Liliana Andrea Villegas Sierra

Avaliação dos Parâmetros de Transporte de um Biocolóide

através de uma Areia Saturada

Dissertação de Mestrado

Dissertação apresentada ao Programa de Engenharia da PUC-Rio como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Engenharia Civil.

Orientador: Prof. Tácio Mauro Pereira de Campos Co-orientador: Profa. Denise Maria Mano Pessôa

Rio de janeiro

Setembro de 2010

Liliana Andrea Villegas Sierra

Avaliação dos Parâmetros de Transporte de um Biocolóide

através de uma Areia Saturada

Dissertação apresentada como requisito parcial para obtenção do título de Mestre pelo Programa de Pós-Graduação em Engenharia Civil da PUC-Rio. Aprovada pela Comissão Examinadora abaixo assinada.

Prof. Tácio Mauro Pereira de Campos Orientador

Departamento de Engenharia Civil - PUC-Rio

Profa. Denise Maria Mano Pessôa Co-orientador

Departamento de Engenharia Civil - PUC-Rio

Prof. Eurípedes de Amaral Vargas Jr. Departamento de Engenharia Civil - PUC-Rio

Profa. Maria Claudia Barbosa Universidade Federal do Rio de Janeiro

Prof. José Tavares Araruna Júnior Departamento de Engenharia Civil - PUC-Rio

Prof. José Eugenio Leal Coordenador(a) Setorial do Centro Técnico Científico - PUC-Rio

Rio de Janeiro, 27 de setembro de 2010

Todos os direitos reservados. É proibida a reprodução total ou parcial do trabalho sem autorização da universidade, da autora e do orientador.

Liliana Andrea Villegas Sierra

Graduou-se em Engenharia Civil pela Universidad Mayor de San Andrés, Bolívia em 2006. Ingressou no curso de mestrado em Engenharia Civil em 2008 na área de Geotecnia. Principais áreas de interesse e linhas de pesquisa: Geotecnia Ambiental, Geotecnia Experimental, Engenharia Sanitária e Hidráulica.

Ficha Catalográfica

Sierra, Liliana Andrea Villegas

Avaliação dos parâmetros de transporte de um biocolóide através de uma areia saturada / Liliana Andrea Villegas Sierra ; orientador: Tácio Mauro Pereira de Campos ; co-orientador: Denise Maria Mano Pessôa. – 2010.

126 f. : il. (color.) ; 30 cm

Dissertação (mestrado)-Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro, Departamento de Engenharia Civil, 2010.

Inclui bibliografia

1. Engenharia civil – Teses. 2. Transporte de contaminantes. 3. Escherichia coli. 4. Areia de quartzo. 5. Filtração mecânica. I. Campos, Tácio Mauro Pereira de. II. Pessôa, Denise Maria Mano. III. Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro. Departamento de Engenharia Civil. IV. Título.

CDD: 624

Para meus pais, Félix e Lupe

Agradecimentos

À CAPES pelo apoio financeiro e à PUC-Rio pela oportunidade de cursar o

mestrado.

Ao professor Tácio Mauro Pereira de Campos, pela orientação e confiança, para

a realização deste trabalho.

À professora Denise Mano Pessôa, obrigada pela ajuda constante, a paciência,

e dedicação que me brindou ao longo de todo este período.

Aos Professores do Departamento de Engenharia Civil da PUC-Rio, pelo ensino

transmitido.

A minha família que com amor incondicional, sempre me apóia e incentiva em

cada etapa da minha vida.

A todos os meus amigos pela amizade sincera, que com alegria, entusiasmo e

companheirismo me ajudaram a superar todos os obstáculos e fizeram do

mestrado uma das melhores etapas da minha vida.

Em especial ao Gerardo, pela compreensão e carinho, principalmente naqueles

momentos em que todo parecia dar errado, obrigada por me ajudar a tornar este

trabalho possível.

Resumo

Sierra, Liliana Andrea Villegas; Campos, Tácio Mauro Pereira de; Pessôa, Denise Maria Mano. Avaliação dos Parâmetros de Transporte de um Biocolóide através de uma Areia Saturada. Rio de janeiro, 2010. 126p. Dissertação de Mestrado - Departamento de Engenharia Civil, Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro.

Neste trabalho são avaliados os parâmetros de transporte da bactéria

Escherichia coli ATCC11229, microrganismo indicador de contaminação fecal,

através de colunas de areia de quartzo saturadas. Com este propósito foi

desenvolvido o equipamento para a execução dos ensaios Advecção-Dispersão-

Sorção (ADS), com injeção contínua de uma suspensão bacteriana em água

destilada em uma concentração inicial de 108 bactérias/mL, por até doze horas

em temperatura ambiente e sob condições que permitiram desprezar os efeitos

do crescimento e decaimento dos microrganismos. Para a determinação dos

parâmetros de transporte foram executados ensaios microbiológicos, ensaios de

batelada e oito ensaios ADS para diferentes valores de gradiente hidráulico. Os

ensaios de batelada mostraram uma baixa adsorção bactéria-solo nas condições

avaliadas. As curvas de chegada obtidas nos ensaios ADS, mostraram elevados

valores para o fator de retardamento entre três e nove, variando

proporcionalmente com o incremento de gradiente hidráulico. Os valores de

dispersão hidrodinâmica variaram entre 1,44x10 ­2 cm2/min e 5,47x10­2 cm2/min.

Os resultados dos ensaios sugerem que os processos físico-químicos têm pouca

influência no transporte deste microrganismo em areia de quartzo, enquanto que

o processo de filtração mecânica, forças hidrodinâmicas, a forma e distribuição

de tamanho dos grãos parecem explicar mais adequadamente o comportamento

das curvas de chegada.

Palavras-chave

Transporte de contaminantes; Escherichia coli; Areia de quartzo; Filtração

mecânica.

Abstract

Sierra, Liliana Andrea Villegas; Campos, Tácio Mauro Pereira de (Advisor); Pessôa, Denise Maria Mano (Advisor). Evaluation of the Transport Parameters of a Biocolloid through a Saturated Sand. Rio de janeiro, 2010. 126p. MSc. Dissertation – Departamento de Engenharia Civil, Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro.

This study deals with the assessment of the transport parameters of the

Escherichia coli ATCC11229 bacteria, a fecal contamination indicator, through

saturated quartz sand columns. With this purpose, it was developed an

equipment to carrying out Advection-Dispersion-Sorption (ADS) experiments,

with continuous input of bacterial distilled water suspension at an influent

concentration of 108 cell/mL for about twelve hours, at environmental temperature

and under conditions that allow disregard the effect of the growth and decay of

the microorganisms. Microbiological experiments, batch tests, and eight ADS

experiments at several hydraulic gradient values, were executed for determine

the transport parameters. The batch tests indicated a low bacterium-soil

adsorption under evaluated conditions. The breakthrough curves, obtained by

ADS experiments, showed high values for the retardation factor, ranged from

three to nine with increasing the hydraulic gradient. The hydrodynamic dispersion

values ranged between 1,44x10-2cm2/min and 5,47x10-2 cm2/min. The results of

the experiments suggested that the physical-chemical processes have a little

influence on the transport of this microorganism in quartz sand, whereas the

straining process, hydrodynamic forces, the shape and grain distribution, would

can explain more appropriately the behavior of the breakthrough curves.

Keywords

Transport of contaminants; Escherichia coli; Quartz sand; Straining.

Sumário

1 INTRODUÇÃO 14

1.1. Objetivo 16

1.2. Estrutura da Dissertação 17

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 18

2.1. Generalidades 18

2.2. Áreas de proteção 21

2.3. Sobrevivência de bactérias e vírus na água subterrânea 22

2.4. Escherichia coli 24

2.5. Transporte de Biocolóides 27

2.6. Processos de Transporte 29

2.6.1. Advecção 29

2.6.2. Dispersão Hidrodinâmica 30

2.6.3. Adsorção 32

2.6.3.1. Sorção de equilíbrio 34

2.6.3.2. Sorção Dinâmica 35

2.6.4. Filtração mecânica (straining) 43

2.6.5. Exclusão 46

2.6.6. Bloqueamento e Ripening 47

2.7. Ensaios experimentais 48

3 MATERIAIS E MÉTODOS 50

3.1. Considerações Gerais 50

3.2. Meio poroso 50

3.2.1. Caracterização geotécnica do meio poroso 51

3.3. Bactéria 55

3.3.1. Manutenção da cepa de Escherichia Coli 55

3.3.2. Determinação do número de bactérias 56

3.3.2.1. Contagem celular em Câmara de Neubauer 56

3.3.2.2. Leitura da densidade óptica por espectrofotometria 57

3.3.2.3. Contagem de microrganismos pela Técnica dos Tubos Múltiplos 58

3.3.2.4. Contagem de Número de Unidades Formadoras de Colônias em

Placas de Petri 59

3.4. O equipamento para o ensaio ADS 60

3.4.1. Características do frasco de Mariotte 62

3.4.2. Características da coluna 63

3.5. Ensaios Microbiológicos 65

3.5.1. Correlação entre Número de Células e Absorbância 65

3.5.2. Curva de crescimento 67

3.5.3. Ensaio de Sobrevivência 68

3.6. Ensaio de Adsorção em Batelada 69

3.7. Ensaio Advecção-Dispersão-Sorção (ADS) 70

3.7.1. Saturação da areia 72

3.7.2. Injeção contínua da suspensão de E. coli 73

3.7.3. Obtenção das curvas de chegada 76

3.8. Ensaios de controle 77

4 APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS 79

4.1. Ensaios Microbiológicos 79

4.1.1. Curvas de correlação entre absorbância e número de células 79

4.1.2. Curva de Crescimento Escherichia coli em meio TSB 81

4.1.3. Avaliação da sobrevivência de E. coli em água 82

4.2. Ensaio de Adsorção em Batelada 83

4.3. Ensaio ADS 85

4.3.1. Curvas de chegada 86

4.3.2. Fator de Retardamento e Dispersão Hidrodinâmica 89

4.3.3. Ensaios de controle 94

4.4. Discussão 95

4.4.1. Retardamento 95

4.4.2. Filtração Mecânica como processo dominante no transporte de E. coli

nos ensaios ADS 97

4.4.3. Influencia das propriedades do meio poroso 100

5 CONCLUSÕES E SUGESTÕES 103

5.1. Conclusões 103

5.2. Sugestões 104

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 105

APÊNDICE A 112

A.1. Determinação do número de células durante o ensaio de adsorção em

batelada 112

A.2. Cálculo do coeficiente de distribuição KD 115

APÊNDICE B 117

B.1. Dados para a construção da curva de chegada 117

B.2. Determinação gráfica dos parâmetros “b” e “R” 122

Lista de Figuras

Figura 2.1. Fontes de contaminação biológica das águas subterrâneas

(Adaptado de Corapcioglu e Haridas, 1984) 18

Figura 2.2. Micrografia eletrônica da E. coli. Escala: o corpo da célula é de

aproximadamente 1 μm de comprimento (Berg, 2004) 25

Figura 2.3. Mecanismos básicos de transporte em filtração de água (Adaptado

de Yao et al., 1971) 37

Figura 2.4. Teoria de energia DVLO. As forças combinadas de atração e

repulsão governam a agregação de partículas com relação à

distância entre elas (Gwyn, 2003) 42

Figura 2.5. Formas em que a filtração limita a migração das partículas,

a) Filtração completa, b) Filtração incompleta ou straining, e

c) Filtração físico química (McDowell-Boyer et al., 1986) 43

Figura 2.6. a) Cinética inicial de deposição, b) Efeito do bloqueamento e

c) Efeito do ripening (Kretzschmar et al., 1999) 48

Figura 3.1. Areia de quartzo. Lupa ZEISS Stereo Discovery V8 x10 de

aumento 51

Figura 3.2. Distribuição de tamanhos dos grãos de quartzo 52

Figura 3.3. Aparato para a determinação da condutividade hidráulica saturada 53

Figura 3.4. a) Câmara de Neubauer utilizada, b) Esquema da CNB com

a lâminula sobre a área de contagem 56

Figura 3.5. Área de Contagem da CNB e esquema da metodologia

de contagem. 57

Figura 3.6. Esquema da Técnica de Contagem em Placa 60

Figura 3.7. Esquema de funcionamento do equipamento para os ensaios ADS

a) Δh=0 , b) Δh>0 61

Figura 3.8. Corte transversal e detalhe da tampa do Mariotte 62

Figura 3.9. Corte transversal e detalhe da base do Mariotte 63

Figura 3.10. Esquema dos componentes da coluna 63

Figura 3.11. Corte transversal da coluna 64

Figura 3.12. Esquema da metodologia seguida para a obtenção das curvas de

correlação entre absorbância e a) Suspensão bacteriana em

meio TSB; b) Suspensão bacteriana em água destilada 67

Figura 3.13. Crescimento das colônias de E. coli no ensaio de adsorção

para diferentes concentrações iniciais 70

Figura 3.14. Foto do equipamento utilizado no ensaio ADS 71

Figura 3.15. Vista superior e lateral da coluna após do processo de

conformação da coluna de areia 73

Figura 3.16. Crescimento do inóculo de E. coli em 500 mL de meio de

cultura TSB 74

Figura 3.17. Linha continua - Forma da curva de chegada sem retardamento

nem decaimento; Linha tracejada - a) Forma da curva de chegada

com retardamento b) Forma da curva de chegada com

decaimento 76

Figura 4.1. Curvas de correlação entre Número de Células e Absorbância

(a) para meio TSB; (b) para água destilada 79

Figura 4.2. Curva de Correlação para células suspendidas em meio de

cultura TSB 80

Figura 4.3. Curva de Correlação para células suspendidas em água destilada 80

Figura 4.4. Curvas de crescimento da Escherichia coli ATCC 11229 82

Figura 4.5. Isoterma de adsorção da E. coli em areia de quartzo 84

Figura 4.6. Curvas de chegada para cada ensaio ADS 88

Figura 4.7. Curvas de chegada para diferentes gradientes hidráulicos 90

Figura 4.8. Variação do fator de Retardamento com relação ao gradiente

hidráulico 91

Figura 4.9. Variação da Dispersão Hidrodinâmica com relação à velocidade

de poros 91

Figura 4.10. Variabilidade da condutividade hidráulica no ensaio ADS 93

Figura 4.11. Distribuição do tamanho dos grãos ao longo da coluna de areia 95

Figura 4.12. Tipos de locais dentro do meio poroso, susceptíveis à retenção

de bactérias devido ao processo de Filtração mecânica 99

Figura 4.13. Fotos ampliadas 600 vezes, da deposição de E.coli O157: H7

em areia de 150 μm (Bradford et al., 2006) 100

Figura 4.14. Imagens ESEM (Environmental Scanning Electron Microscope)

de a) leito de esferas de vidro (ampliadas 200 vezes, b) quartzo

com forma irregular (ampliada 500 vezes) (Tufenkji et al., 2004) 102

Lista de Tabelas

Tabela 2.1. Doenças causadas pelo consumo de água contaminada por

excretos humanos ou animais (Bactérias, Protozoários e Vírus)

(Cajazeiras, 2007) 20

Tabela 2.2. Fatores físico-químicos que afetam a sobrevivência de bactérias

entéricas e vírus no solo (Abu-Ashour et al., 1993) 23

Tabela 2.3. Componentes utilizados em experimentos realizados para o

estudo do transporte de microrganismos 49

Tabela 3.1. Determinação da condutividade hidráulica saturada 54

Tabela 3.2. Características físicas da areia de quartzo limpa 54

Tabela 4.1. Cálculo da concentração de células viáveis suspensas em água

destilada pela Técnica dos Tubos Múltiplos 83

Tabela 4.2. Resultados obtidos através da técnica de contagem em placa 83

Tabela 4.3. Condições hidráulicas durante a saturação da areia 85

Tabela 4.4. Condições hidráulicas do sistema experimental durante a injeção

da suspensão de E. coli 86

Tabela 4.5. Parâmetros de transporte: Retardamento e Dispersão

hidrodinâmica 90

Tabela 4.6. Concentração de E. coli retida ao longo da coluna de areia

(Ensaio ADS 1) 94

Tabela 4.7. Numero de volume de poros necessários para preencher com

bactérias os espaços de poro destinados à filtração mecânica 98

1 INTRODUÇÃO

Um crescente esforço de pesquisa tem sido destinado ao estudo da

migração e retenção de microrganismos em ambientes granulares naturais ou

modelados. O entendimento desses processos é de grande interesse em várias

aplicações ambientais tais como a proteção de fontes naturais de água potável,

tratamentos de filtração natural de água de rios, como a filtração em margem e a

biorremediação de áreas contaminadas.

Para grande parte da população mundial, e especialmente em países em

desenvolvimento e regiões áridas, a principal fonte de água potável é a água

subterrânea, captada de poços perfurados ou escavados. No Brasil, segundo o

Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2010), para o ano 2002,

aproximadamente 58,8% da população brasileira na área rural era abastecida,

para fins domésticos, com água de poço ou nascentes.

Considerando a relação direta entre água usada para beber e surtos de

doenças e epidemias, a contaminação da água subterrânea (em particular a

contaminação de origem microbiológica) constitui-se em uma potencial ameaça

para a saúde publica. Esta é uma das principais razões da necessidade de se

estudar o comportamento do transporte de microrganismos patogênicos no

subsolo.

Nem todos os países possuem legislação estabelecendo perímetros de

proteção em torno de captações de água subterrâneas, porém, a preocupação

em preservar os recursos hídricos é crescente e, vários países já os adotam

como medida preventiva para manter a qualidade destas águas (Coelho e

Duarte, 2003).

Esses perímetros de proteção, todavia estão frequentemente baseados em

distâncias arbitrárias, que podem subestimar ou sobreestimar a proteção dos

recursos de água. Pang et al. (2003), em um estudo relacionado com a

determinação dessas distâncias mínimas, concluíram que estimativas feitas

através da determinação em laboratório da taxa de decaimento dos

microrganismos livres, sem considerar o material do aquífero e outros processos,

podem resultar em distâncias muito maiores do que necessário.

15

Para definir mais adequadamente os perímetros de proteção é necessária

informação referente à atenuação do transporte de patogênicos ou de

indicadores microbiológicos em sistemas de água subterrânea. Esta informação

resulta mais apropriada se efetuada considerando as características próprias do

local como o clima, o material do aquífero e a composição da água subterrânea.

Entretanto, devido à escassa informação referente a investigações

envolvendo, especificamente, esse problema no Brasil, através deste estudo,

tenta-se iniciar um melhor entendimento dos processos que influenciam o

transporte de microrganismos no solo sob as condições ambientais locais.

Com este propósito foi implementado no Laboratório de Geotecnia e Meio

Ambiente da PUC–Rio, um equipamento para a realização de ensaios de

transporte de contaminantes considerando as particularidades que exige o

trabalho com microrganismos, principalmente na minimização do potencial de

contaminação externa durante a execução dos ensaios.

A revisão bibliográfica com relação ao problema exposto mostrou que,

para fins de pesquisa, sobre transporte, microrganismos como bactérias e vírus

são considerados, por suas dimensões, como partículas suspensas ou coloidais,

mais especificamente como biocolóides. Nesses estudos são incluídos

processos conhecidos de advecção, dispersão e processos de filtração

baseados na teoria clássica da filtração do colóide, como também na teoria

DLVO (Derjaguin and Landau, and Verwey and Overbeek).

Experimentalmente, o transporte de microrganismos em meios porosos

saturados tem sido tradicionalmente investigado através da aplicação do método

de colunas empacotadas (packed column), termo utilizado em cromatografia,

onde a concentração dos microrganismos suspensos no efluente é monitorada

em função do tempo.

Estudos realizados sob condições controladas em laboratório estão

dirigidos a avaliar a influência sobre os processos de transporte das

propriedades do biocolóide, do meio poroso e da solução. Materiais como areia

de quartzo seja limpa ou revestida ou leitos de esferas de vidro vêm sendo

implementados em tais estudos como meios granulares. Como microrganismos,

são utilizadas bactérias como as do gênero Pseudomonas (Barton et al., 1995;

Martin et al., 1996; Camesano et al., 1999), Escherichia coli (Pang et al., 2003;

Redman et al., 2004; Foppen et al., 2005; Foppen et al., 2007; Jiang et al.,

2007), Cryptosporidium oocysts (Tufenkji et al., 2004) e vírus como fagos MS2

e PRD1 (Shijven et al., 2002). Em muitos casos também são usadas

microesferas de látex como um modelo representativo das bactérias.

16

Modelos matemáticos do transporte de bactérias em meio saturado,

geralmente envolvem a forma simplificada da equação Advecção-Dispersão-

Sorção, que pode ser derivada a partir dos princípios básicos de balanço de

massa. Poucos esforços na modelagem levam em conta a influência de

numerosos fatores físicos, químicos e biológicos, que em função das atuais

pesquisas, sabe-se que afetam o transporte dos microrganismos na

subsuperfície.

Contudo, a capacidade de prever com precisão o destino de bactérias no

ambiente de subsuperfície, está atualmente limitada pela compreensão

incompleta sobre os mecanismos de deposição (Bradford et al., 2006) e o

entendimento sobre o comportamento dos microrganismos quando fluem através

de meios naturais, ainda constitui uma meta para futuras investigações.

Como ponto de partida para o início do estudo experimental do transporte

de microrganismos em meios porosos foi escolhida água destilada como

solução, areia de quartzo comercial como meio granular, e a bactéria

Escherichia coli ATCC11229 como biocolóide, por se tratar de um importante

indicador de contaminação de origem fecal, de rápido crescimento, fácil

manipulação e fácil detecção nos procedimentos laboratoriais.

1.1. Objetivo

Esta pesquisa tem como objetivo geral estudar o transporte do

microrganismo Escherichia coli ATCC11229 através de areia de quartzo

saturada, sem a interferência de fatores biológicos e sob condições

desfavoráveis à adesão.

Após definir as condições do ensaio, para alcançar esse objetivo foi

necessário o desenvolvimento dos seguintes objetivos específicos:

Elaborar procedimentos microbiológicos necessários para a

quantificação de E. coli, nos diferentes ensaios do trabalho.

Projetar e montar um equipamento apropriado para o estudo de

transporte de microrganismos nas condições experimentais

previstas.

Determinar parâmetros de transporte, retardamento e dispersão

hidrodinâmica de E. coli através de ensaios Advecção-Dispersão-

Sorção com diferentes gradientes hidráulicos.

17

Determinar a sobrevivência de E. coli em água.

Determinar o máximo potencial de adsorção de E. coli em areia

através do ensaio de batelada, sob as mesmas condições dos

ensaios ADS.

1.2. Estrutura da Dissertação

Esta dissertação foi desenvolvida em 5 capítulos que são descritos a

seguir.

O Capítulo 1 trata da introdução da dissertação, na qual se registra a

importância de estudar o transporte dos microrganismos patogênicos em meios

granulares, e uma breve descrição do que tem sido feito nesta área de estudo

com ênfase na parte experimental. Também são apresentados os principais

objetivos e a estrutura geral da dissertação.

No Capítulo 2 é apresentada uma revisão sobre a problemática abordada e

os fundamentos teóricos referidos aos processos de transporte e retenção de

biocolóides no solo, e finalmente as bases teóricas necessárias para a

compreensão dos procedimentos aplicados em ensaios de transporte.

No Capítulo 3 faz-se uma descrição das características relevantes do

biocolóide e do meio poroso utilizados neste trabalho, assim como também, uma

descrição em detalhe do projeto para a construção do equipamento destinado à

execução dos ensaios de transporte. Os procedimentos seguidos na realização

dos ensaios microbiológicos, de batelada e de transporte também são expostos

neste capítulo.

No Capítulo 4 apresentam-se os resultados obtidos para cada ensaio

realizado, e a seguir a discussão destes para, finalmente, no Capítulo 5

apresentar as conclusões do trabalho e as propostas para trabalhos futuros

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Generalidades

No mundo inteiro, os aquíferos - formações geológicas capazes de

armazenar as águas - estão sob perigo cada vez maior de contaminação em

decorrência da urbanização, do desenvolvimento industrial, das atividades

agrícolas e das empresas de mineração.

Uma grande variedade de microrganismos patogênicos pode ser

encontrada em excrementos de seres humanos e de outros animais de sangue

quente. Por isso, a contaminação de águas por material de origem fecal é uma

das formas mais importantes de introdução de microrganismos patogênicos nas

águas (Cajazeiras, 2007). A introdução destes microrganismos na água

subterrânea pode ser atribuída às seguintes causas: ruptura acidental das redes

de esgoto, vazamentos de tanques sépticos residenciais e latrinas, água

infiltrada através de aterros sanitários, recarga artificial de aquíferos por água de

esgoto tratada, e a aplicação de esgoto no solo (Corapcioglu e Haridas, 1984).

Poços mal construídos são particularmente propensos a apresentar esse tipo de

contaminação.

Figura 2.1. Fontes de contaminação biológica das águas subterrâneas

(Adaptado de Corapcioglu e Haridas, 1984)

19

A recarga artificial de fontes de água subterrânea por infiltração de águas

residuais e uma proposta amplamente usada para disposição de águas residuais

domesticas e municipais, por exemplo, na aplicação do sistema alternativo on-

site para o tratamento de águas residuais em áreas costeiras denominado

Marshland Upwelling System (Richardson, 2002).

Outra fonte de bactérias em solos ou em aquíferos de água subterrânea é

a aplicação controlada ou injeção de cepas de bactéria para biorremediação in

situ (bioaumentação) de locais contaminados ou como organismos de

biocontrole contra certas doenças das plantas (Kretzschmar et al., 1999).

Conhecimento sobre transporte de bactérias no meio poroso é assim um

requerimento chave para a disposição segura de águas residuais e para o

desenvolvimento de estratégias de biorremediação efetiva de solos

contaminados e aquíferos utilizando cepas de bactéria.

Existem perfis naturais de solo que podem degradar alguns poluentes até

atingirem a água subterrânea. Mas também, estudos confirmaram que

patogênicos penetram facilmente, rapidamente e profundamente durante

eventos de chuvas fortes (Chu et al., 2001; citado por Knappett, 2006).

Foppen et al. (2008) estudaram os mecanismos de transporte vertical de águas

residuais em um aquífero superficial aluvial pobremente consolidado e os

resultados indicaram a presença de E. coli em uma concentração de

106 UFC/100 mL, em profundidades de 50 m abaixo da superfície do solo.

Por tanto, a preocupação com a contaminação da água subterrânea

concentra-se principalmente nos aquíferos não confinados, especialmente nas

áreas em que a zona vadosa é pouco espessa e o lençol freático é raso.

Entretanto, há riscos significativos de poluição em pontos em que o aquífero é

semiconfinado, se os aquitardes confinantes forem relativamente pouco

espessos e permeáveis (Foster et al., 2006).

De um modo geral os microrganismos patogênicos podem ser agrupados

como: Vírus, Bactérias, Protozoários e Ovos de Helmintos. As bactérias e vírus

mais relevantes em termos de patogenicidade que poderiam possivelmente ser

transportados pelas águas subterrâneas são: Salmonella sp., Shigella sp.,

Yersinia enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, Leptospira sp., Francisella

tularensis, Dyspepsia coli, E. coli enterotóxica, Pseudomonades, Vibrio sp.,

Legionella sp. E os vírus infecciosos hepatitis vírus, pólio vírus, Coxsackie

viruses, adenovirus, rotavirus, e Norwalklike vírus (Pekdeger e Matthess, 1983).

Organizações internacionais como a Organização Mundial de Saúde

(OMS) e outras, tem repetidamente expressado preocupação sobre a

20

disponibilidade e qualidade dos recursos de água, e apontado que doenças

relacionadas com a água constituem ainda sérios problemas de saúde causados

pela poluição microbiológica, saneamento inadequado e falta de água limpa. A

Tabela 2.1 mostra as principais doenças de veiculação hídrica, tendo como

agente causal a ingestão de água contaminada.

Tabela 2.1. Doenças causadas pelo consumo de água contaminada por

excretos humanos ou animais (Bactérias, Protozoários e Vírus)

(Cajazeiras, 2007)

Doença Agente Causal Sintomas

Bac

téri

a

Febre tifóide Disenteria bacilar Cólera Diarréia Leptospirose Salmonelose

Salmonella typhi Bacilo disentérico Víbrio cholerae Escherichia coli Leptospira interrogans Salmonela

Febre elevada, diarréia, ulceração do intestino delgado Forte Diarréia Diarréia extremamente forte, desidratação, alta taxa de mortalidade Icterícia, febre Febre, náusea, diarréia.

Pro

tozo

ári

os

Disenteria amebiana Giardíase

Entamoeba histolytica Giárdia lamblia

Diarréia prolongada, com sangramento, abscessos no fígado e intestino fino Diarréia leve a forte, náusea, indigestão, flatulência

Vír

us

Hepatite infecciosa Gastroenterite Paralisia infantil

Vírus da hepatite A Enterovírus, parvovírus, rotavirus Poliomielites vírus

Icterícia, febre Diarréia leve a forte Paralisia

É evidente então, a suprema importância de prevenir a ingestão de água

subterrânea contaminada. Nesse sentido, para avaliar a proteção das zonas

subterrâneas contra microrganismos patogênicos (principalmente bactérias e

vírus), os mecanismos de controle que devem ser estudados são principalmente,

a persistência das bactérias e de vírus sob condições biológicas e químicas da

água subterrânea e os processos físicos, físico-químicos, e microbiológicos que

controlam o transporte de microrganismos na água subterrânea (Pekdeger e

Matthess, 1983).

O interesse na determinação dos fatores que controlam o transporte

através de materiais geológicos e a derivação de uma teoria adequada para

descrever o transporte tem sido reforçado nas últimas duas décadas, devido à

preocupação referida à polução dos recursos de água subterrânea. As questões

incluem a contaminação das águas subterrâneas por patogênicos, o potencial do

transporte bacteriano em conjunção com a biodegradação de contaminantes

21

orgânicos na subsuperfície, o potencial de descarga de microrganismos gerados

geneticamente no meio geológico e a participação dos microrganismos como

facilitadores do transporte dos radionuclídeos na água subterrânea (Hornberger

et al., 1992).

2.2. Áreas de proteção

Reconhecido o problema da contaminação da água subterrânea, segundo

Foster et al. (2006) a abordagem mais lógica para este problema é, considerá-lo

como a interação entre a vulnerabilidade do aquífero à contaminação e a carga

contaminante que é, será ou pode ser aplicada no meio como resultado da

atividade humana.

Um fator importante que influencia o perigo representado por uma

atividade antrópica é sua proximidade de uma fonte de abastecimento

subterrânea (poço ou nascente). Sendo a avaliação dos perigos de

contaminação do aquífero dependente em primeiro lugar da definição da zona de

captura (perímetros de proteção do manancial) e, em segundo lugar, da

mobilidade, persistência e dispersão dos contaminantes dentro do regime de

fluxo do aquífero (Foster et al., 2006).

Uma área de proteção interna baseada na distância equivalente a um

tempo de trânsito horizontal médio na zona saturada tem sido amplamente

adotada para a proteção contra atividades que potencialmente infiltram vírus,

bactérias e parasitas patogênicos, como é o caso, por exemplo, das águas

residuais e dejetos espalhados nas lavouras. No entanto, o tempo de trânsito

real adotado em diferentes países em diferentes épocas apresentou variações

significativas (de 10 a 400 dias) (Foster et al., 2006).

O conceito de proteção das fontes de abastecimento de água subterrânea

foi estabelecido já há muitas décadas, fazendo parte dos códigos jurídicos dos

países europeus, no trabalho realizado por Coelho e Duarte, (2003) são

apresentados os perímetros de proteção estabelecidos para alguns esses

países. No entanto, o dimensionamento de zonas de proteção de águas

subterrâneas está baseado em observações empíricas da eliminação de

microrganismos na água subterrânea.

Por exemplo, no caso da Nova Zelândia, segundo Pang et al. (2003), é

estabelecida de forma arbitrária, como proteção, uma distância que varia de 30 a

50 metros para a água subterrânea. Na Áustria, na Alemanha, e na Holanda, as

22

zonas de proteção de águas subterrâneas são estabelecidas através do cálculo

do tempo de fluxo até o poço, de 50 a 60 dias, período considerado que cobre o

tempo de sobrevivência de bactérias patogênicas e vírus. Na Suíça, onde os

processos físicos e físico-químicos são mais enfatizados, as áreas de proteção

são calculadas com base de 10 dias de tempo de fluxo ou pelo menos uma

trajetória de fluxo de 100 m de comprimento através do meio poroso (Pekdeger e

Matthess, 1983).

Na América Latina e no Caribe, de acordo com a Pan American Health

Organization (PAHO, 1998) a poluição das águas subterrâneas ameaça

diretamente a saúde de grandes segmentos da população. Como uma

estimativa, 50% das comunidades depende exclusivamente de águas

subterrâneas como fonte de água. E, no entanto, apesar da importância deste

recurso como fonte de água potável, a proteção de aquíferos não recebeu a

devida atenção na Região.

Conforme Toscano et al. 2008, no Brasil, sendo as águas subterrâneas

bens dos estados, não são objeto de leis federais que regulamentem seu uso.

No entanto, podem ser encontrados alguns dispositivos legais referentes, tais

como a Resolução 396 de 03 de abril de 2008 do CONAMA (Conselho Nacional

de Meio Ambiente) que prevê a implementação de Áreas de Proteção de

Aquíferos e Perímetros de Proteção de Poços de Abastecimento e de Áreas de

Restrição e Controle do Uso da Água Subterrânea. Apenas onze estados

brasileiros dispõem de legislação que criam áreas de proteção dos aquíferos e

áreas de proteção sanitária, não sendo sugeridos, em nenhuma legislação,

métodos de delimitação de áreas de proteção.

Finalmente, ao definir o nível de controle necessário para proteger a

qualidade da água subterrânea, vale mais a pena em termos de custo e será

menos prejudicial ao desenvolvimento econômico, utilizar a capacidade de

atenuação natural dos estratos de cobertura do aqüífero, em vez de aplicar ao

terreno controles universais sobre o uso do solo e sobre a emissão de efluentes

(Foster et al., 2006).

2.3. Sobrevivência de bactérias e vírus na água subterrânea

As oportunidades de contaminação da água subterrânea incrementam-se

devido à capacidade de sobrevivência dos microrganismos no meio

subsuperficial por longos períodos de tempo. Segundo Pekdeger e Matthess

23

(1983) dois grupos de microrganismos devem ser diferenciados quando é

considerada a sobrevivência de bactérias e vírus na água subterrânea; os

microrganismos autóctones e os microrganismos alóctones, estes últimos

podendo ser patogênicos ou produtores de enterotoxinas.

As bactérias aloctônicas ingressam dentro da água subterrânea devido à

contaminação e são eliminadas geralmente nesse ambiente. Durante a fase

inicial (fase Lag), sob condições estéreis e oligotróficas, podem sobreviver por

vários meses sem um decrescimento substancial ou ainda incrementar o número

de células, enquanto que, em águas contendo bactérias predadoras, esta fase

pode-se limitar a poucos dias (Matthess et al., 1988)

As enterobactérias, em geral, persistem no solo durante dois ou três

meses. Entretanto, já foi detectado tempo de sobrevivência maior que cinco anos

(Corapcioglu e Haridas, 1984). Estudos de laboratório reportados por Gerba et

al. (1975), citado por Abu-Ashour et al. (1993), indicam um tempo de

sobrevivência para a E. coli maior a 4,5 meses em água subterrânea mantida na

escuridão.

É assim que a sobrevivência de bactérias no solo, normalmente varia a

partir de umas poucas semanas até poucos meses. São muitos os fatores que

afetam a sobrevivência dos microrganismos nos ambientes subsuperficiais. A

Tabela 2.2 resume os efeitos individuais destes fatores sobre a sobrevivência de

bactérias e vírus em um ambiente subsuperficial.

Tabela 2.2. Fatores físico-químicos que afetam a sobrevivência de

bactérias entéricas e vírus no solo (Abu-Ashour et al., 1993)

Fator Impacto na sobrevivência

pH

Menor tempo de sobrevivência em solos ácidos (pH 3-5) do que em solos alcalinos

Conteúdo de água no solo

Maior tempo de sobrevivência em solos úmidos e durante períodos de chuvas fortes

Conteúdo de matéria orgânica

Aumento da sobrevivência e possibilidade de crescimento quando existe quantidade suficiente de matéria orgânica

Textura, tamanho e distribuição das partículas do solo

Principalmente solos finos, minerais de argila e sustâncias húmicas incrementam a retenção de água no solo que aumenta o tempo de sobrevivência

Temperatura Baixas temperaturas incrementam o tempo de sobrevivência

Disponibilidade de nutrientes Aumento do tempo de sobrevivência

Propriedades de adsorção Os microrganismos parecem melhorar sua persistência quando se encontram em estado de sorção

Luz solar Tempos de sobrevivência são curtos na presença de luz solar direta

24

Informação sobre as características de sobrevivência dos microrganismos

é geralmente referida como decaimento, eliminação ou inativação, que é a

destruição irreversível do contaminante através de processos físicos, químicos

ou biológicos. A eliminação de bactérias e vírus pode ser aproximadamente

descrita por uma função exponencial:

)tt(eCC o

o)t(

(2.1)

onde t ≥ t0 e t0 ≤ 7 dias; C0 e C é a concentração inicial e a concentração no

tempo t, e λ é a constante de eliminação calculada através da equação (2.2).

2/1

2ln

(2.2)

onde τ1/2 é a vida media do microrganismo, que varia geralmente entre 1 e 20

dias (Pekdeger e Matthess, 1983).

A equação (2.1) expressa que depois de uma eliminação muito rápida no

início, bactérias e vírus podem ainda existir em pequenas quantidades na água

subterrânea, mesmo depois de longos períodos (i.e. 6 meses). A constante de

eliminação depende de parâmetros físicos, químicos, e biológicos e é específico

para diferentes espécies microbianas, que corresponde a coeficientes de

decaimento, variando desde 0,035 até 0,69 d-1, baseado na equação (2.1)

(Richardson, 2002). Ainda não é possível prever com precisão necessária as

constantes de eliminação com base nos fatores de controle, que devem ser

determinadas para cada espécie e ambiente específico.

Normalmente o crescimento está incluído no coeficiente de decaimento,

resultando em um valor neto de decaimento (Yates e Yates, 1991). Enquanto

ocorre decaimento bacteriano, algum nível de crescimento acontece

simultaneamente. Durante condições de baixa disponibilidade de nutrientes, a

limitada energia disponível é aplicada à manutenção da célula para o

crescimento (Metcalf e Eddy, 1991). Em tal caso, o crescimento pode ser

considerado desprezível.

2.4. Escherichia coli

Para predizer a presença de patogênicos na água, normalmente é usado

um grupo específico de microrganismos, geralmente conhecidos como

organismos indicadores fecais. Os mais importantes indicadores microbianos de

contaminação fecal (poluição) usados são: Escherichia Coli e bactérias

coliformes termotolerantes. Ambos são amplamente utilizados, porque sua

25

detecção é simples, rápida, e confiável. A E. coli é o indicador preferido de

contaminação fecal, pois é o único membro do grupo coliformes termotolerantes

que é invariavelmente encontrada em fezes de animais de sangue quente e que

ultrapassa outros coliformes termotolerantes em ambos os excrementos

humanos e animais (Foppen e Shijven, 2006).

O gênero Escherichia é típico da família Enterobacteriaceae, que tem

como hábitat o intestino de humanos e animais. A Escherichia coli é um bacilo

Gram-negativo, anaeróbico, reto, com forma de bastão de aproximadamente

2,5 μm de comprimento e 0,8 μm de diâmetro e está presente em pares ou

isoladamente. Possui órgãos externos como os chamados pili, filamentos finos e

retos, que lhe permitem captar o substrato específico e um filamento mais fino,

helicoidal e longo denominado flagelo (um o mais) que lhe permite nadar (Berg,

2004). A Figura 2.2 apresenta a imagem de uma célula de E. coli, captada

através de microscopia eletrônica.

Figura 2.2. Micrografia eletrônica da E. coli. Escala: o corpo da célula é de

aproximadamente 1 μm de comprimento (Berg, 2004)

A maioria dos membros da espécie E. coli são considerados organismos

inofensivos, enquanto que algumas estirpes são causadoras de doenças. Três

síndromes clínicas gerais podem resultar de infecção com espécies (patótipos):

doenças entéricas/ diarréicas, infecções do trato urinário, e sepsis / meningite.

Estirpes patogênicas têm sido categorizadas dentro de seis grupos com base em

características sorológicas e de virulência (Kaper et al., 2004, citado por Foppen

e Schijven, 2006).

Geralmente, quando bactérias E. coli são introduzidas dentro de ambientes

aquáticos, morrem gradualmente e este processo é acompanhado por mudanças

26

em suas características. Daubner (1975), citado por Foppen e Schijven (2006),

realizou experimentos de sobrevivência utilizando estirpes frescas de E. coli em

água estéril demineralizada e água altamente mineralizada. Foi observado que

cinco a vinte horas depois que a E. coli é transferida na água estéril, ocorre

encolhimento da célula e redução do conteúdo citoplasmático (na água

destilada) ou dano à integridade da célula em meio mineralizado. A questão

obvia é descobrir qual o efeito dessas mudanças morfológicas e fisiológicas na

adesão bacteriana.

Vários estudos sobre a influência da hidrofobicidade sobre o processo de

adesão, concluíram que E. coli é pobremente adesiva e que é mais um

organismo hidrofílico do que hidrofóbico, e que a hidrofobicidade não determina

a adesão. Em vez disso, o modulador primário de aderência parece ser o

potencial zeta (Foppen e Shijven, 2006).

A carga superficial da E. coli não é medida diretamente, mas é

frequentemente determinada via o que é chamado de mobilidade electroforética,

que é uma media do potencial zeta (definido como a queda de potencial através

da parte móvel da dupla camada responsável pelo fenômeno eletrocinético

(Stumm e Morgan, 1996). Foppen e Shijven (2006) determinaram o potencial

zeta da E. coli ATCC 25922 em varias soluções e os resultados de sua pesquisa

indicaram que para soluções com eletrólitos monovalentes (Na+) e divalentes

(Ca++), com valores de força iônica variando desde 10-5 até 400 mM, na faixa de

pH de 7,19 – 8,81, o potencial zeta variou desde -20 até -170 mV.

No entanto, o potencial zeta é tipicamente aplicado a partículas esféricas

duras, e no caso de células biológicas, elas formam uma camada permeável,

macia de íons em torno da célula, que controla a distribuição espacial do

potencial elétrico da superfície. Além disso, o potencial zeta reflete as

propriedades eletrocineticas resultantes da célula e não é sensível a variações a

pequena escala. Portanto, misturar esta distribuição heterogênea de carga em

um valor de potencial zeta, pode resultar em previsões erradas das interações

da superfície da bactéria e o coletor (Foppen e Shijven, 2006).

Walker et al. (2005) demonstrou que valores de potencial zeta para E. coli

D21g coletadas no meio da fase de crescimento exponencial e na fase

estacionária em soluções para várias concentrações de KCl foram similares,

enquanto que a taxa de deposição bacteriana em colunas de areia de quartzo

limpo (com carga negativa) e força iônica moderada (0,003 – 0,03 M KCl), foi 10

vezes mais alta na fase estacionária do que no meio da fase exponencial. Isto

pode ser atribuído à distribuição não uniforme de carga (negativa) nas células da

27

fase estacionária e consequente menor repulsão e maior adesão, do que as

células da fase exponencial que estão cobertas por proteínas relativamente

simples.

Resumindo, a bactéria E. coli, frequentemente encontrada na água

subterrânea indicando contaminação fecal, é fácil de quantificar, é hifrofílica e

possui forte carga negativa. Estas propriedades fazem que esta bactéria seja

amplamente utilizada como indicador de contaminação fecal, especialmente em

países em desenvolvimento que não dispõem de recursos suficientes de

laboratório. Além do mais, algumas estirpes de E. coli são enteropatogênicas

(Foppen e Shijven, 2006).

2.5. Transporte de Biocolóides

Colóides são comumente definidos como partículas e outras entidades

com dimensões entre aproximadamente 1nm e 1µm (Kretzschmar et al., 1999)

(até 10 µm segundo Bradford et al., 2002). Esses limites de moléculas

dissolvidas por um lado e partículas maiores suspensas por outro são graduais,

e em certa medida arbitrários.

Devido a seu pequeno tamanho, os colóides têm área especifica muito

grande (>10m2/g) tornando-se eficientes coletores de contaminantes ambientais.

Partículas coloidais permanecem estáveis em suspensão por longos períodos de

tempo até que formem agregados maiores ou que se depositem sobre

superfícies de grãos maiores (Kretzschmar et al., 1999).

Muitos contaminantes ambientais são encontrados como colóides

(organismos patogênicos) ou estão associados a colóides (metais pesados,

radionuclídeos, pesticidas, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, etc.).

Portanto, o transporte de vírus e bactérias, chamados de “biocolóides”

(Kretzschmar et al., 1999) é abordado como um problema de transporte de

colóides.

Porém, pelo fato de se tratar de organismos vivos, o estudo do transporte

de microrganismos é mais complexo do que no caso de colóides abióticos. Não

só eles estão sujeitos aos mesmos fenômenos físico-químicos dos colóides, mas

há também um número de processos biológicos que afetam seu transporte (Ginn

et al., 2002).

O transporte de bactérias através de um meio poroso saturado, foco

principal do presente trabalho, é governado através de numerosas relações entre

28

solo, a bactéria e os mecanismos e as propriedades ambientais. Uma descrição

aproximada do transporte bacteriano como um todo, requer a compreensão do

impacto de cada fator na progressão da bactéria através do espaço de poro da

matriz de solo.

A descrição do transporte biocolóides pode ser formulada como um

problema geral de transporte de solutos. Para derivar uma equação que

descreva o transporte de microrganismos no meio poroso, um enunciado

matemático da conservação da massa deve ser formulado, ou seja, a quantidade

do material deixando o sistema deve ser igual à quantidade de material entrando

no sistema, mais ou menos (±) qualquer mudança no armazenamento.

bacteriana

massa de perda

ou Ganho

VEno entrando

bacteriana

Massa

VEdo saindo

bacteriana

Massa

VEno bacteriana

massa de v ariação

de neta Taxa

(2.3)

A equação (2.3) representa o esquema do movimento do contaminante

através de um volume elementar (VE) e mudanças na quantidade do

contaminante. Assume-se que o meio poroso é homogêneo, isotrópico,

incompressível, e totalmente saturado (Yates e Yates, 1991).

Corapcioglu e Haridas (1984, 1986) foram os primeiros em desenvolver um

modelo matemático específico para o transporte de vírus e bactérias através do

meio granular poroso. Este modelo inclui os processos de advecção, dispersão

hidrodinâmica e um número de mecanismos associados à retenção de células

bacterianas no meio poroso, como também os efeitos de crescimento e

decaimento tanto dos microrganismos livres como adsorvidos.

A equação de balanço de massa macroscópico da equação (2.3) para

solutos adsorvidos (microrganismos) fluindo através de um meio poroso, na

forma unidimensional pode ser expressa como:

F2

2

hbulk R

x

Cv

x

CθD

t

θC

t

Sρ

(2.4)

onde C é a massa (ou número) de microrganismos na fase aquosa para uma

distância x e tempo t; S denota a massa (ou número) de microrganismos

adsorvidos por unidade de massa da parte sólida do meio poroso; Dh é o

coeficiente de dispersão hidrodinâmica; v é a velocidade intersticial do fluxo; ρbulk

densidade total seca do meio poroso; θ representa o volume ocupado pela

suspensão por unidade de volume total e RF a taxa de consumo (ou decaimento)

dos microrganismos.

29

Neste trabalho, o estudo está focado no transporte da bactéria, eliminando

as complexidades derivadas dos processos biológicos, tais como crescimento,

morte e predação, restringindo a bactéria a seu estado estacionário (sem

crescimento) durante períodos de tempo para os quais o decaimento não é

observado e o sistema é desprovido de predadores.

Assim, desprezando os efeitos dos processos biológicos, para um meio

poroso homogêneo e saturado (θ=n), a equação (2.4) na forma unidimensional

pode ser simplificada como se apresenta a seguir:

x

Cv

x

CD

t

C

t

S

n 2

2

hbulk

(2.5)

Enquanto os microrganismos são transportados através do meio poroso,

eles são removidos do fluido dos poros por meio de filtração físico-química

(adsorção nas superfícies do grão) representado pelo termo tnSbulk / .

2.6. Processos de Transporte

Como foi explicado previamente, no item 2.5, os microrganismos como

vírus e bactérias são considerados, por suas dimensões e comportamento, como

colóides, mais especificamente biocolóides. Devido à complexidade, que implica

o estudo do efeito combinado dos fenômenos físico-químicos e biológicos sobre

o transporte de organismos vivos nos ambientes subsuperficiais, nesta seção

são estudados os processos de transporte, sem considerar os processos

biológicos em um meio poroso saturado. Dessa forma os principais processos

abordados são; a advecção e a dispersão, processos básicos que controlam o

transporte de solutos e de partículas coloidais suspensas; a filtração mecânica

(straining), que descreve a remoção de colóides baseado no tamanho físico; a

adsorção, resultante de várias forças de origem eletrostática entre o colóide e o

grão, quando a distância entre eles é pequena (da ordem dos nanômetros) e

finalmente, processos como a exclusão, fenômeno observado principalmente no

caso de vírus (Knapett et al., 2008) e o bloqueamento e ripenning, fenômenos

referidos às variações da taxa de deposição com relação ao tempo.

2.6.1. Advecção

Advecção é o processo pelo qual um contaminante é transportado junto

com a massa de fluxo da água subterrânea (Freeze e Cherry, 1979), sendo a

30

taxa média de migração de um soluto igual à velocidade linear média da água

(Fitts, 2002). Assim, a massa de fluxo de um soluto devido unicamente a

advecção é simplesmente:

CqF xax (2.6)

onde Fax é o fluxo de massa de soluto por advecção (massa/tempo/área normal à

direção x), qx é a descarga específica (volume/tempo/área) e C a concentração

do soluto (massa/volume).

Nesse sentido, para quantificar as forças de advecção presentes em um

sistema dado, é preciso determinar a velocidade da água sendo transportada

através do meio poroso. As velocidades da água subterrânea em aquíferos

porosos são geralmente menor do que um metro/dia e até poucos metros/dia.

Velocidades acima 10 m/d são restritas a sedimentos muito grossos e elevados

gradientes hidráulicos (Pekdeger e Matthess, 1983).

Em uma configuração a escala de laboratório, a descarga específica qx é

conhecida, e com base na porosidade do sistema n, a velocidade intersticial v

pode ser calculada através da seguinte relação:

n

qv x (2.7)

Na maioria dos ambientes subsuperficiais, advecção é considerada como o

principal mecanismo de transporte bacteriano (Peterson e Ward, 1987; citado por

Richardson, 2002). Corapcioglu e Haridas (1986) no estudo do transporte de

microrganismos incluíram dentro do termo de advecção, a velocidade de

sedimentação e a velocidade devido à quimiotaxia.

2.6.2. Dispersão Hidrodinâmica

A distribuição real da velocidade das águas subterrâneas varia

significativamente tanto no espaço quanto no tempo, em decorrência da não

uniformidade da velocidade de fluxo e consequentemente a massa de fluido

tende a se espalhar ou dispersar. Este processo é conhecido como dispersão

mecânica (Fitts, 2002).

31

Estas variações na velocidade do fluido são causadas pela resistência ao

longo das paredes dos canais de poros, mudanças da seção transversal dos

canais do poro e da tortuosidade (Frezze e Cherry, 1979).

No transporte real de um soluto na água subterrânea existem dois

processos básicos: a dispersão mecânica e a difusão molecular, ambas as quais

contribuem para uma dispersão transversal (Bear, 1972; Fitts, 2002).

A difusão molecular é a mistura que ocorre como consequência do

movimento aleatório das moléculas dentro do fluido. As moléculas que colidem

ou se impulsionam dentro do liquido tendem, ao longo do tempo, a espalhar os

solutos de modo que as concentrações de soluto se tornam mais uniformemente

distribuídas no espaço. Como outros colóides, bactérias e vírus estão sujeitos ao

movimento Browniano, através do qual a trajetória da partícula individual parece

bastante errática, enquanto o fluxo médio de partícula é proporcional ao

gradiente de concentração (Corapcioglu e Haridas, 1986).

Assim, a difusão move a massa de soluto de regiões com altas

concentrações para regiões com baixas concentrações segundo a primeira lei de

Fick (Fitts, 2002), que para um meio poroso saturado é governada pela equação

seguinte:

x

CnDF mdx

(2.8)

onde Fdx é o fluxo de massa de soluto por difusão (massa/tempo/área) e Dm é a

constante denominada coeficiente de difusão molecular. O coeficiente de difusão

para partículas suspensas (bactérias e vírus) pode ser estimado através da

equação de Stokes-Eistein (Corapcioglu e Haridas, 1986).

O fluxo de um soluto em uma direção qualquer é proporcional ao gradiente

de concentração nessa direção. O sinal negativo na equação (2.8) se deve a que

a massa de soluto se movimenta na direção que as concentrações decrescem,

na direção oposta ao gradiente de concentração.

Os efeitos da dispersão mecânica adicionada à difusão molecular

normalmente são agrupados no que é chamado de dispersão hidrodinâmica. O

coeficiente de dispersão hidrodinâmica Dh é definido pela seguinte equação:

mLh DvD (2.9)

onde αL é o coeficiente de dispersividade, v a velocidade da água subterrânea,

Dm a difusão molecular e τ a tortuosidade.

O coeficiente de dispersividade αL é uma função da falta de

homogeneidade do aquífero, assim este coeficiente cresce com a escala dos

32

experimentos. O meio poroso usado em experimentos de laboratório tem

coeficientes de dispersividade na ordem de 0,1 cm-1 m, em experimentos de

campo na ordem de 0,1 a 100 m, e em rocha cárstica e fissurada 10 – 1000 m

(Pekdeger e Matthess, 1983).

Tanto o coeficiente de dispersão hidrodinâmica como a dispersividade, não

são verdadeiras propriedades físicas do meio poroso, se trata de parâmetros de

ajuste que permitem ao modelo matemático, simular a dispersão de solutos de

um modo mais ou menos similar ao que ocorre dentro de um sistema real (Fitts,

2002).

A significância relativa da difusão em relação à dispersão mecânica pode

ser estimada utilizando um parâmetro adimensional conhecido como número de

Peclet (Pe) para a difusão molecular:

m

eD

vdP (2.10)

onde d é o comprimento médio característico neste caso o diâmetro médio do

grão do meio poroso. Para valores muito baixos de Pe (<0,4) unicamente a

difusão governa o processo de transporte. Para valores entre 0,4 e 5

(aproximadamente) a influência da difusão molecular e a dispersão mecânica

são da mesma ordem de grandeza. Para valores superiores a 5 a propagação do

soluto é dominada pela dispersão mecânica (Bear, 1972).

Pekdeger e Matthess (1983) consideraram que a mobilidade ativa da

bactéria pode ser representada como uma força dispersiva e incluída como uma

componente da dispersão hidrodinâmica, que decresce ao diminuir as

temperaturas (i.e. para E. coli 0,1 m/d a 20°C).

2.6.3. Adsorção

A adsorção, também denominada como filtração físico química (McDowell-

Boyer et al., 1986), é um processo reversível ou irreversível em que a célula

bacteriana é sujeita nas superfícies do solo por várias forças físico-químicas

(carga superficial, forças eletrostáticas, e forças de London-vander Waals)

(Yates e Yates, 1991).

Consequentemente, a adsorção da bactéria na superfície dos grãos é

função das propriedades físicas e químicas do meio e da água dos poros,

33

características da bactéria, e condições hidráulicas do sistema (Corapcioglu e

Haridas, 1984).

Propriedades do meio tal como tamanho do grão, carga superficial, e

estrutura dos poros (i.e. presença de macroporos) podem ter um efeito

significativo no grau de adsorção da bactéria. Em geral, solos de textura fina tais

como argilas, são muito efetivos na retenção de bactérias, em decorrência do

seu pequeno tamanho, grande área superficial específica e carga superficial

(Corapcioglu e Haridas, 1984). Contrariamente, meios com grãos de tamanho

maiores tais como areias, têm baixo potencial de adsorção bacteriana (Peterson

e Ward, 1989 citado em Richardson, 2002). O meio poroso, opostamente

carregado à bactéria que reside, tende a estimular elevados níveis de adsorção

de bactérias. Scholl et al. (1990) encontraram maior adesão de bactéria indígena

(com carga superficial negativa) às superfícies de meio positivamente carregado

(i.e. calcita, quartzo e moscovita cobertos de hidróxidos de ferro e moscovita) do

que no caso de meio negativamente carregado (i.e. quartzo limpo e moscovita).

A estrutura do poro da matriz do solo pode também influenciar o grau de

adesão bacteriana. Sistemas naturais de solo são raramente, ou nunca,

homogêneos em todas as direções, apresentando um grande número de

heterogeneidades e macroporos. A recompactação de solos diminui a presença

de macroporos dentro da estrutura do solo obrigando à bactéria a se infiltrar nos

espaços de poros menores, assim aumentando o potencial de adsorção

bacteriana (Richardson, 2002).

Um elevado conteúdo de sal na água subterrânea poderia incrementar a

adsorção devido à compressão da dupla camada elétrica, permitindo às células

bacterianas se aproximar dos locais carregados no meio. O incremento na

disponibilidade de íons na solução promove a formação de pontes entre o meio

carregado e as superfícies das células bacterianas (Fontes et al., 1991).

Também pode se incrementar a adsorção reduzindo o pH por baixo de 8.0 ou

adicionando cátions, especialmente de espécies divalentes (Corapcioglu e

Haridas, 1986).

A forma e tamanho de uma dada célula bacteriana podem influenciar a

adsorção nas proximidades dos grãos do meio. Em geral, diâmetros maiores

experimentam maiores interações (colisões) com o meio, aumentando assim a

possibilidade de adesão e elevadas velocidades de poros tendem a reduzir as

potenciais oportunidades de contato das bactérias suspensas nas superfícies

dos grãos (Richardson, 2002).

34

A filtração físico-química tem sido modelada tanto como um processo

irreversível quanto reversível em função da análise do termo tnSbulk / da

equação (2.5). No caso do processo reversível, podem ser aplicados tanto

mecanismos de equilíbrio quanto mecanismos cinéticos, descritos a seguir.

2.6.3.1. Sorção de equilíbrio

A adsorção de células bacterianas na superfície dos grãos pode ser

representada através de isotermas de equilíbrio (isoterma de Freundlich ou de

Langmuir), que descrevem a relação entre a concentração de bactérias

adsorvidas S e a concentração de bactérias suspensas C (Domenico e Schwartz,

1990). Assumindo que a adsorção de partículas é um processo que atinge o

equilíbrio rapidamente, pode ser descrito através da forma linear da isoterma de

Freundlich CKS D , expressão que derivada com relação ao tempo, pode ser

facilmente incorporada na equação de transporte equação (2.5) através da

seguinte expressão:

t

CK

t

SD

(2.11)

onde KD é o coeficiente de distribuição ou partição (L3/M) e pode ser obtido

empiricamente em ensaios em batelada no laboratório. Uma vez substituída a

equação (2.11) na equação (2.5), pode-se expressar o fator de retardamento R

como segue:

nK1R bulk

D

(2.12)

Desta forma a equação de transporte é simplificada na forma seguinte:

x

Cv

x

CD

t

CR

2

2

h

(2.13)

A representação linear da adsorção bacteriana implica que está presente

uma única capa de adsorção, onde só as células bacterianas podem ocupar um

local de adsorção dado, a tempo determinado.

A adsorção à superfície do grão impede a migração da bactéria, forçando

assim que ela seja transportada mais lentamente do que a água em torno dos

poros. O termo “retardamento” é geralmente usado para descrever o impacto da

35

adsorção sobre o transporte global (Yates e Yates, 1991). Ainda fatores

adicionais (i.e. filtração mecânica e sedimentação) podem também ser incluídos.

Experimentos de campo têm registrado fatores de retardamento entre 1 e 2

para bactérias (E. coli e Serratia marcescens) (Pekdeger e Matthess, 1983).

Muitos outros estudos revelaram fatores de retardamento menores que 1 (Fontes

et al., 1991), sugerindo velocidades bacterianas mais elevadas que a dos

traçadores introduzidos simultaneamente. Este fenômeno pode ser explicado

através da teoria de exclusão, que será visto no item 2.6.5.

Os vírus em geral, especialmente os poliovírus, têm valores elevados de

KD (até 500), dependendo das propriedades da água e as propriedades dos vírus

respectivos. Assim, a passagem subterrânea pode proporcionar uma proteção

muito efetiva contra a contaminação de vírus. Porém os vírus podem ser

novamente desorvidos, quando as concentrações dos cátions decrescem (i.e.,

devido a uma chuva intensa) sendo assim ativados para maior deslocamento

(Pekdeger e Matthess, 1983).

2.6.3.2. Sorção Dinâmica

Em um sistema composto de microrganismos em suspensão e grãos de

solo, um estado de sorção de equilíbrio não é atingido instantaneamente.

Inicialmente, um mecanismo de sorção cinética em duas etapas controla a

remoção de microrganismos da fase aquosa. No primeiro passo, descrito como

transporte da massa, os microrganismos são transferidos a partir da massa de

fluido para a superfície dos grãos de solo. Em um segundo passo, os

microrganismos são aderidos sobre a superfície como resultado de interações

físico-químicas (Tufenkji, 2004; Kretzschmar et al., 1999). O subsequente

desprendimento pode ser também controlado por processos cinéticos. Sob estas

condições, a taxa de modificação da concentração dos microrganismos retidos

pode ser descrita do seguinte modo:

Skn

Ckt

S

ndet

bulkatt

bulk

(2.14)

onde katt e kdet representam as taxas constante de adsorção e desorção

respectivamente, (T-1). A equação anterior representa um modelo cinético de no-

equilibrio (Jiang et al., 2007).

A aproximação mais frequentemente utilizada em estudos de laboratório e

campo para avaliar o transporte de microrganismos, é a teoria clássica de

36

filtração CFT (Colloid Filtration Theory). Na realidade, este modelo de filtração

denominado “clean-bed” ou leito limpo, trata-se de um caso especial do processo

cinético de adsorção anteriormente explicado, mediante o qual a adesão dos

microrganismos sobre as superfícies dos grãos é considerada irreversível,

desprezando o processo de desprendimento (Tufenkji, 2007). Desta forma a

equação (2.14) se reduz como segue:

Ckt

S

natt

bulk

(2.15)

De acordo com este modelo de transporte, assume-se que a cinética de

deposição de colóides (bactérias), acontece de forma irreversível em duas

etapas:

Primeira etapa; as partículas coloidais são transportadas na direção das

superfícies dos grãos mediante difusão Browniana, intercepção, e

sedimentação resultando em colisões do colóide contra o coletor.

Segunda etapa; se produz a adesão de partículas coloidais nas superfícies

dos grãos em decorrência da ação de forças inter-partículas que incluem,

forças de atração de vander Waals e forças repulsivas da dupla camada

elétrica, esta última fortemente afetada pela composição química da

solução e a carga das superfícies (Kretzschmar et al., 1999).

A cinética da etapa de transporte, que depende primariamente de fatores

físicos foi inicialmente descrita por Yao et al. (1971). Considerando inicialmente

uma única partícula do meio filtrante, esférica, chamada de “coletor”, fixada na

suspensão sem ser afetada pelas partículas vizinhas como é mostrado na Figura

2.3, onde também se mostra a trajetória de uma partícula suspensa (biocolóide),

que pode ser retida sobre o coletor (grãos de areia) devido a fenômenos físicos

de difusão, sedimentação e intercepção.

37

Figura 2.3. Mecanismos básicos de transporte em filtração de água

(Adaptado de Yao et al., 1971)

Para a obtenção da taxa de adesão katt, inicialmente deverá ser

determinada a eficiência do coletor η, definida como a relação entre a taxa na

qual as partículas colidem com o coletor, e a taxa na qual as partículas fluem na

direção da área projetada do coletor como mostra a equação (2.16), onde dg é o

diâmetro médio do grão (coletor), v a velocidade intersticial e Co a concentração

das partículas na suspensão (Yao et al., 1971).

4

dvC

2g

o

colidem partículas ás qual na taxa (2.16)

De acordo com Yao et al. (1971), a eficiência global do meio filtrante para

um filtro granular composto por esferas uniformes, obtida a partir de um balanço

de massa, é relacionada com a eficiência do coletor η, e através da seguinte

relação:

Ld2

)n1(3

C

Cln

go

(2.17)

onde L é a profundidade do meio granular filtrante, n é a porosidade, dg o

diâmetro médio do grão (coletor), C e Co as concentrações do influente e do

efluente da coluna respectivamente. A equação (2.17) pode ser usada para

estimar a distância da viagem de colóides em um meio poroso saturado tal como

os aquíferos de água subterrânea.

38

O objetivo da teoria de filtração (CFT) é determinar η sob condições

físicas e químicas conhecidas. Porém, devido à presença de forças repulsivas

decorrentes da dupla camada elétrica, nem todas as colisões resultam em

adesão de partículas sobre o coletor e, consequentemente se faz necessário

combinar um fator empírico na predição de η. Neste sentido, a eficiência do

coletor teórica denominada como ηo, determinada com base a fatores físicos

como será indicado mais adiante, é multiplicada pelo fator de eficiência de

colisão α, como indica a equação seguinte:

o (2.18)

A eficiência de colisão α para uma dada suspensão coloidal e meio filtrante

pode ser determinado através de ensaios de coluna e varia entre 10-3 e 1 (Ryan

e Elimelech, 1996).

Yao et al. (1971) descreveram quantitativamente os processos incluídos na

teoria da filtração (CFT), considerando que estes atuam na direção principal de

fluxo (a direção da força gravitacional), sendo os colóides transportados a partir

da massa de água para a superfície externa dos grãos. Estes processos são

descritos a seguir:

Difusão: torna-se mais importante como um mecanismo de transporte para

organismos patogênicos pequenos tais como vírus comparados com outros

maiores, como se pode observar na equação (2.19), que descreve o

movimento Browniano. Esta equação é conhecida como a equação de

Einstein (Yao et al., 1971).

d3

kTDg

(2.19)

onde Dg é a difusividade do grão (coletor) na água, k é a constante de

Boltzman (1,38048x10-23 J/K), T é a temperatura absoluta (K), μ é a

viscosidade dinâmica da água (1,002 x 10-3 N·s/m2), e d é o diâmetro do

biocolóide. A efetividade da difusão se incrementa ao decrescer o tamanho

da partícula.

Intercepção: inversamente à difusão que tem um grande efeito sobre

organismos patogênicos menores, a intercepção baseia-se na tendência

de objetos a permanecerem em movimento, uma propriedade pertencente

a colóides maiores (Richardson, 2002). A probabilidade de colisões que

ocorrem devido à intercepção pode ser descrita pela relação abaixo:

39

go

d

d (2.20)

A equação (2.20) mostra que quanto maior a relação entre o diâmetro da

partícula ou biocolóide d com relação ao diâmetro do coletor dg tem-se

maior probabilidade de colisão (Ryan e Elimelech, 1996). Assume-se que

tanto a partícula quanto o coletor são perfeitamente esféricos. Também é

assumida que para uma distância infinita entre o coletor e a partícula, a

concentração C é igual à Co, e C igual a zero para uma distância (d+dg)/2

medida desde o centro do coletor esférico (Yao et al., 1971).

Sedimentação: como o processo de intercepção, a sedimentação também

é proporcional ao tamanho de patogênico enquanto a difusão é

inversamente proporcional. Isso significa que a difusão tenderá a ser o

processo de transporte dominante para patogênicos de menor porte e a

sedimentação e a intercepção dominará o transporte dos maiores.

A sedimentação é o processo de movimento descendente devido à

diferença de densidade e é descrito através da Lei de Stoke’s:

18

gd)(v

2f

s

(2.21)

onde vs é a velocidade de sedimentação, ρ e ρf as densidades da partícula

e do fluido respectivamente, d o diâmetro médio do biocolóide e μ a

viscosidade dinâmica do fluido.

A Lei de Stoke’s assume que a partícula é esférica, macia e rígida, sendo

essas presunções não inteiramente válidas para microrganismos.

Este mecanismo é muito importante na acumulação de uma suspensão de

mineral inorgânico (densidade aproximadamente de 2,5 g/cm3), mas não

para microrganismos, que apresentam tamanho de partícula menor do que

5 μm e densidade aproximadamente de 1 g/cm3 (Pekdeger e Matthess,

1983).

Os três processos citados acima (difusão, interceptação e sedimentação),

que contribuem à eficiência de colisão têm sido integradas dentro de uma

equação por Yao et al. (1971) e pode ser aplicada para a filtração inicial “clean

bed” ou leito limpo, onde a deposição no interior dos poros não altera

significativamente o padrão de fluxo e as características do meio (Yao et

al.,1971). Esta equação incluindo a correção de Happel pode ser escrita como

segue (Hornberger et al., 1992):

40

v18

gd

d

dA

2

3

dvd

kTA90

2f

2

g

s

3

2

g

31sGIDo

)(, /

(2.22)

Na equação acima, ηD, ηI, ηG corresponde aos processos de difusão,

intercepção e sedimentação respectivamente e As é o fator de correção de

Happel que depende da porosidade de acordo com as equações seguintes:

65

5

sp2p3p32

p12A

)( (2.23)

31n1p /)( (2.24)

É também importante salientar que a equação (2.22) foi deduzida para um

coletor único e perfeitamente esférico. Além disso, assume-se que o diâmetro do

coletor não muda o que sim, de fato, ocorre devido ao acúmulo de colóides na

superfície dos grãos e a formação de biofilme (ou bio-fouling) (Knappett, 2006).

Para a determinação da taxa de adesão irreversível katt baseada na CFT,

considerada como um caso especial do processo geral de adsorção cinética, o

sistema é assumido como estacionário, inicialmente livre de microrganismos e a

influência da dispersão hidrodinâmica desprezível (i.e. o termo de dispersão e

pequeno comparado com o termo de advecção, que pode ser estimado através

do valor do número de Peclet (Pe) como foi explicado no item 2.6.2. A solução

para a equação (2.5) sob estas condições, para uma injeção contínua do

biocolóide com uma concentração Co (x=0) em um período de tempo t, e

considerando a relação dada na equação (2.15), está dada pela equação

seguinte:

x

v

kexpCC att

o (2.25)

onde a taxa de adesão katt dos microrganismos está relacionada com η e α,

através da equação (2.17) como segue:

g

attd2

v)n1(3k

(2.26)

É importante apontar que tanto η quanto a taxa de adesão katt podem ser

determinadas diretamente a partir da curva de chegada, seja com o experimento

de fonte contínua ou fonte pulso, considerando o valor de C/Co para o qual a

curva de chegada torne-se estável, através das seguintes equações:

41

oC

Cln

L)n1(

gd

3

2n (2.27)

o

attC

Cln

L

vk (2.28)

Como foi exposto anteriormente o valor da eficiência de colisão α depende

principalmente das condições químicas do sistema. Uma vez que a colisão

acontece, à adesão dependerá do efeito da força resultante da interação entre

partículas (força de atração ou repulsão).

Esta força ou potencial de energia total depende da distância entre

partículas e pode ser calculada como a soma das forças interpartículas tais

como, forças de atração de van der Waals e forças de repulsão eletrostática

(Verwey e Overbeek, 1948; citado por Kretzschmar et al., 1999).

A teoria de energia DLVO (Derjaguin and Landau, and Verwey and

Overbeek) estuda, de forma quantitativa, a estabilidade coloidal e foi

desenvolvida para explicar a coagulação rápida de colóides, observada em

presença de uma concentração eletrolítica alta e mais lenta, no caso de uma

baixa concentração, com uma transição de uma para a outra, conhecida como a

concentração crítica de coagulação (Gwyn, 2003). Desta forma a teoria DLVO

explica as alterações de energia que acontecem entre microrganismos e

superfícies sólidas e envolve uma estimativa da energia potencial de atração e

de repulsão, versus a distância entre partículas Essas quantidades são

mostradas na Figura 2.4 e descritas embaixo. Porém, a teoria DLVO assume a

superfície do colóide como lisa a nível molecular, sólida e inerte. Assim, as

inadequações desta teoria são sustentadas através de medições diretas das

forças de interações entre a bactéria e as superfícies sólidas através de

microscopia atômica (Ginn et al., 2002).

42

Figura 2.4. Teoria de energia DVLO. As forças combinadas de atração e

repulsão governam a agregação de partículas com relação à distância

entre elas (Gwyn, 2003)

As partículas sólidas de um aquífero estão quase sempre carregadas

negativamente. Uma exceção são os hidróxidos de ferro e de manganês e

substâncias orgânicas com baixos valores de pH. Bactérias e vírus, geralmente

carregados negativamente, são fortemente adsorvidos por adsorventes

aniônicos e fracamente por adsorventes catiônicos. Partículas carregadas

negativamente permanecem estáveis em suspensão em filtros de areia,

conforme as forças eletrostáticas de repulsão sejam mais fortes que as forças de

van Der Waals. Os cátions dissolvidos na água reduzem as forças repulsivas das

superfícies dos grãos. Cátions monovalentes são adsorvidos pela substância

sólida diminuindo sua carga negativa. Sob essas condições, as forças da massa

são mais efetivas e a acumulação de partículas acontece. Cátions bivalentes

podem também causar deficiência de carga positiva de modo que as forças

eletrostáticas podem ser mais eficientes para adsorção de bactérias e vírus

(Pekdeger e Matthess, 1983).

As bactérias podem se aderir ativamente e irreversivelmente sobre as

superfícies dos materiais sólidos dos aquíferos. As bactérias aderidas ficam

protegidas contra outras influencias e encontram altas concentrações de

nutrientes, decrescendo a taxa de eliminação. A adesão é mais intensiva na fase

de crescimento exponencial e pode ser de importância imediatamente depois da

intrusão da água poluída (Pekdeger e Matthess, 1983).

43

2.6.4. Filtração mecânica (straining)

A filtração é um mecanismo que pode limitar a migração de partículas.

McDowell-Boyer et al. (1986) consideram três formas de filtração, em função da

relação entre o tamanho da partícula e o tamanho do grão do meio poroso:

1. No caso de partículas ou agregados de partículas de tamanho comparável

ou maior do que o diâmetro médio do grão, a penetração dentro do meio

não acontecerá, mas sim a formação de uma membrana superficial sobre o

meio, conduzindo a uma diminuição na condutividade hidráulica, como

ilustra a Figura 2.5 (a). Esta forma de filtração é denominada em Bradford et

al. (2002) como “complete straining”.

2. O mecanismo de retenção de partículas dentro do meio poroso denominado

como “incomplete straining” (Bradford et al., 2002) ou simplesmente

“straining” (Corapcioglu e Haridas, 1986), acontece quando as partículas são

pequenas o suficiente para entrar no meio poroso sendo capturadas em

espaços de poros menores, como mostrado na Figura 2.5 (b). A retenção

ocorrerá em canais de poro e/ou uniões entre grãos que sejam menores que

uma dimensão crítica (Bradford e Bettahar, 2006).

3. Finalmente, a filtração físico química ou adsorção, processo que foi já

descrito no parágrafo 2.6.3 se refere à colisão e posterior retenção de

colóides em decorrência de forças físico químicas. Este mecanismo tem

maior importância quando o tamanho do colóide é pequeno em relação ao

tamanho de poro do solo (Bradford et al., 2002).

(a) (b) (c)

Figura 2.5. Formas em que a filtração limita a migração das partículas, a)

Filtração completa, b) Filtração incompleta ou straining, e c) Filtração físico

química (McDowell-Boyer et al., 1986)

44

Esta seção está focada no estudo do mecanismo de filtração incompleta

ou straining que, daqui por diante, será referido como filtração mecânica (termo

utilizado em Matthess et al., 1988 e Corapcioglu e Haridas, 1984).

Herzig et al. (1970) citado em Foppen et al. (2005) estimaram o potencial de

filtração mecânica utilizando relações geométricas entre o diâmetro do colóide e

o tamanho médio do grão (d/dg) assumindo os colóides e os grãos esféricos, a

través da equação seguinte:

1

2

d

d1

2

d

dZ)n1(

2

1

gg

(2.29)

onde σ(-) representa o volume de partículas que poderiam ser retidas, por

unidade de volume do total do meio poroso, n a porosidade inicial, Z é o número

de coordenação ou número de contatos entre os grãos do meio poroso. Em

função aos valores de n=0,4 e Z=7 (considerando um arranjo ortorrômbico de

esferas) foi determinado que quando a relação d/dg supera o valor de 0,05 a

filtração mecânica tem uma grande influência no processo de retenção de

partículas (citado por Corapcioglu e Haridas, 1984; Foppen et al., 2005; Bradford

et al., 2006). No entanto, observações experimentais recentes indicaram que a

filtração mecânica se dá para relações muito mais baixas, i.e. 0,002, valor citado

por Tukenkji et al. (2004) e Tufenkji (2007).

Considerando a passagem contínua de uma suspensão de bactérias

através de uma coluna de meio poroso, Foppen et al. (2005) estabeleceram que

o tempo t necessário para preencher a porção de volume de poros destinado à

deposição de bactérias σ, depende da concentração inicial Co a través da

seguinte relação:

o

bact

o Cnt

t

(2.30)

onde to é o tempo requerido para a passagem de um volume de poro (PV), (t/to)

o número de volume de poros que permitirá o preenchimento dos espaços

destinados à filtração mecânica e ρbact a densidade bacteriana (g/mL).

No entanto, em geral o solo não é composto de grãos esféricos e a

distribuição de tamanho não é uniforme. Nesse sentido Foppen et al. (2005)

propõem a utilização da função de densidade de poro f(r) dada na equação

(2.32), sendo r o radio do poro (m) e d o diâmetro do biocolóide. Esta função

permite uma estimativa mais aproximada de σ na equação (2.31). Como

resultado deste estudo Foppen et al. (2005) concluíram que a equação (2.29)

45

ainda parece proporcionar uma base valiosa para avaliar a importância da

filtração mecânica e para calcular o volume disponível para este processo.

drrfd

2

0 (2.31)

A distribuição de tamanho de poro pode ser determinada no laboratório

através da curva de retenção. Contudo, foi proposta uma solução baseada na

função de retenção solo-água de Van Genuchten (1980) (citado em Foppen et

al., 2005) para a determinação da função de densidade de poro através da

expressão seguinte:

)()()(

1mn1n

vv

vvv Ar1Arnmrf

(2.32)

e

vn

w

v

g

2A

cos (2.33)

onde mv, nv e αv são chamados parâmetros de van Genuchten e dependem das

propriedades do solo, δ é a tensão superficial da água 0,0728 N/m a 20°C (valor

extraído de Myers, 1999), β o ângulo de contato na interface que para o caso de

areia saturada é zero, ρw densidade da água (1,0 g/cm3) e g a aceleração da

gravidade (9,81 m/s2).

Foppen et al. (2005) e Foppen et al. (2007) incluem a filtração mecânica

na equação geral de transporte ADS, assumindo que as bactérias são retidas na

parte sólida do meio poroso em duas frações, uma delas está disponível para a

deposição devido à filtração mecânica (S2) e outra fração para a retenção

reversível (S1). Desta forma, a equação para a retenção de bactérias pode ser

expressa como:

t

S

t

S

t

S 21

(2.34)

1att

bulk

1 SkCkn

t

Sdet

(2.35)

Cn

kt

S

bulk

str2

(2.36)

Foppen et al. (2005) observaram experimentalmente que o coeficiente de

filtração mecânica Kstr é função da velocidade de fluxo v, além da relação d/dg

46

antes indicada por Bradford et al. (2003), através da seguinte equação de ajuste

onde a e b são parâmetros de ajuste:

vd

dak

b

g

str

(2.37)

Considerando o processo de filtração mecânica irreversível, sob

condições do meio poroso livre de microrganismos (clean bed), o valor da

dispersão hidrodinâmica desprezível a taxa de deposição devido à filtração

mecânica denominada como kstr, pode ser considerada igual a katt estimada

através da teoria clássica de filtração CFT do colóide (citado por Tufenkji, 2007).

Porém, estudos experimentais indicam que esta aproximação resulta inválida no

caso que o sistema apresenta condições desfavoráveis à adesão (Martin et al.,

1996; Kretzschmar et al., 1999; Tufenkji e Elimelech, 2004; Tufenkji, 2007).

É importante salientar que as equações apresentadas não consideram o

potencial de crescimento de um biofilme ou a formação de aglutinações de

bactérias. Em geral, as bactérias não estão presentes na solução como

partículas individuais, mas podem ser aderidas aos sólidos suspensos.

(Mc Dowell–Boyer et al., 1986). A formação de flocos de bactérias aumenta o

impacto da filtração mecânica reduzindo a relação do diâmetro do meio poroso e

o diâmetro da bactéria (Richardson, 2002).

2.6.5. Exclusão

Denomina-se exclusão ao processo físico que se refere ao incremento da

velocidade de transporte de um colóide ou biocolóide em relação à velocidade

média da água, envolvendo um incremento da taxa de transporte devido ao

tamanho ou carga eletrostática do material transportado (Ginn et al., 2002).

Com relação aos processos que originam a exclusão em Ginn et al. (2002)

são identificados o efeito aniônico e o efeito do tamanho. A exclusão aniônica

acontece em escala molecular, devido a cargas eletrostáticas repulsivas entre o

meio poroso e o soluto, sendo direcionado a se afastar das paredes de poro.

Este efeito pode se ampliar como exclusão de tamanho (size exclusion) no caso

dos microrganismos considerando a distribuição parabólica das velocidades nos

poros. Os microrganismos e colóides maiores, em virtude ao seu tamanho,

experimentam, preferencialmente, as maiores velocidades na proximidade da

linha de fluxo central (Murphy, 2000), atingindo uma velocidade média muito

47

mais elevada que um traçador dissolvido. E pode ser drasticamente mais

pronunciado na observação de uma escala maior em meio natural (Murphy,

2000).

O efeito do tamanho se produz quando a partícula coloidal tem a mesma

escala de uma fração significativa de poros, sendo as partículas redirecionadas

para outros canais de poro maiores, onde os colóides experimentaram

velocidades maiores. Este processo é denominado exclusão de poro (poro

exclusion) ou mais especificamente exclusão de tamanho de poro (poro size

exclusion).

O processo de exclusão no caso de microrganismos é frequentemente

observado em estudos de campo (Hornberger et al., 1992; Pang et al., 2003) e

principalmente no caso de transporte de vírus (Woessner et al., 2001). De

acordo com Sirivithyapakornanand e Keller (2003) os colóides parecem ter uma

maior probabilidade de viajar nas proximidades da linha de corrente central no

espaço de poro, mas os colóides maiores (1-3μm) se espalham em um número

maior de linhas de corrente, desta forma não sendo transportados com a

velocidade máxima.

2.6.6. Bloqueamento e Ripening

A dependência dos coeficientes de adesão com relação ao tempo é

resultado de diferencias no comportamento de adesão de colóides sobre o meio

poroso “limpo” e sobre o meio que já contém colóides aderidos (Bradford et

Bettahar, 2006). Uma diminuição da adesão ocorre quando os locais favoráveis

à adesão são completamente ocupados (bloqueio ou blocking). Por outro lado,

um aumento ou melhoria da adesão pode acontecer quando as partículas

aderidas servem como lugares favoráveis para uma adesão subsequente

(Ripening).

48

a) b) c)

Figura 2.6. a) Cinética inicial de deposição, b) Efeito do bloqueamento e c)

Efeito do ripening (Kretzschmar et al., 1999)

Estes dois processos foram estudados por Camesano et al. (1999)

incluindo um coeficiente na equação (2.35) como segue:

1detattatt

bulk

1 SkCkn

t

S

(2.38)

onde (ψatt) é a função de adesão adimensional que considera o processo de

bloqueamento (blocking). Quando (ψatt) é igual a 1, é assumida a adesão em leito

limpo “clean bed” e a concentração dos colóides retidos no meio poroso

decresce exponencialmente com a profundidade. O valor de (ψatt) torna-se

função de S1 para levar em conta o processo de bloqueamento com (ψatt)

diminuindo enquanto S1 aumenta.

2.7. Ensaios experimentais

Experimentalmente, o transporte de microrganismos em meios porosos

saturados tem sido tradicionalmente investigado através da aplicação do método

de colunas empacotadas (packed column), termo utilizado em cromatografia,

onde a concentração dos microrganismos suspensos no efluente é monitorada

em função do tempo. Com o objetivo de entender os mecanismos de transporte

e retenção de organismos patogênicos, a literatura mostra que foram realizados

vários estudos em laboratório e campo indicados na Tabela 2.3.

O ensaio Advecção-Dispersão-Sorção (ADS) ou também denominado

ensaio de coluna, utilizado no campo da geotecnia para o estudo de transporte

de contaminantes, é aplicado no presente estudo ao estudo do transporte de

microrganismos como se verá em detalhe nos capítulos seguintes.

49

Tabela 2.3. Componentes utilizados em experimentos realizados para o

estudo do transporte de microrganismos

Autor Ano Coloide Meio poroso Solução

HUYSMAN F. e

VERSTRAETE W.1992

Escherichia Coli Strain Ec1 e

Streptococcus faecalis Sf3Solo arenoso e solo argiloso Água desmineralizada

MCCAULOU D. R., et al . 1994Cepas de bactérias isoladas a partir

de um lençol freático S5 e S139

Quartzo, quartzo revestido

com hematita, quartzo

revestido com polimero

Água Artificial

BARTON J. W. 1995 Pseudomonas putida PRS2000 Água Artificial

RYAN Joseph N. et al. 1996partículas de látex (i.e., bacteria e

virus)Leito de esferas de vidro

MARTIN M.J. , et al. 1996Pseudomonas Fluorescens Strain

P17Quartzo medio Água deionizada

HENDRY L. et al. 1999Klebsiella oxytoca Burkholdeira

cepaciaAreia de Sílica Água Artificial

CAMESANO T.A., et al. 1999Pseudomonas putida e carboxilated

latexSolo do sul de Arizona Água Artificial

LI Q. e LOGAN B.E. 1999 Alcaligenes paradoxus bacteria Solo Ringold Água Artificial

BRADFORD S.A., et al. 2002 Partículas de látexLeito de vidro, varias areias de

OttawaÁgua deionizada

LIPING Pang 2003 Escherichia coli e F-RNA phages Areia de Pedra Pomes Água nativa

TUFENKJI N. e

ELIMELECH M.2004

Partículas de látex (e.g., bacteria e

virus)Leitos de vidro Água deionizada

TUFENKJI et al . 2004 Cryptosporidium parvum oocysts Areia de Quartzo Água deionizada

REDMAN J.A. 2004 E. coli K12 strain, D21 Areia de quartzo ultrapura Água deionizada

FOPPEN J.W.A. et al. 2005 E. coli Areia de QuartzoÁgua de torneira

estéril

FOPPEN et al. 2005 E. coli strain ATCC25922 Areia de Quartzo Água estéril

JIANG G. et al. 2005 Bacillus Subtilis Areia de Sílica Água estéril

BRADFORD S.A. et al. 2006 carboxyl latex Areia de Quartzo Água deionizada

LEVY J. 2007 E. coli Sedimentos glaciais Água de aquifero

KUZNAR Z.A. e

ELIMELECH M.2007

partículas de látex e

Cryptosporidium parvumLeitos de vidro Água deionizada

FOPPEN et al. 2007 E. coli ATCC25922 Areia de Quartzo ultra pura Água desmineralizada

JIANG G. et al. 2007 Escherichia coli strain D Areia de Sílica Água deionizada

KIM H.N. et al. 2009Escherichia coli strains (D21g e XL1-

Blue)Areia de Quartzo ultra pura Água artificial

LUTTERODT et al. 2009E. coli strains (UCFL-71, UCFL-94,

UCFL-131, UCFL- 167, UCFL-263 e

UCFL-348)

Areia de Quartzo ultra de

99.1% de pureza

Água desmineralizada

e Água artificial

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Considerações Gerais

Como foi apresentado na Tabela 2.3, são diversos os trabalhos que se

referem ao estudo sobre a interação de microrganismos com o solo, em escala

de laboratório, sob condições controladas, utilizando diversos materiais como

meio poroso e como biocolóides; microrganismos ou modelos representativos

deles.

O estudo do transporte no presente trabalho é realizado através de

ensaios Adveção-Dispersão-Sorção (ADS). Com esta finalidade, inicialmente

foram escolhidos os materiais a serem utilizados nos ensaios de transporte, e

desenvolvido no Laboratório de Geotecnia e Meio Ambiente da PUC-Rio, um

equipamento destinado à realização dos ensaios ADS. Nesta seção serão

apresentadas as propriedades dos materiais escolhidos, os métodos e as

técnicas microbiológicas utilizadas e a descrição do equipamento.

Previamente à realização dos ensaios ADS foi necessária a execução de

ensaios microbiológicos, assim como de ensaios de batelada. A metodologia

utilizada nestes ensaios preliminares e nos ensaios ADS propriamente ditos

também será apresentada nesta seção.

3.2. Meio poroso

O meio poroso utilizado foi areia de quartzo industrial, limpa e seca,

utilizada por Pessôa (2006). Esta areia é resultado da mistura homogênea de

vários tipos de areias com distribuição uniforme de grãos com a finalidade de

obter uma areia bem graduada. As imagens da Figura 3.1, feitas em microscópio

estereoscópico (lupa) mostram a morfologia e tamanho dos grãos. O aspecto da

areia foi descrito por Pessôa (2006) como uma areia formada por grãos de

quartzo hialinos (incolor, transparente) e leitosos (branco translúcido,

embaçado), em geral angulosa.

51

Figura 3.1. Areia de quartzo. Lupa ZEISS Stereo Discovery V8 x10 de

aumento

3.2.1. Caracterização geotécnica do meio poroso

A caracterização geotécnica do meio poroso foi feita através da

determinação das seguintes propriedades: massa específica, distribuição do

tamanho dos grãos, relação de vazios e permeabilidade. O resumo dos

resultados obtidos está disposto na Tabela 3.2, ao final desta seção.

As análises foram realizadas no Laboratório de Geotecnia e Meio

Ambiente da PUC-Rio, utilizando protocolos padrão indicados para cada ensaio.

A massa específica dos grãos (G) ou densidade relativa dos grãos foi

determinada de acordo com o procedimento indicado na norma brasileira

ABNT/NBR 6508/84. O valor médio de 2,64, assim determinado, considera-se

coerente com a densidade teórica do quartzo (2,65).

Devido à dependência do tamanho dos grãos sobre os diferentes

processos de transporte, foi feita a medida da distribuição do tamanho dos grãos

através do ensaio de análise granulométrica, de acordo com o procedimento

especificado pela Norma Brasileira ABNT/NBR 7181/84, utilizando uma mesa

vibratória horizontal.

A Figura 3.2 ilustra a curva granulométrica da areia de quartzo usada nos

experimentos deste estudo. De acordo com a curva granulométrica, o solo

apresenta 12% de areia fina (0,06 até 0,2 mm), 22% de areia média (0,2 até

52

0,6 mm) e 64% de areia grossa (0,6 até 2 mm). Assim, de acordo com a

classificação indicada na Norma Brasileira ABNT/NBR 6502/95, o solo é

classificado como areia grossa.

Figura 3.2. Distribuição de tamanhos dos grãos de quartzo

A partir da curva granulométrica são determinados graficamente os

diâmetros característicos d10=0,18mm, d30=0,55mm, d50=0,92mm e d60=1,10mm,

e através deles os seguintes parâmetros:

Coeficiente de uniformidade Cu=d60/d10=6,11

Coeficiente de curvatura (d302)/(d60xd10)=1,82

De acordo com o Sistema Unificado de Classificação de Solos, um solo

que apresenta um coeficiente de uniformidade maior do que 6, pode ser

classificado como um solo bem graduado. Desta forma a areia de quartzo pode

ser classificada como areia bem graduada (SW), ou seja, os diâmetros dos grãos

estão distribuídos de forma uniforme em todas as faixas granulométricas.

A existência de grãos com diversos diâmetros permite melhor arranjo das

partículas (bom entrosamento) e ocupação dos espaços vazios. A

heterogeneidade dos grãos possui, por sua vez, uma importância considerável

na porosidade. Os grãos menores tendem a se concentrar nos espaços

intersticiais deixados pelos grãos maiores, diminuindo o índice de vazios.

Uma estimativa do diâmetro médio dos grãos corresponde ao valor do

diâmetro característico d50. Porém, para determinar o diâmetro a ser utilizado

nas equações de filtração (dg) quando o meio poroso é composto por diferentes

tamanhos de partículas, como é o caso do presente estudo, será usado o valor

53

do diâmetro efetivo d10, que de acordo com Martin et al. (1996), descreve de

modo mais exato o transporte de bactérias através de um meio heterogêneo.

O índice de vazios máximo e mínimo da areia de quartzo foi determinado

através dos métodos indicados pelas normas brasileiras ABNT/NBR 12004/90 e

ABNT/NBR 12051/91 respectivamente, sendo obtidos os resultados de 0,31 para

o emin e 0,66 para o emax. Nos ensaios ADS, o índice de vazios se manteve em

torno de 0,4, valor que permitiu a determinação da porosidade do meio poroso

através da equação (3.1), obtendo o valor de porosidade (n) igual a 0,29.

e1

en

(3.1)

O coeficiente de permeabilidade ou condutividade hidráulica saturada Ks foi

determinado usando o método da carga constante e parede rígida, de acordo

com a norma ABNT/NBR 13292/95. De forma sucinta, o procedimento envolveu

o uso da Garrafa de Mariotte, a partir da qual o fluxo de saída foi conectado à

válvula de ingresso no fundo do permeâmetro de parede rígida, gerando fluxo

ascendente e constante através da coluna de areia, conforme ilustra a

Figura 3.3. O volume de saída do efluente foi medido através da determinação

do peso do efluente em intervalos de tempo constante.

Figura 3.3. Aparato para a determinação da condutividade hidráulica

saturada

O valor da condutividade hidráulica Ks foi determinado a partir da Lei de

Darcy:

H

ALQK s

(3.2)

Mariotte

Permeâmetro de

Parede rígida

54

onde Q é a vazão de saída medida por peso de água através do tempo, L é o

comprimento, A é a seção transversal da amostra, e Δh a diferença de carga

entre o ingresso e saída da água do permeâmetro. O ensaio foi realizado três

vezes, sendo o valor adotado a média dos resultados dos três ensaios, como é

apresentado na Tabela 3.1.

Tabela 3.1. Determinação da condutividade hidráulica saturada

Ensaio i [-] Ks [cm/s]

1 0,25 2,91E-02

2 0,22 3,05E-02

3 0,20 2,75E-02

Média 2,91E-02

A condutividade hidráulica pode ser calculada também antecipadamente

utilizando a equação de Hazem Ks = d102, que para a areia de quartzo utilizada

corresponde ao valor de 3,24E-02 cm/s. Esta equação determina que para

areias soltas, a condutividade hidráulica é igual ao quadrado do diâmetro do

grão, para o qual só 10% da amostra tem um diâmetro menor. É interessante

notar que Pekdeger e Matthess (1988), citado em Foppen et al., (2005)

relacionam a filtração mecânica com a inversa do d10. Assim, o percentual de

10% da areia mais fina impacta tanto a condutividade como na filtração

mecânica. Esta relação tem lógica desde que estes grãos mais finos irão a

preencher os espaços entre aqueles maiores e assim influenciar o tamanho

médio do poro da coluna compacta inteira.

Tabela 3.2. Características físicas da areia de quartzo limpa

Propriedade Valor

Massa específica dos Grãos, G (-)

Relação de vazios máxima, emax (-)

Relação de vazios mínima, emin (-)

Diâmetro médio, d50 (mm)

Diâmetro efetivo, d10 (mm)

Condutividade hidráulica saturada, Ks (cm/s)

2,64

0,66

0,31

0,92

0,18

2,91E-2

55

3.3. Bactéria

Neste estudo irão ser avaliados, os principais processos conhecidos que

determinam a movimentação e distribuição da E. coli em aquíferos sob

condições de saturação, através da determinação de parâmetros de transporte

como a adsorção e a filtração, com o objetivo de esclarecer a importância

relativa dos vários fatores que influenciam o transporte.

O biocolóide usado como objeto de estudo foi a bactéria Escherichia coli

ATCC (American Type Culture Colletion) 11229, gentilmente cedida pelo

Professor Doutor Marco Antônio Lemos Miguel do Instituto de Microbiologia

Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro. A determinação das

propriedades das células, como densidade específica, densidade seca e

determinação do tamanho das células foram realizadas, mas não fazem parte

dessa dissertação.

As dimensões da bactéria foram obtidas do estudo realizado por Matthess

et al. (1991b) citado em Foppen et al., (2005) e Foppen e Shijven, (2006), que

estudaram o transporte de E. coli ATCC 11229, determinando um comprimento

médio de 2-4 μm, diâmetro médio de 1 µm e a densidade da bactéria variando

entre de 1-1,05 g/cm3.

3.3.1. Manutenção da cepa de Escherichia Coli

A cepa de E. coli foi mantida e transferida por repique mensal, para tubos

de ensaio de 20 mL, contendo 5 mL de meio sólido Trypticase Soy Agar (TSA)

inclinado e também para tubos contendo 10 mL de meio líquido Trypticase Soy

Broth (TSB). As células dos repiques, conservados em geladeira, foram ativadas

para serem usadas nos ensaios, através de preparo do pré-inóculo, pela

transferência de alíquotas dos repiques para tubos de ensaio contendo 10 mL de

meio TSB. Após a inoculação, os tubos (pré-inóculo) eram incubados a

temperatura ambiente por 48 horas após as quais eram imediatamente usados

nos ensaios.

A partir destes tubos contendo o pré-inóculo, foram preparados inóculos,

número de bactérias necessárias para a realização dos ensaios, multiplicando

numericamente a população bacteriana. Para tal inoculou-se uma alíquota do

pré-inóculo, de volume igual ao 1% (v/v) do volume de meio TSB, necessário em

56

função do ensaio que será realizado. Esse conjunto é incubado até que as

bactérias atinjam o final da fase exponencial da curva de crescimento.

3.3.2. Determinação do número de bactérias

A estimativa numérica de células bacterianas foi feita através da contagem

de células por microscopia em Câmara de Neubauer, pela densidade óptica da

suspensão celular e por contagem de células viáveis em meio de cultura através

da técnica dos Tubos Múltiplos e por Contagem em Placas, dependendo do

ensaio a ser realizado. Essas técnicas serão descritas a seguir.

3.3.2.1. Contagem celular em Câmara de Neubauer

A câmara de Neubauer (CNB) consiste numa lâmina de microscopia com

espessura bem maior que uma lâmina normal, onde existe marcação de área

que permite, através de uso de uma lamínula de cobertura, determinar o volume

da amostra contida em cada espaço determinado por quadrantes. Por

conseguinte é possível, após contagem do número de bactérias nesses

quadrantes, se determinar o número de bactérias em cada mL da amostra

referentes a cada ensaio ou condição. Neste estudo foi utilizada uma câmara de

Neubauer modelo 1/400 mm2 x 0,1 mm (Figura 3.4).

a) b)

Figura 3.4. a) Câmara de Neubauer utilizada, b) Esquema da CNB com a

lâminula sobre a área de contagem

A seguir, a Figura 3.5 mostra que a área de contagem de 1 mm2 está

dividida em 25 quadrados cada um deles com área de 0,04 mm2 (1/25 mm2). A

contagem é realizada em pelo menos 5 desses quadrados, escolhidos

57

aleatoriamente. Por sua vez, estes últimos quadrados estão subdivididos em 16

quadrados menores de área igual a 0,0025 mm2 (1/400 mm2).

Figura 3.5. Área de Contagem da CNB e esquema da metodologia de

contagem.

O número total de bactérias é calculado multiplicando por 25 a média do

número de bactérias contadas nos 5 quadrados escolhidos, obtendo assim o

número de bactérias em 1 mm2. Considerando a profundidade da câmara de 0,1

mm o valor pode ser calculado para 1 mm3.

3.3.2.2. Leitura da densidade óptica por espectrofotometria

A espectrofotometria é uma técnica utilizada para determinar a quantidade

de uma substância ou elementos em solução ou suspensão em uma amostra.

Ela é baseada na absorção de radiação dos comprimentos de onda entre as

regiões que variam desde a faixa do ultravioleta, passando pela luz visível, até a

zona do infravermelho.

Desse modo, a absorbância A é uma medida indireta da concentração

bacteriana numa suspensão. A relação linear que existe entre absorbância e

concentração é conhecida como a relação de Beer-Lambert, que pode ser

expressa como:

A abc

(3.3)

onde a é uma constante que depende do tamanho e índice de refração da

bactéria, e do comprimento de onda da luz incidente (Deshpande e Shonnard,

58

1999); b é distância percorrida pelo feixe luminoso através da amostra e

finalmente c a concentração bacteriana.

Assim, a absorbância da luz a cada comprimento de onda é diretamente

proporcional à concentração da solução contida na cubeta. Esta linearidade

deixa de ocorrer em concentrações muito baixas e muito elevadas da

substância, podendo-se, neste último caso, diluir previamente a amostra a medir.

Uma curva padrão deve ser estabelecida para que seja possível correlacionar o

valor da absorbância com a quantidade numérica de bactérias, determinada por

contagem em Câmara de Neubauer ou por contagem de unidades formadoras

de colônias em meio de cultura.

Neste estudo a absorbância foi determinada utilizando o espectrofotômetro

Spectronic Genesys (Spectronic Instruments Inc.) e como recipientes, cubetas

retangulares de quartzo, de 1 cm de comprimento.

3.3.2.3. Contagem de microrganismos pela Técnica dos Tubos Múltiplos

A técnica dos Tubos Múltiplos também é conhecida como Técnica do

Número Mais Provável (NMP) e permite estimar o número de células viáveis

numa suspensão celular através do uso de indução matemática. O princípio

deste método consiste na inoculação de várias réplicas de diluições em série de

uma mesma amostra, em tubos de ensaio com meio de cultura líquido e na

detecção e contagem do número de réplicas nas quais for detectado

crescimento. Assume-se que cada tubo de ensaio onde se detecta crescimento

terá recebido pelo menos uma célula microbiana viável e cultivável. Interpreta-se

que os tubos nos quais não ocorre crescimento microbiano não devem ter

recebido nenhuma célula viável. Os tubos com crescimento distinguem-se

facilmente daqueles onde não ocorreu crescimento, pela presença de turbidez

e/ou mudanças de coloração apresentada pelo meio de cultura específico para

cada espécie ou grupo a ser detectado. A determinação do número mais

provável de células é feita através da aplicação de tabelas publicadas,

preparadas através de cálculos estatísticos, levando-se em consideração uma

combinação do número de réplicas, onde se detecta crescimento e as

respectivas diluições.

Para a determinação do NMP, as amostras foram diluídas sucessivas

vezes e inoculado 1 mL de cada diluição, em triplicata, em tubos com 10 mL de

meio líquido (TSB ou Caldo Fluorocult), de tal forma que se obtivesse uma última

59

diluição de 3 tubos que apresentasse pelo menos um resultado negativo. O

arranjo de número de tubos positivos das 3 diluições foi transposto para Tabelas

estatísticas que informam o NMP para as diferentes combinações de tubos

positivos e que também incluem os limites de confiança dos números mais

prováveis dos microrganismos pesquisados em função da Tabela em questão.

3.3.2.4. Contagem de Número de Unidades Formadoras de Colônias em Placas de Petri

A contagem em placas permite a visualização de colônias de

microrganismos, que são consideradas, cada uma como tendo sido originária de

uma única célula. Como é possível que algumas colônias se originem de células

não separadas, considera-se então não o número de células, mas sim o número

de Unidades formadoras de colônias.

Neste trabalho foi utilizada a técnica de contagem em placa por

derramamento em profundidade ou “pour plate”. Neste, a suspensão da amostra

contendo microrganismos em água sofria diluições sucessivas e uma alíquota de

0,1 mL dessas diluições era aplicada, em triplicata, no fundo de placas de Petri

de plástico, previamente esterilizadas como mostra o esquema da Figura 3.6.

Sobre esta alíquota era aplicado uma quantidade de meio TSA (tripticase soy

agar) fundido, a temperatura de aproximadamente 45º- 50ºC e o conjunto

cuidadosamente homogeneizado, através de movimentos circulares. Após a

solidificação do meio, as placas tampadas eram invertidas e incubadas a

temperatura ambiente (25°C) por 24 a 48 horas, para proceder à contagem do

número de colônias.

Na técnica de contagem em placa, as placas adequadas para contagem

devem ter entre 30 a 300 colônias. Assim, após a contagem, o resultado médio

do número de colônias das placas referentes a cada diluição era registrado e

multiplicado corrigido pelo fator da diluição.

60

Figura 3.6. Esquema da Técnica de Contagem em Placa

3.4. O equipamento para o ensaio ADS

O estudo de laboratório implementado para determinar os parâmetros de

transporte da bactéria E. coli ATCC11229 em areia saturada, denominado

ensaio ADS (Advecção-Dispersão-Sorção), adotou um sistema baseado na

passagem contínua de uma suspensão bacteriana através de uma coluna de

solo, com fluxo vertical constante da base para o topo da coluna, reduzindo os

efeitos gravitacionais sobre o transporte bacteriano e facilitando a saída de

gases na coluna durante sua saturação.

Com este objetivo, no laboratório de Geotecnia da PUC-Rio e como parte

do presente estudo, foi desenvolvido o equipamento necessário para a

realização do ensaio ADS.

Para que fosse possível realizar os ensaios sob condições assépticas

foram utilizados materiais resistentes ao ataque químico e a temperaturas

maiores do que 121°C, visando à esterilização do equipamento por

autoclavação. Sendo assim foram escolhidos o teflon, resistente a uma grande

variedade de produtos químicos usados durante os ensaios, podendo ser usado

61

entre -200°C e +200°C em serviços intermitentes, o polipropileno, que tem boa

resistência química e resistência ao calor de até 120°C e finalmente o silicone.

O equipamento, semelhante ao utilizado para o ensaio de permeabilidade

de solos granulares à carga constante, consiste basicamente de uma coluna de

parede rígida e um reservatório (Frasco de Mariotte), ligados entre si por

mangueiras de silicone. O reservatório está destinado ao armazenamento de

água destilada estéril na etapa de saturação da coluna ou da suspensão

bacteriana durante os ensaios.

O Frasco de Mariotte é um dispositivo usado em laboratório para manter

constante a carga hidráulica do líquido a ser inserido na coluna, sem precisar de

qualquer sistema suplementar ou de bombeamento (Thorel et al. 2002). Assim,

este dispositivo foi utilizado para gerar o fluxo ascendente através da coluna de

areia.

Agitador

magnético

Mariotte

Permeâmetro de

parede rígida

a) b)

Figura 3.7. Esquema de funcionamento do equipamento para os ensaios

ADS a) Δh=0 , b) Δh>0

Devido ao funcionamento hidráulico do equipamento, mostrado na

Figura 3.7 é preciso determinar a posição da coluna com relação ao Mariotte, de

forma que a solução contida no frasco de Mariotte flua até a coluna, da base

para o topo, por efeito da diferença de carga hidráulica Δh. Para isto, a parte

inferior do tubo do frasco de Mariotte deve ficar por cima da válvula de saída da

coluna. Esse sistema permite que a pressão, no final do tubo dentro do frasco,

seja o valor da pressão atmosférica, enquanto que a pressão acima do nível de

62

água no interior do frasco de Mariotte se torna negativa. A Figura 3.7 (a) mostra

a configuração do equipamento para a condição estacionária do sistema (Δh=0)

e na . Figura 3.9 (b) no caso que o gradiente hidráulico é maior que um (Δh>0).

A seguir são descritas as características do Frasco de Mariotte e da

coluna.

3.4.1. Características do frasco de Mariotte

Os Mariottes consistiram de cilindros de teflon com 15,8 cm de diâmetro

interno e comprimento de 29 cm. Foram construídos para conter

aproximadamente 5 litros de material fluido (água ou suspensão bacteriana). A

tampa de cada Mariotte, também de teflon, é acoplada à abertura superior do

Mariotte de forma a não permitir nenhuma passagem de ar. Para garantir o

fechamento hermético, foi disposto um lenço de silicone entre a tampa e o

cilindro. Essa tampa é atravessada por um tubo de polipropileno de 5/8” de

diâmetro sujeita à tampa através de um O-ring como mostra a Figura 3.8. É

importante apontar que foi colocada uma peça adicional no extremo exterior do

tubo em forma de U, com o objetivo de minimizar a entrada de ar contaminado,

durante a execução dos ensaios.

Figura 3.8. Corte transversal e detalhe da tampa do Mariotte

Assume-se que o valor da concentração da suspensão bacteriana se

mantém constante no ingresso da coluna para o ensaio inteiro, nesse sentido

para manter a suspensão bacteriana homogeneizada foi acoplada como base do

Mariotte, na parte inferior do cilindro, uma placa agitadora com um bastão

magnético (Agitador magnético Fisatom mod. 753), conseguindo-se a agitação

contínua da suspensão e, portanto sem variações da concentração inicial. Entre

63

o cilindro e a base também foi colocado um lenço de silicone para a vedação do

reservatório (ver Figura 3.9).

Figura 3.9. Corte transversal e detalhe da base do Mariotte

A saída do fluxo do Mariotte está situada na parte lateral inferior do cilindro

através de uma válvula de aço inoxidável conectada a uma mangueira de

silicone (ϕint= ¼ ̎ ), que conduz o fluxo até a base da coluna.

3.4.2. Características da coluna

O diâmetro das colunas atendeu a relação mínima de d/d10 de 50,

recomendada para estudos de filtração de água. A finalidade do uso dessa

relação é minimizar os efeitos sobre a porosidade e a distribuição de fluxo em

colunas empacotadas (Knappett et al., 2008).

Figura 3.10. Esquema dos componentes da coluna

Como se observa na Figura (3.10) as colunas eram constituídas por

cilindros de teflon com 6,35 cm de diâmetro interno e 20 cm de comprimento.

Discos de alumínio perfurado foram colocados no topo e base das colunas para

uma distribuição uniforme do fluxo e sustentação da coluna de areia. Para evitar

64

a perda de grãos de areia durante o funcionamento da coluna, foi utilizada uma

tela de aço inoxidável com abertura de 0,109 mm (equivalente a malha #150)

também no topo e base da coluna.

A base e a tampa encaixam perfeitamente nos extremos da coluna através

de O-ring’s. A válvula de ingresso do fluxo está situada no centro da tampa

inferior, uma vez que a solução ingressa à base da coluna é acumulada em um

espaço de dimensões relativamente pequenas antes de iniciar sua passagem

através da coluna de areia. Isto permite que a solução seja uniformemente

distribuída, além da placa de alumínio perfurada colocada também com este

mesmo objetivo. A mesma configuração foi projetada para a tampa superior, com

a única diferença que a válvula de saída está situada na parte lateral da tampa.

A Figura (3.11) mostra a seção transversal da coluna completamente montada.

Figura 3.11. Corte transversal da coluna

Durante a montagem da coluna os comprimentos das mangueiras do

influente e efluente foram mantidos constantes para todos os ensaios, para

reduzir a variabilidade entre eles devido às perdas nas tubulações.

65

3.5.Ensaios Microbiológicos

Os ensaios microbiológicos foram realizados sob condições de assepsia,

utilizando para isto uma capela de fluxo laminar durante a manipulação das

culturas bacterianas. Os materiais usados durante os ensaios, tais como meios

de cultura, vidrarias, água, etc., foram previamente esterilizados em autoclave a

121°C, equivalente a uma pressão de 1 atm, por 15 a 20 minutos.

A esterilização da areia foi realizada com a finalidade de destruir a

população de microrganismos com a mínima alteração das propriedades físicas

e químicas do solo, sendo a esterilização com calor úmido (em autoclave) um

dos métodos mais utilizados.

Com este objetivo foram colocados aproximadamente 1250 gramas de

areia seca numa bandeja de vidro coberta por papel alumínio. As dimensões da

bandeja permitiram que a espessura de solo já distribuído não fosse maior do

que 2 cm como recomendado pelo procedimento padronizado no Methods of Soil

Analysis (SSSA, 1994), permitindo a penetração de vapor durante a

autoclavação. O solo foi assim, autoclavado a 0,10 MPa = 1 atm = 1 kgf/cm2 a

121ºC durante 1 hora. Como controle e para verificar a eficiência do processo de

esterilização, alíquotas do solo já autoclavado foram retiradas com espátula

estéril, colocadas em três tubos de ensaio contendo 10 mL de meio TSB cada

um deles, e incubadas por 2 dias (48 horas) a 25ºC não sendo observado

crescimento bacteriano nestes meios.

3.5.1. Correlação entre Número de Células e Absorbância

A determinação do número de células pela densidade óptica da suspensão

bacteriana é um método simples, de fácil manipulação e de resposta rápida.

Entretanto os valores de absorbância não resultam diretamente no número de

células existentes nas culturas. Assim, para se conhecer o número de células

presentes em cada uma das amostras avaliadas nas diferentes etapas de cada

ensaio, a partir de determinações espectrofotométricas, é necessário estabelecer

uma correlação gráfica entre o valor da densidade óptica por absorbância e o

número de células de uma suspensão determinado por uma metodologia que

possibilite a contagem de células, como por exemplo, a contagem em Câmara

de Neubauer.

Foram estabelecidas curvas de correlação tanto para células suspensas

em meio TSB, como para aquelas ressuspensas em água destilada, após

66

centrifugação. As análises da água usada para a saturação das colunas foram

feitas para serem usadas como referência nas determinações do número de

células nos efluentes dos ensaios de batelada e ADS sem a introdução do

inoculo de E. coli.

Para a obtenção de massa celular para as determinações a serem

efetuadas, alíquotas de 1,5 mL de pré-inóculo de E. coli foram inoculadas em

erlenmeyers de 250 mL contendo 150 mL de meio TSB estéril. Esse conjunto foi

incubado em banho-maria a 25°C, com agitação constante de 100 rpm por

24 horas. Experimentos prévios, realizados no laboratório de Geotecnia e Meio

Ambiente, apontaram que a massa celular da cultura de E.coli ATCC 11229 se

estabilizava a partir de 24 horas de incubação nas condições descritas neste

item.

O meio TSB apresenta uma cor amarelada e absorve melhor a luz em

comprimentos de onda diferentes daqueles absorvidos com água destilada.

Como, para alguns ensaios a absorbância foi determinada diretamente dos tubos

de TSB com crescimento bacteriano e, em outros, as células estavam suspensas

em água, foi necessário realizar a correlação entre a absorbância e o número de

células nas duas condições.

No caso do estabelecimento da correlação entre o número de células e a

absorbância medida diretamente em meio TSB, uma alíquota de 10 mL retirada

do crescimento de 24 horas foi diluída sucessivas vezes em meio estéril, e a

absorbância relativa a cada diluição lida em espectrofotômetro a 600 nm (Ling et

al., 2002). As mesmas diluições foram lidas em Câmara de Neubauer para a

determinação da concentração celular, como se mostra na Figura 3.12 a.

Para a construção da curva de correlação entre a concentração de células

e a absorbância, em amostras suspensas em água destilada, alíquotas de 10 mL

do crescimento de 24 horas foram retiradas, centrifugadas a 1225 xg equivalente

3500 rpm na centrífuga Bio Eng Modelo BE-4000 por 25 minutos e ressuspensas

no mesmo volume de água destilada, como é mostrado no esquema da

Figura 3.12 b. Essa suspensão foi então diluída sucessivas vezes para a

contagem de células em Câmara de Neubauer e para a leitura da absorbância a

410 nm (Foppen, et al., 2005).

Com os dados obtidos foram traçadas curvas, onde se procurou

estabelecer a faixa de correlação linear entre os dois parâmetros, para que as

leituras dos ensaios fossem realizadas dentro desses limites de confiança, onde

a Lei de Beer- lambert é válida.

67

a) b)

Figura 3.12. Esquema da metodologia seguida para a obtenção das

curvas de correlação entre absorbância e a) Suspensão bacteriana em

meio TSB; b) Suspensão bacteriana em água destilada

3.5.2. Curva de crescimento

A curva de crescimento da E. coli ATCC 11229 foi feita com o objetivo de

conhecer a cinética do crescimento da referida bactéria sob as condições

determinadas nessa dissertação. O ensaio consistiu na determinação da

concentração de células para diferentes períodos crescentes de incubação.

Para a obtenção da curva de crescimento, alíquotas de 1,5 mL do pré-

inóculo de 24 horas, foram introduzidas em erlenmeyers de 250 mL contendo

150 mL de TSB estéril. Esse conjunto foi incubado em banho-maria a 25°C, com

agitação constante de 100 rpm pelo período de duração do ensaio. Para cada

ensaio foram feitas triplicatas desses conjuntos.

Imediatamente após o procedimento de inoculação foram, então, retiradas,

de forma asséptica, em fluxo laminar, alíquotas de 5 mL de cada frasco, para

determinar o número de bactérias correspondente ao tempo inicial (To) e,

novamente após diferentes e crescentes períodos de incubação, para a

determinação do crescimento bacteriano ao longo do tempo. Esse crescimento

foi avaliado através da determinação da densidade óptica, lendo-se a

absorbância a 600 nm diretamente no material retirado dos erlenmeyers. Caso a

absorbância lida ultrapassasse a faixa do momento linear, a alíquota era diluída

até que caísse numa faixa de leitura confiável.

68

O ensaio foi realizado em triplicata, sendo preparados simultaneamente

três inóculos e incubados paralelamente por um tempo superior a 24 horas. A

concentração final de células para cada ponto da curva de crescimento é

resultante do valor médio de absorbância dos três valores obtidos.

3.5.3. Ensaio de Sobrevivência

O ensaio de sobrevivência da bactéria E. coli ATCC11229 em água

destilada, foi realizado com o objetivo de estabelecer o tempo que, as células

que seriam introduzidas na coluna de areia, permaneceriam na fase estacionária

e, desta forma garantir que o número de células não experimentaria variações

devido ao crescimento ou decaimento, durante a execução do ensaio ADS.

Consistiu na determinação do número de células viáveis coletadas do final

da fase logarítmica de crescimento, ressuspensas em água destilada, através da

contagem de microrganismos pela técnica de tubos múltiplos, para diferentes

períodos de tempo.

Previamente foi preparado o inóculo, adicionando 1 mL do pré-inóculo em

um erlenmeyer de 250 mL contendo 125 mL de meio TSB estéril, este conjunto

foi incubado em banho maria a 25º C e 100 rpm durante 24 horas. Após

24 horas de incubação foi retirada uma alíquota de 5 mL deste crescimento para

realizar determinação da biomassa através da leitura de absorbância no

espectrofotômetro. Imediatamente o inóculo é transferido para tubos falcon

estéreis, para ser centrifugado a 1225 xg equivalente 3500 rpm por 25 minutos.

Após este tempo o sobrenadante foi descartado, e o precipitado ressuspenso em

120 mL de água destilada em um erlenmeyer de 250 mL. A suspensão assim

preparada foi homogeneizada, para posteriormente iniciar a preparação das

diluições sucessivas, requeridas para efetuar a contagem através da técnica dos

tubos múltiplos, correspondentes ao tempo To. Neste instante também foi

retirada uma alíquota de 5 mL para controle das quantidades de células totais

presentes na ressuspensão.

Uma vez realizadas as diluições sucessivas, para cada diluição

considerada, foram inoculados 3 tubos contendo 10 mL de caldo Fluorocult para

a identificação de E. coli, através da transferência de 1 mL para cada um dos

três tubos contendo o meio específico. Finalmente os tubos são incubados em

banho-maria à temperatura de 36°C. As leituras dos tubos que apresentaram

crescimento são realizadas a 24 e 48 horas. Esta leitura corresponde ao tempo

69

inicial T0. Posteriormente o procedimento foi repetido para diferentes períodos de

tempo.

3.6. Ensaio de Adsorção em Batelada

Este ensaio foi realizado com o objetivo de analisar a participação do

processo de adsorção físico-química na retenção de bactérias E. coli na areia de

quartzo, sob condições de ensaio escolhidas. Os ensaios foram executados de

acordo com o procedimento indicado por Jiang et al., (2007) e modificado para

as concentrações de 106, 107, 108, e 109 cel/mL, conforme descrito a seguir.

A areia foi homogeneizada com auxílio de uma espátula, para que fossem

acrescentados 2 gramas deste material em tubos plásticos cônicos de 50 mL

com tampa de rosca (tubos Falcon), procedendo em seguida à esterilização do

conjunto em autoclave a 121ºC por 1 hora.

A massa de células de E.coli foi obtida a partir do crescimento do inóculo,

durante 24 horas em banho-maria a 25ºC e agitação constante de 100 rpm,

preparado utilizando 1 mL de pré-inóculo em 100 mL de meio TSB. Ao final da

incubação, uma alíquota de aproximadamente 5 mL era retirada assepticamente,

para leitura da absorbância a 600 nm e posterior correlação entre Absorbância e

Número de células, para a determinação dos volumes e das diluições da cultura

bacteriana a serem utilizados para a obtenção do número de células necessário

para cada concentração celular testada. Esse volume de suspensão bacteriana

era distribuído em tubos falcon estéreis, centrifugação, por 25 minutos a 1225 xg

equivalente 3500 rpm e ressuspenso em água destilada estéril.

Em seguida, 20 mL da ressuspensão bacteriana, preparada na

concentração desejada, foram adicionados aos tubos falcon com os 2 g de areia

estéril. Esse conjunto foi homogeneizado vigorosamente em um vortex durante

10 segundos e incubado a temperatura ambiente em agitação constante de

100 rpm durante uma hora. Após este período, os tubos foram centrifugados por

30 segundos a 120 xg equivalentes a 1100 rpm na centrífuga Bio Eng Modelo

BE-4000. Após a centrifugação, foram retirados 10 mL do sobrenadante e

colocados em outro tubo falcon de 50 mL vazio e estéril. A concentração de

células neste sobrenadante foi determinada através de diluição serial para a

contagem em placa com a técnica de derramamento em profundidade, conforme

descrito no item 3.3.2.4. Este ensaio foi realizado em duplicata para cada

concentração. A Figura 3.13 mostra a aparência das placas de Petri após o

70

crescimento das colônias (UFC) de E. coli em meio sólido TSA para duas

diluições diferentes.

Figura 3.13. Crescimento das colônias de E. coli no ensaio de adsorção

para diferentes concentrações iniciais

O coeficiente de partição KD (mL/g) ou coeficiente de distribuição é um

valor relativo que representa a razão entre o número de bactérias aderidas à

superfície da fase sólida Cs (UFC/g) e o número de bactérias que permanece em

suspensão Cw. (UFC m/L), calculado segundo a seguinte equação:

w

sD

C

CK (3.4)

A concentração de células na fase sólida, a concentração de células em

suspensão, e a porcentagem de adsorção Pa, são dadas pelas seguintes

equações:

W

NNC st

s

(3.5)

V

NC s

w (3.6)

100

N

NNP

t

sta

(3.7)

onde Nt é o número total de bactérias adicionadas ao solo (UFC), Ns o número

total de bactérias no sobrenadante (UFC), W a massa do solo utilizada (g) e V o

volume de fluido na mistura (mL).

3.7. Ensaio Advecção-Dispersão-Sorção (ADS)

O objetivo dos ensaios ADS foi avaliar os processos de transporte da

bactéria E.coli em areia saturada, através da obtenção da curva de chegada

71

(Breakthrough curve) para diferentes velocidades de fluxo. Os ensaios foram

executados no equipamento projetado neste estudo (Figura 3.14),

exclusivamente com esta finalidade e cujas características foram descritas no

item 3.4.

Figura 3.14. Foto do equipamento utilizado no ensaio ADS

O procedimento do ensaio é semelhante ao ensaio de permeabilidade de

solos granulares à carga constante, porém com percolação contínua da

suspensão bacteriana em água destilada, numa concentração inicial conhecida.

Na medida em que a solução permeia através do solo (areia de quartzo), o

efluente é coletado e determinado o valor da concentração celular. O grande

diferencial deste ensaio com outro de transporte de contaminantes, reside nos

cuidados específicos que exige a manipulação da bactéria, devendo se cumprir

um protocolo de esterilização antes de cada ensaio e prever qualquer tipo de

contaminação externa durante o ensaio. A areia e a água destilada e

componentes da coluna tais como, mangueiras, discos perfurados, malha de

aço, tubo de polipropileno foram esterilizados com antecedência a cada ensaio,

assim como toda a vidraria e materiais a serem utilizados.

Basicamente cada ensaio foi dividido em duas etapas: saturação da areia

e injeção contínua da suspensão bacteriana, cada uma destas descritas a

seguir.

72

3.7.1. Saturação da areia

O procedimento inclui a montagem do equipamento e conformação da

coluna de areia.

Inicialmente o interior do frasco de Mariotte foi esterilizado utilizando uma

solução de acetona, preparado assim para verter imediatamente após este

tratamento, 3,5 litros de água destilada já estéril, reservada para a saturação da

areia. Em seguida a tampa era colocada, e ajustados os parafusos para seu

fechamento hermético, introduzindo finalmente o tubo de polipropileno.

Posteriormente a base da coluna também foi esterilizada com acetona,

mantendo fechada a válvula da base da coluna e colocados o disco perfurado, a

malha de aço, e o cilindro de teflon. Em seguida a mangueira de silicone era

conectada na válvula de saída do Mariotte. Abrindo-se esta válvula deixava-se

fluir a água destilada até que toda a mangueira estivesse preenchida e sem a

presença de bolhas de ar, para finalmente ligar a mangueira à base da coluna. A

partir daqui inicia-se o processo de conformação da coluna de areia.

A areia já esterilizada e previamente seca na estufa a 105°C e passada

pela malha #150, foi vertida dentro da coluna em 4 camadas de

aproximadamente 300 g (5 cm) com ajuda de um Becker e um funil de vidro.

Antes de colocar a primeira camada de areia deixou-se fluir um volume de água

equivalente ao volume de poros necessários para preencher os poros da areia

desta primeira camada, considerando o volume adicional que é mantido na base

da coluna. Para as camadas subsequentes, antes de colocar a camada de areia

correspondente, água estéril foi adicionada aos poucos, com o auxílio de uma

proveta graduada de 100 mL. Entre camada e camada foram aplicadas 25

batidas laterais na coluna. Esta prática minimizou a formação de regiões

heterogêneas no empacotamento da coluna.

Concluída a conformação da coluna de areia, o topo da coluna era

nivelado utilizando uma barra metálica apoiada nas bordas do cilindro, para a

imediata colocação da malha de aço, disco metálico perfurado e a tampa

superior da coluna. As fotografias da Figura 3.15 mostram a coluna antes de

colocar a tampa superior. Finalmente eram ajustados os parafusos para o

fechamento hermético da coluna, e a partir de aqui, iniciava-se a saturação da

areia, através da passagem contínua de aproximadamente 4 volume de poros de

água destilada, com a aplicação de uma carga hidráulica constante, determinada

pela posição do tubo de polipropileno no interior do Mariotte.

73

Figura 3.15. Vista superior e lateral da coluna após do processo de

conformação da coluna de areia

Concluída a saturação eram medidos o pH e a condutividade elétrica da

água. E antes de dar inicio ao ensaio ADS propriamente, a válvula superior e

inferior da coluna eram fechadas até efetuar a conexão da mangueira que

permitirá a injeção da suspensão bacteriana.

3.7.2. Injeção contínua da suspensão de E. coli

Paralelamente à etapa de saturação foi preparada a suspensão de E. coli a

ser injetada na coluna, com o objetivo de obter uma concentração da suspensão

em torno de 1 x 108 cel/mL. Esta foi considerada a concentração inicial de

células injetadas para cada ensaio. Para isto, primeiro foi preparado o inóculo

bacteriano de E. coli mediante a inoculação de 5 mL do pré-inóculo em 500 mL

de meio TSB, sendo o conjunto incubado em agitação constante de 100 rpm e

temperatura aproximada de 25°C. A quantidade de inóculo preparado foi

determinada com base no número de células crescidas até 24 horas de

incubação e em função da quantidade de células necessárias para obter a

concentração inicial desejada (1 x 108 cel/mL). A foto da Figura 3.16 mostra o

inóculo sendo incubado no banho Maria e a turvação do meio, relativa ao

crescimento no final do tempo de incubação. A determinação da concentração

de bactérias no inóculo foi feita através da medida de densidade óptica e

posterior correlação na curva de calibração.

74

Figura 3.16. Crescimento do inóculo de E. coli em 500 mL de meio de

cultura TSB

Após o crescimento, o inóculo foi distribuído uniformemente em tubos

falcon estéreis de 50 mL de capacidade, para serem centrifugados, sob

condições assépticas, a 1225 xg equivalente 3500 rpm por 25 minutos. Através

desse processo as células são precipitadas no fundo do tubo e desse modo a

suspensão separada em material precipitado e o sobrenadante. Após a

centrifugação o sobrenadante era descartado assepticamente em algum

recipiente dentro da capela de fluxo laminar. Em seguida as células precipitadas

eram ressuspensas com auxílio de um agitador mecânico (vortex), adicionando-

se 1 ou 2 mL de água destilada estéril. Após a total ressuspensão do

precipitado, era acrescentada água destilada para completar um volume de 500

mL de suspensão bacteriana.

Todos os 500 mL da suspensão bacteriana eram colocados no interior do

Frasco de Mariotte, previamente desinfetado com uma solução de acetona e

com o bastão magnético no interior. Imediatamente depois era adicionada água

estéril até completar os 4 litros de suspensão de E. coli. O reservatório então era

fechado e a altura do tubo regulada em função do gradiente a ser imposto, de

acordo com cada ensaio. A partir deste momento era ligado o agitador

magnético para a homogeneização contínua dos 4 litros de suspensão

bacteriana a ser injetada na coluna de areia.

Antes do início da injeção da suspensão bacteriana, porém, e

encontrando-se a coluna já saturada, todas as válvulas eram fechadas para

proceder-se à troca da mangueira utilizada para a saturação da coluna, por outra

que conduzia a suspensão de bactérias do Mariotte até a base da coluna. Da

mesma forma que durante a etapa de saturação a mangueira era colocada de

forma a evitar a formação de bolhas de ar. A partir de aqui o equipamento estava

75

preparado para iniciar a passagem contínua da suspensão de E. coli através da

coluna de areia. A injeção da suspensão bacteriana foi efetuada de forma

contínua, passando entre 12 e 14 volume de poros, variando de acordo com

cada ensaio. A duração de cada ensaio foi determinada pela forma da curva de

chegada (Breakthrough curve) quando a concentração normalizada (C/Co)

tornava-se constante.

O fluxo foi medido frequentemente durante todo o ensaio

(aproximadamente a cada 10 minutos), com o objetivo de controlar o volume de

saída do efluente da coluna e de forma simultânea observar o comportamento da

condutividade hidráulica durante a injeção da suspensão bacteriana. Para tal,

utilizou-se uma proveta graduada e um cronômetro, sendo calculado o valor da

vazão (Q) através da relação Volume/ Tempo. Posteriormente, com o valor do

gradiente hidráulico constante ao longo da execução do ensaio e através da Lei

de Darcy, foram calculados os valores de velocidade de Darcy (vd) e

condutividade hidráulica (KS).

Durante todo o ensaio o agitador magnético se manteve em contínuo

funcionamento e na mesma velocidade de agitação, isto com a finalidade de

causar o mínimo de interferências no fluxo de saída.

A coleta de amostras foi realizada em provetas de vidro graduadas, de

25 mL, previamente esterilizadas. O volume coletado foi de 15 mL a intervalos

de 15 ou 30 minutos variando em função do gradiente imposto. Para a

determinação da concentração do efluente, foi medida a absorbância no

espectrofotômetro, durante cada intervalo de amostragem. Uma vez lida a

absorbância as amostras foram mantidas na geladeira para a um posterior

controle através da contagem na câmara de Neubauer seguindo o procedimento

detalhado no item 3.3.2.1.

É importante salientar que foi realizado um controle da concentração do

influente da coluna, extraindo para isso, com uma seringa, uma alíquota da

mangueira no setor de saída do Mariotte e lida a absorbância para posterior

correlação na curva de calibração. Esse controle foi feito em decorrência que é

assumido que o valor da concentração inicial é mantido constante durante a

totalidade do ensaio.

Para a determinação da densidade seca total do solo (ρBulk) uma vez

desmontada a coluna, a areia foi esterilizada e depois seca na estufa a 105°C,

para a obtenção do peso seco. Sendo conhecido o volume ocupado pela areia, o

valor da densidade seca total foi calculado dividindo o peso da areia seca entre o

volume da coluna.

76

3.7.3. Obtenção das curvas de chegada

Como foi explicado na revisão bibliográfica, o transporte de biocolóides

através de um meio poroso saturado é representado matematicamente através

da equação (2.5). A solução analítica desta equação, proposta por Ogata e

Banks (1961), citada em Azevedo et al. (2002), é apresentada a seguir:

tRD2

vtRLerfc

D

vLexp

tRD2

vtRLerfc

2

1

C

C

hhho

(3.8)

onde L é o comprimento da coluna de solo, erfc é a função de erro

complementar, R o fator de retardamento, Dh a dispersão hidrodinâmica, t o

tempo e v a velocidade intersticial.

A representação gráfica da equação de transporte ADS equação (2.5) é

denominada curva de chegada ou curva de transporte (Breakthrough curve), a

forma da curva e mostrada na Figura 3.17.

a) b)

Figura 3.17. Linha continua - Forma da curva de chegada sem

retardamento nem decaimento; Linha tracejada - a) Forma da curva de

chegada com retardamento b) Forma da curva de chegada com

decaimento

O valor de retardamento pode ser obtido da curva de transporte,

assumido como igual ao valor de volume de poro PV, correspondente à

concentração relativa (C/Co) igual a 0,5 na curva de chegada. Esta suposição foi

definida a partir da solução analítica apresentada na equação (3.8), na qual se

negligencia o segundo termo do lado direito da equação e substituindo alguns

termos da mesma, tem-se, segundo explicação matemática mostrada por

Azevedo et al. (2002):

77

2

1

o RT4

PTRerfc

2

1

C

C (3.9)

onde T é igual a v·t/L e P é igual a v·L/Dh. Tomando T=R na equação (3.9), o

argumento da função de erro complementar toma-se nulo e a função é, então,

igualada à unidade. Assim tem-se a concentração relativa igual a 0,5. Na

determinação do coeficiente de dispersão hidrodinâmica, para o ponto de

concentração relativa de 0,5 é traçada uma tangente a este ponto. Com isto é

possível estabelecer o valor de b, como dado por Azevedo et al. (2002):

h

x

RT

o

RD4

Lvb

dT

CCd

)/( (3.10)

A equação acima mostra que a representação matemática do lado

esquerdo da equação nada mais é do que uma derivada, obtida a partir da

equação (3.9). Observa-se, portanto, que o valor de b é a tangente tomada na

curva de chegada na concentração relativa de 0,5. Com o valor b é possível, a

partir da igualdade mostrada na equação (3.10), obter o coeficiente de dispersão

hidrodinâmica, dado por:

22

xh

bR4

LvD

(3.11)

3.8. Ensaios de controle

No final dos ensaios ADS observou-se a necessidade de realizar alguns

controles com uma forma de verificar os procedimentos realizados e auxiliar na

posterior análise dos resultados.

Foi realizado o controle da concentração de ingresso da suspensão

durante os últimos ensaios ADS, aproximadamente na metade e no final do

ensaio, através da retirada de alíquotas de aproximadamente 5 mL, com a

utilização de uma seringa, para a posterior determinação da concentração inicial

mediante a medida da densidade óptica e posterior correlação entre absorbância

e número de células.

Um segundo controle foi realizado, imediatamente após a finalização do

ensaio ADS, que consistiu na determinação da concentração de bactérias retidas

na areia e a distribuição granulométrica dos grãos de areia, ao longo da coluna.

78

Para isto, foram determinados três pontos de amostragem, na base, na metade e

no topo da coluna (este controle foi realizado para o ensaio ADS 1).

Para a retirada das amostras de forma asséptica, a coluna foi levada para

a capela de fluxo laminar, onde foi cuidadosamente desmontada. Uma vez

retirada a tampa superior, foram coletadas as amostras de areia do topo da

coluna, em torno de 1 grama para a determinação da concentração de bactérias

e aproximadamente 100 gramas para a análise granulométrica. A seguir foi

colocada uma tampa de encaixe perfeito no interior da coluna, ocupando o

espaço deixado pela areia que foi retirada, e assim, a coluna foi virada para a

obtenção das amostras correspondentes à base, e por último à metade da

coluna, da mesma maneira como foi feito no topo da coluna. Imediatamente

depois foram realizadas as diluições sucessivas requeridas para a aplicação da

técnica dos Tubos múltiplos e para determinar as concentrações da bactéria na

areia. Posteriormente, foi obtida a curva granulométrica mediante peneiramento

para cada ponto de amostragem através do procedimento padronizado pela

Norma Brasileira ABNT/NBR 7181/84.

Finalmente, uma vez concluídos todos os ensaios programados, foi

realizado um último ensaio, que permitiu determinar o diâmetro médio dos poros

da coluna de areia. Dessa forma, foram montadas quatro colunas de areia com

densidade seca média de 1,74 g/cm3, em cilindros de acrílico de dimensões de

aproximadamente 6 cm de diâmetro interno e 9 cm de comprimento. Os cilindros

foram colocados dentro de uma bandeja, cada um deles disposto sobre uma

pedra porosa e papel filtro situado na base do cilindro de areia.

No inicio do ensaio, a bandeja foi preenchida com água de forma que a

pedra porosa fosse totalmente coberta para a água começar a ascender nas

colunas, por capilaridade. Depois de observada a estabilização foi medida a

altura de capilaridade hc. Considerando a média dessa altura foi calculado o

diâmetro médio dm de poro conforme a equação seguinte:

ghd

c

m

(3.12)

onde, δ é a tensão superficial da água 0,0728 N/m a 20°C (valor extraído de

Myers, 1999), e g a aceleração da gravidade (9,81 m/s2).

4 APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS

4.1. Ensaios Microbiológicos

4.1.1. Curvas de correlação entre absorbância e número de células

Como primeiro passo para a obtenção dos resultados, foram traçadas as

curvas de correlação entre absorbância e número de células. As equações de

correlação são de fundamental importância para a determinação das

concentrações de ingresso e saída de bactérias introduzidas nas colunas para o

ensaio ADS.

As curvas foram feitas em duplicata para água e para meio de cultura TSB

(Figura 4.1.). Através dos resultados obtidos foi possível definir as diluições que

deveriam ser usadas para a obtenção dos pontos da curva no setor em que a Lei

de Beer Lambert é válida.

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

2,00

Ab

so

rbâ

nc

ia [

A]

Concentração [N° cel/ml]

Duplicata 1

Duplicata 2

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

2,00

Ab

so

rbâ

nc

ia [

A]

Concentração [N° cel/ml]

a) b)

Figura 4.1. Curvas de correlação entre Número de Células e Absorbância

(a) para meio TSB; (b) para água destilada

80

A seguir, as Figuras 4.2 e 4.3 mostram as curvas de ajuste linear para as

correlações Absorbância versus Número de células, respectivamente para; a

leitura de absorbância das diferentes diluições da suspensão celular em meio

TSB a 600 nm e para a leitura da absorbância do mesmo material em água a

410 nm.

y = 3E-09x + 0,019R² = 0,996

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0,00E+00 5,00E+07 1,00E+08 1,50E+08 2,00E+08 2,50E+08 3,00E+08 3,50E+08 4,00E+08

Ab

so

rbâ

nc

ia [

A]

Concentração [N° cel/ml]

Meio de Cultura TSB Lineal (Meio de Cultura TSB)

Figura 4.2. Curva de Correlação para células suspendidas em meio de

cultura TSB

y = 4E-09x + 0,017R² = 0,998

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,0E+00 2,0E+07 4,0E+07 6,0E+07 8,0E+07 1,0E+08 1,2E+08 1,4E+08 1,6E+08 1,8E+08

Ab

so

rbâ

nc

ia [

A]

Concentração [N° cel/ml]

Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3 Ensaio 4 Ensaio 5

Figura 4.3. Curva de Correlação para células suspendidas em água

destilada

81

Foram realizados de 2 a 5 ensaios para cada condição e após o ajuste da

curva, obtidos os coeficientes de correlação, R=0,996 para a leitura da

suspensão bacteriana em meio TSB e de R= 0,998 para a leitura da suspensão

bacteriana em água.

No caso da suspensão de células bacterianas em água destilada, foram

realizados 5 ensaios, para uma ampla gama de diluições dentro do ramo inicial

da curva apresentada no gráfico da Figura 4.1.b. Foi calculada a média dos

resultados obtidos e ajustados os pontos a uma curva linear neste caso a faixa

de validez da equação de ajuste, está definido entre 0 e 0,6.

Obtidas assim as equações de regressão e todas as condições

permanecendo constantes é suficiente ler a absorbância da suspensão e

calcular, usando essas equações, a concentração de células.

Para Meio de Cultura TSB 91076942

01930

ml

celNC

,

,aAbsorbânci

Para Água Destilada 91012654

01720

ml

celNC

,

,aAbsorbânci

4.1.2. Curva de Crescimento Escherichia coli em meio TSB

As curvas de crescimento obtidas para os ensaios realizados são

apresentadas no gráfico da Figura 4.4. São observados, para ambas as curvas,

limites de tempo coincidentes entre as fases de crescimento lag, exponencial e

estacionária.

Observa-se, no gráfico apresentado, o fim da fase logarítmica em

aproximadamente 24 horas após o início da incubação, seguida da fase

estacionária. O fim da fase logarítmica foi escolhido para ser usado como tempo

de incubação porque nesta fase o número de células que se dividem equivale a

quantidade de células que morrem, mantendo assim, o número de células

estável durante o tempo no qual os ensaios irão transcorrer. O número de

bactérias determinado após este período mostrou-se também constante, tanto

para estes, como para os ensaios seguintes, na ordem de 109 cel/mL, sendo

possível, após centrifugar as células obtidas do crescimento do inóculo,

ressuspendê-las no mesmo volume ou em volume maior, obtendo concentrações

iniciais para introduzir na coluna com células nas mesmas condições numéricas

para todos os ensaios ADS (entre 1,0 x 108 até 1,79 x 108 cel/mL). Este tempo

82

de incubação foi o mesmo utilizado por Foppen et al. (2005) para a obtenção de

aproximadamente 109 cel/mL de Escherichia coli ATCC25922.

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75

Ab

so

rvâ

nc

ia (A

)

Tempo (h)

Ensaio 1 Ensaio 2

Figura 4.4. Curvas de crescimento da Escherichia coli ATCC 11229

4.1.3. Avaliação da sobrevivência de E. coli em água

Esses ensaios foram realizados com o objetivo de avaliar a constância

numérica da população bacteriana presente na suspensão que iria ser

introduzida na coluna, durante os ensaios ADS.

Os Resultados apresentados na Tabela 4.1 indicam que o número de

células viáveis se manteve constante até o último período de tempo analisado

(35 horas), superior ao tempo de duração dos ensaios que tiveram até, no

máximo, aproximadamente 12 horas de duração. Este resultado garantiu que o

número de células da bactéria E. coli ATCC11229 suspensas em água destilada,

não sofreria variações no tempo, sendo desprezado o efeito do crescimento e de

morte dos microrganismos durante a execução dos ensaios de batelada e

principalmente nos ensaios ADS.

Fase lag

Fase log

Fase Estacionaria

83

Tabela 4.1. Cálculo da concentração de células viáveis suspensas em

água destilada pela Técnica dos Tubos Múltiplos

Tempo NMP/mL

* 9,59E+08

2 2,40E+08

11 2,40E+08

25 2,40E+08

35 2,40E+08

Tempo de incubação 24 horas

* Concentração inicial determinada através de leitura de densidade óptica (Número de

células Totais.

4.2. Ensaio de Adsorção em Batelada

Os ensaios de adsorção foram executados sob condições de temperatura

entre 22 e 24°C; pH neutro; e baixa força iônica, entre 10 e 20 µS/cm.

Os resultados finais, dos ensaios de adsorção da E. coli ATCC11229 em

areia de quartzo limpa, obtidos para cada concentração (109, 108, 107 e 106)

encontram-se resumidos na Tabela 4.2. Os dados determinados no laboratório

se encontram dispostos no Apêndice A.

Tabela 4.2. Resultados obtidos através da técnica de contagem em placa

Co Nt Ns Pa Cs Cw

UFC/mL UFC UFC % cel/g cel/mL

3,08E+09 6,15E+10 1,35E+10 78,0 2,40E+10 6,77E+08

3,91E+08 3,91E+08 3,91E+08 31,9 1,25E+09 2,66E+08

2,34E+07 4,68E+08 3,37E+08 25,2 6,56E+07 1,68E+07

2,13E+06 4,26E+07 3,81E+07 10,6 2,26E+06 1,90E+06

Co :concentração Inicial da suspensão bacteriana; Nt :número total de células na suspensão

bacteriana; Ns: número total de células no sobrenadante; Pa :percentagem de adsorção;

Cs:concentração de células sorvidas no solo; Cw:concentração de células na solução.

Os dados obtidos para as concentrações de células da bactéria no solo e

no sobrenadante, Cs e Cw respectivamente, foram plotados em um gráfico de

escala logarítmica dupla (Figura 4.5) e, ajustados à isoterma de Freundlich

(Cs=K Cw m) para a determinação do potencial máximo de sorção da bactéria na

areia de quartzo limpa.

84

y = 0,001x1,465

R² = 0,972

1,00E+03

1,00E+06

1,00E+09

1,00E+12

1,00E+05 1,00E+07 1,00E+09

Cs

[c

el/g

]

Cw [cel/mL]

Figura 4.5. Isoterma de adsorção da E. coli em areia de quartzo

A partir da equação de ajuste são obtidos os parâmetros KD=0,001 mL/g e

m=1,465, com um coeficiente de determinação r2=0,972. O valor do expoente

reflete a forma da curva, e neste caso, mostra que a relação entre Cs e Cw não foi

completamente linear. O valor de KD reflete o alcance da sorção, assim

KD= 0,001 mL/g significa que de cada célula que ficou adsorvida na areia, 1000

se mantiveram no sobrenadante, mostrando uma baixa adesão da bactéria a

este solo.

Jiang et al. (2007), estudaram a adsorção das células da bactéria E. coli

(strain D) suspensas em água deionizada em areia de sílica fina e grossa

separadamente, e obtiveram valores de KD de 10 e 0,01 mL/g respectivamente,

apontando uma diferença de até 3 ordens de grandeza entre ambos os valores.

No caso deste estudo foi obtido um valor de KD de uma ordem de grandeza

menor que o valor obtido por Jiang et al. (2007) para areia grossa. Esta diferença

pode ser atribuída à pequena massa de 2 gramas utilizada nos ensaios de

batelada, além de se tratar com uma areia de quartzo bem graduada.

Observa-se que a percentagem de adsorção se incrementa na medida em

que se aumenta a concentração inicial da suspensão bacteriana (Tabela 4.2)

mostrando a dependência da adsorção com relação à concentração da

suspensão, ainda utilizando areia de quartzo da mesma distribuição

granulométrica para todos os casos.

85

O valor do coeficiente de distribuição KD próximo a zero obtido a partir do

ajuste, indica que a adesão das bactérias na areia de quartzo é nula, o que é de

se esperar devido à carga elétrica negativa da E. coli e da areia de quartzo,

criando uma força eletrostática repulsiva. A utilização de água destilada como

solução, contribui a criar condições desfavoráveis para a adesão em decorrência

de sua baixa força iônica. Isto sugere que a presença de qualquer oxido na areia

de quartzo tem efeito desprezível na deposição de bactérias, que poderia ter

sido originado pelo processo de peneiramento mecânico (Brown et al., 2002).

Em função destes resultados também se desprezam os efeitos de

bloqueamento (blocking), já que este processo está presente em um sistema

onde tanto o colóide quanto o meio poroso estão opostamente carregados

(Deshpande e Shonnard,1999).

4.3. Ensaio ADS

Foram conduzidos 8 ensaios ADS, um de cada vez, devido ás exigências

do procedimento do ensaio. Todos os ensaios foram executados sob condições

de fluxo em regime permanente e na temperatura ambiente entre 22 e 24°C, pH

e força iônica similares às condições de execução dos ensaios de batelada. Na

Tabela 4.3 são apresentadas as condições hidráulicas do sistema durante a

etapa de saturação.

Tabela 4.3. Condições hidráulicas durante a saturação da areia

ENSAIO i Q K vd pV pH EC ml/min cm/d cm/d μS/cm

1 0,09 4,70 2,89E-02 213,48 4,0 7,3 9,8

2 0,09 3,26 2,01E-02 148,24 3,0 6,5 18,1

3 0,09 3,62 2,23E-02 164,47 4,6 _ _

4 0,09 4,70 2,89E-02 213,48 4,2 6,7 9,0

5 0,09 5,46 3,36E-02 248,14 4,0 6,8 8,4

6 0,10 5,02 2,76E-02 228,05 4,4 7,0 11,4

7 0,09 4,29 2,64E-02 194,88 5,8 7,1 12,5

8 0,09 3,09 1,90E-02 140,50 4,9 6,9 11,4 i: gradiente hidráulico; Q: vazão; Ks: condutividade hidráulica saturada; vd :velocidade de Darcy; PV: volume de

poro; EC: condutividade elétrica.

A saturação da areia foi realizada aplicando o mesmo gradiente hidráulico

de 0,09, considerando-se esse valor baixo suficiente para uma boa saturação da

areia e alto o suficiente para permitir a passagem de 3 a 4 volume de poros em

um tempo apropriado para proceder à preparação da seguinte etapa do ensaio.

86

Na Tabela 4.3 também são apresentados os valores de pH e condutividade

elétrica da água destilada medida no final da etapa de saturação, e considerados

os valores iniciais na etapa de injeção da suspensão bacteriana.

No ensaio ADS 1 o gradiente hidráulico imposto foi o mínimo possível

devido às baixas velocidades que apresenta um aquífero natural (<1m/d). Assim,

nos ensaios ADS posteriores o gradiente foi sendo incrementado, sendo

realizados os ensaios ADS dentro de uma faixa de gradiente hidráulico de 0,03

até 0,36.

A Tabela 4.4 apresenta os valores de gradiente definidos para cada ensaio

e os valores médios de vazão de saída do efluente (Q), da velocidade de Darcy

(vd) e da condutividade hidráulica saturada (Ks), embora os valores de

condutividade hidráulica não tenham se mantido constantes, particularmente

para gradientes maiores que 0,24. Também são apresentados os valores de

densidade seca (ρbulk), determinada no final dos ensaios e com base a este valor

calculados os valores de porosidade (n) e velocidade intersticial (v). A variação

da condutividade hidráulica é analisada no item 4.3.2.

Tabela 4.4. Condições hidráulicas do sistema experimental durante a

injeção da suspensão de E. coli

ENSAIO Co i *vd *KS *Q ρbulk n v

cel/mL cm/d cm/s mL/min g/cm3 cm/d

1 1,07E+08 0,03 70,17 2,66E-02 1,54 1,89 0,28 247,36

2 1,65E+08 0,06 205,57 3,93E-02 4,52 1,86 0,29 698,46

3 1,55E+08 0,06 179,05 3,43E-02 3,94 1,86 0,30 604,93

4 1,79E+08 0,06 174,01 3,33E-02 3,83 1,86 0,29 592,55

5 1,63E+08 0,16 374,39 2,79E-02 8,23 1,87 0,29 1280,91

6 1,40E+08 0,24 544,06 2,67E-02 11,97 1,87 0,29 1861,41

7 1,31E+08 0,24 411,13 2,02E-02 9,04 1,89 0,28 1442,92

8 1,31E+08 0,36 681,32 2,19E-02 14,98 1,90 0,28 2446,46 * Valor médio para cada ensaio

4.3.1. Curvas de chegada

As curvas de chegada para E. coli construídas para 8 ensaios ADS com

injeção continua são discutidos nesta seção. As Tabelas de amostragem,

controle de saída de volume de poros e determinação do número de

microrganismos são apresentados no Apêndice C1.

87

Na Figura 4.6, são plotadas as curvas de chegada de células de E. coli,

para cada ensaio, junto com os pontos de controle medidos com a técnica de

contagem em câmara de Neubauer. Observa-se a proximidade dos pontos

determinados em CNB com os pontos definidos através das leituras de

absorbância, o que é de se esperar em virtude dos valores de absorbância

medidos estiver entre 0,002 até 0,707, ou seja, dentro da faixa de validade da

equação de correlação.

A curva de transporte caracteriza-se por apresentar forma de uma

sigmóide, esta configuração é observada apenas nas curvas correspondentes a

baixos gradientes hidráulicos isto é para 0,03, 0,06 até 0,16. Para gradientes

maiores, a curva e mais parecida com uma função quadrática.

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

0 2 4 6 8 10 12 14 16

C/C

o

volume de poro

Ensaio 1 (i=0,03) Contagem em CNB

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

0 2 4 6 8 10 12 14 16

C/C

o

volume de poro

Ensaio 2 (i=0,06) Contagem em CNB

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

0 2 4 6 8 10 12 14 16

C/C

o

volume de poro

Ensaio 3 (i=0,06) Contagem em CNB

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

0 2 4 6 8 10 12 14 16

C/C

o

volume de poro

Ensaio 4 (i=0,06) Contagem em CNB

88

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

0 2 4 6 8 10 12 14 16

C/C

o

volume de poro

Ensaio 5 (i=0,16) Contagem em CNB

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

0 2 4 6 8 10 12 14 16

C/C

o

volume de poro

Ensaio 6 (i=0,24) Contagem na CNB

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

0 2 4 6 8 10 12 14 16

C/C

o

volume de poro

Ensaio 7 (i=0,24) Contagem em CNB

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

0 2 4 6 8 10 12 14 16

C/C

o

volume de poro

Ensaio 8 (i=0,36) Contagem em CNB

Figura 4.6. Curvas de chegada para cada ensaio ADS

Pode-se observar uma estabilização da concentração do efluente antes da

curva superar o valor de C/Co igual à unidade, para as curvas que apresentam o

formato de uma sigmóide. A formação deste patamar sugere a capacidade de

atenuação de E. coli pela areia de quartzo. Porém observa-se também nos

ensaios 1 e 3, uma tendência ao desprendimento das células que puderam ficar

retidas na medida que o fluxo continua.

No entanto, a determinação de C/Co no patamar da curva permite calcular

a eficiência real do coletor único (η) através da equação (2.27), valor

adimensional que representa as oportunidades que o biocolóide tem para colidir

com os grãos de areia. O valor teórico da eficiência do coletor calculada através

da equação (2.22) comparado com o valor real ou experimental determina a

eficiência da adesão (α).

89

Neste caso, o patamar claramente definido só foi atingido na curva que

corresponde ao ensaio 4, sendo o valor de C/Co igual a 0,9 aproximadamente.

Nesse caso o valor da eficiência de colisão (α) é de 0,05, o que é de se esperar

devido a que o ensaio foi realizado sob condições desfavoráveis (presença da

barreira de energia repulsiva) e que ainda mais reforça o resultado obtido no

ensaio de adsorção exposto no item 4.2.

A curva correspondente ao menor gradiente (i=0,03) mostra um patamar

temporário para o valor de C/Co igual a 0,5. A formação deste patamar parece

estar relacionada com a baixa velocidade do ensaio, contrário da análise

apresentada por Foppen et al. (2005), que sugeriram que o patamar não é

afetado pelas variações da taxa de fluxo e sim pela concentração inicial, sendo

que neste estudo a concentração inicial foi mantida constante. Mas também, de

acordo com Foppen et al. (2005), a formação do patamar na curva de chegada

pode ser atribuída à presença de poros pequenos demais para a passagem da

bactéria através de eles, o que pode ter influenciado nos resultados do presente

estudo.

Esse processo conhecido como filtração mecânica, pressupõe que o

volume destinado à retenção de partículas (bactérias) é fixo para um

determinado meio poroso devido a sua dependência com a geometria do grão e

da bactéria. A determinação da quantidade de bactérias que o meio poroso é

capaz de reter pode ser expressa pelo valor do volume de bactérias retidas por

unidade de volume de meio poroso (σ) e os cálculos, a análise e a possível

explicação para o comportamento das curvas de chegada, com base ao

processo associado, são discutidas no item 4.4.2.

4.3.2. Fator de Retardamento e Dispersão Hidrodinâmica

Os indicadores de transporte: retardamento (R) e dispersão hidrodinâmica

(Dh) foram determinados para cada ensaio conforme o método indicado em

Azevedo et al. (2002).

Esse método permite obter, de forma gráfica e direta, o valor do

retardamento a partir das curvas de chegada, como também calcular o valor da

dispersão hidrodinâmica através da determinação gráfica do parâmetro b. Os

gráficos mostrando a aplicação do método descrito em Azevedo et al. (2002),

são apresentados no Apêndice B2.

90

A Tabela 4.5 resume os valores de R e b medidos graficamente e o valor

calculado de (Dh) com base nesses valores.

Tabela 4.5. Parâmetros de transporte: Retardamento e Dispersão

hidrodinâmica

Ensaio i Co vd v R b Dh Pe cel/mL cm/d cm/d cm2/min

1 0,03 1,07E+08 70,17 247,36 3,3 1,2 1,74E-02 197,1

2 0,06 1,65E+08 205,57 698,46 4,1 1,5 2,04E-02 475,3

3 0,06 1,55E+08 179,05 604,93 4,0 1,6 1,63E-02 514,7

4 0,06 1,79E+08 174,01 592,55 4,5 1,5 1,44E-02 572,6

5 0,16 1,63E+08 374,39 1280,91 4,9 1,1 4,87E-02 365,1

6 0,24 1,31E+08 411,13 1442,92 6,0 0,9 5,47E-02 366,4

7 0,24 1,40E+08 544,06 1861,41 7,4 2,0 9,39E-03 2752,5

8 0,36 1,31E+08 681,32 2446,46 9,0 3,5 2,73E-03 12469,0 i: gradiente hidráulico; Co :concentração Inicial da suspensão bacteriana; vd :velocidade de Darcy; v: velocidade

intersticial; R: retardamento; b :parâmetro da curva de chegada obtido de forma gráfica; Dh: Dispersão

hidrodinâmica; Pe: número de Peclet.

Na Figura 4.7 pode-se observar claramente o comportamento das curvas

de chegada em função da variação do gradiente hidráulico, considerando que,

no caso do gradiente hidráulico igual a 0,06, a curva é o resultado da média dos

valores de C/Co dos ensaios 2, 3 e 4 e para o gradiente hidráulico 0,24, o

resultado da média dos valores de C/Co para os ensaios 6 e 7.

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

1,10

1,20

1,30

1,40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

C/C

o

volume de poro

i=0,03 Média i=0,06 i=0,16 Média i=0,24 i=0,36

Figura 4.7. Curvas de chegada para diferentes gradientes hidráulicos

91

Observa-se que todas as curvas atingem a metade da concentração inicial,

(C/Co=0,5) para valores de volume de poro maiores do que a unidade, ou seja,

todas as curvas de chegada apresentam retardamento. Este incremento do fator

de retardamento com relação ao gradiente imposto apresenta um

comportamento linear contrário ao comportamento esperado para um problema

de transporte de contaminantes, como mostra o gráfico da Figura 4.8, onde na

medida em que a velocidade aumenta o retardamento diminui. E ainda mais,

considerando o resultado do ensaio de adsorção, poderia se esperar que as

curvas não apresentem retardamento nenhum.

R = 16,47 i+ 2,893R² = 0,932

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4

R

Gradiente i

Figura 4.8. Variação do fator de Retardamento com relação ao gradiente

hidráulico

y = 0,053x - 0,001R² = 0,887

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2

D [c

m2/m

in]

Velocidade [cm/min]

Figura 4.9. Variação da Dispersão Hidrodinâmica com relação à

velocidade de poros

92

No gráfico da Figura 4.9, mostra-se a relação entre a dispersão e a

velocidade. Os valores de dispersão hidrodinâmica foram calculados em função

de R e b apresentados na Tabela 4.5, assim como também em função da

velocidade de poros, que corresponde à média dos valores medidos para cada

ensaio. Através da equação de correlação pode-se obter o valor de

dispersividade αL=0,053 cm.

Teoricamente existe uma relação linear dada pela equação (2.9) entre

ambos os parâmetros dispersão hidrodinâmica e velocidade de poros, sendo a

inclinação da reta o fator da dispersividade longitudinal (αL) e a interseção com o

eixo vertical a difusão molecular (Dm). No caso do presente estudo, os valores

que apresentam esta tendência teórica são os primeiros pontos do gráfico, ou

seja, para os ensaios com gradiente menor que 0,24 e como será visto mais

adiante, para aqueles ensaios em que não houve diminuição notável da

condutividade hidráulica. Assim, a redução da dispersividade hidrodinâmica a

partir da velocidade de 14,43 m/d (1 cm/min) pode estar relacionada com a

diminuição de canais de poro disponíveis para a propagação do fluxo, que se

manifesta através da redução da condutividade hidráulica.

Nos gráficos da Figura 4.10 apresentam-se as variações de condutividade

hidráulica com relação ao número de volume de poros. Os valores de

condutividade hidráulica foram obtidos durante a execução do ensaio ADS

através da medida da vazão do efluente. Note-se que esses valores assim

determinados no início dos ensaios encontram-se muito próximos ao valor de

condutividade hidráulica determinado durante a caracterização da areia de

quartzo, valor este representado pela linha tracejada nos gráficos da Figura 4.10.

Cada um dos ensaios ADS foi realizado aplicando um gradiente hidráulico

constante, porém os ensaios executados com valores de gradiente superiores a

0,24 (ensaios 7 e 8) mostraram uma notável diminuição da condutividade

hidráulica (de 0,03 até 0,01 cm/s), como pode ser observado na Figura 4.10 (c) e

em consequência também da velocidade de percolação. Esta observação,

permite afirmar que durante os ensaios 7 e 8 houve uma diminuição da

porosidade, mudando as condições iniciais desses ensaios, e

consequentemente conduzindo a um erro no cálculo da dispersão hidrodinâmica

correspondente a esses ensaios, conforme valores plotados no gráfico da

Figura 4.9.

Nos casos de gradientes mais baixos, a permeabilidade também

apresentou variações, mas em menor proporção e com uma tendência distinta,

93

às vezes aumentando outras diminuindo, que pode se atribuir a variações da

velocidade de agitação da suspensão dentro do frasco de Mariotte.

0,005

0,015

0,025

0,035

0,045

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Ks

cm

/s

volume de poro

Ensaio 1 (i=0,03)

0,005

0,015

0,025

0,035

0,045

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Ks

cm

/s

volume de poro

Ensaio 5 (i=0,16)

0,005

0,015

0,025

0,035

0,045

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Ks

cm/s

volume de poro

Ensaio 6 (i=0,24) Ensaio 7 (i=0,24) Ensaio 8 (i=0,36)

Figura 4.10. Variabilidade da condutividade hidráulica no ensaio ADS

(c)

(a)

(b)

94

De acordo com McDowell-Boyer et al. (1986), a mais importante

manifestação dos mecanismos de filtração é a redução da condutividade

hidráulica como o entupimento dos poros, o que explica a diminuição da

condutividade hidráulica observada.

4.3.3. Ensaios de controle

Na Tabela 4.6 são apresentados os resultados obtidos através da técnica

dos Tubos Múltiplos correspondentes ao ensaio ADS 1, para a determinação da

concentração de bactérias retidas ao longo da coluna de areia após a passagem

da suspensão bacteriana de forma contínua e constante. Pode-se observar que

a maioria da massa de E. coli foi depositada próximo ao local de ingresso da

suspensão na coluna.

Tabela 4.6. Concentração de E. coli retida ao longo da coluna de areia

(Ensaio ADS 1)

Seção da

coluna NMP/100mL NMP/10mL

Peso do solo úmido (g)

umidade %ω

Peso solo

seco Ws (g)

Concentração de células por grama de

solo (cel/g)

Base 2,10E+10 2,10E+09 1,600 6,8 1,50 1,40E+09

Metade 9,30E+08 9,30E+07 1,139 6,9 1,07 8,73E+07

Topo 4,00E+07 4,00E+06 1,631 21,0 1,35 2,97E+06

As determinações da concentração de bactérias ao longo da coluna de

areia indicaram que, à medida que esses microrganismos percolam através da

coluna, sua concentração diminui, com presença de uma concentração celular

mais elevada nas primeiras camadas e menor concentração no final da coluna.

Este comportamento é de se esperar considerando a equação da eficiência do

filtro formulada conforme a teoria da filtração equação (2.25).

Na Figura 4.11 são apresentadas as curvas granulométricas obtidas

através da análise por peneiramento, efetuada para amostras correspondentes a

três seções ao longo da coluna de areia comparada com a curva granulométrica

determinada para a caracterização do meio poroso (linha tracejada). Os

resultados mostram que na houve diferença significativa entre as curvas

granulométricas correspondentes a porções de areia retiradas da base, metade

e topo da coluna, o que permite afirmar que a distribuição dos grãos foi mantida

constante ao longo da coluna de areia durante a execução dos ensaios ADS.

95

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

0,1 1 10

% q

ue

pas

a

abertura (mm)

Coluna Base Mitade Topo

Figura 4.11. Distribuição do tamanho dos grãos ao longo da coluna de

areia

4.4. Discussão

4.4.1. Retardamento

Valores do fator de retardamento para Escherichia coli, determinados

através de experimentos de laboratório, utilizando colunas de areia com injeção

contínua são reportados pela literatura como próximos à unidade, a partir de

0,56 até 2,06 (Pang et al., 2003; Powelson e Mills., 2001 citado em Foppen e

Schijven, 2006).

Como foi visto para este estudo, os valores de retardamento obtidos a

partir da curva de transporte, variam proporcionalmente com a velocidade, a

partir de valores de 3 até 9, sendo muito superiores aos valores encontrados na

literatura.

Normalmente a existência de fatores de retardamento muito elevados é

atribuída à participação de processos de adsorção físico-química durante o

transporte, ou seja, a interações entre os grãos do solo e o contaminante

(bactéria), devido a forças físicas (forças de van der Waals e forças

96

eletrostáticas) ou, em alguns casos ligações químicas, que originam a fixação

das células da bactéria aos grãos do solo.

Contudo, no presente estudo os ensaios foram executados sob condições

desfavoráveis à adsorção físico-química, devido à utilização de água destilada,

que apresenta baixa condutividade elétrica e pH próximo ao neutro, além da

carga eletrostática negativa do quartzo e da E. coli, esta última por sua natureza

hidrofílica. Este fato foi confirmado através dos resultados obtidos nos ensaios

de batelada obtendo um coeficiente de partição próximo a zero (KD=0,001mL/g)

permitindo afirmar que, sob ás condições dos ensaios de transporte as bactérias

são muito pouco retidas no meio poroso.

Portanto, o fator de retardamento calculado com base ao coeficiente de

partição, através da equação (2.12) resulta ser aproximadamente igual à

unidade, contrariamente às observações realizadas com base nas curvas de

chegada nos ensaios ADS. Nesse sentido, a participação do processo de

adsorção físico-química no transporte de E. coli suspensa em água destilada, em

areia de quartzo nas condições avaliadas, é considerada desprezível.

Por outro lado, a teoria da filtração desenvolvida para estudar a deposição

de partículas em uma primeira etapa, na qual o leito de areia encontra-se limpo,

está baseada na proporcionalidade entre o incremento da taxa de deposição de

primeira ordem com relação ao incremento da velocidade dos poros de acordo

com a equação (2.28) (Tufenkji, 2004; Kretzschmar et al., 1999). Resultados

obtidos por Pang et al. (2003) para E. coli, utilizando água subterrânea e solos

nativos, verificaram esta relação entre a taxa de deposição e a velocidade de

fluxo, com valores de retardamento próximos à unidade, concluindo que a

filtração é o processo dominante na remoção ou atenuação de bactérias.

Contudo, a teoria da filtração não prediz adequadamente o comportamento da

deposição, em presença de interações repulsivas da dupla camada eletrostática

(Kretzschmar et al., 1999), condições impostas no presente trabalho. Além disso,

não foi encontrada na literatura nenhuma relação entre a taxa de deposição e o

retardamento.

Outros estudos (Li et al., 2004, Bradford et al., 2006) avaliaram a retenção

da bactéria E. coli para diferentes velocidades de fluxo, sob condições não

favoráveis. Os resultados destas pesquisas mostraram tendência de produzir

elevadas concentrações no efluente para maiores velocidades de fluxo,

contrariamente a teoria da filtração anteriormente descrita. Observaram também

que a forma da curva de chegada é afetada pela ocorrência da filtração

mecânica, principalmente no caso de areias finas.

97

Consequentemente, uma explicação para a obtenção de fatores de

retardamento muito elevados, como os obtidos no presente trabalho, pode ser

atribuída à influência da filtração mecânica, como é descrito a seguir.

4.4.2. Filtração Mecânica como processo dominante no transporte de E. coli nos ensaios ADS

De acordo com Foppen et al. (2005), a capacidade do meio poroso para

capturar as bactérias pode ser determinada através do cálculo do volume de

poros disponíveis para a retenção de bactérias por unidade de volume de meio

poroso (σ). De acordo com a literatura, a significância do processo de filtração

mecânica está associada à relação d/dg, considerando os diâmetros das

partículas e dos grãos completamente esféricos. Devido ao fato da E. coli ser

uma bactéria em forma de bastão, para este estudo foi utilizado como diâmetro

da bactéria (d), o valor médio da dimensão maior, isto é 3 µm. Utilizar a

dimensão menor de (1µm) subestimaria a influência do processo de filtração

mecânica. No caso do diâmetro de grão foram utilizados para os cálculos o

diâmetro característico d50= 920 µm e o diâmetro efetivo d10=180 µm. Com estas

definições, a relação d/dg foi igual a 0,003 e 0,02 para d50 e d10, respectivamente,

que resulta ser maior do que 0,002, para valores inferiores a este. De acordo

com Tufenkji (2004), o processo de filtração mecânica não tem impacto sobre o

transporte. Devido ao valor muito baixo para d/dg comparado com valores

referenciais antigamente definidos como 0,05 (Pekdeger e Matthess, 1983)

esperava-se que filtração mecânica tivesse pouca significância. Porém o

comportamento das curvas de chegada mostra o contrário.

Para o melhor entendimento do processo de filtração mecânica, no

presente estudo, foi calculado o valor de (σ) utilizando a equação (2.29),

proposta por Herzig (1970) e também através da integração da função de

densidade de poro, proposta por Wise et al. (1994), ambas as estratégias citadas

em Foppen et al. (2005) e descritas no item 2.6.4. Os parâmetros de van

Genuchten utilizados para o cálculo dos coeficientes da função de poro foram

determinados pelo método de redes neuronais Schaap et al. (1998).

Considerando a velocidade de poros constante para cada ensaio, como

também a concentração inicial, haverá um tempo para o qual todos os sítios

disponíveis estejam preenchidos e, consequentemente, também haverá um

número definido de volume de poros, que pode ser calculado através da relação

dada pela equação (2.30). A partir do estudo realizado por Foppen et al. (2005)

98

foi deduzido o valor do número de células por grama de biomassa igual a

6,36E+11, que permite transformar as unidades de concentração inicial de

(cel/mL) para (g/mL) e assim calcular o número de volume de poros que são

necessários passar através da coluna de areia para preencher os canais de poro

que teoricamente estão disponíveis para a retenção de células. Os resultados

são apresentados na Tabela 4.7.

Tabela 4.7. Número de volume de poros necessários para preencher com

bactérias os espaços de poro destinados à filtração mecânica

σ [-] % σ Co (cel/mL) Co (g/mL) pV Smax

Equação Herzig et al., 1970

dg=d50 6,71E-06 0,001 1,46E+08 2,30E-04 0,10 3,58E-06

dg=d10 3,98E-04 0,040 1,46E+08 2,30E-04 6,16 2,12E-04

Função de densidade de poro

2,47E-03 0,247 1,46E+08 2,30E-04 38,15 1,32E-03

Co:valor médio de todos os ensaios. Para a determinação da função de densidade de poro foram

considerados foram considerados os parâmetros de van Genuchten αv=3,01 (1/m) e nv=3,9966

com base nas propriedades da areia: ρbulk=1,89 e n=0,3.

Note-se que o valor do volume de bactéria que pode ser retido no meio

poroso (σ) de acordo com a equação da função de densidade de poros é

superior ao valor calculado através das aproximações baseadas na relação de

aspecto (d/dg), que pode ser interpretado pelo fato de que esta última

aproximação considera os grãos do solo como esferas do mesmo diâmetro

enquanto que a função de densidade de poro considera a distribuição do

tamanho dos poros.

Assim, os resultados obtidos indicam que, para uma areia bem graduada

como a utilizada neste estudo considerar o valor de diâmetro efetivo está mais

próximo do comportamento real do que considerar o diâmetro característico d50.

Por outro lado, com base ao ensaio de capilaridade, foi determinado um

diâmetro médio de poro igual a 352 μm, que resulta maior do que 124 μm, este

último calculado a partir da função de densidade de poro. Isto significa que o

valor de (σ) real será menor que 0,25% valor apresentado na Tabela 4.7. O valor

mais próximo à realidade pode ser então calculado mediante a determinação da

curva característica da areia no laboratório.

Contudo, as curvas de chegada obtidas neste trabalho mostraram que

houve um tempo para o qual a concentração do efluente superou o valor da

99

concentração inicial, o que sugere que ainda existam espaços disponíveis à

deposição devido ao processo de filtração mecânica, a deposição resulta ser

reversível devido ao elevado gradiente hidráulico aplicado nos ensaios. Só foi

possível observar a formação do patamar para os ensaios realizados com

gradientes menores que 0,06. Com maior definição para os ensaios 2 e 4 (v=5,9

m/d) e, no caso do ensaio 1 (v =2,47 m/d), foi observado um patamar temporário

para um valor de C/Co de aproximadamente 0,5.

Este comportamento pode ser explicado mediante a análise da Figura

4.12, onde pode se observar a forma como o solo pode reter bactérias, tanto nas

contrições dos poros como nos canais de poro que apresentam uma

extremidade com diâmetro igual a zero, esses últimos denominados por Foppen

et al. (2005) como DEP (Dead End Pore).

a) Tipo A. Constrição de poro b) Tipo B. DEP (Dead End Pore)

Figura 4.12. Tipos de locais dentro do meio poroso, susceptíveis à

retenção de bactérias devido ao processo de Filtração mecânica

Com base a essas considerações, para ensaios realizados com elevadas

velocidades (>6 m/d), a areia é capaz de reter bactérias mais rapidamente, seja

nas regiões tipo A ou tipo B. Porém, forças hidrodinâmicas, consequência da

elevada velocidade do ensaio, podem atuar com maior intensidade sobre as

bactérias retidas na região tipo A, forçando-as a atravessar a estreiteza do canal

de poro. Esta suposição tem como base a afirmação feita por Bradford et

al.(2006), que assumiram que as células de E. coli podem se agregar quando

um grande número delas monodispersas são depositadas na constrição dos

poros ou nos locais de filtração mecânica. Quando a E. coli depositada atinge

uma concentração crítica no local de filtração mecânica, a E. coli O157:H7

100

agregada pode ser liberada dentro a solução aquosa como resultado de forças

hidrodinâmicas de cisalhamento.

Este fenômeno pode explicar também as elevadas concentrações no

efluente determinadas para velocidades maiores a 6m/d (C/Co>1), evidenciando

que o processo de filtração mecânica para velocidades de fluxo muito elevadas é

menos eficiente como processo de atenuação de patogênicos.

O comportamento observado confirma a afirmação, realizada por Bradford

et al. (2002), que um modelo de remoção de partículas que considera tanto a

adsorção cinética (irreversível) junto com a filtração mecânica é mais real,

particularmente para sistemas com partículas e tamanhos de grão

intermediários.

No entanto, o processo de filtração mecânica tem uma clara influência

sobre a atenuação de bactérias, vários estudos (Bradford et al., 2006; Li et al.,

2004) demonstraram que quanto mais baixa a velocidade de fluxo, maior a

capacidade de atenuação do meio poroso, o que é observado através da

estabilização da curva para um determinado valor de C/Co menor que a unidade.

Este tipo de deposição devido à filtração mecânica foi mostrado por Bradford

(2006) através de fotos ampliadas 600 vezes (Figura 4.13). É por esta razão que

o processo de filtração mecânica é modelado também como um processo

irreversível (Pang et al., 2003).

Figura 4.13. Fotos ampliadas 600 vezes, da deposição de E.coli O157: H7

em areia de 150 μm (Bradford et al., 2006)

4.4.3. Influencia das propriedades do meio poroso

Foi mostrado que a filtração mecânica pode explicar o comportamento das

curvas de chegada, mas por outro lado, nesta seção é discutida a influência da

101

forma do grão, além do tamanho como sobre os processos de transporte e

retenção.

No estudo realizado por Bradford et al. (2002), utilizando colóides

carboxílicos, carregados negativamente e areia quartzosa de diferentes

tamanhos, os autores concluíram que o pico do efluente decresce com o

incremento do tamanho dos colóides e diminuição do tamanho dos grãos,

variáveis que foram mantidas constantes no presente estudo. Também

concluíram, que a concentração de colóides no efluente é altamente dependente

da distribuição do tamanho dos grãos, porém utilizaram areias com coeficientes

de uniformidade entre 1 e 3, menores que o valor de 6,11 correspondente à areia

utilizada neste trabalho.

Embora os experimentos realizados por Bradford et al. (2002) não tenham

sido dirigidos à determinação do fator de retardamento, não foi observado

retardo nas curvas de chegada, o que poderia estar relacionado com a utilização

de meios porosos com distribuição uniforme dos grãos.

Foppen e Shijven (2006) apresentam resultados obtidos por Mathess et al.

(1995a), que demonstram que o coeficiente de uniformidade não afeta o valor do

coeficiente de filtração (ou coeficiente de adesão katt) que está diretamente

relacionado com o valor de C/Co (patamar da curva de chegada). Entretanto, a

influência deste parâmetro na forma da curva de chegada e consequentemente

no retardamento, não foi analisada.

Portanto, pode-se afirmar que embora o coeficiente de uniformidade não

afete a eficiência de filtração, pode, sim, influenciar a forma da curva chegada.

Quanto à análise da forma dos grãos, experimentos realizados por Tufenkji

et al. (2004) comparam o transporte de Criptosporidium parvum oocysts e

microesferas de látex, através de areia de quartzo e de esferas de vidro de

tamanho comparável com o tamanho da areia. Estes estudos revelaram que a

forma do grão contribui consideravelmente no potencial de filtração mecânica do

meio poroso, como pode ser observado na Figura 4.14. Deste modo, Tufenkji et

al. (2004) demonstraram que comparado com a sílica esférica, a sílica britada

resulta numa maior atenuação de microesferas e Cryptosporidium devido ao

efeito de filtração mecânica.

102

Figura 4.14. Imagens ESEM (Environmental Scanning Electron

Microscope) de a) leito de esferas de vidro (ampliadas 200 vezes, b)

quartzo com forma irregular (ampliada 500 vezes) (Tufenkji et al., 2004)

Com base neste estudo, pode se afirmar que a forma predominantemente

angulosa da areia de quartzo comercial utilizada neste trabalho, pode ter

contribuído ainda mais na retenção de bactérias devido ao processo de filtração

mecânica.

5 CONCLUSÕES E SUGESTÕES

5.1. Conclusões

Este estudo avaliou os parâmetros de transporte do microrganismo

patogênico Escherichia coli ATCC11229 suspenso em água destilada, através

de colunas saturadas de areia de quartzo.

Os ensaios de sobrevivência permitiram demonstrar que a massa de

células injetadas na coluna de areia foi mantida constante o tempo de execução

dos ensaios ADS, ou seja, o efeito de fatores biológicos não interferiu no

transporte deste microrganismo na areia de quartzo.

O ensaio de batelada, através da obtenção do coeficiente de partição KD

igual a 0,001 mL/g, demonstrou que sob condições desfavoráveis à adesão (i.e.

pH próximo ao neutro, baixa condutividade elétrica e coletor e microrganismo

com igual carga elétrica) o processo de filtração físico-química pode ser

considerado desprezível no transporte da E. coli em areia de quartzo.

Sem a interferência do processo de filtração físico-química, os valores para

o fator de retardamento R, entre 3 e 9, obtidos diretamente da curva de chegada

não representa a capacidade de adsorção da bactéria na areia durante o

transporte, sugerindo a intervenção do processo de filtração mecânica.

A diminuição da condutividade hidráulica observada para os ensaios

executados com velocidade de poros maior que 14,4 m/d, evidencia o

entupimento dos poros da areia, alterando as propriedades hidráulicas do meio

poroso, sendo possível estabelecer uma relação linear entre a dispersão

hidrodinâmica e a velocidade de poro, só para valores de dispersão

hidrodinâmica compreendidos entre 1,44 x10-2 cm2/min e 5,47 x10- 2 cm2/min.

Não foi observada a remoção de bactérias devido ao processo de filtração

mecânica nos ensaios realizados com velocidades de poro maiores que 6m/d.

Contrariamente foi observada uma concentração no efluente da coluna maior do

que a concentração inicial no final destes ensaios, que sugere que as bactérias

inicialmente retidas foram arrastadas em decorrência da ação de forças

hidrodinâmicas cisalhantes.

104

O processo dominante neste estudo foi a filtração mecânica, sendo

observado que este processo, além de depender da concentração inicial,

depende também da variação da velocidade, da distribuição do tamanho e da

forma dos grãos.

Uma descrição precisa do transporte de bactérias requer a compreensão

dos efeitos combinados de sorção, filtração física, velocidade intersticial e

dispersão.

5.2. Sugestões

O estudo e o comportamento de microrganismos em solos é ainda um

desafio. A seguir são apresentadas algumas sugestões e recomendações para

pesquisas futuras, com o objetivo de complementar e comprovar os dados

apresentados.

Determinar a distribuição real do tamanho de poros através da obtenção

da curva de retenção solo-água em laboratório e estudar o comportamento da E.

coli ATCC11229 utilizando areia de quartzo com distribuição granulométrica

uniforme, para confirmar o efeito do coeficiente de uniformidade no processo de

filtração mecânica.

Avaliar o sistema experimental proposto utilizando como solução água com

elevada força iônica que permita avaliar a influência do processo de adsorção

físico-química e, consequentemente determinar a taxa de desorção.

Realizar ensaios de transporte de microrganismos aplicando velocidades

de fluxo menores a 6m/d, representado melhor as velocidades dos aquíferos

naturais.

Definir a velocidade crítica que causa o desprendimento das bactérias que

são retidas pelo processo de filtração mecânica.

Pesquisas recentes sugerem que o monitoramento da concentração da

fase fluida é insuficiente para a identificação dos mecanismos fundamentais

controlando o transporte dos microrganismos, devendo ser complementados

pela distribuição espacial dos microrganismos retidos (Tufenkji, 2007).

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APÊNDICE A

A.1. Determinação do número de células durante o ensaio de adsorção em batelada

Nesta seção são apresentadas as tabelas de resultados obtidas no

laboratório durante a execução dos ensaios de adsorção em batelada através da

técnica de contagem em placa “pour plate”, para a determinação dos parâmetros

Nt (número total de células) e Ns (número de células no sobrenadante). Valores

utilizados para a obtenção da isoterma de adsorção de E. coli em areia de

quartzo. Foram realizados ensaios para quatro concentrações iniciais 106, 107,

108 e 109 cel/mL

Concentração de 106 cel/mL

Determinação de Nt [UFC] para o tempo inicial To:

-2 -3 -4 -5

DUPLICATA 1 1136,00 99,00 13,00 0,00

123,00 18,00 1,00

144,00 14,00 0,00

media [UFC/0,1ml] 1136,00 122,00 15,00 0,33

UFC/ml 1,14E+06 1,22E+06 1,50E+06 3,33E+05

Nt [UFC] 2,27E+07 2,44E+07 3,00E+07 6,67E+06

DUPLICATA 2 1620,00 182,00 18,00 3,00

235,00 12,00 2,00

222,00 27,00 1,00

media [UFC/0,1ml] 1620,00 213,00 19,00 2,00

UFC/ml 1,62E+06 2,13E+06 1,90E+06 2,00E+06

Nt [UFC] 3,24E+07 4,26E+07 3,80E+07 4,00E+07

Diluições

Determinação de NS [UFC] para o tempo final T1:

-2 -3 -4 -5

DUPLICATA 1 1564,00 182,00 35,00 1,00

176,00 20,00 3,00

195,00 16,00 4,00

media [UFC/0,1ml] 1564,00 184,33 23,67 2,67

UFC/ml 1,56E+06 1,84E+06 2,37E+06 2,67E+06

Ns [UFC] 3,13E+07 3,69E+07 4,73E+07 5,33E+07

DUPLICATA 2 1124,00 195,00 20,00 1,00

190,00 32,00 4,00

186,00 25,00 3,00

media [UFC/0,1ml] 1124,00 190,33 25,67 2,67

UFC/ml 1,12E+06 1,90E+06 2,57E+06 2,67E+06

Ns [UFC] 2,25E+07 3,81E+07 5,13E+07 5,33E+07

Diluições

Concentração de 107 cel/mL

Determinação de Nt [UFC] para o tempo inicial To:

-3 -4 -5 -6

DUPLICATA 1 1528,00 288,00 13,00 4,00

1944,00 249,00 9,00 2,00

276,00 21,00 6,00

media [UFC/0,1ml] 1736,00 271,00 14,33 4,00

UFC/ml 1,74E+07 2,71E+07 1,43E+07 4,00E+07

Nt [UFC] 3,47E+08 5,42E+08 2,87E+08 8,00E+08

DUPLICATA 2 836,00 172,00 6,00 1,00

468,00 204,00 2,00 0,00

800,00 215,00 6,00 1,00

media [UFC/0,1ml] 701,33 197,00 4,67 0,67

UFC/ml 7,01E+06 1,97E+07 4,67E+06 6,67E+06

Nt [UFC] 1,40E+08 3,94E+08 9,33E+07 1,33E+08

Diluições

Determinação de NS [UFC] para o tempo final T1:

-3 -4 -5 -6

DUPLICATA 1 1836,00 16,00 18,00 5,00

1240,00 34,00 29,00 2,00

45,00 40,00 5,00

media [UFC/0,1ml] 1538,00 31,67 29,00 4,00

UFC/ml 1,54E+07 3,17E+06 2,90E+07 4,00E+07

Ns [UFC] 3,08E+08 6,33E+07 5,80E+08 8,00E+08

DUPLICATA 2 456,00 167,00 9,00 3,00

399,00 130,00 12,00 1,00

472,00 252,00 12,00 3,00

media [UFC/0,1ml] 442,33 183,00 11,00 2,33

UFC/ml 4,42E+06 1,83E+07 1,10E+07 2,33E+07

Ns [UFC] 8,85E+07 3,66E+08 2,20E+08 4,67E+08

Diluições

Não foram considerados os valores que correspondem à diluição 10-4

para a

Duplicata 1.

Concentração de 108 cel/mL

Determinação de Nt [UFC] para o tempo inicial To:

-4 -5 -6 -7

DUPLICATA 1 1560,00 332,00 68,00 1,00

1744,00 347,00 57,00 12,00

339,00 42,00 6,00

media [UFC/0,1ml] 1652,00 339,33 55,67 6,33

UFC/ml 1,65E+08 3,39E+08 5,57E+08 6,33E+08

Nt [UFC] 3,30E+09 6,79E+09 1,11E+10 1,27E+10

DUPLICATA 2 2264,00 325,00 32,00 8,00

2116,00 302,00 37,00 3,00

345,00 34,00 6,00

media [UFC/0,1ml] 2190,00 324,00 34,33 5,67

UFC/ml 2,19E+08 3,24E+08 3,43E+08 5,67E+08

Nt [UFC] 4,38E+09 6,48E+09 6,87E+09 1,13E+10

Diluições

Determinação de NS [UFC] para o tempo final T1:

-4 -5 -6 -7

DUPLICATA 1 1716,00 177,00 39,00 8,00

1240,00 199,00 42,00 3,00

203,00 42,00 7,00

media [UFC/0,1ml] 1478,00 193,00 41,00 6,00

UFC/ml 1,48E+08 1,93E+08 4,10E+08 6,00E+08

Ns [UFC] 2,96E+09 3,86E+09 8,20E+09 1,20E+10

DUPLICATA 2 792,00 96,00 37,00 10,00

772,00 116,00 35,00 8,00

147,00 30,00 14,00

media [UFC/0,1ml] 782,00 119,67 34,00 10,67

UFC/ml 7,82E+07 1,20E+08 3,40E+08 1,07E+09

Ns [UFC] 1,56E+09 2,39E+09 6,80E+09 2,13E+10

Diluições

Concentração de 109 cel/mL

Determinação de Nt [UFC] para o tempo inicial To:

-5 -6 -7 -8

DUPLICATA 1 1508,00 317,00 32,00 5,00

267,00 31,00 3,00

339,00 23,00 1,00

media [UFC/0,1ml] 1508,00 307,67 28,67 3,00

UFC/ml 1,51E+09 3,08E+09 2,87E+09 3,00E+09

Nt [UFC] 3,02E+10 6,15E+10 5,73E+10 6,00E+10

DUPLICATA 2 1708,00 464,00 1188,00 748,00

media [UFC/0,1ml] 1708,00 464,00 1188,00 748,00

UFC/ml 1,71E+09 4,64E+09 1,19E+11 7,48E+11

Nt [UFC] 3,42E+10 9,28E+10 2,38E+12 1,50E+13

Diluições

Não foram considerados os valores que correspondem às diluições 10-7

e 10-8

para

a Duplicata 2.

Determinação de NS [UFC] para o tempo final T1:

-5 -6 -7 -8

DUPLICATA 1 1868,00 452,00 189,00 65,00

394,00 207,00 50,00

416,00 216,00 57,00

media [UFC/0,1ml] 1868,00 420,67 204,00 57,33

UFC/ml 1,87E+09 4,21E+09 2,04E+10 5,73E+10

Ns [UFC] 3,74E+10 8,41E+10 4,08E+11 1,15E+12

DUPLICATA 2 724,00 59,00 21,00 1,00

89,00 26,00 2,00

55,00 21,00 3,00

media [UFC/0,1ml] 724,00 67,67 22,67 2,00

UFC/ml 7,24E+08 6,77E+08 2,27E+09 2,00E+09

Ns [UFC] 1,45E+10 1,35E+10 4,53E+10 4,00E+10

Diluições

Não foram considerados os valores que correspondem às diluições 10-7

e 10-8

para

a Duplicata 1.

A.2. Cálculo do coeficiente de distribuição KD

Concentração de 106 cel/mL

Dil Co Nt Ns Pa Cs Cw KD

UFC/ml UFC UFC % cel/g cel/ml ml/g

DUPLICATA 1 -2 1,14E+06 2,27E+07 3,13E+07 -37,7 -4,27E+06 1,56E+06 -2,7

-3 1,22E+06 2,44E+07 3,69E+07 -51,1 -6,21E+06 1,84E+06 -3,4

-4 1,50E+06 3,00E+07 4,73E+07 -57,8 -8,64E+06 2,37E+06 -3,6

-5 3,33E+05 6,67E+06 5,33E+07 -700,0 -2,33E+07 2,67E+06 -8,7

DUPLICATA 2 -2 1,62E+06 3,24E+07 2,25E+07 30,6 4,96E+06 1,12E+06 4,4

-3 2,13E+06 4,26E+07 3,81E+07 10,6 2,27E+06 1,90E+06 1,2

-4 1,90E+06 3,80E+07 5,13E+07 -35,1 -6,67E+06 2,57E+06 -2,6

-5 2,00E+06 4,00E+07 5,33E+07 -33,3 -6,67E+06 2,67E+06 -2,5

O valor de KD determinado para a concentração 106 cel/mL corresponde ao valor da tabela

calculado para a diluição 10-3

da Duplicata 2 igual a 1,2 mL/g.

Concentração de 107 cel/mL

Dil Co Nt Ns Pa Cs Cw KD

UFC/ml UFC UFC % cel/g cel/ml ml/g

DUPLICATA 1 -3 1,74E+07 3,47E+08 3,08E+08 11,4 1,97E+07 1,54E+07 1,3

-4 2,71E+07 5,42E+08 6,33E+07 88,3 2,38E+08 3,17E+06 75,3

-5 1,43E+07 2,87E+08 5,80E+08 -102,3 -1,46E+08 2,90E+07 -5,0

-6 4,00E+07 8,00E+08 8,00E+08 0,0 0,00E+00 4,00E+07 0,0

DUPLICATA 2 -3 7,01E+06 1,40E+08 8,85E+07 36,9 2,59E+07 4,42E+06 5,9

-4 1,97E+07 3,94E+08 3,66E+08 7,1 1,40E+07 1,83E+07 0,8

-5 4,67E+06 9,33E+07 2,20E+08 -135,7 -6,33E+07 1,10E+07 -5,8

-6 6,67E+06 1,33E+08 4,67E+08 -250,0 -1,67E+08 2,33E+07 -7,1

Dil Co Nt Ns Pa Cs Cw KD

UFC/ml UFC UFC % cel/g cel/ml ml/g

DUPLICATA 1 -4 2,71E+07 5,42E+08

-3 3,08E+08

media 5,42E+08 3,08E+08 43,2 1,17E+08 1,54E+07 7,6

DUPLICATA 2 -4 1,97E+07 3,94E+08 3,66E+08

media 3,94E+08 3,66E+08 7,1 1,40E+07 1,83E+07 0,8

2,34E+07 4,68E+08 25,2 6,56E+07 1,68E+07 4,2

O valor de KD determinado para a concentração 107 cel/mL corresponde ao valor médio,

dos valores calculados para as diluições 10-4

e 10-3

da Duplicata 1 e a diluição 10-4

da

Duplicata 2. Assim o valor de KD resulta ser igual a 4,2 mL/g.

Concentração de 108 cel/mL

O valor de KD determinado para a concentração 108 cel/mL corresponde ao valor médio,

dos valores calculados para a Duplicata 1 e a Duplicata 2, utilizando a média das diluições

10-5

e 10-6

. Assim o valor de KD resulta ser igual a 4,7 mL/g.

Concentração de 109 cel/mL

Dil Co Nt Ns Pa Cs Cw KD

UFC/ml UFC UFC % cel/g cel/ml ml/g

DUPLICATA 1 -5 1,51E+09 3,02E+10 3,74E+10 -23,9 -3,61E+09 1,87E+09 -1,9

-6 3,08E+09 6,15E+10 8,41E+10 -36,7 -1,13E+10 4,21E+09 -2,7

-7 2,87E+09 5,73E+10

-8 3,00E+09 6,00E+10

DUPLICATA 2 -5 1,71E+09 3,42E+10 1,45E+10 57,6 9,84E+09 7,24E+08 13,6

-6 4,64E+09 9,28E+10 1,35E+10 85,4 3,96E+10 6,77E+08 58,6

-7 4,53E+10

-8 4,00E+10

O valor de KD determinado para a concentração 109 cel/mL corresponde ao valor calculado

considerando a diluição 10-6

(para Nt) da Duplicata 1 e 10-6

da Duplicata 2 (para Ns). Assim

o valor de KD resulta ser igual a 35,5 mL/g.

APÊNDICE B

B.1. Dados para a construção da curva de chegada

Ensaio 1 (i=0,03)

N°Absorbância

[A] Nº cel/ml C [cel/ml] C/Covol percolado

medido pV

C [cel/ml]

CNB C/Co

0 0,006 -2,71E+06 0,00E+00 0,00 20,0 0,1 0,00E+00 0,00

1 0,020 6,84E+05 6,84E+05 0,01 170,0 0,9 0,00E+00 0,00

2 0,062 1,09E+07 1,09E+07 0,10 275,0 1,5 1,70E+07 0,15

3 0,276 6,27E+07 6,27E+07 0,59 380,0 2,1 8,48E+07 0,74

4 0,238 5,35E+07 5,35E+07 0,50 470,0 2,6

5 0,242 5,45E+07 5,45E+07 0,51 565,0 3,1 5,83E+07 0,51

6 0,266 6,03E+07 6,03E+07 0,57 660,0 3,7

7 0,300 6,85E+07 6,85E+07 0,64 750,0 4,2 8,88E+07 0,77

8 0,336 7,73E+07 7,73E+07 0,72 840,0 4,79 0,359 8,28E+07 8,28E+07 0,78 935,0 5,2

10 0,378 8,74E+07 8,74E+07 0,82 1025,0 5,7 1,13E+08 0,98

11 0,387 8,96E+07 8,96E+07 0,84 1115,0 6,2

12 0,399 9,25E+07 9,25E+07 0,87 1210,0 6,7 7,90E+07 0,69

13 0,412 9,57E+07 9,57E+07 0,90 1305,0 7,3

14 0,422 9,81E+07 9,81E+07 0,92 1390,0 7,7 1,22E+08 1,06

15 0,587 1,38E+08 1,38E+08 1,30 1930,0 10,7 1,42E+08 1,23

16 0,607 1,43E+08 1,43E+08 1,34 1960,0 10,9

Ensaio 2 (i=0,06)

N°Absorbância

[A] Nº cel/ml C [cel/ml] C/Covol percolado

medido pV

C [cel/ml]

CNB C/Co

0 0,005 -2,95E+06 0,00E+00 0,00 16,0 0,1 0,00E+00 0,00

1 0,010 -1,74E+06 0,00E+00 0,00 176,0 0,9

2 0,074 1,38E+07 1,38E+07 0,08 311,0 1,7 1,36E+07 0,08

3 0,142 3,02E+07 3,02E+07 0,18 437,0 2,3

4 0,213 4,75E+07 4,75E+07 0,29 567,0 3,0

5 0,307 7,02E+07 7,02E+07 0,43 702,0 3,8 6,57E+07 0,40

6 0,423 9,83E+07 9,83E+07 0,60 852,0 4,67 0,497 1,16E+08 1,16E+08 0,70 957,0 5,1

8 0,598 1,41E+08 1,41E+08 0,85 1062,0 5,7

9 0,621 1,46E+08 1,46E+08 0,89 1212,0 6,5 1,40E+08 0,85

10 0,626 1,48E+08 1,48E+08 0,89 1362,0 7,3

11 0,635 1,50E+08 1,50E+08 0,91 1457,0 7,8

12 0,651 1,54E+08 1,54E+08 0,93 1593,0 8,5

13 0,651 1,54E+08 1,54E+08 0,93 1593,0 8,5

Ensaio 3 (i=0,06)

N°Absorbância

[A] Nº cel/ml C [cel/ml] C/Covol percolado

medido pV

C [cel/ml]

CNB C/Co

0 0,015 -5,27E+05 0,00E+00 0,00 15,0 0,1 0,00E+00 0,00

1 0,022 1,17E+06 1,17E+06 0,01 130,0 0,7

2 0,031 3,35E+06 3,35E+06 0,02 231,0 1,2 2,75E+06 0,02

3 0,090 1,76E+07 1,76E+07 0,11 355,0 1,9

4 0,142 3,02E+07 3,02E+07 0,20 490,0 2,6 3,05E+07 0,25

5 0,214 4,77E+07 4,77E+07 0,31 615,0 3,3

6 0,319 7,31E+07 7,31E+07 0,47 740,0 3,9 6,15E+07 0,51

7 0,398 9,23E+07 9,23E+07 0,60 850,0 4,5

8 0,468 1,09E+08 1,09E+08 0,71 970,0 5,2 7,68E+07 0,63

9 0,494 1,16E+08 1,16E+08 0,75 1070,0 5,7

10 0,543 1,27E+08 1,27E+08 0,82 1170,0 6,2 1,01E+08 0,83

11 0,524 1,23E+08 1,23E+08 0,79 1305,0 7,0

12 0,531 1,25E+08 1,25E+08 0,80 1415,0 7,5 9,95E+07 0,82

13 0,582 1,37E+08 1,37E+08 0,88 1525,0 8,1

14 0,583 1,37E+08 1,37E+08 0,89 1650,0 8,8 9,90E+07 0,81

15 0,611 1,44E+08 1,44E+08 0,93 1775,0 9,5

16 0,635 1,50E+08 1,50E+08 0,97 1915,0 10,2 1,12E+08 0,92

17 0,668 1,58E+08 1,58E+08 1,02 2030,0 10,8

18 0,680 1,61E+08 1,61E+08 1,04 2135,0 11,4

Ensaio 4 (i=0,06)

N°Absorbância

[A] Nº cel/ml C [cel/ml] C/Covol percolado

medido pV

C [cel/ml]

CNB C/Co

0 0,008 -2,22E+06 0,00E+00 0,00 15,0 0,1 0,00E+00 0,00

1 0,011 -1,50E+06 0,00E+00 0,00 140,0 0,8

2 0,062 1,09E+07 1,09E+07 0,06 260,0 1,4 8,45E+06 0,04

3 0,129 2,71E+07 2,71E+07 0,15 390,0 2,1

4 0,166 3,61E+07 3,61E+07 0,20 515,0 2,8 2,90E+07 0,13

5 0,224 5,01E+07 5,01E+07 0,28 631,0 3,4

6 0,307 7,02E+07 7,02E+07 0,39 741,0 4,0 8,30E+07 0,38

7 0,400 9,28E+07 9,28E+07 0,52 859,0 4,6

8 0,475 1,11E+08 1,11E+08 0,62 969,0 5,2 1,24E+08 0,57

9 0,528 1,24E+08 1,24E+08 0,69 1074,0 5,8

10 0,575 1,35E+08 1,35E+08 0,76 1184,0 6,4 1,63E+08 0,75

11 0,614 1,45E+08 1,45E+08 0,81 1299,0 7,0

12 0,645 1,52E+08 1,52E+08 0,85 1414,0 7,6 1,85E+08 0,85

13 0,668 1,58E+08 1,58E+08 0,88 1539,0 8,3

14 0,681 1,61E+08 1,61E+08 0,90 1659,0 8,9 1,93E+08 0,89

15 0,686 1,62E+08 1,62E+08 0,91 1784,0 9,6

16 0,690 1,63E+08 1,63E+08 0,91 1910,0 10,3 2,00E+08 0,92

17 0,692 1,64E+08 1,64E+08 0,92 2030,0 10,9

18 0,693 1,64E+08 1,64E+08 0,92 2135,0 11,5

Ensaio 5 (i=0,16)

N°Absorbância

[A] Nº cel/ml C [cel/ml] C/Covol percolado

medido pV

C [cel/ml]

CNB C/Co

0 0,007 -2,47E+06 0,00E+00 0,00 15,0 0,1 0,00E+00 0,00

1 0,025 1,90E+06 1,90E+06 0,01 210,0 1,1 2,50E+05 0,00

2 0,119 2,47E+07 2,47E+07 0,15 395,0 2,1 1,93E+07 0,14

3 0,193 4,26E+07 4,26E+07 0,26 570,0 3,1 2,96E+07 0,21

4 0,281 6,39E+07 6,39E+07 0,39 737,0 4,0 4,34E+07 0,31

5 0,357 8,24E+07 8,24E+07 0,51 892,0 4,8 0,00

6 0,425 9,88E+07 9,88E+07 0,61 1047,0 5,7 6,85E+07 0,50

7 0,475 1,11E+08 1,11E+08 0,68 1202,0 6,5 0,00

8 0,513 1,20E+08 1,20E+08 0,74 1357,0 7,3 9,58E+07 0,69

9 0,544 1,28E+08 1,28E+08 0,78 1507,0 8,1 0,00

10 0,572 1,34E+08 1,34E+08 0,83 1662,0 9,0 1,02E+08 0,74

11 0,608 1,43E+08 1,43E+08 0,88 1822,0 9,8 1,07E+08 0,77

12 0,638 1,50E+08 1,50E+08 0,92 1988,0 10,7 1,40E+08 1,01

13 0,673 1,59E+08 1,59E+08 0,98 2158,0 11,7 1,17E+08 0,85

14 0,707 1,67E+08 1,67E+08 1,03 2328,0 12,6 1,60E+08 1,16

Ensaio 6 (i=0,24)

N°Absorbância

[A] Nº cel/ml C [cel/ml] C/Covol percolado

medido pV

C [cel/ml]

CNB C/Co

0 0,007 -2,47E+06 0,00E+00 0,00 15,0 0,1 0,00E+00 0,00

1 0,015 -5,27E+05 0,00E+00 0,00 190,0 1,0 2,50E+05 0,00

2 0,089 1,74E+07 1,74E+07 0,12 365,0 2,0 1,93E+07 0,14

3 0,133 2,81E+07 2,81E+07 0,20 536,0 2,9 2,96E+07 0,21

4 0,181 3,97E+07 3,97E+07 0,28 702,0 3,8 4,34E+07 0,31

5 0,231 5,18E+07 5,18E+07 0,37 847,0 4,6 0,00

6 0,273 6,20E+07 6,20E+07 0,44 992,0 5,4 6,85E+07 0,50

7 0,317 7,27E+07 7,27E+07 0,52 1138,0 6,1 0,00

8 0,358 8,26E+07 8,26E+07 0,59 1288,0 7,0 9,58E+07 0,69

9 0,392 9,08E+07 9,08E+07 0,65 1433,0 7,7 0,00

10 0,432 1,01E+08 1,01E+08 0,72 1568,0 8,5 1,02E+08 0,74

11 0,469 1,09E+08 1,09E+08 0,78 1698,0 9,2 1,07E+08 0,77

12 0,506 1,18E+08 1,18E+08 0,85 1833,0 9,9 1,40E+08 1,01

13 0,543 1,27E+08 1,27E+08 0,91 1973,0 10,7 1,17E+08 0,85

14 0,567 1,33E+08 1,33E+08 0,95 2113,0 11,4 1,60E+08 1,16

15 0,589 1,39E+08 1,39E+08 0,99 2248,0 12,1 1,30E+08 0,94

16 0,605 1,42E+08 1,42E+08 1,02 2378,0 12,8 1,51E+08 1,09

17 0,626 1,48E+08 1,48E+08 1,05 2503,0 13,5

18 0,659 1,56E+08 1,56E+08 1,11 2608,0 14,1

19 0,686 1,62E+08 1,62E+08 1,16 2704,2 14,6

Ensaio 7 (i=0,24)

N°Absorbância

[A] Nº cel/ml C [cel/ml] C/Covol percolado

medido pV

C [cel/ml]

CNB C/Co

0 0,002 -3,68E+06 0,00E+00 0,00 15,0 0,1 4,00E+05 0,00

1 0,036 4,56E+06 4,56E+06 0,03 190,0 1,1 0,00

2 0,053 8,68E+06 8,68E+06 0,07 345,0 1,9 9,45E+06 0,07

3 0,085 1,64E+07 1,64E+07 0,13 510,0 2,8 0,00

4 0,112 2,30E+07 2,30E+07 0,18 655,0 3,6 2,16E+07 0,16

5 0,140 2,98E+07 2,98E+07 0,23 790,0 4,4 0,00

6 0,174 3,80E+07 3,80E+07 0,29 920,0 5,1 4,27E+07 0,32

7 0,205 4,55E+07 4,55E+07 0,35 1035,0 5,7 0,00

8 0,246 5,55E+07 5,55E+07 0,42 1160,0 6,4 0,00

9 0,281 6,39E+07 6,39E+07 0,49 1265,0 7,0 5,40E+07 0,41

10 0,303 6,93E+07 6,93E+07 0,53 1360,0 7,5 5,43E+07 0,41

11 0,332 7,63E+07 7,63E+07 0,58 1455,0 8,1 0,00

12 0,357 8,24E+07 8,24E+07 0,63 1550,0 8,6 8,70E+07 0,66

13 0,381 8,82E+07 8,82E+07 0,67 1645,0 9,1 0,00

14 0,417 9,69E+07 9,69E+07 0,74 1805,0 10,0 9,70E+07 0,73

15 0,433 1,01E+08 1,01E+08 0,77 1880,0 10,4 0,00

16 0,462 1,08E+08 1,08E+08 0,82 2030,0 11,2 9,65E+07 0,73

17 0,483 1,13E+08 1,13E+08 0,86 2165,0 12,0 1,07E+08 0,81

18 0,545 1,28E+08 1,28E+08 0,97 2290,0 12,7 1,47E+08 1,11

19 0,610 1,44E+08 1,44E+08 1,09 2405,0 13,3 1,55E+08 1,17

20 0,631 1,49E+08 1,49E+08 1,13 2510,0 13,9 1,56E+08 1,18

21 0,639 1,51E+08 1,51E+08 1,15 2605,0 14,4 0,00

Ensaio 8 (i=0,36)

N°Absorbância

[A] Nº cel/ml C [cel/ml] C/Covol percolado

medido pV

C [cel/ml]

CNB C/Co

0 0,005 -2,95E+06 0,00E+00 0,00 15,0 0,1 4,00E+05 0,00

1 0,029 2,87E+06 2,87E+06 0,02 220,0 1,2 0,00

2 0,033 3,83E+06 3,83E+06 0,03 395,0 2,2 5,30E+06 0,05

3 0,049 7,71E+06 7,71E+06 0,06 565,0 3,2 0,00

4 0,072 1,33E+07 1,33E+07 0,10 725,0 4,1 1,17E+07 0,11

5 0,100 2,01E+07 2,01E+07 0,15 880,0 5,0 0,00

6 0,139 2,95E+07 2,95E+07 0,22 1033,5 5,9 0,00

7 0,178 3,90E+07 3,90E+07 0,30 1175,5 6,7 0,00

8 0,206 4,58E+07 4,58E+07 0,35 1305,5 7,4 3,53E+07 0,35

9 0,242 5,45E+07 5,45E+07 0,41 1430,5 8,1 0,00

10 0,282 6,42E+07 6,42E+07 0,49 1570,5 8,9 0,00

11 0,344 7,92E+07 7,92E+07 0,60 1740,5 9,9 0,00

12 0,394 9,13E+07 9,13E+07 0,70 1900,5 10,8 6,65E+07 0,66

13 0,433 1,01E+08 1,01E+08 0,77 2060,5 11,7 0,00

14 0,485 1,13E+08 1,13E+08 0,86 2230,5 12,6 8,50E+07 0,84

15 0,532 1,25E+08 1,25E+08 0,95 2345,5 13,3 0,00

16 0,586 1,38E+08 1,38E+08 1,05 2460,5 13,9 1,20E+08 1,18

17 0,603 1,42E+08 1,42E+08 1,08 2575,5 14,6 1,29E+08 1,27

B.2. Determinação gráfica dos parâmetros “b” e “R”

Nesta seção apresentam-se as gráficas das curvas de chegada obtidas

durante os ensaios ADS, indicando a forma como foi determinado o fator de

retardamento R, assim como também o valor de b para posterior calculo da

dispersão hidrodinâmica Dh.

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

1,10

1,20

1,30

1,40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

C/C

o

volume de poro

Ensaio 1 (i=0,03)

R=3,3 b=1,2 Dh=1,74E-2 [cm2/min]

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

1,10

1,20

1,30

1,40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

C/C

o

volume de poro

Ensaio 2 (i=0,06)

R=4,1 b=1,5 Dh=2,04E-2 [cm2/min]

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

1,10

1,20

1,30

1,40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

C/C

o

volume de poro

Ensaio 3 (i=0,06)

R=4,0 b=1,6 Dh=1,63E-2 [cm2/min]

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

1,10

1,20

1,30

1,40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

C/C

o

volume de poro

Ensaio 4 (i=0,06)

R=4,5 b=1,5 Dh=1,44E-2 [cm2/min]

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

1,10

1,20

1,30

1,40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

C/C

o

volume de poro

Ensaio 5 (i=0,16)

R=4,9 b=1,1 Dh=4,87E-2 [cm2/min]

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

1,10

1,20

1,30

1,40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

C/C

o

volume de poro

Ensaio 6 (i=0,24)

R=6,0 b=0,9 Dh=5,47E-2 [cm2/min]

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

1,10

1,20

1,30

1,40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

C/C

o

volume de poro

Ensaio 7 (i= 0,24)

R=7,4 b=2,0 Dh=9,39E-3 [cm2/min]

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

1,00

1,10

1,20

1,30

1,40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

C/C

o

volume de poro

Ensaio 8 (i=0,36)

R=9,0 b=3,5 Dh=7,89E-3 [cm2/min]