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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
ASSOCIAÇÃO ENTRE A INFECÇÃO PELO Trichuris Trichiura, PRODUÇÃO DE
CITOCINAS E DOENÇAS ALÉRGICAS DAS VIAS RESPIRATÓRIAS (ASMA) EM
CRIANÇAS DA REGIÃO METROPOLITANA DO RECIFE, PERNAMBUCO
JULIANA PRADO GONÇALES
RECIFE
2015
JULIANA PRADO GONÇALES
ASSOCIAÇÃO ENTRE A INFECÇÃO PELO Trichuris Trichiura, PRODUÇÃO DE
CITOCINAS E DOENÇAS ALÉRGICAS DAS VIAS RESPIRATÓRIAS (ASMA) EM
CRIANÇAS DA REGIÃO METROPOLITANA DO RECIFE, PERNAMBUCO.
Dissertação de mestrado apresentada a banca
avaliadora do Programa de Pós-Graduação em
Medicina Tropical do Centro de Ciências da
Saúde da Universidade Federal de Pernambuco,
para obtenção do título de mestre.
Orientadora: Drª. Valdênia Maria Oliveira de Souza
RECIFE
2015
Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária: Adelaide Lima, CRB4-647
G635a Gonçales, Juliana Prado. Associação entre a infecção pelo trichuris trichiura, produção de citocinas e
doenças alérgicas das vias respiratórias (asma) em crianças da Região Metropolitana do Recife, Pernambuco / Juliana Prado Gonçales. – Recife: O autor, 2015.
67 f.: il. tab.; 30 cm.
Orientadora: Valdênia Maria Oliveira de Souza. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco, CCS.
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, 2015. Inclui referências, apêndices e anexos.
1. Trichuris. 2. Asma. 3. Imunomodulação. 4. TH2. 5. Citocinas. I. Souza, Valdênia Maria Oliveira de (Orientadora). II. Título.
618.9883 CDD (23.ed.) UFPE (CCS2015-144)
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO (UFPE)
Pró-Reitoria para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação (PROPESQ)
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE (CCS)
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical (PPGMEDTROP)
RELATÓRIO DA BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DA MESTRANDA
J U L I A N A P R A D O G O N Ç A L E S
No dia 27 de fevereiro de 2015, às 09h00, na Sala do Depto. de Medicina Tropical do CCS/UFPE -, os
Membros Doutores: a Profa. Dra. Vlaudia Maria Assis Costa (Presidente da Banca – UFPE), a
Profa. Dr. Virgínia Maria Barros de Lorena (CPqAM/FIOCRUZ) e o Prof. Dr. André de Lima
Aires (UFPE), como componentes TITULARES da Banca Examinadora da mestranda JULIANA
PRADO GONÇALES sobre a sua Dissertação intitulada “ASSOCIAÇÃO ENTRE A INFECÇÃO
PELO Trichuris Trichiura, PRODUÇÃO DE CITOCINAS E DOENÇAS ALÉRGICAS DAS
VIAS RESPIRATÓRIAS (ASMA) EM CRIANÇAS DA REGIÃO METROPOLITANA DO
RECIFE, PERNAMBUCO”, a qual foi orientada pelo Prof. Dr. Valdênia Maria Oliveira de
Souza (UFPE). Ao final da arguição de cada membro da Banca Examinadora e resposta da mestranda,
as seguintes menções foram publicamente fornecidas.
Profa. Dra. Vlaudia Maria Assis Costa
Profa. Dra. Virgínia Maria Barros de Lorena
Prof. Dr. André de Lima Aires
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
REITOR
Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Francisco de Sousa Ramos
DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Nicodemos Teles de Pontes Filho
COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
MEDICINA TROPICAL
Valdênia Maria Oliveira de Souza
VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
MEDICINA TROPICAL
Vera Magalhães da Silveira
CORPO DOCENTE
Ana Catarina de Souza Lopes
Ana Lúcia Coutinho Domingues
Célia Maria Machado Barbosa de Castro
Edmundo Pessoa de Almeida Lopes Neto
Fábio André Brayner dos Santos
Heloísa Ramos Lacerda de Melo
Maria Amélia Vieira Maciel
Maria Rosângela Cunha Duarte Coêlho
Marli Tenório Cordeiro
Ricardo Arraes de Alencar Ximenes
Valdênia Maria Oliveira de Souza
Vera Magalhães da Silveira
Vlaúdia Maria Assis Costa
CORPO DOCENTE COLABORADOR
Maria de Fátima Pessoa Militão de Albuquerque
Rejane Pereira Neves
Dedico este trabalho a minha mãe, Irma pelo incentivo
constante e pelo amor incondicional ofertado.
E minha filha Ellen por sempre me dar forças para
seguir em frente. A vocês sou eternamente grata!
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter me concedido discernimento e sabedoria para que eu conseguisse
trilhar esse caminho.
A minha mãe pela dedicação e apoio incondicional e por me ensinar a nunca desistir.
A minha filha por sempre me dar forças e por compreender minha ausência em muitos
momentos.
A minha orientadora Drª. Valdênia Maria Oliveira de Souza pela oportunidade,
paciência e conhecimentos compartilhados.
A todas as crianças e responsáveis que participaram deste trabalho e contribuíram para
sua realização.
Ao Dr. Décio Medeiros pela colaboração e conhecimentos ofertados.
Ao Wheverton Ricardo, Érica Fernandes e Cássia Nobrega pela contribuição para o
desenvolvimento deste trabalho.
A todos do setor de Imunologia do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami
(LIKA) que contribuíram direta ou indiretamente para este trabalho.
Aos funcionários do Laboratório de Esquistossome Experimental do Centro de
Pesquisa Aggeu Magalhães (CPqAM/FIOCRUZ) pelo auxilio e conhecimento compartilhado.
Aos meus amigos Alan Montezano, Deborah Guimarães, Viviane Martha, Georgea
Cahu e Eduarda Mangueira pelo amor, paciência e apoio.
A CAPES pelo auxilio e incentivo a pesquisa.
“Don't be afraid of your fears.
They're not there to scare you.
They're there to let you know
that something is worth it.”
C. JoyBell C.
RESUMO
A prevalência de doenças alérgicas, como rinite e asma, é menor em países subdesenvolvidos,
onde há uma maior exposição a agentes infecciosos, como os helmintos. A relação entre
infecções com T. trichiura e a prevalência das doenças alérgicas e reatividade cutânea ainda
não está estabelecida. Os estudos divergem quanto à alteração (potencializar ou reduzir) do
quadro clínico e/ou testes cutâneos, bem como, a carga parasitária da população estudada. O
estudo teve como objetivo verificar se existe diferença entre a ocorrência de asma alérgica,
prick test, níveis séricos das citocinas IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α e anticorpos IgE anti-ascaris
em crianças com infecção ativa por T. trichiura. Para isto, crianças com ou sem asma foram
definidas pelo questionário ISAAC, foram realizados o prick-test, parasitológico
(Hoffman/Kato Katz) e coleta de sangue, que foi submetido a cultura (estimulada com PHA) e
o sobrenadante coletado para a dosagens das citocinas (CBA). A prevalência de crianças com
parasitológico positivo foi de 16,9 % (61/361 crianças), entre essas 27,9 % (17/61) foram
positivas para infecção por Trichuris trichiura (12/17) ou co-infectadas por Trichuris
trichiura/ Ascaris lumbricoides (5/17). O grupo de pacientes infectados, com ou sem asma,
produziram níveis significantemente elevados para todas as citocinas em relação ao grupo
controle. Além disso, o grupo dos pacientes infectados sem asma apresentou um tendência
maior de produção de IL-6, TNF-alfa e IL-10 que os com asma; os pacientes infectados e
asmáticos apresentaram uma menor reatividade no Prick Test quando comprado aos asmáticos
não infectados. Então, a infecção por T. trichiura parece modular positivamente os níveis das
citocinas TNF-α, IL-10 e IL-6, mas em pacientes asmáticos estes níveis tendem a ser
controlados. As reações de hipersensibilidade cutânea imediata parece ser menos frequente
em asmáticos quando infectados. Os dados levantam a possibilidade de uma modulação
mútua entre asma e tricuríase, favorecendo um estado de maior cronicidade de ambas
entidades de doença.
Palavra-chave: Trichuris. Asma. Imunomodulação. Th2. Citocinas.
ABSTRACT
The prevalence of allergic diseases such as rhinitis and asthma is smaller in developing
countries, where there is a greater exposure to infectious agents, such as helminths. The
relationship between infection with T. trichiura and the prevalence of allergic diseases and
skin reactivity is not yet established. Studies differ as to the nature of the change (increase or
reduce) in the clinical condition and/or skin tests, as well as the parasite load of the studied
population. The study aimed to determine whether there are differences between the
occurrence of allergic asthma, prick test, serum levels of IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α and anti-
Ascaris IgE antibodies in children with active infection by T. trichiura. For this purpose,
children with and without asthma were defined by the ISAAC questionnaire, prick-test and
parasitological (Hoffman/Kato Katz) were performed and blood samples were collected,
which were then subjected to culture (stimulated with PHA) and the collected supernatant for
cytokines measurements (CBA). The prevalence of children with positive parasitological was
16.9% (61/361 children), and among these 27.9% (17/61) were positive for Trichuris
trichiura infection (12/17) or co-infected with Trichuris trichiura/Ascaris lumbricoides
(5/17). The group of infected patients, with or without asthma, produced significantly high
levels for all cytokines in the control group. Furthermore, the group of patients infected
without asthma showed a greater tendency of IL-6,TNF-α and IL-10 production than those
with asthma; infected and asthmatic patients had a lower reactivity in Prick Test when
compared to those with asthma who were uninfected. Thus, the infection with T. trichiura
positively modulates the levels of TNF-α, IL-10 and IL-6 cytokines, but these levels in
asthmatic patients tend to be controlled. The immediate hypersensitivity skin reactions
appears to be less common in asthmatics when infected. The data raise the possibility of a
mutual modulation between asthma and trichuriasis, favoring a state of chronic course on both
disease entities.
Keyword: Trichuris. Asthma. Immunomodulation. Th2. Cytokines.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES E TABELAS
FIGURA 1 Esquema do ciclo biológico do Trichuris trichiura............................................ 17
TABELA 1 Características do grupo controle de acordo com idade, sexo, prick test, IgE
anti-ascaris...........................................................................................................
35
TABELA 2 Características do grupo de infectados de acordo com idade, sexo, prick test,
IgE anti-ascaris....................................................................................................
35
TABELA 3 Associação do prick test e IgE anti-ascaris entre as crianças
asmáticas..............................................................................................................
35
TABELA 4 Mediana das concentrações de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α e valores
absolutos de neutrófilos e eosinófilos em crianças asmáticas e não asmáticas
infectadas por Trichuris trichiura e controles.....................................................
36
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
APCs “Antigen-presenting cell” – Célula Apresentadora de Antígeno
TCR “T cell receptor” – Receptor de Célula T
MHC “Major histocompatibility complex” – Complexo Principal de Histocompatibilidade
Treg cell “Regulatory T cell” – Célula T Regulatória
IFN-γ Interferon - γ
STAT4 Transdutor e Ativador de sinal de Transcrição - 4
STAT6 Transdutor e Ativador de sinal de Transcrição - 6
IL-4 Interleucina-4
IL-5 Interleucina-5
IL-6 Interleucina-6
IL-9 Interleucina-9
IL-10 Interleucina-10
IL-12 Interleucina-12
IL-13 Interleucina-13
IL-17 Interleucina-17
IL-22 Interleucina-22
IL-25 Interleucina-25
IL-33 Interleucina-33
ILC-1 “Innate lymphoid cell” – Linfócitos Inatos tipo 1
ILC-2 “Innate lymphoid cell” – Linfócitos Inatos tipo 2
ILC-3 “Innate lymphoid cell” – Linfócitos Inatos tipo 3
MBP Proteína Básica Principal
TGF-β “Transforming Growth Factor Beta” – Fator de transformação do crescimento beta
FcεRI “High affinity immunoglobulin E receptor”
HRB Hiper-reatividade brônquica
MIP-1α “Macrophave Inflammatory Protein 1 alpha”
TNF-α “Tumor necrosis fator alpha” - Fator de necrose tumoral alpha
IgG Imunoglobulina G
IgE Imunoglobulina E
VEGF “Vascular endotelial growth fator” – Fator de crescimento endotelial vascular
ISAAC “International Study of Asthma and Allergies in Childhood”
CBA “Cytometric Bead Array”
OPD “Ortho-phenylenediamine” - Orto-fenilenodiamina
Prick Test Teste de Hipersensibilidade Cutâneo
ELISA Imunoensaio Enzimático
PHA “Phytohaemagglutinin” - Fitohemaglutinina
CPqAM Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães
LIKA Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami
SUMÁRIO
1. Introdução.......................................................................................................................... 14
2. Revisão de Literatura......................................................................................................... 16
2.1 Aspectos gerais da infecção por T. trichiura...................................................................... 16
2.2. Resposta Imune aos Helmintos.......................................................................................... 18
2.3 Imunopatogênese da Asma................................................................................................ 22
2.4 Interações entre as infecções por T. trichiura e a asma alergia.......................................... 24
3. Objetivos............................................................................................................................ 27
3.1 Objetivo Geral.................................................................................................................... 27
3.2 Objetivos Específicos......................................................................................................... 27
4. Materias e Métodos............................................................................................................ 28
4.1 Desenho do Estudo............................................................................................................. 28
4.2 Área do Estudo................................................................................................................... 28
4.3 População e grupos de estudo............................................................................................ 28
4.4 Critérios de Inclusão e Exclusão........................................................................................ 29
4.5 Coleta das amostras de fezes e realização do parasitológico............................................. 29
4.6 Aplicação do Questionário ISAAC.................................................................................... 30
4.7 Realização do Teste Cutâneo............................................................................................. 30
4.8 Coleta de sangue e realização do Leucograma................................................................... 31
4.9 Dosagem de IgE anti-Ascaris por Imunoensaio Enzimático Indireto)............................... 31
4.10 Cultura de Células.............................................................................................................. 31
4.11 Determinação dos níveis das citocinas por Cytometric Bead Array (CBA)...................... 32
4.12 Análise Estatística.............................................................................................................. 32
4.13 Fluxograma......................................................................................................................... 33
5. Resultados.......................................................................................................................... 34
6. Discussão............................................................................................................................ 37
7. Conclusão........................................................................................................................... 40
Referências......................................................................................................................... 41
Apêndice A - Gráficos das citocinas.................................................................................. 47
Apêndice B - Artigo em inglês........................................................................................... 50
Anexos................................................................................................................................ 62
14
1. INTRODUÇÃO
A prevalência de doenças alérgicas, como rinite e asma, é menor em países
subdesenvolvidos, onde há uma maior exposição a agentes infecciosos, como os helmintos
(PONTE et al, 2007). Um estudo com base populacional demonstrou que infecções por
geohemiltos (Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura e Ancylostomidae) inibem a
reatividade do teste cutâneo e a prevalência de sibilância (BIGGELAAR et al, 2004).
Entretanto, estudo realizado por PALMER et al, 2002, demonstrou que as infecções por A.
lumbricoides aumentaram a reatividade do teste cutâneo, enquanto um ensaio clínico
realizado por COOPER et al, 2005, sugeriu que as infecções por geohelmintos (A.
lumbricoides, T. trichiura e Ancylostomidae) não influenciam no teste cutâneo e nos
sintomas da asma. Estes dados demonstram que a reatividade do teste alérgico cutâneo
(“prick test”) e os sintomas de doenças alérgicas são controversos.
Em relação aos estudos que relacionam a infecção por T. trichiura, RODRIGUES et
al, 2008, demonstraram uma prevalência reduzida na reatividade do teste cutâneo em crianças
em idade escolar (10-13 anos) infectados com o helminto. Outro estudo realizado por
ALCÂNTRA-NEVES et al, 2010, demonstrou que a infecção por T. trichiura em pré-
escolares (2-4 anos), resultou em uma sibilância precoce sendo considerado um fator de risco
para a asma. Em 2010, um estudo randomizado duplo-cego, utilizando ovos de Trichuris suis
para o tratamento de doença de rinite alérgica, em pacientes adultos dinamarqueses, obteve
uma melhora nos sintomas da doença nas 27 semanas de tratamento em relação ao grupo
placebo (BAGGER et al, 2010).
A relação entre infecções com T. trichiura e a prevalência das doenças alérgicas e
reatividade cutânea ainda não está estabelecida. Os estudos divergem quanto à alteração
(potencializar ou reduzir) do quadro clínico e/ou testes cutâneos, bem como, a carga
parasitária da população estudada. O aspecto imunorregulatório das infecções por T. trichiura,
como o perfil Th2 (IL-4, IL-5 e IL-13, IgE) e de células T regulatórias (IL-10 e TGF-β), não
tem sido avaliado, e pode ter impacto sobre a asma e reações alérgicas atópicas (HELMBY et
al, 2009).
O presente estudo teve como objetivo verificar a correlação entre a infecção por T.
trichiura, a asma alérgica, a reatividade do teste cutâneo, os níveis séricos de citocinas (IL-4,
IL-6, IL-10 e TNF-α) e a dosagem de anticorpos IgE anti-ascaris em crianças da área urbana
do Recife. Sendo esta infecção comum em comunidades carentes no Estado, pretende-se,
15
então, verificar se a infecção ativa por T. trichiura pode ser considerado um fator protetor
para as manifestações de doenças alérgicas.
16
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Aspectos Gerais da Infecção por T.trichiura
Estima-se que mais de um bilhão de pessoas, em todo mundo, estejam infectadas por
pelo menos uma espécie de geohelmintos, principalmente, no países em desenvolvimento,
sendo o Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura e ancilostomídeos os mais frequentes
(FONSECA et al, 2010). As infecções por T. trichiura sozinha infecta quase 800 milhões de
pessoas no mundo, onde a maioria dos infectados são crianças em idade escolar (WHO,
2006), podendo essas crianças apresentar sinais de desnutrição, atraso no crescimento retardo
mental e déficits educacionais (BETHONY et al, 2006). A grande desigualdade
socioeconômica observada no Brasil, juntamente com o processo desordenado da urbanização
levam a população a viver em condições precárias, sem saneamento básico e infraestrutura, o
que propicia a transmissão das helmintíases.
A maioria das infecções são assintomáticas, sendo as consequências patológicas
causadas pelo parasita ao hospedeiro: diarreia, a má absorção, desnutrição, anemia,
dificuldade de aprendizagem, falta de concentração, problemas no desenvolvimento ósseo; os
casos mais graves estão ligados com a alta carga parasitária, imunidade e fatores nutricionais
do indivíduo, podendo ocorrer obstrução intestinal, hemorragia, prolapso retal e formação de
abcesso (STEPHENSON et al., 2000; REY, 2008).
A susceptibilidade as infecções por helmintos variam muito, mas está principalmente
relacionada com as condições econômicas da população, sendo que as maiores prevalências
ocorrem em áreas a qual o saneamento básico e a educação são deficientes e em regiões
tropicais, devido a temperatura e a umidade favorecer o ciclo de biológico do parasita,
entretanto, é possível ocorrer em outras regiões devido a imigração (COOPER et al. 2008;
NORMAN et al. 2010).
Devido à similaridade de hábitat fora do hospedeiro com o parasito Ascaris sp. a
distribuição de T. trichiura segue o mesmo padrão, sendo muito comum co-infecções. As
maiores prevalências, em crianças, são encontradas principalmente na China, Índia e outros
países asiáticos; América Latina; Caribe e Oriente Médio (STEPHENSON et al., 2000).
Um Estudo realizado por Fonseca et al, 2010, no norte e nordeste, demonstrou uma
prevalência de 36,5 % para infecção por geo-helmintos de 2.523 crianças estudadas, onde A.
lumbricoides foi a espécie mais frequente (25,1%), seguido por T.trichiura (12,2%) e
ancilostomídeos (12,2%). Seixas et al., 2011, em um estudo realizado na Bahia com 200
17
crianças demonstraram uma prevalência de 94%, onde 25% estavam infectados por
A.lumbricoides e 10% por T.trichiura, destes 188 pacientes infectados 39% eram
monoparasitados e 22% poliparasitados.
O T.trichiura tem o ciclo de vida direto, habitando o trato intestinal do hospedeiro
aonde a transmissão ocorre passivamente através dos ovos ingeridos pelo hospedeiro em
decorrência da contaminação por fezes. O desenvolvimento das larvas ocorre estritamente no
intestino. (BRADLEY & JACKSON, 2004)
Figura 1: Esquema do ciclo biológico do Trichuris trichiura.
Legenda: 1 – Ovos contidos nas fezes ganham o solo. 2 – desenvolvimento dos ovos no solo. 3 – Ovos se tornam
embrionados. 4 – Ovos infectantes. Após a ingestão, os ovos passam para o intestino delgado aonde ocorre a eclosão das
larvas. 5 - Maturação e estabelecimento no intestino. 6- Os vermes adultos vivem no ceco e migram para o cólon intestinal
aonde se fixam. A fêmea começa a eliminar os ovos entre 60 a 70 dias após a infecção que pode chegar a 20.000 ovos por
dia. Fonte: modificado de CDC. http://www.dpd.cdc.gov/dpdx
A fêmea elimina cerca de 3.000 a 20.000 ovos por dia. O embrião contido no ovo se
desenvolve no ambiente para se tornar infectante dependendo das condições ambientais,
18
sendo que temperaturas muito elevadas ou muito baixas não permitem o desenvolvimento dos
ovos. Porém, em condições ambientais ideais de temperatura (25ºC – 34ºC) e umidade (77%)
os ovos de T.trichiura podem se desenvolver e permanecer viáveis por um longo período
(NEVES, 2011).
Ao serem ingeridos, os ovos chegam ao intestino grosso sem migrar para qualquer
outro órgão, posteriormente, as larvas deixam os ovos e se fixam à mucosa tornando vermes
maduros em 1-3 meses (REY, 2008).
2.2 A resposta imune aos helmintos
Depois de milhões de anos de evolução, o sistema imunológico se desenvolveu para
combater diversos tipos de patógeno, sendo dividido em sistema imune inato e adaptativo. O
inato é responsável por agir rapidamente contra uma vasta gama de antígenos encontrados
frequentemente, reconhecendo estruturas compartilhadas por classes de organismos e que não
estão presentes no hospedeiro, enquanto que o adaptativo reconhece pequenas diferenças nos
antígenos para promover uma resposta mais especifica, tendo a capacidade de manter a
memória dos antígenos a qual o hospedeiro já foi exposto em algum momento (LI et al., 2011;
ABBAS et al., 2011).
Para que se inicie uma resposta do sistema imune é necessário que ocorra a
apresentação de antígenos específicos de cada patógeno invasor, para apresentar o antígeno ao
sistema imune, as células apresentadoras de antígenos (APCs) promovem o acoplamento do
receptor de células T (TCR) com o complexo peptídeo – MHC-II (complexo principal de
histocompatibilidade classe II) desencadeando a expansão clonal e diferenciação das células T
CD4. Este processo de diferenciação, de modo geral, resulta em respostas imunes altamente
polarizadas com secreção de citocinas e quimiocinas (ABBAS et al., 2011).
As células T auxiliares naive podem diferenciar-se em quatro subgrupos principais:
Th1, Th2, células T regulatórias (Treg) e Th17 (WEAVER & HATTON, 2009). A população
de células Th1 produzem grandes quantidades de interferon- γ (IFN-γ) e interleucina-12 (IL-
12), sendo esta resposta responsável por debelar patógenos intracelulares, enquanto a resposta
do tipo Th2 está relacionada com patógenos extracelulares, como as infecções helmínticas.
(LI et al., 2011)
19
Muitos fatores podem influenciar a diferenciação para uma resposta Th1 ou Th2, mas
as citocinas IL-12 e IL-4, respectivamente, são apontadas como o principal indutor destas
respostas, agindo como um transdutor e ativador da transcrição de sinal 4 e 6
(STAT4/STAT6) o que leva à uma expressão genética e, subsequente, diferenciação da
população específica (MULLEN et al., 2001; O 'SHEA et al., 2011)
As respostas imunes nas infecções por helmintos são múltiplas devido ao fato dos
parasitas serem antigenicamente muito complexos e com uma grande diversidade metabólica,
como também, o fato de terem a capacidade de sobreviver muitos anos dentro do hospedeiro
devido sua capacidade de imunomodulação do sistema imune ou a outros mecanismos de
escape (MACHADO et al., 2004).
Helmintos são patógenos indutores da resposta Th2 que incluem células inatas que
respondem ou secretam as citocinas IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13. Estas células inatas incluem
eosinófilos, basófilos, mastócitos, macrófagos alternativamente ativados (M2) e linfócitos
inatos do tipo 2 (ILC-2) (NUSSBAUM et al., 2013). Os macrófagos M2 tem uma baixa
expressão de IL-12 e uma levada expressão de IL-10 e tem como função promover um
ambiente antiinflamatório e imunossuprimido, participando na reparação tecidual, enquanto
os macrófagos-M1 tem expressão baixa de IL-10 e função pró-inflamatória (BISWAS et al.,
2010).
Os ILCs foram divididos em três subtipos: ILC-1 que secretam IFN-γ; ILC-2 secretam
IL-5 e IL-13 e o ILC-3 secretam IL-17 e IL22 (SPITS et al., 2013). Os macrófagos M1 e ILC-
1 em conjunto com as células Th1 mediam a imunidade protetora para vírus, bactérias e
tumores, enquanto que os macrófagos M2 e ILC-2 juntamente com as células Th2
desempenham um papel importante na expulsão do parasita. Apesar de toda indução
ocasionada pelos macrófagos M2, ILC-2 e células Th2, o parasita ainda pode persistir no
hospedeiro refletindo as potentes propriedades imunes da maioria dos helmintos, incluindo a
produção de moléculas imunomoduladoras que inibem a função das células T ou das APCs,
como também, podem promover a indução das células Treg (FINLAY et al., 2014).
A IL-4 liga-se ao IL-4R e IL-13R, resultando na ativação de STAT6, na realidade,
ambos os receptores partilham uma mesma subunidade (IL-4Ra) sendo um componente
crítico na resposta contra os helmintos. A IL-4 promove a mudança de classe de isótipo nas
células B o que resulta na produção de imunoglobulina G específica contra o parasita (IgG) e
IgE, como também, estimulam os macrófagos M2 que secretam uma variedade de compostos
anti-helmínticos que reduzem a viabilidade dos parasitas (RODRIGUEZ-SOSA et al., 2002;
ANTHONY et al., 2006; ANTHONY et al., 2007). Os M2 possuem uma alta expressão de
20
arginase-1 que promove a diminuição da L-arginina no microambiente, privando, os
helmintos deste aminoácido essencial (ANTHONY et al., 2 006).
Enquanto a IL-4 desempenha um papel importante na resposta imune do tipo Th2, essa
citocina não é necessária para a expulsão do parasita, porém, a IL-13, IL-4Rα e STAT6 são
essenciais para esta função (URBAN et al., 1998). A IL-13 está associada com a mediação
das alterações no órgão/tecido alvo, estando envolvida com a indução da hiperplasia das
células caliciformes, produção de muco e contração do musculo liso, auxiliando na
eliminação do parasita (ANTHONY et al., 2007). Cliffe et al., 2005, demonstram, em ratos
infectados com T.muris, que a IL-13 aumenta a atividade das células epiteliais no intestino o
que auxiliaria a expulsão do parasita.
A interleucina-5 (IL-5) promove a ativação dos eosinófilos que tem como função
atacar os helmintos liberando mediadores, como a proteína básica principal (MBP) ou através
de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (FINLAY et al., 2014). Kelly et al., 2010,
utilizando proteína purificada em um estudo in vitro, demonstrou a capacidade tóxica que a
MBP tem sobre um grande número de parasitas.
Outras duas citocinas, interleucina-6 (IL-6) e interleucina-9 (IL-9), têm sido
associadas com as infecções helmínticas tendo um papel importante tanto na susceptibilidade
quanto na resistência à infecção por helmintos. A IL-6 é uma citocina pleiotrópica com
amplas funções, tendo um papel importante na ativação e diferenciação dos macrófagos,
linfócitos e células B, como também, regula ativamente a inflamação aguda e crônica (NAKA
et al., 2002).
Pasare et al, 2004, mostraram que a produção de IL-6 em células dendríticas ativadas
inibem a função das células T regulatórias (Treg), enquanto que Wan et al., 2007
demonstraram uma expansão nestas células Treg por decorrência da produção da IL-6. Um
estudo realizado por Smith & Maizels em 2014, apontou a IL-6 como sendo um fator
determinante para a susceptibilidade à infecção helmíntica, modificando o fenótipo das
células Treg e limitando a capacidade de resposta protetora Th2.
Já a IL-9 é pertencente à família das citocinas de cadeia γ exercendo efeitos gerais em
vários tipos celulares, como: eosinófilos, células T e células epiteliais, sendo esta citocina
associada a resposta do tipo Th2 (NOELLE et al., 2010; WILHELM et al., 2012). As células
Th9 se desenvolvem a partir das células T CD4 + naive sob a influência conjunta da IL-4 e
TGF-β, produzindo IL-9 e IL-10, como também, co-expressam IL-17 (DARDALHON et al.,
2008; VELDHOEN et al., 2008; BERIOU et al., 2012). Estudos apontam que as células Th9
desempenham um papel importante nas alergias e na asma (SOROOSH et al., 2009), na auto-
21
imunidade (OUYANG et al., 2013) e na atopia (YAO et al., 2011), bem como, a IL-9 tem
sido implicada na resistência à infecção intestinal por helmintos (FAULKNER et al., 1997;
RICHARD et al., 2000)
Para que o sistema imune consiga promover a expulsão do parasita é necessário a
presença de células Th2, porém a IL-25 ou a IL-33 podem induzir produção suficiente de IL-
13, em nuócitos, a fim de promover o estímulo das células caliciformes para que ocorra a
expulsão do parasita do intestino (NEILL et al., 2010), mas, para que essa resposta do sistema
inato seja sustentada é necessária a ativação das células T CD4+ durante a infecção helmíntica
crônica. (LOKE et al., 2007).
O ambiente imunoregulado impede a eliminação do parasita, porém protege também,
o hospedeiro contra inflamações excessivas. Estudos apontam que este ambiente
imunoregulado induzido pelos helmintos possa ter um impacto sobre as respostas
imunológicas de infecções concomitantes e, talvez, alterar a progressão da doença.
(MATERA et al., 2008).
Correale et al., 2008 demonstram um aumento produção de IL-10 em pacientes com
infecção helmínticas e esclerose múltipla com melhora dos sintomas clínicos desses pacientes.
Em 2010, um estudo randomizado duplo-cego utilizando ovo Trichuris suis para o tratamento
de rinite alérgica em pacientes de 18-65 anos na Dinamarca, obteve uma melhora nos
sintomas da doença nas 27 semanas de tratamento em relação ao grupo placebo (BAGER et
al., 2010).
A infecção por T. trichiura/T. muris desvia para uma resposta de perfil misto, onde
ambas citocinas de resposta Th1, como as de Th2, são observadas. Já foi demonstrado que o
desenvolvimento inadequado da resposta Th1 pode levar a infecção crônica pelo parasita,
assim como, altos níveis de IFN- γ, IL-12 e IL-18, foram associados com a infecção (ELSE et
al., 1999; KLEMENTOWICZ et al., 2013). Além disso, Hayes et al., 2007, demonstraram que
o TNF-α promove uma resposta Th1 mais forte, associando esta citocina com uma melhora da
resposta imune Th1 e Th2 durante a infecção.
Além da resposta Th1, a resposta Th2 é o principal tipo de resposta presente na
infecção por T.trichiura/muris, as citocinas IL-4 e Il-13 são as principais citocinas que atuam
na resposta frente a este parasita, estando associadas com a resistência e expulsão do mesmo
(GRENCIS et al., 2001).
As citocinas regulatórias, IL-10 e TGF-β, também estão associadas com a infecção por
este parasita, Schopf et al., 2002 demonstraram que em ratos com deficiência de IL-10 a
infecção por T.muris foi severa ou até mesmo fatal, como também, Collison et al., 2010,
22
detectaram em ratos infectados por este parasita, altos níveis de ambas as citocinas. Em
conjunto as células regulatórias e as citocinas tem um papel importante na modulação da
resposta efetora e na sobrevivência e expulsão do parasita.
2.3 Imunopatogênese da Asma
A asma é uma doença inflamatória crônica caracterizada por hiper-reatividade das vias
aéreas inferiores e por limitação reversível do fluxo de ar, sendo desencadeada pela ativação
dos mastócitos do trato respiratório induzida por aeroalérgenos, em sua maioria, resultando
em uma constrição dos brônquios e secreção aumentada de muco, sendo caracterizada pela
presença de um grande número de linfócitos Th2, eosinófilos, neutrófilos. Manifesta-se,
clinicamente, por episódios recorrentes de sibilância, dispnéia, aperto no peito e tosse
(ASBAI/SBPT/SBP 2006; JANEWAY et al., 2002;)
A reação inflamatória é dependente dos linfócitos T CD4+ que secretam
preferencialmente citocinas do tipo 2 (IL-4, IL-5, IL-9, IL-13) sendo responsáveis pelo
desenvolvimento do quadro asmático (YSELL & GROUX, 2000; FIREMAN, 2003;
MUCIDA et al., 2003). Esta reação alérgica pode ocorrer em dois momentos, no inicial, a
qual ocorre a ligação da IgE aos receptores FcεRI presentes em basófilos e mastócitos que são
responsáveis pela liberação de mediadores inflamatórios; e no tardio ocorre migração de
células inflamatórias, como eosinófilos e linfócitos, para o tecido causando dano tecidual,
produção de muco e hiper-reatividade brônquica (HRB) (GONZALO et al., 1996; FIREMAN,
2003). O microambiente inflamatório é formado pelas citocinas, quimiocinas (eotaxina, MIP-
1α, entre outras), moléculas de adesão e seus receptores (VLA, ICAM e VCAM) (ANWAR et
al., 1994; WALSH et al., 1996; GONZALO et al., 1996).
A eosinofilia presente está associada com a produção da IL-5, sendo esta responsável
pela diferenciação, recrutamento e ativação dos eosinófilos, os produtos secretados
contribuem para o dano tecidual e como consequência a HRB e o remodelamento pulmonar
(HUMBLES, 2004). Já a IL-4 está associada com a polarização dos linfócitos para o padrão
Th2 e mudança de isótipo da imunoglobulina, e como isso, influencia as reações
imunológicas envolvidas na asma (HAILE et al., 1999).
A IgE possui um papel importante, já que é capaz de ativar mastócitos e basófilos, os
mastócitos ao serem ativados liberam mediadores como histaminas, triptases, prostaglandinas
23
e leucotrienos, contribuindo para indução, como também, manutenção do processo
inflamatório de fase tardia (BRADDING, 2003).
Além das células do perfil Th2, a subpopulação de células Th17 ativadas, são capazes
de produzirem, também, citocinas pró-inflamatórias (IL-17, TNF-α, IL-1β e IL-6) e
quimiocinas (CXCL1, CXCL2 e CXCL-8) sendo importantes para a inflamação mediada por
neutrófilos presentes na inflamação aguda observada na asma alérgica (HOSHINO et al.,
2000; PRAUSE et al., 2004; HASHIMOTO et al., 2005). A IL-17 induz, igualmente a il-6, a
produção de muco, como também, aumenta a expressão do fator de crescimento endotelial
vascular (VEGF) (HONORATI et al., 2004).
De acordo com a literatura, a prevalência da doença vem aumentando
progressivamente na última década, estima-se que cerca de 300 milhões de pessoas tenham a
doença, sendo responsável por 1 em cada 250 mortes, em todo o mundo (AKINBAMI et al.,
2012). De modo geral, os maiores índices de prevalência são encontrados em países
desenvolvidos, como Austrália, Estados Unidos e Canadá, enquanto as menores taxas são
encontradas em países ainda em desenvolvimento (ISAAC 1998). No Brasil a prevalência
média de sintomas entre crianças de 6-7 e 13-14 anos é de 24% e 19%, respectivamente
(SOLE et al., 2006).
A hipótese da higiene atribui esse aumento da prevalência a uma falha na
imunorregulação causada pela diminuição da exposição a certos organismos que coexistiam
com os hospedeiros definitivos ao longo da história evolutiva dos mamíferos (ROOK, 2007).
No Brasil é uma importante causa de morbidade e mortalidade com alto custo para os serviços
de saúde, porém os dados para quantificar esse impacto e os fatores de riscos envoltos na
doença ainda são escassos (COOPER et al., 2009).
Dentre os inúmeros fatores podem influenciar a asma alérgica, estão as infecções por
geohelmintos, principalmente Ascaris lumbricoides, T. trichiura e ancilostomídeos, sendo que
essas infecções estão amplamente distribuídas em países de clima quente e úmido (COPPER
et al., 2009). A prevalência global estimada é de 1,5 bilhões; 1,3 bilhões e 900 milhões,
respectivamente, com cerca de 2 bilhões de pessoas estão infectadas com pelo menos um
desses parasitas (BROOKER & HOTEZ et al., 2010).
Alguns estudos forneceram dados sugerindo que as infecções por helmintos podem
influenciar as doenças alérgicas, evidenciando que as infecções podem aumentar o risco de
manifestações asmáticas (LEONARDI-BEE et al., 2006; PEREIRA et al., 2007; SILVA et al.,
2008), enquanto outro demonstrou uma associação inversa (COPPER et al., 2006).
24
A influência dessas infecções sobre a asma pode depender de fatores ambientais,
intensidade da infecção, capacidade individual de reconhecimento de moléculas e o papel do
parasita na imunomodulação dos mediadores para inibir o processo inflamatório.
2.4 Interações entre as infecções por T. trichiura e a asma alérgica
Existem muitas semelhanças entre as respostas inflamatórias alérgicas com a resposta
imune induzida por helmintos, caracterizada pela presença de células do perfil Th2 que
secretam IL-13 e IL-4 estimulando células pró-inflamatórias (mastócitos e eosinófilos) a
liberarem outros medicadores (heparina, lipídios reativos, triptase e quinases) que levam ao
aumento da permeabilidade vascular, aumento na produção de muco e contração do músculo
liso (HOPKIN, 2009).
Os helmintos estão em constante ataque por uma gama de mecanismos com o objetivo
de expulsá-lo do hospedeiro. Para evitar que isso ocorra é necessário o desenvolvimento de
mecanismos por parte do parasita para estabelecer um ambiente não inflamatório e, assim, a
sobrevivência. Para aumentar esta sobrevivência o parasita modula a resposta imunológica
para um tipo menos apropriado, como interferir no equilíbrio das respostas Th1/Th2,
produção de citocinas reguladoras (IL-10 e TGF – β) promovendo supressão nas respostas de
células T e B, como também mimetiza proteínas do hospedeiro, levando a tolerância
(BRADLEY & JACKSON, 2004; HOPKIN, 2009).
Como os mecanismos supressores não são direcionados somente ao parasita, eles
podem afetar o desenvolvimento das reações alérgicas em pacientes com infecção ativa por
geohelmintos (MATERA et al., 2008). Tem sido proposto que a supressão ocasionada por
infecções helmínticas é mais importante em crianças do que em adultos e mesmo após a
eliminação da infecção esse perfil supressor é mantido (RODRIGUES et al., 2008). Além
disso, Guadalupe et al., 2009, demonstraram que as infecções helmínticas maternas afetariam
diretamente a imunidade infantil.
O mecanismo exato pelo qual o parasita modula a resposta imunológica ainda não
está totalmente esclarecido, porém, existe quatro fatores que podem determinar o efeito que o
helminto causa sobre a alergia: 1. Tempo - a duração da primeira infecção é um dos fatores
mais importantes, infecções mais duradoras podem estar mais propensas a induzir efeitos
moduladores no sistema imune, esse efeito supressor é mais importante nos primeiros anos de
25
vida e as infecções posteriores parecem não afetar nesse fenótipo já programado na infância
(COOPER et al., 2006; COOPER, 2009). 2. Intensidade da Infecção – altas cargas parasitárias
podem promover uma supressão maior do que baixas cargas parasitárias que podem ter o
efeito oposto (COOPER, 2009). 3. Genética – a capacidade de induzir os mecanismos de
imunomodulação podem estar relacionados com a genética do hospedeiro, onde aqueles
indivíduos susceptíveis a doenças atópicas podem ser mais propensos a desenvolver reações
alérgica à helmintos e outros alérgenos, como também, podem ser geneticamente mais
resistente a infecção (PEISONG et al., 2005; MOLLER et al., 2007; COOPER, 2009). 4.
Parasita – diferentes helmintos podem ter efeitos distintos sobre o risco de doenças alergias e
atópicas (LEONARDI-BEE et al., 2006; COOPER, 2009).
Há mais de uma década pesquisadores tentam estabelecer uma relação entre infecções
com helmintos e a intensidade e prevalência das doenças alérgicas (LYNCH et al., 1993;
DOLD et al., 1998; SCRIVENER et al., 2001). Cooper et al., 2003, concluiu em seu estudo
que as infecções parasitárias protegeriam contra à sensibilização alérgica, mas não seria
protetor em relação ao sibilos e rinite, onde a infecção por Ascaris e Trichuris estariam
associados a redução da prevalência de alergia no prick test, mas não nos sintomas alérgicos,
em crianças no Equador.
Um outro estudo realizado na Indonésia comparou a intensidade da infecção por
helmintos em crianças em idade escolar e concluíram que a intensidade da infecção seria um
fator importante na proteção para as doenças alérgicas (YAZDANBAKHSH & WAHYUNI et
al., 2005). Em estudo realizado na África por Haileamlak et al., 2005, demonstraram uma
associação entre as infecções parasitárias e a dermatite (atópica), onde as infecções por
Trichuris aumentariam o risco em desenvolver a doença.
Os estudos envolvendo Trichuris ainda são controversos, RODRIGUES et al, 2008,
demonstrou uma prevalência reduzida na reatividade do teste do cutâneo em escolares (10-13
anos) com infecção ativa por Trichuris Trichiura, assim como, MONCAYO et al., 2012,
apontou que não existe associação entre a infecção ativa por geohelmintos e os sibilos.
Entretanto, ALCÂNTARA-NEVES et al., 2010, demonstrou que a infecção por T.
trichiura em pré-escolares (2-4 anos), resultou em uma sibilância precoce sendo considerado
um fator de risco para a asma. Em 2010, um estudo randomizado duplo-cego utilizando ovo
Trichuris suis para o tratamento de rinite alérgica em pacientes de 18-65 anos na Dinamarca,
obteve uma melhora nos sintomas da doença nas 27 semanas de tratamento em relação ao
grupo placebo (BAGER et al., 2010).
26
As infecções por helmintos produzem moduladores potentes da resposta inflamatória
do hospedeiro que os protegem contra morte ou expulsão. A identificação desses fatores e
uma compreensão dos mecanismos que levam a modulação, pode resultar no
desenvolvimento de novos tratamentos antiinflamatórios.
27
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Verificar a associação entre a asma alérgica, reatividade do teste cutâneo para
alérgenos respiratórios, níveis séricos das citocinas IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α e anticorpos IgE
anti-ascaris em crianças com infecção ativa por Trichuris trichiura quando comparadas com
crianças sem infecção por Trichuris trichiura, na região urbana do Recife.
3.2 Objetivos específicos
Comparar entre crianças com infecção ativa por Trichuris trichiura e crianças sem
infecção por Trichuris trichiura, quanto a:
Asma Alérgica;
Reatividade positiva do teste cutâneo para alérgenos respiratórios;
Níveis de anticorpos IgE anti-ascaris;
Níveis de citocinas IL-4, IL-6, IL-10 e TNF-α;
Contagem de Eosinófilos.
28
4. MATERIAL E MÉTODO
4.1 Desenho do estudo
Foi realizado um estudo de caso-controle para verificar a associação da asma alérgica,
reatividade do teste cutâneo para alérgenos respiratórios, níveis séricos das citocinas IL-4, IL-
6, IL-10, TNF-α e anticorpos IgE anti-ascaris, onde o caso foram os crianças com infecção
ativa e asma alérgica e o controle paciente com asma alérgica sem a infecção ativa.
4.2 Área do estudo
O estudo foi realizado na Ilha de Itamaracá- PE pertencente a região metropolitana do
Recife, localizada a aproximadamente 48 km da capital Pernambucana. A população é
estimada em 24.413 habitantes. Possui uma área de 66.684 km², com densidade populacional
de 364.37 hab./km², sendo o clima da região é tropical chuvoso, com verão seco (IBGE,
2014). O Índice de Desenvolvimento Humano do município é de 0,653, sendo similar ao do
estado de Pernambuco (0,616).
4.3 População e grupos do estudo
Foram cadastradas 655 crianças com idade entre 2-14 anos, onde 361 crianças
realizaram o exame parasitológico. As crianças que apresentaram parasitológico negativo
foram classificadas entre asmáticas e não asmáticas pelo questionário ISAAC e divididas em
dois grupos controles (não infectados com asma e não infectados sem asma).
Os pacientes asmáticos foram definidos a partir da resposta positiva para a questão 2
do questionário ISAAC e os pacientes com infecção por T.trichiura foram definidos através
do parasitológico.
Os grupos serão divididos de acordo com a presença ou não de asma e infecção ativa:
1. Infecção Ativa por T. trichiura e Asma alérgica;
2. Infecção Ativa por T. trichiura e sem Asma alérgica;
3. Sem infecção Ativa por T. trichiura e com Asma alérgica;
4. Sem Infecção Ativa por T. trichiura e sem Asma alérgica.
29
4.4 Critérios de inclusão e exclusão
Critérios de inclusão do estudo:
Indivíduos com idade entre 4-14 anos;
Ambos os sexos;
Para o grupo dos casos foi utilizado somente crianças com infecção por
Trichuris trichiura e co-infectadas com T.trichiura + A.lumbricoides.
Critérios de exclusão:
Idade superior a 14 anos de idade;
< 4 anos;
Adolescentes gestantes;
Tratamento com anti-helmíntico realizado até seis meses antes da primeira
coleta de fezes;
Apresentarem positividade para protozoários patogênicos e outros parasitas na
amostra de fezes coletada;
Pacientes com outras doenças respiratórias (hipertrofia adenoideanas,
insuficiência respiratória crônica causada por: fungos, bactérias e vírus)
concomitante com asma ou rinite.
4.5 Coleta das amostras de fezes e realização do parasitológico
A coleta do material fecal da população do estudo foi realizada mediante a distribuição
de recipientes numerados que serão recolhidos em prazo máximo de 24 horas. No momento
em que os recipientes foram distribuídos foi informado ao responsável pelo paciente o
objetivo da pesquisa (de maneira clara) e as instruções necessárias para a coleta de fezes e
sangue (jejum mínimo de 4 horas). No dia seguinte, foi recolhida a amostra de fezes e
realização da coleta de sangue (10mL), através de punção na veia cubital. Foram coletados
5mL de sangue em tubos com heparina para dosagens de anticorpos o questionário (ISAAC)
foi aplicado logo após a coleta de sangue.
O material fecal foi transportado para o Laboratório de Esquistossomose do CPqAM-
Fiocruz, e as amostras foram submetidas às técnicas de Hoffman e Janer e Kato-Katz exame
30
direto das fezes para a pesquisa de cistos de protozoários, bem como ovos e larvas de
helmintos, com leitura de 3 lâminas.
A inclusão dos moradores que aderirem ao projeto foi vinculada a assinatura do Termo
de Consentimento Livre e Esclarecido (ANEXO I).
4.6 Aplicação de questionário ISAAC
Após a coleta das amostras de sangue foram aplicados os questionários do protocolo
ISAAC, módulo asma e rinite, validados no Brasil (SOLÉ et al. 1998; VANNA et al. 2001).
Os questionários foram preenchidos na presença da pesquisadora principal e/ou dos auxiliares
de pesquisa, devidamente treinados e especialmente instruídos para evitar explicações que
poderiam interferir nas respostas (LUNA et al., 2011) (ANEXO II).
4.7 Realização do teste cutâneo
Para realização do teste cutâneo, foi explicado aos pacientes os procedimentos de
realização do exame e sua importância. A superfície volar medial do antebraço foi avaliada
para exclusão de lesões dérmicas e realizar-se-á a assepsia com álcool 70%. Colocar-se-á os
extratos de alérgenos (gota única), utilizando-se o conta-gotas, a uma distância de
aproximadamente 2 cm, e com um PUNTOR®: (dispositivo plástico que limita o grau de
penetração na pele) inocular os alérgeno na região sub-cutânea dos pacientes. Após 3 minutos,
retira-se o excesso de extrato com papel toalha, evitando-se contaminar os testes vizinhos.
Faz-se leitura 15 a 20 minutos após a puntura. O teste cutâneo de leitura imediata para
alérgenos inalantes é composta por: Dermatophagoides pteronyssimus, Dermatophagoides
farinae, Blomia tropicalis, Periplaneta americana, Blatela germanica, epitélio de cão, epitélio
de gato, mistura de fungos e Aspergilus sp, além de controle positivo (histamina 10 mg/mL) e
negativo (excipiente) (IPI-ASAC). A detecção de pápula de induração com pelo menos 3 mm
em seu diâmetro médio caracterizará o teste positivo.
31
4.8 Coleta de sangue e realização do Leucograma
As amostras de sangue, utilizadas nas dosagens sorológicas e ensaio molecular, foram
encaminhadas ao setor de Imunologia do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami
(LIKA). As amostras foram então centrifugadas a 5.000 r.p.m. durante 10 minutos e o plasma
será separado e armazenado sob-refrigeração a -80 ºC para posterior dosagem dos parâmetros
avaliados.
Para o Leucograma as amostras de sangue foram coletadas em tubos estéril a vácuo
com anticoagulante (EDTA) sendo processadas no mesmo dia da coleta em aparelho de
automação. As lâminas foram coradas utilizando-se técnicas de May-Grunwald-Giemsa e
submetidas à análise e contagem por microscopia óptica e avaliação dos níveis totais e
diferenciais de leucócitos (BRITO et al., 2012).
4.9 Dosagem de IgE anti-Asc por Imunoensaio Enzimático Indireto
As placas de 96 poços (Nunc MaxiSorp, Roskilde, Denmark) foram sensibilizadas por
3 horas, 25°C, com 15 g/mL de antígeno solúvel de Ascaris diluídos em tampão carbonato
bicarbonato (50L/poço). Em seguida as placas foram lavadas três vezes com tampão de
lavagem PBS-T (Tween 0,05%) e os poços foram então bloqueados com 100L/poço de PBS-
T contendo 3% de leite “overnight” a 4°C. As placas novamente foram lavadas três vezes com
PBS-T e foram adicionados os soros dos pacientes na diluição de 1:10 diluídos em PBS
0,01M e incubados a 37ºC por 1h. Um novo ciclo de lavagens foi realizado e em seguida se
adicionou o anti-IgE humano conjugado a peroxidase, produzidos em cabra (Sigma, cód:
A9667). Após nova lavagem com PBS-T (3x), a revelação foi realizada com OPD (Ortho-
phenylenediamine, Sigma Chemical, St. Louis, Mo., USA) dissolvido em tampão tris-citrato
0,1M (pH 5,5) e H2O2. As placas foram lidas no leitor de ELISA (OD450).
4.10 Cultura de células
As culturas de sangue total foram realizadas em tubos de polipropileno de 14 mL (BD
SystemTM). Foram utilizados 500µL de sangue total em 1 mL de meio RPMI 1640 com
glutamina (2mM), gentamicina 50mg/mL(Sigma), 10mM HEPES (Sigma) e 5% soro fetal
bovino (Cultilab). As células foram estimuladas separadamente com Phytohaemagglutinin
(PHA) ou apenas com meio de cultura e incubadas por 24 horas, a 37ºC em estufa de CO2.
32
Após esse período, o sobrenadante foi coletado e armazenado. A detecção das citocinas com o
mitógeno foi maior do que as condições sem estimulo (dados não mostrados).
4.11 Determinação dos níveis das citocinas por Cytometric Bead Array (CBA)
As amostras de sobrenadante de cultura armazenadas a –80 ºC foram descongeladas à
temperatura ambiente e submetidas detecção das citocinas IL4, IL-6, IL-10 e TNF-α por
citometria de fluxo através de partículas (bead) ligadas com PE padrão, (BD Bioscienses) por
meio da técnica:“Cytometric Bead Array” (CBA). O procedimento foi realizado conforme a
descrição do manual de instrução do BD™ Cytometric Bead Array (CBA) for Human
Th1/Th2 Cytokine Kit II.
4.12 Análise Estatística
Para a análise das citocinas, primeiramente foi verificado a existência da associação
entre os grupos utilizando o teste não paramétrico de Krustal-Wallis e posteriormente, o teste
não paramétrico Mann-Whitney para comparar as medianas entre os grupos. Para comparar a
positividade do prick test, IgE anti-ascaris, sexo, idade e distribuição da asma foi realizado o
Teste Exato de Fisher ou o teste do Qui-Quadrado. Todas as análises foram realizadas
utilizando o programa GraphPrism 5.0.
33
4.12 FLUXOGRAMA
Parasitológico
Assinatura do TCLE
Informações sobre a pesquisa
Entrega do material para coleta fecal
Coleta da amotra de fezes
Teste cutâneo Coleta de sangue
Aplicação do ISAAC
Dosagem IgE
Anti-asc
Leucograma
Processamento e
armazenamento
Cultura celular Coleta de sangue
Dosagem do nível das citocinas
34
5. RESULTADOS
A prevalência de crianças com parasitológico positivo foi de 16,9 % (61/361 crianças),
entre essas 27,9 % (17/61) foram positivas para infecção por Trichuris trichiura (12/17) ou
co-infectadas por Trichuris trichiura/Ascaris lumbricoides (5/17). Das 31 crianças
selecionadas para controle, 51,60% (16/31) eram asmáticas e 48,40% (15/31) não asmáticos,
de acordo com os critérios utilizados. Dos pacientes asmáticos 81,25% (13/16) apresentaram
positividade para o Prick Test, enquanto nos não asmáticos essa positividade foi de apenas
7,7% (1/13), sendo assim estatisticamente significante (p= 0.0001).
A média de idade das crianças asmáticas (não infectadas) foi de 7,2 anos e das não
asmáticas de 9,25 anos. Quanto ao IgE anti-ascaris não houve diferença estatística entre os
dois grupos. Os dados referentes a sexo, idade, reatividade do teste cutâneo (Prick Test) e IgE
anti-ascaris foram apresentados na tabela 1. Das 17 crianças do grupo de casos, 52,9 % (9/17)
foram classificadas com asmáticas e 47,1% (8/17) como não asmática. Os dados referentes a
sexo, idade, carga parasitária, reatividade do teste cutâneo e IgE anti-asc foram apresentadas
na Tabela 2.
Nas crianças infectadas a média de idade foi de 8,7 anos, com predomínio de
crianças do sexo feminino (77,77%), entre o grupo das crianças asmáticas, sendo a associação
entre sexo estatisticamente significante (p=0.01). As crianças asmáticas apresentaram uma
prevalência de 44% para a reatividade positiva do PrickTest, enquanto que as não asmáticas
essa prevalência foi de 37%, sendo que a associação do prick test neste grupo não foi
estatisticamente significante (p=0.63).
Ao associar a positividade do Prick Test entre os indivíduos asmáticos (infectados e
não infectados) não foi possível estabelecer uma relação estatisticamente significante, porém
apresentou uma maior prevalência entre as crianças não infectadas. O IgE anti-ascaris,
apresentou um resultado semelhante, mas a prevalência foi similar entre os dois grupos
(Tabela 3).
35
Tabela 1
Características do grupo controle de acordo com a idade, sexo, prick test, IgE anti-ascaris
*p obtido através do teste exato de Fisher.
#
p obtido através do Qui-quadrado
Tabela 2
Características do grupo dos infectados de acordo com a idade, sexo, prick test, IgE anti-
ascaris.
*p obtido através do teste exato de Fisher
Tabela 3
Associação do prick test e IgE anti-ascaris entre as crianças asmáticas
*p obtido através do teste exato de Fisher
Asmático Não Asmático p
N° 16/31 (51,60%) 15/31 (48,40%)
Idade # 0.5936
≤ 7 anos 9/16 (56,25%) 7/15 (46,66 %)
≥8 anos 7/16 (43,75%) 8/15 (53,33 %)
Sexo # 0.8705
Feminino 7/16 (43,75%) 8/15 (53,33 %)
Masculino 9/16 (56,25%) 7/15 (46,66 %)
Prick Test* 13/16 (81.25%) 1/13 (7.7%) 0.0001
IgE Anti-asc # 6/16 (37,5%) 7/15 (46,6%) 0.6052
Asmáticos Não Asmáticos p*
N° 9/17 (52,90%) 8/17 (47,1%)
Idade 0.6372
≤ 7 anos 4/9 (44,44%) 5/8 (62,5%)
≥8 anos 5/9 (66,66%) 3/8 (37,5%)
Sexo 0.01
Feminino 8/9 (77,77%) 2/8 (25,00 %)
Masculino 1/9 (22,23%) 6/8 (75,00 %)
Prick Test 4/9 (44,44%) 3/8 (37,50%) 0.6372
IgE Anti-asc 6/9 (66,66%) 2/8 (46,6%) 0.1534
Carga Parasitária 0.6199
Alta 2/9 (22,22%) 3/8 (37,50 %)
Baixa 7/9 (77,78%) 5/8 (62,5 %)
Infectados Não Infectados p*
Prick Test 4/9 (44,44%) 13/16 (81,25%) 0.087
IgE Anti-asc 6/9 (66,66%) 10/16 (62,50%) 1.000
36
Para a análise das citocinas os grupos foram agrupados em asmáticos e não asmáticos
com análise das medianas dos valores obtidos através da dosagem por CBA do sobrenadante
de cultura estimulado com PHA. Em todas as citocinas ocorreram maior produção, quando
comparadas entre os infectados asmáticos com os não infectados asmáticos, bem como, os
infectados não asmáticos com os não infectados sem asma, sendo estatisticamente significante
em todas as análises.
Quando comparamos os valores de neutrófilos e eosinófilos entre os grupos de
asmáticos e não asmáticos (com e sem infecção), somente os eosinófilos do grupo dos não
asmáticos apresentaram uma associação estatisticamente significante. Ao relacionar as
citocinas entre o grupo dos infectados (com e sem asma) verificamos uma associação positiva
( p <0.01) somente para a IL-10, apesar da TNF-α apresentar uma tendência ao aumento em
crianças não asmáticas ( p<0.1). Os valores de p, mediana, e valor mínimo-máximo das
citocinas, neutrófilos e eosinófilos estão demonstrados na Tabela 4.
Tabela 4
Mediana das concentrações de IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α e valores absolutos de neutrófilos e
eosinófilos em crianças asmáticas e não asmáticas infectadas por Trichuris trichiura e
controles.
*p<0.05 quando comparado ao grupo controle.
**p<0.05 quando comparado ao grupo de
infectados não asmáticos. O valor de p foi obtido através da análise das medianas por Mann-
Whitney
Asmáticos Não Asmáticos
Infectados
(n = 9)
Controles
(n = 16)
p* Infectados
(n = 8)
Controles
(n = 15)
p*
IL-4 5,19
(0-8,15)
0
(0-5,11)
0.0001 6,57
(5,08-8,49)
0
(0-5,06)
0.0001
IL-6 2.553
(56,35-23.551)
29,02
(2,45-2.218)
0.0044 5.055
(5.010-27.830)
46,43
(0-3.551)
0.0002
IL-10** 23,82
(5,9-394,33)
0
(8,93-19,39)
0.0004 60,19
(58,15-227,40)
0
(0-67,09)
0.0006
TNF-α 12,52
(10,95-1.461)
0
(0-16,77)
0.0005 93,91
(28,84-158,73)
0
(0-82,78)
0.0017
Neutrófilos 3.312
(1.454-6.577)
4.377
(2.358-7.207)
0.7656 3.113
(1.792-5.101)
5.017
(1.360-7.732)
0.0587
Eosinófilos 439
(376-4.430)
890
(558-2245)
0.2572 502
(256-4.430)
229
(89-455)
0.0279
37
6. DISCUSSÃO
Atualmente, os estudos divergem quanto a relação da infecção helmíntica e a asma
alérgica, principalmente em pacientes infectados com T. trichiura e co-infectados. As
citocinas podem promover a supressão ou indução nas respostas celulares, refletindo nas
manifestações alérgicas no hospedeiro (BRADLEY & JACKSON, 2004; HOPKIN, 2009).
Neste estudo, foi avaliada a produção de IL-4, IL-6, TNF-α e IL-10, reatividade do teste
cutâneo para aeroalérgenos, IgE anti-ascaris, eosinófilos e neutrófilos em crianças asmáticas
com infecção ativa por T. trichiura e/ou co-infectados T. trichiura/A. lumbricoides.
O estudo contou com um número pequeno de crianças infectadas com T. trichuris
quando comparado com outros estudos (RODRIGUES et al., 2008MONCAYO et al., 2010;
ALCÂNTRA-NEVES et al., 2010). É sabido que a diminuição da prevalência das
helmintíases, como também do T. trichiura, vem sendo relatada devido à estratégia do
Ministério da Saúde brasileiro em realizar tratamento em massa nas crianças de escolas
públicas. Este fato pode explicar a baixa prevalência de infectados obtidos, que difere de
outros estudos que não são de zona urbana, onde há falhas na estratégia de tratamento em
massa (VASCONCELOS et al., 2011; SILVA et al., 2014).
Então, a fim de evitar perdas de pacientes, não foi realizado um pareamento entre sexo
e idade a fim de evitar a influência destas variáveis nos resultados. Pode ser observada maior
prevalência do sexo feminino entre os asmáticos infectados e do sexo masculino no grupo
apenas de infectados. Embora saibamos da necessidade de maior número de crianças, nós não
acreditamos numa influência do sexo em nossos resultados, visto que a média de idade foi de
8,7 anos. Nesta fase, não há influência dos hormônios femininos e a marcha atópica
(fenômeno de progressão com a idade da asma que ocorre no sexo masculino) é mais evidente
na adolescência (SPERGEL, 2005; RAMIREZ-DEL-POZO et al., 2012). Então, se faz
necessário um estudo de acompanhamento a fim de comprovar estas considerações.
Sendo assim, foi possível observar que os níveis de produção de citocinas pro-
inflamatórias e reguladoras, IL-6, TNF-α e IL-10, e a reatividade do teste cutâneo para
aeroalérgenos foi menor em crianças asmáticas com infecção ativa por T. trichiura e/ou co-
T.trichiura/A.lumbricoides.
Para o TNF-α, ambos os grupos, asmáticos e não asmáticos, apresentaram maiores
níveis desta citocina quando infectados. Este aumento pode estar associado com a infecção
helmíntica, visto que o TNF-α juntamente com a IL-13 são responsáveis por promoverem a
secreção de MUC2 e RELMβ que auxiliam diretamente na expulsão do parasita (HAYES et
38
al., 2007). Em acordo com nossos achados, outros estudos relataram o aumento de TNF-α em
pacientes infectados com T. trichiura ou T. muris (TURNER et al., 2002). Além disso, aqui,
os pacientes infectados apresentaram baixa carga parasitária e Stefan et al., 2002
demonstraram relação inversa onde altas cargas parasitárias estão relacionadas com uma
redução na secreção de TNF-α.
Apesar do TNF-α ser uma citocina pró-inflamatória presente em pacientes asmáticos
(HOSHINO et al., 2000), foram detectados níveis baixos em pacientes asmáticos (AL-
DAGHRI et al., 2014). Aqui, níveis semelhantes de TNF-α foram também observados em
pacientes controles (sem infecção) asmáticos em relação ao não asmático. Contudo, pacientes
asmáticos e infectados apresentaram menores níveis de TNF-alfa (embora não significativos)
que os não asmáticos e infectados, podendo então, a manifestação alérgica estar influenciando
negativamente nos níveis de TNF-α.
De modo semelhante ao TNF-α, foi detectada mais IL-6 nos pacientes infectados com
uma tendência maior de produção nos pacientes quando não asmáticos. Em conjunto, estes
achados sugerem uma menor produção de citocinas pro-inflamatórias nestas condições:
tricuríase/ascaridíases junto com asma.
A função imunossupressora da IL-10 é apontada, em pacientes infectados e portadores
de doenças crônicas (esclerose múltipla e rinite alérgica) como causa de melhora clínica da
doença (CORREALE et al., 2008; BAGER et al., 2010; REYES et al., 2011; VLUGT et al.,
2012). No nosso estudo, a tricuríase levou a maiores níveis de IL-10 nos indivíduos sejam
asmáticos ou não. Contudo, foi possível observar menores níveis de IL-10 nos pacientes
infectados asmáticos do que quando infectados não asmáticos. Então, a tricuríase nos
asmáticos não levou ao aumento desta citocina. É possível que nos indivíduos com asma os
níveis menores de IL-10 estejam associados a fatores genéticos dos pacientes, como a
presença de polimorfismos genéticos que levam à menor síntese e níveis séricos desta citocina
(SALES et al., 2012; FIGUEIREDO et al., 2013).
Em conjunto, estes dados parecem excluir a participação da IL-10 na tendência de
diminuição da IL-6 e TNF-α observada. De fato, para as infecções por geo-helmintos a IL-10
parece não atuar nesta imunomodulação, e sim, a possível ação das T regulatórias via contato
ou TGF-β (SOUZA et al., 2013; MATERA et al., 2008).
Com relação a IL-4, ocorreu produção maior de IL-4, bem como, de eosinófilos
quando observamos as crianças não asmáticas e infectadas. Dados esses que corroboram os já
publicados em que a IL-4 e eosinófilos participam da resposta imune ao parasita (BElKAID et
al., 2006) caracterizando um perfil Th2. Embora a IL-5 tenha um papel no aumento de
39
eosinófilo circulantes, a IL-4 também está envolvida com a ativação destas células
(DAVOINE & LACY, 2014). A IL-4, também modula positivamente as manifestações
alérgicas (HAILE et al., 1999), porém ao analisar as duas entidades de doenças juntas (asma +
infecção) não houve uma maior produção desta citocina e de eosinófilos circulantes, quando
comparados aos indivíduos apenas com a infecção.
Apesar de a literatura relatar a influência da IgE anti-Asc como sendo um fator de
risco, onde altos títulos estão associados com a piora da asma (FAULKER et al., 2002;
ALCÂNTARA-NEVES et al., 2010), nós não observamos diferença neste parâmetro entre os
grupos. Da mesma forma, não houve diferença entre a presença de sintomas alérgicos e a
infecção helmíntica, achados estes semelhantes ao encontrado em outros estudos (COOPER et
al., 2003; MONCAYO et al., 2012). Contudo, a reatividade do teste cutâneo foi mais
frequente nos pacientes não infectados e asmáticos, sendo possível associar a presença da
infecção com a diminuição da reatividade do Prick Test. Esses achados corroboram com os
estudos Rodrigues et al., 2008; Moncayo et al., 2010, que relataram uma prevalência reduzida
no Prick Test em pacientes infectados por T. trichiura com baixa carga parasitária. Estes
autores sugerem a participação de células T regulatórias, induzida pelo parasita, na redução do
prick-test. Estas células teriam um efeito supressor em tecidos distantes, como a pele, e
interfeririam negativamente na ativação dos mastócitos. Os autores sugerem ainda que a
primeira infecção pelo parasita poderia programar o sistema imunológico para um perfil
menos alérgico e as infecções posteriores mediariam a fase efetora.
Em resumo, a infecção por T. trichiura parece modular positivamente os níveis das
citocinas TNF-α, IL-10 e IL-6, mas em pacientes asmáticos estes níveis tendem a ser
controlados. As reações de hipersensibilidade cutânea imediata parecem ser menos frequentes
em asmáticos quando infectados. Apesar da necessidade de ampliar o estudo, no que diz
respeito ao número de pacientes e parâmetros imunológicos, os dados levantam a
possibilidade de uma modulação mútua entre asma e tricuríase, favorecendo um estado de
maior cronicidade de ambas entidades de doença.
40
7. CONCLUSÃO
1. A infecção por T. trichiura induz maiores níveis de citocinas TNF-α, IL-10 e IL-6,
mas em pacientes asmáticos são modulados negativamente;
2. Ocorreu produção maior de IL-4, bem como, de eosinófilos quando observamos as
crianças apenas infectadas, caracterizando um perfil Th2. Nas crianças asmáticas e
infectadas, observamos a produção maior apenas de IL-4, mas não de eosinófilos, em
comparação as asmáticas sem infecção;
3. As reações de hipersensibilidade cutânea imediata são menos frequentes em asmáticos
quando infectados;
4. Não foi observado influência do IgE anti-Asc nos grupos estudados.
41
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47
APÊNDICE A
Gráfico das dosagens das citocinas por CBA.
Pacientes Asmáticos
IL-4 - Asmáticos
Infe
ctad
o
Não
Infe
ctad
o
0
2
4
6
8
10
IL-6 - Asmáticos
Infe
ctad
o
Não
Infe
ctad
o
0
5000
10000
15000
20000
IL-10 - Asmáticos
Infe
ctad
o
Não
Infe
ctad
o
0
100
200
300
400
500
TNF-a - Asmáticos
Infe
ctad
o
Não
Infe
ctad
o
0
500
1000
1500
2000
Todos as análises foram realizadas por Mann Whitney
p < 0.0001 p < 0.0044
p < 0.0004 p < 0.0001
48
Pacientes Não Asmáticos
IL-4 - Não Asmático
Infe
ctad
o
Não
Infe
ctad
o
0
2
4
6
8
10
IL-6 - Não Asmáticos
Infe
ctad
o
Não
Infe
ctad
o
0
10000
20000
30000
IL-10 - Não Asmáticos
Infe
ctad
o
Não
Infe
ctad
o
0
200
400
600
TNF-a - Não Asmáticos
Infe
ctad
o
Não
Infe
ctad
o
0
50
100
150
200
Todos as análises foram realizadas por Mann Whitney
p < 0.0001 p < 0.0002
p < 0.0006 p < 0.0017
49
Pacientes Infectados
IL-4 Infectados
Asm
átic
os
Não
Asm
átic
os
0
2
4
6
8
10
IL-6 - Infectados
Asm
áticos
Não
Asm
áticos
0
10000
20000
30000
IL-10 - Infectados
Asm
átic
os
Não
Asm
átic
os
0
200
400
600
TNF-a - Infectados
Asm
átic
os
Não
Asm
átic
os
0
100
200
300
400
p < 0.1139 p < 0.1828
p < 0.01 p < 0.13
Todos as análises foram realizadas por Mann Whitney
50
APÊNDICE B
Article in English
ASSOCIATION BETWEEN THE Trichuris trichiura ACTIVE INFECTION,
CYTOKINE PRODUCTION AND ALLERGIC RESPIRATORY DISEASES
(ASTHMA) IN CHILDREN OF THE METROPOLITAN REGION OF RECIFE,
PERNAMBUCO
Juliana Prado Gonçales1, Valdênia Maria Oliveira Souza
1
1Immunology Section - Keizo Asami Immunopathology Laboratory (LIKA) - Federal
University of Pernambuco, Recife - PE / Brazil.
Abstract
The prevalence of allergic diseases such as rhinitis and asthma is smaller in developing
countries, where there is a greater exposure to infectious agents, such as helminths. The
relationship between infection with T. trichiura and the prevalence of allergic diseases and
skin reactivity is not yet established. Studies differ as to the nature of the change (increase or
reduce) in the clinical condition and/or skin tests, as well as the parasite load of the studied
population. The study aimed to determine whether there are differences between the
occurrence of allergic asthma, prick test, serum levels of IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α and anti-
Ascaris IgE antibodies in children with active infection by T. trichiura. For this purpose,
children with and without asthma were defined by the ISAAC questionnaire, prick-test and
parasitological (Hoffman/Kato Katz) were performed and blood samples were collected,
which were then subjected to culture (stimulated with PHA) and the collected supernatant for
cytokines measurements (CBA). The prevalence of children with positive parasitological was
16.9% (61/361 children), and among these 27.9% (17/61) were positive for Trichuris
trichiura infection (12/17) or co-infected with Trichuris trichiura/Ascaris lumbricoides
(5/17). The group of infected patients, with or without asthma, produced significantly high
levels for all cytokines in the control group. Furthermore, the group of patients infected
without asthma showed a greater tendency of IL-6,TNF-α and IL-10 production than those
with asthma; infected and asthmatic patients had a lower reactivity in Prick Test when
compared to those with asthma who were uninfected. Thus, the infection with T. trichiura
positively modulates the levels of TNF-α, IL-10 and IL-6 cytokines, but these levels in
asthmatic patients tend to be controlled. The immediate hypersensitivity skin reactions
appears to be less common in asthmatics when infected. The data raise the possibility of a
mutual modulation between asthma and trichuriasis, favoring a state of chronic course on both
disease entities.
Keyword: trichuris, helminths, asthma, immunomodulation, Th2, cytokines.
51
1. Introduction
According to the literature, the prevalence of allergic disorders has been increasing
progressively over the past decade. It is estimated that approximately 300 million people have
the disease, accounting for one in every 250 deaths worldwide (Akinbami et al., 2012). The
hygiene hypothesis attributes this increase in prevalence to a failure in immunoregulation
caused by decreased exposure to certain organisms coexisted with the definitive hosts
throughout the evolution of mammals (Rook, 2007).
Among the many factors can influence allergic asthma are STH infections, particularly
Ascaris lumbricoides, T. trichiura and hookworms, and these infections are widespread in
countries with hot and humid weather (Copper et al., 2009). The estimated overall prevalence
is 1.5 billion; 1.3 billion and 900 million, respectively, with about 2 billion people are
infected with at least one of these parasites (Brooker and Hotez et al., 2010).
As already reported (Bradley and Jackson, 2004; Matera et al.,2008; Rodrigues et al.,
2008; Hopkin, 2009) the parasite is able to survive for years in the host by modulating the
immune response to establish a favorable environment for their survival, with production of
regulatory cytokines. As the suppressor mechanisms are not directed only to the parasite, they
can affect the development of allergic diseases in patients with active infection STH.
However, this relationship is not yet fully understood, particularly in patients infected by
T.trichiura.
This study aims to determine the correlation between infection with T. trichiura,
allergic asthma, skin test reactivity to respiratory allergens, serum cytokine levels (IL-4, IL-6,
IL-10 and TNF-α) and the dosage of anti-allergen IgE antibodies in children in Recife
metropolitan area.
2. Methods and Materials
2.1 Study Design and Population
We conducted a case-control study in the Metropolitan Region of Recife,
approximately 18 km of the Pernambuco capital. The population is estimated at 4,046,845
inhabitants. It has an area of 3.995.9 square kilometers, and the climate is rainy tropical, with
dry summer. We studied 655 children aged 2-13 years recruited from kindergartens and
schools, of which 361 children underwent parasitological examination. Children with negative
52
parasitological were ranked among asthmatic and asthma by ISAAC questionnaire and
divided into two control groups (not infected with asthma and not infected without asthma).
2.2 Parasitological Analysis
Samples were subjected to Hoffman, Pons and Janer, Kato -Katz techniques and direct
examination of stool for the presence of protozoan cysts and helminth eggs and larvae, with
reading 3 blades.
2.3 Prick Test
Skin testing was performed on the right forearm of each child using standardized
extracts (IPI ISAC Brasil®) of Dermatophagoides pteronyssinus, Blomia tropicalis, Blattella
germanica, Periplaneta americana, fungi and the cat and dog fur. Salt and 10 mg/ml
histamine solution were used as negative and positive controls, respectively. The reactions
were read after 15 minutes and an average size of wheal 3mm or greater was considered
positive.
2.4 Cell Culture
Whole blood cultures were performed in polypropylene tubes of 14 ml (BD
SystemTM). 500μL whole blood were used in 1 ml RPMI 1640 with glutamine (2 mM),
gentamicin 50 mg/ml (Sigma), 10mM HEPES (Sigma) and 5% fetal bovine serum (Cultilab).
Cells were separately stimulated with Phytohaemagglutinin (PHA) or with only culture
medium and incubated for 24 hours at 37ºC in CO2 incubator. After this period, the
supernatant was collected and stored. Detection of cytokines with the mitogen was higher
than the conditions with no stimulation (data not shown).
2.5 Anti-IgE Asc
Dosing was performed using the indirect enzyme immunoassay technique "inhouse".
The 96-well plates (NuncMaxiSorp, Roskilde, Denmark) were coated overnight, 4°C with 40
μg/ml soluble Ascaris antigen diluted in carbonate bicarbonate buffer (50μL/well), after
washing, were then blocked with 100 μL/well of PBS-T-BSA and incubated at 37°C. A new
washing cycle is performed and then it was added 50μL of sample already diluted. After a
further incubation and washing, it was added anti-IgE human conjugated to peroxidase
produced in goat (Sigma A9667). After further incubation buffer was added to the developer
53
(comprising OPD - Ortho-phenylenediamine, Sigma Chemical, St. Louis, Mo., USA, diluted
in tris-buffered citrate and H2O2). Plates were read at two absorbance times the cut-off.
2.6 Determination of Cytokine
Determination of cytokine levels was performed using a Cytometric Bead Array
(CBA) for Human Th1/Th2 Cytokine Kit II (BD Bioscienses). Patients were considered
positive with value equal to or higher than 4.9 pg/mM (IL-4), 4.5 pg/mL (IL-10), 2.4 pg/mL
(IL-6) and 3.8 pg/mL (TNF-α)
2.7 Definition of Asthma
Classification was carried out through the questionnaires ISAAC, asthma and rhinitis
module, validated in Brazil (Solé et al 1998;. Vanna et al., 2001). Questionnaires were filled
by the child's legal guardian.
2.8 Statistical Analysis
For statistical analysis we used the Mann-Whitney test, Fisher's exact test, chi-square.
All analyzes were performed using the GraphPrism 5.0.
3. Results
The prevalence of children with positive parasitological was 16.9% (61/361 children),
among these 27.9% (17/61) were positive for infection with Trichuris trichiura (12/17) or co-
infected with Trichuris trichiura/Ascaris lumbricoides (5/17). Of the 31 children selected for
control, 51.60% (16/31) were asthmatic and 48.40% (15/31) without asthma, according to the
criteria used. Of asthmatic patients 81.25% (13/16) were positive for Prick Test, while in non-
asthmatic this positivity was only 7.7% (1/13), so statistically significant (p = 0.0001).
The average age of asthmatic children (uninfected) was 7.2 years and the non-
asthmatic 9.25 years. As for the anti-Ascaris IgE, there was no statistical difference between
the two groups. Data regarding gender, age, skin test reactivity (Prick Test) and IgE anti-
Ascaris were presented in Table 1. Of the 17 children in the case group, 52.9% (9/17) were
classified as asthmatic and 47.1% (8/17) as non-asthmatic. Data regarding gender, age,
parasite load, skin test reactivity and IgE anti-asc were presented in Table 2.
In children infected average age was 8.7 years, with female children predominant
(77.77%) among the group of asthmatic children, and the association between sex statistically
54
significant (p= 0.01). Asthmatic children showed a prevalence of 44% for positive reactivity
Prick Test, whereas among non-asthmatic this prevalence was 37%, and the association of
prick test in this group was not statistically significant (p=0.63).
By associating the Prick Test positivity among asthma patients (infected and
uninfected), it was not possible to show a statistically significant relationship, but it had a
higher prevalence among uninfected children. The IgE anti-Ascaris, showed a similar result,
but the prevalence was similar between the two groups (Table 3).
For the analysis of cytokines, groups were grouped in asthmatic and non-asthmatic
with analysis of median values obtained from dosing by CBA culture supernatant stimulated
with PHA. In all cytokines occurred higher production compared between asthmatic patients
infected with non-asthmatics infected as well as non-asthmatics infected with uninfected
without asthma, being statistically significant in all analyzes.
Comparing the values of neutrophils and eosinophils among asthmatic and non-
asthmatic groups (with and without infection), only the non-asthmatic group of eosinophils
showed a statistically significant association. By linking cytokines among the group of
infected (with and without asthma), it was observed a positive association (p <0.01) only for
IL-10, despite TNF-α showing a tendency to increase in non-asthmatic children (p <0.1) . The
p values, median, minimum, and maximum value of cytokines, neutrophils and eosinophils
are shown in Table 4.
4. Discussion
Currently, studies differ as the relationship between helminth infection and allergic
asthma, particularly in patients infected with T. trichiura and co-infected. The cytokines may
promote the suppression or induction in cellular responses, reflecting allergic manifestations
in the host (Bradley and Jackson, 2004; Hopkins, 2009). This study evaluated the IL-4, IL-6,
TNF-α and IL-10, the skin test reactivity to aeroallergens, Ascaris anti-IgE, neutrophils and
eosinophils in asthmatic children with active infection by T. trichiura and/or co-infected T.
trichiura/A.lumbricoides.
The study included a small number of children infected with T. trichiura when
compared to other studies (Rodrigues et al, 2008; Moncayo et al, 2010; Alcantra-Neves et al.,
2010). It is known that the reduction of the prevalence of helminth infections, as well as the T.
trichiura has been reported due to the Brazilian Ministry of Health's strategy to conduct mass
treatment in public school children. This may explain the low prevalence of infected obtained,
55
which differs from other non-urban areas studies where there are gaps in mass treatment
strategy (Vasconcelos et al., 2011; Silva et al., 2014).
So, in order to avoid loss of patients a pairing of gender and age was not carried out in
order to avoid the influence of these variables on the results. It was observed higher
prevalence of females among the infected asthmatic and of males in the group only infected.
Although we are aware of the need for more children, we do not believe in the influence of
gender on our results, as the average age was 8.7 years. At this stage, there is no influence of
the female hormones and the atopic march (progression phenomenon at the age of asthma that
occurs in males) is more evident in adolescence (Sergel et al., 2005; Ramirez-Del-Pozo et al.,
2012). So, a follow-up study is needed to prove these considerations.
Therefore, it was possible to observe that the production levels of pro-inflammatory
cytokines and regulatory, IL-6, TNF-α and IL-10, and the reactivity skin test for inhalant
allergens was lower in asthmatic children with active infection by T. trichiura and/or co-
T.trichiura /A.lumbricoides.
For TNF-α, both groups, asthmatics and non-asthmatics, had higher levels of this
cytokine when infected. This increase may be associated with the helminth infection, whereas
TNF-α together with IL-13 are responsible for promoting the secretion of MUC2 and RELMβ
which assist directly in the expulsion of the parasite (Hayes et al., 2007). In accordance with
our findings, further studies reported an increase in TNF-α in patients infected with
T.trichiura or T.muris (Turner et al., 2002). Moreover, here, the infected patients had low
parasite load and Stefan et al., 2002 demonstrated an inverse relationship where high parasitic
loads are related to a reduction in TNF-α secretion.
Although TNF-α is a pro-inflammatory cytokine present in patients with asthma
(Hoshino et al., 2000), low levels were detected in asthmatics (Al-Daghri et al., 2014). Here,
similar levels of TNF-α were also observed in control patients (without infection) asthmatics
compared to non-asthmatic. However, asthma and infected patients had lower TNF-alpha
levels (although not significant) to asthmatics and non-infected, which can then be allergic
manifestation negatively influencing the TNF-α levels.
Similarly to TNF-α, IL-6 was detected more in infected patients with an increased
tendency production in patients non-asthmatic. Together, these findings suggest a lower
production of pro-inflammatory cytokines in these conditions: trichuriasis/ascariasis with
asthmas.
Immunosuppressive function of IL-10 is pointed in infected patients and those with
chronic diseases (multiple sclerosis and allergic rhinitis) as cause of clinical improvement of
56
the disease (Correale et al., 2008; Bager et al., 2010; Reyes et al., 2011; Van der Vlugt et al,,
2012.) In our study, trichuriasis led to higher IL-10 levels in individuals whether they are
asthmatic or not. However, it was observed lower levels of IL-10 in asthmatic patients
infected than non-asthmatics infected. Thus the trichuriasis in asthmatics did not lead to
increase in this cytokine. It is possible that in individuals with asthma, lower levels of IL-10
are associated with genetic factors of patients, as the presence of genetic polymorphisms lead
to reduced synthesis, and serum levels of this cytokine (Sales et al., 2012; Figueiredo et al.,
2013).
Together, these data seem to exclude the involvement of IL-10 in the downward trend
of IL-6 and TNF-α observed. Indeed, for infections by soil-transmitted helminths IL-10
appears to not act in this immunomodulation, but actually the possible actions of T regulatory
via contact or TGF-β (Souza et al., 2013; Matera et al., 2008).
It is worth mentioning that the cytokine IL-6 has been described as an important factor
in controlling innate immune responses and cellular, for its effects on the differentiation of
distinct cell subsets as Th17 and Treg and thus mediate pro-inflammatory responses or anti-
inflammatory, respectively (Schon; Weiskirchen and Tacke, 2014). In the presence of TGF-β
and IL-6 is induced to Th17 lymphocyte profile; whereas in the absence of IL-6, TGF-β
promotes the generation of Treg lymphocytes (Bettelli et al., 2006; Akdis et al., 2012.). Then,
lower IL-6 levels could favor greater generation of T regulatory in infected asthma group.
This fact deserves to be investigated as well as TGF-β levels in patients and controls.
Regarding IL-4, there was a increased production of IL-4, as well as eosinophils when
we observe children without asthma and infected. These data corroborate those already
published in which IL-4 and eosinophils participate in the immune response to the parasite
(Belkaid et al., 2006) featuring a Th2 profile. Although IL-5 plays a role in the increase of
circulating eosinophils, IL-4 is also involved in activation of these cells (Davoine and Lacy,
2014). IL-4, also positively modulates the allergic manifestations (Haile et al., 1999), but
when analyzing the two entities joints diseases (asthma + infection) there was no increased
production of this cytokine and circulating eosinophils when compared to individuals, only
with the infection
Although the literature report the influence of anti-Asc IgE as a risk factor where high
titers are associated with worsening of asthma (Faulker et al., 2002; Alcântra-Neves et al.,
2010), we did not observe any difference in this parameter between the groups. Similarly,
there was no difference between the presence of allergy symptoms and helminth infection,
these findings similar to that found in other studies (Cooper et al., 2003; Moncayo et al.,
57
2012.).However, the reactivity of the skin test was more frequent in asthmatic patients and
uninfected being possible to associate the presence of infection with decreased reactivity
Prick Test. These findings corroborate the study Rodrigues et al., 2008; Moncayo et al., 2010,
which reported a low prevalence in Prick Test in patients infected by T. trichiura with low
worm burden. These authors suggest the participation of T regulatory cells induced by the
parasite, in reducing the prick test. The cells would have a suppressive effect on distant tissues
such as skin and interfere negatively with the activation of mast cells. The authors also
suggest that the first parasite infection could program the immune system to a less allergic
profile and subsequent infections mediate the effector phase.
5. Conclusion
The infection with T. trichiura positively modulates levels of the cytokines TNF-α, IL-
10 and IL-6, but these levels in asthmatic patients tend to be controlled. The immediate
hypersensitivity skin reactions appears to be less common in asthmatics when infected.
Despite the need to expand the study, with regard to the number of patients and
immunological parameters, the data raise the possibility of a mutual modulation between
asthma and infection by T. trichiura, favoring a more chronic state of the two disease entities.
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60
Table1
Characteristics Group control according to the age, sex, skin prick test, IgE anti-Ascaris
*p obtained by Fisher's exact test.
#
p obtained by Chi-square
Table 2
Characteristics of the group infected with age, sex, skin prick test, anti-IgE ascaris.
*p obtained by Fisher's exact test.
Asthmatic Non-Asthmatic p
N° 16/31 (51,60%) 15/31 (48,40%)
Age # 0.5936
≤ 7 years 9/16 (56,25%) 7/15 (46,66 %)
≥8 years 7/16 (43,75%) 8/15 (53,33 %)
Sex # 0.8705
Female 7/16 (43,75%) 8/15 (53,33 %)
Male 9/16 (56,25%) 7/15 (46,66 %)
Prick Test* 13/16 (81.25%) 1/13 (7.7%) 0.0001
IgE Anti-asc # 6/16 (37,5%) 7/15 (46,6%) 0.6052
Asmáticos Não Asmáticos p*
N° 9/17 (52,90%) 8/17 (47,1%)
Age # 0.6372
≤ 7 years 4/9 (44,44%) 5/8 (62,5%)
≥8 years 5/9 (66,66%) 3/8 (37,5%)
Sex # 0.01
Female 8/9 (77,77%) 2/8 (25,00 %)
Male 1/9 (22,23%) 6/8 (75,00 %)
Prick Test 4/9 (44,44%) 3/8 (37,50%) 0.6372
IgE Anti-asc 6/9 (66,66%) 2/8 (46,6%) 0.1534
Parasite load 0.6199
High 2/9 (22,22%) 3/8 (37,50 %)
Low 7/9 (77,78%) 5/8 (62,5 %)
61
Table 3
Association prick test and IgE anti-Ascaris among asthmatic children
*p obtained by Fisher's exact test.
Table 4
Median concentrations of IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TNF-α and absolute values of neutrophils
and eosinophils in asthmatic and non-asthmatic children infected with Trichuris trichiura, and
controls.
* p <0.05 when compared to the control group. ** p <0.05 when compared to non-asthmatics
infected group. The p value was obtained by analysis of medians by Mann-Whitney
GUIDE FOR AUTHORS
Internacional Journal of Parasitology
https://www.elsevier.com/journals/international-journal-for-parasitology/0020-7519/guide-
for-authors
Infectados Não Infectados p*
Prick Test 4/9 (44,44%) 13/16 (81,25%) 0.087
IgE Anti-asc 6/9 (66,66%) 10/16 (62,50%) 1.000
Asthmatic Non-Asthmatic
Infected
(n = 9)
Controls
(n = 16)
p* Infected
(n = 8)
Controls
(n = 15)
p*
IL-4 5,19
(0-8,15)
0
(0-5,11)
0.0001 6,57
(5,08-8,49)
0
(0-5,06)
0.0001
IL-6 2.553
(56,35-23.551)
29,02
(2,45-2.218)
0.0044 5.055
(5.010-27.830)
46,43
(0-3.551)
0.0002
IL-10** 23,82
(5,9-394,33)
0
(8,93-19,39)
0.0004 60,19
(58,15-227,40)
0
(0-67,09)
0.0006
TNF-α 12,52
(10,95-1.461)
0
(0-16,77)
0.0005 93,91
(28,84-158,73)
0
(0-82,78)
0.0017
Neutrófilos 3.312#
(1.454-6.577)
4.377
(2.358-7.207)
0.7656 3.113
(1.792-5.101)
5.017
(1.360-7.732)
0.0587
Eosinófilos 439#
(376-4.430)
890
(558-2245)
0.2572 502
(256-4.430)
229
(89-455)
0.0279
62
ANEXO
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)
Título do projeto: INFECÇÃO ATIVA PELO S. mansoni OU GEO-
HELMINTOS E SEU EFEITO SOBRE OS NÍVEIS DE IL-33, ST2 SOLÚVEL E
QUIMIOCINAS EM PACIENTES COM ASMA ALÉRGICA DO MUNICÍPIO DE
JABOATÃO DOS GUARARAPES, PERNAMBUCO.
Durante a leitura do documento abaixo fui informado(a) que posso interromper para
fazer quaisquer perguntas.
O estudo acima citado tem por objetivo estudar os anticorpos e hormônios (citocinas)
envolvidos alergia no sangue de crianças de 5 a 14 anos de idade com asma e com vermes
intestinais. Em outros estudos parece que estes anticorpos e hormônios são diferentes em
crianças alérgicas com e sem parasitos intestinais (vermes) e parece que isto é capaz de
modificar as manifestações das doenças alérgicas nas crianças parasitadas. Também será
avaliado o comportamento destes anticorpos no sangue de crianças não alérgicas, com e sem
vermes, para comparar com as crianças alérgicas.
Foi solicitada a minha permissão para que o menor sob minha guarda
___________________________________________ participe desta pesquisa. Serão
selecionadas crianças residentes no município de Jaboatão dos Guararapes, Pernambuco.
A participação do menor está relacionado a responder um questionário sobre as
doenças alérgicas, coleta de fezes para exame parasitológico, retirada de 10 ml (1 colher de
sopa) de sangue da veia do braço com agulha e seringa descartáveis para medir os anticorpos
e hormônios (citocinas) a cada três meses (até 12 meses). As crianças que tiverem parasitoses
serão tratadas da verminose – a escolha do remédio vai depender do verme encontrado.
Os riscos que as crianças podem ter ao participar desta pesquisa são o de acontecer
hematoma (mancha roxa) no local da retirada de sangue e de ter algum efeito colateral da
63
medicação (náusea, vômitos, diarréia) para vermes, que são raros e, de qualquer forma deverá
ser tomada, pois os vermes fazem mal à saúde e devem ser eliminados.
De benefício pessoal, a criança terá o tratamento da verminose e será verificado se a
parasitose foi eliminada a cada 3 meses (até completar um ano), e receberei orientações de
higiene e métodos para evitar uma nova infecção. No caso das crianças alérgicas, o tratamento
seguirá normalmente dentro do atendimento no Ambulatório.
A contribuição para o conhecimento das doenças e sua relação (alergias e verminoses)
poderá levar a um melhor tratamento das alergias e das verminoses, mas isto pode não ocorrer
diretamente para o menor sob minha guarda.
As minhas respostas, informações e resultados dos exames serão anotadas
(questionário) e guardadas nos arquivos/pastas e computadores do Laboratório de
Imunopatologia Keizo Asami (LIKA) sob a responsabilidade da Dr.ª Valdênia Souza e MSc.
Wheverton Nascimento.
Uma vez que todo o atendimento será feito durante as visitas regulares dos pacientes
ao tratamento Ambulatorial em postos de saúde, não está previsto pagamento de despesas de
locomoção.
Foi explicado que tenho o direito de recusar a participação do menor sob minha
guarda, ou, se já a tiver dado, retirá-la, sem necessidade de explicação e sem perda de
qualquer direito e de atendimento digno no referido Ambulatório. As informações desta
pesquisa são confidenciais e a identidade do menor será preservada, sem que apareça o nome
do menor em nenhum documento de divulgação dos resultados ou qualquer dado que possa
identificá-lo.
64
Nome do responsável________________________________________
Assinatura________________________________ Data ___/___/___
Menor___________________________________ Data ___/___/___
Testemunha 1: ______________________________ Data ___/___/___
Testemunha 2: ______________________________ Data ___/___/___
Nome do Intrevistador: ________________________ Assinatura: ______________
Contatos importantes:
Dr.ª Valdênia Souza e MSc. Wheverton Nascimento
Endereço: Av. Professor Moraes Rego, s/n Cidade Universitária, Recife - PE, 50.670-420
Telefones: 2101-2661 / 2101-2515 / 2101-2500
E-mail: [email protected]
Comitê de ética em Pesquisa:
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM/FIOCRUZ) - Av. Professor Moraes
Rego, s/n Cidade Universitária, CEP: 50.670-420, Tel: 2101-2500
Digital
65
ANEXO
Questionário ISAAC
Preencha o espaço indicado com o nome do posto de saúde, o nome da criança, e data
de nascimento. Se você cometer um erro nas respostas de escolha simples, circule os
parênteses e remarque a resposta correta. Marque somente uma opção, a menos que seja
instruído para o contrário. Posto de Saúde:____________________________________________________
Data de hoje: ______ / ______ / ______
Nome da criança:__________________________________________________
Idade da criança:____________ Data de nascimento: _____/_____/_____
(Assinale todas as respostas até o final do questionário)
Sexo da criança: ( ) Maculino ( ) Feminino
Questionário 1
1) Alguma vez no passado, seu(sua) filho(filha) teve sibilos (chiado no peito)?
( ) Sim ( ) Não
Se você respondeu não, passe para a questão número 6
2) Nos últimos 12 (doze) meses, seu(sua) filho(filha) teve sibilos (chiado no peito)?
( ) Sim ( ) Não
3) Nos últimos 12 (doze) meses, quantas crises de sibilos (chiado no peito) seu(sua)
filho(filha) teve?
( ) Nenhuma crise
( ) 1 a 3 crises
( ) 4 a 12 crises
( ) mais de 12 crises
4) Nos últimos 12 (doze) meses, com que frequência seu(sua) filho(filha) teve o sono
perturbado por chiado no peito?
( ) Nunca acordou com chiado
( ) Menos de 1 noite por semana
( ) Uma ou mais noites por semana
5) Nos últimos 12 (doze) meses, seu chiado foi tão forte a ponto de impedir que seu(sua)
filho(filha) conseguisse dizer mais de 2 palavras entre cada respiração?
( ) Sim ( ) Não
6) Alguma vez na vida seu(sua) filho(filha) teve asma?
( ) Sim ( ) Não
7) Nos últimos 12 (doze) meses, teve chiado no peito após exercícios físicos?
( ) Sim ( ) Não
8) Nos últimos 12 (doze) meses, seu(sua) filho(filha) teve tosse seca á noite, sem estar
gripado ou com infecção respiratória?
( ) Sim ( ) Não
66
Questionário 2
Todas as perguntas são sobre problemas que ocorreram quando você não estava gripado ou
resfriado
1) Alguma vez na vida seu(sua) filho(filha) teve problema com espirros ou coriza (corrimento
nasal), quando não estava resfriado ou gripado?
( ) Sim ( ) Não
Se a resposta foi não, passe para a questão 6.
2) Nos últimos 12 (meses), seu(sua) filho(filha) teve algum problema com espirros, coriza
(corrimento nasal) ou obstrução nasal quando não estava gripado ou resfriado?
( ) Sim ( ) Não
3) Nos últimos 12 (doze) meses, esse problema nasal foi acompanhado de lacrimejamento ou
coceira nos olhos?
( ) Sim ( ) Não
4) Nos últimos 12 (doze) meses, esse problema nasal ocorreu? (Por favor, marque em qual ou
quais meses isso ocorreu).
( ) Janeiro ( ) Maio ( ) Setembro
( ) Fevereiro ( ) junho ( ) Outubro
( ) Março ( ) Julho ( ) Novembro
( ) Abril ( ) Agosto ( ) Dezembro
5) Nos últimos 12 (doze) meses, quantas vezes as atividades diárias do(da) seu(sua)
filho(filha) foram atrapalhadas por esse problema nasal?
( ) Nasal
( ) Um pouco
( ) Moderado
( ) Muito
6) Alguma vez na vida seu(sua) filho(filha) teve rinite?
( ) Sim ( ) Não
67
ANEXO
