INTRODUO

A tcnica de diluio do nmero mais provvel (NMP) empregada para estimar o nmero de microrganismos de uma amostra a partir de respostas onde os resultados so reportados como positivos ou negativos em nica diluio ou para diluies mltiplas em tabela que foram previamente calculadas estatisticamente.Suas principais aplicaes so a contagem de coliformes totais, coliformes fecais e E.Coli em gua e alimentos (SILVA et al, 2007).A tcnica NMP como qualquer outra tcnica, est sujeita a varias fontes de erros.

OBJETIVO

O objetivo do presente trabalho aplicar a tcnica do nmero mais provvel (NMP) na deteco de coliformes totais e fecais (E.Coli) em uma amostra de gua coletada no bebedouro da granja do IFRS - Campus Bento Gonalves.

REVISO BIBLIOGRAFICA

Tcnica de diluio idealizada por McCrady (1915), onde se faz uma estimativa da densidade mdia dos microrganismos na amostra.Segundo a Instruo Normativa N 62, DE 26 de agosto de 2003, define a tcnica do nmero mais provveis como um mtodo que permite estimar a densidade de microrganismos viveis presentes em uma amostra sob anlise.A tcnica do nmero mais provvel um mtodo de anlise quantitativo que permite determinar o nmero mais provvel (NMP) do (s) microrganismo(s) alvo na amostra, atravs da inoculao de alquotas dessa amostra em uma sria de tubos, contendo um meio de cultura lquido adequado ao seu crescimento (SILVA et al, 2007).A determinao do nmero de microrganismos baseada no princpio de que, subdividindo a amostra em alquotas, algumas alquotas vo conter microrganismos e outras no, dependendo da quantidade dos microrganismos na amostra. O nmero de alquotas com microrganismos (tubo com crescimento positivo aps a incubao) e alquotas sem microrganismos (tubos com crescimento negativo aps a incubao) permite estimar, por clculo de probabilidade, a densidade original dos microrganismos na amostra. Essa aplicao da teoria da probabilidade depende de que os microrganismos estejam distribudos ao acaso e homogeneamente por toda a amostra. No caso de amostras lquidas, essa condio pode ser atingida sem dificuldade, atravs da cuidadosa agitao do material. No caso de amostras slidas pode ser atingida no preparo e homogeneizao da primeira diluio, tomando-se as alquotas a partir dessa diluio. HHHH situaes em que as alquotas da amostra slida so inoculadas diretamente no caldo de cultura. A inoculao direta das amostras slidas, entretanto, menos comum e depende do tipo de amostra (SILVA et al, 2007).Como a inoculao feita em meios lquidos, a tcnica do NMP apresenta algumas vantagens em relao contagem padro em placas. Uma delas a possibilidade de inocular quantidades maiores da amostra, aumentando-se proporcionalmente o volume de meio de cultura. Isso confere a tcnica umasensibilidade maior do que a da contagem em placas e em grande flexibilidade no estabelecimento do limite de deteco. Outra vantagem que permite a introduo de etapas de recuperao de injurias, utilizando um meio no seletivo para a inoculao inicial, mais favorvel aos microrganismos injuriados, e depois transferindo a cultura para meios seletivos (SILVA et al, 2007).A tcnica do NMP bastante verstil, permitindo a enumerao de diferentes grupos ou espcies de microrganismos, variando-se o meio de cultura e as condies de incubao(SILVA et al, 2007). Ela pode detectar microrganismos que turvam o meio, que produzem gs, cido ou base, etc.Suas principais aplicaes so a contagem de coliformes totais, coliformes fecais e E. coli em gua e alimentos. Pode tambm ser utilizada em outros ensaios quantitativos, quando a contaminao esperada na amostra est abaixo do limite de deteco do plaqueamento ou quando partculas do alimento interferem na contagem em placas. Outra aplicao a adaptao de mtodos qualitativos para quantitativos, como a contagem de Salmonella, Listeria Monocytogenes e outros microrganismos tradicionalmente analisados por mtodos de presena/ ausncia (SILVA et al, 2007).Para a inoculao, a tcnica do NMP apresenta dois formatos dependendo de como as alquotas so distribudas. Um o formato do teste de diluio mltipla, no qual trs cinco ou dez alquotas de uma diluio so inoculadas numa srie de trs, cinco ou dez tubos e, depois, uma nova sria de trs, cinco ou dez alquotas, da diluio subseqente, so inoculadas em outra sria detubos e assim por diante. Quanto maior o nmero de diluies e de tubos por diluio, maior a preciso da contagem. Para a maioria das situaes encontradas nas anlises de alimentos trs diluies so suficientes para uma boa estimativa do NMP. O outro formato o teste de diluio nica que mais utilizado para amostras com baixo nvel de contaminao, para as quais no h necessidade nem se justifica a preparao de diluies. Uma de suas principais aplicaes so a contagem de coliformes em gua tratada e em sucos e refrigerantes (SILVA et al, 2007).O grupo dos coliformes totais inclui as bactrias na forma de bastonetes Gram negativos, no esporognicos anaerbios facultativos, capazes de fermentar a lactose com produo de gs, em 24 a 48 horas a 35C. O grupo inclui cerca de 20 espcies, dentre as quais encontram-se tanto bactrias originarias do trato gastrintestinal de humanos e outro animais de sangue quente, como tambm diversos gneros e espcies de bactrias no entricas, como Serratia e Aeromona , por exemplo. Por essa razo, sua enumerao em gua e alimentos menos representativa, como indicao de contaminao fecal, do que a enumerao de coliformes fecais ou E.Coli (SILVA et al, 2005).O grupo de coliformes fecais ou coliformes termotolerantes tem a mesma definio de coliformes totais, porem, restringindo-se aos membros capazes de fermentar a lactose com produo de gs, em 24 horas a 44,5- 45,5C. Essa definio objetivou, em principio, selecionar apenas os coliformes originrios do trato gastrintestinal. Atualmente sabe-se, entretanto, que o grupo doscoliformes fecais inclui pelo menos trs gnero, e Escherichia, Enterobacter e Klebsiella , dos quais dois (Enterobacter e Klebsiella) incluem cepas de origem no fecal. Por esse motivo, a presena de coliformes fecais em gua e alimentos menos representativa, como indicao de contaminao fecal, do que a enumerao direta de E.Coli, porm, muito mais significativa do que a presena de coliformes totais, dada a alta incidncia de E.Coli dentro do grupo fecal. Cerca de 95% dos coliformes existentes nas fezes humanas e de outros animais so E.coli ( SILVA et al, 2005).A portaria N 518 de 25 de maro de 2004 estabelece os procedimentos e responsabilidade relativo ao controle e vigilncia da qualidade da gua para consumo humano e seu padro de potabilidade, onde deve apresentar ausncia de coliformes fecais (termotolerantes) e totais em 100 ml de gua.A tcnica de enumerao de microrganismos por NMP inclui as seguintes etapas analticas:a) Teste presuntivo (leitura dos resultados obtidos na srie de tubos mltiplos). Recupera clulas injuriadas.b) Teste confirmatrio (subcultivo dos tubos positivos do teste presuntivo em caldo de maior impedincia ou em gar seletivo diferencial para o microrganismo pesquisado).c) Teste completo identificao bioqumica da (s) espcie (s) microbiana (s) presente(s).Para aplicar a tcnica NMP e determinar fecais (E.Coli) no teste presuntivo utiliza-se o caldo lauril triptose (caldo LST) que possibilita a recuperao de clulas injuriadas e permite uma adaptao inicial as condies restritas que selecionam os coliformestotais, capazes de fermentar a lactose com produo de gs (capturado nos tubos de Duran), quando incubadas 35-37C, por 48 horas. No teste confirmativo, se tem a confirmao de coliformes fecais, utiliza-se o caldo lactosado bile verde brilhante (caldo VBBL) com crescimento de gs (capturado nos tubos de Duran) quando incubados 35C, por 24 48 horas. E por fim, o teste completo utiliza-se o caldo EC, onde os microrganismos continuam fermentando a lactose com produo de gs (capturado nos tubos de Duran), quando incubados a temperatura de 44,5-45,5C por 24 horas tendo como objetivo a E.Coli.Para determinar os microrganismos produtores de gs atravs da tcnica NMP os tubos positivos so aqueles que formam uma bolha de gs no tubo de Duran que este, est invertido dentro do tubo de ensaio como mostra na figura 1. Entretanto, na leitura final do NMP devero ser consideradas somente as 3 diluies mais significativas.

Figura 1: tubo positivo[pic]

A concentrao de coliformes totais relacionada com a qualidade higinica dos alimentos, sendo altas concentraes indicativas de limpeza e higienizao deficientes, tratamento trmico ineficiente. J uma alta concentrao de coliformes fecais indica contaminao de um alimento com matria de origem fecal, j que assuma-se que haja um alto percentual de E.Coli dentre os coliformes fecais.A combinao de tubos negativos e positivos na tcnica do NMP permite estimar, por clculo de probabilidade, a densidade do (s) microrganismo (s) alvo naamostra. Os clculos podem ser feitos usando vrias frmulas, mas, para as combinaes de tubos positivo e negativos que ocorrem com mais freqncia, os valores j foram calculados e tabulados em tabelas de NMP, no sendo necessrio o uso de frmulas (SILVA et al, 2007).

MATERIAIS E MTODOMATERIAIS Estufa a 35C Bico de Bunsen Pissetas com lcool 70% iodado Algodo Tubos de Duran (um para cada tubo de ensaio) 9 tubos de ensaio contendo 10 ml de caldo LST Pipetas de 10 ml

MEIOS DE CULTURA Caldo Lauril Sulfato Triptose (caldo LST)

DESCRIO DA AMOSTRAgua coletada por alunos e funcionrios no bebedouro da granja do Instituto Federal do Rio Grande do Sul Campus Bento Gonalves.

METODOLOGIATeste presuntivo Homogeneizou-se a amostra Colocou-se 10 ml da amostra nos 9 tubos que contm o caldo LST Incubou-se a 35C durante 48 horas Decorrido o tempo de incubao separar os tubos positivos, ou seja, que apresentarem gs no interior do tubo de Duran.

RESULTADOS E DISCUSSO

A anlise de contagem de microrganismos pelo nmero mais provvel teve de amostra a gua do bebedouro da granja. Em que foi feito por diluio nica, pipetando-se 10 ml da amostra para cada tubo (9 tubos) com caldo LST e posterior incubao a 35C, onde depois de 24 horas tivemos a primeira leitura, onde no apresentou formao de gs e turvamento em nenhum dos tubos. Depois de 48 horas fizemos a segunda leitura tendo como resultado negativo (sem formao de gs eturvamento nos tubos). Sendo assim, no prosseguindo com o teste confirmativo e o completo.Portanto, podemos afirmar que segundo a tcnica de NMP a gua do bebedouro da granja no possui coliformes totais, tendo como resultado negativo, sem formao de gs, ou seja, nos tubos de Duran no houve formao de bolhas de ar.O resultado encontrado foi o esperado, pois sabemos que na granja no tem ou no teve surtos de infeco, intoxicao ou toxinfeco por coliformes.

CONCLUSO

A determinao do nmero de microrganismos presentes em um alimento pode ser feito pela tcnica do nmero mais provvel (NMP) que se pode obter informaes sobre a populao presuntiva (teste presuntivo), real (teste confirmativo) e a verdadeira espcie (teste completo) de microrganismos.A tcnica NMP para determinar coliformes (formadores de gs), foi considerada eficiente na anlise da gua, onde no foi detectado coliformes totais, sendo assim passando apenas pelo teste presuntivo.