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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
JOSELIA CRISTINA DE OLIVEIRA MOREIRA
“DETECÇÃO E ISOLAMENTO DE NOROVÍRUS EM COLÔNIAS DE RATOS DE
LABORATÓRIO (Rattus norvergicus)”.
CAMPINAS
2016
JOSELIA CRISTINA DE OLIVEIRA MOREIRA
“DETECÇÃO E ISOLAMENTO DE NOROVÍRUS EM COLÔNIAS DE RATOS DE
LABORATÓRIO (Rattus norvergicus)”.
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências.
ORIENTADOR: PROF. DR. FERNANDO FERREIRA COSTA
COORIENTADOR: PROFA. DRA. DULCINÉIA MARTINS DE ALBUQUERQUE
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA JOSELIA CRISTINA DE OLIVEIRA MOREIRA, E ORIENTADO PELO PROF. DR. FERNANDO FERREIRA COSTA.
CAMPINAS
2016
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): Não se aplica.
Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas Ana Paula de Morais e Oliveira - CRB 8/8985
Moreira, Joselia Cristina de Oliveira, 1982- M813d Detecção e isolamento de norovírus em colônias de ratos de laboratório
(Rattus norvergicus) / Joselia Cristina de Oliveira Moreira. – Campinas, SP:
[s.n.], 2016.
MorOrientador: Fernando Ferreira Costa.
MorCoorientador: Dulcinéia Martins de Albuquerque. MorDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas,
Faculdade de Ciências Médicas.
Mor1. Norovirus. 2. Ratos. I. Costa, Fernando Ferreira,1950-. II.
Albuquerque, Dulcinéia Martins. III. Universidade Estadual de Campinas.
Faculdade de Ciências Médicas. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Detection and isolation of norovirus in laboratory rat
colonies (Rattus norvergicus) Palavras-chave em inglês: Norovirus Rats Área de concentração: Fisiopatologia Médica
Titulação: Mestra em Ciências Banca examinadora: Fernando Ferreira Costa
Mário Ângelo Claudino
Delma Pegolo Alves Data de defesa: 21-12-2016 Programa de Pós-Graduação: Fisiopatologia Médica
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
JOSELIA CRISTINA DE OLIVEIRA MOREIRA
ORIENTADOR: PROF. DR. FERNANDO FERREIRA COSTA
COORIENTADOR:PROFA. DRA. DULCINÉIA MARTINS DE ALBUQUERQUE
MEMBROS:
1. PROF. DR. FERNANDO FERREIRA COSTA
2. PROFA. DRA. DELMA PEGOLO ALVES
3. PROF. DR. MÁRIO ÂNGELO CLAUDINO
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências
Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora
encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Data: 21/12/2016
DEDICATÓRIA
À minha família que esteve ao meu lado durante esta jornada,
compartilhando momentos de alegria e me apoiando e incentivando nos momentos
difíceis para que eu nem ao menos sonhasse em desistir.
A vocês família, razão do meu viver, dedico este trabalho.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a este Deus maravilhoso que me sustentou, honrou e colocou
em minha vida estas pessoas maravilhosas a quem vou agradecer.
Ao meu marido Anderson Moreira pelo amor e compreensão dedicados a
mim; suportando as minhas ausências e ansiedades com toda paciência.
À minha mãe Joana Bento Batista de Oliveira pela dedicação
incondicional, pela força e estímulo; meu exemplo de vida e mulher.
Ao meu pai José Rosa de Oliveira, meus irmãos Tiago e Paulo Henrique
pelo apoio de sempre.
Ao meu filho do coração Lucas Batista pelos momentos de alegria e
descontração. E à minha Lívia que mesmo na barriga da mamãe já me faz realizada
e me dá forças pra seguir em frente.
Ao meu orientador Prof. Dr. Fernando Ferreira Costa que aceitou me
orientar sem mesmo me conhecer, meu muito obrigado.
À minha co-orientadora Dulcinéia Martins de Albuquerque, esta
profissional excepcional, inteligente e dedicada a qual aprendi a admirar e a
respeitar, mais que obrigada, você ajudou a iluminar meus caminhos.
À idealizadora deste projeto, Daniele Masselli Rodrigues Demolin uma
mulher guerreira, a companheira de todas as horas, de todos os momentos, a
profissional, a amiga e uma irmã. Com você aprendi tudo o que sei meu muitíssimo
obrigado
Ao meu irmão do coração Robson da Silva Pontes, por sempre estar
presente na minha vida, amizade assim poucos podem dizer que tem.
À minha amiga Clarice Yukari Minagawa Issei, uma companheira que
levarei para sempre em meu coração, obrigada por sempre estar disposta a me
ajudar e orientar em momentos difíceis.
À Euma da Cunha Ramos que em tão pouco tempo tornou-se tão
importante em minha vida.
À Jéssica Stoppa Viana, por ser mais que uma simples estagiária, por ser
uma amiga sempre cuidando de mim.
Aos meus companheiros de equipe do laboratório Lenira Aparecida
Guaraldo de Andrade e Silvio Rogério Cardoso dos Santos pela compreensão de
sempre.
Ao diretor do CEMIB/UNICAMP Prof. Dr Rovilson Gilioli pelo apoio no
desenvolvimento deste projeto.
Aos meus colegas de trabalho do Centro Multidisciplinar para a
Investigação Biológica - Cemib/Unicamp, meu muito obrigado por me acolherem e
me apoiarem. Por todas as áreas que passei fui sempre muito bem recebida.
Ao André Benevides Pires da informática do CEMIB, pela ajuda em
diversos momentos.
Ao Marcos Alexandre Finzi Coratti pela ajuda no início deste projeto e
mais, por me apresentar à equipe do Laboratório do prof. Fernando (Hemocentro).
A esta equipe sensacional do Laboratório de Hemoglobinopatias do Prof.
Fernando e da Dra. Dulcinéia que sempre me recebeu muito bem e me acolheu
como membro da equipe.
Ao André Schwambach Vieira que sempre esteve disposto a me ajudar,
seja qual fosse minha necessidade.
Aos alunos Alexandre Hilário Matos, Amanda Morato do Canto e Beatriz
Bertelli que me ajudaram no Western Blotting.
À Dioze e à Sandra Brambila que me ajudaram cedendo reagentes.
Às meninas do LNBio, Renata Rocha de Oliveira e Sami Yokoo que me
auxiliaram com a ultracentrífuga mesmo sem me conhecer.
À Izi do Núcleo de Medicina Experimentalpela ajuda com as fotos de
fluorescência.
Ao Francisco de Assis da Silva (Chico) do Parque Ecológico, pela ajuda
com os ratos silvestres.
A todos pela ajuda inestimável, meu mais profundo obrigado.
RESUMO
Norovírus (NoV) é um agente infeccioso de amplitude mundial, sendo o principal
responsável por causar surtos de gastroenterites virais em crianças, idosos e
indivíduos imunocomprometidos. Assim como em humanos, a infecção por NoV
também ocorre em diversos modelos animais: camundongos, cães, gatos, bovinos e
suínos. Recentemente, o vírus foi identificado em ratos de laboratório (Rattus
novergicus), mas até o momento, não há relatos de seu isolamento em cultura
celular ou de metodologias para detecção deste vírus em amostras de ratos. Diante
disso, este estudo tem por objetivo realizar o isolamento celular de NoV de colônias
de ratos e implantar técnicas de diagnóstico molecular, semi-nested RT-PCR e a
técnica sorológica de IFI para monitoramento sanitário deste agente. Para o
isolamento do vírus, suspensões de fezes de ratos convencionais foram inoculadas
em células permissivas de macrófago RAW 264.7, até a observação de efeito
citopático. A reação de semi-nested RT-PCR foi estabelecida com primers
específicos para a região conservada do capsídeo (VP1) e utilizada para
confirmação do isolamento viral. A implantação destas metodologias auxiliou no
estabelecimento de um programa de monitoramento sanitário e na determinação da
prevalência molecular (12%) e sorológica (11,45%) deste vírus nas colônias de rato
de biotérios brasileiros. Análises moleculares dos isolados virais demonstraram uma
identidade de nucleotídeos de 98% com a mesma região das cepas padrão de rato,
resultando no depósito da primeira cepa brasileira de NoV de rato no GenBank
KU169124, bem como o estabelecimento das metodologias de diagnóstico para
norovírus.
Palavras Chave: Norovírus, Ratos.
ABSTRACT
Norovirus (NoV) is a high prevalent viral agent of worldwide and responsable to
cause outbreaks of gastroenteritis in children, elderly and immunocompromised
individuals. As well as in humans the NoV infection occurs in several animal models:
mice, dogs, cats, cattle and pigs. Recently, the virus was identified in laboratory rats
(Rattus novergicus), so far there are no reports of its isolation or establishment of
diagnostic methods for the detection of this virus in rat samples. This study aimed to
isolate NoV of rat colonies and the establishment of a semi-nested RT-PCR and
Indirect Immunofluorescence to monitoring this agent. For virus isolation,
suspensions of feces were inoculated in a permissive cell line RAW 264.7 until
presentation of citopatic effects. The semi-nested reaction was established using
specifics primers to conserved region of the capside protein (VP1) and used to
confirm the viral isolation. These methodologies contributed in the establishing of a
health monitoring program and determining the molecular (12%) and serologic
(11.45%) prevalence of this virus in the rat colonies of Brazilian animal facilities.
Molecular analysis showed 98% of nucleotide identity between our isolate and the
same region of rat prototype, resulting in the deposit of our isolate in the GenBank
KU169124 and the establishment of diagnostic methodologies.
Keywords: Norovirus, Rats.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Árvore filogenética. Classificação dos Norovírus. ........................................... 20 Figura 2: Estrutura e organização do genoma dos Norovírus. ....................................... 21
Figura 3: RAW 264.7 normal. .............................................................................................. 47 Figura 4: Efeito citopático de norovírus de rato em células RAW 264.7. 48
Figura 5: Efeito citopático de norovírus em células RAW 264.. ..................................... 48
Figura 6: Eletroforese em gel de agarose 2% corado com GelRedTM, dos produtos amplificados pela semi-nested RT-PCR. ........................................................................... 50
Figura 7: Cromatograma e sequência consenso de isolado celular...........................51
Figura 8: Depósito da cepa de norovírus de rato no GenBank. ..................................... 52 Figura 9: Ensaio de placa ..................................................................................................... 53
Figura 10: Western Blotting 54
Figura 11: Eletroforese em gel de agarose 2% corado com GelRed TM dos produtos amplificados pela semi nested.. .......................................................................................... 55
Figura 12: Detecção de norovírus em amostras de fezes de rato. ................................ 56
Figura 13: Detecção de norovírus de rato em biotérios brasileiros ............................... 56
Figura 14: Alinhamento das sequências de nucleotídeos das cepas protótipo de norovírus. ................................................................................................................................ 58 Figura 15: Árvore filogenética de norovírus. ..................................................................... 60
Figura 16: Reação de Imunofluorescência indireta .......................................................... 62
Figura 17: Reação de Imunofluorescência indireta de amostras negativas. .............. 62
Figura 18: Detecção de anticorpos específicos contra NoV de rato por Imunofluorescência Indireta. ................................................................................................ 63
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Primers utilizados para identificação molecular .............................................. 39 Tabela 2: Primer utilizado na PCR controle ...................................................................... 40
Tabela 3: Sequências referência utilizadas neste estudo ............................................... 43 Tabela 4: Amostras positivas isoladas de RAW 264.7 em diferentes passagens. ..... 50
Tabela 5: Cálculo de Unidades Formadoras de Placa (PFU/mL) .................................. 53
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Matriz de identidade.......................................................... 59.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
UNICAMP - Universidade Estadual de Campinas
CEMIB - Centro Multidisciplinar para a Investigação Biológica na Área da Ciência de
Animais de Laboratório
ICLAS - International Concil for Laboratory Animal Science
FELASA - Federation of European Laboratory Animal Science Association
PEP Program - Performance Evaluation Program for Diagnostic Laboratories
CDC - Centers for Disease Control and Prevention
NoV - Norovírus
NoVs - Noroviroses
MNV - Norovírus murino
HuNoV - Norovírus humano
SPF - Specific Pathogen Free
SFB - Soro Fetal Bovino
AANE - Aminoácidos não essenciais
PBS - Phosphate Buffered Saline
AA - Aminoácidos
DEPC - Dietilpirocarbonato
DMEM - Dulbecco´s Modified Eagle Medium
kDa - kilodalton
ECP - Efeito Citopático
HBGAs - Histo-blood group antigens
FUT- Fucosil transferases
IFN - Interferon
IL10 - Interleucina 10
VPg - Viral protein genome-linked
SRSV - Small Round Structured Virus
ORF - Open Reading Frames
RAG - Recombination Activating Gene
STAT-1 - Signal Transducer and Activator of Transcription 1
MFIA - Multiplexed Fluorescence Immuno Assay®
IFI - Imunofluorescência Indireta
PFU - Plaque Forming Unit
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 17
1.1 Histórico ......................................................................................................................... 17
1.2 Estrutura e classificação ................................................................................................. 18
1.3 Transmissão e patogenia dos Norovírus ......................................................................... 20
1.4 Estabilidade e inativação dos Norovírus ........................................................................ 22
1.5 Norovírus Murino ........................................................................................................... 22
1.6 Norovírus em Cultura Celular ........................................................................................ 24
1.7 Imunidade ....................................................................................................................... 25
1.8 Vacina para Norovírus .................................................................................................... 27
1.9 Norovírus em Ratos ........................................................................................................ 28
2- OBJETIVOS ........................................................................................................................ 31
2.1 Objetivo Geral ................................................................................................................ 31
2.2 Objetivos Específicos ..................................................................................................... 31
3- MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................ 32
3.1 Obtenção do Material Biológico..................................................................................... 32
3.1.1 Linhagem celular. .................................................................................................... 32
3.1.2 Amostras de fezes para isolamento de Norovírus em células ................................. 33
3.1.3 Amostras de fezes para teste na reação semi-nested RT-PCR ................................ 33
3.1.4 Amostras de plasma ................................................................................................. 33
3.1.5 Preparo da suspensão de fezes ................................................................................. 33
3.2 Isolamento viral .............................................................................................................. 34
3.2.2 Ensaio de placa ........................................................................................................ 34
3.2.3 Preparo da agarose 3% ............................................................................................ 35
3.2.4 Inóculo viral ............................................................................................................. 35
3.2.5 Precipitação em cloreto de cálcio ............................................................................ 36
3.2.6 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page) ................................................. 36
3.2.7 Western Blotting ...................................................................................................... 37
3.3 Extração de RNA Viral................................................................................................... 37
3.3.1 Kit QIAmp® Viral RNA mini kit ............................................................................. 37
3.3.2 TRIzol™ .................................................................................................................. 38
3.3.3 Desenho do primers ................................................................................................. 38
3.4 Reações Moleculares ...................................................................................................... 39
3.4.1 Transcrição Reversa (RT-PCR) e Semi-Nested RT-PCR ....................................... 39
3.4.2 PCR controle ............................................................................................................... 40
3.4.3 Purificação ............................................................................................................... 40
3.4.4 Clonagem da sequência de DNA ............................................................................. 41
3.4.5 Ligação .................................................................................................................... 41
3.4.6 Transformação ......................................................................................................... 41
3.4.7 Plaqueamento .......................................................................................................... 41
3.4.8 Extração de DNA plasmidial ................................................................................... 42
3.4.9 Sequenciamento ....................................................................................................... 42
3.4.10: Análise do sequenciamento .................................................................................. 42
3.4.11 Medidas para minimizar riscos de contaminação nas reações moleculares .............. 44
3.5 Reações sorológicas ........................................................................................................ 44
3.5.1 Produção de soros policlonais anti-NoV em ratos................................................... 44
3.5.2 Produção de lâminas para Imunofluorescência Indireta .......................................... 45
3.5.3 Reação de Imunofluorescência Indireta (IFI) .......................................................... 45
4 Resultados .............................................................................................................................. 47
4.1 Isolamento viral .............................................................................................................. 47
4.2 Ensaio de placa ............................................................................................................... 52
4.3 Precipitação com cloreto de cálcio e Western Blotting .................................................. 53
4.5.1 Produção de soros policlonais ................................................................................. 61
4.5.2 Imunofluorescência Indireta (IFI) .......................................................................... 61
5 Discussão ............................................................................................................................... 64
6. Conclusões ............................................................................................................................ 71
5 REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 72
17
1 INTRODUÇÃO
Norovírus (NoV) são vírus muito contagiosos e geneticamente diversos,
que afetam uma grande parcela da população mundial. A suscetibilidade a estes
vírus é evidenciada em pessoas de todas as idades, principalmente em crianças
menores de cinco anos e idosos, que geralmente precisam de hospitalização e
cuidados especiais1,2.
A infecção por NoV acontece no intestino delgado, caracterizada
pelo encurtamento das microvilosidades que provocam lesões na mucosa do
intestino, causando a diarréia. Outras alterações como o aumento no número de
linfócitos T citotóxicos intraepiteliais, mudanças típicas de apoptose nas células
epiteliais também são descritas durante a infecção em humanos3.
O vírus ainda tem sido descrito em humanos e animais, sendo conhecido
por causar diversas doenças e lesões que acometem ampla variedade de espécies
hospedeiras, tornando-se assim, um patógeno de importância pública. Desta forma o
estudo da doença causada por este vírus, se tornou incontestável, mas a falta de um
sistema de cultivo celular para os norovíurs humanos (HuNoV) tem dificultado o
esclarecimento da patologia causada por NoV 4.
Embora a biologia molecular tenha trazido avanços significativos para o
diagnóstico da doença causada por NoV, a descoberta do norovírus murino (MNV),
único NoV capaz de se replicar em cultura celular, possibilitou o melhor
entendimento da doença causada por esse vírus.
1.1 Histórico
Epidemias de gastroenterites virais em seres humanos foram
primeiramente descritas em 1929 por Zahorsky 5. Inicialmente denominada de
“winter vomiting disease”, esta doença, até então desconhecida, caracterizava-se
por episódios súbitos de vômitos e diarréia que se apresentavam nos períodos mais
18
frios. Suspeitava-se da presença de um agente viral como causador da doença,
porém seu isolamento e identificação não foram possíveis pelos métodos
tradicionais de cultura celular 6.
Este agente viral foi descrito em 1968, quando pacientes, voluntários
foram desafiados com filtrado fecal obtidos de um grupo de estudantes, afetados por
um surto de gastroenterite na cidade de Norwalk, Ohio, EUA. A partícula viral foi
inicialmente denominada de “Norwalk-like virus” ou “small round structured virus”
(SRSV), os quais são vírus não cultiváveis, conhecidos atualmente como Norovírus7.
Em 1972, Kapikian e colaboradores descreveram a etiologia desta
síndrome pela utilização da imunomicroscopia eletrônica. Esta técnica foi a primeira
ferramenta usada para identificar o NoV tornando-se também importante para
caracterização de outros vírus entéricos, embora tenha se mostrado uma técnica
demorada e pouco sensível 8,9.
Além da imunomicroscopia eletrônica, os ensaios imunológicos
desenvolvidos durante o final da década de 1970 e durante os anos 80 também
tiveram grande importância dentre as metodologias adotadas para a detecção do
NoV. O progresso da biologia molecular permitiu a clonagem e sequenciamento
completo de seu genoma, o que tornou possível os avanços no estudo de sua
infecção 10.
Desde então este vírus tem sido descrito em humanos e animais, sendo
conhecido por causar diversas doenças e lesões que acometem ampla variedade de
espécies hospedeiras 4.
1.2 Estrutura e classificação
Norovírus pertence à família Caliciviridae, que segundo a classificação
proposta pelo Comitê Internacional de Taxonomia Viral (ICTV) estão incluídos em
quatro gêneros: Vesivirus, Lagovirus, Sapovius, Nebovirus e Norovirus 11,12. Outros
gêneros, provisoriamente nomeados como Valovirus (suínos) e virus Tulane-like
(macaco rhesus) foram propostos para compor esta mesma famíia 13.
19
Dentre os Calicivirus, membros dos gêneros Sapovirus e Norovirus são
considerados os agentes patogênicos de maior importância, apresentando um clado
filogenético distinto, onde os membros compartilham cerca de 98% da identidade
dos aminoácidos para a sequência completa da proteína do capsídeo.14,15,16.
A análise filogenética da sequência de aminoácidos dividiu o gênero
Norovirus em seis genogrupos (G), onde os GI, GII e GIV são os responsáveis por
Noroviroses (NoVs) humanas 17,18,19, GII infecta suínos 20, GIII infecta bovinos 21
enquanto gatos, camundongos e cães pertencem aos genogrupos IV, V e VI 22, 23, 24
respectivamente de acordo com a figura 1.
Todos os membros desta família apresentam capsídeo icosaédrico, com
diâmetro entre 27 e 40 nm, genoma de RNA fita simples, linear com polaridade
positiva, poliadenilado na extremidade 3’ e com 7,5 kilobases (Kb) de tamanho
(figura 2). Na extremidade 5’ apresentam uma proteína ligada covalentemente,
denominada VPg (genome-linked viral protein). A VPg está presente tanto no RNA
genômico quanto no subgenômico, o qual é transcrito para codificar as proteínas
estruturais do vírus 18,25, 26.
O genoma contém três regiões abertas de leitura (Open Reading Frames
– ORF), que são responsáveis por codificar as proteínas estruturais e não
estruturais. A ORF1 codifica uma poliproteína de 195 kDa não estrutural que é
clivada por uma 3C-like proteinase 25, 27, 28. A ORF2 codifica a proteína viral VP1 de
cerca de 60 kDa,responsável pela formação da estrutura do capsídeo viral 29. A VP1
pode ser dividida em dois domínios: domínio S, na região amino terminal (N-
terminal), que é a mais conservada entre os Calicivirus, formando o envoltório
icosaédrico do capsídeo. Domínio P na região carboxi-terminal (C-terminal), onde se
formam a sequência mais variável, da proteína que contribui para a especificidade
das linhagens. A ORF3 codifica para uma proteína viral de 20 kDa, denominada VP2
e cuja função é promover a estabilidade da proteína do capsídeo 30.
Todos os genogrupos de NoV apresentam 3 ORFs, com exceção do MNV que
apresenta uma ORF adicional denominada ORF4. Esta foi identificada sobreposta à
ORF2 e caracterizada por produzir uma proteína chamada VF1 (fator de virulência
1), a qual está relacionada à todas as diferentes cepas de MNV. A função desta
20
nova ORF ainda não está totalmente esclarecida, mas sabe-se que está relacionada
a apoptose celular e à modulação da resposta a infecção 31.
Fonte: Adaptação, Vinjé, J. 2015
Figura 1: Árvore filogenética. Classificação dos Norovírus.
1.3 Transmissão e patogenia dos Norovírus
Estima-se que por ano cerca de 23 milhões de internações e 200.000
mortes em todo o mundo sejam causadas por este agente. Segundo o CDC (Center
for Disease Control and Prevention) somente nos Estados Unidos 50.000
internações e 300 mortes por ano são causadas por surtos de noroviroses 32. Desta
forma, este vírus foi classificado como um patógeno emergente entre os humanos,
dentre os quais crianças, idosos, imunocomprometidos e transplantados são os mais
susceptíveis 33.
Genogrupo I
Humano
Genogrupo III
Bovino
Genogrupo II
Humano e Suíno
Genogrupo VI
Canino
Genogrupo IV
Humano, felino, canino
Genogrupo V
Murino
Genogrupo VII
Canino
21
A transmissão em humanos e animais ocorre predominantemente pela via
oral-fecal 19 e a contaminação fecal em alimentos, água, fômites e o contato direto
(pessoa-pessoa) são responsáveis pela ocorrência da maioria dos surtos de
gastroenterite determinados por este vírus 34. A patogenia da infecção por NoV ainda
não está totalmente esclarecida, embora estudos epidemiológicos continuem sendo
realizados para sua melhor determinação.
Fonte: Adaptado, Donaldson et al., 2010.
Fonte: Adaptado, Karst et al., 2015.
Figura 2: Estrutura e organização do genoma dos Norovírus. A. Genoma do vírus. B.
Estrutura do capsídeo viral. C. Organização genomica de norovírus murino, único NoV que apresenta
a ORF 4 responsável pela produção da proteína VF1.
C
A
B
22
1.4 Estabilidade e inativação dos Norovírus
Os membros da família Calicivírus apresentam uma densidade de 1,33 a
1,41g/mL determinada por ultracentrifugação em cloreto de césio 5. Suas partículas
virais são estáveis a 56ºC e mantém sua infectividade em pH 2,7 por até três horas.
Quando mantidos a 4ºC diminuem minimamente seu poder de infecção, mas a
maioria são inativados em temperaturas de 63º a 72ºC 25.
Irradiações ionizantes e não ionizantes, altas concentrações de
hipoclorito, glutaraldeídos e compostos fenólicos são capazes de inativar alguns
calicivírus, embora não haja relatos específicos da eficiência deste método para o
norovírus murino (MNV). Devido à falta de modelos de cultura celular para os
Norovírus humanos, estudos para a determinação da estabilidade e inativação
destes vírus tornaram-se um fator de grande limitação, mas atualmente, devido a
estudos com cultura de células utilizando a cepa protótipo de NoV murino (MNV-1)
foi possível testar a resistência a uma grande variedade de tratamentos químicos e
físicos 35.
1.5 Norovírus Murino
O Norovírus murino (MNV) foi descrito pela primeira vez em 2003, em
camundongos knockout para os genes RAG2, gene ativador de recombinação
(recombination activating gene) e STAT-1 (signal transducer and activator of
transcription 1), genes tradutores de sinais e ativadores de transcrição. Estes
animais desenvolviam uma doença sistêmica causada até então por um patógeno
desconhecido, mas que poderia ser transmitido por inoculações intracerebrais
sucessivas. Tanto as linhagens RAG2/STAT1-/- e camundongos knockout para
receptores αβγ interferon (IFNαβγR-/-) quando infectados eram capazes de sucumbir
à infecção após 30 dias. Sinais clínicos de encefalite, vasculite, pneumonia e
hepatite também foram descritos nestes animais 23.
23
Métodos de diagnóstico baseados na análise da sequência de
nucleotídeos de outros NoVs foram realizados para confirmar e identificá-lo como
MNV-1 23. Desde então, MNV-1 foi considerado um patógeno entérico, altamente
virulento em linhagens imunodeficientes capaz de provocar infecção sistêmica, com
sinais de inflamação em tecidos como: pulmão, fígado, baço e peritônio 5, 36.
Em camundongos imunocompetentes, o vírus é capaz de induzir uma
infecção persistente com excreção de partículas virais infecciosas por períodos
prolongados 37.
Em 2006, três novas cepas de NoV foram descobertas e denominadas
MNV-2, MNV-3 e MNV-4. Estas diferem da cepa protótipo, MNV-1, pois são capazes
de induzir infecção persistente em camundongos imunodeficientes 38.
MNV se caracteriza por ser um dos patógenos mais prevalentes em
animais de laboratório 39. Dados de um levantamento sorológico realizado nos
Estados Unidos e Canadá entre 2003 e 2005 comprovaram que aproximadamente
30% de amostras de soros apresentaram anticorpos para MNV, sugerindo que este
agente é altamente prevalente e endêmico em colônias de camundongos 35. Após
isso, outros estudos foram realizados em muitos países, utilizando diversas
metodologias tanto sorológicas 40, 41, 42 quanto moleculares 34,43 para determinar a
prevalência de MNV. Estes estudos também encontraram resultados semelhantes,
caracterizando MNV como um patógeno prevalente em camundongos de laboratório,
mantidos em diferentes condições sanitárias 29.
Camundongos infectados excretam partículas virais infecciosas nas fezes
por um longo período. Sendo assim a transmissão pode ocorrer não apenas pela via
oral fecal como também pela “maravalha” contaminada 5, 37. O vírus ainda é capaz
de alterar a produção de interferon para escapar do sistema imune de seu
hospedeiro explicando assim a grande letalidade em animais imunodeficientes. 44.
Após a descoberta de MNV em 2003, muitos avanços puderam ser
realizados, pois este vírus é o único NoV que se replicava “in vitro”. Esta
característica foi fundamental para a determinação da patogenia do vírus, visto a
incapacidade de cultivar o norovírus humano. Deste modo, a identificação da
24
primeira linhagem celular de macrófagos e células dendríticas permissiva, RAW
264.7, foi de grande importância para a propagação do vírus “in vitro”, tornando-se
assim a um modelo de estudo das doenças causadas por NoV 45.
1.6 Norovírus em Cultura Celular
Durante muitos anos o único NoV que se replicava “in vitro” era o MNV,
motivo pelo qual ele passou a ser o modelo mais acessível, capaz de elucidar os
mecanismos de infecção e replicação dos norovírus humanos (HuNoV), uma vez
que este não é capaz de se replicar in vitro 35.
A primeira descrição de NoV em cultura celular aconteceu em 2004 por
Wobus et al., que descreveu o tropismo deste vírus por linhagens de células
hematopoiéticas como os macrófagos e células dendríticas. Até então, pensava-se
que o fato de NoV causar doença entérica indicasse que a infecção ocorresse no
intestino delgado, mas estudos relataram que a replicação de MNV não acontece
nos enterócitos. Os macrófagos e células dendríticas quando infectados com MNV
desenvolvem células com morfologia anormal, apresentando aumento do núcleo,
grânulos e células vesículadas ao longo do citoplasma, podendo alterar a atividade
de tradução da célula45.
Embora avanços incontestáveis tenham sido realizados através do estudo
de MNV, a comunidade científica continuou a procurar por um sistema de
propagação in vitro para HuNoVs. Ao longo dos anos muitos estudos tentaram
cultivar o vírus humano, pesquisadores tentaram inclusive infectar macrófagos,
células dentríticas humanas e células epiteliais que revestem o intestino, mas não
obtiveram sucesso.46,47.
Testes com MuNoVs em células B mostraram o antígeno viral em placas
de Peyer de camundongos infectados. Isso levou pesquisadores a tentarem o cultivo
de HuNoVs nas mesmas condições, para testar um sistema de cultura celular
baseado no cultivo e infecção de células B de humanos 48.
Este estudo foi muito promissor e levou pesquisadores a investir neste
tipo de cultura, pois foi observado aumento do número de cópias do genoma viral
em cultura de células B. Ao contrário de outros estudos que focaram sem sucesso
25
no GI.1, este estudo utilizou a cepa GII.4 Sidney de HuNoVs, mas o diferencial foi
utilizar fezes não processadas e não filtradas como inóculo 49.
Alguns estudos têm demonstrado que bactérias comensais presentes nas
fezes atuam como cofator de infecção e utilizam as HBGAs (Histo blood group
antigen), antígenos de superfície celular, como fator de fixação, assim como um
receptor de células B para a entrada viral 50.
A replicação do vírus nas células B foi evidenciada pelo aumento do
número de cópias e título viral, sugerindo que NoV faz transcitose ou seja,
atravessam o epitélio intestinal acessando as células alvo do sistema imune,
incluindo imunidade adaptativa e inata 19,49.
Recentemente, outro grupo tentou isolar NoV em pacientes deficientes e
não deficientes em células B, mas obtiveram resultados positivos em 60% de ambos
os casos, indicando que a infecção por HuNoV pode se desenvolver mesmo na
ausência de células B 51. Estes resultados mostram divergências entre laboratórios e
sugerem que um sistema de cultivo para HuNoV ainda precisará de mais estudos
para determinar um método de cultura reprodutível para o HuNoV 52.
1.7 Imunidade
Informações sobre imunidade em humanos têm sido obtidas através de
estudos realizados com voluntários que foram desafiados com Norwalk vírus
sucessivamente. Estes apresentaram dois tipos de imunidade: Imunidade de longa
duração e imunidade de curta duração 17.
Na imunidade de longa duração os indivíduos desafiados com o vírus
tiveram comportamentos diferentes após a segunda infecção com NoV. Em
indivíduos que tiveram sintomatologia da doença na primeira infecção a re-infecção
aconteceu após o período de 31 a 34 meses, enquanto que em indivíduos que não
apresentaram sintomas após a primeira infecção, este período variou entre 27 a 42
meses. Quanto à imunidade de curta duração, vírus-específica, aquela que segue
26
um padrão tradicional da doença, o indivíduo que foi exposto ao vírus uma vez, se
torna resistente à reinfecção por um período de 6 a 14 semanas.
Pessoas e animais infectados por NoV podem desenvolver uma resposta
de anticorpos antivirais e periféricos das mucosas, desta forma, componentes da
resposta imune adaptativa contribuem para o controle e clearance da infecção por
NoV 19. Anticorpos específicos do tipo IgG são encontrados em períodos mais
longos de excreção, enquanto que anticorpos do tipo IgA e IgM em períodos curtos
de tempo 53.
Estudos experimentais utilizando a cepa protótipo MNV-1 mostram que a
duração da infecção e a manifestação da doença podem variar de acordo com o tipo
de animal. Camundongos imunocompetentes infectados por MNV fazem uma
importante resposta imune do tipo humoral produzindo anticorpos policlonais,
permitindo o monitoramento sorológico. Camundongos deficientes em células T e B,
com ausência dos receptores para interferon α, β e γ, acabam por fazer infecção
persistente, pois são incapazes de fazer a eliminação viral, indicando deste modo
que, componentes da imunidade inata são essenciais para a resistência à infecção
por MNVs 54.
A infecção destas células hematopoéticas provoca a secreção de uma
citocina imunomoduladora importante chamada Interferon (IFN), ela é uma via de
sinalização que alerta quanto à presença de MNV e regulamenta milhares de genes.
O vírus pode alterar a produção de IFN para escapar do sistema imune de seu
hospedeiro, explicando assim a grande letalidade em animais imunodeficientes. Isso
comprova que a presença de MNV em biotérios de experimentação pode causar
confusão na interpretação de resultados em pesquisas. Alguns autores sugerem que
determinar os mecanismos pelos quais o IFN controla a infecção é fundamental para
compreendermos como funciona o sistema imune contra NoV 55. Estudos realizados
com MNV em camundongos deficientes para interferon do tipo I demonstram que
este tipo de interferon previne lesões sérias e letais, pois controla a disseminação de
MNV em tecidos periféricos 56.
Dentre os fatores importantes amplamente estudados estão as Histo-
blood group antigens (HBGAs) que fazem parte de um grupo complexo de
27
carboidratos que podem se ligar à glicoproteínas ou lipoproteínas presentes nos
fluidos corporais como: sangue, saliva, conteúdo intestinal, leite materno e células
epiteliais. Estudos indicam que nem todas as pessoas são susceptíveis a certos
genótipos de NoV e isto pode estar ligado à presença destas HBGAs nos
enterócitos, como um fator determinante para certos genótipos 53.
HuNoV reconhecem as HBGAs que são expressas nas superfícies da
mucosa intestinal. A síntese de HBGAs, especificamente do sistema ABH e Lewis
requer o uso de enzimas fucozil e glicosil transferases controladas por FUT2, FUT3
e genes do sistema ABO. Indivíduos com dois alelos FUT2 mutados e desprovidos
de antígenos do tipo H em seu intestino ou células epiteliais, são chamados não
secretores. Indivíduos secretores do antígeno H do tipo 1 são susceptíveis a
infecção por NoV, enquanto os não secretores são resistentes. 56. Embora dados
relativos à imunidade tenham fornecido informações importantes para o estudo de
NoV, ainda é preciso entender melhor os mecanismos de infecção causada por este
vírus, bem como a natureza da resposta imune que protege o indivíduo de uma
infecção mais virulenta.
1.8 Vacina para Norovírus
Atualmente há uma grande procura pelo desenvolvimento de uma
vacina contra NoV, principalmente em países desenvolvidos, os mais afetados por
este vírus, chegando a investir milhões em combate e prevenção 57. No entanto, a
falta de um sistema de cultura celular para HuNoV, e a grande quantidade de cepas
virais, tem limitado o desenvolvimento de uma vacina efetiva 58. Desde a criação da
vacina contra rotavírus nos Estados Unidos, o NoV passou a ser o agente viral que
causa maior taxa de hospitalizações e de mortalidade nesse país 59. Visto isso, uma
empresa privada americana tentou desenvolver uma vacina utilizando antígeno do
GI de NoV, contendo adjuvantes e quitosana mucoaderentes. Esta vacina foi testada
em voluntários pela via intranasal e inicialmente causou um nível de proteção
moderada contra o vírus Norwalk. Outras tentativas de uma vacina eficiente
utilizaram uma combinação de antígenos de GI e GII.4, mas não obtiveram taxas
suficientes de imunização 60. .
28
Estudos recentes têm sido realizados com a intenção de desenvolver
uma vacina combinada (com partículas de norovírus e rotavírus), para prevenir
gastroenterites infantis. Quanto à proteção de grupos especiais como idosos,
militares e viajantes de cruzeiros que também são regularmente expostos ao vírus,
seria necessário uma vacina específica para NoV. Embora em ambos os casos esta
vacina precise ser científica e financeiramente viável à população 61.
1.9 Norovírus em Ratos
Após a identificação de MNV e sua alta prevalência em camundongos de
laboratório no mundo todo 37,40,43,62, pesquisadores passaram a procurar evidências
de NoVs em colônias de ratos, visto que, este modelo animal também é muito
utilizado na pesquisa biomédica atual.
A possibilidade de que um NoV pudesse infectar ratos mobilizou também
biotérios comerciais de alto padrão como a Charles Rivers nos Estados Unidos, a
iniciar em 2003 a procura por NoV nesta espécie 63. Para isso conjuntos de primers
degenerados foram sintetizados e as amostras de rato foram testadas para a
presença de NoV. Embora a amostragem tenha sido ampla, não foi possível a
detecção do vírus nas amostras de rato 35.
Em 2005, Hsu e colaboradores tentaram a identificação e caracterização
deste vírus em colônias de ratos da linhagem Sprague Dawley. Para isolar o vírus,
testes sorológicos foram realizados, utilizando MNV (norovírus murino) como
antígeno. Os testes foram realizados mediante estudos previamente relatados, onde
reações sorológicas cruzadas de NoVs podem acontecer entre as diferentes
espécies hospedeiras, como por exemplo, entre humanos e suínos 64.
Os resultados sorológicos obtidos pelas técnicas de Dot blot, Ensaio de
fluorescência multiplexado (MFI) e Imunofluorescência Indireta (IFI) sugeriram que
há um NoV capaz de infectar ratos de laboratório, pois, os animais podiam fazer a
soro conversão, apresentando anticorpos séricos contra o NoV presente nos
camundongos (MNV). Embora os testes sorológicos tenham sido promissores, o
29
cultivo deste norovírus “in vitro” e a obtenção de uma sequência de nucleotídeos
específica para ratos, não foi possível 37.
Somente em 2012, pesquisadores japoneses anunciaram uma linhagem
de NoV obtida de roedores selvagens. Neste estudo pesquisadores verificaram a
presença de MNV em roedores silvestres do gênero Apodemus speciosus e Rattus
rattus. Para isso, 47 amostras foram testadas por RT-PCR, seguidos de um nested-
PCR. Das amostras testadas, 7 foram positivas para NoV em A. speciosus e 1 em R.
rattus. Os resultados destas reações foram confirmados por sequenciamento onde
se observou homologia significativa do NoV presente nos ratos com a cepa padrão
de MNV-1 isolada de camundongos. Análises filogenéticas revelaram que a
distribuição destas amostras se agrupava de acordo com cada região e/ou país
analisada, indicando que a diversidade de MNV poderia estar ligada com a
distribuição da espécie hospedeira 65.
Este resultado confirma a hipótese de que roedores selvagens revelariam
associações de variantes de MNV em populações selvagens de espécies–
específicas, sugerindo que NoV tenha um ancestral comum ou uma característica
que poderia ser compartilhada com outros genogrupos 66.
Pesquisas têm sido realizadas na tentativa de entender a relação
zoonótica de NoV com diversos tipos de hospedeiros, visto que todos os isolados do
vírus em humanos são inseridos nos genogrupos I, II e IV, enquanto outros
hospedeiros como bovinos e camundongos, no GIII e GV 30.
Smith e colaboradores (2012) relataram uma diferença de 22% a 23% na
sequência de nucleotídeos do genoma completo de MNV entre as diferentes
espécies hospedeiras de camundongos, encontrados em pet shops, mantidos por
criadores domésticos, assim como camundongos mantidos em laboratório. Desta
forma a alta variabilidade genética deste vírus torna muito difícil sua detecção em
outras espécies hospedeiras como: hamsters, gerbil, cobaias, chinchila e ratos,
mesmo utilizando primers específicos para diferentes regiões do genoma do vírus 66.
No segundo semestre de 2012, foram descritas duas sequências
genômicas de NoV, isoladas de amostras de fezes de Rattus norvergicus em Hong
30
Kong. O genoma completo é de aproximadamente 7.541 bases de tamanho,
contendo 53.9% de C e G e 91.4% de identidade entre as duas sequências. Com
organização típica de NoV, divididos em três regiões abertas de leitura (ORFs). A
ORF1 engloba uma poliproteína de 1.700 aminoácidos (aa), as proteínas do
capsídeo (VP1) contêm 548 aa, enquanto a menor proteína não estrutural (VP2)
apresenta 218 aa 67. Até o presente momento, não há relatos na literatura
descrevendo outros isolados de NoV em ratos, ou métodos de diagnóstico para
detecção e determinação da prevalência deste vírus nas colônias de ratos de
laboratório. Deste modo, levando em consideração que NoV é um patógeno de
amplitude mundial, e que a presença deste vírus no modelo animal utilizado pode
interferir nos resultados de pesquisas científicas, este estudo tem por finalidade o
isolamento de NoV em cultura celular, para estabelecer e implantar técnicas de
identificação, molecular (semi-nested RT-PCR) e a técnica sorológica de
Imunofluorescência indireta (IFI), para o diagnóstico de norovírus em ratos de
laboratório de diferentes biotérios brasileiros.
31
2- OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Isolar Norovírus de colônias de ratos, mantidos em biotérios brasileiros, a
fim de estabelecer metodologias de diagnóstico molecular e sorológico, junto ao
Laboratório de Controle de Qualidade Sanitária do Centro Multidisciplinar para a
Investigação Biológica na área da Ciência em Animais de Laboratório-
CEMIB/UNICAMP.
2.2 Objetivos Específicos
Isolar o Norovírus “in vitro” a partir de amostras fecais obtidas de colônias de
ratos convencionais, por meio da inoculação de suspensão de fezes destes animais
na linhagem celular permissiva RAW 264.7;
Padronizar a técnica de semi-nested RT-PCR para detectar Norovírus em
amostras fecais de ratos;
Implantar a técnica de Imunofluorescência Indireta para detecção de
anticorpos séricos contra Norovírus de rato;
Avaliar a prevalência de infecção por Norovírus em colônias de ratos de
diferentes biotérios brasileiros.
32
3- MATERIAIS E MÉTODOS
Todos os experimentos foram realizados no Laboratório do Controle de
Qualidade Animal (LCQS) do CEMIB/UNICAMP. Visto que o Laboratório é uma
referência no monitoramento sanitário de colônias de ratos e camundongos de
biotérios do Brasil e da América Latina e desde 2006 está credenciado ao ICLAS
(International Concil for Laboratory Animal Science) e é acreditado pelo programa
"Laboratory Animal Quality Network". Este programa de avaliação dos laboratórios
de diagnóstico (PEP Program - Performance Evaluation Program for Diagnostic
Laboratories) tem como objetivo principal supervisionar a sensibilidade e
especificidade dos testes adotados no monitoramento sanitário de colônias de
animais de laboratório. Todos os agentes emergentes e reemergentes monitorados
pelo laboratório estão de acordo com as recomendações e lista de exclusão da
FELASA (Federation European Laboratory Animal Science Association).
3.1 Obtenção do Material Biológico
Todos os procedimentos adotados neste estudo foram submetidos e
aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade
Estadual de Campinas (CEUA-UNICAMP) sob o número 2901-1.
Os materiais biológicos foram obtidos da seguinte maneira:
3.1.1 Linhagem celular.
A linhagem celular RAW 264.7, proveniente de macrófagos murinos
transformados pela injeção intraperitoneal do vírus de Leucemia de Abelson (A-
MuLV) foi utilizada para o isolamento do vírus, propagação em lâminas teflonadas,
teste de Imunofluorescênica Indireta (IFI) e produção do antígeno viral. Para a
realização dos experimentos, a monocamada confluente de células RAW 264.7 foi
mantida em meio DMEM, (Nutricell, SP, Brasil), suplementado com 10% de soro
fetal bovino (SFB, Nutricell SP, Brasil), 50µg/mL de Gentamicina (Sigma-Aldrich,
Missouri, USA), aminoácido não essencial 100 x concentrado (AANE, Cultilab, SP,
Brasil) e 20mM de L-glutamina (Sigma-Aldrich, Missouri, USA).
33
Para os repiques celulares foi utilizado um raspador de células (TPP,
Suíça). A monocamada confluente foi raspada e homogeneizada. A suspensão
celular foi distribuída em novas garrafas de cultura contendo DMEM suplementado.
As garrafas de cultura celular foram mantidas a 37o C em atmosfera úmida contendo
5% CO2 e observadas diariamente em microscópio invertido (Reichert Jung, Biostar,
NY, USA) até a formação da monocamada de células.
3.1.2 Amostras de fezes para isolamento de Norovírus em células
Para o isolamento do vírus foram utilizadas 13 amostras de fezes de
rato, mantidos em colônias de 11 biotérios convencionais e 2 amostras de fezes de
ratos selvagens.
3.1.3 Amostras de fezes para teste na reação semi-nested RT-PCR
As amostras de fezes foram coletadas de 108 ratos
imunocompetentes, com diferentes idades, provenientes de 23 Biotérios brasileiros,
mantidos sob sistema de barreiras ou de forma convencional. As amostras recém-
coletadas foram acondicionadas em tubos estéreis e estocadas a -80oC até o
momento do uso.
3.1.4 Amostras de plasma
As amostras foram coletadas de 96 ratos de diferentes linhagens, com
idades entre quatro e oito meses e provenientes de 12 biotérios diferentes. O plasma
coletado foi inativado a 56ºC por 30 minutos, e diluídos na proporção 1:5 em tampão
PBS 0,01M para posterior análise pela reação de imunofluorescência indireta.
3.1.5 Preparo da suspensão de fezes
As amostras de fezes foram pesadas em balança semi-analítica e
ressuspendidas em 1,0mL de tampão PBS 0,01M estéril, de maneira a ficarem na
concentração teste de 20%. Após isso as amostras foram homogeneizadas para
34
total dissolução do material fecal. Em seguida, foram centrifugadas á 10.000 rpm por
10 minutos e estocadas até o momento do uso.
3.2 Isolamento viral
3.2.1 Isolamento do vírus em cultura celular
As suspensões de fezes destinadas à tentativa de isolamento viral
foram previamente centrifugadas e filtradas em membrana de acetato de celulose de
porosidade de 0,45µM (Millipore, Bedford-MA), e 1,0 mL destas suspensões foram
inoculadas nas garrafas de cultura, com monocamada celular confluente por
aproximadamente 90 minutos e mantidas em estufa 37°C, contendo 5% de CO2 para
adsorção viral. Após este período foi adicionado meio de cultivo com 2% SFB
(Nutricell, SP, Brasil), 50µg/mL de Gentamicina (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) e as
garrafas novamente mantidas em atmosfera úmida, a 37ºC e com tensão de 5% de
CO2. As células foram acompanhadas diariamente até a observação de efeito
citopático (ECP). Assim que o ECP foi evidenciado em no mínimo 50% do tapete
celular, as garrafas foram congeladas e descongeladas por 3 vezes para provocar a
lise celular. Em seguida centrifugadas a 5.000 rpm por 10 minutos à 4ºC. O
sobrenadante obtido foi congelado a -20ºC para realização de passagens sucessivas
em células RAW 264.7. Alíquotas de cada passagem foram feitas para posterior
extração de RNA viral e confirmação do isolamento do vírus 68.
3.2.2 Ensaio de placa
Este protocolo foi padronizado seguindo o recomendado por Gonzalez-
Hernandes et al., 2012 com modificações. Todos os testes foram realizados em
duplicata 69.
Para realizar o ensaio de placa foram selecionadas garrafas com tapete
confluente, mantidas em meio completo, suplementado como descrito acima. As
35
células foram repicadas e 2 mL desta suspensão contendo 1X106 células viáveis
foram adicionados em placas de 6, 12 e 24 poços. Estas foram incubadas a 37°C
em estufa com tensão de 5% de CO2 até atingir cerca de 70% de confluência.
3.2.3 Preparo da agarose 3%
Foram pesados 3g de agarose ultrapura (Uniscience, Brasil) e
adicionado em 100 mL de água deionizada, em seguida autoclavado por 20 min a
121°C. Após a esterilização a solução foi mantida em banho-maria a 42°C até o
momento do uso.
3.2.4 Inóculo viral
Após o preparo da solução de agarose 3%, foram feitas diluições do
inóculo viral (vírus proveniente das passagens seriadas em células RAW 264.7 e
positivas no semi-nested RT-PCR) que correspondem a 10-1, 10-2 e 10-3. O meio foi
retirado de cada poço assepticamente e 1 mL de cada diluição do vírus foi
acrescentado. As placas foram novamente incubadas por um período de 90 minutos,
para adsorção viral. Após este período foram acrescentados 2 mL em cada poço de
uma solução na proporção 1:1 contendo, agarose 3% e meio de cultura DMEM
contendo, 2% de SFB (Nutricell, SP, Brasil), 50µg/mL de Gentamicina (Sigma-
Aldrich, Missouri, USA), AANE 100x concentrado (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) e
20mM de L-glutamina (Sigma-Aldrich, Missouri, USA). Após solidificação, as placas
foram novamente incubadas nas mesmas condições acima e acompanhadas
diariamente em microscópio invertido por no máximo 72 horas.
A visualização das placas foi feita através de vermelho de fenol 0,33%.
(0,33g do corante + 100 mL de PBS 0,01M e autoclavado). Para a visualização das
placas foram adicionados 2 mL do corante e incubado por 1 hora, após este período
foi possível visualizar e contar as unidades formadoras de placa.
36
O cálculo do título viral segue a seguinte fórmula: Número de placas de
cada poço (duplicata), nas diferentes diluições, multiplicado pelo valor da diluição. O
resultado é dado em PFU/mL.
3.2.5 Precipitação em cloreto de cálcio
Para concentração das partículas virais, o sobrenadante celular
contendo o antígeno viral, foi submetido ao protocolo de precipitação com cloreto de
cálcio. Para isso, adicionou-se cloreto de cálcio dihidratado 50 mM (MERCK) ao
sobrenadante contendo o antígeno viral, sob agitação constante, a 4ºC overnight. No
dia seguinte o material precipitado foi centrifugado a 12,000 rpm por 30 min a 4ºC e
o sobrenadante ressuspendido em 500µL de tampão TNE pH 7,4 (Tris 0,01M, EDTA
0,001M e NaCl 0,1M) e estocado a -80ºC até o momento do uso.
3.2.6 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-Page)
A verificação da presença da proteína alvo foi realizada através de gel
de poliacrilamida (SDS-Page). Para o gel de resolução a concentração adotada foi
de 8% de acrilamida e bis-acrilamida, enquanto que a concentração do gel de
empilhamento foi de 4%. Todas as amostras foram previamente aquecidas a 100ºC
por 5 min em banho-maria. Em um dos poços do gel, foi aplicado 5µL de marcador
de peso molecular pré-corado (Kaleidoscope Precision plus proteinTM Bio-Rad,
EUA). A corrida eletroforese foi realizada em cuba vertical 120V por 1 hora. Após a
corrida as proteínas foram transferidas para a membrana de nitrocelulose (Bio-Rad,
EUA) umidecida. A transferência foi realizada em cuba a seco (Amersham
Biosciences Multiphort II, GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Suécia) a 3500V
por 2 horas. Em seguida, a membrana foi incubada por 2h em uma solução de leite
em pó desnatado a 5%, em temperatura ambiente, para bloquear os sítios de
ligação não específicos das proteínas.
37
3.2.7 Western Blotting
Após o bloqueio a membrana foi lavada 3 vezes por 5 minutos com tampão
PBS-Tween 20 0.1% e incubada em anticorpo primário, diluídos na concentração de
1:500, por 12h a 4°C. Novamente a membrana foi lavada com o tampão e incubada
com o anticorpo secundário conjugado com
peroxidase (goat anti- IgG de rato, Sigma-Aldrich, Missouri, USA) na concentração
de 1:10.000, por 2 horas, em temperatura ambiente. Um ensaio de
quimiluminescência (SuperSignal, West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce,
Rockford-EUA) foi realizado para identificar a imunorreatividade das bandas,
utilizando fotodocumentador G-BOX, software GeneSnap e Software GeneTools
(Syngene, MD, USA) para análise por densiometria.
3.3 Extração de RNA Viral
3.3.1 Kit QIAmp® Viral RNA mini kit
A extração do RNA total foi realizada pela utilização do Kit QIAmp® Viral
Mini kit (QIAgen® Inc., Valencia, California), conforme protocolo descrito pelo
fabricante.
Em resumo, um volume de 140µl de suspensão fecal foi adicionado à
560µl do tampão AVL e homogeneizados por 15 segundos. Essa preparação foi
incubada por 10 minutos e em seguida foram adicionados 560µl de Etanol P.A. a
este volume e centrifugado. Um volume de 500µl do Tampão AW1 foi adicionado e
novamente centrifugado. Nas etapas seguintes, 500µL do tampão AW2 foram
adicionados à coluna e duas centrifugações foram realizadas. O líquido que passou
pela coluna foi descartado. O RNA retido na coluna foi eluído em 50µL do tampão de
eluição AVE, e então mantido a -80oC até o momento do uso.
38
3.3.2 TRIzol™
As amostras de sobrenadantes de células RAW 264.7 infectadas com
suspensão de fezes 20% foram submetidas à extração pelo TRIzol™ (Invitrogen,
Carlsbad,CA,USA). Sendo assim, 900µL de TRIzol™ foram adicionados para cada
300µL de amostra e esta mistura foi incubada por 5 minutos à temperatura ambiente
e em seguida 240µL de clorofórmio gelado foi adicionado, incubando-se por mais 5
minutos à temperatura ambiente. Após centrifugação a fase aquosa foi coletada e o
RNA precipitado com isopropanol gelado (v:v) por 10 minutos. Após nova
centrifugação o sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspendido em 1,0
mL de etanol 75%. Após homogeneização foi realizada nova centrifugação e o RNA
foi ressuspendido em 35µL de água tratada com DEPC (Dietilpirocarbonato), e
aquecido por 55ºC por 10 minutos.
3.3.3 Desenho do primers
Duas sequências de primers foram obtidas através do alinhamento do
genoma completo de MNV-1 (número de acesso no GenBank: AY228235) e
norovírus de rato (JX486101 and JX486102) em uma região do capsídeo (VP1)
altamente conservada. As sequências foram utilizadas para diferentes finalidades: 1-
para testar amostras de fezes e 2- amostras provenientes de células infectadas e
submissão ao GenBank de acordo com a tabela 1.
39
Tabela 1: Primers utilizados para identificação molecular
Primer Sequências 5’- 3’ Localização* Tamanho do amplificado
Conjunto I Primeira reação
F-AAATTTTGTCCAGTGYCCCCTT R-AACCACCTTGCCAGCAGTAA
5271 – 5292 5469 – 5450
199pb
Conjunto I Semi-nested
F-TTCACCGTCTCCCCAAGAA R-AACCACCTTGCCAGCAGTAA
5299 – 5317 5469 – 5450
171pb
Primeira reação Conjunto II
F-TTGTKAATGAGGATGAGTGATG R-AACCACCTTGCCAGCAGTAA
5823 – 5843 5469 – 5450
374pb
Semi-nested Conjunto II
F-CGACACCCAAGGTGCCTC R-AACCACCTTGCCAGCAGTAA
5795 - 5813 5469 – 5450
344pb
* Alinhamento entre JX486101 e AY228235.
IUB CODE: Y= C ou T
K= G ou T
3.4 Reações Moleculares
3.4.1 Transcrição Reversa (RT-PCR) e Semi-Nested RT-PCR
A reação de transcrição reversa foi realizada utilizando OneStep RT-PCR
Kit (QIAgen® Inc., Valencia, California) de acordo com protocolo recomendado pelo
fabricante. A reação consiste de: 0,2μM de cada primer, 1X tampão OneStep RT-
PCR, 0,4mM of dNTP, RNase Inhibitor 10U/μL, 1X tampão Q-solution e 1μL de
enzima. A reação foi realizada em volume de 25µL como segue: Transcrição reversa
50°C por 30min; ativação da DNA polimerase 96°C por 2min, seguida de 40 ciclos
de amplificação, denaturação de 95°C por 30s, 55°C por 30seg, extensão 72°C por
1min. O produto da primeira reação (2 μL) foi utilizado para a semi-nested nas
mesmas condições descritas acima. Todas as reações foram feitas em termociclador
GenePro 96G (BioER, Binjiang, China). A eletroforese foi realizada a 80V em gel de
40
agarose 2%, corado com GelRed™(Biotum Inc. Hayward, CA, USA) juntamente com
marcador de peso molecular de DNA com 100pb (Thermo Fisher Scientific Inc.,
Carlsbad, CA, USA) por 50 minutos em cuba horizontal. Os fragmentos foram
visualizados e documentados no equipamento Geldoc-ItTMImaging System (UVP,
(Cambridge, UK).
3.4.2 PCR controle
As amostras foram submetidas a uma PCR controle para um gene
constitutivo. A região escolhida foi um fragmento da GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato
desidrogenase), por se tratar de uma enzima que está relacionada à glicólise, esta é
expressa por todas as células de mamíferos.
A reação foi padronizada com conjunto de primers específicos (tabela
2) e volume final de 15µl nas seguintes condições: 95º C 2 minutos, seguidos de 35
ciclos de 94ºC 15 segundos para ativação da DNA polimerase, anelamento 57ºC por
15 segundos e extensão de 72ºC por 15 segundos. A concentração dos reagentes
usados foi: tampão 1x, 2,0mM MgCl2, 0,2µM de cada primer. 0,2 µM dNTP e 1,5U de
DNA polimerase (Biotools, B&M Labs, SA) .
Tabela 2: Primer utilizado na PCR controle
Primer
Sequências 5’- 3’
Tamanho amplificado
GAPDH
F-CCTGCCAAGTATGATGACATCAA R-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT
90pb
3.4.3 Purificação
Após amplificação, as bandas visualizadas em gel de agarose 2%
foram selecionadas para a purificação com o Kit Gel Extraction Kit SIGMA
41
(GenEluteTM, St. Loius, USA) conforme protocolo descrito pelo fabricante. Em
resumo, um volume de três vezes o peso do gel do tampão Gel Solubilization
Solution foi acrescentado à amostra e homogeneizado por 15 segundos e a mistura
incubada por 10 minutos a 60ºC. Enquanto isso foi adicionado às colunas 500µL do
tampão Column Preparation Solution. Depois disso foi adicionado um volume de 500
µL de isopropanol 100%. A seguir a amostra foi centrifugada e depois, um volume de
700µl do Tampão Wash Solution foi adicionado e novamente centrifugado e o RNA
eluído em 50µL do tampão Elution Solution. As amostras foram mantidas a -80ºC até
o momento do uso.
3.4.4 Clonagem da sequência de DNA
Para clonagem das sequências foi utilizado o Kit pGEM®- T Easy
Vector Systems (Promega, Madson, USA) conforme protocolo descrito pelo
fabricante.
3.4.5 Ligação
A ligação foi realizada da seguinte maneira: 5µL de tampão 2X Rapid
Ligation Buffer, 1µL do vetor pGEM T Easy vector (50ng), 1 µL de T4 DNA ligase
(3U/ µL) e 3µL do produto da PCR (150ng). Incubação de uma hora a 4ºC.
3.4.6 Transformação
A transformação foi realizada utilizando a célula bacteriana
competente de alta eficiência JM109 (Pomega, Madison, CA). Para a transformação
2µL da reação de ligação acima foram adicionados a 50µL de célula competente e
incubadas em banho de gelo por 20 minutos. Após este período foram submetidos a
um choque térmico, 50 segundos a 42ºC e incubadas novamente em banho de gelo
por 2 minutos. Nova incubação foi realizada a 37ºC por 1 hora e 30 minutos em
900µL de meio LB sob agitação constante de 150 RPM.
3.4.7 Plaqueamento
Para o plaqueamento foram utilizados 100µL da solução de
transformação. O plaqueamento foi realizado em meio LA agar contendo: ampicilina
42
50mg/mL, IPTG 1mM e X-Gal 20mg/mL e incubados a 37ºC. No dia seguinte as
colônias brancas foram selecionadas e incubadas a 37ºC overnight em meio LB com
agitação constante.
3.4.8 Extração de DNA plasmidial
Para extração do plasmídeo foi utilizado o Kit QIAprep mini prep®.
(QIAgen® Inc., Valencia, California), conforme protocolo descrito pelo fabricante. As
colônias bacterianas foram centrifugadas e o precipitado foi ressuspendido em
250µL de tampão P1, 250µL do tampão P2, misturar e 350µL do tampão N3 e em
seguida centrifugadas por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para a coluna
e centrifugado. Foram adicionados 500µL do tampão PB e nova centrifugação, em
seguida adicionados 750 µL do tampão PE e centrifugadas novamente. Para eluir o
DNA 50µL de tampão EB foi adicionado e estocado a -80ºC até o momento do uso.
3.4.9 Sequenciamento
Para confirmação da presença do NoV os produtos amplificados
obtidos pela reação de semi-nested RT-PCR e clonados, foram sequenciados em
ambas as direções utilizando Big-Dye®-Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit
(Applied Biosystems,Austin, Texas, USA) conforme protocolo disponibilizado pelo
fabricante com modificações. A eletroforese capilar foi realizada no equipamento ABI
3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) e as sequências
geradas foram analisadas pelo software Sequencing Analysis Software *v.* 5.4
(Applied Biosystems, Foster City, CA,USA).
3.4.10: Análise do sequenciamento
Os cromatogramas foram visualizados no Bioedit Sequence Alignment
Editor Program 7.2.570 (Carsbald, USA) e comparados às sequências depositadas no
NCBI Entrez Nucleotide (www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez). As sequências
consenso foram criadas através dos softwares Assembler tool (http://www.hpa-
43
bioinformatics.org.uk/cgiBin/assembly_tool/seq_assemble.cgi) e CodonCode aligner.
Os isolados obtidos neste estudo foram alinhados por Clustal W algorithm
(Heidelberg, Germany) (1000 bootstrap analysis) no Bioedit software e comparados
com as sequências referência obtidas no GenBank de acordo com a tabela 3.
Tabela 3: Sequências referência utilizadas neste estudo
GENOGRUPO E
ESPÉCIE
SEQUÊNCIAS PROTÓTIPOS Nº DE ACESSO DO
GENBANK
Rato Rn/GV/HKU_CT2/HKG/2011 JX486101
Rato Rn/GV/HKU_KT/HKG/2012 JX486102
GI (Humano) Hu/GI.1/CHA6A003_20091104/2009/USA KF039737
GII (Suíno) Swine/GII/OH-QW125/03/US AY823305
GII (Humano) Hu/NLV/GII/Neustrelitz260/2000/DE AY772730
GIII (Bovino) Bo/Newbury2/1976/UK AF097917
GIV(Felino) cat/GIV.2/CU081210E/USA/2010 JF781268
GIV (Humano) Hu/GIV.1/LakeMacquarie/NSW268O/2010/AU JQ613567
GV (Murino) Mu/NoV/GV/MNV1/2002/USA AY228235
GV(Murino) Murinenorovirus2 (MNV-2) DQ223041
GV (Murino) Murine norovirus 3 (MNV-3) DQ223042
GV (Murino) Murine norovirus 4 (MNV-4) DQ223043
GV (Murino) Murine norovirus 5 (MNV-5) EF650480
GV (Murino) Murine norovirus 6 (MNV-6) EF650481
GV (Murino) Murine norovirus 7 (MNV-7) GQ180108
GV (Murino) MNV/Brasilia-DF/Pr+Ob/2012 KF976714
GVI(Canino) dog/GVI.1/HKU_Ca035F/2007/HKG FJ692501
Outgroup Sapporo virus-Manchester polyprotein X86560
Outgroup Norwalk virus M87661
44
3.4.11 Medidas para minimizar riscos de contaminação nas reações
moleculares
O Laboratório de Controle de Qualidade Sanitária Animal (LCQS) possui a
infraestrutura necessária para a realização de técnicas moleculares para fins de
diagnóstico. Cinco salas diferentes são destinadas a reações moleculares: 1-para
extração de ácidos nucleicos, 2- preparo dos reagentes, 3- sala template para
adição do DNA e RNA e 4- sala de termocicladores e eletroforese. No caso das
reações nested e semi-nested PCR o produto amplificado da primeira reação era
acrescentado à segunda em uma quinta sala. No entanto, é importante ressaltar que
cada ambiente utilizado possui aventais, luvas, ponteiras com barreiras, tubos e
placas DNase e RNase free, todos descartáveis e não há trânsito de materiais entre
estas salas.
3.5 Reações sorológicas
3.5.1 Produção de soros policlonais anti-NoV em ratos
A produção de soros hiperimunes foi realizada de acordo com o
protocolo descrito por Hsu et al., 2005. O protocolo de produção de anticorpos
policlonais foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação
Animal da Universidade Estadual de Campinas (CEUA-UNICAMP) sob o número
2901-1.
Ratos livres de patógenos especificados (SPF) de 6 linhagens
diferentes: Wistar, Lewiss, SHR, Ficher 344, Sprague Dawley e WabNot, com 45
dias de idade, foram obtidos do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica
na Área da Ciência de Animais de Laboratório (CEMIB/UNICAMP). Os animais
foram mantidos no biotério de experimentação do Laboratório de Controle de
Qualidade Sanitária Animal do CEMIB/UNICAMP, onde grupos de 3 animais foram
mantidos em microisoladores multi-espécies, em estantes ventiladas específicas
45
para a espécie. Estes receberam água, maravalha e ração esterilizadas em
vapor úmido sob pressão à temperatura de 121°C por 30 minutos.
Os ratos foram inoculados pela via gastroesofágica com 0,2mL de
norovírus de rato. No 30° dia após inoculação, foram sacrificados em câmara de
CO2. O sangue coletado por punção cardíaca e centrifugado a 5000 rpm por 10
minutos para a separação plasma. Os soros foram diluídos na proporção 1:5,
inativados a 56°C e estocado a 20°C até o momento do uso. O mesmo protocolo foi
utilizado para a infecção experimental, mas neste caso utilizando MNV de
camundongo como antígeno para saber se as amostras reagem de forma cruzada
entre as espécies.
3.5.2 Produção de lâminas para Imunofluorescência Indireta
No preparo de lâminas para reação de imunofluorescência indireta, foi
utilizado o protocolo descrito por Gilioli et al., 2003 71. Em resumo as células RAW
264.7 foram cultivadas em lâminas multitestes teflonadas (Dinatech,USA). Sobre a
monocamada celular confluente, foram adicionados 30 µL da suspensão viral na
diluição 1:3. Em seguida, as lâminas foram mantidas em estufa a 37°C, com tensão
de 5% de CO2, por um período de 90 minutos, para a adsorção viral. Após este
período, foi adicionado meio de manutenção DMEM contendo 2% SFB. A
observação de efeito citopático (ECP) foi realizada diariamente. Após a visualização
do ECP, o meio de manutenção foi retirado de forma asséptica, por meio de uma
bomba de vácuo de pressão negativa. As lâminas secaram à temperatura ambiente
e em seguida foram fixadas em acetona gelada por 20 minutos, identificadas e
estocadas a -80oC até o momento do uso.
3.5.3 Reação de Imunofluorescência Indireta (IFI)
A reação de imunofluorescência indireta foi realizada de acordo com o
protocolo descrito por Kraft & Meyer, 198672.
46
O teste protocolo foi utilizado para analisar as 96 amostras de soro de
ratos, provenientes dos diferentes Biotérios brasileiros (produção, experimentação e
convencionais) e amostras de animais imunizados para obtenção de soros controle
positivo da reação.
Para a avaliação destas amostras, 25µl dos soros testes foram diluídos
1:5 em tampão PBS 0,01M e foram adicionados em cada poço e incubados à
temperatura ambiente, em câmara úmida, por 20 minutos e da mesma forma as
amostras de soro controle negativo e positivo, originárias dos animais imunizados
previamente, foram adicionados. As lâminas foram submetidas a lavagens com
tampão PBS 0,01M. Em seguida, 25µL de conjugado de carneiro anti-rato IgG,
(Sigma-Aldrich, MIssouri, USA), marcado com fluoresceína diluído a 1:160 em
solução PBS - Azul de Evans foi acrescentado em cada poço para contrarstar
células positivas e negativas (onde esta última apresenta coloração avermelhda) e
novamente as lâminas foram incubadas. Em seguida foram montadas em lamínula
de vidro utilizando solução de glicerina tamponada alcalina (0,5M, pH: 8,5).
As leituras foram realizadas em microscópio binocular de fluorescência de
epi-iluminação (ZEISS, Alemanha) modelo Standart 20, lâmina de mercúrio HBO
50W para luz ultravioleta, barreira de 450 a 490nm, filtros de excitação BG 38 e
aumento final de 400 vezes. As amostras de soro foram classificadas como
positivas, negativas e inespecíficas (fluorescência não específica).
Todos os soros testes também foram testados para a presença de
anticorpos específicos contra outros patógenos, como: Coronavírus (RCV),
Adenovírus tipo 1, Adenovírus tipo 2, Rotavírus, Reovírus tipo 3 (Reo-3), vírus da
pneumonia (PVM), vírus minuto do rato (RMV), Rat theilovirus (RTV), Sendai,
Citomegalovírus (RCMV); para as bactérias Mycoplasma pulmonis e Clostridium
piliforme e o parasita Toxoplasma gondii.
47
4 Resultados
4.1 Isolamento viral
As células normais RAW 264.7 (figura 3) foram infectadas com
suspensão de fezes de rato 20% provenientes de 13 amostras de fezes (11
provenientes de biotérios convencionais e 2 de ratos selvagens). De cada uma
destas amostras foram feitas 4 passagens “cegas” sucessivas em células RAW
264.7, totalizando 52 amostras a serem analisadas.
As células infectadas apresentaram efeito citopático (ECP) sugestivo de
infecção por NoV três dias após a infecção (figura 4). O ECP foi caracterizado pela
presença de células vesiculadas, contendo grânulos e aumento do núcleo. Estas
características são as mesmas observadas na infecção das células RAW 264.7 com
o NoV que infecta camundongos (MNV), como mostram as figuras 5 A e 5 B.
Figura 3: RAW 264.7 normal, aumento de 400X (fonte: acervo pessoal do autor)
48
Figura 4: Efeito citopático de norovírus de rato em células RAW 264.7. ECP 3dpi. Aumento de 400X
(fonte: acervo pessoal do autor)
Figura 5: Efeito citopático de norovírus em células RAW 264.7 infectadas com suspensão de fezes
de rato e camundongo. A- células infectadas com suspensão de fezes de rato 20%. B- células
infectadas com suspensão de fezes de camundongo à 20%. Aumento de 400X (fonte: acervo pessoal
do autor).
A B
49
Para confirmação do isolamento do vírus, todas as alíquotas de
sobrenadante de células infectadas, foram submetidas à extração de RNA, tanto por
kit comercial quanto pelo método de TRIzol™, visando avaliar e padronizar o melhor
protocolo de extração. Neste caso, após dosagem do RNA, ambos os protocolos se
mostraram efetivos para as amostras provenientes do sobrenadante de cultura
celular.
Inicialmente, tentou-se a padronização de uma reação de RT-PCR
convencional, mas nenhuma destas amostras foi positiva nesta reação. Após isso
estabeleceu - se uma reação mais sensível, um semi-nested RT-PCR. Conjuntos de
primers foram confeccionados e avaliados em diferentes condições. A padronização
das reações foi realizada com RNAs das amostras de cultura celular, que
apresentaram ECP característico e posteriormente, a condição selecionada foi
aplicada às amostras dos isolados laboratoriais. Dois conjuntos de primers foram
testados para estas amostras, cujo produto final foi de 171pb e 344pb. O conjunto
com maior tamanho de amplificado (344pb) foi mais eficiente para as amostras
provenientes de cultura celular, portanto, nós optamos por utilizá-lo. As amostras
amplificadas foram então sequenciadas e a presença do NoV foi confirmada e o
isolado submetido ao GenBank.
Dentre as 52 amostras (correspondentes às passagens celulares) cerca
de 70% apresentaram ECP. Estas foram então testadas pelo semi-nested RT-PCR,
onde, apenas 5 foram positivas para norovírus (figura 6). Quanto às amostras
provenientes de ratos selvagens estas se apresentaram todas negativas.
Para melhor identificação destas amostras elas foram nomeadas como:
LCQS ct1 a LCQS ct5, sendo importante ressaltar que estas amostras representam
5 biotérios convencionais e apresentaram-se positivas em diferentes passagens
celulares (tabela 4).
50
Figura 6: Eletroforese em gel de agarose 2% corado com GelRedTM
, dos produtos amplificados pela
semi-nested RT-PCR (344pb) para a região VP1 do capsídeo do NoV em amostras de células
infectadas com suspensão de fezes de rato. Coluna PM: Padrão de peso molecular 100pb (Thermo
Fisher Scientific Inc., Carlsbad, CA, USA), colunas de 1 a 6: amostras de células infectadas, coluna
7: controle negativo (água DEPC), coluna 8: controle positivo de reação (plasmídeo). As amostras
que apresentaram à banda na posição correspondente a 344pb (indicadas por seta) foram positivas
para a presença do NoV. Fonte: acervo pessoal do autor.
Tabela 4: Amostras positivas isoladas de RAW 264.7 em diferentes passagens.
Identificação LCQS ct1 LCQS ct2 LCQS ct3 LCQS ct4 LCQS ct5
1º passagem X
2º passagem X X X
3º passagem X
4º passagem
Embora bandas específicas tenham sido visualizadas no gel de agarose
na reação de semi-nested RT-PCR, as amostras foram clonadas e sequenciadas a
fim de determinar a sequência nucleotídica do NoV de rato e confirmar o isolamento
do vírus. As sequências consenso foram obtidas através dos softwares CodonCode
aligner (figura 7) e Assembler tool e comparadas as sequência padrão de rato
PM 1 2 3 4 5 6 7 8
344pb
51
(acesso n° JX486102 e JX486102) depositadas no GenBank. A análise molecular da
região sequenciada mostrou uma identidade de nucleotídeos com as cepas padrão
de 98%, confirmando o isolamento de norovírus de rato. Em seguida a sequência foi
depositada no GenBank sob o número de acesso KU169124 (figura 8).
Figura 7: Cromatograma e sequência consenso de isolado celular LCQS ct1, obtido pelo softwer
Codon Code Aligner.
52
Figura 8: Depósito da cepa de norovírus de rato no GenBank acesso n° KU169124
Outras técnicas como ensaio de placa e Western Blotting foram
utilizadas para complementação do resultado do isolamento viral.
4.2 Ensaio de placa
Este método foi utilizado para quantificação das partículas virais dos
isolados celulares. Para esta reação foram selecionadas as 5 amostras positivas no
semi-nested RT-PCR (LCQS ct1 a LCQS ct5). As amostras foram testadas em
duplicata nas diluições padrão de. 10-1 10-2 e 10-3 (figura 9). Dentre as 5 amostras
selecionadas apenas 2 (LCQS ct1 e LCQS ct4) apresentaram unidades formadoras
de placas em duas das diluições previamente adotadas 10-1 e 10-2 (tabela 5 ).
53
Figura 9: Ensaio de placa: amostras inoculadas em duplicata nas diluições padrão 10-1
, 10-2
e 10-3
.
Tabela 5: Cálculo de Unidades Formadoras de Placa (PFU/mL)
LCQS ct1 PFU/mL LCQS ct4 PFU/mL
diluição 10-1 10+ 11= 21 21x10-1 10+8 = 18 18x10-1
diluição 10-2 1+3 = 4 4x10-2 2+ 2 = 4 4x10-2
diluição 10-3 0 0 0 0
4.3 Precipitação com cloreto de cálcio e Western Blotting
Após a concentração das partículas virais pela precipitação com cloreto
de cálcio, o sobrenadante celular contendo o antígeno viral foi submetido ao SDS-
Page e posterior Western Blotting.
A reação de Western Blotting revelou uma banda específica de
aproximadamente 60 kDa (figura 10). A amostra de soro de rato utilizada para o
blotting foi fortemente positiva na reação de IFI, assim esta banda sugere à presença
de proteínas específicas do capsídeo de norovírus.
54
Figura 10: Western Blotting: Coluna PM: Marcador de peso molecular de proteína pré-corado
(Kaleidoscope Precision plus proteinTM
Bio-Rad, EUA), coluna 1: tampão de reação, coluna 2:
amostra de sobrenadante de células normais não infectadas, coluna 3 a 7: amostras de
sobrenadantes de células positivas no semi nested RT-PCR, Coluna 8 e 9: amostras de
sobrenadante de células infectadas com MNV: As amostras que representam a banda na posição
correspondente a aproximadamente 60kDa (indicadas pelas setas) correspondem a proteínas do
capsídeo de NoV. Fonte: acervo pessoal do autor.
55
4.4 Reações Moleculares
4. 4.1 Semi-nested RT-PCR
Foram selecionadas 108 amostras de fezes de ratos, provenientes de 23
biotérios brasileiros e amostras de fezes de quatro ratos selvagens para avaliação
por semi-nested RT-PCR do conjunto de primers cujo produto final era de 171pb
(figura11), pois durante a padronização, este se mostrou mais sensível para este tipo
de amostra.
Figura 11: Eletroforese em gel de agarose 2% corado com GelRed TM
dos produtos amplificados
pela semi nested RT-PCR (171pb) para região do capsídeo do NoV (VP1), de amostras de fezes.
Coluna PM: Padrão de peso molecular 100pb (Thermo Fisher Scientific Inc., Carlsbad, CA, USA),
coluna de 1 a 11: amostras de fezes de rato, coluna 12: controle negativo de reação (água DEPC),
coluna 13: controle positivo de reação (plasmídeo). Fonte: Acervo pessoal do autor.
Dessa forma, 11% das amostras avaliadas foram positivas (12/108) e
89% (96/108) negativas (figura 12). As amostras positivas representam seis
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
171-pb
56
diferentes biotérios , nos quais 2 são biotérios de produção (SPF) e 4 biotérios
convencionais (figura 13). As amostras de ratos selvagens avaliadas foram
negativas.
Figura 12: Detecção de norovírus em amostras de fezes de rato.
Figura 13: Detecção de norovírus de rato em biotérios brasileiros
11%
89%
Detecção de Norovírus em amostras de fezes de rato
amostras de fezespositivas
amostras de fezesnegativas
26%
74%
Detecção de Norovírus de rato em biotérios brasileiros
biotérios positivos biotérios negativos
57
4.4.2 Clonagem e sequenciamento
Todos os amplicons positivos na semi-nested RT-PCR foram
clonados, purificados e sequenciados em ambas as direções. Os clones obtidos
foram denominados de LCQS Unib1 a 12 e a análise das sequências foi realizada
através do software Bioedit. A análise molecular das amostras revelou uma
identidade de nucleotídeos de 98% para o fragmento amplificado quando
comparadas às cepas padrão de rato (JX486101 e JX486102) depositadas no
Genbank.
As sequências consenso obtidas através dos softwares Assembler tool e
CodonCode foram alinhadas pelo Clustal W com as sequências do capsídeo (VP1)
de todas as linhagens protótipos, descritas anteriormente na tabela 3. Este
alinhamento revelou a substituição de uma única base na posição 5334 (C por T) e
na posição 5343 (T por A) de todas as 12 sequências obtidas neste estudo e as
sequencias JX486101 e JX486102 (figura 14). No entando, esta troca não provocou
uma alteração na sequência de aminoácidos ou mudança na estrutura proteica do
vírus (dados não mostrados) caracterizando um polimosfismo.
A comparação das 12 sequências (LCQS Unib 1 a 12) com sequências
padrão de todos os genogrupos de norovírus gerou ainda uma matrix de identidade
que pode ser observada no quadro 1.
Uma árvore filogenética foi gerada, através do software Molecular
Evolutionary Genetic Analysis - MEGA 6 73, utilizando o método neighbor joining,
maximum composite likelihood model (1000 bootstraps) e nucleotide substitution and
pairwise deletion of gaps (figura 15). Dois membros da família Caliciviridae foram
utilizados como grupo externo: Sapporo virus (X86560) e Norwalk virus (M87661).
58
Figura 14: Alinhamento das sequências de nucleotídeos das cepas protótipo de norovírus. (A) Eletroferograma de 171 pb das amostras de rato positivas na
reação de semi-nested RT-PCR. (B) Alinhamento da sequência de nucleotídeos do gene da VP1 de norovírus. As sequências de rato isoladas (LCQS Unib
1 a 12) foram alinhadas com GI (NoV Humano), GII (humano e suino), GIII (bovino), GIV (humano e felino), GV (Todos os protótipos de camundongo e a
cepa brasileira de MNV) e o GVI (cachorro). O alinhamento multiplo foi realizado através do algorítimo Clustal W. Os pontos indicam bases idênticas,
enquanto as letras representam nucleotídeos diferentes.
59
Quadro 1: Matriz de identidade
SequencesRat LCQS
Unib1
Rat LCQS
Unib2
Rat LCQS
unib3
Rat LCQS
Unib4
Rat LCQS
Unib5
Rat LCQS
Unib6
Rat LCQS
Unib7
Rat LCQS
Unib8
Rat LCQS
Unib9
Rat LCQS
Unib10
Rat LCQS
Unib11
Rat LCQS
Unib12
Rat LCQS Unib1 ID 100,0% 100,0% 91.2% 98.8% 82.5% 98.2% 98.2% 98.8% 84.5% 89.8% 98.2%
Rat LCQS Unib2 100,0% ID 100,0% 91.2% 98.8% 82.5% 98.2% 98.2% 98.8% 84.5% 89.8% 98.2%
Rat LCQS Unib3 100,0% 100,0% ID 91.2% 98.8% 82.5% 98.2% 98.2% 98.8% 84.5% 89.8% 98.2%
Rat LCQS Unib4 91.2% 91.2% 91.2% ID 90.1% 80.3% 92.8% 92.8% 91.2% 79.9% 89,0% 90.6%
Rat LCQS Unib5 98.8% 98.8% 98.8% 90.1% ID 82.4% 97.1% 97.1% 97.6% 83.5% 88.7% 97,0%
Rat LCQS Unib6 82.5% 82.5% 82.5% 80.3% 82.4% ID 81.1% 81.1% 81.5% 70.2% 75.4% 80.9%
Rat LCQS Unib7 98.2% 98.2% 98.2% 92.8% 97.1% 81.1% ID 100,0% 98.2% 83.3% 91.5% 97.7%
Rat LCQS Unib8 98.2% 98.2% 98.2% 92.8% 97.1% 81.1% 100,0% ID 98.2% 83.3% 91.5% 97.7%
Rat LCQS Unib9 98.8% 98.8% 98.8% 91.2% 97.6% 81.5% 98.2% 98.2% ID 83.6% 89.8% 98.2%
Rat LCQS Unib10 84.5% 84.5% 84.5% 79.9% 83.5% 70.2% 83.3% 83.3% 83.6% ID 76.9% 83.1%
Rat LCQS Unib11 89.8% 89.8% 89.8% 89,0% 88.7% 75.4% 91.5% 91.5% 89.8% 76.9% ID 89.3%
Rat LCQS Unib12 98.2% 98.2% 98.2% 90.6% 97,0% 80.9% 97.7% 97.7% 98.2% 83.1% 89.3% ID
JX486101 96.4% 96.4% 96.4% 90.1% 96.4% 82.4% 94.8% 94.8% 95.3% 81.5% 86.5% 94.7%
JX486102 94.3% 94.3% 94.3% 91.2% 94.2% 80.6% 94.8% 94.8% 94.3% 80,0% 87.6% 93.7%
AY228235 74.1% 74.1% 74.1% 74.1% 75,0% 62.9% 74.7% 74.7% 74.1% 62.9% 68.5% 73.5%
DQ223041 74.1% 74.1% 74.1% 74.1% 75,0% 62.9% 74.7% 74.7% 74.1% 62.9% 68.5% 73.5%
DQ223042 63.4% 63.4% 63.4% 63.9% 64,0% 54.3% 63.9% 63.9% 63.4% 55,0% 58.6% 62.9%
DQ223043 62.9% 62.9% 62.9% 63.5% 63.5% 53.8% 63.4% 63.4% 62.9% 54.6% 58.1% 62.5%
EF650480 55.5% 55.5% 55.5% 55.2% 56,0% 46.9% 55.9% 55.9% 55.5% 49,0% 51.4% 55.1%
EF650481 73.7% 73.7% 73.7% 73,0% 74.5% 62,0% 74.3% 74.3% 73.7% 62.6% 68.1% 73.1%
KF976714 74.3% 74.3% 74.3% 73.6% 75.1% 62.5% 74.8% 74.8% 74.3% 63.1% 68.7% 73.7%
GQ180108 76.7% 76.7% 76.7% 73,0% 77.6% 64.5% 76.4% 76.4% 76.7% 64.8% 68.5% 76.1%
AF097917 40.7% 40.7% 40.7% 41,0% 40.3% 33.4% 40.7% 40.7% 40.3% 42.8% 39.6% 40,0%
AY772730 6.6% 6.6% 6.6% 6.4% 6.6% 5.6% 6.6% 6.6% 6.6% 7.3% 6.3% 6.5%
AY823305 6.3% 6.3% 6.3% 6.2% 6.3% 5.5% 6.3% 6.3% 6.4% 6.7% 5.8% 6.2%
FJ692501 6.8% 6.8% 6.8% 6.7% 6.7% 5.8% 6.8% 6.8% 6.8% 7.1% 6.3% 6.6%
KF039737 7.2% 7.2% 7.2% 7.2% 7.1% 6,0% 7.2% 7.2% 7.2% 7.8% 6.6% 7.1%
JQ613567 6.5% 6.5% 6.5% 6.7% 6.5% 5.6% 6.6% 6.6% 6.6% 7,0% 6.3% 6.4%
JF781268 6.4% 6.4% 6.4% 6.5% 6.4% 5.3% 6.5% 6.5% 6.4% 6.7% 6.2% 6.3%
M87661 7.1% 7.1% 7.1% 7.1% 7.1% 5.9% 7.1% 7.1% 7.2% 7.7% 6.6% 7,0%
X86560 5.1% 5.1% 5.1% 5.3% 5,0% 4.7% 5.1% 5.1% 5.2% 5.4% 5.1% 5,0%
60
Figura 15: Árvore filogenética de norovírus: A árvore foi construída utilizando as sequências da
proteína do capsídeo (VP1) dos genogrupos GI a GVI e os isolados de rato (LCQS Unib 1 a 12). A
árvore foi gerada através do software MEGA 6.06 (1000 replicatas). as sequências da família
Caliciviridae do vírus Sapporo (X86560) e do vírus Norwalk (M87661) foram utlizadas como grupo
externo.
61
4.5 Reações sorológicas
4.5.1 Produção de soros policlonais
Visando obter soros hiperimunes para utilização como controle positivo da
reação de IFI, ratos das linhagens Wistar/Unib, Lewis, Fischer 344, Wab Not, SHR e
Sprague Dawley foram inoculados com vírus isolado do rato. Dentre estas linhagens,
apenas as linhagens Wistar/Unib e Sprague Dawley apresentaram uma resposta
efetiva na produção de anticorpos contra NoV indicando assim que as diferentes
linhagens de rato podem apresentar diferenças na resposta imunológica.
Estes animais não apresentaram nenhum sinal clínico da doença durante
o período de 30 dias após a inoculação por via oral. Estes soros positivos foram
utilizados como controle positivo na reação de imunofluorescência indireta.
4.5.2 Imunofluorescência Indireta (IFI)
A análise das amostras de soros pela Imunofluorescência Indireta foi
realizada com o objetivo de determinar a presença de anticorpos anti- NoV em ratos
naturalmente e experimentalmente infectados.
Foram testadas 96 amostras de soros que representam 12 diferentes
biotérios brasileiros (convencionais e SPF) e mais os soros de ratos submetidos à
inoculação.
A reação de IFI para NoV foi caracterizada pela fluorescência
citoplasmática e de células dendríticas como demonstra a figura 16. Todas as
amostras foram classificadas após a leitura como: amostras positivas (fluorescência
característica), negativas (sem fluorescência) e inespecíficas (fluorescência não
característica). Na figura 17 está representada a fluorescência negativa para
norovírus.
62
Do total das 96 amostras testadas por IFI, 12 demonstraram positividade
para NoV de rato, representando uma prevalência sorológica de 11,45% nos
biotérios brasileiros analisados Figura 18.
Figura 16: Reação de Imunofluorescência indireta. Amostra de soro de rato positiva para norovírus.
Reação caracterizada pela fluorescência citoplasmática das células dendríticas e de macrófagos.
Aumento 400X. (Fonte: acervo pessoal do autor).
Figura 17: Reação de Imunofluorescência indireta. Amostra de soro de rato negativa para norovírus,
esta reação é caracterizada pela coloração avermelhada como indica a seta na figura.
Aumento 400X. (Fonte: acervo pessoal do autor).
63
Figura 18: Detecção de anticorpos específicos contra NoV de rato por Imunofluorescência Indireta.
11,45% n=12
88,55% n=85
Detecção de anticorpos específicos contra Norovírus por IFI
amostras de soropositivas
amostras de soronegativas
64
5 Discussão
Desde a sua descoberta, o norovírus tem sido descrito como a maior
causa de surtos de gastroenterite em humanos 74. O vírus é altamente contagioso e
causa anualmente milhares de mortes e hospitalizações em países desenvolvidos 2,
75.
Os estudos com HuNoV têm sido limitados devido à falta de um sistema
efetivo de cultura celular. O avanço das pesquisas e o esclarecimento dos
mecanismos da patogênese viral só puderam ser elucidados após a descoberta do
norovírus murino (MNV) em 200323, uma vez que este era o único que se replicava
in vitro45. Mesmo assim, pesquisadores no mundo todo continuam tentando, mesmo
que sem sucesso o cultivo de HuNoV in vitro 47,76, 77.
Embora o isolamento de HuNoV ainda não esteja estabelecido, avanços
importantes vem sendo descritos Jones e colaboradores (2014) relataram que
HuNoV poderia infectar células B in vivo e in vitro, desde que dados prévios
demonstraram a presença de MNV em células B e nas placas de Peyer nas
linhagens de camundongos deficientes para IFN e IL10. Ao mesmo tempo
camundongos Rag 1-/- deficientes para células B e T apresentaram uma redução no
título viral quando comparadas as linhagens selvagens48.
A partir destes resultados a cepa GII.4, a mais prevalente entre os
norovírus que infectam humanos foi utilizada para à infecção em uma linhagem
humana denominada BJAB (Human Burkitt Lynphoma B Cell Line) imortalizada pelo
vírus Epstein-Barr, onde foi observado o aumento de número de cópias do genoma
viral, sugerindo uma infecção produtiva do vírus48. Neste sentido, estes autores
demonstraram que um sistema de co-cultura de células epiteliais intestinais com
bactérias da microbiota intestinal que expressam HBGAs, facilita a adesão do virus
as bactérias comensais e posterior infecção de células B. Portanto, as bactérias
comensais poderiam servir como cofator de infecção48,49.
Embora estes resultados tenham sido promissores, estudos recentes
demonstraram resultados divergentes, sugerindo a necessidade de um sistema de
cultivo efetivo de HuNoV51,52.
65
A infecção por NoV está associada ainda a várias espécies animais como:
cachorros, gatos, felinos, bovinos e suínos. Na maioria destas espécies a infecção
resulta em uma gastroenterite aguda, com exceção da infecção em camundongos,
que dependendo do status genético da linhagem, pode se observar uma infecção
letal ou subclínica19. Neste sentido, MNV ainda continua sendo o melhor modelo
para os estudos de NoV, uma vez que é o agente mais prevalente em colônias de
camundongos de laboratório35.
Recentemente Tsunesumi e colaboradores (2012) descreveram a
presença de NoV em ratos silvestres do gênero Rattus rattus e Apodemus speciosus
65. Neste mesmo ano Tse e colaboradores66 identificaram dois isolados de NoV de
Rattus novergicus. Os isolados foram depositados no GenBank sob o número de
acesso: JX486101 e JX48610266. Após isso nenhum outro relato de NoV em rato foi
descrito, assim como nenhum método de diagnóstico para a detecção do vírus nas
colônias de ratos mantidos em laboratório. Baseados nestes relatos, este estudo
teve por objetivo isolar norovírus de ratos, mantidos em biotérios brasileiros, a fim de
estabelecer metodologias de diagnóstico molecular e sorológico.
Inicialmente, visando o isolamento do agente viral, células RAW 264.7
permissivas a replicação por MNV 45 foram inoculados com suspensão de fezes de
ratos provenientes de biotérios mantidos sem sistemas de barreiras sanitárias
(convencionais) e ratos selvagens. Após a segunda passagem foi observado à
presença de efeito citopático, caracterizado pela presença de células vesiculadas,
com grânulos e aumento de núcleo 36.
Mediante a presença de ECP característico, inicialmente padronizamos
uma reação de RT-PCR convencional para confirmação do isolamento viral, uma vez
que esta tem sido uma ferramenta eficiente na detecção de viroses causadas por
vírus de RNA 78. Mesmo com a utilização de primers específicos para a região do
gene do capsídeo (VP1), por esta metodologia não foi possível a vizualização de
bandas no gel de agarose, provavelmente devido à baixa concentração de RNA viral
nas amostras analisadas. Sendo assim, foi padronizado um protocolo de semi-
nested RT-PCR, uma reação mais sensível para a detecção de NoV 43.
66
Quanto aos resultados obtidos na reação de semi-nested RT-PCR, das
cinquenta e duas amostras obtidas de passagens celulares, cinco apresentaram-se
positivas e representam cinco diferentes biotérios brasileiros, confirmando assim o
isolamento viral. Em 2005, Hsu e colaboradores tentaram o isolamento deste vírus
em colônias de ratos da linhagem Sprague Dawley, mas sem sucesso 37. Assim,
este é o primeiro relato do isolamento do norovírus de rato em célula e resultou no
depósito da cepa brasileira no GenBank (acesso n°KU 169124).
Vale a pena salientar que as duas amostras de fezes de ratos selvagens
não se apresentaram positivas em todas as passagens celulares testadas, assim
como aconteceu em outro estudo prévio65.
Para quantificação das partículas infecciosas e fornecimento de títulos
virais reprodutíveis o método de ensaio de placa foi utilizado. Este foi aplicado para
amostras de cultura celular, positivas no semi nested RT-PCR. Dentre as 5 amostras
analisadas apenas duas apresentaram unidades formadoras de placa e em apenas
duas diluições (10-1, 10-2). O número de placas observadas também foi menor
quando comparado àquelas apresentadas pelas diversas estirpes de MNV. Os
baixos títulos virais obtidos podem estar associados a uma possível adaptação deste
vírus em cultura celular.
Uma das limitações deste método é que muitas estirpes não apresentam
as placas e muitas vezes necessitam de outras metodologias como a de TCID 50
para serem quantificadas 79,80. Talvez isto explique o fato de três das amostras de
isolados celulares não terem apresentado unidades formadoras de placas.
Atualmente métodos para a detecção de NoV tem sido desenvolvidos e
bem estabelecidos 34,81,82. Assim, para garantir a correta identificação deste e de
outros patógenos, técnicas de diagnóstico como: RT-PCR 37, qRT-PCR 83 , ELISA
40,41 e ensaio imunoenzimático multiplexado – multiplex 37 tornaram-se ferramentas
importantes nas rotinas de laboratórios de diagnóstico. Além destas técnicas, as
reações nested e semi-nested PCR, têm sido cada vez mais utilizadas, por serem
métodos de diagnósticos mais sensíveis na detecção de baixas concentrações de
vírus de RNA em amostras de fezes e swabs de ambiente 43. Neste sentido, a
reação de semi-nested RT-PCR foi uma ferramenta importante neste estudo não
67
apenas para a caracterização do isolamento viral, como também para o
estabelecimento de uma rotina de monitoramento sanitário para pesquisa de NoV
em amostras de fezes de rato.
Por meio desta metodologia nós analisamos cento e oito amostras de
fezes provenientes de biotérios brasileiros, que mantém animais sob sistemas de
barreira rigorosos ou sob condições ambientais convencionais. Dentre elas, doze
(11%) apresentaram-se positivas e estas representam seis diferentes biotérios
brasileiros, sendo dois de produção e quatro convencionais. Estes resultados
indicam que NoV está circulando nas colônias de rato dos biotérios brasileiros e
pode infectar inclusive animais mantidos sob sistemas de barreiras sanitárias. O
mesmo pode ser observado em relação ao MNV que infecta camundongos de
laboratório, mantidos em ambas as condições ambientais (com ou sem sistemas de
barreiras sanitárias). De acordo com dados da literatura, a prevalência de MNV em
amostras de fezes de camundongos, pela reação de nested PCR foi estimada em
13,1% 34. Desta forma, o MNV vem sendo descrito como o patógeno mais prevalente
em colônias de camundongos 35, 37,40.
Neste estudo foram avaliadas ainda 4 amostras de fezes de ratos
selvagens, mas, diferentemente do que aconteceu no primeiro relato da ocorrência
de NoV nestes animais, que apresentaram uma positividade de 7% (n=47) 65, nós
não obtivemos nenhuma amostra positiva. Este fato pode ser devido à localização
geográfica, distribuição destes animais no Brasil ou devido à amostragem destes
animais que foi pouco representativa em nosso estudo 66.
Após a clonagem e sequenciamento das amostras positivas na semi-
nested RT-PCR, a análise molecular da mesma região conservada do gene do
capsídeo, revelou uma identidade de nuclotídeos de 98% entre as 12 amostras
obtidas e as sequências referência de rato depositadas no GenBank (JX486101 e
JX486102) 67.
As 12 sequências isoladas das fezes de ratos foram comparadas ainda
com às cepas protótipo de cada um dos genogrupos de NoV (GI a GVI) e em todos
os casos notou-se a substituição de dois nucleotídeos na posição 5334 (T>C) e na
posição 5343 (T>A) em relação aos protótipos de rato já conhecidos (JX486101 e
68
JX486102). Embora estes polimorfismos não tenham levado à mudanças na
sequência de aminoácidos, eles podem representar uma evolução independente
entre as estirpes de NoV 84.
Sabe-se ainda que a recombinação é um evento comum na família
Caliciviridae e em especial em vírus de RNA de fita simples, que é o caso dos NoVs,
assim novas cepas deste vírus estão sempre aparecendo 85. Desta forma a
genotipagem de NoV a partir de sequências parciais da proteína do capsídeo (VP1)
ou RNA polimerase dependente de RNA não são recomendadas, uma vez que há
alta taxa de recombinação nesta região, na junção ORF1-ORF2 86.
Neste estudo, à análise filogenética baseada no alinhamento das
sequências da VP1 dos isolados de rato permitiu agrupar todas as sequências em
um novo genótipo dentro do genogrupo V. O que foi consistente com relatos prévios
3, 65, 66. Neste caso sugere-se que o NoV de rato possa compreender um novo
genótipo dentro do genogrupo V, denominado de GV.II.
Uma vez determinada a prevalência molecular de NoV de rato, nosso
objetivo foi determinar também a prevalência sorológica. Através do isolamento do
vírus em células RAW 264.7, foi possível a implantação da técnica de IFI para
avaliação da prevalência sorológica deste vírus nas colônias de rato do Brasil. Para
isso, foram avaliadas noventa e seis amostras de soro, provenientes de diferentes
biotérios brasileiros, destas doze apresentaram-se positivas, indicando uma
prevalência de 11,45%. Embora a reação de IFI para NoV de rato tenha se mostrado
específica, ela apresenta uma desvantagem, que é a necessidade de um técnico
altamente treinado para fazer a interpretação dos resultados 87.
Estudos de prevalência de NoV em camundongos também foram
realizados pela técnica de Imunofluorescência Indireta. Um deles realizado em
animais de laboratório na América do Norte demonstrou uma prevalência de 22,1%,
indicando MNV, como o patógeno mais prevalente encontrado em colônias de
camundongos utilizados em pesquisa biomédica 37. Neste contexto, uma vez que
MNV é altamente prevalente em colônias de camundongo 37,40,41 e que muitos
estudos já demonstraram que o vírus pode impactar em resultados experimentais
69
35,88,89,90, foi imprescindível que este vírus fizesse parte de programas regulares de
monitoramento sanitário.
Com o intuito de identificar a proteína viral e determinar a especificidade
dos anticorpos com a proteína do capsídeo, uma eletroforese de poliacrilamida
seguida de um Western Blotting foram padronizadas. Para isso, cinco amostras de
sobrenadante de célula positivas no semi nested RT-PCR, foram utilizadas como
antígeno e testadas com soros de rato positivos na reação de IFI. Como resultado,
uma banda com tamanho aproximado de 60kDa foi identificada, sugerindo que
pudesse ser uma proteína pertencente ao capsídeo dos norovírus.
Em um estudo prévio realizado em 2005 com soros de rato positivos nas
reações de IFI e MFIA, uma banda em torno de 59kDa foi identificada e considerada
específica uma vez que a mesma membrana também foi testada em amostras de
soro de camundongos experimentalmente infectados com MNV 37. Este resultado
sugere que este novo NoV pode fazer infecção natural em ratos e esta pode ser
produtiva, com soro conversão efetiva nestes animais.
Embora este estudo, tenha sido muito importante na caracterização deste
vírus, ainda não está claro qual o impacto que ele pode causar nas colônias de rato.
Assim, estudos futuros serão necessários para entender melhor a patogênese deste
virus e o impacto que ele pode causar em pesquisas que utilizam ratos como modelo
experimental.
Outro fato que deve ser salientado é que, uma vez que este vírus está
circulando nas colônias de rato, métodos para descontaminação destes animais
precisam ser avaliados e implantados, pois, embora o vírus esteja presente em
maior proporção em biotérios convencionais, biotérios de produção com sitemas de
barreira SPF, também podem ser contaminados.
Isto se deve provavelmente ao fato de que NoV é um vírus estável e muito
pequeno que pode se disseminar facilmente mesmo em condições ambientais
desfavoráveis 35. Neste caso nós sugerimos que a descontaminação destas colônias
possam ser realizadas através de histerectomia ou transferência de embriões 91
70
embora existam relatos, de que mesmo estas técnicas precisam ser realizadas mais
de uma vez para promover a total descontaminação da linhagem 92.
Atualmente, a Federação Européia de Animais de Laboratório (FELASA)
93 não recomenda uma rotina de monitoramento sanitário para NoV de rato, uma vez
que a prevalência deste vírus nunca tinha sido demonstrada em ratos de laboratório.
No entanto, com base em nossos resultados, NoV de rato deveria ser incluído em
todos os programas de monitoramento de saúde animal.
Em conclusão, este é o primeiro relato do isolamento de NoV de rato in
vivo e da identificação molecular deste vírus em amostras de fezes de ratos de
laboratório (Rattus norvegicus) no Brasil através do desenvolvimento de uma semi-
nested RT-PCR. Além disso, evidenciamos a prevalência deste agente viral em
colônias de ratos de biotérios brasileiros, pois até o momento havia sido descrito
apenas em outras espécies (Rattus rattus e Apodemus speciosus) 66.
71
6. Conclusões
Este é o primeiro relato do isolamento de NoV de rato em cultura
celular;
Este isolado de cultura celular resultou no depósito da cepa
brasileira no GenBank sob o n° de acesso KU169124;
Nós desenvolvemos uma semi-nested RT-PCR sensível, capaz
de detectar de maneira eficiente NoV em amostras de fezes de rato, bem
como determinamos a prevalência molecular de NoV de rato em biotérios
brasileiros mantidos sob sistema de barreiras sanitárias ou convencionais;
Implantamos a reação sorológica de IFI como uma alternativa
eficiente na detecção de NoV de rato, bem como determinamos a prevalência
sorológica do vírus;
Baseado na análise filogenética dos isolados nós sugerimos que
Norovírus do rato seja classificado no GV como um novo genótipo, chamado
GV.II;
Devido à prevalência do vírus, sugerimos a inserção deste
agente na lista de exclusão da FELASA (Federação Européia de Animais de
Laboratório).
72
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