Embed Size (px)
Citation preview
LUCIANA SANTOS SOUZA PAULI
PAPEL DO EXERCÍCIO FÍSICO NA REGULAÇÃO DA PROTEÍNA
ROCK EM HIPOTÁLAMO DE CAMUNDONGOS OBESOS:
EFEITOS SOBRE A SINALIZAÇÃO DA INSULINA E LEPTINA
LIMEIRA
2017
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Ciências Aplicadas
LUCIANA SANTOS SOUZA PAULI
PAPEL DO EXERCÍCIO FÍSICO NA REGULAÇÃO DA PROTEÍNA ROCK EM
HIPOTÁLAMO DE CAMUNDONGOS OBESOS: EFEITOS SOBRE A
SINALIZAÇÃO DA INSULINA E LEPTINA
Tese apresentada à Faculdade de
Ciências Aplicadas da Universidade
Estadual de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do
título de Doutora em Ciências da Nutrição
e do Esporte e Metabolismo, na área de
concentração Metabolismo e Biologia
Molecular.
Orientador: EDUARDO ROCHETE ROPELLE
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE
À VERSÃO DE DEFESA DA TESE
DEFENDIDA PELA ALUNA LUCIANA
SANTOS SOUZA PAULI, E
ORIENTADA PELO PROF. DR.
EDUARDO ROCHETE ROPELLE
LIMEIRA
2017
Banca examinadora da defesa de doutorado
Presidente
Prof. Dr. Eduardo Rochete Ropelle (Faculdade de Ciências Aplicadas /Unicamp)
Membros
Prof. Dr. Leandro Pereira de Moura (Faculdade de Ciências Aplicadas/Unicamp)
Prof. Dr. Adelino Sanchez Ramos da Silva (Escola de Educação Física e Esporte de
Ribeirão Preto/USP)
Profa. Dra. Angélica Rossi Sartori Cintra (Faculdade Anhanguera de
Indaiatuba/Anhanguera)
Profa. Dra. Ellen Cristini de Freitas (Escola de Educação Física e Esporte de Ribeirão
Preto/USP)
Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo
de vida acadêmica do aluno
DEDICATÓRIA
Dedico esta tese à minha mãe Adélia Aparecida Santos Souza e a meu pai José
Macedo de Souza, que sempre me incentivaram e se dedicaram intensamente para a
minha formação educacional e desenvolvimento pessoal. Esta tese é pra vocês, pai e mãe.
AGRADECIMENTOS
Início meus agradecimentos à Deus. Pois ele me concede a certeza de que somos
humanos e por isso estamos sempre em evolução e aprendendo. Me permite ser
misericordioso e perseverante, ter coragem e sabedoria pra melhor compreender as
alegrias e as tristezas da vida.
Quero agradecer minha família, minha mãe, meu pai e irmão por fazerem parte da
minha vida, por contribuírem no meu desenvolvimento pessoal e intelectual e sempre
serem a fonte de apoio inesgotável.
Agradeço muito o auxílio do meu marido e de meu filho. Os amores da minha
vida. Agradeço o carinho e a força nesta trajetória.
Meus sinceros agradecimentos ao meu orientador Eduardo Ropelle. Pelos
ensinamentos, dedicação e paciência em todo o processo do doutorado.
De modo muito importante, também quero agradecer aos alunos do Laboratório
de Biologia Molecular do Exercício (LABMEX). Ao laboratório de Fisiologia do
Exercício e Metabolismo (LAFEM) da USP de Ribeirão Preto e ao Laboratório de
Genômica Nutricional (LABGEN) da FCA. Agradeço também ao Laboratório da Profa.
Eliete da Unesp de Rio Claro.
Quero agradecer aos professores do programa de pós-graduação em ciências da
nutrição e do esporte e metabolismo da FCA pelas disciplinas ministradas e que muito
contribuíram na minha formação acadêmica.
Agradeço aos professores que fizeram parte da qualificação e defesa de tese pela
leitura, sugestões e críticas construtivas.
Novamente quero agradecer a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São
Paulo – FAPESP pelo apoio financeiro (processo n° 2013/21061-8).
RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar se o exercício físico agudo tem efeitos no
conteúdo da proteína Rock1 em hipotálamo e relacionar esse fenômeno com a
sensibilidade à insulina, leptina e regulação da ingestão alimentar de camundongos
obesos. Para alcançar os objetivos foram utilizados camundongos Swiss distribuídos nos
seguintes grupos: controle (CTL) animais que receberam uma dieta padrão; obesos
induzido por dieta rica em gordura (Hiper-SD) animais que receberam uma dieta rica em
gordura; e obeso exercitado agudamente (Hiper-EA) animais que receberam a dieta rica
em gordura e foram submetidos a um protocolo de exercício agudo. Foram realizadas
coletas de sangue para análise sanguínea de insulina e glicemia de jejum, a extração do
hipotálamo e análise das proteínas de interesse através da técnica de Western Blot. Os
dados foram analisados através de teste “t de Student”, quando comparados dois grupos.
E análise de variância (Anova), seguida do teste de múltiplas médias de Bonferroni,
quando apropriado para comparar os grupos controle e experimentais. A significância
estatística adotada foi de p<0,05. Os resultados obtidos mostram que camundongos
obesos apresentam alteração na via de sinalização da leptina e insulina no hipotálamo e
isso é acompanhado por alterações no conteúdo da proteína Rock e aumento da ingestão
alimentar. Ao contrário, os animais submetidos ao protocolo de exercício apresentaram
aumento na sensibilidade a leptina e insulina e maior conteúdo proteico de Rock1 no
hipotálamo se comparado a seus pares obesos não exercitados. Em adição, foram
observados aumentos de fosforilação de JAK2 e Akt, da associação JAK2 com Rock1 e
Rock1 com IRS-1 e também, aumento da fosforilação do IRS-1 em serina 632/635 no
hipotálamo. A luz desses achados, é possível considerar, no mínimo em parte, que
alteração nos níveis proteicos da proteína Rock1 no hipotálamo pode estar associado a
condição de redução da sensibilidade à leptina e insulina e aumento da ingestão alimentar
na obesidade. Por outro lado, o exercício físico foi capaz de agir positivamente sobre a
via da Rock e aumentar a sensibilidade tanto da leptina quanto da insulina no hipotálamo
e com isso atenuar a hiperfagia nos camundongos obesos. Tal descoberta amplia o
conhecimento acerca dos efeitos do exercício físico sobre processo de controle da fome
e abre portas para novas ações terapêuticas contra a obesidade e doenças associadas.
Palavras-chaves: Obesidade, insulina, leptina, exercício físico, hipotálamo, ingestão
alimentar e proteína Rock
ABSTRACT
The objective of this study was to evaluate the effects of acute physical exercise
on the expression of protein Rock1 in hypothalamus and to relate this phenomenon with
insulin and leptin sensitivity and food intake of obese mice. To achieve the objectives
Swiss mice were used in the control groups (CTL), animals that received a standard diet;
Obese-induced high-fat diet (Hyper-SD), animals that received a high- fat diet; And obese
exercised acutely (Hyper-EA), animals that received a high-fat diet and were submitted
an acute exercise protocol. Blood samples were collected for analysis of insulinemia and
glycemia fasting. Subsequently, hypothalamus extraction and Western blot analysis of
the proteins of interest were performed. The data were analyzed by Student's test, when
two groups were compared. And analysis of variance (Anova), followed by Bonferroni's
multiple means test, when appropriate for the controlled and experimental groups. The
statistical significance was set at p <0.05. The results show that obese mice present a
change in the signaling pathway of leptin and insulin in the hypothalamus and this
resulted were accompanied by not increased in content of Rock protein and increased
food intake. Contrary to the animals submitted to the acute exercise protocol showed
increased sensitivity to leptin and insulin and higher protein content of Rock1 in the
hypothalamus compared to their non-exercised obese mice. In addition, there was an
increases in phosphorylation of JAK2 and AKT proteins, the association of JAK2 with
Rock1 and IRS-1 with Rock1, and increased phosphorylation of IRS-1 in serine 632/635
in the hypothalamus. Considering these data, it is possible to consider, at least in part, that
protein levels of the Rock protein can be associated with a condition of reduced sensitivity
to leptin and insulin in hypothalamus and increased food intake in obesity. On the other
hand, physical exercise was able to act positively on a rock pathway and increase a
sensitivity of both leptin and insulin in hypothalamic neurons and attenuate hyperphagia
in obese mice. This discovery broadens the knowledge about the effects of physical
exercise on the process of food intake control and opens the door to new therapeutic
actions against obesity and associated diseases.
Key words: Obesity, insulin, leptin, exercise, hypothalamus, food intake and protein
Rock
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Via de transdução do sinal da insulina e leptina em neurônios
hipotalâmicos...................................................................................................................20
Figura 2. Ativação de vias inflamatórias e de estresse de retículo endoplasmático e os
efeitos inibitórios sobre a via da insulina e
leptina..............................................................................................................................23
Figura 3. Mecanismo de ação pelo qual a Rock regula a sinalização e o metabolismo de
glicose mediado pela insulina no músculo esquelético e aumenta a captação de
glicose..............................................................................................................................26
Figura 4. Esquema ilustrativo das etapas experimentais desenvolvidas no projeto de
pesquisa...........................................................................................................................31
Figura 5. Esquema ilustrativo do protocolo de exercício físico
agudo...............................................................................................................................33
Figura 6. Esquema ilustrativo do protocolo de análise de ingestão
alimentar.........................................................................................................................34
Figura 7. Ingestão alimentar em resposta ao estímulos com insulina ou leptina nos
diferentes grupos experimentais.......................................................................................40
Figura 8. Análise da via de sinalização da leptina e da Rock em hipotálamo nos diferentes
grupos experimentais.......................................................................................................42
Figura 9. Via de sinalização da insulina e associação da Rock com o IRS-
1.......................................................................................................................................45
Figura 10. Esquema ilustrativo da hipótese do efeito do exercício físico sobre o
metabolismo da Rock e a melhora na sinalização da insulina e leptina no
hipotálamo.......................................................................................................................52
LISTA DE ABREVIATURAS
AgRP – Peptídeo relacionado ao gene Agouti
Akt - Protein quinase B ou proteína serina/treonina quinase
APAF1 - Apoptotic peptidase activating factor 1
CART – Transcrito relacionado à cocaína e à anfetamina
CRH - hormônio liberador de corticotrofina
eIF2α - eukaryotic translation initiation factor 2A
FADD - Fas-Associated protein with Death Domain
Foxo1 - Fator de transcrição da família forkhead BOX O
IKK – Proteína Iκappa kinase
IL-1β – Interleucina-1β
IL-6 – Interleucina-6
IL-10 – Interleucina-10
IR – Receptor de insulina
IRS-1 – Substrato do receptor de insulina 1
IRS-2 – Substrato do receptor de insulina 2
JAK2 – Proteína Janus kinase 2
JNK – Proteína c-jun N-terminal quinase
MAPK – Proteína quinase ativada por mitógenos
MyDD88 - Myeloid differentiation primary response gene 88
NFκB – fator nuclear kappa B
NPY – Neuropeptídeo Y
PERK – Proteína quinase tipo PKR residente no retículo endoplasmático
PI3q – fosfatidilinositol 3-quinase
POMC - Pró-opiomelanocortina
PTP1B – Proteína tirosina fosfatase 1B
PDK – Proteína quinase dependente de fosfoinosítideos de membrana
Rock – proteína Rho-Kinase
SOCS3 - Proteína supressora da sinalização de citocinas
STAT3 - Proteína que transmite o sinal da superfície celular ao núcleo ativando a
transcrição nuclear
TLR4 - Receptor do Tipo Toll Like
SUMÁRIO
RESUMO.........................................................................................................................07
ABSTRACT....................................................................................................................08
LISTA DE FIIGURAS....................................................................................................09
LISTA DE ABREVIATURAS.......................................................................................10
INTRODUÇÃO..............................................................................................................13
Transmissão do sinal da insulina e leptina no hipotálamo..................................14
Obesidade e inflamação hipotalâmica.................................................................20
Papel da Rho-kinase (Rock) em mediar a sinalização da insulina e leptina.......25
Efeito protetor do exercício físico sobre a sinalização da insulina e leptina......27
OBJETIVOS....................................................................................................................30
Objetivos gerais...................................................................................................30
Objetivos específicos...........................................................................................30
MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................31
Animais experimentais.........................................................................................31
Implante das cânulas............................................................................................32
Protocolo de exercício físico e lactacidemia.......................................................33
Imunoblot............................................................................................................36
Análise estatística................................................................................................36
RESULTADOS...............................................................................................................38
DISCUSÃO.....................................................................................................................47
CONCLUSÕES...............................................................................................................53
REFERÊNCIAS..............................................................................................................54
13
1. INTRODUÇÃO
A obesidade é considerada um dos grandes fenômenos clínico-epidemiológicos da
atualidade e fatores como sedentarismo (inatividade fisiológica) e hábitos alimentares
inadequados (alimentos ricos em calorias e gordura saturada) desempenham papeis relevantes
na gênese da doença. O acúmulo excessivo de gordura corporal é considerado um fator crucial
para o desenvolvimento do risco cardiometabólico e está associado a doenças vasculares e do
coração, doenças respiratórias (como exemplo, asma), dislipidemias, esteatose hepática não
alcoólica, osteoartrite, síndrome dos ovários policísticos, alguns tipos de câncer, hipertensão e
diabetes mellitus tipo 2 (1-6). Desse modo, a obesidade constitui uma das mais importantes
questões de saúde pública e o desenvolvimento de diferentes abordagens terapêuticas para a
doença é um ponto de grande importância na sociedade atual.
Neste cenário, o cérebro ocupa lugar de destaque no desenvolvimento de obesidade,
tendo a insulina e a leptina papel relevante sobre o hipotálamo, um centro controlador da fome
e da termogênese (7). Alterações na sinalização intracelular dessas biomoléculas no hipotálamo
tem proeminente relação com o descontrole da fome e aumento da massa adiposa corporal (7,
8). Por outro lado, o exercício físico é um importante componente no controle do peso corpóreo
em longo prazo. A prática regular do exercício tem impacto não somente no gasto energético
diário, mas também, participa do processo de regulação da fome. De acordo com os estudos
científicos relacionados a esta temática, o exercício físico é capaz de regular positivamente
diversas proteínas envolvidas na transdução do sinal da insulina e leptina no sistema nervoso
central (9, 10). Parte desses efeitos positivos do exercício estão relacionados a miocinas
produzidas durante a contração muscular com efeitos anti-inflamatórios em neurônios
hipotalâmicos (9-12). Esses achados dão suporte à hipótese de que o efeito supressor do
exercício sobre a fome na obesidade possa ser mediado através do sistema nervoso central pelo
hipotálamo, sendo essencial para a redução da adiposidade ou a manutenção em longo prazo
do fenótipo magro.
Entretanto, embora seja crescente o número de evidências que suportam a
participação do exercício físico na modulação do sistema nervoso central para o controle das
respostas hiperfágicas decorrentes da obesidade, ainda não é totalmente compreendido os
mecanismos moleculares envolvidos neste processo. A hipótese desse trabalho de pesquisa é
de que o exercício físico além de efeitos anti-inflamatórios atrelados ao desfecho positivo sobre
a via de transdução do sinal da insulina e leptina, também tenha ação em outras moléculas
14
intracelulares envolvidos com um aumento na fosforilação de proteínas integrantes destas vias.
Com destaque ao papel da Rho-Kinase (Rock) que se estabelece como uma proteína com efeitos
positivos tanto sobre a via da insulina quanto da leptina, aumentando o sinal e os efeitos
biológicos destes dois hormônios a nível periférico e central do organismo (13).
Mediante um cenário caótico no qual ainda não há uma estratégica totalmente
efetiva de combate a obesidade, a descoberta e o entendimento de novas rotas de sinalização
intracelular, em especial, no centro regulador da fome (o hipotálamo), permitirá novas ações
contra a obesidade. Porém, antes de partirmos para o objetivo deste trabalho, se faz necessário
apresentar o conteúdo teórico relacionado ao tema de pesquisa aqui abordado, para que seja
possível, compreender os principais mecanismos envolvidos no processo de controle da fome
e termogênese e as adaptações decorrentes da obesidade e do exercício nesse complexo sistema.
1.1. TRANSMISSÃO DO SINAL DE INSULINA E LEPTINA NO HIPOTÁLAMO
Na década de 40 e 50, estudos realizados em animais com estimulação elétrica
permitiu a compreensão de que o cérebro e especificamente o hipotálamo consistia no centro
regulador da fome. Após estímulos em áreas específicas do hipotálamo (hipotálamo lateral e
núcleo paraventricular), verificou-se que animais (roedores e gatos) apresentavam um
comportamento hipofágico (fome atenuada) ou hiperfágico (fome acentuada), respectivamente
(14, 15). Em seguida, foi sendo compreendido que sinais provenientes da periferia como
adipócitos, sistema gastrointestinal e hormônios advindos de vários tecidos e órgãos ao
atingirem o hipotálamo participam da regulação da fome e do gasto energético (16). Os estudos
de parabiose (intercomunicação circulatória entre dois organismos) nesse período também
foram muito importantes no entendimento do fatores que comunicam o cérebro e, portanto,
regulam o controle da fome (17). Além disso, os trabalhos com a técnica de estereotaxia
permitiram elucidar melhor quais biomoléculas têm crucial papel no controle da ingestão
alimentar em animais (18). Foi então, que tanto a insulina como a leptina ganharam notório
destaque nesta função. Estas e outras questões serão abordadas no decorrer dessa revisão de
literatura.
A leptina é um hormônio peptídeo produzido principalmente no tecido adiposo
branco (proporcionalmente ao volume deste tecido) e, está envolvida no controle da ingestão
alimentar e no dispêndio de energia, atuando em células neuronais do hipotálamo (19). Este
15
hormônio possui uma estrutura semelhante a família das citocinas (20-23). Seu papel sobre o
controle da fome foi descoberto em estudos primários de parabiose, no qual um componente
ainda desconhecido presente no sistema circulatório de camundongos magros ao passar para o
sistema circulatório de um camundongo obeso (ob/ob) conduziu este animal a redução da massa
corporal (magresa) (17). Assim, definiu-se que esse componente pelo efeito robusto sobre a
perda de peso receberia o nome de leptina, termo que é derivado da palavra em latim “leptos”
que significa magro. Depois em 1994, em publicação que foi destaque na capa da revista
científica Nature, identificou-se o gene responsável pela síntese dessa citocina (leptina) no
organismo, com papel crucial sobre o controle da ingestão alimentar e gasto energético (24).
Portanto, alguns organismos deficientes do gene da leptina como os camundongos ob/ob podem
se beneficiar do tratamento com leptina.
O receptor de leptina ObRb foi identificado inicialmente e expresso de forma
abundante em neurônios do núcleo arqueado do hipotálamo, sendo responsável por receber e
iniciar a transdução do sinal da leptina no hipotálamo (25). O núcleo arqueado é constituído de
um número significativo de neurônios que recebem os estímulos de sinais provenientes da
periferia, sendo uma área de muito interesse pelos pesquisadores que estudam a obesidade.
Porém, não é a única área de importância e outras estruturas tem ganhado destaque nos últimos
anos. O receptor de leptina não possui atividade catalítica intrínseca e depende para propagação
do seu sinal de uma proteína intracelular chamada Janus quinase-2 (JAK-2). A JAK2 recebe
este nome em virtude da analogia com o Deus da mitologia grega chamado Janus. De acordo
com a mitologia Janus tinha duas faces, e como a proteína JAK é capaz de se conectar ao
receptor de leptina por um lado e de outro lado da molécula fosforilar a proteína STAT3,
conforme será descrito a seguir (26), recebeu esta denominação de proteína Janus Kinase ou
JAK. A conexão da leptina ao seu receptor promove o recrutamento de outra unidade de
receptor, induzindo mudança conformacional e ativação da JAK2 (27). Esse fenômeno resulta
na fosforilação da JAK2 em vários resíduos tirosina tornando-se ativa para que a seguir fosforile
e ative outra molécula de JAK-2 associada ao segundo receptor (25). Subsequentemente as
JAK-2 uma vez ativas catalisam a fosforilação dos receptores de leptina (ObRb) nos sítios de
tirosinas (28). Desse modo ocorre a transdução do sinal da leptina.
Nessa cascata de sinalização, cabe destacar que a leptina também promove o
recrutamento e a fosforilação das proteínas da família dos substratos do receptor de insulina
(IRSs) (29). Os IRSs (IRS-1 e IRS-2) fosforilados são responsáveis pela ativação da enzima
fosfatidilinositol 3-quinase (PI3q) que desempenha um papel relevante na transdução do sinal
16
da leptina (30, 31). Isso, porquê a ativação da via da insulina culmina na fosforilação e extrusão
do núcleo do fator de transcrição da família forkhead BOX O (FoxO1), levando a redução da
expressão de neuropeptídeos orexigênicos como o neuropeptídeo Y (NPY) e o peptídeo
relacionado ao gene agouti (AgRP). No entanto, outro sítio de ativação do receptor de leptina
leva ao recrutamento e ativação de moléculas da família de transdutores-e-sinal-e-ativadores-
de-transcrição (STATs, predominantemente STAT-3) responsáveis por conduzir o sinal gerado
pela leptina ao núcleo onde coordenam a transcrição de genes de neuropeptídeos responsivos
ao sinal hormonal (32). Nessa situação serão expressos os neuropeptídeos como o transcrito
relacionado à cocaína e à anfetamina (CART) (35) e o hormônio alfa-melanócito estimulador
(-MSH) derivado de POMC (proopiomelanocortina), relacionados aos efeitos anorexigênicos
do hormônio.
Após a ativação dos receptores de leptina no cérebro e das proteínas envolvidas na
transmissão do sinal desse hormônio, respostas neuronais integradas são necessárias para
modular a ingestão alimentar e o gasto energético. Alguns neuropeptídeos importantes para o
funcionamento dessa rede neuronal estimulam a ingestão alimentar como NPY (33) e o AGRP
(34), enquanto outros provocam redução da ingestão alimentar como o CART (35) e o -MSH
(36). Sabidamente, a leptina regula o balanço energético diminuindo os níveis de
neuropeptídeos anabólicos NPY e AGRP e aumentando a concentração de neuropeptídeos
catabólicos CART e -MSH. Esta regulação parece envolver também neurônios que expressam
ácido gama-aminobutírico (GABA) (neurônios GABérgicos) e glutamina (Glutaminérgicos)
localizado no hipotálamo. Estes neurotransmissores participam do controle da fome de maneira
muito relevante. Corroborando com isto, a expressão hipotalâmica da POMC está reduzida no
camundongo deficiente em leptina ob/ob e esta é aumentada pela suplementação por leptina
(37, 38, 39, 40). Em seguida, foi também observado que diversos fatores influenciam o sinal da
leptina, incluindo o hormônio insulina (41-44).
A insulina circula em níveis proporcionais ao conteúdo de tecido adiposo (atrelado
a resistência à ação ou secreção desse hormônio) e atravessa a barreira hematoencefálica
atingindo o hipotálamo (45). Os receptores de insulina são expressos em neurônios envolvidos
na ingestão alimentar e presentes no núcleo arqueado e outras áreas do hipotálamo (46, 47). A
administração de insulina diretamente no sistema nervoso central reduz a ingestão alimentar e
diminui a massa corporal, enquanto a deficiência desse hormônio causa hiperfagia (48). Cabe
17
salientar que a via de sinalização da insulina presente no hipotálamo é exatamente a mesma
presente em outros tecidos do organismo.
A correlação dos níveis séricos de insulina com o conteúdo de gordura corporal é
consequência da resistência à insulina induzida pelo aumento da adiposidade corporal (49).
Assim, à medida que o conteúdo de tecido adiposo no organismo aumenta a insulina deve
aumentar para compensar a resistência à insulina e manter a homeostase de glicose (50, 51).
Contudo, mesmo com altos níveis de insulina circulante é possível observar a deficiência na
transmissão do sinal desse hormônio no tecido hipotalâmico de roedores. Isso significa que a
resistência à insulina já muito bem conhecida na periferia também acontece no hipotálamo em
modelos de animais obesos como camundongos ob/ob e db/db ou ratos Zucher (52-54) e em
ratos Wistar alimentados com dieta hiperlipídica (54), demonstrando que fatores ambientais são
capazes de modular a via de sinalização da insulina no sistema nervoso central.
Estudos pioneiros que identificaram o receptor de insulina no sistema nervoso
central foram fundamentais para o progresso do entendimento sobre o papel da insulina sobre
o controle da fome, demonstrado que não é somente crucial em funções metabólicas em tecidos
periféricos (43, 55-58). Muitos desses avanços deve-se a utilização de equipamentos de
estereotaxia que permitem o implante de cânulas no sistema nervoso central que atingindo a
região do hipotálamo permite a micro infusão ou injeção de substâncias diversas e o estudo do
comportamento alimentar, incluindo a insulina. Mais recentemente outros equipamentos (como
por exemplo, lâminas de multi-cortes em matriz de aço coronal) tem permitido não só a análise
do hipotálamo mais de segmentos específicos desta região ampliando ainda mais o
conhecimento sobre esta área importante do cérebro em funções como controle da fome,
controle da sede, libido, entre outras.
Após a ligação da insulina ao seu receptor de membrana de estrutura
heterotetramérica ocorre uma alteração conformacional da molécula e a auto-fosforilação da
subunidade beta nos resíduos de tirosina (56, 59). Em seguida ocorre o recrutamento e a
fosforilação em tirosina de substratos do IR, os IRSs, principalmente o IRS-1 e o IRS-2 (41,
60). A fosforilação de IRSs promove a ligação e ativação da enzima PI3q (41, 60). Na sequência
a proteína quinase dependente de fosfoinoinosítedeos (PDK) e fosforilada e isso induz a
fosforilação da Akt. A Akt tem importante participação nos diferentes efeitos biológicos da
insulina, dentre eles, a Akt fosforila o fator de transcrição Foxo1 no hipotálamo, promovendo
a sua extrusão e isso diminui a transcrição de neuropeptídeos orexigênicos (NPY e AgRP).
18
Além disso, a insulina modula, em paralelo à a via de sinalização da leptina, com efeitos
anorexigênicos (61). Esta comunicação entre as vias da insulina e leptina e vice-versa é
denominado de inter-relação ou cross-talk. Em seguida conexões com outros neurônios
localizados no hipotálamo permitem a regulação da fome e do gasto energético.
Os neurônios presentes no núcleo arqueado do hipotálamo possui conexões axonais
com outros neurônios localizados em áreas como o hipotálamo lateral (LH), núcleo
paraventricular (NPV) e núcleo dorsomedial (DMH). Mais recentemente tem sido explorado
também o núcleo ventromedial (VMH). Ademais, estudos realizados pelo pesquisador Bradford
Lowell, têm demonstrado a presença de receptores de insulina e leptina em outras áreas do
cérebro, com participação no fino processo de controle da ingestão alimentar e do gasto
energético do organismo (39, 40). A identificação da participação de outras áreas do cérebro
nesse processo ocorreu através de experimentos em que foi realizado a deleção específica de
receptores de leptina em neurônios POMC do núcleo arqueado e ocorreu apenas um modesto
aumento na ingestão alimentar (40).
Estes achados permitem considerar que os receptores de leptina localizados em
neurônios POMC no arqueado não são exclusivamente responsáveis pela regulação da leptina
e homeostase do peso corporal e que estes receptores em outros neurônios em outras áreas do
hipotálamo também são importantes. Em adição, outras áreas como o núcleo do trato solitário
(NTS) tem sido sugerido como um importante local da ação anoréxica do leptina. Tais achados
tem expandido o conhecimento da ação da leptina e insulina sobre o controle a fome. Revelando
que experimentos adicionais serão necessários para melhor conhecer a ação dos hormônios no
controle da fome. Classicamente, no hipotálamo lateral existem neurônios que expressam orexina e
-MSH e no núcleo paraventricular localizam os neurônios que sintetizam o hormônio
liberador de corticotrofina (CRH) e o hormônio liberador de tireotrofina (TSH) (62-63). Através
destas conexões neuronais ocorrem o controle da fome e do gasto energético do organismo. Em
condição de jejum, neurônios que expressam NPY/AGRP encontram-se ativados e através de
conexões axonais com os neurônios de segunda ordem provocam à inibição da produção de
neurotransmissores anorexigênicos e ativadores da termogênese TSH e CRH no núcleo
paraventricular, e ativação da produção de neurotransmissores orexigênicos e inibidores da
termogênese (orexina e MCH) no núcleo hipotalâmico lateral (62-63). O desfecho final desta
regulação é o aumento da fome e a redução da termogênese. Ao contrário quando há
19
desregulação neste controle da fome exercido pelo hipotálamo têm-se aumento da fome e
redução do gasto energético. Assim no hipotálamo a ação da insulina e leptina isoladamente ou
em conjunto se mostra primordial para manutenção de um balanço energético equilibrado e
manutenção da massa corporal do organismo. Embora o entendimento sobre as ações da leptina
e insulina tenha avançado bastante ainda tem muito a que ser estudado. Destaca-se ainda que a
inter-relação (cross-talk) entre as vias de sinalização da leptina e insulina possui resultados
funcionais relevantes (29). De acordo com os estudos a via JAK2/STAT3 pode ser ativada por
insulina assim como a via IRS/PI3q pode ser ativada por leptina (62-63)).
Por outro lado, prejuízos na via de sinalização tanto da insulina quando da leptina
induzidos pela obesidade induzem alteração no controle da fome. Na prática, embora
organismos obesos apresentem um aumento tanto dos níveis de leptina quanto de insulina o
sinal destes hormônios se mostram prejudicados no hipotálamo, o que explica, no mínimo em
parte, a disfunção hipotalâmica e a hiperfagia associada ao aumento excessivo de massa
adiposa.
Atualmente se conhece alguns mecanismos que induzem a resistência à insulina e
leptina nos centros controladores da fome e que estão envolvidos com a hiperfagia e obesidade
(62-63). Há um processo inflamatório de baixa magnitude que é capaz de induzir descontrole
dos sinais de saciedade (64-67). Animais obesos induzidos por dieta rica em gordura
apresentam um aumento da expressão e da atividade de proteínas próinflamatórias no
hipotálamo, e este processo inflamatório seria o principal evento intracelular responsável pela
resistência central à insulina e à leptina em roedores, contribuindo com a hiperfagia e o
desenvolvimento da obesidade (68). Desta forma, faz-se importante o entendimento de como
ocorre o fenômeno de resistência à estes dois hormônios. A figura 1 representa um esquema
ilustrativo da via de sinalização da insulina e leptina no hipotálamo e o efeito em regular a
ingestão alimentar.
20
Figura 1. Via de transdução do sinal da insulina e leptina em neurônios hipotalâmicos. A
ligação da insulina a seu receptor de membrana induz uma cascata de sinalização intracelular
que culmina na ativação da Akt. A Akt por sua vez leva a fosforilação da Foxo1 nuclear e a sua
extrusão para o citoplasma. O fator de transcrição Foxo1 participa da transcrição de
neuropeptídeos oregxigênicos (NPY e AGRP) que aumentam a fome. Dessa maneira, a insulina
exerce seu efeito anorexigênio no hipotálamo. O hormônio leptina ao se ligar ao seu receptor
de membrana induz uma cascata de sinalização que culmina na migração do fator transcricional
STAT3 para o núcleo da célula neuronal. A proteína STAT3 no núcleo participa da transcrição
de neuropeptídeos denominados anorexigênicos (POMC e CART) que suprimem a fome.
Existe ainda uma inter-relação “Cross-Talk” entre estes dois hormônios e na presença de
leptina, a via de sinalização da insulina é acentuada. De maneira similar a via da JAK2 pode
ser intensificada na presença simultânea de insulina. Portanto, esses dois hormônios agindo
isoladamente ou em conjunto são responsáveis pelo controle da fome (redução) e aumento do
gasto energético. NPY, Neuropeptídeo Y, AGRP, peptídeo relacionado ao gene Agouti; POMC,
pró-ópiomelanocortina; CART, transcrito relacionado a anfetamina e cocaína. Foxo1, fator de
transcrição da família forkhead BOX O; JAK2, proteína Janus Kinase 2, STAT3, proteína que
transmite o sinal da superfície celular ao núcleo ativando a transcrição nuclear [Figura realizada
pelo próprio autor deste trabalho].
1.2. OBESIDADE E INFLAMAÇÃO HIPOTALÂMICA
Em 2005 foi observado que alterações inflamatórias são detectadas no sistema
nervoso central de animais obesos induzidos pela oferta de uma dieta hiperlipídica. De Souza
et al. (66) demonstraram que moléculas relacionadas à imunidade, incluindo citocinas
próinflamatórias como as interleucinas 1 e 6 (IL-1 e IL-6) e o fator de necrose tumoral alfa
(TNF, representaram a maior classe de genes com expressão hipotalâmica alterada após 16
semanas de dieta hiperlipídica. A via da c-jun N-terminal quinase (JNK) (66) e do complexo
21
Ikappa kinase/fator nuclear kappa B (IKK/NF-B), assim como indução de estresse do retículo
endoplasmático (ER estresse) (67, 69) são ativadas e relacionadas com prejuízos na sinalização
de insulina e leptina no hipotálamo nessa condição de obesidade induzida por oferta de uam
dieta rica em gordura saturada e hipercalórica..
A sinalização inflamatória pode influenciar a ação da leptina e da insulina no
hipotálamo de diversas maneiras. Em tecidos periféricos, IKK e JNK fosforilam os IRSs em
serina 307, tornando-o menos sensível aos sinais de transdução do receptor de insulina (inibição
da fosforilação em tirosina) (70-72). A administração intracerebroventricular de um inibidor da
IKK ou o exercício físico é capaz de reverter ou atenuar a resistência à insulina hipotalâmica
induzida por dieta hiperlipídica (9, 73). Além disso, a deleção do IKK ou da proteína que se
acopla ao Toll Like Receptor 4 (TLR4), a proteína MyD88 neuronal restaura sensibilidade à
insulina e leptina em camundongos submetidos a dieta hiperlipídica (74). Esses achados
permitiam compreender que estas vias inflamatórias podem ser alvos de ação contra a
hiperfagia e obesidade.
Outro mecanismo pelo qual a inflamação hipotalâmica está ligada a resistência à
insulina e leptina é através de auto-regulação do supressor de sinalização de citocinas SOCS3.
Um membro de uma família de proteínas originalmente caracterizada como reguladores de
feedback negativo de inflamação (70, 75). SOCS3 inibe a sinalização da insulina e a leptina por
ligação direta aos seus receptores (70-75). A ingestão de dieta hiperlipídica aumenta a expressão
SOCS3 hipotalâmica e isso está coincidentemente relacionado com o aparecimento de
resistência à leptina (28).
Assim como a SOCS3, a proteína tirosina fosfatase PTP1B é uma molécula de
interrupção de sinal que inibe a sinalização da leptina e insulina. Os mecanismos responsáveis
por estes efeitos envolve sua habilidade de desfosforilar o IR, a proteína JAK2 e outros
componentes das duas vias de sinalização (76). Dados recentes sugerem que dieta hiperlipídica
aumenta a expressão da PTP1-B em diversos tecidos, incluindo o hipotálamo (77, 79). A
ativação de IKK e a ativação do fator transcricional NF-B eleva os níveis de PTP1B que então
culmina com o desfecho negativo sobre a via de sinalização tanto de insulina como de leptina
no hipotálamo. Camundongos nocaute da PTP1B em todos os neurônios (78) ou
especificamente em neurônios POMC são resistentes a obesidade induzida por dieta rica em
gordura. Assim, alternativas terapêuticas capazes de bloquear a sinalização desta proteína
especificamente no hipotálamo pode ser algo promissor contra a obesidade.
22
O excesso de adiposidade na obesidade está atrelada a outro fenômeno que envolve
a participação do retículo endoplasmático (RE). O RE tem inúmeras funções relevantes, sendo
responsáveis pela biossíntese de lipídios e principalmente proteínas. Na condição de estresse
metabólico, como no estado de obesidade, a homeostase funcional do RE é rompida, levando
ao acúmulo de proteínas mal formadas (inoveladas) no seu interior. Nessa situação, as células
acometidas ativam um complexo sistema de sinalização conhecido como Unfolded Protein
Response (UPR). Sobre condição de estresse proteínas provenientes do RE tem ações negativas
na via de sinalização da insulina (80). Estes efeitos podem ocorrer também no sistema nervoso
central e desregular o controle da fome 80-81). Isso porque componentes do UPR (como por
exemplo, as proteínas eIF2fator de iniciação eucariótico 2) e PERK (Proteína quinase tipo
PKR residente no retículo endoplasmático)) desencadeiam ativação da serina quinase JNK e
IKK/NFB, exacerbando os efeitos inflamatórios da dieta hiperlipídica (81). Tais proteínas
também são sinalizadas a nível hipotalâmico ativando as mesmas quinases inflamatórias
envolvidas com prejuízos no sinal da insulina e leptina no hipotálamo.
Quando intervenções farmacológicas ou a realização de exercício físico tem se
mostrado capaz de inibir o estresse de RE em camundongos submetidos à dieta hiperlipídica e
diminuem a ingestão alimentar e peso corporal (9, 69). Ao contrário, a indução do estresse do
RE através de fármacos (tapsigargina) em neurônios resulta em hiperleptinemia, obesidade,
hiperfagia e redução de taxa metabólica associada com severa resistência à leptina hipotalâmica
(81). Caso a homeostase energética não seja restaurada, a UPR culmina com a indução de
mecanismos de morte (apoptose), recentemente descrita em hipotálamo (82). A figura 2, ilustra
de maneira resumida as vias inflamatórias e de estresse de retículo endoplasmático envolvido
no descontrole da fome na obesidade e consumo de dieta rica em gordura.
23
Figura 2. Ativação de vias inflamatórias e de estresse de retículo endoplasmático e os
efeitos inibitórios sobre a via de sinalização da insulina e leptina. A obesidade e o consumo
excessivo de gordura está atrelado ao aumento dos níveis de TNF-α. A ligação desta citocina
ao seu receptor leva a ativação de vias inflamatórias como das serinas quinases JNK e o IKK.
O IKK ao estar ativado, desencadeia a fosforilação do Iκβ e deste modo, sua dissociação do
fator de transcrição NFκB. Quando liberado, o NFκB se transloca para o núcleo e aumenta a
transcrição de citocinas pró-inflamatórias (IL1-β, iNOS, IL-6, TNF-α, etc.) e de outras proteínas
como a SOCS3 e a PTP-1B. A SOCS3 tem a capacidade de se ligar fisicamente a proteínas da
via da leptina (JAK2) e impede que estas proteínas sejam ativadas. Já, a PTP-1B, por ser uma
proteína tirosina fosfatase, induz a desfosforilação das proteínas JAK2, IR e IRS, diminuindo a
ativação da via da leptina e insulina e assim, sua ação inibitória sobre a fome. Já o estresse de
retículo endoplasmático induz a ativação das proteínas eIF2 e PERK que ativam o IKK
desencadeando o processo inflamatório e o prejuízo nas vias da insulina e leptina em neurônios
hipotalâmicos. IR, receptor de insulina; IRSs, substratos do receptor de insulina; PI3K,
fosfatilinositol 3-quinse; IKK, Ikappa Kinase; NF-B, fator nuclear Kappa B; TNF-, fator de
necrose tumoral alpha; ObR, receptor de leptina; JAK2, Janus Kinase 2; STAT3, proteína que
transmite o sinal da superfície celular ao núcleo ativando a transcrição nuclear; PTP1B, proteína
tirosina fosfatase 1B; eiF2, fator de iniciação eucariótico 2; PERK, Proteína cinase tipo PKR
residente no retículo endoplasmático. [Figura realizada pelo próprio autor deste trabalho].
No intuito de melhor compreender qual tipo de gordura saturada é capaz de induzir
o processo inflamatório, outro estudo muito elegante conduzido por Velloso e colaboradores
mostrou que a infusão de alguns tipos de ácidos graxos purificados, infundidos diretamente no
hipotálamo alterava o padrão de indução inflamatória (67). Ácidos graxos saturados e de cadeia
longa como o esteárico e araquídico foram mais prejudiciais do que gorduras como o palmítico..
Assim, o processo inflamatório induzido por alguns tipos de ácidos graxos no hipotálamo
24
prejudica a sinalização da insulina e leptina e favorece o estado de hiperfagia. As proteínas aqui
ativadas são as mesmas anteriormente descritas (IKK, JNK, SOCS3, PTP1B, e de estresse de
RE) presentes em tecidos periféricos e que também são encontradas no sistema nervoso central.
Perigosamente, a manutenção da inflamação de baixo grau pode levar a apoptose de neurônios
controladores da fome.
Entende-se hoje que o consumo de gordura alterando o padrão de resposta neuronal
a hormônios, altera o comportamento alimentar mediado pelo hipotálamo. Mais do que isso,
em 2012 foi demonstrado em humanos que, com apenas um dia de consumo de uma dieta rica
em gordura, o processo inflamatório é acionado (83). Isso significa que a manutenção de uma
dieta rica em gordura e hipercalórica levará a um estado de disfunção hipotalâmica e hiperfagia.
Neste momento é preciso compreender bem que a obesidade é uma doença nefária, que se
instala de forma silenciosa e insidiosa. Sendo que o hipotálamo parece ser uma região muito
sensível aos desajustes alimentares e com participação primária e efetiva para o aumento da
adiposidade corporal. Havendo a manutenção da obesidade e os desajustes hipotalâmicos existe
indicativos fortes que pode ocorrer morte de neurônios que controlam a fome, em especial
daqueles anorexigênicos em roedores (82). Embora sejam necessários mais estudos nessa área,
não é descartada a hipótese de que o processo apoptótico em células hipotalâmicas aconteça
também em seres humanos que fazem consumo permanente de alimentos com alto teor de
gordura saturada e que se tornam obesos (84). Isso redobra a necessidade de intervenções que
sejam capazes de prevenir e tratar a inflamação subclínica e a obesidade.
Embora seja reconhecido o grande avanço na área e na compreensão dos
mecanismos atrelados a disfunção hipotalâmica e na regulação da fome, não é ainda totalmente
conhecido os mecanismos pelos quais isso acontece e como se dá a interação entre eles. Além
disso, recente estudo demonstrou que o prejuízo na sinalização da leptina no hipotálamo poder
estar relacionado a menor expressão e atividade de uma proteína denominada Rho-Kinase
(Rock) que é capaz de interagir fisicamente com a JAK2 e com isso aumentar sua atividade,
causando a ativação de STAT3 e Foxo1 no hipotálamo (85). Sendo proposto que a presença de
Rock1 no hipotálamo potencializa a sinalização da leptina através da sinalização tanto da
STAT3 quanto da PI3q, provendo um novo mecanismo para o entendimento da ação central da
leptina na regulação do peso corporal. Em adição, esta proteína se mostra capaz também de
aumentar a fosforilação em serina 632/635 do IRS-1 e potencializar a sinalização da insulina
em tecidos periféricos (85). No entanto a ação da Rock diretamente sobre a via da insulina no
hipotálamo é desconhecido.
25
PAPEL DA RHO-KINASE (ROCK) EM MEDIAR A SINALIZAÇÃO DA INSULINA E
LEPTINA
A proteína Rho-Kinase (Rock) é uma serina/treonina quinase e possui duas
isoformas Rock1 ou alfa e Rock2 ou beta (86). Suas ações no organismo ainda não é totalmente
compreendido, mas são diversas. Esta molécula pode ser ativada pela ligação no domínio
RhoA/GTP ou pode ser inativa pela ligação RhoE/GTP (86). Assim RhoA seria a enzima
ativadora da molécula Rock e RhoE a enzima inativadora da Rock. Esse conhecimento tem
permitido estudar possíveis biomoléculas de ação regulatória sobre estas enzimas ampliando o
conhecimento sobre o metabolismo da Rock (entenda-se metabolismo da Rock como a via de
sinalização desta molécula e seus efeitos biológicos). A Rock está envolvida em várias funções
celulares tais como: captação de glicose, adesão celular, organização da actina, motilidade
celular e vascular e contração do músculo liso. Os primeiros estudos realizados envolvendo
proteínas da família Rho foram realizados na década de 90, por um grupo de autores que que
propuseram que proteínas da família Rho poderiam desempenhar a importante função de
transmitir sinais intracelulares em diferentes tecidos (87-89). A partir destes achados uma série
de estudos tem sido realizados para melhor compreender a função da Rock sobre o
metabolismo, especialmente sobre sua ação sobre a via da insulina e leptina em diversos tecidos.
Em estudo muito bem elaborado, Furukawa e colaboradores no ano de 2005
sugeriram que a proteína Rho Kinase poderia controlar a homeostase glicêmica através do
aumento da fosforilação da Akt tanto em células musculares bem como em adipócitos (90),
demostrando o possível potencial desta proteína em interagir com a via de sinalização da
insulina. Para isso, neste mesmo estudo os autores propõem o mecanismo de atuação da proteína
Rock em aumentar as fosforilação da Akt por fosforilar diretamente os substratos do receptor
de insulina 1 (IRS-1) em serina nos resíduos 632/635 (Figura 3). Segundo os autores, a proteína
Rock fosforila o IRS-1 em seus resíduos de serina 632/635, e isso promove a ativação da enzima
PI3q levando assim, ao aumento da captação de glicose pelo músculo esquelético. Cabe
ressaltar que diferentemente do mecanismo de fosforilação em serina no resíduo 307 induzido
por serina qunases como a JNK e IKK, Furukawa apresentou que a fosforilação dos resíduos
serin 632/635 aumenta a transdução do sinal da insulina no músculo esquelético (90). Em
adição, os autores mostraram que a inibição farmacológica da proteína Rock, por reduzir a
sinalização da insulina, reduz a captação de glicose em célula muscular e em adipócito e, ainda,
os autores concluem que quando inibida a Rock, pode levar ao estado de resistência à insulina
26
no músculo esquelético (90). Portanto, a fosforilação em serina do IRS-1 nos resíduos 632/635
leva a um aumento na transdução do sinal da insulina e seus efeitos biológicos.
Figura 3. Mecanismo de ação pelo qual a Rock regula a sinalização e o metabolismo de
glicose mediado pela insulina no músculo esquelético e aumenta a captação de glicose. A
Rock induz a fosforilação em serina dos resíduos 632/635 do substrato 1 do receptor de insulina
(IRS-1) e consequentemente aumenta a fosforilação da Akt no músculo esquelético. Como
consequência há um aumento na translocação de GLUT-4 para a membrana celular e do
aumento na entrada de glicose para o meio intracelular [Figura realizada pelo próprio autor
deste trabalho].
Outro estudo também importante ocorreu no final do ano 2000, onde pesquisadores
analisaram os efeitos da inibição da Rock1 em camundongos e mostraram que
independentemente deste ser macho ou fêmea, quando há a anulação da Rock1 desenvolvem a
resistência à insulina por apresentarem menor fosforilação do IRS-1 em serina 632/635 e com
isso menor ativação da PI3q (91). Em análises de tecido muscular de humanos, foi demonstrado
que após o estímulo com insulina não houve o aumento da fosforilação da Rock1 nos indivíduos
obesos diabéticos se comparados aos sujeitos magros (92). Ainda em indivíduos portadores de
diabetes, Nakamura et al., 2006, mostraram que indivíduos com concentrações elevadas de
glicose no sangue apresentaram maiores níveis de RNAm de insulina e com isso o aumento na
transcrição do gene de insulina por meio da supressão da via Rho-kinase, levando esses
indivíduos ao estado de hiperinsulinemia (93). Já os efeitos da proteína Rock em potencializar
27
a sinalização da insulina em hipotálamo são desconhecidos. As poucas evidências que existem
apontam um efeito positivo da proteína Rock agindo sobre a via de sinalização da leptina
hipotalâmica.
Depois de estudos mostrando a atuação da Rock em músculo e adipócito, Huang et
al., (2012) mostraram que a Rock1 também pode atuar como regulador central da leptina, por
se comportar como mediador intracelular específico deste hormônio no hipotálamo e assim,
regular o balanço energético. Neste estudo os autores identificaram Rock1 em duas distintas
populações de neurônios no núcleo arqueado do hipotálamo que são controladas pela leptina:
POMC e AgRP/NPY (85). No estudo verificaram que após infusão intracerebroventricular de
leptina, ocorreu aumento na atividade da Rock1 em camundongos C57BL/6 e ob/ob, mas não
para db/db mostrando assim que a atividade da Rock em decorrência da leptina é mediada pelo
receptor específico da leptina (85). Ainda, os autores mostraram que após a administração de
leptina a Rock1 induziu a fosforilação direta da JAK2 em resíduos de serina, que por sua vez
continuou a cascata de fosforilações dessa via incluindo STAT3 e PI3q no hipotálamo. Já
quando a Rock1 foi inibida em neurônios POMC, os animais aumentaram o consumo alimentar
diário e consequentemente a quantidade de tecido adiposo, mostrando assim que a Rock1 atua
também como forte controladora do balanço energético. Assim, a Rock seria capaz de se
associar tanto com o IRS-1 quanto com a JAK2 e aumentar a sinalização desses dois hormônios.
Mediante estes achados, parece evidente que a proteína Rock tem efeitos
importantes no controle metabólico e na sinalização da insulina e leptina, podendo estar
envolvida no desenvolvimento de algumas doenças, especialmente obesidade e diabetes
mellitus tipo 2 (94). Como o exercício físico tem efeitos positivos sobre a sinalização da insulina
e da leptina em células hipotalâmicas (9, 10), é possível que ele regule positivamente a Rock e
com isso melhore o sinal desses hormônios auxiliando no controle da fome. Dados ainda não
publicados de nosso laboratório tem evidenciado um papel positivo do exercício em regular a
Rock 1 e 2 no músculo esquelético de camundongos Swiss e ratos obesos.
28
EFEITO PROTETOR DO EXERCÍCIO SOBRE RESISTÊNCIA À INSULINA E
LEPTINA HIPOTALÂMICA
A prática do exercício físico está associada a atenuação do processo inflamatório
decorrente da obesidade com consequente melhoria da resistência à insulina e leptina (9, 10).
Trabalho com roedores revelou que o exercício pode aumentar temporariamente os níveis de
citocinas antiinflamatórias, tais como a IL-10, sem que haja mudança da massa corporal (9). A
IL-10 é uma citocina importante com efeitos biológicos múltiplos. Esta citocina regula a
ativação inflamatória em diferentes tipos de células, como monócitos/macrófagos e células T
através da inibição da transcrição e póstranscricional de toda a gama de citocinas
próinflamatórias (9).
Recentemente, nosso grupo focando no hipotálamo demonstrou que o exercício
físico melhora a sensibilidade à insulina e leptina (9, 10). Este fenômeno decorre de uma potente
atividade anti-inflamatória no tecido hipotalâmico desencadeado agudamente pelo exercício
(9). O exercício aumenta a concentração da citoquina anti-inflamatória, IL-10, no hipotálamo,
a qual inibe a sinalização da via IKK/NF-kB e o estresse de retículo endoplasmático, sendo
estes efeitos provenientes do aumento do aumento da miocina IL-6 e consequentemente IL-10
circulantes (9). A injeção diretamente no hipotálamo de anticorpo anti-IL-10 suprimiu o efeito
do exercício em aumentar a sinalização da insulina e leptina no hipotálamo.
Estudo com humano demonstrou que sessão única de exercício físico é capaz de
produzir um efeito sobre a ingestão alimentar em adolescentes obesos. Foi observado que o
exercício físico de moderada a alta intensidade (75% VO2máx) produz respostas positivas para
o controle da ingestão alimentar nesta população. Os adolescentes obesos que realizaram
exercício físico a 75% do VO2máx apresentaram redução da ingestão alimentar tanto no
almoço, como no jantar, quando comparados aos seus pares sedentários e aos indivíduos obesos
que realizaram exercício físico agudo de baixa intensidade (40% do VO2máx) (95). Esse
achado reforça os resultados primariamente encontrados em roedores.
Em estudo também com humanos Broom e colaboradores demonstraram que tanto
o exercício aeróbio de corrida a 70% do VO2máx por 60 minutos quanto o exercício resistido
a 80% de 1RM tiveram efeito supressivo sobre a ingestão alimentar e isso foi acompanhado por
menores níveis de grelina circulante (96). Mais relacionado ao nosso estudo, Petterson e
colaboradores que expos roedores a roda de atividade verificaram redução da ingestão
alimentar, do peso corporal e aumento da pSTAT3 em neurônios do núcleo arqueado
29
comparados aos animais não expostos a mesma atividade (97). Ao encontro a este estudo, Laing
e colaboradores verificaram que camundongos C57BL6 treinados em esteira rolante tiveram
aumento na pSTAT3 hipotalâmica (98).
Estes dados mostram que o exercício é uma ferramenta importante na prevenção e
no tratamento da obesidade, com efeitos importantes sobre os mecanismos relacionados ao
controle da fome em roedores (9, 10) e em humanos (95, 96). Além disso, é possível que o
exercício físico possa agir positivamente modulando outras proteínas envolvidas no sinal
molecular da insulina e da leptina no hipotálamo, regulando positivamente a proteína Rock. Tal
descoberta trará avanços consideráveis sobre os mecanismos pelo qual o exercício físico
promove benefícios no controle da ingestão alimentar e na massa corporal. Além disso, os
achados no presente estudo poderão auxiliar na criação de novas estratégias terapêuticas contra
a obesidade e doenças associadas.
30
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
O objetivo principal do estudo foi investigar o papel do exercício físico na regulação
da proteína Rock1 e os efeitos sobre a sinalização da insulina e leptina em hipotálamo de
camundongos obesos induzidos por dieta rica em gordura.
2.2. Objetivos Específicos
Investigar em diferentes grupos experimentais (controle, obeso e obeso exercitado
agudamente) os seguintes parâmetros nas diferentes etapas:
Etapa 1 – Caracterização do modelo experimental de obesidade induzido por dieta
hiperlipídica
A – Avaliar a evolução da massa corporal, comprimento corporal, índice de Lee
(relação peso/tamanho), ingestão hídrica e o peso do tecido adiposo epididimal dos animais
durante o experimento; B – Avaliar a sensibilidade à insulina através do teste de tolerância à
insulina; C – Investigar o efeito da infusão intracerebroventricular (i.c.v.) ou intraperitoneal
(i.p.) de insulina e leptina na ingestão alimentar de 24 horas; D – investigar a glicemia e
insulinemia; E – investigar a expressão proteica de Rock 1 no hipotálamo dos animais.
Etapa 2 – Avaliação da regulação da proteína Rock1 através da dieta hiperlipídica e do
exercício físico
F – Avaliar a associação entre as proteínas IRS-1/Rock1 e JAK2/Rock1 no
hipotálamo dos animais; G – Avaliar o nível proteico e a fosforilação das proteínas IRS-1,
JAK2, Akt, no hipotálamo após infusão i.c.v. de insulina e leptina.
31
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1.Animais experimentais.
Foram utilizados camundongos Swiss, com quatro semanas de idade, provenientes
do Centro de Bioterismo da UNICAMP (CEMIB). Os animais foram previamente pesados,
alocados em gaiolas individuais ou metabólicas quando necessário, e distribuídos em grupos de
acordo com a similaridade do peso corporal. Os animais receberam água e dieta ad libitum.
Foram acondicionados em ambiente com temperatura (21 °C ± 2) e fotoperíodo (12/12 horas
claro/escuro) controlados. Todos os experimentos foram iniciados após a aprovação do projeto
pelo comitê de ética e pesquisa da UNICAMP (n° do processo 4311-1).
3.2.Desenho Experimental.
O desenho experimental foi distribuído em duas fases, sendo a primeira delas
dividida em duas partes: o desenvolvimento do modelo experimental (indução de obesidade),
canulação hipotalâmica e o protocolo de exercício físico agudo. A segunda fase foi
caracterizada pela realização dos procedimentos experimentais incluindo avaliação dos
parâmetros metabólicos e extração do hipotálamo para análises moleculares. A figura 4,
representa um resumo esquemático das etapas experimentais.
Figura 4. Esquema ilustrativo das etapas experimentais desenvolvidas no projeto de pesquisa.
32
3.3.Fase 1: Preparo do Modelo Experimental:
Desenvolvimento de obesidade em animais submetidos à dieta hiperlipídica
(Hiper). A dieta que que induz obesidade é estruturada a partir de uma dieta normal para
roedores, proposta por Reeves et. al., em 1993, e adotada pelo American Institute of Nutrition
(AIN) como padrão (99). Esse modelo originalmente proposto possui 4% lipídios em sua
formulação, oriundos exclusivamente do óleo de soja. Animais que consumiram esta dieta
fizeram parte do grupo controle (C). Os animais se tornam obesos e resistentes à insulina à
partir do consumo de uma dieta semelhante à AIN, contudo, modificada em seu conteúdo de
lipídios. Esta dieta possuiu 35% de lipídios, sendo 4% oriundos do óleo de soja e os outros 31%
de gordura suína (banha) (100). Os animais que consumiram esta dieta fizeram parte dos grupos
chamados hiperlipídicos (Hiper), sendo os animais Hiper não exercitados considerados como
grupo sedentário (Hiper-SD) e o grupo submetido ao protocolo de exercício agudo considerado
Hiper exercitado agudamente (Hiper-EA). A oferta da dieta hiperlipídica aos grupos Hiper-SD
e Hiper-EA aconteceu por período de 8 semanas. Em seguida os animais foram canulados e em
seguida o grupo Hiper-EA foi submetido ao protocolo de exercício físico agudo.
3.3.1. Implante das Cânulas:
Os animais controles, Hiper-SD e Hiper-EA foram submetidos à anestesia com
ketamina na dose de 200ul/Kg, xilasina na dose de 400ul/kg, diazepan na dose de 200ul/Kg
misturados com 200ul de salina. Receberam paracetamol na dose de 200mg/kg de peso, diluído
em água. O procedimento foi iniciado quando os reflexos corneano e de retirada da pata a dor
estiverem abolidos. Os camundongos foram adequadamente posicionados no aparelho para
realização de cirurgia estereotáxica, após tricotomia e anti-sepsia da região craniana, realizamos
incisão inter-parietal de aproximadamente 1 cm de extensão. A seguir, o periósteo foi
divulsionado e com a calota craniana exposta, foi possível visualizar o Bregma Paxinos and
Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordennates). A implantação das cânulas obedeceu
às oordenadas estereotáxicas para alcance do terçeiro ventrículo hipotalâmico (antero posterior
-1.8 e profundidade -.0) previamente estabelecidas pelo atlas estereotáxico. Depois de
implantada, a cânula foi fixada ao crânio do animal om acrílico polimerizante. Após o período
de uma semana de recuperação da cirurgia estereotáxica, os animais foram submetidos a um
teste de resposta de ingestão hídrica subsequente ao tratamento com angiotensina II (2,0 μl de
solução 10-6 M) para avaliação da adequação da posição da cânula. Camundongos com resposta
33
positiva à angiotensina II foram selecionados. Os procedimentos foram realizados de acordo
com estudos prévios (9).
3.3.2. Protocolo de exercício físico agudo e lactacidemia
Todos os animais foram adaptados ao meio aquático. Para isso, os camundongos
(controle e Hiper-SD) foram colocados por três dias/semana ao meio líquido com água na
profundidade do tórax. Esse procedimento visou simular o estresse recebido pelos grupos
exercitados. Os ratos Hiper-EA foram aclimatizados por três dias (10 min por dia) ao meio
liquido. Em seguida, num único dia de experimento, os animais nadaram em grupos de 4 em
baldes plásticos de 45 cm de diâmetro e 70 cm de profundidade. A temperatura da água foi
mantida em 31-32°C. Os animais realizaram o exercício de natação em duas sessões de 3 horas,
separadas por 45 minutos de repouso (9). Para todas as análises da fase 2 foram utilizados
animais do grupo controle, obeso e obeso exercitado para devidas comparações. O Sacrifício
foi realizado imediatamente após a última sessão de exercício físico. O exercício foi realizado
no horário das 13:15 as 18:45 da tarde. Foi mensurado o lactato sanguíneo nas condições basal,
após a primeira sessão de exercício e ao final da segunda sessão de exercício. O sangue foi
coletado da cauda do animal. As concentrações de lactato sanguíneo foram determinadas pelo
método enzimático. A figura 5, representa um esquema ilustrativo da etapa do protocolo de
exercício físico agudo.
Figura 5. Esquema ilustrativo do protocolo de exercício físico agudo. Os camundongos do
grupo Hiper-EA realizaram duas sessões de 3 horas de exercício, separadas por um período de
45 minutos de recuperação e imediatamente ao término do exercício foram realizados os
procedimentos experimentais de interesse.
34
3.3.3. Tratamento intracerebroventricular e análise da ingestão alimentar
Os animais de todos os grupos experimentais foram privados de alimento por.7
horas (das 13:00h às 19:00h), sem restrição de acesso a água. Em seguida através de uma cânula
implantada no crânio atingindo o terceiro ventrículo hipotalâmico, os animais receberão a
injeção de veículo, insulina (200mU) ou leptina (10-6 M) (9), que ocorreu as 19:00 horas para
avaliar a ingestão alimentar dos animais. Assim, após os respectivos tratamentos, os animais
foram colocados em gaiolas metabólicas individuais. A ração foi previamente pesada. Após 12
horas, a ração consumida foi novamente avaliada, sendo a diferença entre as medidas
(pesagem), o valor referente a ingestão alimentar em gramas. Para comparação do consumo
alimentar entre os grupos os valores foram convertidos em quilocalorias (Kcal). A figura 6 traz
um resumo do protocolo realizado para análise da ingestão alimentar dos animais.
Figura 6. Esquema ilustrativo do protocolo de análise de ingestão alimentar
3.4. Fase 2: Demais procedimentos experimentais
3.4.1. Teste de tolerância à insulina intraperitoneal
O teste foi realizado ao final do período experimental dos protocolos descritos. O
alimento para os diferentes grupos de animais foram retirados seis horas antes do procedimento
e a primeira coleta de sangue equivaleu ao tempo 0 do teste. Após essa coleta, a insulina (2U/kg
de peso corporal) foi injetada intraperitonealmente e amostras de sangue foram coletadas pela
35
cauda nos tempos 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos para a determinação da glicemia. A velocidade
constante do decremento da glicose (Kitt) foi calculada usando a formula 0,693/t1/2. O t1/2 da
glicose foi calculado a partir da curva da análise dos mínimos quadrados da concentração da
glicose durante a fase de decaimento linear. Determinação da glicemia ocorreu através do uso
de glicosímetro portátil (Accu-Check – Roche).
3.4.2. Determinação da glicose e insulina sérica.
Os níveis séricos de insulina foram determinados através de kits colorimétricos
específicos - ELISA (Thermo Scientific Rockford, IL, EUA), conforme recomendação do
fabricante. A glicose no sangue foi determinada através de glicosímetro portátil (Accu-Check
– Roche).
3.4.3. Extração do tecido hipotalâmico
Os animais receberam previamente aos procedimentos cirúrgicos e de extração dos
tecidos injeção intraperitoneal (i.p.) de ketamina (50 mg/kg; Ketalar; Parke-Davis, Ann Arbor,
MI) e xilasina (20 mg/kg; Rompun; Bayer, Leverkusen), e eutanásiados por decapitação. Todos
os animais permaneceram em jejum de 7 horas antes dos procedimentos de extração dos tecidos.
Os animais que receberam o tratamento com insulina ou leptina tiveram a injeção desses
hormônios através da cânula implantada e atingindo o hipotálamo 20 minutos antes de serem
eutanásiados para a extração do hipotálamo e respectivas análises de biologia molecular.
Em seguida a caixa craniana foi aberta para a remoção do hipotálamo. Esse tecido
foi homogeneizado em tampão de imunoprecipitação contendo 1% de Triton X 100, 100 mM
de Tris (pH 7,4), 100 mM de pirofosfato de sódio, 100 mM de fluoreto de sódio, 10 mM de
EDTA, 10 mM de vanadato de sódio, 2 mM de PMSF e 0,1 mg/mL de aprotinina a 4 ºC. O
homogenato foi centrifugado à 11000 rpm por 30 minutos. No sobrenadante foi determinada a
concentração de proteína utilizando o método proposto por Bradford (101) e posteriormente foi
realizada a determinação do extrato total e o ensaio de imunoprecipitação com anticorpo
específico.
3.4.4. Imunoprecipitação
Após determinação da concentração das proteínas foi realizada a
imunoprecipitação com anticorpo específico (Rock1). Após incubação, os imunocomplexos
36
foram recuperados com Proteina A Sepharose 6 MB por 2 horas à 4 ºC e decantados por
centrifugação por 20 minutos à 4 ºC/ 11000 rpm. O precipitado foi lavado três vezes, em
intervalos de 5 minutos, com tampão de lavagem (2 mM ortovanadato de sódio, 100 mM Tris-
HCl; 1 mM RDTA; 0,5% Triton X-100). O sobrenadante foi descartado, ficando-se apenas
com as proteínas precipitadas (imunocomplexos).
3.4.5. Imunoblot
Os imunocomplexos foram ressuspensos em tampão de Laemmli, contendo 100
mmol/L de DTT. Após rápida fervura foram aplicados em gel de poliacrilamida para separação
por eletroforese (SDS-PAGE). As proteínas separadas em SDS-PAGE foram transferidas para
membrana de nitrocelulose em aparelho de transferência da BIO-RAD. A membrana de
nitrocelulose foi incubada “overnight” com anticorpo especifico. A ligação de anticorpo a
proteínas não-específicas foi minimizada pela pré-incubação da membrana de nitrocelulose
com tampão de bloqueio (5% de leite em pó desnatado; 10 mmol/L de Tris; 150 mmol/L de
NaCl; 0.02% de Tween 20) por 1,5 hora. Posteriormente, as membranas foram incubadas por 2
horas na temperatura ambiente com o anticorpo secundário referente às especificações dispostas
no pelo primeiro anticorpo utilizado. O sinal foi detectado por tratamento com 2 mL de solução
quimioluminescente do reagente de quimioluminescência SuperSignal® West Pico
Chemiluminescent Substrate, da Pierce Reagents, expostos a filmes fotossensíveis de RX
Kodak e revelados por método tradicional. As bandas identificadas na autoradiografia foram
quantificadas através de densitometria óptica.
3.4.6. Anticorpos
O anticorpo utilizado para imunoprecipitação foi anti-Rock1 (Santa Cruz
Biotechnology, CA, USA). Os anticorpos utilizados para o imunoblot foram anti-phospho-IRS-
1 (Ser632 e 635), anti-Akt, antiphospho-Akt (Ser473), anti-JAK2, anti-phospho-JAK2
(Tyr1007) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), anti-IRS-1, antiphospho-IRS-1, Anti-
Rock1, e GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA).
3.4.7. Análise Estatística
Todos os resultados foram expressos como média ± DP. Os resultados dos
“Westerns blot ou imunoblot” foram apresentados como comparações diretas das bandas
proteicas nas autorradiografias ou avaliadas por equipamento fotodocumentador. Os dados
foram analisados através de teste “t de Student”, quando comparados dois grupos. E análise de
variância (Anova), seguida do teste de múltiplas médias de Bonferroni, quando apropriado para
37
comparar os grupos controle e experimentais. A significância estatística adotada foi de p<0,05.
O programa STATISTICA 6.0 foi empregado para efetuar as análises.
38
4. RESULTADOS
A seguir são apresentados os resultados obtidos com os diferentes grupos
experimentais (C, controle; Hiper-SD, obesos sedentários; e Hiper-EA, obesos sedentários
exercitados agudamente). Os dados foram expressos como média ± DP seguido do número
indicado dos experimentos. Na tabela 1 são apresentados os resultados fisiológicos e de
composição corporal dos animais.
Tabela 1. Caracterização da amostra.
Variáveis/Grupo C OB OB-E
Massa Corporal Inicial (g) 18,2 ± 0,5 18,0 ± 0,8 18,19 ± 1,0
Massa Corporal Final (g) 43,0± 1,5 52,1 ± 1,4* 52,4± 1,7*
Ganho de Massa Corporal (g) 24,7± 1,7 34,1± 1,8* 34,2 ± 2,2*
Comprimento (cm) 11,1 ± 0,2 11,2 ± 0,2 11,3 ± 0,3
Gordura epididimal (mg) 281,8 ± 12,6 371,6 ± 8,3* 376,0± 9,4#
Glicemia de jejum (mg/dL) 123,6 ± 4,1 250,4 ± 13,8* 214.7 ± 14,2*#
Insulinemia de jejum (ng/mL) 1,9 ± 0,2 4,5 ± 0,7* 3,5 ± 0,3*#
kITT (% consumo/min) 4,7 ± 0,3 2,6 ± 0,4* 3,6 ± 0,4*#
Lactato Basal (mmol/L) ND ND 1,12 ± 0,8
Lactato após 1° sessão de esforço
Lactato após 2° sessão de esforço
ND
ND
ND
ND
4,18 ± 0,5**
4,70 ± 0,4**
Resultados expressos como média e DP. n = 10 animais por grupo. *p<0.05 versus controle. E
** versus condição basal. KITT, constante de decaimento da glicose durante o teste de
tolerância à insulina. ND, não determinados.
Na Tabela 1, estão apresentados os dados comparativos dos grupos controle (C);
obeso sedentário dieta hiperlipídica (Hiper-SD); e obeso exercitado agudamente dieta
hiperlipídica (Hiper-EA). Os grupos de animais obesos tiveram maior aumento da massa
corporal quando comparados ao grupo controle. Isto mostra que a dieta hiperlipídica utilizada
foi eficiente em induzir obesidade nos animais. O comprimento (distância focinho-ânus) não
diferiu entre os grupos. O peso da gordura epididimal foi significativamente maior para os
grupos que receberam a dieta hiperlipídica quando comparado ao grupo controle. Confirmando
39
assim a indução de obesidade induzida pelo consumo da dieta rica em gordura. Na análise
sanguínea, verifica-se que o grupo de animais obesos tiveram valores de glicemia maior se
comparado ao grupo controle. Resultados similares foram encontrados para a concentração de
insulina nos animais. Sendo observado aumento na concentração de insulina nos animais obesos
em relação ao grupo controle. No entanto este parâmetro foi reduzido nos animais exercitados
se comparados aos seus pares obesos não exercitados no mesmo período. Tal fato, está atrelado
ao efeito do exercício em induzir adaptações moleculares que favorecem o aumento da captação
de glicose e com isso a redução da secreção de insulina endógena. Na análise da sensibilidade
à insulina através do teste de tolerância à insulina, verifica-se que os animais do grupo obeso
apresentaram menor consumo de glicose por minuto durante o teste se comparado ao grupo
controle. Por outro lado, o exercício físico agudo foi capaz de aumentar a sensibilidade à
insulina durante o teste (tabela 1). Por fim, nas análise da lactato sanguíneo observa-se que os
valores de lactato aumentaram em relação a condição basal tanto após a primeira sessão de
exercício quanto após a segunda sessão de esforço. No entanto, os valores observados
encontram-se abaixo da lactacidemia referente ao limiar anaeróbio em exercício de natação para
roedores. Sendo este um indicativo de que o protocolo de exercício é caracterizado pelo volume
alto e intensidade sub-máxima. Barras representam media e desvio padrão de n = 10 animais.
*p<0.05 versus controle.
Em seguida, foram realizados os experimentos de análise da ingestão alimentar dos
animais tanto após o estímulo com insulina quanto após o estímulo de leptina. Os resultados
permitem observar que os camundongos obesos (Hiper-SD) tiveram uma maior ingestão
alimentar (consumo em calorias) se comparado aos camundongos controles (Figura 7A e 7B).
No entanto, os animais que foram submetidos ao protocolo de exercício físico agudo (Hiper-
EA) quando estimulado com insulina ou leptina (i.c.v.) se comparado a condição sem estímulo
(sem infusão dos hormônios) tiveram uma supressão da fome e a ingestão alimentar reduziu
significativamente. No entanto, observa-se que nos animais obesos (Hiper-SD) que não
realizaram o protocolo de exercício físico que não houve diferença significativa na ingestão
alimentar no comparativo antes e após a infusão de insulina ou leptina. Isto demonstra que a
obesidade induzida pela dieta rica em gordura induziu distúrbios hipotalâmicos nos
mecanismos de controle da fome.
40
Figura 7. Ingestão alimentar em resposta ao estímulos com insulina (7A) ou leptina
(7B) nos diferentes grupos experimentais.
Figura 7. (A) Ingestão alimentar de 12 horas após estímulo com insulina ou (B) leptina
intracerebroventricular (i.c.v.) nos diferentes grupos experimentais: C, grupo controle; Hiper-
SD, grupo obeso induzido por dieta hiperlipídica (DHL) ofertada por 8 semanas; Hiper-EA,
grupo obeso induzido por DHL ofertada por 8 semanas e submetido ao protocolo de exercício
físico agudo (n=10 por grupo). A análise foi realizada em porcentagem de variação em relação
ao grupo controle. p<0.05 *diferença intra-grupo (comparação com o mesmo grupo na
condição com e sem estímulo) negativo (-) e em relação ao grupo Hiper-EA.
0
1 0
2 0
3 0
In g e s tã o A lim e n ta r
(K
ca
l)
C o n t ro l e
H ip e r -S D
H ip e r -E A
- + - + - +In s u lin a :
**
A
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
In g e s tã o A lim e n ta r
(Kc
al)
C o n t ro l e
H ip e r -S D
H ip e r -E A
- + - + - +L e p tin a
*
*
B
41
Após as análises fisiológicas, de composição corporal e de ingestão alimentar foram
realizados os ensaios de Western Blot para a avaliação da transdução do sinal tanto da leptina
quanto da insulina no hipotálamo dos animais. Como pode ser observado na Figura 8A os
camundongos obesos (Hiper-SD) se mostraram menos responsivos a leptina em relação aos
animais controles (magros). Isto pode ser observado através da menor fosforilação da proteína
JAK2 hipotalâmica nos animais obesos se comparados aos animais controles. Em conjunto,
verifica-se que o conteúdo de Rock1 e a associação de Rock1 com a JAK2 no hipotálamo está
reduzida nos animais obesos (Hiper-SD) se comparado aos animais controles. Tal resultado
demonstra que a obesidade está atrelada a uma supressão da via da Rock no hipotálamo e
consequentemente da via de sinalização da leptina. Ao contrário, os animais obesos exercitados
(Hiper-EA) apresentaram um aumento na fosforilação da JAK2 e da associação Rock1/JAK2
após estímulo com leptina no hipotálamo quando comparados aos animais obesos (Figura 8B).
Isto demonstra que o exercício físico é capaz de modular a proteína Rock e isto parece ter um
efeito positivo sobre a via da leptina.
42
Figura 8. Análise da via de sinalização da leptina e da Rock em hipotálamo nos
diferentes grupos experimentais.
0
5 0
1 0 0
1 5 0
M e ta b o lis m o d a J A K /R o c k 1 H ip o ta lâ m ic a
(% d
e e
xp
re
ss
ão
)
C o n tro le
H ip e r-S D
p J A K 2 R o c k 1 R o c k 1 / J A K 2
*
*
*
43
Na Figura 8 estão apresentados os dados da fosforilação e conteúdo total da poteína Jak2,
conteúdo total da protéina Rock1 e da associação entre as proteínas Rock1 e Jak2 no hipotálamo
dos animais controles, Hiper-SD e Hiper-EA com estímulo de leptina intracerebroventricular
(i.c.v.). A análise foi realizada em porcentagem de variação em relação ao grupo controle.
Barras representam media e desvio padrão (n = 7 animais por grupo). Resultados relativizados
* p<0.05 versus controle ou Hiper-SD.
+ + + + + + + + + + + + + +
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
M e ta b o lis m o d a J A K /R o c k 1 H ip o ta lâ m ic a
(% d
e e
xp
re
ss
ão
)
H ip e r-S D
H ip e r-E A
p J A K 2 R o c k 1 R o c k 1 / J A K 2
*
* *
44
Figura 9. Via de sinalização da insulina e associação da Rock com o IRS-1. Foram
realizados também os ensaios de Western Blot para a avaliação da transdução do sinal da
insulina no hipotálamo dos diferentes grupos experimentais. Os resultados obtidos foram
dispostos na figura 9. Pode-se verificar que os camundongos obesos (Hiper-SD) se mostraram-
se menos responsivos a insulina em relação aos animais controles (magros). Isto pode ser
observado através da menor fosforilação em tirosina da proteína IRS-1 hipotalâmica nos
animais obesos se comparados aos animais controles. (Figura 9A). Em conjunto, verifica-se
que o conteúdo de Rock1 e a associação de Rock1 com o IRS-1 no hipotálamo está reduzido
nos animais obesos se comparado aos animais controles. Tal resultado demonstra que a
obesidade está atrelada a uma diminuição do metabolismo da Rock no hipotálamo e
consequentemente da via de sinalização da insulina. Ao contrário, os animais obesos
exercitados (Hiper-EA) apresentaram um aumento na fosforilação do IRS-1 em tirosina e da
associação Rock1/IRS-1 após estímulo com insulina no hipotálamo quando comparados aos
animais obesos (Figura 9B). Tal fato é um indicativo que a proteína Rock parece exercer efeito
positivo sobre a via de sinalização da insulina e pode ser regulada pelo exercício físico.
45
Figura 9. Análise da via de sinalização da insulina e da Rock em hipotálamo nos
diferentes grupos experimentais.
0
5 0
1 0 0
1 5 0
E x p re s s ã o d a R o c k e d a v ia d a in s u lin a
(% d
e e
xp
re
ss
ão
)
C o n tro le
H ip e r-S D
p IR S -1
T y r 6 1 2
R o c k 1 R o c k /
IR S -1
p - IR S -1
S e r 6 3 2 /6 3 5
p -A K T
S e r 4 7 3
* * *
*
*
46
Na Figura 9 estão apresentados os dados da fosforilação (resíduos Tyr612 e Ser 632/635) e
conteúdo total da poteína IRS-1, conteúdo total da protéina Rock1 e da associação entre as
proteínas Rock1 e IRS-1 no hipotálamo dos animais controles, Hiper-SD e Hiper-EA com
estímulo de insulina intracerebroventricular (i.c.v.). Barras representam media e desvio padrão
(n = 7 animais por grupo). A análise foi realizada em porcentagem de variação em relação ao
grupo controle. * p<0.05 versus controle ou Hiper-SD.
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
E x p re s s ã o d a R o c k e d a v ia d a in s u lin a
(% d
e e
xp
re
ss
ão
)
H ip e r-S D
H ip e r-E A
p IR S -1
T y r 6 1 2
R o c k 1 R o c k /
IR S -1
p - IR S -1
S e r 6 3 2 /6 3 5
p -A K T
S e r 4 7 3
* *
*
**
47
5. DISCUSSÃO
A compreensão da atuação de novas moléculas na via de sinalização da leptina e
insulina no hipotálamo se faz importante para melhor compreensão do estado de resistência a
estes hormônios e distúrbios relacionados aos descontrole da fome e obesidade. No presente
estudo em resumo observou-se que animais obesos apresentam menor atividade da proteína
Rock em neurônios hipotalâmicos, promovendo redução da fosforilação da JAK2 e do IRS-1
no resíduo Ser 632/635 e no resíduo Tyr612 com consequente redução da fosforilação da Akt.
Nossos resultados reforçam a ideia do papel relevante da ação da Rock em contribuir com a
regulação da fome no hipotálamo como proposto por Huang e colaboradores em 2012 (85).
Além disso, os resultados encontrados confirmaram a hipótese de nosso trabalho tendo o
exercício físico efeitos positivos na regulação da proteína Rock no hipotálamo e redução da
ingestão alimentar nos camundongos obesos.
O conjunto de dados obtidos demonstram que animais obesos, após serem
submetidos ao protocolo agudo de exercício físico aeróbio, conseguem minimizar os
transtornos no metabolismo da Rock decorrentes da obesidade induzida pelo consumo de dieta
rica em gordura. Concatenando estes achados, verifica-se que o exercício físico promoveu
maior associação entre as proteínas Rock1 com JAK2 e Rock1 com IRS-1, levando ao aumento
na fosforilação da Akt e consequentemente maior fosforilação do IRS-1 nos resíduos de serina
632/635. Um dado importante que deve ser apresentado é que estes resultados obtidos
ocorreram independente de alterações na massa corporal e adiposa dos animais. Estes dados
sugerem um novo mecanismo de atuação do exercício físico na via de sinalização da insulina e
leptina através do aumento da atividade da Rock e consequentemente num melhor controle da
ingestão alimentar de animais obesos.
As avaliações realizadas permitem considerar que a dieta rica em gordura foi eficaz
em induzir obesidade nos animais. Tal fato foi acompanhado pelo aumento da massa corporal
e adiposa epididimal. Estes resultados estão de acordo com outros estudos da literatura e do
nosso grupo (9, 10, 66, 67, 82, 97). Ademais, os animais cumpriram o tempo de 6 horas de
exercício físico sem nenhum problema sendo identificado. As amostras de sangue extraídas dos
animais durante o exercício foram utilizadas para dosagem do lactato. Os resultados obtidos
demonstram que a intensidade de exercício foi sub-máxima, caracterizando o esforço como
sendo de baixa intensidade e volume alto. Dados prévios do nosso grupo tem mostrado que os
valores de lactato não estão acima de 5 mmol para este protocolo de exercício, indicando que a
intensidade não é superior ao limiar anaeróbio dos animais (9, 103). Nos parâmetros
48
fisiológicos os resultados obtidos mostram que os animais obesos têm valores maiores de
glicemia e insulinemia se comparado aos animais magros. Resultados que também foram
encontrados em estudos prévios do nosso grupo e na literatura com este tipo de dieta (9, 10, 66,
67, 82, 97). Por outro lado, o exercício físico agudo foi capaz de reduzir os valores de glicemia
e insulinemia dos animais. Tal fato foi também acompanhado de melhora na sensibilidade à
insulina verificado através do teste de tolerância à insulina no grupo de animais obesos
exercitados. Estes resultados foram dispostos na tabela 1. Com isso, é possível considerar que
a dieta rica em gordura ofertada induziu alterações na composição corporal como aumento da
adiposidade e alteração na sensibilidade à insulina, com declino na taxa de decaimento da
glicose por minuto. No mais, os resultados observados a seguir para os experimentos de western
blot podem ser considerados como efeitos do exercício físico agudo e não de mudança na
composição corporal. Já que os animais exercitados não apresentaram alteração na massa
corporal total se comparados aos seus pares controles.
O papel da proteína Rock vem sendo bastante investigado primeiramente por atuar
diretamente na sinalização da insulina e também por apresentar ações tecido-específicas que
ainda não foram totalmente compreendidas A ação positiva da Rock sobre a via de transdução
do sinal da insulina é ainda incerto, já que estudos mostram que suas ações divergem estre os
tecidos muscular, adiposo e hepático, etc. (84). Na década de 90. Farah e colaboradores
sugeriram que a Rock se associa diretamente com IRS-1 (104), adiante Begum propôs que a
Rock, após ser ativada pela enzima RhoA é ativada e fosforila o IRS-1 em serina, inibindo
assim a sinalização da insulina em tecidos de músculo vascular liso (105). No entanto, ao
contrário, Furukawa e colaboradores, mostraram que em tecido muscular esquelético a Rock
contribui de maneira positiva com a sinalização da insulina e por conseguinte com a captação
de glicose por fosforilar o IRS-1 no resíduo SER 632/635 (90). E que a inibição da Rock no
músculo prejudica a transdução do sinal da insulina (90).
No presente trabalho pode-se considerar que animais obesos sedentários
apresentam redução no conteúdo e na atividade da Rock no hipotálamo, colaborando com a
redução da sinalização da insulina e leptina, com consequente aumento no balanço energético
positivo (aumento da ingestão alimentar) e indução de obesidade. Estes dados obtidos estão de
acordo com outros estudos realizados com análise do papel da Rock em tecidos periféricos. Por
exemplo, estudo de Lee e colaboradores em 2009, demonstrou aumento da resistência à insulina
e redução da tolerância à glicose após deleção da Rock 1 em todo o organismo e mostrou que
na ausência da Rock há redução da fosforilação de proteínas cruciais envolvidas na sinalização
da insulina, a partir do IRS-1 Ser 632/635, sucessivamente com a redução da associação do
49
IRS-1 com PI3q, da fosforilação de Akt e da fosforilação do substrato da Akt de 160 KDa
(AS160) (91). Complementando tais evidências, em trabalho que fez uso de amostras de
humanos, Chun e co-autores mostraram que indivíduos obesos e diabéticos apresentam redução
da atividade da Rock, com consequente redução da atividade de moléculas envolvidas na
sinalização da insulina no tecido muscular (92). Logo, parece indubitável o papel da Rock em
colaborar com a sinalização da insulina no tecido muscular esquelético. Futuros experimentos
com inibidor da Rock ou técnicas de biologia molecular que permitem silenciar o gene ou fazer
a superexpressão desta proteína no hipotálamo poderão aumentar o conhecimento a respeito de
suas ações e interações com a via molecular da leptina e da insulina no hipotálamo.
Embora a atuação do exercício físico em aumentar a fosforilação e atividade de
moléculas pertencentes a via da insulina e leptina seja clara, em contrapartida o mecanismo
pelo qual este aumento ocorre ainda não foi completamente proposto na literatura,
principalmente quando se trata de neurônios hipotalâmicos. No presente estudo pressupôs que
a proteína Rock, através de sua capacidade em fosforilar diretamente o IRS-1 e a JAK2, poderia
ser um elo importante entre o exercício físico com proteínas proximais da via de sinalização da
insulina e leptina. Os estudos realizados até o presente momento demonstraram um efeito
positivo do exercício principalmente agindo sobre proteínas de ação pró-inflamatórias e
portanto, inibitórias sobre diferentes pontos da via de sinalização dos hormônios insulina e
leptina. Poucos são os estudos que visaram investigar o efeito do exercício sobre proteínas de
efeito positivo aos sinais desses hormônios. Como esperado, constatou-se que após a prática de
exercício houve aumento na atividade da via da insulina e leptina e tal acontecimento foi
atrelado ao aumento na fosforilação das principais proteínas envolvidas na transdução do sinal
dessas biomoléculas (IRS/Akt e JAK2), o que já está bem estabelecido na literatura.
Porém, o principal achado deste estudo foi obter fortes evidências da participação
da proteína Rock neste mecanismo. Nossos dados sugerem que em resposta ao exercício a Rock
participa da regulação da homeostase energética em animais obesos através do aumento da
fosforilação em SER 632/635, o que acontece pelo aumento da associação da Rock1 com o
IRS-1 e aumento da associação da Rock1 com a JAK2 no tecido hipotalâmico. Tal fato está
associado com menor hiperfagia o que pode contribuir a médio e longo prazo com a redução da
adiposidade corporal e aumento da sensibilidade à insulina e leptina. Tal tentativa de analogia
e interpretação pode ser reforçado pelos achados de Huang e colaboradores, que utilizaram de
um inibidor da Rock (Y-27632) e verificaram que após o tratamento ocorreu redução da
atividade da proteína Rock e menor fosforilação da JAK2 no hipotálamo de roedores (85).
50
De acordo com a literatura há inúmeras biomoléculas que podem aumentar ou
diminuir a atividade da Rock. A investigação destas biomoléculas podem ampliar o
conhecimento do efeito do exercício sobre o metabolismo da Rock e sobre o sistema nervoso
central. Dentre as proteínas candidatas pode-se destacar a PTP1B, PTEN e PDK1 que foram
analisadas em tecido muscular esquelético. Tendo estas proteínas supracitadas possível papel
relevante na conexão entre obesidade, resistência à insulina e metabolismo da Rock (106, 107,
108, 109,110).
A proteína PTB1B é uma fosfatase que está envolvida com o metabolismo da RhoA
(enzima ativadora de Rock). Constatou-se que em resposta ao tratamento com RhoA, houve
uma redução significativa da atividade da PTP1B. Assim sendo, fica evidente que RhoA reduz
a atividade de PTP1B (104). No presente estudo, não foi avaliado os níveis de RhoA, porém o
aumento desta enzima em resposta ao exercício físico poderia explicar o aumento da ativação
da Rock e inibição da PTP1B no hipotálamo contribuindo com o aumento na sinalização da
insulina e leptina. Em estudos prévios do grupo foi demonstrado que o exercício físico é capaz
de reduzir a expressão de PTP1B no hipotálamo de roedores obesos e isso foi acompanhado
pelo aumento na fosforilação de JAK2 hipotalâmica (106).
A phosphatase and tensin homolog (PTEN) é outra molécula que tem ação negativa
sobre a via de sinalização da insulina. Sua ação negativa se dá pela sua interação com a PI3q e
consequente desregulação da Akt no músculo (104, 108). Ao contrário, o exercício físico é
capaz de reduzir os níveis desta proteína significativamente, conforme demonstrado por Ma e
colaboradores (109). Assim sendo, a redução dos níveis de PTEN permite um aumento na
transdução do sinal da insulina. Isso por que o aumento da ativação de RhoA induz o aumento
da atividade da Rock. Por sua vez, a Rock é capaz de fosforilar a PTEN, promovendo sua
migração para o centro do citoplasma. Agora distante da membrana celular não há interação
entre a PTEN e a PI3-q. No entanto, quando a Rock foi inibida, foi observado maior conteúdo
de PTEN próximo a membrana celular e consequentemente, maior resistência à insulina.
Portanto, não se descarta a hipótese de que o efeito do exercício físico sobre a PTEN também
possa acontecer a nível do sistema nervoso central. O que explicaria o aumento na atividade e
expressão da Rock em resposta ao exercício de natação utilizado no presente estudo. No
entanto, novos ensaios serão necessários para melhor elucidar este mecanismo intracelular no
hipotálamo e seus efeitos no controle da ingestão alimentar..
Além destas proteínas supraciatadas, a quinase 1 dependente de fosfoinosítideos
(PDK1) também parece exercer efeito sobre o metabolismo da Rock. Através de sua ligação ao
PIP3 é capaz de mediar a fosforilação da Akt e com isso modular a via da insulina. Estudos
51
prévios realizados demonstraram que animais obesos apresentam redução dos níveis de PDK1
(108, 110). De acordo com a literatura, a proteína PDK pode se associar a Rock e com isso
inibir a associação da Rock com RhoE (enzima inibidora da ativação da Rock) e
consequentemente reduzir a inibição da Rock (110). Portanto, sabendo que o exercício é capaz
de agir positivamente sobre a via de sinalização da insulina é possível que sua ação em aumentar
a fosforilação da PDK impeça que a RhoE exerça efeito inibitório sobre a Rock, explicando o
aumento da atividade e expressão da Rock no hipotálamo observada no presente trabalho. No
entanto, estas são hipóteses que precisam ser investigadas afim de conhecer se o exercício físico
regula estas proteínas em neurônios do hipotálamo.
Além disso, é preciso considerar que a Rock apresenta duas isoforma, a Rock1 e a
Rock 2. No presente estudo foi investigado especialmente a Rock1. Huang descreve que a
Rock1 estaria presente em neurônios hipotalâmicos com papel chave no controle da fome (85).
Neste estudo os autores identificaram Rock1 em duas distintas populações de neurônios no
núcleo arqueado do hipotálamo que são controladas pela leptina: POMC e AgRP/NPY (85). Os
mesmos autores ainda verificaram que após infusão intracerebroventricular de leptina, ocorreu
aumento na atividade da Rock1 em camundongos C57BL/6 e ob/ob, mas não para db/db
mostrando assim que a atividade da Rock em decorrência da leptina é mediada pelo receptor
específico da leptina (85). Ainda, os autores mostraram que após a administração de leptina a
Rock1 induziu a fosforilação direta da JAK2 em resíduos de serina, que por sua vez continuou
a cascata de fosforilações dessa via incluindo STAT3 e PI3q no hipotálamo. Já quando a Rock1
foi inibida em neurônios POMC, os animais aumentaram o consumo alimentar diário e
consequentemente a quantidade de tecido adiposo, mostrando assim que a Rock1 atua como
relevante mecanismo envolvido no controle do balanço energético. Em acordo a estes achados,
os dados da presente proposta mostram que o aumento na expressão da Rock1 foi associada
com aumento na atividade das proteínas envolvidas com o sinal molecular da insulina e da
leptina, indo de encontro com os achados prévios de Huang. No entanto, se faz necessário
investigar mais a fundo o papel da Rock2 no hipotálamo.
Na luz destes achados, pode-se sugerir que a proteína Rock tem efeitos importantes
no controle metabólico e na sinalização da insulina e leptina no hipotálamo, podendo estar
envolvida no desenvolvimento de algumas doenças, especialmente obesidade e diabetes
mellitus tipo 2. O exercício físico se mostra capaz de agir positivamente sobre o metabolismo
da Rock aumentando a responsividade de neurônios reguladores da fome a insulina e leptina.
52
A figura 10 representa um esquema ilustrativo da hipótese do efeito do exercício físico sobre o
metabolismo da Rock e a melhora na sinalização da insulina e leptina no hipotálamo.
Figura 10. O exercício físico de natação aumentou o conteúdo da proteína Rock e a associação
dela com a JAK2 e o IRS-1 aumentando a transdução do sinal dos hormônios leptina e insulina,
respectivamente, no hipotálamo contribuindo com a homeostase energética em camundongos
obesos [Figura realizada pelo próprio autor deste trabalho].
.
53
CONCLUSÃO
Conclui-se através dos resultados obtidos no presente trabalho que o exercício físico
aeróbio de natação foi capaz de regular o metabolismo da proteína Rock1 sugerindo ser este
um mecanismo atrelado ao aumento na transdução do sinal da insulina e leptina no hipotálamo
de camundongos Swiss obesos induzidos pela oferta de uma dieta rica em gordura saturada.
Este se mostra como um novo mecanismo de ação do exercício físico em regular a sinalização
da insulina e leptina e induzir melhoras na homeostase energética do organismo.
54
REFERÊNCIAS
1. NCD-RisC NRFC. 2016. Trends in adult body-mass index in 200 countries from 1975 to
2014: a pooled analysis of 1698 population-based measurement studies with 19.2 million
participants. Lancet 387; (10026): 1377-1396.
2. Bhurosy, T. 2014. Overweight and Obesity Epidemic in Developing Countries : A Problem
with Diet, Physical Activity, or Socioeconomic Status ? The scientific World Journal, 964236.
3. Brown, R. E. et. al. 2015. Consequences of obesity and weight loss: a devil’s advocate
position. Obesity Reviews, 16, 77–87.
4. DeMarco VG; et. al. 2014. The pathophysiology of hypertension in patients with obesity.
Nature Review Endocrinology, 10 (6), 364-376.
5. Park J. et. al. 2014. Obesity and cancer-mechanism underlaying tumour progression and
recurrence. Nature Review Endocrinology, 10 (8), 455-65.
6. Must, A et al. 1999. The disease burden associated with overweight and obesity. JAMA.
282(16): 1523-9.
7. Yu, JH et al. 2012. Molecular mechanisms of appetite regulation. Diabetes Metab J.
36(6):391-8.
8. Morton, GJ et al. 2006. Central nervous system control of food intake and body weight.
Nature 443:289–295.
9. Ropelle, ER et al. 2010. IL-6 and IL-10 anti-inflammatory activity links exercise to
hypothalamic insulin and leptin sensitivity through IKKbeta and ER stress inhibition. PLoS
Biol. 24;8(8), e1000465.
10. Rodrigues Bde A et. al. 2015. Acute Exercise Decreases Tribbles Homolog 3 Protein Levels
in the Hypothalamus of Obese Rats. Med Sci Sports Exerc. 47(8):1613-23.
11. Bi, S et al. 2005. Running wheel activity prevents hyperphagia and obesity in Otsuka long-
evans Tokushima Fatty rats: role of hypothalamic signaling. Endocrinology 146:1676-1685.
12. Ropelle, E.R et al. 2008. Central exercise action increases the AMPK and mTOR response
to leptin. PLoS One 3:e3856.
55
13. Huang H et al. 2013. Metabolic actions of Rho-kinase in periphery and brain. Trends
Endocrinol Metab. 24(10):506-14.
14. Hetherington AW et al 1939. Ranson SW. Experimental hypothalamico-hypophyseal
obesity in the rat. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. Exp Biol
Med (New York, N.Y.). 41(2):465-6.
15. Anand BK et al. 1951. Brobeck JR. Hypothalamic control of food intake in rats and cats.
Yale J Biol Med. 24(2):123-40.
16. Kennedy GC. 1953. The role of depot fat in the hypothalamic control of food intake in the
rat. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 140(901):578-96.
17. Coleman DL. 1973. Effects of parabiosis of obese with diabetes and normal mice.
Diabetologia.9(4):294-8.
18. Carvalheira JB. et al. 2003. Selective impairment of insulin signalling in the hypothalamus
of obese Zucker rats. Diabetologia.46(12):1629-40.
19. Friedman, JM et al. 1998. Leptin and the regulation of body weight in mammals. Nature
395: 763-770.
20. Sinha, MK et al. 1996. Ultradian oscilations of leptin secretion in humans. Biochemical and
biophysical Research Communications 228: 733-738.
21. Maurigeri, D et al. 2002. The leptin, a new hormone of adipose tissue: clinical findings and
perspectives in geriatrics. Archieves of Gerontology and Geriatrics 34: 47-54.
22. Tartaglia LA. 1997. The leptin receptor. J Biol Chem 272: 6093-6096.
23. Chua, SC Jr et al. 1996. Phenotypes of mouse diabetes and rat fatty due mutations in the
OB (leptin) receptor. Science 271: 994-996.
24. Zhang Y, et al. 1994. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue.
Nature. 372(6505):425-32.
25. Tartaglia LA. 1997. The leptin receptor. J Biol Chem 272: 6093-6096
26. Bjorbaek, C et al. 1997. Divergent signaling capacities of the long and short isoforms of
the leptin receptor. J Biol Chem 272: 32686-32695.
56
27. Zabeau, L et al. 2003. The ins and outs of leptin receptor activation. FEBS lett 546; 45-50.
28. Munzberg, H et al. 2005. Molecular and anatomical determinants of central leptin
resistance. Nat Neurosci 8: 566-570.
29. Kelerrer, M et al. 1997. Leptin activates PI3 kinase in C2C12 myotubes via janus kinase-2
(JAK-2) and insulin receptor substrate-2 (IRS-2) dependent pathways. Diabetologia 40:1358-
1362.
30. Xu, AW et al. 2005. PI3K integrates the action of insulin and leptin on hypothalamic
neurons. J Clin Invest 115: 951-958.
31. Bjorbaek, C et al. 2001. Divergent roles of SHP-2 in ERK activation by leptin receptors. J
Biol Chem 276: 4747-4755.
32. Bjorbaek, C et al. 2004. Kahn BB. Leptin signaling in the nervous system and the periphery.
Recent Prog Horm Res 59: 305-331.
33. Stephens, T.W. et al. 1995. The role of neuropeptide Y in the antiobesity action of the obese
gene product. Nature 377:530-532.
34. Shutter, J.R et al. 1997. Hypothalamic expression of CART, a novel gene related to agouti,
is up-regulated in obese and diabetic mutant mice. Genes Dev 11:593-602.
35. Kristensen P et al. 1998. Hypothalamic CART is a new anorectic peptide regulated by
leptin. Nature 393:72-76.
36. Fan, W et al. 1997. Role of melanocortinergic neurons in feeding and the agouti obesity
syndrome. Nature 385:165-168.
37. Mizuno, TM et al. 1998. Hypothalamic pro-opiomelanocortin mRNA is reduced by fasting
and [corrected] in ob/ob and db//db mice, but is stimulated by leptin. Diabetes. 47(2):294-7.
38. Schwartz, MW et al. 1997. Leptin increases hupothalamic pro-opiomelanocortin mRNA
expression in the rostral arcuate nucleus. Diabetes. 46(12):2119-23.
39. Saper CB et al. 2014. The hypothalamus. Curr Biol. 2014 Dec 1;24(23):R1111-6.
40. Krashes MJ et al. 2016. Melanocortin-4 receptor-regulated energy homeostasis. Nat
Neurosci. 19(2):206-19.
57
41. Carvalheira, JB et al. 2001. Insulin modulates leptin-induced STAT3 activation in rat
hypothalamus. FEBS lett 500: 119-124.
42. Carvalheira, JB et al. 2003. Interaction between leptin and insulin signaling pathways
differentially affects JAK-STAT and PI3-kinase-mediated signaling in rat liver. Biol Chem
384: 151-159.
43. Woods, S.C et al. 1979. Chronic intracerebroventricular infusion of insulin reduces food
intake and body weight of baboons. Nature 282:503-505.
44. Woods, S.C et al. 1985. Insulin: its relationship to the central nervous system and to the
control of food intake and body weight. Am J Clin Nutr 42:1063-1071.
45. Baura, G.D et al. 1993. Saturable transport of insulin from plasma into the central nervous
system of dogs in vivo. A mechanism for regulated insulin delivery to the brain. J Clin Invest
92:1824-1830.
46. Baskin D.G et al. 1988. Insulin and insulin-like growth factors in the CNS. Trends Neurosci
11:107-111.
47. Baskin, D.G et al. 1999. Leptin receptor mRNA identifies a subpopulation of neuropeptide
Y neurons activated by fasting in rat hypothalamus. Diabetes 48:828-833.
48. Sipols, A.J et al. 1995. Effect of intracerebroventricular insulin infusion on diabetic
hyperphagia and hypothalamic neuropeptide gene expression. Diabetes 44:147-151.
49. Schwartz, M.W et al. 1997. Evidence that plasma leptin and insulin levels are associated
with body adiposity via different mechanisms. Diabetes Care 20:1476-1481.
50. Polonsky, K.S et al. 1988. Twenty-four-hour profiles and pulsatile patterns of insulin
secretion in normal and obese subjects. J Clin Invest 81:442-448.
51. Kahn, S.E et al. 1993. Quantification of the relationship between insulin sensitivity and
beta- cell function in human subjects. Evidence for a hyperbolic function. Diabetes 42:1663-
1672.
52. da Silva, B.A et al. 1998. Functional properties of leptin receptor isoforms containing the
gln-- >pro extracellular domain mutation of the fatty rat. Endocrinology 139:3681-3690.
58
53. Lee, G.H et al. 1996. Abnormal splicing of the leptin receptor in diabetic mice. Nature
379:632-635.
54. El-Haschimi, K. et al. 2000. Two defects contribute to hypothalamic leptin resistance in
mice with diet-induced obesity. J Clin Invest 105:1827-1832.
55. Kasuga, M. et al. 1982. Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit
of its own receptor. Science 215:185-187.
56. Saltiel, A.R. et al. 2001. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid
metabolism. Nature 414:799-806.
57. Havrankova, J. et al. 1979. Concentrations of insulin and insulin receptors in the brain are
independent of peripheral insulin levels. Studies of obese and streptozotocin-treated rodents. J
Clin Invest 64:636-642.
58. Margolis, R.U et al. 1967. Insulin in the cerebrospinal fluid. Nature 215:1375-1376.
59. White, M.F. 1997. The insulin signalling system and the IRS proteins. Diabetologia 40
Suppl 2:S2-17.
60. Torsoni, M.A et al. 2003. Molecular and functional resistance to insulin in hypothalamus
of rats exposed to cold. Am J Physiol Endocrinol Metab 285:E216-223.
61. Plum, L et al. 2005. The role of insulin receptor signaling in the brain. Trends Endocrinol
Metab 16:59-65.
62. van de Sande-Lee et al. 2012. Hypothalamic dysfunction in obesity. Arq Bras Endocrinol
Metabol. 56(6):341-50.
63. Araujo EP et al. 2016. Mechanisms in endocrinology: Hypothalamic inflammation and
nutrition. Eur J Endocrinol. 175(3):R97-R105.
64. Velloso, L.A et al. 2008. Diet-induced inflammation of the hypothalamus in obesity.
Neuroimmunomodulation 15:189-193.
65. Yang, L. et al. 2008. Stressing the brain, fattening the body. Cell 135:20-22.
66. De Souza, C.T et al. 2005. Consumption of a fat-rich diet activates a proinflammatory
response and induces insulin resistance in the hypothalamus. Endocrinology 146:4192-4199.
59
67. Milanski, M et al. 2009. Saturated fatty acids produce an inflammatory response
predominantly through the activation of TLR4 signaling in hypothalamus: implications for the
pathogenesis of obesity. J Neurosci 29:359-370.
68. Yang, L. et al. 2008. Stressing the brain, fattening the body. Cell 135:20-22.
69. Zhang, X et al. Hypothalamic IKKbeta/NF-kappaB and ER stress link overnutrition to
energy imbalance and obesity. Cell 2008;135:61–73.
70. Myers, M.G et al. 2008. Mechanisms of leptin action and leptin resistance. Annu Rev
Physiol 70:537-556.
71. Schenk, S et al. 2008. Insulin sensitivity: modulation by nutrients and inflammation. J Clin
Invest 118:2992-3002.
72. Shoelson, S.E et al. 2006. Inflammation and insulin resistance. J Clin Invest 116:1793-1801.
73. Posey, K.A et al. 2009. Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation,
and insulin resistance in rats fed a high-fat diet. Am J Physiol Endocrinol Metab 296:E1003-
1012.
74. Zhang, X et al. Hypothalamic IKKbeta/NF-kappaB and ER stress link overnutrition to
energy imbalance and obesity. Cell 2008;135:61–73.
75. Howard, J.K et al. 2004. Enhanced leptin sensitivity and attenuation of diet-induced obesity
in mice with haploinsufficiency of Socs3. Nat Med 10:734-738.
76. Zabolotny, J.M et al. 2008. Protein-tyrosine phosphatase 1B expression is induced by
inflammation in vivo. J Biol Chem 283:14230-14241.
77. Bence, K.K et al. 2006. Neuronal PTP1B regulates body weight, adiposity and leptin action.
Nat Med 12:917-924.
78. Banno, R et al. 2010. PTP1B and SHP2 in POMC neurons reciprocally regulate energy
balance in mice. J Clin Invest 120:720-734.
79. Picardi, PK et al. Modulation of hypothalamic PTP1B in the TNF-alpha-induced insulin
and leptin resistance. FEBS Lett. 2010 Jul 16;584(14):3179-84.
60
80. Flamment M et al. 2012. New insights into ER stress-induced insulin resistance. Trends
Endocrinol Metab. 23(8):381-90.
81. Ozcan, L et al. 2009. Endoplasmic reticulum stress plays a central role in development of
leptin resistance. Cell Metab 9:35-51.
82. Moraes, J.C et al. 2009. High-fat diet induces apoptosis of hypothalamic neurons. PLoS
One 4:e5045.
83. Thaler JP et al. 2012. Obesity is associated with hypothalamic injury in rodents and humans.
J Clin Invest. 2012 Jan;122(1):153-62.
84. van de Sande-Lee S. 2011. Partial reversibility of hypothalamic dysfunction and changes in
brain activity after body mass reduction in obese subjects. Diabetes. 60(6):1699-704.
85. Huang, H et al. 2012. Rho-kinase regulates energy balance by targeting hypothalamic leptin
receptor signaling. Nat Neurosci. 15:1391-8.
86. Leung, T et al. 1995. A novel serine/threonine kinase binding the Ras-related RhoA GTPase
which translocates the kinase to peripheral membranes. J Biol Chem. 270(49):29051-4.
87. Chong, LD. et. al. 1994. The small GTP-binding protein Rho regulates a
phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase in mammalian cells. Cell 79, 507-513.
88. Takai, Y et al. 2005. Rho small G protein and cytoskeletal control. Princess Takamatsu
Symp. 24:338-50, 1994.
89. Riento K et al. 2003. RhoE binds to ROCK I and inhibits downstream signaling. Mol Cell
Biol. 23(12):4219-29.
90. Furukawa, N et al. Role of Rho-kinase in regulation of insulin action and glucose
homeostasis. Cell Metabolism 2:119-129, 2005.
91. Lee, DH et al. 2009. Targeted disruption of ROCK1 causes insulin resistance in vivo. J Biol
Chem. 284:11776-80.
92. Chun, KH et al. 2011. In vivo activation of ROCK1 by insulin is impaired in skeletal muscle
of humans with type 2 diabetes. Am J Physiol Endocrinol Metab. 300:E536-42.
61
93. Nakamura, Y et al. 2006. Marked increase of insulin gene transcription by suppression of
the Rho/Rho-kinase pathway. Biochem Biophys Res Commun. 350:68-73.
94. Zhou, H et. al. 2011. Long-term diabetic complications may be ameliorated by targeting
Rho kinase. Diabetes Metab Res Rev 27: 318-330.
95. Thivel, D et al. 2012. The 24-h energy intake of obese adolescents is spontaneously reduced
after intensive exercise: a randomized controlled trial in calorimetric chambers. PLoS One.
7:e29840.
96. Reeves, PG et al. 1993. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the
American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A
rodent diet. J Nutr. 123:1939-51.
97. Broom DR et al. 2008. Influence of resistance and aerobic exercise on hunger, circulating
levels of acylated ghrelin, and peptide YY in healthy males.Am J Physiol Regul Integr Comp
Physiol. 296: 29-35.
98. Patterson CM et al. 2009. Three weeks of postweaning exercise in DIO rats produces
prolonged increases in central leptin sensitivity and signaling. Am J Physiol Regul Integr Comp
Physiol296(3):R537-48.
99. Laing BT et al. 2016. Voluntary exercise improves hypothalamic and metabolic function in
obese mice. J Endocrinol. 229(2):109-22.
100. Pauli, JR et al. 2008. Acute physical exercise reverses S-nitrosation of the insulin receptor,
insulin receptor substrate 1 and protein kinase B/Akt in diet-induced obese Wistar rats. J
Physiol. 15;586(2):659-71.
101. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities
of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 7;72:248-54, 1976.
102. Wang W et al. 2012. Mitochondrial fission triggered by hyperglycemia is mediated by
ROCK1 activation in podocytes and endothelial cells. Cell Metab. 8;15(2):186-200.
103. Da Silva AS et al, 2010. Exercise intensity, inflammatory signaling, and insulin resistance
in obese rats. Med Sci Sports Exerc. 42(12):2180-8.
62
104. Farah S, Agazie Y, Ohan N, NgSee JK, Liu XJ: A rho-associated protein kinase, ROK-
alpha binds insulin receptor substrate-1 and modulates insulin signaling. J Biol Vhem. 273:
4740-4746, 1998.
105. Bergum N, Sndu OAIM, Lohmann SM, Sinolenski A: Active Rho kinase (ROCK alpha)
associates with insulin receptor substrate-1 and inhibits insulin signaling in vascular smooth
muscle cells. J Biol Chem, 277: 6214-6222, 2002.
106. Chiarreotto-Ropelle EC, Pauli LS, Katashima CK, Pimentel GD, Picardi PK, Silva VR, de
Souza CT, Prada PO, Cintra DE, Carvalheira JB, Ropelle ER, Pauli JR. Acute exercise
suppresses hypothalamic PTP1B protein level and improves insulin and leptin signaling in
obese rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2013 Sep 1;305(5):E649-59, 2013.
107. Liu F et al. 1996. Direct binding of the proline-rich region of protein tyrosine phosphatase
1B to the Src Homology 3 domain of p130Cas. J Biol Chem, 271, 31290-31295.
108. Nakashima N et al. 2000. The tumor suppressor PTEN negatively regulates insulin
signaling in 3T3-L1 adipocytes. J Biol Chem, 275, 12899-12895.
109. Ma Z e tal. 2013. Swimming exercise training-induced left ventricular hypertrophy
involves microRNAs and synergistic regulation of the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. Eur
J Appl Physiol, 113, 2473-2486.
110. Pinner S et al. 2008. PDK1 regulates cancer cell motility by antagonism inhibition of
ROCK1 by RhoE. Nat Cell Biol 10, 127-137.
