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UNIVERSIDADE DE VORA DEPARTAMENTO DE BIOL OGIA

MICROBIOLOGIA

Textos de apoio e Manual prtico

Carlos Sinogas, Lus Alho, Isabel Brito

2003 / 2004

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NDICE

Comportamentos em laboratrio de microbiologia .............................................................................3

Nvel de segurana 1 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------3 Registos e relatrios .....................................................................................................................6 Tcnicas laboratoriais bsicas em microbiologia................................................................................7

Meios de cultura-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------7 Esterilizao ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------8 Tubos de cultura e placas de Petri -----------------------------------------------------------------------------------------------8 Instrumentos para transferncia de culturas ----------------------------------------------------------------------------------9 Cmaras de cultura-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------9 Frigorfico -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------9

Mtodos de esterilizao ............................................................................................................. 10 Esterilizao pelo calor ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 10 Esterilizao por gases ------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 12 Radiaes------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 12 Filtrao estril---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 12

O Microscpio............................................................................................................................ 13 Componentes principais do microscpio-------------------------------------------------------------------------------------- 13 Princpios tericos ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 14 Observao ao Microscpio------------------------------------------------------------------------------------------------------- 15

Morfologia das bactrias.............................................................................................................. 16 Corantes ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 16

Meios de cultura ........................................................................................................................ 18 Tipos de meio ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 18 Preparao ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 19

Contagens de microrganismos....................................................................................................... 20 Avaliao directa -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 20 Contagem de viveis --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 21

Isolamento de colnias em meio slido .......................................................................................... 22 Sementeira por espalhamento--------------------------------------------------------------------------------------------------- 22 Sementeira por riscado ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 22

Condies ambientais de crescimento dos microrganismos................................................................. 24 Oxignio ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 24 pH do meio ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 25 Temperatura-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 25

PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS....................................................................................................... 27 P1. MICRORGANISMOS NO MEIO AMBIENTE------------------------------------------------------------------------------ 27 P2. OBSERVAO COMPARADA DE BACTRIAS, FUNGOS E PROTOZORIOS ------------------------------------ 30 P3. PIPETAGENS E DILUIES----------------------------------------------------------------------------------------------- 33 P4. MEIOS DE CULTURA ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 36 P5. CULTURAS PURAS--------------------------------------------------------------------------------------------------------- 38 P6. COLORAO DE BACTRIAS. MORFOLOGIA E ASSOCIAO ---------------------------------------------------- 40 P7. QUANTIFICAO DE MICRORGANISMOS----------------------------------------------------------------------------- 43 P8. CADEIA DE TRANSMISSO ----------------------------------------------------------------------------------------------- 47 P9. TESTE DO PAPEL HIGINICO ------------------------------------------------------------------------------------------- 49 P10. CONDIES AMBIENTAIS DE CRESCIMENTO MICROBIANO ------------------------------------------------------- 51 P11. ANTIBITICOS------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 55 P12. ANTI-SPTICOS E DESINFECTANTES---------------------------------------------------------------------------------- 57 P13. MICROBIOLOGIA DAS GUAS ------------------------------------------------------------------------------------------- 59 P14. ANLISE MICROBIOLGICA DO LEITE -------------------------------------------------------------------------------- 62 P15. PREPARAO DE UM IOGURTE ---------------------------------------------------------------------------------------- 66 P16. ISOLAMENTO DE RHIZOBIUM. Observao de ndulos e bacteroides --------------------------------------- 68 P17. BACTERIFAGO DE E. COLI -------------------------------------------------------------------------------------------- 77 P18. ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)-------------------------------------------------------------------- 80

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COMPORTAMENTOS EM LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA

Os laboratrios de Microbiologia so locais especiais, ambientes por vezes nicos, capazes de promover a disseminao de agentes causadores de doenas infecciosas nas pessoas que neles trabalham ou com quem estas contactam.

Qualquer microrganismo, por mais incuo que seja, interage com o meio e com as outras formas de vida que o envolvem. Porque esta interaco pode ser indesejvel ou mesmo perigosa, h que observar algumas regras durante as operaes laboratoriais com microrganismo s.

As regras e comportamentos que se determinam pretendem tambm contribuir para evitar a propagao de contaminaes cruzadas, susceptveis de perturbar o sucesso das experincias laboratoriais dos prprios e de terceiros.

N VEL DE SEGURANA 1

O nvel do risco associado ao contacto depender do microrganismo propriamente dito, seu tipo, forma e quantidades, das formas de vida e do tipo de contacto que estabelecido e da durao desse contacto.

Tendo em conta principalmente a segurana dos operadores, consideram-se geralmente quatro nveis de segurana biolgica ("Biohazard") dependentes da perigosidade para o homem ou para o ambiente dos microrganismo s que a so manipulados. Esto tipificados os graus de conteno requeridos para os diferentes nveis de segurana biolgica.

Nos trabalhos que se desenvolvero no laboratrio durante a execuo das prticas aplicar-se- um nvel de segurana 1, adequado para ensino e treino para graduao universitria. Este nvel de segurana biolgica no requer mais que a pele do prprio operador como barreira de conteno, porque os microrganismo s utilizados no representam risco especial para o homem, quando manipulados de acordo com boas prticas laboratoriais, nem para o ambiente.

Um microrganismo nor malmente no associado a doenas humanas poder, contudo, ser lesivo em situaes particulares, como a imunodeficincia ou outras.

Regras

Para alm do risco para o operador, associado manipulao de microrganismo s, as experincias que se realizaro so c ertamente novidade para alguns dos estudantes, com experincia laboratorial limitada e rotinas de boas prticas laboratoriais no estabelecidas. Importa, por isso, prevenir. preciso proteger a sade do prprio experimentador e de terceiros, que tambm podero ser alvo de prticas menos adequadas. O sucesso das experincias depender do grau de rigor com que as mesmas forem executadas e dos baixos nveis de contaminaes cruzadas que for possvel manter.

boa prtica observar, cumprir e fazer cumprir as regras, procedimentos e comportamentos que se indicam:

Acesso

O acesso ao laboratrio de microbiologia restrito s pessoas qualificadas para o efeito, que incluem os estudantes / formandos apenas durante os perodos de aulas previstos.

Bata

O uso de uma bata comprida, limpa e devidamente ajustada ao corpo indispensvel sempre que se opere em laboratrio. A bata protege o operador e o seu vesturio de eventuais acidentes. Idealmente a bata dever ser usada apenas no laboratrio de microbiologia, sendo

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vestida entrada e despida sada. Desta forma, alm de proteger o experimentador, a bata minimiza o transporte de microrganismos exteriores para o laboratrio, permitindo a manuteno de uma baixa carga contaminante e evita a propagao indesejvel no exterior dos microrganismos manipulados no laboratrio.

Cabelos

Os cabelos compridos devero sempre ser atados e no permitido o uso de peas de vesturio soltas, como batas desabotoadas, lenos de pescoo ou gravatas soltas. Alm da movimentao excessiva de ar que provocam, a sua eventual inflamao nos bicos de gs poder ter consequncias desastrosas.

Mos

entrada e sada do laboratrio preciso lavar bem as mos com abundante gua e sabo, tambm para minimizar as contaminaes cruzadas. Dependente do tipo de microrganismo a manipular, o uso de luvas impermeveis, mscaras ou outras proteces, poder ser exigvel. Mesmo quando normalmente no recomendado, o uso de luvas poder ser necessrio em situaes de soluo de continuidade na pele das mos do operador.

Comer e beber

expressamente proibido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto ou aplicar cosmticos durante a execuo de experincias laboratoriais. Usar sempre pipetas mecnicas, nunca pipetar com a boca. aconselhvel adquirir o hbito de manter as mos longe da boca.

Bancada de trabalho

O local de trabalho dever estar sempre devidamente limpo, para o que se impe proceder desinfeco da bancada antes de iniciados os trabalhos, para no permitir a contaminao das prprias experincias com microrganismos de sesses anteriores, e depois das manipulaes terminadas para minimizar a propagao dos microrganismo s com que se operou.

Livros e cadernos

S permitido levar para a bancada o material de apoio estritamente indispensvel execuo do trabalho, como o protocolo experimental, um bloco de notas ou um caderno e um lpis. Todos os restantes pertences do operador, como pastas, casacos ou sacos devero ser acondicionados em local prprio, antes de iniciada a experimentao.

Materiais

Todo o equipamento e material de laboratrio amovvel, utilizado durante a experimentao, dever ser reposto no local indicado depois de concluda a sua utilizao. Particularmente as placas e tubos contaminados para rejeitar devero ser desinfectados ou colocados em local prprio para descontaminao.

Acidentes

Qualquer acidente dever ser de imediato reportado ao responsvel pela sesso de trabalho. Lquidos ou outro material infectado, inadvertidamente transferidos para fora dos contentores a que se destinam devero ser de imediato desinfectados com o apoio do responsvel.

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Planeamento

No iniciar qualquer experincia sem o conveniente planeamento. O conhecimento e compreenso prvios dos procedimentos experimentais, grelhas adequadas para registo dos resultados e a efectiva disponibilidade de todos os recursos materiais necessrios constituem elementos importantes para o sucesso das experincias. O tempo "perdido" num planeamento inicial largamente compensado pelo nvel da aprendizagem conseguido e pela preveno da necessidade de repetio de experincias eventualmente bloqueadas.

Procedimentos gerais

Todos os procedimentos devero ser efectuados tendo em mente a minimizao da contaminao do material em uso e a formao de aerossis ou respingos. A manipulao de microrganismos viveis ou de meios de cultura em placas ou tubos no fechados dever se efectuada nas proximidades da chama, onde o ambiente menos propcio contaminao com outros agentes areos. Correntes de ar ou insectos voadores devero ser evitados, quanto possvel. Tambm no mesmo sentido devero ser evitadas movimentaes ou conversas desnecessrias durante a execuo dos procedimentos laboratoriais.

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REGISTOS E RELATRIOS

conveniente usar um bloco ou caderno para registo de todas as ocorrncias e dos resultados da experimentao. Sugere-se o uso de caderno de laboratrio, de preferncia com folhas no amovveis, por forma a que no sejam eliminadas notas ou registos considerados irrelevantes na altura, como sucede com frequncia quando se passam os apontamentos "a limpo", mas de grande utilidade para consulta futura para eventual repetio da experincia. O rigor e pormenor dos registos efectuados facilitaro a aprendizagem, a interpretao dos resultados obtidos e a redaco posterior do relatrio do trabalho.

Um qualquer relatrio de uma experincia laboratorial dever documentar de forma to completa quanto possvel o procedimento executado e os resultados obtidos. Para alm disso dever ser tambm objectivo do relator redigir um documento compreensvel para o leitor e susceptvel de apoiar a eventual repetio da mesma experincia em idnticas condies.

Para a elaborao dos relatrios sugerem-se, como orientao, as seguintes seces:

Ttulo - Identificador do contedo do relatrio.

Resumo - Pequeno texto de que constem os objectivos almejados e as concluses obtidas.

Objectivo - Razo de ser do trabalho realizado.

Introduo - Dados conhecidos que justificam a realizao da experincia relatada.

Palavras chave - Termos directamente relacionados com o trabalho.

Material e reagentes - Listagem exaustiva do equipamento, reagentes e outro material usado

Protocolo experimental - Marcha geral dos procedimentos aplicados. Devero ser relatados os procedimentos concretos executados, com referncia a eventuais desvios relativamente ao procedimento recomendado / descrito.

Resultados - Registo das observaes efectuadas e dos dados recolhidos.

Discusso - Comentrio crtico aos resultados obtidos.

Concluso - Descrio do cumprimento ou incumprimento do objectivo, decorrente dos resultados obtidos.

Nota crtica - Comentrio globalidade da experincia, com recomendaes para a sua repetio.

Bibliografia - Referncias consultadas ou utilizadas para a realizao do trabalho.

Dependente do tipo do trabalho executado e da forma do relatrio, algumas das seces descritas podero ser fundidas, como "Resultados e discusso" ou "Discusso e concluses", por exemplo.

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TCNICAS LABORATORIA IS BSICAS EM MICROBIOLOGIA

Os microrganismo s so ubquos. Podem encontrar -se no solo, no ar, na gua, na comida, nos esgotos e nas superfcies corporais, entre outros locais. Ou seja, existem por todo o lado nossa volta, o nosso ambiente est repleto de microrganismos. A microbiologia separa estas populaes mistas em espcies individuais para efeitos do seu estudo. Uma cultura que contenha uma nica espcie de clulas designada por cultura pura. Para isolar e estudar os microrganismos em cultura pura, o microbiologista necessita de equipamentos laboratoriais bsicos e da aplicao de tcnicas especficas usando materiais particulares:

Equipamento Autoclave

Esterilizao Ansas e agulhas. Pipetas Transferncia de culturas Banhos de gua e estufas Cmaras de cultura Frigorficos

Materiais Meios de cultura Caldo nutritivo Semi-slido Slido Agar em rampa Agar profundo Placas de agar Tubos para cultura, Placas de Petri

Tcnicas Espalhamento Riscado Incorporao / diluio

M EIOS DE CULTURA

A sobrevivncia e o suporte de vida dos microrganismos depende do fornecimento adequado de nutrientes e convenientes condies para o seu crescimento. Quanto aos nutrientes, grande parte dos microrganismos apenas necessitam de substncia solveis de baixo peso molecular, usualmente originadas pela degradao enzimtica de outros nutrientes mais complexos. Uma soluo contendo estes nutrientes designada como meio de cultura. Em geral, os meios de cultura so lquidos, semi-slidos ou slidos. Um meio lquido sem agente solidificante designado por caldo nutritivo. Um caldo nutritivo suplementado com um agente solidificante, usualmente o agar, origina um meio slido ou semi-slido. O agar um extracto de algas marinhas, um carbo-hidrato complexo que contem maioritariamente galactose e possui muito pouco valor nutritivo. O agar muito adequado como agente solidificante porque se liquefaz a 100C e solidifica a 40C. Devido a estas propriedades, os microrganismos, em especial os patognicos, podem ser cultivados a temperaturas da ordem dos 37C sem receios de liquefaco do meio solidificado. Um meio de cultura bem solidificado exige uma concentrao de agar da ordem dos 1,5 a 1,8%. Uma concentrao inferior a 1% resulta num meio semi-slido. A grande vantagem e utilidade do meio slido reside no facto da existncia de uma superfcie dura, em que os microrganismos podem crescer, adequada utilizao de tcnicas especiais para o isolamento de colnias separadas. Cada colnia formada por um conjunto de clulas resultantes da multiplicao de uma nica clula e representa o crescimento de uma espcie microbiana nica. Uma colnia bem definida e isolada constitui uma cultura pura. Alem disso, o agar quando ainda slido a temperatura elevada, pode ser distribudo por tubos de ensaio que, depois de arrefecidos e solidificado o meio servem para a cultura em profundidade, para teste

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da produo de gs, ou em meio inclinado para cultura em rampa, para teste de caractersticas ou preservao de culturas.

Para alm das necessidades nutritivas, vrios outros factores ambientais precisam de ser controlados para o sucesso da cultura dos microrganismos, como sejam o pH, a temperatura, o ambiente gasoso ou a presso osmtica.

ESTERILIZAO

A esterilizao ponto-chave para o sucesso do trabalho em microbiologia. Para trabalhar em condies de esterilidade fundamental o uso de material estril e a aplicao de tcnicas adequadas. A esterilizao processo pelo qual todas as formas de vida so eliminadas de qualquer meio ou material. As principais tcnicas para a esterilizao de rotina no laboratrio de microbiologia so as seguintes:

Calor Calor seco (ar quente)

160C a 180C durante hora a 3 horas Material de vidro em vazio Calor hmido (vapor) Circulao de vapor a 100C. Esterilizao intermitente

(solues termo -lbeis) Autoclave. Vapor sob presso, temperaturas acima dos 100C

(meios de cultura, solues termo -estveis)

Filtrao Membranas filtrantes com poros de 0,05 m a 0.8 m Remoo de microrganismo s de solues termo-lbeis por

filtrao

Produtos qumicos

xido de etile no Material de plstico Beta-propiolactona Tecidos vivos, materiais biolgicos

TUBOS DE CULTURA E PLACAS DE PETRI

Tubos de ensaio em vidro e placas de Petri em vidro e plstico constituem os principais suportes para o desenvolvimento das culturas de microrganismos. Um meio nutritivo adequado na forma de caldo nutritivo ou de agar usado em tubos de ensaio, enquanto nas placas de Petri apenas se usa meio slido. Um ambiente estril preservado nos tubos de cultura por vrios tipos de tampas. Historicamente o rolho de algodo hidrfobo, desenvolvido por Schroeder e von Dusch no sculo dezanove. Hoje em dia, a maior parte dos laboratrios usam tampas em forma de manga, em metal ou plstico resistente ao calor. A vantagem destas tampas reside no facto de no exigirem tanto trabalho na sua preparao e serem mais facilmente removidas e reintroduzidas nos tubos.

As placas de Petri disponibilizam uma maior superfcie para cultura e crescimento dos microrganismos. So compostas por uma base circular inferior, onde colocado o meio e por uma tampa do mesmo formato e ligeiramente maior que se encaixa na base. Existem placas de Petri de vrias dimenses para diferentes exigncias laboratoriais. Na rotina so usadas placas de aproximadamente 15 cm de dimetro. O meio nutritivo estril, contendo agar, num volume de 15 a 20 ml vertido nas placas quando ainda quente aps fuso do agar e deixado arrefecer a temperatura inferior a 40C. Depois de inoculadas com os microrganismos as placas so incubadas em posio invertida para evitar que as gotas de condensao, formadas na tampa durante o arrefecimento do agar, caiam sobre a superfcie do agar.

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INSTRUMENTOS PARA TRANSFERNCIA DE CULTUR AS

Existe a necessidade de transferir os microrganismos de um meio de cultura para outros, desde culturas de armazenamento e manuteno para culturas de anlise, para o isolamento de culturas puras ou para a expanso da massa de microrganismos. o processo de subcultura que tem de necessariamente ser efectuado com tcnica estril para e vitar potenciais contaminaes das subculturas.

As ansas e agulhas, usualmente fabricadas com metais inertes como a platina e inseridas em cabos prprios para a manipulao, so instrumentos muito durveis de fcil utilizao. So facilmente esterilizveis no momento da sua utilizao por incinerao chama, numa posio quase vertical at o metal ficar ao rubro. Importar depois deixar arrefecer entre 10 a 20 segundos, fora da chama, mas na sua proximidade, onde a carga de microrganismo s ambientais viveis inferior. Depois de arrefecidos, para no inactivar os microrganismo s a transferir, podem ser usadas para "picar" uma cultura slida ou lquida e inocular outro meio. Uma vez esterilizada, a ansa dever ser de imediato utilizada antes de ser de novo colocada na bancada.

As pipetas so outros dos instrumentos de transferncia de culturas de uso muito generalizado. So calibradas e permitem a transferncia de quantidades de culturas lquidas preestabelecidas. So de vidro ou plstico, com uma extremidade afilada e outra para a aspirao e expulso do lquido que contenham. Podem ser esterilizadas por calor seco ou hmido, conforme o tipo de material de que so constitudas. Apesar de tradicionalmente serem instrumentos para "pipetar boca" proibido usar a boca para aspirar microrganismos. Existem auxiliares mecnicos disponveis para o efeito, como peras de borracha ou corpos de seringa que se adaptam na extremidade larga da pipeta.

CMARAS DE CULTURA

Das condies para crescimento dos microrganismos, uma das mais relevantes a sua temperatura ptima de crescimento. As estufas so usadas para a manuteno da temperatura ptima dos microrganismo s em crescimento durante o perodo de cultura. So cmaras em que a temperatura ambiente interior controlada por termstato, para que a mesma seja mantida dentro de limites apropriados para o crescimento celular. Usam em geral um sistema de circulao de ar aquecido e, para evitar a desidratao dos meios em incubao, devero conter tambm uma fonte de vapor de gua (um copo com gua no seu interior, por exemplo).

Os banhos de gua (banho -maria) com gua a temperatura controlada por termstato constituem outro dos instrumentos frequentemente empregues para a criao das condies de temperatura ptima de crescimento dos microrganismo s. O ntimo contacto da gua a temperatura controlada com o recipiente onde crescem os microrganismo s apresenta a vantagem de permitir uma mais rpida e eficaz transferncia do calor. Alm disso, os banhos com agitao facilitam tambm o arejamento das culturas, de grande importncia para o crescimento dos microrganismo s aerbios. A desvantagem do banho de gua reside no facto de s poder ser usado para as culturas em meio lquido, ao contrrio das estufas de ar, que servem tanto para culturas em meio lquido como em meio slido.

FRIGORFICO

O frigorfico outra das peas fundamentais em laboratrio de microbiologia. O ambiente de baixa temperatura que disponibiliza da maior relevncia para a manuteno e armazenamento das culturas em fase de no crescimento entre os perodos de subcultura, e para a conservao dos meios esterilizados e outros reagentes. Tambm as solues e compostos termo-lbeis tm perodos de conservao mais alargados quando armazenados a baixas temperaturas.

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MTODOS DE ESTERILIZAO

Esterilizao um processo que elimina todos os organismos vivos que se encontrem superfcie ou no interior de um material, podendo ser alcanado pela exposio do material a agentes letais fsicos ou qumicos ou, no caso dos lquidos, pela separao mecnica dos organismos atravs de filtraes. Existem muitas formas de esterilizar materiais e meios, e a sua escolha depende da natureza dos materiais a serem esterilizados bem como da disponibilidade de meios de trabalho.

A noo de esterilidade (estril = infecundo) encontra-se frequentemente associada a duas outras: a de assepsia (ausncia de sepsis = putrefaco) e a de desinfeco (livrar da infeco). Estes significados literais correspondem, de facto, s noes tcnicas destas terminologias. Em microbiologia referimo -nos a esterilizao quando se pretende impedir a propagao de microrganismos; a assepsia quando se pretende trabalhar em ambiente desprovido de microrganismos e a desinfeco quando se aplicam tcnicas destinadas a eliminar microrganismos potencialmente patognicos para o operador.

Destas noes, a adquirir no exerccio da experimentao que se desenvolver na disciplina, importa considerar em particular as tcnicas que se utilizam em microbiologia para a eliminao de microrganismo s viveis: a esterilizao.

ESTERILIZAO PELO CALOR

A. Calor Hmido

O aparelho mais usado para esterilizar materiais e meios de cultura a autoclave. As autoclaves trabalham semelhana de panelas de presso domsticas. As autoclaves de laboratrio operam normalmente sob uma presso de 1,02 Bar a uma temperatura de 121C. A autoclave esteriliza a maioria dos materiais em 15-30 minutos, sendo a variao do tempo de esterilizao devida relao superfcie/volume dos materiais a serem esterilizados.

Aspectos da esterilizao por vapor-presso

Temperatura

Os endoesporos das bactrias so as formas de vida mais resistentes ao calor, e a sua destruio pode ser conseguida se for aplicado vapor sobre presso. Uma temperatura de 121C oferece uma boa margem de segurana se for mantida durante um espao de tempo apropriado.

Humidade

A coagulao do protoplasma bacteriano em temperaturas moderadas requer humidade e h medida que esta removida a temperatura necessria para haver coagulao aumenta rapidamente. Se o vapor for sobreaquecido ficar mais "seco" o que ocasiona um aumento da temperatura e do tempo de exposio para a esterilizao, que na situao extrema de esterilizao em calor seco ser de 170C durante uma hora. Em concluso, vapor excessivamente quente perde alguma da sua eficcia como agente letal para alm de poder ser lesivo para os materiais a serem tratados.

Presso

A presso, nos valores usados na autoclave, por si s no exerce qualquer efeito na esterilizao, sendo til para elevar a temperatura do vapor acima dos 100C.

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Tempo

O tempo necessrio para que o vapor penetre e aquea os materiais a serem esterilizados. Mesmo quando as temperaturas de esterilizao so atingidas, os esporos ( e as clulas vegetativas) no so todo s mortos de uma vez. A velocidade de morte uma constante a uma dada temperatura e por cada unidade de tempo de exposio ao agente letal, uma proporo constante de uma dada populao morta. Normalmente demora 11 a 12 minutos a 121C (calor hmido) par a matar os endoesporos das bactrias termoflicas.

Purga

O ar relativamente frio na cmara de esterilizao muito mais pesado que o vapor temperatura de esterilizao. Se no for permitida a sada do ar cria-se uma estratificao na autoclave que condu z a uma falta de uniformizao das temperaturas desenvolvidas. Uma vez que o ar e o vapor so lentos a misturarem-se, as diferenas de temperatura entre camadas pode ser muito grande, por isso a necessidade de se substituir todo o ar por vapor (purga).

Natureza do carregamento

Geralmente, os materiais mais volumosos requerem um maior tempo de esterilizao, sendo prefervel esterilizar pequenos volumes de cada vez, por exemplo prefervel esterilizar 5 bales de litro de cada vez do que esterilizar apenas um balo com cinco litros. Os frascos devem ser tapados com algodo ou papel. Se for necessrio usar rolhas roscadas, devem ir pouco apertadas para a autoclave de modo a permitirem a sada de ar e entrada de vapor, evitando-se assim o rebentamento de frascos na autoclave.

Procedimento para operao da autoclave - Verificar as tampas dos frascos (no apertadas, para permitir a troca de gases com o exterior). - Introduzir na autoclave o material a esterilizar. - Fechar a autoclave e apertar a tampa seguindo os cuidados adequados recomendados. - Abrir a torneira de sada de vapor para permitir a purga do ar no interior. - Ligar a corrente elctrica e colocar o termstato para a posio mxima. - Aguardar que a corrente de vapor que sai pela torneira seja bastante intensa. (Completa

substituio do ar no interior por vapor de gua) - Fechar a torneira de sada do vapor. - Aguardar que o termmetro atinja a temperatura de esterilizao desejada (121C), ou que o

indicador de presso marque 1,02 Bar. - Reduzir a potncia do termstato de modo a manter constante a temperatura. - Atingida a temperatura de esterilizao, iniciar a contagem do tempo (por exemplo 20

minutos). - Desligar a autoclave. - Aguardar at o indicador de presso indicar 0. - Abrir a torneira de purga (pode ainda haver presso e o ar estar muito quente). - Abrir a autoclave. Remover os materiais esterilizados,

(ATENO: os materiais esterilizados podem estar muito quentes) - Depois do arrefecimento conveniente fechar os frascos mal roscados

B. Calor seco

O calor seco usado para esterilizar material de vidro, outros materiais slidos termoestveis e alguns componentes de meios ou alimentos que ficariam imprprios se expostos ao vapor. Trata-se tambm de um dos mtodos de esterilizao mais usados e de muito fcil aplicao. O equipamento indispensvel apenas uma estufa de alta temperatura (160 - 200C). Para alm de ter de ser tida em conta a resistncia trmica dos materiais a esterilizar por esta tcnica, a

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outra precauo a considerar prende -se com a minimizao da possibilidade de contaminar esses materiais depois da esterilizao.

ESTERILIZAO POR GASES

O recente incremento do uso de material de plstico de utilizao nica ("disposable") como seringas, caixas de Petri, tubos de cultura, filtros, etc., levou ao desenvo lvimento de uma nova forma de esterilizao que usa gases txicos para a eliminao dos microrganismo s de materiais termo-sensveis. A aplicao desta tcnica requer a utilizao de equipamentos prprios que forcem a circulao do gs txico atravs de todas as superfcies dos materiais, o que a torna de difcil utilizao em laboratrios de tipo no industrial.

O xido de etileno o gs usado com maior frequncia neste tipo de esterilizaes. Este gs, ao contrrio de muitos produtos qumicos txicos, pouco corrosivo e no altera os materiais a serem esterilizados, sendo facilmente removido por arejamento. As suas desvantagens incluem a necessidade de longos perodos de exposio para se obter a esterilizao (vrias horas), a reactividade com componentes dos meios e certos tipos de plsticos e a necessidade de equipamentos prprios e disponibilidade do gs, como se referiu.

RADIAES

Alguns processos comerciais usam as radiaes para a esterilizao a frio de certos materiais como produtos farmacuticos, por exemplo. A irradiao o uso de radiaes ionizantes de alta energia que incluem raios gama produzidos a partir de cobalto-60 ou csio -139 e de raios catdicos produzidos em geradores e aceleradores de electres.

A irradiao com luz ultravioleta no uma forma muito satisfatria de esterilizao dada a sua fraca capacidade de penetrao nos materiais e produtos a esterilizar. , contudo, de utilizao frequente na diminuio do nvel de contaminao de espaos confinados, como salas estreis ou pequenos ambientes.

FILTRAO ESTRIL

O principal mtodo para a esterilizao de lquidos que contenham componentes termo -sensveis tais como vitaminas, protenas sricas e antibiticos, por exemplo, a filtrao. Tradicionalmente os microbiologistas esterilizavam estes produtos recorrendo a filtros feitos a partir de terra de diatomceas e fibras de asbesto, previamente esterilizados em autoclave. Presentemente estes filtros foram substitudos por filtros de acetato de celulose ou policarbonatos nos quais os tipos de poros desenvolvidos permitem filtraes com elevados graus de preciso. Existem actualmente disponveis no mercado filtros esterilizantes de vrios poros e capacidades filtrantes. Os mais frequentes e, por isso, mais acessveis so filtros de poros de 0,45 m ou 0,2 m de dimetro, que retm os microrganismos presentes nas solues.

Para esterilizar uma soluo por filtrao, no h mais que passar essa soluo atravs de um destes filtros pela aplicao de uma presso positiva no lquido a filtrar (filtros de seringa, por exemplo) ou na rarefaco do ar no contentor que recebe o filtrado. Em qualquer dos casos esta tcnica requer a recolha do filtrado em condies de assepsia para impedir a contaminao do lquido esterilizado.

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O MICROSCPIO

A Microbiologia , por definio, uma cincia que estuda os organismos vivos demasiado pequenos para poderem ser vistos a olho nu. Necessrio ser, por isso, usar microscpios para poder observar os microrganismos. Se bem que existam vrios tipos de microscpios, todos eles so basicamente constitudos por dois sistemas de lentes, uma fonte de luz e mecanismos mecnicos de ajuste das distncias focais.

COMPONENTES PRINCIPAI S DO MICROSCPIO

Platina

A platina do microscpio uma plataforma com uma abertura central para permitir a passagem da luz, abaixo dos sistemas de lentes. Esta plataforma constitui a superfcie de suporte para colocao das amostras. Em geral as amostras de microrganismos so colocadas em lminas de vidro transparente sobre a abertura central da platina. A maior parte dos microscpios tm tambm mecanismos mecnicos que permitem a movimentao das lminas na horizontal para posicionamento da amostra.

Fonte luminosa

A fonte de luz encontra-se por baixo da amostra. A iluminao pode ser exterior ao microscpio, natural ou artificial, conduzida para a amostra por espelhos que a concentram ou ser proveniente de uma fonte prpria directamente dirigida por lentes.

Condensador

Este componente encontra-se imediatamente abaixo da platina e constitudo por lentes que permitem a concentrao da luz nos sistemas das lentes de amplificao, depois de passar pela amostra a ser observada. Usualmente tem tambm acoplado um diafragma para regulao do nvel de luminosidade adequado observao.

Lentes

O corpo do microscpio constitudo por um tubo onde esto alojados os dois sistemas de lentes para ampliao. No cimo do tubo existem as oculares, por onde se observa, e no extremidade inferior as objectivas que recolhem a luz proveniente da fonte de iluminao depois de passar pela amostra. Um sistema mecnico permite aproximar e afastar a objectiva do objecto de acordo com a ampliao a usar e para focagem.

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PRINCPIOS TERICOS

Para a utilizao eficiente do microscpio convir compreender os princpios bsicos do microscpio, que a seguir se indicam.

Ampliao

A capacidade de ampliao depende dos conjuntos de lentes instaladas no tubo do microscpio: a ocular e a objectiva. A objectiva, na parte inferior do tubo, produz uma imagem real projectada no plano fo cal, imagem essa depois ampliada pela ocular para a produo da imagem final observvel. Os microscpios mais frequentes so equipados com um tambor que contem vrias objectivas com diferentes capacidades de ampliao. A ampliao total da amostra resulta do produto da capacidade de ampliao da objectiva pela capacidade de ampliao da ocular:

Ampliao

(Objectiva) (Ocular)

Ampliao final (Objectiva X

ocular)

4 X 10 X 40 X

10 X 10 X

100 X

45 X 10 X 450 X

100 X 10 X

1000 X

Resoluo

Apesar da ampliao ser importante, deve notar-se que no ilimitada pelo simples aumento da capacidade de ampliao das lentes oculares e objectivas. A capacidade de ampliao das lentes est limitada pelo seu poder de resoluo. O poder de resoluo definido pela capacidade da lente em permitir a identificao de dois objectos adjacentes como entidades discretas. Quando a discriminao deixa de ser possvel, isto , quando dois objectos se confundem num s, a lente perdeu a sua capacidade de resoluo. Maiores ampliaes no corrigem esta perda, apenas permitem a observao de imagens dos objectos cada vez mais difusas. O poder de resoluo de uma lente depende do comprimento de onda da luz, da abertura numrica, caracterstica de cada lente e dependente do seu dimetro e da relao deste com a distncia focal e do ndice de refraco do material da lente.

Iluminao

Para uma boa observao necessrio que a quantidade de luz seja apropriada ampliao. A iluminao regulada pelo condensador e pelo diafragma que permitem uma concentrao da luz na amostra em quantidades apropriadas. Demasiada luz obscurece o objecto, por falta de contraste e luz insuficiente no permite a observao. A intensidade da luz para a observao depende tambm do tipo de amostra a ob servar, do nvel da sua transparncia e/ou concentrao.

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Com regra, quando a ampliao das lentes aumenta, diminui a distncia de trabalho (entre a objectiva e o objecto) e aumenta a abertura numrica (exige mais luz). As relaes prticas aproximadas entre as distncias de trabalho e as objectivas so:

Objectiva Distncia de trabalho Objectiva Distncia de trabalho

4 X 9 - 10 mm

45 X 0,5 - 0,7 mm

10 X 5 - 8 mm 100 X 0,13 - 0,18 mm

OBSERVAO AO M ICROSCPIO

Os passos que se indicam devero ser cumpr idos para uma correcta e eficiente utilizao do microscpio.

Afastar a objectiva da platina

Colocar a lmina na platina de forma a centrar o objecto da observao

Rodar o tambor das objectivas posicionando a de menor ampliao

Aproximar a objectiva da lmina a uma distncia inferior prevista (ver tabela acima). Nunca movimentar o tubo observando pela ocular.

Afastar a objectiva da lmina, observando pela ocular, at obteno de uma imagem ntida

Regular a intensidade luminosa e focagem usando o diafragma (ou regulador da fonte de iluminao) e o condensador

Centrar no campo visual o microrganismo a observar

Muitos microscpios uma vez focados com a objectiva de menor ampliao ficam focados para as restantes

Rodar o tambor das objectivas para a ampliao pretendida (a observao com objectiva de 100 requer o uso de leo de imerso entre a lente e a lmina)

Acertar a focagem com o parafuso micromtrico

Observar e registar observao, movimentando a lmina na horizontal, se necessrio

Remover a amostra. Limpar a platina e a lente. Posicionar a objectiva de menor ampliao. Descer o tubo ocular.

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MORFOLOGIA DAS BACTRIAS

A morfologia dos microrganismo s s pode ser observada ao microscpio. Mas devido ao seu reduzido tamanho e ao seu ndice de refraco, muito prximo do ndice de refraco da gua, no fcil a observao microscpica de microrganismos em geral e de bactrias em particular. Sendo tambm, em geral, no pigmentadas, a observao microscpica s se torna acessvel aumentando o contraste entre o meio envolvente e o contedo celular. Para permitir o estudo das propriedades das bactrias e classific-las em grupos para efeitos de diagnstico, vrias coloraes biolgicas e procedimentos especficos foram desenvolvidos.

CORANTES

Quimicamente um corante pode ser definido como um composto orgnico que contem um ncleo benznico ligado a um cromforo e a um grupo auxocrmico:

Benzeno

+ Solvente orgnico incolor

Cromforo +

Grupo qumico que introduz c or no anel benznico

Cromognio: Composto corado (no corante)

Auxocromo Grupo qumico ligado ao cromognio e que pode ligar-se s estruturas celulares

Corante

Um dos corantes frequentemente usados para contrastar o meio citoplasmtico de bactrias e clulas o azul-de-metileno . Quando em soluo ioniza-se, originando um cromognio positivamente carregado, e reage reversivelmente com os componentes celulares de carga negativa. A imagem documenta as trs partes constituintes do corante: ncleos benznicos, Cromforo (anis aromticos com duplas ligaes) e o auxocromo (io cloreto):

Quanto s suas caractersticas inicas, os corantes podem ser bsicos ou catinicos (como o azul de metileno) e cidos ou aninicos que se ionizam em cromognios de carga negativa e se ligam s estruturas celulares de cargas positivas.

As tcnicas de colorao podem subdividir-se em tcnicas simples para visualizao directa da morfologia, como exemplo o azul-de-metileno, ou diferenciais, que possibilitam a discriminao entre tipos morfolgicos diferentes de bactrias ou determinadas estruturas subcelulares.

Colorao negativa Colorao do meio envolvente das bactrias Nigrosina Tinta da china

Colorao simples (Morfologia - cocos, bacilos, etc. - e associaes entre bactrias - pares, cadeias, cachos, etc.)

cidos Bsicos Indiferenciados

Tipos de coloraes

Colorao diferencial Separao entre grupos Gram cido-resistente

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Visualizao de estruturas

Flagelos Cpsulas Esporos Ncleos

Colorao de Gram

A colorao de Gram, desenvolvida em 1884, a colorao diferencial mais utilizada em microbiologia e permite classificar as bactrias em dois grupos: as Gram negativas e as Gram positivas.

Parede rgida Parede externa

Peptidoglicano + + Acido Teicoico + Polisacridos + Protena + Lipopo lisacridos + Lipoprotena + ou + cido resistentes nunca so podem ser Sensibilidade a:

Sulfamidas Penicilina Azida de sdio

pouco sensveis pouco sensveis

pouco resistentes

muito sensveis muito sensveis

resistentes

O processo da colorao baseia-se na capacidade que certos microrganismos possuem em reter a colorao do cristal violeta por descolorao com lcool, so as Gram positivas. As que se deixam descorar, as Gram negativas, so depois contrastadas com um corante de cor diferente.

A capacidade de reter a colorao inicial, nas condies do procedimento, devida diferente estrutura da parede celular (ver imagem e tabela de caractersticas). Em particular as vrias camadas do peptidoglicano existente nas bactrias Gram positivas so responsveis por impedir a remoo dos complexos, que se formam entre o cristal violeta e o mordente (substncia que aumenta a afinidade entre a clula e o corante), no passo da lavagem com lcool.

Basicamente a colorao de Gram consta de uma exposio inicial da bactria ao cristal violeta, aps o que adicionada uma soluo de iodo. O iodo penetra com facilidade na clula e forma complexos insolveis com o cristal violeta. A adio do lcool no passo seguinte permite a eliminao dos complexos por pas sagem atravs da fina camada de peptidoglicano das Gram negativas, mas insuficiente para os fazer passar atravs da grossa camada das gram positivas. Depois da lavagem com o lcool, as Gram negativas, que ficaram descoradas, so contrastadas com um segundo corante, de cor diferente e menos intenso que o primeiro. O passo crtico a remoo dos complexos do cristal violeta - iodo pelo lcool. Um tratamento excessivo pode descorar as bactrias Gram positivas e um tratamento insuficiente no remover a cor violeta das bactrias gram negativas.

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MEIOS DE CULTURA

TIPOS DE MEIO

Existem vrios tipos de meios em que as bactrias podem crescer. Os meios podem ser definidos ou complexos.

Nos meios quimicamente definidos, quantidades determinadas de reagentes qumicos puros so misturados para a preparao do meio de cultura. Contm, em geral, sais inorgnicos que incluem fontes de carbono e de azoto. Outros componentes indispensveis ao crescimento bacteriano so necessrios em to pequenas quantidades que as pequenas contaminaes dos reagentes qumicos usados na preparao do meio so suficientes.

Meios complexos, que contm todos os ingredientes necessrios ao crescimento do microrganismo, so compostos por misturas de protenas e outros extractos de origem biolgica, em que as quantidades precisas de cada aminocido ou glcido, por exemplo, no so conhecidas. Alguns dos componentes dos meios complexos so resultantes de digestes preliminares de produtos biolgicos. Estas digestes permitem uma melhor acessibilidade do microrganismo aos materiais plsticos de que necessita. Peptonas e triptonas, hidrolizados enzimticos de protena animal e de levedura, respectivamente, so dois frequentes constituintes dos meios complexos.

Um exemplo de cada um destes dois tipos de meio:

Meio definido

Meio complexo

NaNO 2 0.1 g/l Triptona 5,0 g/l

K2HPO4 0.5 g/l

Extracto de levedura 2,5 g/l

CaCO 3 5.0 g/l Glucose 1,0 g/l

MgSO 4 . 7 H2O 0.2 g/l

Agar 15,0g/l

FeSO 4 . 7 H2O 0.005 g/l

NaCl 0.5 g/l

Para alm de definidos ou complexos, os meios de cultura poderem tambm ser classificados de outras forma, Nomeadamente:

Meios Enriquecidos - Quando contm tambm alguns importantes factores de crescimento como vitaminas, aminocidos ou componentes do sangue. So meios necessr ios para fazer crescer microrganismos mais exigentes;

Meios Selectivos - A utilizao deste tipo de meios permite a seleco de um microrganismo particular de entre uma populao em que os restantes microrganismo s presentes no conseguem crescer. Os aditivos para tornar estes meios selectivos so os antibiticos ou outros compostos txicos;

Meios Diferenciais - Como o nome indica, este tipo de meio permite a separao de microrganismos de diferentes caractersticas, como a colorao das colnias ou da regio envolvente do meio de cultura.

Meios Salinos Mnimos - So meios quimicamente definidos que contm apenas os sais inorgnicos indispensveis ao crescimento bacteriano (o exemplo de meio definido atrs um meio salino mnimo). Uma determinada fonte de carbono pode ser adicionada, dependendo do tipo de microrganismo a fazer crescer no meio.

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Alguns meios podem ser considerados, em simultneo, englobados em mais de uma das categorias indicadas. Um agar salino de manitol, por exemplo, um meio complexo, dife rencial e selectivo.

PREPARAO

A preparao prtica de um meio de cultura relativamente simples e pode ser conseguida com sucesso se as regras seguintes forem devidamente aplicadas:

Usar sempre material de vidro bem lavado e enxaguado com gua destilad a, para evitar contaminaes com detergentes ou outros qumicos;

Usar sempre esptulas limpas na pesagem dos componentes;

Os rtulos dos meios desidratados contem instrues para a sua preparao e referncia s quantidades de gua para a sua dissoluo;

O s componentes devem ser pesados individualmente para receptculos individuais. Nunca devolver ao frasco original quaisquer quantidades do componente removidas em excesso;

prefervel adicionar os componentes a gua previamente colocada no vaso para a dissoluo. O contrrio pode originar a formao de agregados colados ao fundo do frasco de difcil dissoluo;

Se o meio contem muitos componentes prefervel dissolv-los individualmente antes de efectuar a mistura. A adio de agar dever ocorrer no fim da preparao e s depois dos restantes componentes j se encontrarem dissolvidos;

No preparar nenhum meio se no for possvel esteriliz-lo de imediato;

Nunca autoclavar um meio em frasco que esteja a mais de meio. As rolhas ou tampas no devero estar apertadas durante a autoclavagem.

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CONTAGENS DE MICRORGANISMOS

Os estudos em microbiologia obrigam com frequncia determinao do nmero de microrganismos num determinado volume, para caracterizao da populao presente numa certa amostra, ou para avaliao do crescimento do microrganismo em considerao. Vrios mtodos podem ser usados para o efeito, dependendo do tipo de microrganismo , dos recursos laboratoriais disponveis e do objectivo do estudo, nomeadamente:

MTODOS DIRECTOS

- Cmaras de contagem microscpica (manual) - Turbidimetria - "Coulter counter" (electrnica) - Peso seco ou pasta mole

MTODOS QUMICOS

- Avaliao de DNA / protenas - Parmetros metablicos

(consumo Oxignio, produo de dixido de carbono) CONTAGEM DE VIVEIS

- Incorporao de diluio em agar - Diluio limite - Filtrao estril e cultura de filtrado

AVALIAO DIRECTA

O mtodo por ventura mais simples e rpido executado por diluio da amostra e contagem directa dos microrganismo s ao microscpio.

Dada uma populao de microrganismo s a quantificar, h que dilui-la de forma apropriada e contar o nmero total de microrganismos num determinado volume da diluio. Existem lminas de microscpio que contm cmaras de contagem de volumes conhecidos. Estas cmaras permitem a determinao da conc entrao de microrganismos na amostra de partida por clculos efectuados a partir do nmero de microrganismos observados na superfcie delimitada.

Sendo um processo prtico, no , contudo, aplicvel a fungos ou bolores, por exemplo, onde difcil identificar clulas individuais ao microscpio. Para estas situaes, outras medidas indirectas so aplicveis. A pesagem da matria seca (aps eliminao do meio de cultura ou solvente) constitui um indicador da massa presente na amostra, por exemplo.

A avaliao da capacidade de uma suspenso de microrganismo s em dispersar e absorver a luz incidente , dentro de certos limites, proporcional concentrao da matria insolvel em suspenso. Utilizando espectrofotmetros apropriados possvel construir curvas de absoro, de disperso ou reflexo da luz em funo da concentrao de determinado microrganismo em suspenso. Dada uma amostra problema, o seu comportamento face a um raio de luz incidente permite posicionar o resultado observado na curva padro e assim determinar a sua concentrao relativa.

Quaisquer destes mtodos permitem determinar o nmero de microrganismos numa unidade de volume da amostra em estudo, mas no fornece indicaes sobre as concentraes de microrganismos viveis ou cultivveis.

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CONTAGEM DE VIVEIS

Os mtodos de contagem aps crescimento permitem a avaliao das populaes de microrganismos viveis e baseiam-se na capacidade de desenvolvimento de uma cultura (ou colnia), a partir de uma nica clula. A partir da amostra em estudo procede-se a diluies sucessivas, inoculao de meios de cultura apropriados e avaliao do nmero de microrganismos cultivveis.

Quando se pretende determinar o nmero de microrganismo s presentes em amostras de leite ou gua, por exemplo, usa-se a chamada tcnica de contagem em placa. Estas contagens so efectuadas por incorporao de um volume conhecido da amostra (frequentemente diluda), em agar nutritivo adequado e conveniente incubao. Da mesma forma o espalhamento uniforme de um volume conhecido da amostra na superfcie de um agar slido origina a formao de colnias discretas, cada uma delas proveniente de um microrganismo que se posicionou nesse local. A concentrao de microrganismos presentes na amostra inicial calculada a partir do nmero total de colnias que se desenvolveu na placa, das diluies efectuadas e do volume de diluio incorporado ou espalhado sobre o agar.

Quando a concentrao de microrganismo s na amostra em estudo baixa as contagens de microrganismos so efectuadas aps conveniente concentrao da amostra. Para o efeito regra proceder-se filtrao de um volume conhecido da amostra por filtros esterilizantes (que retm as bactrias presentes) e inoculao do filtro sobre superfcie de agar nutritivo. Nos locais do filtro em que foram retidas bactrias haver o desenvolvimento de uma colnia e o nmero total de colnias corresponder ao nmero de bactrias cultivveis presentes no volume de amostra filtrado.

As contagens podem tambm ser efectuadas por crescimento microbiolgico em meio lquido. Para tanto h que proceder a mltiplas diluies sequenciais da amostra em estudo, at para alm da probabilidade de existncia de um s microrganismo no volume de diluio a inocular no meio de cultura. Aps conveniente incubao de todos os meios inoculados, observar -se- o crescimento at uma certa diluio e ausncia de crescimento nas maiores diluies subsequentes. Tendo em conta a primeira diluio em que se no observa crescimento e a ltima em que ainda existe esse crescimento (correspondente inoculao de, pelo menos, uma bactria), o nmero de rplicas efectuadas e as diluies sequenciais, determina-se o nmero mais provvel de microrganismos presentes na amostra inicial, de acordo com procedimentos estandardizados e tabelas estatsticas apropriadas.

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ISOLAMENTO DE COLNIAS EM MEIO SLIDO

SEMENTEIRA POR ESPALHAMENTO

Se aplicarmos uma algota de cultura bacteriana lquida ou suspenso de bactrias sobre a superfcie de um meio com agar numa caixa de Petri, e se a espalharmos uniformemente com uma vareta de vidro dobrada (semeador de vidro) ou com o auxlio de pequenas esferas de vidro esterilizadas, de tal maneira que as clulas bacterianas presentes fiquem uniformemente afastadas umas das outras, aps incubao obteremos colnias individualizadas.

Para o sucesso no isolamento de colnias pela tcnica do espalhamento necessrio que o nmero de bactrias viveis presentes seja discreto e no muito elevado. Para uma placa de Petri de 10 cm de dimetro adequado utilizar um nmero de bactrias da ordem da centena. Se o nmero de bactrias total da suspenso a usar no conhecido, devero efectuar -se diluies prvias do incuo.

SEMENTEIRA POR RISCADO

A tcnica conhecida como riscado das mais frequentemente empregues em microbiologia para o isolamento de colnias, dada a facilidade da sua execuo.

Existem vrias tcnicas de riscado, todas elas dando excelentes resultados se executadas correctamente. O objectivo do riscado o de produzir colnias bem separadas umas das outras a

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partir de uma suspenso de clulas concentrada. As clulas ficam muito juntas no incio do riscado, dando colnias confluentes, mas medida que o riscado continua cada vez menos clulas permanecem na ansa ocasionando a que se depositem cada vez mais afastadas umas das outras no meio de cultura, formando colnias cada vez mais separadas (Ver Figura). Uma boa placa de riscado resulta de vrios movimentos contnuos ou descontnuos (com esterilizao chama e arrefecimento) da ansa ou semeador ao longo da placa.

Antes de executar os seus riscados em placa atente na demonstrao feita, dando especial ateno esterilizao da ansa entre cada srie de riscos, bem como ao seu arrefecimento subsequente (para no inactivar as clulas a que vai tocar a seguir ).

Procedimento geral

Utilize placas de Petri com LB/agar/amp. Com a ansa de inoculao, risque cuidadosamente uma cultura mista sobre as placas utilizando uma das tcnicas ilustradas na figura. Preste ateno fora com que aplica a ansa na superfcie do agar, de forma a no a rasgar.

Coloque as placas, em posio invertida, na estufa de incubao a 37C. No esquecer de identificar convenientemente as placas com o seu nome, data e contedo.

Aps incubao, estude o crescimento bacteriano das nas placas. Observe as diferenas em termos de forma, tamanho e aparncia das colnias formadas. Avalie se a tcnica de riscado foi aplicada correctamente para o isolamento de colnias.

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CONDIES AMBIENTAIS DE CRESCIMENTO DOS MICRORGANISMOS

Para alm dos nutrientes para a sntese dos seus componentes vitais e da energia qumica necessria ao seu metabolismo, outras condies ambientais so necessrias para um adequado crescimento microbiano no laboratrio. Entre os parmetros a controlar merecem especial destaque as concentraes relativas de oxignio, os valores do pH no meio e a temperatura para o seu crescimento.

OXIGNIO

Entre os microrganismos existe uma grande variao quanto s suas necessidades em oxignio.

Os aerbios estritos (ou obrigatrios) crescem apenas na presena de oxignio. Encontram-se normalmente superfcie de plantas, nas camadas superficiais do solo e em suspenso nas poeiras. Estes organismos possuem apenas metabolismo respiratrio e usam o oxignio como nico aceitador final na sua cadeia transportadora de electres.

Os anaerbios estritos (ou obrigatrios) no necessitam de oxignio para o seu crescimento, o oxignio de facto txico para este tipo de microrganismos. Encontram-se geralmente em zonas pantanosas, no estmago dos ruminantes, no interior do intestino humano e de outros animais no ruminantes ou alojados nos tecidos de feridas profundas, o metabolismo deste tipo de microrganismos normalmente fermentativo.

Os microrganismos com metabolismo fermentativo, e que portanto no usam o xignio no seu metabolismo, mas que a sua presena no tem efeitos txicos designam-se por anaerbios aerotolerantes.

Para alm destes podem ainda considerar -se outros grupos de microrganismos atendendo s suas necessidades em oxignio, assim tem-se ainda os microaeroflicos que requerem oxignio livre para o seu crescimento mas numa concentrao muito baixa (2 a 10%).

A maioria dos microrganismos conhecidos encontra-se algures entre os dois extremos dos aerbios estritos e dos anaerbios aerotolerantes. So os anaerbios facultativos que crescem tanto na presena como na ausncia de oxignio. Estes organismos respiram quando dispem de oxignio e fazem metabolismo fermentativo quando este se esgota. Atendendo a que obtm mais energia quando respiram estes organismos crescem mais depressa em condies aerbicas do que em condies de anaerobiose.

Se um microrganismo anaerbio facultativo for inoculado em meio de cultura apropriado e incubado, as clulas vo respirar at todo o oxignio ser consumida a partir dessa altura o seu metabolismo passa a fermentativo, o seu crescimento continua mas mais lentamente. Esta situao acontece frequentemente em ambientes aquticos onde se d a deposio de detritos animais e vegetais e em processos de fermentao controlados para a obteno de determinados alimentos e bebidas.

O conhecimento do modo como o oxignio afecta o metabolismo de determinado microrganismo deve sugerir a melhor maneira de o estabelecer em cultura (fazer crescer) e de o classificar.

Para alm de aceitador final na cadeia transportadora de electres na respirao o oxignio altera o potencial de oxidao - reduo das clulas. Muitos sistemas enzimticos das bactrias exigem condies extremamente reduzidas, ou seja um potencial de oxidao - reduo baixo para que possam funcionar e vice-versa.

O tipo de crescimento microbiano ao longo de um tubo de ensaio reflecte a sua necessidade relativa de oxignio. Os aerbios estritos cresceram apenas superfcie do meio no tubo, os anaerbios facultativos deve m crescer ao longo de todo o tubo, os aerotolerantes anaerbios cresceram tambm ao longo de todo o tubo mas provavelmente cresceram melhor junto ao fundo. O crescimento dos anaerbios estritos depende de at que ponto o oxignio se consegue

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difundir no me io de cultura e da sensibilidade das clulas em questo s formas txicas de oxignio. Anaerbios que sejam muito sensveis a ambientes que contenham oxignio podem nunca conseguir crescer, mas outros crescero desde o fundo at ao topo do tubo.

PH DO MEIO

O pH constitui outro dos factores que influncia o crescimento microbiano. Cada espcie cresce numa gama definida de pH e tem um pH ptimo para o seu desenvolvimento. Os microrganismos acidfilos tm o seu ptimo de crescimento entre 0 e 5,5. Os neutrfilos entre 5,5 e 8 e os alcalfilos entre 8,5 e 11,5. Os alcalfilos extremos tm o seu ptimo de crescimento a valores de pH superiores a 10. De um modo geral cada tipo de microrganismos tem preferncia por uma gama caracterstica de pH. A maioria das bactrias e protozorios so neutrfilos. A maioria dos fungos prefere ambientes ligeiramente cidos, entre pH 4 e 6. As algas tambm parecem preferir condies ligeiramente cidas.

Embora os microrganismos, de um modo geral, possam crescer numa gama relativamente grande de pH existem limites para a sua tolerncia. Variaes drsticas no pH podem causar o rompimento da membrana celular ou inibir a actividade enzimtica ou os transportadores membranares de protenas.

Apesar das possveis variaes de pH no habitat, o pH interno da maioria dos microrganismos situa-se prximo da neutralidade (5 a 5,5). Vrios mecanismos tm sido apontados como responsveis por esta situao. A membrana plasmtica pode ser relativamente impermevel aos protes. Os neutfilos aparentemente trocam potssio por protes recorrendo a um sistema de transporte activo. Os alcalfilos extremos mantm o seu pH interno prximo da neutralidade trocando ies sdio internos por protes externos. Para alm disso existe uma certa capacidade tampo a nvel interno que contribui para esta homeostasia do pH.

Os microrganismos frequentemente alteram o pH do seu habitat atravs da produo de produtos do seu metabolismo de carcter cido ou bsico, por esta razo so normalmente includos nos meios de cultura tampes cuja finalidade evitar que os metabolitos excretados alterem o pH de tal forma que seja inibitrio para o crescimento.

TEMPERATURA

A temperatura constitui outro factor que influencia profundamente o crescimento microbiano, tal como acontece para todos os outros organismos. Os microrganismos so particularmente sensveis temperatura uma vez que so geralmente unicelulares e poiquilotrmicos (a sua temperatura varia com a temperatura externa). A temperatura influencia de forma decisiva o crescimento microbiano uma vez que interfere na velocidade das reaces enzimticas. A taxa de cada reaco aumenta medida que aumenta a temperatura, deste modo o metabolismo como um todo mais activo a altas temperaturas e o microrganismo cresce mais depressa. A partir de determinados valores o crescimento acaba por ser menor, e temperaturas demasiado altas podem mesmo ser letais. Estas temperaturas provocam a desnaturao das enzimas, dos transportadores de membrana e outras protenas. Temperaturas muito elevadas provocam a rotura das membranas celulares uma vez que a dupla camada lipdica se altera por aco do calor. Assim e embora em termos funcionais as enzimas operem mais rapidamente a temperaturas elevadas, o crescimento microbiano acaba por sofrer decrscimo s na medida em que os estragos causados por estas temperaturas no podem ser reparados de forma adequada.

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Definem-se 5 classes de microrganismos de acordo com a sua gama de temperatura de crescimento:

Classe Temperatura (C)

Psicrfilos 0 - 15

Psicrotrficos 0 - 35

Mesfilos 15 - 45

Termfilos 45 - 80

Hipertermfilos 65 - 110

Os psicrfilos crescem bem a 0C e a sua temperatura ptima de crescimento situa-se nos 15C ou abaixo disso. As membranas celulares destes microrganismos tm nveis elevados de cidos gordos insaturados que permanecem num estado semi-fluido a baixas temperaturas e os seus sistemas enzimticos, de transporte e sntese proteica esto adaptados a estas condies. A temperatura mxima que toleram 20C, a partir deste valor as me mbranas celulares sofrem disrupo e a clula perde o seu contedo. Estes microrganismos vivem nas zonas do rctico e Antrctico.

Os psicotrficos ou psicrfilos facultativos podem crescer a 0C, embora a sua temperatura ptima de crescimento se situe entr e os 20 e 30C. A temperatura mxima que toleram 35C. Estes microrganismos, normalmente bactrias e fungos, so a principal causa de deteriorao de alimentos refrigerados.

Os mesfilos tm uma temperatura ptima de crescimento entre 20 e 45C e toleram temperaturas mnimas de 15 a 20C e mximas de 45C. A maioria dos microrganismos pertence a esta classe. Quase todos os agentes causadores de doenas no Homem so mesfilos.

Os temfilos podem crescer a temperaturas de 55C ou superiores, o mnimo que toleram 45C e a sua temperatura ptima de crescimento situa-se entre os 55 e 65C. Na sua grande maioria so bactrias que proliferam em silagens, compostos ou linhas de gua sobreaquecidas. Os seus sistemas enzimticos e protenas so mais estveis que os dos mesfilos e os lipidos de membrana so mais saturados.

Os hipertermfilos tm a sua temperatura ptima de crescimento entre 80 e 110C, normalmente no crescem bem a temperaturas inferiores a 65C. Foram encontrados alguns microrganismos deste tipo a crescer a grandes profundidades no mar, em zonas muito quentes.

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PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS

P1. MICRORGANISMOS NO MEIO AMBIENTE

Introduo

O nosso meio ambiente est repleto de microrganismos. Podemos encontr-los no ar, na gua, nos vrios objectos e superfcie s que nos circundam, etc. e por isto que o trabalho em microbiologia dever ser executado em condies de assepsia que impeam a contaminao dos meios usados com microrganismos adventcios.

Este trabalho pretende ilustrar a ubiquidade dos microrganismos.

Material e Reagentes - Estufa de incubao - Placas de Petri com agar nutritivo - Placas de Petri com meio de mosto

Procedimento experimental

Testar vrios ambientes e objectos existentes no laboratrio, usando placas de Petri contendo meio slido nutritivo para a revelao dos microrganismos a detectar. Cada grupo dever eleger um dos seguintes elementos a testar:

Identificar as placas, no fundo, com:

1. Data, Operador, Incuo

2. Abrir uma placa sobre a bancada e deix-la exposta durante cerca de 30 minutos

Tossir para a superfcie do agar

Espalhar gua da torneira sobre o agar. Aguardar alguns minutos. Remover o excesso com papel absorvente

Tocar com os dedos em vrios locais da superfcie do agar

Tirar um cabelo e "col-lo" superfcie do agar

Use a imaginao para inocular outras placas

Incubar as placas de Petri em estufa a 25C durante, pelo menos, uma noite

3. Observar as placas e registar :

Nmero de colnias totais e Nmero de colnias diferentes

Aspecto geral da placa e das colnias

4. Descrever as caractersticas das colnias, acompanhando de esboos dos aspectos observados, relativamente a:

Superfcie e bordos da colnia (lisa, rugosa, granular, irregular, filamentosa, etc.)

Caracterstica pticas (cor, transparncia, brilho, etc.)

Consistncia (membranar, butirosa, quebradia, etc.)

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Registo de resultados

MICRORGANISMOS NO MEIO AMBIENTE

Operador: Data: ____/____/____

Incuo: Total de colnias:

Caracterizao das colnias observadas

Dimenso Aspecto Cor Consistncia Nmero de

colnias Desenho

Notas:

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P2. OBSERVAO COMPARADA DE BACTRIAS, FUNGOS E PROTOZORIOS

Introduo

Os microrganismo s no so todos iguais embora partilhem a caracterstica comum de na sua maioria serem individualmente invisveis a olho nu, necessitando por isso de ampliao de forma a serem visualizados. Os microrganismo s diferem entre si na sua organizao celular, na sua aparncia e na sua actividade. A dimenso celular s por si pode-nos auxiliar na constituio de diferentes grupos.

Podemos dividir os microrganismos em dois grandes grupos baseados no tipo de organizao celular. Os microrganismo s eucariticos e os microrganismos procariticos. Os microrganismo s eucariticos incluem trs grandes grupos; os protozorios, as algas e os fungos. Estes ltimos, os fungos, so divididos em dois subgrupos em funo da sua organizao multicelular ou unicelular, bolores e leveduras respectivamente. Os microrganismos procariticos incluem as bactrias e as cianobactrias.

Protozorios. Considerados como simples "animais" unicelulares dada a complexidade das suas estruturas celulares. So conhecidas muitas espcies que colonizam ambientes aquticos ricos em nutrie ntes tais como lagoas, mares e gua do solo. A maioria de vida livre e inofensivos para o homem apesar de algumas espcies serem patognicas causando doenas tais como a malria e a doena do sono. So microrganismos eucariticos possuindo um ou mais ncleos. Frequentemente mveis possuindo como meios de locomoo clios, flagelos ou pseudpodes. As suas dimenses so variveis podendo variar de alguns m a vrios mm.

Algas. Trata-se de um grupo de organismos que realizam a fotossntese e que se disseminam por quase todos os ambientes aquticos. Alguns destes microrganismo s atingem grandes dimenses sendo macroscopicamente visveis, no entanto a maioria so microscpicos. As algas microscpicas so normalmente organismos livres encontrados em locais onde gua e luz estejam presentes. So normalmente visveis como uma pelcula verde superfcie de lagoas e aqurios.

Fungos. Grupo muito diverso a largamente disseminado de microrganismos eucariticos unicelulares e multicelulares (incluindo cenocticos). Nos fungos podemos distinguir dois tipos; os bolores e as leveduras. Os bolores so normalmente organismos pluricelulares em que as clulas se organizam em estruturas tubulares semi-rgidas designadas por hifa. Uma massa de hifas toma a designao de miclio. De acordo com as espcies, as hifas podem ser de 3 tipos; no septadas (cenocticas), septadas com clulas mononucleadas e septadas com clulas multinucleadas. O dimetro de uma hifa varia de 1 m a dimenses visveis a olho nu. Num miclio podemos encontrar hifas vegetativas e hifas frteis. Estas ltimas albergam estruturas reprodutivas dos fungos (esporos), podendo ser do tipo sexuado ou assexuado. As leveduras so uma categoria de fungos normalmente caracterizada com base em aspectos morfolgicos e fisiolgicos. Organizam-se normalmente na forma unicelular podendo desenvolver estruturas alongadas resultantes de divises celulares incompletas (pseudomiclio). Fermentam uma larga gama de acares e o seu modo de reproduo assexuada , caracteristicamente, por gemulao. As suas dimenses so reduzidas (alguns m) sendo geralmente maiores que as bactrias.

Bactrias. Microrganismos procariticos unicelulares muito diversificados e de distribuio ubiquitria. Por possurem parede celular rgida, possuem formas caractersticas designadas por bacilos (bacillus), cocos (coccus), espiraladas (spirillum) e vibrio (vibrio). As espcies de bactrias moveis possuem flagelos que podem estar inseridos na clula em diferentes localizaes (polar, lofotrica e peritriquial) O seu processo de multiplicao por fisso binria. As suas dimenses podem ser inferiores a 1 m, sendo na sua maioria entre 1 e 10 m.

Cianobacterias (algas verdes -azuis). Grupo heterogneo de microrganismo s procariticos que realizam fotossntese com produo de O2, ao contrrio do que acontece com as bactrias fotossintetizantes. Distinguem-se das microalgas pois no possuem cloroplastos bem como outros organitos caractersticos da clula eucaritica. Podem ser organismos unicelulares embora

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existam muitas espcies caracteristicamente coloniais ou filamentosas. As suas dimenses so muito semelhantes s das bactrias.

Material e Reagentes - cultura de E. coli - cultura de Rhizobium - cultura de S. cereviseae - cultura de fungos - suspenso de Leishmania - gua de poa orgnica

- Soluo salina estril - Lminas e lamelas - Microscpio e Lupa - Azul metileno - Infuso de palhas - Ansas

Procedimento experimental

1. Sobre uma lmina de vidro coloque uma pequena gota de corante azul metileno diludo, sobre a qual coloca uma ansada do material que pretende observar, observando cuidados de assepsia.

2. Com o auxlio da ansa homogeneze a suspenso obtida.

3. Cubra a suspenso com uma lamela, pressionando levemente.

4. Observe ao microscpio, aumentando progressivamente de ampliao. Quando usar a objectiva 100 x utilize leo de imerso.

5. Para a observao de fungos filamentosos, no abra as placas de Petri, procedendo s observaes atravs do vidro da placa usando a lupa.

6. Fazer esboos das clulas observadas, tendo em ateno a complexidade celular observvel e a dimenso relativa dos espcimes.

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Registo de resultados

OBSERVAO COMPARADA DE BACTRIAS, FUNGOS E PROTOZORIOS

Operador: Data: ____/____/____

Organismo Esboo da morfologia

predominante

Dimenso relativa Comentrio

E. coli

Rhizbio

S. cereviseae

Leishmania

Cultura de fungos

gua de poa orgnica

Infuso de palhas

Notas:

33

P3. PIPETAGENS E DILUIES

Introduo

O rigor nas diluies a efectuar com alguns materiais biolgicos e reagentes, no contexto de vrios dos trabalhos experimentais que aqui se incluem, crtico e fundamental para o sucesso e para a fiabilidade dos resultados.

Porque se observa com alguma frequncia uma grande inabilidade dos estudantes para a manipulao adequada das micropipetas e para um raciocnio operacional das diluies expressas como potncias de 10, introduz-se este trab alho preliminar.

Material e reagentes - Soluo concentrada de azul-de-metileno - Soro fisiolgico (salino) - Micropipetas diversas - Tubos de ensaio - Espectrofotmetro

Procedimento (por grupo)

1. Marque 10 tubos de ensaio (de 1 a 10)

2. A partir da soluo concentrada de azul-de-metileno proceda, esterilmente, s seguintes diluies sequenciais (decimais):

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Solvente (ml) 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5

Corante (ml) 0,5

Soluo precedente (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Diluio 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10

3. Registe as intensidades de cor observveis nos diferentes tubos

4. Determine a absorvncia das solues dos tubos com nmero par a 600-660 nm

5. Marque 5 tubos de ensaio (de 1 a 5)

6. A partir da soluo concentrada de azul-de-metileno proceda, esterilmente, s seguintes diluies sequenciais (centesimais):

Tubo 1 2 3 4 5

Solvente (ml) 5 5 5 5 5

Corante (l) 50

Soluo precedente (l) 50 50 50 50

Diluio 10-2 10-4 10-6 10-8 10-10

34

7. Registe as intensidades de cor observveis nos diferentes tubos

8. Determine a absorvncia das solues dos tubos com nmero par a 600-660 nm

9. A partir da soluo concentrada de azul-de-metileno proceda preparao de 5 ml de soluo diluda a 5x104

10. Observe a intensidade de cor observvel

11. Determine a absorvncia da soluo a 600-660 nm

12. Compare o conjunto dos resultados que obteve

13. Insira num grfico, de tipo semi-logartmico, todos os resultados que obteve

14. Calcule as mdias de concentrao da soluo de partida para cada conjunto de diluies.

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Registo de resultados

PIPETAGENS E DILUIES

Operador: Data: ____/____/____

Amostra DO600nm / ml Observaes DO600nm / ml (Soluo 100)

10-2 10-4 10-6 10-8

Aln

ea 4

.

10-10 Mdia

Amostra DO600nm / ml Observaes DO600nm / ml (Soluo 100)

10-2 10-4 10-6 10-8

Aln

ea 8

.

10-10 Mdia

Amostra DO600nm / ml Observaes DO600nm / ml (Soluo 100)

Aln

ea 1

1.

5 x 10-4

Notas:

36

P4. MEIOS DE CULTURA

Introduo

Quando no laboratrio se pretende cultivar microrganismo s necessrio fornecer -lhes as fontes de nutrientes (materiais plsticos e energticos) indispensveis ao seu crescimento. Os meios de cultura, para cumprir as suas funes tero de estar isentos de contaminantes susceptveis de tambm crescer nas condies em que o microrganismo em teste se vai propagar.

Neste trabalho preparar-se- um meio de cultura slido e testar-se- a capacidade do estudante para a sua preparao estril.

Material e Reagentes - Autoclave - Estufa de incubao - Potencimetro - Balo Erlenmeyer de 250 ml - Placas de Petri esterilizadas

- Extracto de carne - Peptona - Agar - 0,1N HCl e 0,1N NaOH - gua destilada

Procedimento experimental

1. Medir 200 ml de gua destilada para o balo Erlenmeyer

2. Pesar os seguintes produtos:

Extracto de carne 0,75 gr

Peptona 1,25 gr

3. Adicionar ao balo e agitar at dissoluo

4. Verificar e acertar a pH 7.2, se necessrio, com as solues de NaOH ou HCl

5. Adicionar gua destilada ao volume final de 250 ml

6. Adicionar 3,75 gr de agar (1,5% final)

7. Homogeneizar por agitao (o agar no dissolve a frio)

8. Esterilizar o meio de cultura na autoclave a 121C durante 15 minutos

9. Aps a esterilizao agitar o balo para homogeneizar o contedo

10. Deixe arrefecer at cerca de 45C (quando o calor se comea a suportar na mo)

11. Distribuir esterilmente por placas de Petri (meia altura) evitando a formao de bolhas de ar

12. Deixar solidificar sobre a bancada (placas tapadas)

13. Incubar na estufa a 30C durante 24 horas

14. Observar, registar e rejeitar as placas eventualmente contaminadas

37

Registo de resultados

MEIOS DE CULTURA

Operador: Data: ____/____/____

Nmero de placas preparadas (A): Nmero de placas contaminadas (B):

Taxa de sucesso 100 - (100 x B / A):

Notas:

38

P5. CULTURAS PURAS

Introduo

Um microrganismo , colocado num meio de cultura slido adequado ao seu crescimento, multiplicar-se- no local em que foi colocado, dado que o meio slido no lhe permite movimentar -se livremente. Se num meio slido os microrganismos forem colocados suficientemente afastados uns dos outros, cada um constituir um ncleo de crescimento a partir do qual surgir uma massa macroscopicamente visvel - uma colnia.

Neste trabalho prtico isolar -se-o culturas puras de bactrias usando o mtodo do riscado e o mtodo das placas de incluso

Material e Reagentes - Estufa de incubao - Banho Maria a 45C - Vortex - Ansa

- Placas de Petri - Placas de Petri com agar nutritivo - Tubos com agar nutritivo fundido - Salino estril

Procedimento experimental

Riscado

1. Marcar uma placa de Petri contendo agar nutritivo (incuo, operador, data, tcnica do riscado)

2. Esterilizar a ansa na chama e arrefecer nas proximidades

3. Tomar uma poro de cultura com as bactrias a isolar

4. Espalhar o contedo da ansa na superfcie do agar (escolha um dos mtodos atrs descritos)

5. Repita o isolamento noutra placa usando uma tcnica de riscado diferente

6. Incubar as placas, em posio invertida, na estufa a 30C durante 24 horas

7. Observar as placas e registar a existncia de colnias isoladas

Placas de incluso

1. Marcar uma placa de Petri estril (incuo, operador e data)

2. Tomar um tubo com agar fundido do banho -maria

3. Adicionar uma ansada de cultura em estudo. Homogeneizar no vortex

4. Verter o contedo do tubo na placa de Petri cobrindo todo o fundo

5. Deixar solidificar sobre a bancada

6. Ressuspender uma ansada de cultura em 1 ml de soluo salina estril

7. Tomar uma ansada e repetir o processo para isolamento de colnias (passos 2 a 5)

8. Incubar as placas, em posio invertida, na estufa a 30C durante 24 horas

9. Observar o crescimento bacteriano e registar a existncia de colnias isoladas

39

Registo de resultados

CULTURAS PURAS

Operador: Data: ____/____/____

Incuo:

Isolamento por riscado

Tcnica exercitada Aspecto geral da placa Nmero de colnias

isoladas Percentagem da cultura

em isolamento

Isolamento por placas de incluso

Quantidade de incuo Aspecto geral da placa Nmero de colnias isoladas

Percentagem da cultura em isolamento

Notas:

40

P6. COLORAO DE BACTRIAS. MORFOLOGIA E ASSOCIAO

Introduo

Para a observao microscpica de micror ganismo s necessrio diferenciar o seu contedo interno do meio exterior envolvente.

Neste trabalho observar -se-o vrias caractersticas de bactrias por observao ao microscpio de preparaes submetidas a processos de colorao diversos. Pretende-se observar bactrias vivas e respectiva mobilidade, contrastadas por colorao do meio envolvente, discriminao entre microrganismo s Gram positivos e Gram negativos e identificao do tipo de associao entre as clulas individuais.

Material e Reagentes - Microscpio - Ansa - Lminas e lamelas de microscpio

- Azul-de-metileno - Tinta-da-china - Reagentes para colorao de Gram

Procedimento experimental

Preparao das lminas

1. Lavar as lminas com sabo e com lcool para eliminar vestgios de gordura

2. Limpar com papel absorvente . Secar bem ao ar

3. Manipular as lminas tocando apenas nos bordos

Preparao de um esfregao

1. Identificar lminas numa das extremidades

2. Tomar uma gota de cultura com uma ansa (a partir de meios lquidos)

3. Colocar a suspenso no centro da lmina (Para meios slidos tomar uma gota de salino no centro da lmina e homogeneizar uma colnia de cultura com a ansa)

4. Espalhar bem toda a suspenso bacteriana com movimentos circulares da ansa

5. Deixar secar completamente ao ar

6. Fixar a preparao "cortando" a chama 3 x com a lmina (suspenso para cima)

7. Corar pelo mtodo escolhido

Colorao negativa (observao vital)

1. Identificar lminas numa das extremidades

2. Colocar uma gota de tinta-da-china no centro, a 2/3 do comprimento da lmina

3. Adicionar uma gota de suspenso da bactria (ou ansada com uma colnia)

4. Colocar lamela para observao vital

5. Observar ao microscpio de imediato

6. Registar a mobilidade observada, se aplicvel

41

Colorao negativa

1. Preparar uma suspenso bacteriana em tinta-da-china (como atrs)

2. Tocar com a extremidade de outra lmina na gota (posio inclinada)

3. Deslocar as duas lminas arrastando a suspenso para formar uma fina camada

4. Deixar secar bem ao ar

5. Observar ao microscpio procurando uma zona da lmina em que a observao seja possvel

6. Registar a forma das bactrias e o tipo de associao das clulas individuais

Colorao simples

1. Colocar a lmina com o esfregao fixado sobre duas varetas na tina de lavagem

2. Colocar I ou II gotas de soluo de azul-de-metileno (suficiente para cobrir o esfregao)

3. Deixar actuar o corante durante 30 segundos a dois minutos

4. Passar a lmina por vrias "mudas" de gua at no ser arrastado corante visvel

5. Deixas secar ao ar

6. Observar ao microscpio e registar as observaes

Colorao de Gram

(respeitar rigorosamente os tempos indicados)

1. Colocar a lmina com o esfregao fixado sobre duas varetas na tina de lavagem

2. Cobrir o esfregao com a soluo de cristal violeta. Deixar actuar durante 1 minuto

3. Eliminar rapidamente o corante com gua corrente (jacto suave) - cerca de 5 segundos

4. Cobrir o esfregao com soluo de iodo. Deixar actuar durante 1 minuto

5. Eliminar rapidamente o iodo com gua corrente (jacto suave) - cerca de 5 segundos

6. Descorar com lcool a 95 corrente at sair sem cor (10 - 20 segundos)

7. Lavar com gua corrente (jacto suave) - cerca de 5 segundos

8. Cobrir o esfregao com soluo de safranina. Deixar actuar durante 30 segundos

9. Lavar com gua corrente at no ser arrastado corante visvel

10. Eliminar excesso de gua com papel absorvente. Deixar secar ao ar

11. Observar ao microscpio

12. Registar as observaes: Desenhar os diferentes tipos de bactrias observadas Forma das bactrias Tipo de associao Propriedade Gram (positivo ou negativo)

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Registo de resultados

COLORAO DE BACTRIAS. MORFOLOGIA E ASSOCIAO

Operador: Data: ____/____/____

Colorao negativa

Amostra Mobilidade Forma / Associao Desenho

Colorao simples

Amostra Forma Associao Desenho

Colorao Gram

Amostra Gram Forma Associao Desenho

Notas:

43

P7. QUANTIFICAO DE MICRORGANISMOS

Introduo

Os estudos em microbiologia obrigam com frequncia determinao do nmero de microrganismos num determinado incuo, para caracterizao da populao presente numa certa amostra, ou para avaliao do crescimento do microrganismo em considerao.

Avaliar a concentrao de microrganismos numa suspenso problema, fornecida para o efeito, constitui o objectivo deste trabalho. As tcnicas a executar na sesso laboratorial sero indicadas pelo docente

Preparao de diluies

Material e Reagentes - Amostra em estudo - Micropipetas, pontas e microtubos (ou pipetas graduadas) - Microtubos (ou tubos de ensaio

Procedimento experimental

1. Observar as diluies e os volumes pretendidos (proporcionais aos indicados) para a execuo da tcnica;

2. Preparar as diluies utilizando a tcnica assptica, conforme ao esquema:

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10

Amostra (100)

100 m l - - - - - - - - -

Diluio anterior - 100 m l 100 m l 100 m l 100 m l 100 m l 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml

Solvente 900 m l 900 m l 900 m l 900 m l 900 m l 900 m l 900 ml 900 ml 900 ml 900 ml

3. Homogeneizar bem cada diluio antes de tomar a amostra para a seguinte.

4. Anotar as diluies efectuadas

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Contagem por Turbidimetria

Material e Reagentes - Diluies adequadas - Turbidmetro

Procedimento

1. Acertar os 0% de transmitncia sem amostra

2. Transferir cerca de 3ml de SF para cuvete do espectrofmetro

3. Acertar os 100% de transmitncia

4. Substituir SF pela amostra mais diluda

5. Registar leitura do espectrofotmetro

6. Repetir passos 4 e 5 at ao primeiro tubo

7. Fazer o grfico respectivo

Avaliao em Cmara de Contagem

Material e Reagentes - Diluies adequadas - Microscpio - Cmara de

contagem

Procedimento experimental

1. Montar adequadamente a lamela na lmina para contagem

2. Com auxlio de pipeta Pasteur encher o espao entre as duas lminas com a suspenso a avaliar

3. Observar ao microscpio

4. Enumerar os microrganismos contidos nas divises da lmina de contagem

5. Determinar a quantidade de microrganismos no volume contado

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6. Calcular a concentrao por unidade de volume da suspenso inicial

7. Registar os resultados

Contagem de viveis (espalhamento)

Material e Reagentes - Diluies adequadas - Pipetas Pasteur ou espalhador de vidro - Placas de Petri com agar nutritivo - Estufa de incubao

Procedimento experimental

1. Marcar a placa com agar

2. Pipetar 200 ml da diluio indicada para o centro de uma placa com agar nutritivo

3. Espalhar superfcie do agar at ao completo esgotamento do lquido, com auxlio de um espalhador ou de pipeta pasteur dobrada.

4. Repetir os passos anteriores com as demais diluies requeridas.

5. Incubar em estufa a 37C durante 48 horas, em posio invertida

6. Observar as placas e contar o nmero de colnias de cada placa

7. Determinar a concentrao da amostra inicial (100)

Contagem de viveis (incorporao)

Material e Reagentes - Diluies adequadas - Placas de Petri esterilizadas - Agar nutr