M E T A B O L I S M OEstequiometria e balanço de fluxos

(em perspectiva sistêmica)

Notas de Aula

Manuel Mateus Ventura

Brasília, 2006

2

• M E T A B O L I S M O• Estequiometria e balanço de fluxos

• (em perspectiva sistêmica)

• Notas de Aula (apresentação em MS - ppt) por Manuel Mateus Ventura

• Brasília, 2006

3

• Estas notas de aula visam apresentar aos• estudantes de graduação e, particularmente,• aos de pós-graduação, na área de Biologia,• um dos tópicos de maior relevância teórica• e prática, que se insere em Biologia de Sis-• temas. São um esforço didatização.

• venturamm@unb.br (para contacto).• Disponível em www.manuelmateusventura.pro.br

• jun-2006 corrigido em 11-08-2006

4

REAÇÕES QUÍMICAS

• Reações químicas ocorrem quando moléculas que se encontram alteram suas

composições e estruturas com reordena- ção de seus átomos constitutivos e surgi-mento de outra(s) molécula(s).

5

REAÇÕES QUÍMICAS 2

• Equação estequiométrica: indica as es – pécies que participam da reação (reagen - tes e produtos) e suas proporções mole - culares relativas (estequiometria):

a1A1+ a2A2+...+anAn = b1B1+ b2B2 +...+bmBm

ou, de forma mais compacta,

∑r arAr -∑P bPBP = 0

r = 1, 2, ... , n p = 1, 2, ... , m

6

Equações de reações

• ∑ij aijXj = 0 i = 1, ... , m reações

j = 1, ... , n espécies

R1 a11X1 + a12X2 + ... + a1nXn = 0

R2 a21X1 + a22X2 + ... + a2nXn = 0

-------------------------------------------------------------

Rm am1X1+ am2X2+ ... + amnXn = 0

7

• A equações estequiométricas em forma

matricial:

a11 a12 ... a1m X1

a21 a22 ... a2m ∙ X2 =

------------------------------- ---

an1 an2 ... anm Xm

a11X1 + a12X2 + ... + a1mXm 0

a21X1 + a22X2 + ... + a2nXm = 0 = 0

---------------------------------------------------

am1X1+ am2X2 + ... + amnXm 0

8

• Conservação de elementos

A equação estequiométrica deve ser balanceada para os elementos que constituem as espécies moleculares

(reagentes e produtos) que participam

da reação.

Os elementos conservam seus números

atômicos Z.

9

Matriz de elementos:

Cada de seus elementos dá o número de

átomos de um elemento químico por mo-

lécula de reagente ou produto.

Exemplo, a seguir.

10

• Consideremos a reação: GLICOSE(G) + ATP = G6P + ADP + H+

Matriz de elementos: G ATP G6P ADP

H + H+ 12 13 12 13 C 6 10 6 10 E = O 6 13 9 10 N 0 5 0 5 P 0 3 1 2

11

• Conservação da carga:

Em uma reação deve haver balanço de carga elétrica.

Matriz de carga:

para a reação anterior, tem-se

G ATP G6P ADP H+

Cel = 0 -4 -2 -3 1

12

• Redes de reações químicas• Estamos habituados a ver seqüen-• cias de reações que se ramificam• ao nível de espécies moleculares• que participam das transformações• químicas. Por exemplo: • E• A B C F• D

13

• Nessas redes, distinguem-se nós• ou vértices, em correspondência• às espécies moleculares e cone- • xões ou arestas que indicam as• transformações químicas entre os nós.• Em sistemas muito complexos, como• os do metabolismo celular, as redes• de multirreações interconectadas• podem ter tamanho enorme,

constituidas por milhares de nós e conexões.

14

• Redes biológicas são representa-ções abstratas de sistemas biológi-cos, que apresentam muito das propriedades fundamentais dessessistemas.De tais características, destacam-se: a)modularidade, b)robustez ou

resiliência e c)recorrência na utili- • zação de certos elementos.

15

• Redes de moléculas e reações

entre elas são o centro da atividade celular, a qual resulta, no todo, da combinação de todas essas redes

(metabolismo e seu controle, sinalização, expressão gênica etc.)

16

• A arquitetura (topologia) de uma rede relaciona-se à sua robustez

ouresiliência, ou seja, a capacidade

deresistência aos agentes externos einternos que podem afetar ou

destruira integridade da rede.

17

• Redes biológicas são sistemas

dinâmicos, i.e., seu estado global

evolui no tempo.

• A dinâmica de uma rede depende

dos estados internos atingidos

pelos seus vértices e sua evolução

temporal.

18

• O estudo de redes como um todoestá a levar à descoberta de propri-edades e princípios gerais válidospara as mais diversas redes, inclusi-ve biológicas.Para esse fim, a contribuição de físi- cos tem sido relevante, por meio deuma ferramenta adequada- a mecâ –nica estatística.

19

• A representação de sistemas biológicos por redes tem a vantagem de permitir o uso de conceitos e procedimentos da teoria dos grafos, a qual tem sido muito usada em tecnologia.

20

• GRAFOS: representação simbólica

• de interações ou transformações

• entre quaisquer entidades(molécu-

• las,elementos em crcuitos elétricos,

• indivíduos em uma população,ecos-

• sistema ou grupo social,emissores e receptores de informação etc.).

• Grafos são entidades matemáticas.

21

METABOLISMO• O metabolismo da célula viva é uma rede(“network”) de interconversões de espécies químicas pela qual a célula obtém os blocosestruturais e a energia necessários à sua organização estrutural e funcional.É um conjunto de reações químicas conecta-das e integradas, caracterizado por uma topo-logia e uma dinâmica. As reações são, em ge-ral, catalisadas por enzimas. Além de reações,podem ocorrer processos de transporte.

22

Genética Proteínas Metabolismo Sinalização

Biologia Celular

Química - Computação- Biologia de sistemas

23

• ERA PÓS-GENÔMICA

(dados produzidos em alto fluxo por

NMR, MS, 2d-gel, DNA arrays, two-

-hybrids technique etc.)

(com base no Dagstuhl Seminar on

• Integrative Bioinformatics 2004)

• segue

24

•

• BIOLOGIA MOLECULAR

• Meta- OGE PRR Prote- Trans-

bolismo ômica criptômica

OGE:organização genômica estrutural

Metabo- PRR:padrões de regiões regulatórias

lômica

25

CERCA DE 600 BASES DE DADOS E VÁ -

RIAS FERRAMENTAS ANALÍTICAS DISPO-

NÍVEIS NA WEB

CIÊNCIA DA TAREFAS

COMPUTAÇÃO BIOLÓGICAS ( MÈTODOS E (EXPERIMEN-

CONCEITOS) TAIS)

26

• A N Á L I S E (extração de informação)

• integração desafio

BIOINFORMÁTICA

INTEGRATIVA (novos níveis de entendi-

mento)

CÉLULA VIRTUAL

27

• O funcionamento de uma célula

• envolve um sistema altamente

• complexo de processos químicos

• interconectados, o metabolismo, cuja

• reconstrução, constitui a meta final da biologia de sistemas.

28

Metabolismo decompõe nutrientes em mo-

léculas mais simples e energia (catabolismo);

sintetisa moléculas orgânicas complexas (ana-

bolismo), as quais são a base estrutural e

funcional da célula.

Metabolismo compreende:

- reações químicas catalisadas por enzimas

- metabolitos: pequenas moléculas consumi

das e produzidas nos processos químicos.

29

• Dado o papel relevante das enzimas, po –de-se dizer que o metabolismo celular é aexpressão bioquímica (fenótipo bioquímico)do genoma.1 - Uma enzima pode catalisar mais de umareação química (promiscuidade de subs-trato); as reações catalisadas apresen –tam, geralmente, similaridade.2 – Enzimas podem ser formadas por maisde uma cadeia peptídica e constituir oligô-meros.

30

3 – Mais de uma enzima podem catalisar

a mesma reação química.

Assim, o número de enzimas não corres –

ponde ao número de genes que as codifi

cam e ao número de reações catalisadas.

31

• O METABOLISMO E SUA RE-

• GULAÇÃO SÃO AS FUNÇÕES

• MAIS FUNDAMENTAIS DE UMA CÉLULA

32

• RECONSTRUÇÃO METABÓLICA• identifica, categoriza e interconecta

• genes, proteínas, reações e metaboli-

• tos que participam do metabolismo de

• um sistema biológico para constituir

• uma rede, a qual pode ser usada como

• base para caracterizar crescimento e

• predizer fenótipos celulares.

33

• Reconstrução metabólica• GENOMA

• SEQUENCIAMENTO (base de dados)

• ANOTAÇÃO• (identificação de segmentos codificantes+• dados bioquímicos e fisiológicos)

• RECONSTRUÇÃO

• da rede metabólica e regulatória

34

A modelagem e simulação de redes• metabólicas são de grande relevân-• cia para o entendimento quantitati -• vo do metabolismo de um micro-• organismo e servem ao aperfeiçoa-• mento deliberado das capacidades• metabólicas por meio das técnicas• de DNA recombinante (engenharia• metabólica).

35

SIMULAÇÕES COMPUTACIONAIS:VANTAGENS:podem mostrar a não viabilidade de hipó-teses aparentemente plausíveis e, ao confirmarem uma hipótese, podem

proverpredições quantitativas e mesmo direcio-nar o trabalho experimental.Entretanto, não se deve esquecer deque usam modelos e são simulações.

36

• A enorme massa de dados de que• se dispõe e que resulta de técnicas• analíticas de alto fluxo (“high • throughput”) está a exigir o aperfei -• çoamento intenso e contínuo de • algorítmos que possibilitem o tra-• tamento computacional para atingir• o entendimento integrado da dinâ-• mica celular (tecnologias- “omics”).

37

• Os dados que resultam do tra -

• balho experimental com células

• vivas constituem a base para

• trabalhar com a modelagem com-

• putacional do metabolismo.

• Simulação e modelagem,contudo,

• são de relevância em conseguir, a partir desses dados, visão mais pene-

• trante da dinâmica dos sistemas em

• estudo.

38

• Para ter em mente !

• “The important thing in science is

• not so much to obtain new facts

• as to discover new ways of

• thinking about them.”

• Sir William Bragg

39

• ABORDAGEM CINÉTICA

• NO ESTUDO DO

• METABOLISMO

40

• A expressão das velocidades de• reações químicas por equações• diferenciais, com base na lei de• ação das massas, tem possibili-• tado o estudo da evolução no• tempo de sistemas metabólicos• não muito complexos, i.e., em es-• cala subgenômica.

41

Tem sido o procedimento adotadona cinética enzimática, para o estu-do de enzimas individuais ou empequeno número.Exige que sejam conhecidas as cons-tantes de velocidade das reações envol-vidas, o que representa grande obstáculo no estudo de redes metabólicas com-plexas, em escala genômica.

42

• Contudo,

• eritrócito e mitocôndrio têm tido

seus metabolismos estudados por

via cinética.

43

Para a reação

k1 aA + bB cC + dD,

k-1

tem-sev = - (1/a)d[A]/dt = - (1/b)d[B]/dt = 1/c)d[C]/dt = (1/d)d[D]/dt v = velocidade da reação

k1, , k-1 = constantes de velocidade

44

• As equação cinética será

v = v - v = k1[A]α [B]β - k-1[C]γ [D]δ

onde os expoentes indicam a ordem cinética relativa a cada reagente; a ordem cinética da reação,n = α + β + γ + δ. Note-se que as ordems cinéticaspodem não ser necessariamenteIguais aos respectivos coeficientesestequiométricos.

45

• Seqüências de reações.Seja o seguinte caso simples:

k1 k2

X1 X2 X3

X1´= dX1/dt = - k1[X1]

X2´= dX2/dt = k1[X1] – k2[X2]

X3´= dX3/dt = k2[X2]

[X1]0 + [X2]0 + [X3]0 = [X1]t + [X2]t + [X3]t

estado estacionário: X1´= X2´= X3´= 0

46

• No estado estacionário, os fluxos

de reação não se anulam, como no

equilíbrio, mas compensam-se de

tal modo que dXi/dt = 0. Neste caso,

as equações diferenciais da cinética

convertem-se em um sistema de

equações algébricas simultâneas.

47

• Integração das equações cinéticas:

• - em forma analítica ou exata,

possível somente em casos especiais;

• - por métodos numéricos,aproxima-

• dos e computacionais

48

• Equações cinéticas para sequên-

cias de reações, lineares ou ramificadas, podem ser obtidas pelo método computadorizado de King- Altman, bem conhecido em cinética enzimática.

49

• Programas para o estudo cinético• do metabolismo:• dos inúmeros disponíveis, indica-• remos os seguintes:• GEPASI Pedro Mendes 1989 -• 2002 //www.gepasi.org;• E-cell2 Keio University;• CellDesigner V. 2.26 2003-2005• The Systems Biology Institute• //www.celldesigner.org

50

M A T R I Z

E S T E Q U I O M É T R I C A

S um conceito básico

em análise do metabolismo

51

Matriz estequiométrica (S)• Smn é uma matriz de ordem mxn, onde m filas correspondem ao número de espécies químicas (substratos e produtos) e n colu – nas indicam o número de reações envolven- do essas espécies. Os elementos de S são os coeficientes este- quiométricos aij das espécies que correspon- dem às filas i e colunas j i = 1,2,...,m j = 1,2,...,n

S = aij

aij < 0 substratos aij >0 produtos aij = 0

52

UM IMPORTANTE CONCEITO

O conceito de matriz estequiométrica é es –

sencial para representar e analisar mate –

maticamente os sistemas metabólicos.

Possibilita o uso da álgebra linear, inclusive

da análise convexa, em bioinformática e

biologia computacional.

53

Matriz estequiométrica 2 R1 R2 Rn reações j = 1,...,n

a11 a12 ... a1n espécies

S = a21 a22 ... a2n químicas i = 1,...,m

--------------------------------

am1 am2 ... amn

aij : coeficientes estequiométricos

aij < 0 substratos aij > 0 produtos

aij = 0 a espécie molecular i não participa da reação j

54

• Na matriz estequiométrica, como definida aqui, temos:

a)as filas de S representam as espécies

químicas (substratos e produtos);

b)as colunas de S indicam as reações;

c)os elementos de S são os coeficientes

estequiométricos aij com sinal negativo

para substratos e positivo para produtos.

aij = 0 indica que a espécie i não partici –

pa da reação j.

55

• Subespaços de S:

a11 a12 ... a1n espécies: 1, ... , m

S = a21 a22 ... a2n reações: 1, ... , n

--------------------------------

am1 am2 ... amn

S pode ser representada tanto pelos vetorescoluna quanto pelos vetores fila:

rT1 a1k ai1

S = c1 ... cn = . ck = . ri = . . . . . . .

rTm amk ain

56

Subespaço de vetores coluna:

é determinado pelo conjunto de vetores

coluna de S e denotado por R(S).

R(S) determina o espaço de concentração

dinâmico.

Os vetores coluna, que correspondem às

reações químicas da rede metabólica consi-

derada e que constam de S, contribuem

para as variações das concentrações dos

metabolitos.

57

Subespaço de vetores fila:

é determinado pelo conjunto de vetores fila.

e denotado por R(ST).

No espaço de fila estão as variações de

concentração que contribuem às taxas de

fluxo das reações.

58

• Posto (“rank”) de uma matriz, r .• Definição. O posto de uma matriz A é a • ordem da maior sub-matriz quadrada cujo• determinante não é nulo.• Ex.: 3 0 3 3 0 3• A = 2 4 6 detA = 2 4 6 =• 1 5 6 1 5 6• • = 3 4 6 + 3 2 4 = 0• 5 6 1 5

• O posto de A não pode ser 3, pois detA = 0, mas• é igual a 2, como se pode ver.

59

• Proposição. O posto da matriz A é igual à

dimensão do subespaço de seus vetores

coluna ou vetores fila:

postoA = dimR(A) = dimR(AT) = r

60

• ESPAÇO –N U LO DE SDefinição. O espaço –n u l o (direito) da

matriz S é o conjunto de todas as soluções

v1

v = ... = v1 ... Vn T

vn

das soluções do sistema de equações Sv = 0,o qual corresponde ao estado estacionário.

61

O espaço-n u l o é um subespaço e é denotado por N(S) ou nulo(S).

Se r = posto de Smn, tem-se

dimN(S) = n-r , N(S) ┴ R(ST)

N(S) determina o espaço que compreende

os caminhos de estado estacionário da

rede metabólica considerada.

62

• Espaço-nulo (esquerdo) de Smn é o con –

junto das soluções

y1

y = ... = y1 ... ym T

ym

do sistema de equações

STy = 0 .

É denotado por L = N(ST) ou nulo(ST) e

tem-se dim(ST) = m-r , N(ST) ┴ R(S).

63

• Seja a equação de balanço dinâmico dx/dt = Sv = 0e multipliquemos ambos os membros por L: Ldx/dt = LSv = 0 Ldx/dt = 0 Lx = const.A última expressão indica que os vetores deL definem as relações de conservação entreconcentrações de metabolitos em uma redemetabólica.

64

Matriz de espécies (reagentese produtos)

Vetor coluna:

•

• Xm = X1 X2 ... Xm T

65

• CONSERVAÇÃO DE ELEMENTOS

• Seja a reação G+ATP = G6P+ADP+H+

G ATP G6P ADP S = -1 -1 1 1

H 12 13 12 13 -1 0 C 6 10 6 10 . -1 = 0 = 0 O 6 13 9 10 1 0 N 0 5 0 5 1 0 P 0 3 1 2 E ∙ ST = 0

66

• CONSERVAÇÃO DA CARGA ELÉTRICA

• G ATP G6P ADP S = -1 -1 1 1

Cel= 0 -4 -1 -3

Cel ∙ ST = 0

A ortogonalidade entre Cel e ST indica a conservação da carga.

67

MATRIZ ESTEQUIOMÉTRICA:um exemplo mais complexo

• Uma seqüência de reações da glicólise:

R1 Glicose(G) + ATP = G6P + ADP + H+

R2 G6P = F6P

R3 F6P + ATP = FBP + ADP + H+

R4 FBP = 63P + DHAP

R5 2G3P + NAD+ + Pi= BPG + NADH + H+

S, a seguir

68

R1 R2 R3 R4 R5

G -1 ATP -1 -1 ADP 1 1 G6P 1 -1 F6P 1 -1 FBP 1 -1 G3P 1 -2 = S DHAP 1 BPG 1 NAD+ -1 NADH 1 Pi -1 H+ 1 1 1 Posições em branco correspondem a zeros.

69

S de uma rede metabólica • X1 X2 X3 X5

• X4 X6 X7

• R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7

• X1 -1• X2 1 -1 -1• X3 1 -1 • X4 1 -1• X5 1 -1• X6 1 -1• X7 1 1

70

Conectividades em S

• S é uma matriz que conecta todas as es-pécies químicas (metabolitos) que partici –pam de um determinada sistema metabóli –co.Propriedades de conectividade.- Número de participação: número de vezes que um

metabolito participa das - reações do sistema. É, no mínimo, 2 para- Metabolitos internos.- Número de moléculas em uma reação: soma- de todos os coeficientes estequiométricos na equação- de uma reação.

71

Partição de S• A matriz estequiométrica plena S abrangereações internas (n) e metabolitos internos(m) da célula que correspondem a uma par-

tição denotada por Sint. Entretanto, outraspartições ou subpartições podem ser consi-deradas, como para substratos, produtos,Intermediários metabólicos, constituintes debiomassa e reações de troca entre organe-loas e outros compartimentos da célula.

72

Partição de S

Sint

S =

Sext

73

Partição de S: exemplo específico R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 Glicose -1 subtratos ------------------------------------------------------------------------- Succin.. 1 Lactato 1 H2 1 produtos Acetato 1 etanol 1 -------------------------------------------------------------------------- PEP 2 -1 -1 NAD+ -1 2 1 2 NADH 1 -2 -1 -2

intermediários CO2 -1 1 ATP 1 1 Acetl-CoA 1 -1 -1

74

• No sistema metabólico da célula, as espé-• cies químicas que participam das várias• reações são distinguidas como• a) substratos,• b) produtos metabólicos,• c) metabolitos intermediários e• d) produtos de biomassa.• O termo metabolito, freqüentemente, tem• significação abrangente.

75

• Coeficientes estequiométricos:• αij para substratos Xs ; βij para produtos• metabólicos Xp; γij para constituintes de• biomassa Xb; gij para metabolitos interme-• diários Xint.• Para as j reações, tem-se

∑j ∑i αijXs + ∑j ∑i βijXp + ∑j ∑iγijXb + ∑j ∑igijXint =0

A seguir, em forma matricial :

76

• Estequiometria global da célula em forma• matricial:

ATXs + BTXp+ ΓTXb + GTXint = 0ou ainda, por partição da matriz estequio –métrica única para o sistema. • ST Xs

• -------------------- Xp = 0•

------------------------------ Xb

• -------------------- Xint

• --------------------

77

REAÇÕES E FLUXOS

• As reações químicas do metabolismo podem ser vistas como fluxos de matéria associados a trocas de energia e processos de transporte.

Ao serem referidas, reações são quase sem- pre tomadas como os fluxos que ocorrem através delas. As redes metabólicas são fluxos interconecta- dos que a célula viva mantém sob controle por me – canismos de modulação enzimática (ativação e ini- rição) e regulação da expressão de genes.

78

Fronteiras em sistema metabólicos• Sistemas metabólicos podem ser delimi –

tados por fronteiras, físicas ou não.

Ao ser definida a fronteira, tem-se

- interior, onde está o sistema metabólico

considerado;

- exterior .

Fluxos internos ocorrem no interior e fluxos

externos entre o interior e o exterior.

79

Rede metabólica

• v6 b2

• v3 D E

• b1 v1 v2 v4

A B C

• v5

• F G

• v7 b3

• fronteira

80

• Matriz estequiométrica da rede:

• R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 b1 b2 b3

• -1 -1 A• 1 -1 B• 1 -1 1 -1 C• S = 1 -1 -1 D • 1 -1 E• 1 -1 F• 1 -1 G

81

• Vetor de concen- Vetor de fluxo

tração v1

• v2

• x1 v3

x = x2 v = v4

. v5

. v6

. v7

xm b1

b2

b3

82

O vetor de fluxo é função das concentra –

ções e das constantes cinéticas k das

reações:

v = v (kj) j = 1, 2, ... , n

kj são parâmetros experimentais de difícil

determinação e nem sempre disponíveis.

As velocidades de reação são funções não

lineares das concentrações dos metabolitos,

na forma dada na cinética química.

83

• Equação de balanço dinâmico :

• dx/dt = S ∙ v • Estado estacionário:

• dx/dt = S ∙ v = 0• Metabolitos intermediários não variam

• suas concentrações dentro do intervalo de tempo dos experimentos. São consumi-

• dos na mesma taxa em que são produzi-

• dos.

84

• O estado estacionário, onde dXi/dt = 0, é• uma idealização, matematicamente van-• tajosa.• A escala de tempo dos processos enzimá-• ticos, comparada com a dos vários pro –• cessos fisiológicos, justifica a aproxima –• ção do estado estacionário.• O tempo t não está presente nas equa – • ções de balanço do estado estacionário.

85

dx/dt = S ∙ v = 0

R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 b1 b2 b3

• v1 -v1-b1

-1 -1 v2 v1-v2

1 -1 v3 v2-v3+v4-v5

1 -1 1 -1 v4 v3-v4-v6

1 -1 -1 v5 = v7-b2

1 -1 v5 v5-v7

1 -1 v6 v7-b3

1 -1 b1

b2

b3

86

• A consideração do estado estaci-• onário permite substituir sistemas• de equações diferenciais em sis-• temas de equações algébricas li-• neares.• As derivadas dx/dt não mais apa-• recem.

87

• Para ilustração, tome-se a rede metabólica (grafo) simples:

• b1 v1 b2

• X1 X2

• v2 v3 v4

• X3

88

• O balanço de fluxo em estado• estacionário:• dx/dt = S ∙ v = o Xi

´ = dX1´/dt

• v1

• X1´ -1 -1 0 0 -1 0 v2 0

• X2´ = 1 0 1 -1 0 -1 v3 = 0

• X3´ 0 1 -1 1 0 0 v4 0

• b1

b2

89

• v1

• -1 -1 0 0 -1 0 v2 -v1-v2-b1

• 1 0 1 -1 0 -1 v3 = v1+v3-v4-b2

• 0 1 -1 1 0 0 v4 v2-v3+v4

• b1

b2

90

Balanço de fluxos em estado

• estacionário

• dX1/dt = -v1-v2-b1 = 0

• dX2/dt = v1+v3-v4-b2 = 0

• dX3/dt = v2-v3+v4 = 0

91

• RESTRIÇÕES ADICIONAIS

• Sobre fluxos internos:

• vj ≥ 0 j = 1, . . . ,n

• Sobre fluxos externos:

• exterior sistema bj ≤ 0

• exterior sistema bj ≥ 0

92

• CONE DE FLUXOS

• n >> m : o número de reações

• excede de muito o número de

• metabolitos, o que correspon –

• de a dizer que o número de

• colunas de S é muito maior do

• o número de filas.

93

• Os sistemas de equações line-

• ares homogêneas formados

• pelas equações de balanço di-

• nâmico do estado estacionário,

• S ∙ v = 0,

• têm um número infinito de solu-

• ções em seu espaço-nulo.

94

• Ao tomar em conta as restri –• ções (inequações) impostas • ao sistema, a análise convexa• mostra que o espaço de solu-• ção é um cone poliédrico com-• vexo, o qual contém todos os• pontos do espaço-nulo de co-• ordenadas não negativas, mais• os pontos correspondentes aos• fluxos externos de coordenadas• negativas.

95

• Palsson & Schuster propõem

• que o espaço inteiro de fluxo,

• no qual estão contidas as so-

• luções do sistema, representa

• a capacidade da rede metabó-

• lica considerada.

96

• CONE DE FLUXO (estado estacionário)

p1p3

p2

p4

pi arbitrários, somente para ilustração

97

• “Caminhos extremos”• (extreme pathways)• Constituem um número míni –• mo de vetores que, por combi-• nação linear, podem gerar • qualquer vetor do cone de• fluxo:• v = ∑i wipi , wi ≥ 0 , i = 1, ... , k

98

• Caminhos extremos:• são as arestas do cone poliédri –• co; • não podem ser representados por• combinações de quaisquer outros• vetores do cone, lembrando o que• ocorre com os vetores de base de• um espaço vetorial; são “conicamen-• te independentes” (Schilling).

99

• Caminhos extremos:

• qualquer vetor do cone polié -

• drico pode ser representado

• por combinação linear não ne-

• gativa dos vetores de caminho

• extremo.

100

• Cada caminho-extremo de um

• cone poliédrico corresponde a um conjunto de fluxos que sa-

• tisfaz à equação de balanço

• de massa mais as restrições.

101

• Restringindo o cone de estado

• estacionário:

• vimos que esse cone contem

• um número infinito de solu –

• ções;

• somente algumas soluções

• têm significação fisiológica.

102

• Restrições relativas a fluxos ex-• ternos têm que ser considera-• das, além das que já foram• citadas, tais como o organismo,• ambiente, disponibilidade de• substratos, transporte por difu-• são e outras.• Todas essas restrições resultam• em diminuição do espaço de fluxo.

103

• DISTRIBUIÇÃO OTIMIZADA

• DE FLUXOS

• pode ser computada com re-

• lação a uma certa função-objeti-

• vo,linear, Z = ∑j cjvj .

104

• Escolhida a função-objetivo Z,

• a otimização (minimização/maxi-

• mização) de S∙v =0 + restrições é um problema de

• programação linear (PL), geral –

• mente resolvido pelo algorítmo

• simplex.

105

• A escolha de Z:• a função Z deve atender à maxi-• mização (ou minimização) de• uma determinada característica• da rede metabólica:• crescimento celular (max.);• concentração de um determina-• do metabolito (max./mini.);• demanda de energia (mini.)• etc.

106

Determinação dos caminhos

extremos de uma rede metabó-

lica pelo algorítmo de Shilling:

Schlling,C.H.,Letscher,D. and

Palsson,B.O. 2000. J. theor.

Biol. 203: 229-248.

107

• Retome-se a rede metabólica (grafo):

• b1 v1 b2

• X1 X2 • v2 v3 v4

• X3

• e, a seguir, sua matriz S.

108

• v1 v2 v3 v4 b1 b2 • X1

-1 -1 0 0 -1 0 • S = X2 1 0 1 -1 0 -1 • X3 0 1 -1 1 0 0

• 3 metabolitos• 4 fluxos internos, 2 fluxos externos

109

• Matriz inicial: ST unida a I4x4

• X1 X2 X3

• 1 -1 1 0 v1

• T(0)= 1 -1 0 1 v2

• 1 0 1 -1 v3

• 1 0 -1 1 v4

• T(E) 1 -1 0 b1

• 1 0 -1 b2

110

• Na matriz inicial, identificar os metabolitosque não têm fluxos externos a eles associa-dos e cujo número é denotado por μ .O metabolito X3, como se pode ver, é o úni-co a não estar associado a um fluxo externo.Assim, tem-se μ = 1.A seguir, forme-se uma nova matriz por cópia detodas as filas de T(0) que contenham um zerona coluna de ST que corresponda a X3. No ca-so presente, copia-se somente a 1a. fila.Em continuação, sejam adicionadas todas as combi-nações possíveis, de tal modo que se tenha zero nacoluna que corresponde a X3.

111

• Do procedimento anterior, tem-se • X1 X2 X3 • 1 -1 1 0 v1

• 1 1 -1 1 0 v2 • T( μ) = 1 1 0 0 0 v3

•

• 1 -1 0 b1

• 1 0 -1 b2

112

• A partir da matriz T(μ), é formada a matriz• final T(final):• v1 v2 v3 v4 b1 b2

• p1 1 0 0 0 -1 1 • T(final)= p2 0 1 1 0 -1 1 • p3 0 0 1 1 0 0• • donde os caminhos extremos: • p1 = v1 – b1+b2 , p2 = v2 + v3 -b1+b2

• p3 = v3 + v4

113

• Exemplo• Verifique se o vetor • v = 5 2 3 -3 6 1 T • está contido no cone de fluxo da• rede metabólica em consideração• 5• v1 v2 v3 v4 b1 b2 2 p1 1 0 0 0 -1 1 3 0 p2 0 1 1 0 -1 1 -3 = 0 = 0 p3 0 0 1 1 0 0 6 0• 1

114

• Rede metabólica (grafo):

• b1 v1 p1 b2

• X1 X2

• p2 v2 v3 v4

• X3 p3

• com “caminhos extremos” indicados

115

MATRIZ ESTEQUIOMÉTRICA

Análise por

DECOMPOSIÇÃO DE VALOR

SINGULAR (SVD) Por conveniência, é usada a abreviação em

inglês.

116

• DECOMPOSIÇÂO DE VALOR• SINGULAR (SVD) DE UMA • MATRIZ.• Definição matemática.• Seja Amxn uma matriz de elementos reais,

• geral. • A decomposição de valor singular de• Amxn é a fatoração A = Umxm∑mxn(Vnxn

)T,• onde Umxm = “matriz de vetores singu-• lares esquerdos”, ∑mxn= matriz diagonal e• Vnxn= “matriz de vetores singulares direitos” .

117

• Os elementos da matriz diagonal ∑mxn são

• os valores singulares: σ1≥ σ2 ≥ ... ≥ σn ,

• os quais são as raizes quadradas (não nu-• las) dos autovalores (eigenvalores) de • AAT e ATA.• U contém o espaço de coluna e o espaço• nulo esquerdo.• V contém o espaço de fila e o espaço nulo• de A.• O espaçp de fila contém informação • termodinâmica.

118

Colunas de U e V fornecem bases orto –normais para os 4 subespaços fundamen –tais de S.As primeiras colunas de U e V fornecembases ortonormais para os espaços de co –luna e fila, respectivamente.As restantes m-r colunas de U dão uma base ortonormal para o espaço-nulo esquer-do.As n-r colunas de V dão uma base orto –normal para o espaço-nulo.

119

• Mapeamento entre vetores singulares• S = U ∑ VT

• SV = U ∑ VTV = U ∑

• Svk = σkuk

• S mapeia o vetor singular direito sobre o vetor singular esquerdo por

• meio do valor singular correspondente.

120

• SVD tem aplicações em várias áreas de• ciência e técnica e pode ser usada para• Identificar e caracterizar os aspectos bio-• químicos dominantes da rede metabólica. • SVD mostra aspectos interessantes e de• utilidade da matriz decomposta, os quais• não são aparentes na matriz original.• A análise de S por SVD, a despeito de

não tratar explicitamente da dinâmica da• rede considerada, fornece informação• topológica sobre relações sistêmicas entre• metabolitos e fluxos.

121

• SVD torna evidentes aspectos úteis e im-• portantes da matriz decomposta,os quais• não podem ser vistos diretamente a par-• tir da matriz original. • As matrizes componentes U, ∑ ,V são, em• geral, ortogonais e independentes.• Os vetores singulares(modos) são ortonor-• mais.• UTU = Imxm VTV= Inxn

•

122

• Combinação linear de metabolitos e de fluxos.

• dx/dt = S∙v S= U∑VT

• multiplicando por UT

• UT dx/dt = UTU∑VTv = ∑VTv

• d(ukTx)/dt = σk(vk

Tv) k = 1,...,r• r : posto de S ; uk :vetor sing. esquer;• Vk : vetror singular direito.

123

• Continuação

Do procedimento anterior, vemos que há

uma combinação linear de fluxos

vkT∙ v = vk1 v1 + vk2 v2 +... + vkn vn

que movimenta uma combinação linear de

Metabolitos. Os vk são contrbuições de eigen-

reações.

ukT∙ u = uk1 x1 + uk2 x2 +...+ ukr xm

em uma extensão dada por σk (valor singu-

lar). Os uk equivalem aos coeficientes este -

quiométricos sistêmicos.

124

Desde que, em SVD, os vetores singulares

são ortonormais um ao outro, cada dos k mo-

vimentos é desacoplado dos demais.

Então, a combinação linear de concentrações

dada para ukT∙u pode ser considerada como

uma reação sistêmica desacoplada e impul –

sionada pela combinação linear de reações

definidas em vkT∙ v .

As reações metabólicas sistêmicas ou eigen-

reações podem descrever a rede metabólica

como um todo.

125

• Seja

• U ∑ VT

• SV = U ∑ VT V = U ∑

• Assim, tem-se Svk = σkuk

• o que significa que S mapeia o vetor singu-

• lar direito sobre o vetor singular esquerdo,

por meio do valor singular relativo.

126

• Tratamento semelhante ao dado acima tem

sido usado em análise de expressão de genes

por SVD.

Alter, O., Brown, P.O., Botstein,D. Singular

Value decomposition for genome-wide

expression data processing and modeling.

PNAS 97(18) 10101-10106 (2000)

127

• Computação dos valores singulares

• Tomemos uma simples reação de isome-

• rização que consiste na interconversão

• v1

• AB BA ou X1 X2

• v2

• A decomposição de valor singular (SVD)

• da matriz estequiométrica (S) dessa reação

• é obtida como a seguir:

128

• Continuação

• v1 v2

X1 -1 1 = 2-1/2 -1 1 2 0 2-1/2 1 -1

X2 1 -1 1 1 0 0 1 1

• S = U ∙ ∑ VT

A 2a. coluna de U compreende o espaço-nulo

esquerdo de S.

A 2a. fila de VT compreende o espaço-nulo

(direito) de S.

129

• Computação dos valores singulares • Seja a matriz estequiométrica S3x6 corres-• pondente à rede metabólica anterior:• v1 v2 v3 v4 b1 b2 • X1

-1 -1 0 0 -1 0 • S = X2 1 0 1 -1 0 -1 • X3 0 1 -1 1 0 0 • A SVD de S pode ser obtida pelo usodo matrix-calculator acessado em//www.bluebit.gr/matrix-calculator/ calculate.asp(resultado a seguir)

130

• Decomposição SVD:• U=• -0.082 0.858 0.508 0.000 0.000 0.000• 0.802 -0.245 0.544 0.000 0.000 0.000• -0.591 -0.452 0.068 0.000 0.000 0.000

• ∑ =

• 2.361 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000• 0.000 1.953 0.000 0.000 0.000 0.000• 0.000 0.000 0.782 0,000 0.000 0.000• 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000• 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000• 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

• V=

0.375 -0.565 0.047 -0.734 0.000 0.000 -0.216 -0.671 0.205 0.419 0.363 -0.392 0.590 0.106 -0.159 0.210 0.700 0.285 -0.590 -0.106 0.159 -0.210 0.337 0.677 0.035 -0.439 -0.649 0.314 - 0.363 0.392 -0.340 0.126 - 0.696 -0.314 0.363 -0.392

•

131

• MODOS ELEMENTARES

• DE FLUXO

132

• Modo de fluxo:

• distribuição de fluxos estacionários

• que mantêm proporções fixas.

• 1

• v1

• 2 3

• v2

• v1 / v2 = constante

133

• Formalmente, o modo de fluxo, M, é

• definido com o conjunto

• M = {V Є Rr: V = λ V*, λ >0} ,

• satisfazendo às condições:

• estado estacionário, SV* =0;

• para reações irreversíveis, tem-se

• que um subvetor de V, V*irr >=0.

134

• Modo elementar de fluxo:• um modo de fluxo indecomponí-• vel;• compreende um conjunto mínimo de reações enzimáticas irreversíveis• e em regime estacionário;• o conjunto de modos elementares• E é único para uma dada rede meta-• bólica.

135

• Por computação dos modos ele-

• mentares de fluxo (E), uma rede

• metabólica pode ser decomposta

• em partes mínimas, sob a condi-

• ção de estado estacionário.

• Os aspectos essenciais da estru-

• tura da rede podem tornar-se apa-

• rentes.

136

• Combinação linear de fluxos:• uma distribuição de fluxos pode • ser representada por uma com-• binação linear de fluxos elemen-• tares:• V = λ1e1 + λ2e2 + ... = ∑i λiei

λi ≥ 0

137

• ANÁLISE DE ROTAS

• METABÓLICAS POR MODOS

• ELEMENTARES DE FLUXO• Schuster,S., Fell, D., Dandekar, T. :

• A general definition of metabolic pathways

• useful for systematic organization and

analysis of complex metabolic networks.

Nature Biotechnol. 18(2000) 326-332.

138

• O programa usado para computar

• modos elementares de fluxo E

• em redes metabólicas:

• Y A N A• 2003-2004 Dep Bioinformatics, Univ. of

• Würzburg• //yana.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de

139

• O algorítmo sobre o qual YANA é

• baseado não será detalhado aqui.

• Pode ser achado em• //www.mpi-magdeburg.mpg.de/de/research/projects/• 1010/1014/1020/mfaeng/mfapric.html• //www.biomedcentral.com/1471-2105/6/135

140

• Como ilustração, pode ser executado o• exemplo (contido na distrbuição do YANA)

que permite computar os modos elementares de fluxo para a rota das fosfopentoses (arquivo glycolysis+ppp.sbm).

• A matriz estequiométrica da sub-rede con-• siderada é computada de início.• Dados de entrada e saída são listados e gra-• ficados.

•

141

• ANÁLISE DE BALANÇO DE• FLUXOS EM REDES META-• BÓLICAS.• PROGRAMA DE COMPUTADOR• FBA versão 2.0• por Jeremy S. Edwards e• Bernhard Palsson

142

• Capacidades do “software” FBA:

• Calcula distribuições ótimas de

• fluxo para função-objetivo defini-

• da pelo usuário.

• Permite estudar o efeito da supres-

• são de genes.

• Gera mapa de fluxos.

143

• Um excelente “primer” de FBA

• (Nature Biotechnology) e uma

• versão de demonstração do pro-

• grama podem ser obtidos de

• //gcrg.ucsd.edu/downloads/fba.html

144

• Um programa interativo de demons-

• tração (FBA/MOMA) para E. coli,

• computa fluxos metabólicos e pos-

• sibilta prever efeitos resultantes

• da supressão de gene(s).

• Pode ser usado em:

• //atlas.med.harvard.edu/moma/

•

145

• Leitura sugerida:

• Palsson, B.O. Systems Biology-• Properties of Reconstructed Networks. • Cambridge University Press. 2006. • Stephanopoulos, G.N.,Aristidou. A.A.,Nielsen, J. Metabolic• Engineering. Academic Press. 1988.• Meyer,C.D. Matrix analysis and applied linear algebra.

SIAM. Philadelphia. 2003.• Boldrini, J.L. et al. Álgebra Linear. Harper & Row• do Brasil(editora Harbra Ltda.).3a.ed.1986. • Campbell, H.G. Matrices with Applications.Mere-

• dith Corp. New York. 1968.