas produzidas pelos mastócitos são conhecidas também

pela sua atividade fibrogenética como interleucina 4 (MONROE et al., 1988), Fator de

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Necrose Tumoral Alfa e Fator de Crescimento Tumoral Beta 1 (KOVACS, 1991).

Finalmente, os mastócitos podem contribuir diretamente para a fibrose através de sua

habilidade para produzir glicoproteínas da matriz extracelular (THOMPSON et al.,

1991).

Muitos desses mediadores não são produzidos exclusivamente pela ativação

dos mastócitos, particularmente no contexto da inflamação crônica. Entretanto, evidências

sugerem uma causa direta no relacionamento entre ativação dos mastócitos e inibição da

fibrose e/ou ativação e proliferação dos fibroblastos (METCALFE et al.,1997).

Experimentalmente, tem sido demonstrado que os mastócitos do peritônio de

ratos aumentam a proliferação de fibroblastos 3T3 e a produção de colágeno em culturas

de monocamadas (LEVI-SCHAFFER, RUBINCHICK, 1994).

Estudos in vivo e in vitro sugerem que os mastócitos podem interagir com os

fibroblastos, induzindo fibrose. In vitro, os fibroblastos regulam a sobrevivência e

diferenciação dos mastócitos, enquanto estas células causam mudanças bioquímicas nos

fibroblastos, podendo induzir fibrose (LEVI-SCHAFFER, RUBINCHICK, 1994).

Nas inflamações crônicas em geral têm-se atribuído aos mastócitos participação

na colagenogênese do fenômeno produtivo-reparativo (BENSLEY, 1949; MORRIONE,

1952; FERNEX, 1960, 1961, 1963, 1968; ORFANOS, STTÜTGEN, 1963).

A indução de novos vasos sanguíneos, ou angiogênese, tem sido em parte

relacionada com os mastócitos (MENINGER, ZETTER, 1992). Primeiro, porque os

mastócitos do tecido conjuntivo estão topograficamente associados com pequenos vasos

(RAKUSAN et al., 1990; RHODIN, FUJITA, 1989). Segundo, porque os mastócitos

acumulam um número de situações angiogênese-dependente, incluindo ovulação

(KRISHNA et al., 1989), formação de hemangioma (DETHLEFSEN et al., 1986),

neoplasia (DE CIDRE, DE LUSTIG, 1990; DONHUIJSEN et al.,1992; HAFEZ,

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COSTLOW, 1988; LE QUERREC et al., 1993) e disfunção do miocárdio (OLIVETTI et

al., 1989; RAKUSAN, CAMPBELL, 1991).

Grânulos de mastócitos têm sido descritos dentro das células endoteliais

(ATKINS et al., 1985; DESCHRYVER-KECSKEMETI et al., 1992) e estimulam sua

proliferação (DUNCAN et al., 1992; MARKS et al., 1986; ROCHE, 1985).

Do ponto de vista funcional, é concebível que uma interação entre mastócitos e

sistema nervoso periférico exista e levaria a vários processos inflamatórios e fisiológicos.

Neuropeptídeos, como neurotensina e substância P, induzem degranulação dos

mastócitos. Além disso, tem sido mostrado que a substância P estimula as células

endoteliais vasculares e induz infiltração granulocítica através da degranulação dos

mastócitos (GRONBECH, LACY, 1994; LIWAMOTO et al., 1992; MATSUDA et al.,

1989; YANO et al., 1989). De fato, mastócitos foram descritos em íntima associação com

nervos periféricos no trato gastrintestinal e em uma variedade de sítios anatômicos em

humanos e em outras espécies de mamíferos (BIENENSTOCK et al., 1993).

Com relação à fixação dos mastócitos, TAINSH e PEARSE (1992) usaram o

formol como fixador e distinguiram dois subtipos de mastócitos, os sensíveis e

insensíveis ao formol. Estudaram histoquimicamente 4 tipos de mastócitos: peritoniais, do

mesentério, da pele e do pulmão de rato. Essas células apresentaram diferentes respostas

à coloração pelo azul de alcian-safranina O após fixação pelo formol. Utilizando a

coloração seqüencial verificaram que mastócitos do mesentério e da pele foram

resistentes ao formol e exibiram características intermediárias de coloração.

BIANCHI e MUGNAI (1991) testaram as técnicas de coloração por Azul de

Toluidina e Astra Blue em língua de rato para análise histoquímica por imagem dos

mastócitos. A comparação entre essas duas colorações mostra que a preparação corada

pela técnica de Astra Blue captura mais pixels do que aquela corada pelo Azul de

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Toluidina. A escolha de Astra Blue como uma alternativa para Azul de Toluidina em

análises densidométricas de mastócitos é baseada na propriedade de restringir a coloração

aos grânulos dos mastócitos.

XAUBET et al. (1991) compararam diferentes fixadores e métodos de

coloração para identificar mastócitos obtidos no lavado broncoalveolar de pacientes com

doenças pulmonares intersticiais. As células foram fixadas com formaldeído e metanol e

identificadas pelas colorações metacromáticas com May Grunwald Giemsa, Azul de

Toluidina e Giemsa Galamina Azul. Depois da fixação pelo formaldeído poucas células

foram identificadas independente da coloração utilizada, enquanto que um maior número

de mastócitos foi observado depois da fixação com metanol. Usando esse fixador,

identificaram-se mais células pela técnica de Azul de Toluidina do que pelo May

Grunwald Giemsa; entretanto, não houve diferença entre Toluidina e Giemsa Galamina

Azul. A fácil identificação de mastócitos depois da coloração pelo Azul de Toluidina,

combinada com a fácil aplicação, sugerem que essa coloração depois da fixação pelo

metanol é o método mais útil para determinar mastócitos em fluidos.

RONAI et al. (1993) analisaram as colorações May Grunwald Giemsa e Azul

de Toluidina para detectarem mastócitos no fluido broncoalveolar e consideraram as duas

colorações adequadas.

Na doença de Chagas tem-se relatado aumento do número de mastócitos,

associado ou não ao processo inflamatório, tanto em humanos como experimentalmente.

ALMEIDA et al. (1975) estudando cardiopatas chagásicos verificaram, através

de estudo quantitativo, mastocitose relacionada topograficamente com a miocardite.

Admitiram que um dos possíveis fatores responsáveis pelo caráter fibrosante da

miocardite chagásica crônica seria o aumento do número de mastócitos no miocárdio.

Para a contagem dos mastócitos os fragmentos foram cortados em micrótomo de

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congelação, cortes de 20μm de espessura, os quais foram corados com azul de toluidina a

0,5%, pH 4,5.

ROCHA (1986) descreveu aumento do número de mastócitos no nó sinusal de

chagásicos crônicos, porém, esse autor não estabeleceu relação com a fibrose.

TAFURI et al. (1971) e TAFURI (1974), em estudos ultra-estruturais,

ressaltaram mastocitose no megaesôfago e megacólon chagásico referindo que os

mastócitos localizavam-se na cápsula, no interior dos gânglios do plexo mientérico,

próximos ao interstício intermuscular e entre os feixes de células musculares.

TAFURI, RASO (1983) descreveram dois tipos de mastocitose nos megas

chagásicos: um focal, sempre relacionado com focos de inflamação e outro, difuso,

independente desses focos.

PEREIRA (1972) procedeu estudo quantitativo dos mastócitos da camada

muscular circular do esôfago de chagásicos crônicos sem mega e encontrou aumento do

número de mastócitos, em relação a não chagásicos. Descreveu que o aumento de

mastócitos era difuso, não havendo relação topográfica com os focos inflamatórios. A

contagem de mastócitos foi feita em cortes corados pelo azul de toluidina a 0,5% de pH

4.

ADAD (1989) descreveu que parecia haver maior número de mastócitos na

muscular circular do esôfago de chagásicos crônicos, distribuídos de modo difuso sem

relação topográfica com os focos inflamatórios. Entretanto, ao realizar análise

quantitativa de mastócitos na muscular do esôfago (ADAD et al., 1992) e do cólon

(ADAD et al, 1997c) de chagásicos crônicos, com e sem mega, não detectaram diferença

estatisticamente significante. Esses estudos foram feitos em cortes corados pela técnica de

Giemsa.

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LOPES (1999), quantificou o colágeno no miocárdio de cardiopatas de

diferentes etiologias, inclusive chagásica, através de métodos bioquímicos, biofísicos e

morfométricos. Embora não tenha detalhado a análise segundo a etiologia da cardiopatia,

verificou que o método morfométrico utilizado (percentagem de pontos da ocular

integradora, coincidentes com área de fibrose) guardava relação com a concentração de

hidroxiprolina que permitia estimar o teor de colágeno.

PINHEIRO (2000) realizou estudo morfométrico na muscular circular do cólon

contando o número de mastócitos e medindo o tecido conjuntivo fibroso nessa camada,

em cortes histológicos corados pela técnica de Giemsa de anéis intestinais retirados da

transição reto-sigmóide de 26 chagásicos crônicos, 13 com megacólon e 13 sem

megacólon comparados a 13 não chagásicos. Demonstrou que havia maior número de

mastócitos e aumento evidente do conjuntivo fibroso nos chagásicos com mega em

relação aos chagásicos sem mega e aos não chagásicos. Entretanto, não foi possível

demonstrar se existia relação entre fibrose e o número de mastócitos, talvez devido ao

tamanho da amostra. Expandindo o estudo anterior, foram avaliados 30 casos de

chagásicos crônicos sendo 15 anéis da transição reto-sigmóide de chagásicos com

megacólon e 15 sem megacólon comparados a 15 não chagásicos, PINHEIRO et al.

(2003) concluíram que o número de mastócitos e a fibrose foram maiores no grupo com

megacólon em relação ao chagásico sem mega e ao não chagásico e, não houve diferença

significante entre os dois últimos grupos. Concluíram ser provável a relação entre

mastocitose e fibrose no megacólon chagásico, como já foi demonstrado em outras

doenças.

PEREIRA (2002) realizou estudo morfológico, histoquímico, imuno-

histoquímico, morfométrico e ultra-estrutural na língua de indivíduos chagásicos

crônicos autopsiados e concluiu que a densidade de tecido conjuntivo fibroso e de

18

mastócitos nos indivíduos chagásicos foi significamente maior, quando comparados aos

não-chagásicos.

Com relação à doença de Chagas experimental, MENEZES, ALCÂNTARA

(1965) observaram aumento do número de mastócitos em áreas de reinoculação de T.

cruzi na pele de camundongos. Segundo esses autores, a inflamação, determinada por

novo inóculo, seria a causa do aumento dessas células.

TAFURI, BRENER (1967) descreveram aumento do número de mastócitos na

submucosa e especialmente na muscular do intestino delgado e do intestino grosso de

camundongos cronicamente infectados com a cepa “ABC” do Trypanosoma cruzi.

CHAPADEIRO et al. (1988) em ratos albinos Wistar, infectados

experimentalmente por Trypanosoma cruzi, referiram que, na fase aguda, os mastócitos

estavam ausentes ou eram escassos nos animais infectados. Os autores não fizeram

referência ao comportamento dessas células na fase crônica da doença.

PINHEIRO et al. (1992) em ratos cronicamente infectados por Trypanosoma

cruzi, demonstraram aumento do número de mastócitos no miocárdio, porém, não

puderam demonstrar relação com a fibrose. Quantificaram também o número de

eosinófilos, que não diferiu estatisticamente dos ratos não chagásicos. A contagem das

células foi realizada em cortes corados pela técnica de Giemsa.

PIRES et al. (1992) infectaram experimentalmente camundongos e

demonstraram aumento dos níveis de histamina no músculo esquelético e no trato

gastrointestinal. Esses autores sugeriram que haveria paralelismo entre o aumento dos

níveis de histamina e o aumento de mastócitos nos tecidos na doença de Chagas.

POSTAN et al. (1994) demonstraram proliferação in situ e migração de

mastócitos, obtidos através de cultura in vitro de corações de camundongos infectados

experimentalmente por Trypanosoma cruzi. As células foram identificadas como

19

mastócitos pelo microscópio eletrônico e pela positividade dos grânulos quando corados

pelas técnicas de Giemsa, Azul de Toluidina e Sulfato de Berberina.

CALIARI et al. (2002) através de análise morfométrica computadorizada

quantificaram as áreas ocupadas por músculo cardíaco, tecido conjuntivo fibroso e tecido

adiposo no átrio direito de cães experimentalmente infectados pelo Trypanosoma cruzi.

Todos os cães infectados apresentaram miocardite crônica fibrosante com graus variáveis

de redução de músculo cardíaco, aumento do tecido conjuntivo e substituição por tecido

adiposo.

ADAD estudou isoladamente esôfago (1989) e cólon (1996). Refere ter tido a

impressão de que na muscular do esôfago em geral existem muito mais mastócitos que no

cólon dos controles. Considerando que o mastócito pode ter relação com processo

inflamatório e fibrose, seria interessante avaliar quantitativamente essa célula nesses dois

órgãos. Além disso, não encontramos na literatura estudos comparativos entre número de

mastócitos na muscular do esôfago em relação ao cólon, seja em indivíduos normais ou

chagásicos. Por essas razões nos propusemos realizar análise quantitativa do número de

mastócitos na muscular circular do esôfago e do cólon de chagásicos crônicos, com e sem

mega, visando conhecer melhor a morfologia do megaesôfago e megacólon chagásicos.

20

OBJETIVOS

21

Geral

Avaliar comparativamente o número de mastócitos na muscular do esôfago e

do cólon normais e, verificar se existe aumento do número de mastócitos no esôfago e

cólon de chagásicos crônicos com e sem mega, visando contribuir para a patogênese das

lesões dos megas chagásicos.

22

Específicos

1. Comparar o número de mastócitos na muscular do esôfago entre os diferentes

grupos.

2. Comparar o número de mastócitos na muscular do cólon entre os diferentes grupos.

3. Comparar o número de mastócitos na muscular do esôfago em relação ao cólon dos

mesmos indivíduos, tanto não chagásicos quanto chagásicos.

4. Avaliar semi-quantitativamente a miosite e a fibrose na túnica muscular do esôfago

e do cólon de chagásicos crônicos com e sem mega.

23

MATERIAL E MÉTODO

24

1. Material

Foram estudados 28 casos de necrópsias realizadas no Serviço de Patologia do

Hospital Escola da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba, Minas Gerais.

Os 28 casos correspondem a 16 chagásicos crônicos e 12 não chagásicos sem

qualquer patologia gastrointestinal, que serviram de controle. O grupo dos 16 chagásicos

foi dividido em dois subgrupos:

Chagásico sem mega - constituído por 10 chagásicos sem megacólon e sem

megaesôfago;

Chagásico com mega - composto por 6 chagásicos com megaesôfago e megacólon.

O diagnóstico de infecção chagásica foi baseado na positividade de pelo menos

duas das três seguintes reações no sangue e/ou líquido pericárdico: ELISA (Enzime-linked-

immunosorbent-assay), hemaglutinação passsiva e imunofluorescência indireta para

25

Trypanosoma cruzi. Os indivíduos do grupo controle apresentaram as três reações

negativas.

O diagnóstico de megaesôfago foi feito através de dados clínicos (disfagia) e

radiológicos (radiografia contrastada de esôfago). O diagnóstico de megacólon também foi

feito a partir de dados clínicos (obstipação intestinal acompanhada freqüentemente de

complicações como fecaloma e volvo) e radiológicos (enema opaco mostrando dilatação e

perda das haustrações acompanhadas ou não de alongamento do cólon e/ou radiografia

simples de abdome, evidenciando fecaloma e dilatação intestinal). A análise dos dados

clínicos, exame físico, eletrocardiograma, radiografia de tórax e exame contrastado de

esôfago, constantes nas fichas hospitalares e/ou de dados das necrópsias, permitiu

classificar os chagásicos em portadores ou não de megaesôfago, bem como cardiopatas

(com ou sem insuficiência cardíaca) ou não cardiopatas. Os anexos 1, 2 e 3, relacionam os

dados de identificação dos pacientes e os principais achados anatomoclínicos nos grupos

não chagásico, chagásico sem mega e chagásico com megaesôfago e megacólon,

respectivamente.

A idade variou de 25 a 85 (53 ± 17,26) anos no grupo não chagásico, 47 a 84 (59,5

± 14,67) anos no grupo chagásico sem mega e 43 a 67 (55,3 ± 12,04) anos no grupo

chagásico com mega.

Em relação ao sexo, 10 (83,3%) do grupo não chagásico, 6 (60%) do grupo

chagásico sem mega e 5 (83,3%) do grupo chagásico com mega, eram do sexo masculino.

Quanto à cor, foram separados em brancos e não brancos, sendo que 8 (66,7%) do

grupo não chagásico, 4 (40%) do grupo chagásico sem mega e 3 (50%) do grupo chagásico

com mega, eram brancos.

2. Método

26

2.1. Colheita e processamento do material

Retirou-se de cada caso, um anel com cerca de 0,5cm de “altura” na transição reto-

sigmóide, ou seja, no sigmóide distal e no terço inferior do esôfago, a 5 cm da cárdia . Os

anéis do sigmóide distal e do esôfago foram fixados em formol a 4%, sendo os anéis

menores preenchidos com papel de filtro antes de serem colocados no formol para mantê-

los com o formato anular. Para evitar que os anéis maiores fossem subdivididos, eram

abertos a fresco, enrolados sobre si mesmos com um papel de filtro justaposto à mucosa,

facilitando a fixação e moldando-os para posterior inclusão. Após a fixação, os anéis foram

submetidos à desidratação, diafanização e inclusão em parafina, confeccionando-se blocos

para microtomia, com até 5x5cm, obtendo-se cortes histológicos com 7µm de espessura.

Os cortes foram corados segundo as técnicas de hematoxilina-eosina, Tricrômico de

Masson e Giemsa. A seguir, procedeu-se à análise quantitativa dos mastócitos, nos cortes

corados pela técnica de Giemsa, e à análise semi-quantitativa da fibrose, nos cortes corados

pelo Tricrômico de Masson. Os cortes corados pala técnica de hematoxilina-eosina foram

utilizados para análise geral dos anéis e avaliação semi-quantitativa da miosite.

2.2. Análise quantitativa dos mastócitos

A contagem dos mastócitos foi feita na muscular circular do cólon e do esôfago, nos

cortes corados pela técnica de Giemsa, utilizando um microscópio de luz comum, da marca

LEICA, modelo DIASTAR.

Os cortes histológicos dos anéis eram marcados em 8 locais, criando subdivisões

aproximadamente eqüidistantes entre si, sendo os mastócitos contados em 8 campos

27

microscópicos consecutivos em cada subdivisão, totalizando 64 campos microscópicos,

com ocular de 10x milimetrada e objetiva de 40x, correspondendo a uma área total de

12,6mm². O número de mastócitos era anotado em cada campo e, ao final, obtinha-se a

soma do número de mastócitos em 64 campos para cada caso.

2.3. Análise semi-quantitativa da miosite e da fibrose.

Para a avaliação da miosite foram utilizados cortes histológicos corados pelas

técnicas de Hematoxilina-eosina e Giemsa observando-se a presença ou não dessas

alterações. O processo inflamatório na túnica muscular do esôfago e do cólon foi

classificado em discreto, moderado ou intenso com base no tamanho e freqüência dos focos

de exsudato.

Para a análise semi-quantitativa da fibrose foram utilizados os cortes histológicos

corados segundo a técnica de Tricrômico de Masson, obtendo-se a fibrose em azul e o

músculo em vermelho. A análise da fibrose foi feita na muscular circular do cólon e do

esôfago tanto nos chagásicos sem mega quanto com mega comparados ao grupo não

chagásico. Analisou-se a fibrose de substituição (neoformação conjuntiva que parecia

interromper e substituir miocélulas) e a fibrose intersticial (endomisial/perimisial; aumento

do conjuntivo entre as miocélulas). A fibrose foi classificada quanto à intensidade, em

discreta, moderada ou intensa.

2.4. Análise estatística

28

O tamanho ideal da amostra do número de campos microscópicos a serem medidos

para a contagem dos mastócitos foi obtido após cálculo das médias acumuladas para

quantidades adequadas, nos casos controles (WILLIAMS,1981).

As variáveis analisadas não apresentaram distribuição normal, sendo comparadas

por meio da estatística de Kruskal-Wallis com relação aos três grupos de estudo e Mann-

Whitney quando agrupados todos os chagásicos num mesmo grupo, através do programa

GraphPad InStat.

Para a comparação da miosite e da fibrose foi utilizado o Teste Exato de Fisher.

O nível de significância considerado para os testes foi de 5% (p < 0,05).

29

RESULTADOS

30

A análise estatística demonstrou homogeneidade entre os grupos não chagásico,

chagásico sem mega e chagásico com mega, com relação à idade, sexo e cor.

1. Análise quantitativa dos mastócitos

A avaliação preliminar global dos cortes corados pela técnica de Giemsa permitiu

observar que os mastócitos, em todos os grupos, encontravam-se dispersos em toda a túnica

muscular do cólon e do esôfago, em geral sem formar acúmulos (Figuras 1, 2, 3, 4, 5 e 6).

Nos chagásicos havia mastócitos tanto nos focos de miosite, quanto dispersos no restante

da muscular (Figuras 7 e 8).

31

32

33

34

O Quadro 1 mostra o resultado da contagem dos mastócitos em 64 campos

microscópicos de grande aumento (área total: 12,6mm²), na muscular circular do esôfago e

do cólon de cada caso.

Quadro 1 – Numero de mastócitos em 64 campos microscópicos (área total: 12,6mm²) na muscular do esôfago e do cólon em cada caso, segundo os grupos de estudo.

Caso GrupoMastócitos

EsôfagoMastócitos

Cólon1 NC 346 82 NC 160 03 NC 70 24 NC 18 05 NC 122 16 NC 62 17 NC 373 18 NC 59 09 NC 133 010 NC 241 2011 NC 84 2412 NC 108 113 CSM 182 314 CSM 474 515 CSM 185 016 CSM 74 117 CSM 196 018 CSM 114 4219 CSM 27 120 CSM 43 021 CSM 44 11122 CSM 1070 4923 CCM 578 3024 CCM 340 2925 CCM 60 2526 CCM 118 727 CCM 241 3128 CCM 179 1

NC: não chagásico; CSM: chagásico sem mega; CCM: chagásico com mega

Nota-se, no quadro 1, grande variação no número de mastócitos nos diferentes

grupos sendo, em geral, maior no esôfago em comparação ao cólon, em todos os grupos.

A Tabela 1 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular do esôfago

do grupo não chagásico e indivíduos chagásicos com e sem mega em conjunto.

35

Tabela 1 - Resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do esôfago no grupo não chagásico em relação aos indivíduos chagásicos com e sem mega em conjunto.

MASTÓCITOSNÃO

CHAGÁSICO CHAGÁSICOMédia 148 245Desvio padrão 114 270Mediana 115 180Valor máximo 373 1070Valor mínimo 18 27n° de casos 12 16

Teste de Mann-Whitney p = 0,4499

Como observa-se na Tabela 1, embora os valores médios sejam maiores nos

chagásicos, talvez devido a grande variabilidade do número de mastócitos no esôfago, a

diferença não foi estatisticamente significante entre o grupo não chagásico e os indivíduos

chagásicos com e sem mega em conjunto (p = 0,4499).

A Tabela 2 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do

esôfago nos grupos não chagásico, chagásico sem mega e chagásico com mega.

Tabela 2 - Resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do esôfago nos grupos não chagásico, chagásico sem mega e chagásico com mega.

NÃO CHAGÁSICOMASTÓCITOS CHAGÁSICO sem megaesôfago com megaesôfagoMédia 148 241 253Desvio padrão 114 319 187Mediana 115 148 210Valor máximo 373 1070 578Valor mínimo 18 27 60n° de casos 12 10 6

Teste de Kruskal-Wallis p = 0,4980

Como observa-se na Tabela 2, os valores médios no grupo com mega tendem a

ser maiores que no chagásico sem mega e também maiores neste em relação ao não

chagásico; porém, não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos (p =

36

0,4980), em relação à contagem de mastócitos na muscular do esôfago. Talvez isso se deva

a grande variabilidade individual, além do pequeno número de casos no grupo com mega.

A Tabela 3 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular circular

do cólon do grupo não chagásico e dos indivíduos chagásicos com e sem mega em

conjunto.

Tabela 3 - Resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do cólon no grupo não chagásico em relação aos indivíduos chagásicos com e sem mega em conjunto.MASTÓCITOS NÃO CHAGÁSICO CHAGÁSICOMédia 5 21Desvio padrão 8 29Mediana 1 6Valor máximo 24 111Valor mínimo 0 0n° de casos 12 16

Teste de Mann-Whitney p = 0,0735

Como observa-se na Tabela 3, embora os valores médios sejam maiores nos

chagásicos, talvez devido a grande variabilidade no número de mastócitos no cólon, a

diferença não foi estatisticamente significante entre os grupos não chagásico e indivíduos

chagásicos com e sem mega em conjunto (p = 0,0735).

A Tabela 4 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do

cólon entre os grupos não chagásico, chagásico sem mega e chagásico com mega.

Tabela 4 - Resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do cólon, nos grupos não chagásico, chagásico sem mega e chagásico com mega. NÃO CHAGÁSICOMASTÓCITOS CHAGÁSICO sem megacólon com megacólonMédia 5 21 20Desvio padrão 8 37 13Mediana 1 2 27Valor máximo 24 111 31Valor mínimo 0 0 1n° de casos 12 10 6

Teste de Kruskal-Wallis p = 0,0728

37

Como observa-se na Tabela 4, apesar dos valores médios nos chagásicos com e

sem megacólon terem sido maiores que os do grupo não chagásico, talvez devido a grande

variabilidade no número de mastócitos no cólon, a diferença não foi estatisticamente

significante (p = 0,0728).

Comparamos também a contagem de mastócitos no esôfago em relação ao cólon

do mesmo indivíduo em cada grupo, pois nos impressionou a tendência geral de ter mais

mastócitos no esôfago.

A Tabela 5 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular do esôfago

e do cólon, dos mesmos indivíduos, do grupo não chagásico.

Tabela 5 - Resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do esôfago e do cólon, dos mesmos indivíduos, no grupo não chagásico.MASTÓCITOS ESÔFAGO CÓLONMédia 148 5Desvio padrão 114 8Mediana 115 1Valor máximo 373 24Valor mínimo 18 0n° de casos 12 12

Teste de Mann-Whitney p < 0,0001

Como nota-se na Tabela 5, quando se compara o número de mastócitos no

esôfago e no cólon dos mesmos indivíduos do grupo não chagásico, observa-se diferença

estatisticamente significante (p < 0,0001), sendo maior no esôfago.

A Tabela 6 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular do esôfago

e do cólon dos mesmos indivíduos do grupo chagásico com e sem mega em conjunto.

38

Tabela 6 – Resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do esôfago e do cólon, dos mesmos indivíduos, do grupo chagásico com e sem mega em conjunto.MASTÓCITOS ESÔFAGO CÓLONMédia 245 21Desvio padrão 270 29Mediana 180 6Valor máximo 1070 111Valor mínimo 27 0n° de casos 16 16

Teste de Mann-Whitney p < 0,0001

Como observa-se na Tabela 6, quando se compara o número de mastócitos no

esôfago e no cólon dos mesmos indivíduos, do grupo chagásico com e sem mega em

conjunto, nota-se diferença estatisticamente significante ( p < 0,0001), sendo maior no

esôfago.

A Tabela 7 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular do esôfago

e do cólon, dos mesmos indivíduos do grupo chagásico sem mega.

Tabela 7 – Resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do esôfago e do cólon, dos mesmos indivíduos do grupo chagásico sem mega.MASTÓCITOS ESÔFAGO CÓLONMédia 245 21Desvio padrão 319 37Mediana 148 2Valor máximo 1070 111Valor mínimo 27 0n° de casos 10 10

Teste de Mann-Whitney p = 0,0021

Como nota-se na Tabela 7, quando se compara o número de mastócitos no

esôfago e no cólon dos mesmos indivíduos do grupo sem mega, observa-se diferença

estatisticamente significante (p < 0,0021), sendo maior no esôfago.

A Tabela 8 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular do esôfago

e do cólon, dos mesmos indivíduos do grupo chagásico com megaesôfago e megacólon.

39

Tabela 8 – Resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do esôfago e do cólon, dos mesmos indivíduos do grupo chagásico com megaesôfago e megacólon.MASTÓCITOS MEGAESÔFAGO MEGACÓLONMédia 253 20Desvio padrão 187 13Mediana 210 27Valor máximo 578 31Valor mínimo 60 1n° de casos 6 6Teste de Mann-Whitney p = 0,0022

Como observa-se na Tabela 8, quando se compara o número de mastócitos no

esôfago e no cólon dos mesmos indivíduos do grupo chagásico com megaesôfago e

megacólon, nota-se diferença estatisticamente significante (p < 0,0022), sendo maior no

esôfago.

A análise global desses resultados permite concluir que o número de mastócitos

no esôfago é muito maior que no cólon em todos os grupos, o que indica uma diferença na

estrutura desses dois órgãos, o que pode ser importante na amplificação da resposta

inflamatória. Entretanto, com relação a possível mastocitose nos chagásicos, não foi

possível, com o número de casos estudados, estabelecer diferença.

2. Análise semi-quantitativa da miosite e da fibrose

Miosite, caracterizada por infiltrado celular associado a degeneração e/ou necrose

das miocélulas não foi observada nos esôfagos do grupo não chagásico (Figura 9). No

grupo chagásico sem mega detectou-se miosite em 6 (60%) dos 10 casos, enquanto nos

chagásicos com megaesôfago miosite esteve presente em todos os 6 (100%) casos. Em

todos os chagásicos os focos eram constituídos predominantemente por mononucleares,

ocasionalmente com eosinófilos de permeio (Figuras 10 e 11).

40

Com base na freqüência e tamanho dos focos de exsudato, classificou-se a

miosite em discreta, moderada ou intensa. De modo geral, quanto mais numerosos eram os

focos de miosite, mais intenso era o exsudato e o aspecto destrutivo da lesão.

41

42

O Quadro 2 mostra a avaliação da miosite, da fibrose de substituição e

intersticial e o número de mastócitos na muscular circular do esôfago nos grupos não

chagásico, chagásico sem mega e chagásico com mega.

Quadro 2 - Miosite, fibrose de substituição e intersticial e número de mastócitos na muscular circular do esôfago, em cada caso, nos grupos não chagásico, chagásico sem mega e chagásico com mega.

Caso Grupo Miosite Fibrosesubstituição

Fibrose intersticial

Número de mastócitos

1 NC - - - 3462 NC - - - 1603 NC - - - 704 NC - - - 185 NC - - - 1226 NC - - - 627 NC - - - 3738 NC - - - 599 NC - - - 133

10 NC - - - 24111 NC - - - 8412 NC - - - 10813 CSM ++ - + 18214 CSM - - - 47415 CSM - - - 18516 CSM + - - 7417 CSM ++ - + 19618 CSM ++ + - 11419 CSM - - - 2720 CSM + - + 4321 CSM - - - 4422 CSM ++ - - 107023 CCM + + ++ 57824 CCM ++ ++ ++ 34025 CCM + +++ +++ 6026 CCM ++ + + 11827 CCM + +++ ++ 24128 CCM + ++ +++ 179

NC: não chagásico; CSM: chagásico sem mega; CCM: chagásico com mega; - : ausente; + : discreta; ++ : moderada; +++: intensa.

Quando realizamos o Teste exato de Fisher para compararmos a presença ou

ausência de miosite entre os grupos chagásico sem mega e chagásico com mega não

encontramos diferença estatisticamente significante (p = 0,2335).

43

Com relação à fibrose, avaliada nos cortes corados pelo Tricrômico de Masson,

observou-se que no grupo não chagásico havia, em geral, escasso tecido conjuntivo, na

túnica muscular do esôfago (Figura 15), correspondendo a delgadas faixas entre as

miocélulas (conjuntivo intersticial). Em nenhum caso deste grupo foi vista fibrose de

substituição e/ou intersticial.

No grupo chagásico sem megaesôfago, observou-se discreta fibrose de

substituição em apenas 1 (10%) dos 10 casos, representada por raros focos de fibrose

interrompendo miocélulas. Em outros 3 (30%) casos desse grupo havia fibrose intersticial

discreta (Figura 16).

Nos chagásicos com megaesôfago, havia aumento evidente do tecido conjuntivo

fibroso, com fibrose de substituição e intersticial em todos os 6 (100%) casos (Figura 17).

Quando realizamos o Teste exato de Fisher para compararmos a presença ou

ausência de fibrose de substituição entre os grupos chagásico sem mega e chagásico com

mega, observamos diferença estatisticamente significante (p = 0,0009), sendo mais

freqüente no grupo com megaesôfago. Essa fibrose poderia estar relacionada com antigos

focos de miosite, pela destruição das miocélulas. Quando comparamos a fibrose intersticial

nos grupo chagásico sem mega e chagásico com mega, também observamos diferença

estatisticamente significante (p = 0,0114), sendo mais freqüente nos esôfagos com mega.

44

45

Com relação à análise do cólon, não havia miosite em nenhum dos controles não

chagásicos (Figura 12); detectou-se miosite em 5 (50%) dos 10 casos do grupo chagásico

sem mega, sendo discreta em todos eles (Figura 13). Nos chagásicos com megacólon,

miosite esteve presente em 4 (66,7%) dos 6 casos, sendo discreta em 2 e moderada nos

outros 2 casos (Figura 14). O aspecto da miosite, do ponto de vista qualitativo, era

semelhante ao do esôfago.

46

47

O Quadro 3 mostra a avaliação da miosite, da fibrose de substituição e intersticial

e do número de mastócitos na muscular circular do cólon, nos grupos não chagásico,

chagásico sem mega e chagásico com mega.

Quadro 3 - Miosite, fibrose de substituição e intersticial e número de mastócitos na muscular circular do cólon, em cada caso, nos grupos não chagásico, chagásico sem mega e com mega.

Caso Grupo Miosite Fibrosesubstituição

Fibroseintersticial

Número de mastócitos

1 NC - - - 82 NC - - - 03 NC - - - 24 NC - - - 05 NC - - - 16 NC - - - 17 NC - - - 18 NC - - - 09 NC - - - 010 NC - - - 2011 NC - - - 2412 NC - - - 113 CSM + - - 314 CSM + + + 515 CSM - - - 016 CSM - - + 117 CSM + - - 018 CSM + - - 4219 CSM - - - 120 CSM - - - 021 CSM - + - 11122 CSM + - - 4923 CCM + + ++ 3024 CCM ++ ++ +++ 2925 CCM - ++ +++ 2526 CCM ++ ++ + 727 CCM - ++ ++ 3128 CCM + ++ +++ 1

NC: não chagásico; CSM: chagásico sem mega; CCM: chagásico com mega; - : ausente; + : discreta; ++ : moderada; +++ : intensa.

Quando realizamos o Teste exato de Fisher para compararmos a presença ou

ausência de miosite entre os grupos chagásico sem mega e chagásico com mega não

encontramos diferença estatisticamente significante (p = 1,0000).

Como observa-se no Quadro 3 não havia fibrose de substituição e/ou intersticial

na muscular circular do cólon em nenhum caso do grupo não chagásico (Figura 18).

48

No grupo chagásico sem mega observou-se fibrose de substituição (Figura 19) em

2 (20%) dos 10 casos e intersticial em outros 2 (20%) casos.

Nos chagásicos com megacólon, havia aumento evidente do tecido conjuntivo

fibroso em todos os 6 (100%) casos, com freqüentes focos de fibrose tanto de substituição

quanto intersticial (Figura 20).

49

50

Quando realizamos o Teste exato de Fisher para compararmos a presença ou

ausência de fibrose de substituição no cólon entre os grupos chagásico sem mega e

chagásico com mega, observamos que há diferença estatisticamente significante (p =

0,0070), sendo mais freqüente no megacólon. Essa fibrose poderia ter relação com antigos

focos de miosite, pela destruição das miocélulas. Quando comparamos a fibrose intersticial

nos mesmos grupos, observamos também diferença estatisticamente significante (p =

0,0070), sendo mais freqüente e intensa no megacólon.

51

DISCUSSÃO

52

Em nosso estudo comparamos o número de mastócitos no esôfago e cólon de

chagásicos crônicos com e sem megacólon em relação a não chagásicos; porém, não

conseguimos demonstrar diferença entre os grupos.

Não encontramos na literatura nenhum estudo feito simultaneamente nesses dois

órgãos. Existem estudos isolados do esôfago e do cólon.

Com relação ao estudo do esôfago nossos dados estão de acordo com os de

ADAD et al. (1992), que também não encontraram diferença significante entre chagásicos

com mega, sem mega e não chagásicos. Estão em desacordo com o estudo de PEREIRA et

al. (1992), que avaliaram 20 casos de chagásicos crônicos sem megaesôfago em relação aos

controles, encontrando maior número de mastócitos nos chagásicos. Talvez essa diferença

entre nosso estudo e o de PEREIRA et al. (1972) decorra do menor número de casos que

avaliamos, porque embora os valores médios da contagem de mastócitos tenham sido

maiores nos chagásicos com e sem mega em relação aos controles, a diferença não foi

estatisticamente significante. Infelizmente não conseguimos aumentar nosso número de

casos devido a dificuldade em obter chagásicos com megaesôfago e megacólon

53

simultaneamente, que tivessem sido submetidos à necrópsia. No início deste estudo

coletamos e avaliamos vários casos só com megacólon ou apenas com megaesôfago;

acabamos por excluí-los no final porque os grupos ficavam mistos, dificultando

entendimento e comparação do esôfago e cólon no mesmo indivíduo.

Na realidade até mesmo aumentar o número de casos de chagásicos sem

megas foi difícil porque necrópsias já realizadas anteriormente às vezes não tinham o anel

completo do esôfago e cólon nos locais padronizados para este estudo.

Quanto ao número de mastócitos no cólon, nossos dados concordam com os

de ADAD et al. (1997), que também não encontraram diferença significante entre

chagásicos com megacólon, sem megacólon e não chagásicos. Esses autores também

trabalharam com pequeno número de casos. Ao aumentar o número de casos, PINHEIRO

(2000) e PINHEIRO et al. (2003), conseguiram demonstrar maior número de mastócitos

nos chagásicos com megacólon. No presente estudo, assim como já referido para o esôfago,

notou-se uma tendência dos valores médios de mastócitos no cólon serem maiores nos

chagásicos em relação aos não chagásicos (p = 0,07), porém a diferença não foi

estatisticamente significante. Outro fator que deve ser lembrado como causa de dificuldade

neste presente estudo é que os casos foram todos de necrópsia, o que certamente implica

em maior grau de autólise que o ocorrido no material de PINHEIRO (2000) e PINHEIRO

et al. (2003), que tinham em seu material vários casos de megacólon obtidos por cirurgia. A

autólise pode interferir na afinidade tintorial das células. Entretanto, como queríamos

comparar esôfago e cólon dos mesmos indivíduos só foi possível trabalhar com material de

necrópsia.

O dado mais interessante deste estudo é sem dúvida a demonstração de que a

muscular do esôfago é muito mais rica em mastócitos do que a do cólon. Esse dado é

inédito. Não encontramos na literatura nenhum estudo comparativo entre o cólon e o

54

esôfago, seja em controles ou em chagásicos, com relação a mastócitos. Parece-nos

importante porque o mastócito é uma célula que pode contribuir para a amplificação do

processo inflamatório favorecendo maior inflamação no esôfago. Esse dado talvez possa ter

relação, pelo menos em parte, com o achado de ADAD et al. (2000) que encontraram maior

freqüência e intensidade de miosite no esôfago, em relação ao cólon de chagásicos

crônicos. Em nosso material também parece ter ocorrido essa tendência, embora o número

de casos de mega do presente estudo seja pequeno.

Acreditamos que diferença estruturais, histológicas, entre órgãos são

importantes para explicar aspectos patogenéticos. Foi demonstrado anteriormente, em

estudo do nosso grupo (ETCHEBEHERE, 2001), que o esôfago e o cólon diferem com

relação aos gânglios do sistema nervoso entérico. A vascularização dos gânglios esofágicos

pode favorecer ganglionite e denervação mais rápida e intensa e, de modo semelhante, a

maior quantidade de mastócitos poderia favorecer maior grau de miosite e talvez de

fibrose.

A fibrose na muscular circular do esôfago e do cólon é mais evidente e intensa

nos casos de chagásicos com megas, apresentando-se em parte, como de substituição e em

parte, intersticial. Acreditamos que a fibrose de substituição nos megas representaria uma

seqüela da miosite, como já foi demonstrado em estudos de megaesôfago (TAFURI et al.

1971; TAFURI, RASO, 1983; ADAD, 1989) e também de megacólon chagásico, sendo

que ADAD (1996) descreveu ter observado proliferação fibroblástica incipiente em focos

de miosite destrutiva.

Para TAFURI, RASO (1983) a fibrose intersticial não estaria relacionada

com a inflamação. Poderia ser decorrente da estruturação da substância fundamental por

enzimas circulantes provenientes de fibroblastos distantes da área de fibrose ou poderia

estar relacionada à mastocitose presente na doença de Chagas experimental e humana.

55

Todavia em nosso estudo, não foi possível demonstrar relação entre mastocitose e fibrose,

talvez devido ao pequeno número de casos. Acreditamos na possibilidade da fibrose

intersticial ser decorrente, pelo menos em parte, de um aumento inespecífico do conjuntivo

de sustentação, acompanhando a hipertrofia das miocélulas como é visto por exemplo na

cardiopatia hipertensiva. Essa possibilidade está sendo levantada também pelo fato de que

a fibrose intersticial no megacólon foi semelhante a encontrada no megaesôfago, apesar do

esôfago ser muito mais rico em mastócitos que o cólon.

Em conclusão, não encontramos na literatura estudos que comparem o número de

mastócitos na muscular circular do cólon e do esôfago, mas apenas estudos isolados. A

análise global desses resultados permite concluir que o número de mastócitos no esôfago é

muito maior que no cólon em todos os grupos, o que indica uma diferença estrutural entre

esses dois órgãos. Com relação à mastocitose em chagásicos, não foi possível, com o

número de casos estudados, estabelecer diferença.

56

CONCLUSÃO

57

1. Na muscular do esôfago, não houve diferença estatisticamente significante entre o

número de mastócitos nos chagásicos com megaesôfago em relação aos chagásicos

sem mega e aos não chagásicos.

2. Na muscular circular do cólon não houve diferença, estatisticamente significante,

entre o número de mastócitos nos chagásicos com megacólon em relação aos

chagásicos sem mega e aos não chagásicos.

3. O número de mastócitos no esôfago foi muito maior que no cólon em todos os

grupos, o que indica uma diferença estrutural entre esses dois órgãos.

4. Não houve diferença estatisticamente significante entre a freqüência de miosite no

grupo chagásico com mega em relação aos chagásicos sem mega.

5. Fibrose de substituição e fibrose intersticial foram vistas mais frequentemente no

grupo chagásico com mega em relação aos chagásicos sem mega.

58

RESUMO

59

Com o objetivo de avaliar comparativamente o número de mastócitos na

muscular do esôfago e do cólon normal e, verificar se existe aumento do número de

mastócitos no esôfago e cólon de chagásicos crônicos com e sem mega, contamos o

número de mastócitos e avaliamos semi-quantitativamente a miosite e a fibrose visando

contribuir para a patogênese das lesões dos megas chagásicos.

Foram estudados 28 casos de necrópsias sendo 12 controles não chagásicos, 10

chagásicos sem megas e 6 chagásicos com megaesôfago e megacólon. Foram retirados um

anel na transição reto-sigmóide e outro no terço inferior do esôfago, a 5 cm da cárdia de

todos os casos. Os anéis foram fixados em formol a 4% e processados para inclusão em

parafina. Os cortes histológicos foram corados pelas técnicas de Hematoxilina-Eosina,

Giemsa e Tricrômico de Masson.

Os mastócitos foram contados em 64 campos do microscópio de luz comum,

marca LEICA, modelo DIASTAR (área total: 12,6mm²), em cortes corados pela técnica de

Giemsa. Avaliou-se semi-quantitativamente a miosite e o tecido conjuntivo fibroso em

60

cortes corados pela técnica de Hematoxilina-Eosina e Tricrômico de Masson. Essas

alterações foram classificadas em discreta, moderada ou intensa.

As conclusões seguintes sintetizam nossa análise:

1. Na muscular do esôfago não houve diferença, estatisticamente significante,

entre o número de mastócitos nos chagásicos com megaesôfago em relação aos chagásicos

sem mega e aos não chagásicos.

2. Na muscular circular do cólon não houve diferença, estatisticamente

significante, entre o número de mastócitos nos chagásicos com megacólon em relação aos

chagásicos sem mega e aos não chagásicos.

3. O número de mastócitos no esôfago foi muito maior que no cólon em todos

os grupos, o que indica uma diferença estrutural entre esses dois órgãos.

4. Não houve diferença estatisticamente significante entre a freqüência de

miosite no grupo chagásico com mega em relação aos chagásicos sem mega.

5. Fibrose de substituição e fibrose intersticial foram vistas mais freqüentemente

no grupo chagásico com mega em relação aos chagásicos sem mega.

61

ABSTRACT

62

EVALUATION OF THE MAST CELLS IN THE CIRCULAR MUSCULATURE OF

THE ESOPHAGUS AND COLON OF CHRONIC CHAGA´S DISEASE WITH AND

WITHOUT MEGA

With the objective of comparatively evaluate the number of mast cells in the

circular musculature of the esophagus and the normal colon, and to verify if there is an

increase of the number of mast cells in the esophagus and colon of chronic chagasics with

and without mega, we counted the number of mast cells and evaluated semi-qualitatively

myositis and fibrosis aiming to contribute to the pathogenesis of the lesions of mega

chagasic ones.

28 cases of necropsy were studied, being 12 non-chagasic controls, 10 chagasic

without megas and 6 chagasic with megacolon and megaesophagus. A ring in the rectal

sigmoid transition was drawn and another one in the lower third of the esophagus, 5 cm of

the cardia of all the cases. The rings were fixed in formol 4% and processed for an

63

inclusion in paraffin. Histological cuts were stained by the hematoxylin-eosin, Giemsa and

Tricrômico of Masson techniques.

Mast cells were counted in 64 microscopic fields of common light, LEICA-

DIASTAR model (total area: 12. 6mm², in cuts stained by Giemsa technique. Myositis was

semi-quantitatively evaluated and the fibrous connective tissue in cuts stained by

hematoxylin-eosin and Tricrômico of Masson techniques. These alterations were classified

in discrete, moderate or intense ones.

The following conclusions synthesize our analysis:

1. In the musculature of the esophagus there was no statistically significant difference

between the number of mast cells in the chagasic subjects with megaesophagus,

related to the chagasic ones without mega and to the non-chagasic ones.

2. In the musculature of the colon there was no statistically significant difference

between the number of the mast cells in the chagasic subjects with megacolon,

related to the chagasic ones without mega and to the non-chagasic ones.

3. The number of mast cells in the esophagus was much higher than in the colon in all

of the groups, what indicates a structural difference between these two organs.

4. There was not a statistically significant difference between the frequency of

myositis in the chagasic group with mega related to the chagasic ones without

mega.

5. Substitution fibrosis and interstitial fibrosis were seen more frequently in the

chagasic group with mega, related to the chagasic ones without mega.

64

NORMAS TÉCNICAS ADOTADAS

65

ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS E TÉCNICAS. Referências Bibliográficas: NBR-6023. Rio de Janeiro, 1989, 19p.

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ANEXOS

80

Anexo 1- Idade, sexo, cor e principais dados anatomoclínicos do grupo não chagásico.CASO IDADE

(anos)SEXO COR OBSERVAÇÕES

1 54 M B Doença hipertensiva; aneurisma dissecante de aorta2 79 M B Cardiopatia isquêmica; aneurisma cerebral3 85 M NB Pós-operatório de aneurisma de aorta; infarto agudo do

miocárdio4 47 M NB Traumatismo crânio-encefálico5 34 M B Infarto agudo do miocárdio6 25 F NB Trombose venosa e infarto cerebral7 48 M NB Cardiopatia hipertensiva8 56 M B Epilepsia há 20 anos; empiema pleural9 45 M B Etilismo crônico; pancreatite aguda10 68 M B Aneurisma sacular roto de aorta; cardiopatia hipertensiva11 45 F B Embolia pulmonar12 50 M B Cardiopatia hipertensiva

M = masculino; F = feminino; B = branco; NB = não branco

81

Anexo 2 - Idade, sexo, cor e principais dados anatomoclínicos do grupo chagásico sem megas.CASO IDADE

(anos)SEXO COR OBSERVAÇÕES

13 61 M NB Cardiopatia chagásica crônica14 66 M B Cardiopatia chagásica crônica15 47 F NB Cardiopatia chagásica crônica com ICC16 70 M B Cardiopatia chagásica crônica com ICC17 40 M NB Cardiopatia chagásica crônica com ICC18 47 F NB Cardiopatia chagásica crônica19 42 M B Cardiopatia chagásica crônica com ICC20 70 M NB Cardiopatia chagásica crônica com ICC21 84 F B Cardiopatia chagásica crônica e adenocarcinoma de ceco22 68 F NB Pneumonia e Cardiopatia chagásica crônica com ICC

M = masculino; F = feminino; B = branco; NB = não branco; ICC = insuficiência cardíaca congestiva. O diagnóstico de cardiopatia chagásica crônica nesse grupo foi feito com base principalmente nos achados necroscópicos, associados à sorologia positiva para doença de Chagas e, eventualmente, a dados clínicos, eletrocargiográficos, ou radiológicos, quando disponíveis.

82

Anexo 3 - Idade, sexo, cor e principais dados anatomoclínicos e radiológicos do grupo chagásico com megaesôfago e megacólon

CASO IDADE(anos)

SEXO COR OBSERVAÇÕES

23 43 M B Cardiopatia chagásica crônica24 54 M NB Cardiopatia chagásica crônica25 53 M NB Cardiopatia chagásica crônica, fecaloma26 72 M B Cardiopatia chagásica crônica, politraumatismo27 67 M NB Megaesôfago operado há 2 anos, desnutrição e

broncopneumonia28 43 F B Cardiopatia chagásica crônica

M = masculino; F = feminino; B = branco; NB = não branco. O diagnóstico de cardiopatia chagásica nesse grupo foi feito com base principalmente nas alterações eletrocargiográficas, associadas aos dados do exame físico, radiológico e sorologia positiva para doença de Chagas.

83