Métodos Alternativos ao Uso de Animaisno Desenvolvimento de Medicamentos

Eduardo Pagani MD PhDGestor de Desenvolvimento de Fármacos do LNBio

Coordenador da RENAMA no LNBioPresidente da SOBRAFITO

Russell, W.M.S. and Burch, R.L. The Principles of Humane Experimental Technique Methuen,

London, 1959

• Reduction: obtain comparable information from fewer animals.

• Replacement: use of non-animal methods whenever it is possible to achieve the same scientific aims.

• Refinement: alleviate or minimize potential pain, suffering or distress and enhance animal welfare.

Raciocínio Toxicológico Clássico

Talidomida introduzida em 1957 como antiemético para gestantes sem ser testada em humanos.

http://www.chm.bris.ac.uk/motm/thalidomide/start.html

Por que desenvolver e implementar métodos alternativos ao uso de animais?

• Ética• Economia de:

– Recursos– Tempo

• Melhora do potencial preditivo

Out-of-Pocket and Capitalized Costsper Approved Drug

121

336 282

466403

802

0100

200

300400

500

600

700800

900

Mil

lio

ns

of

2000

$

Preclinical Clinical Total

Out-of-Pocket Capitalized

Source: DiMasi et al., J Health Economics 2003;22(2):151-185

H. Olson et al. Toxicology Letters 102-103 (1998) 535-538

O raciocínio toxicológico clássico

• Cumpriu seus objetivos mas,

• Apresenta problemas éticos;

• Consome muito tempo e dinheiro;

• Apresenta limitações para a predição de risco:– Supervaloriza a segurança em detrimento do acesso.

– Não é adequado para idiossincrasias.

– Evoluiu pouco nas últimas décadas principalmente em função de implicações regulatórias.

Quais as iniciativas em curso para métodos mais éticos, mais baratos,

mais rápidos e mais preditivos?

I - Para avaliação do potencial de irritação e corrosão da pele:Método OECD TG 430 - Corrosão dérmica in vitro: Teste de Resistência Elétrica Transcutânea;Método OECD TG 431 - Corrosão dérmica in vitro: Teste da Epiderme Humana Reconstituída;Método OECD TG 435 - Teste de Barreira de Membrana in vitro; eMétodo OECD TG 439 - Teste de irritação Cutânea in vitro.II - Para avaliação do potencial de irritação e corrosão ocular:Método OECD TG 437 - Teste de Permeabilidade e Opacidade de Córnea Bovina;Método OECD TG 438 - Teste de Olho Isolado de Galinha;Método OECD TG 460 - Teste de Permeação de Fluoresceína.III - Para avaliação do potencial de fototoxicidade:Método OECD TG 432 - Teste de Fototoxicidade in vitro 3T3 NRU.IV - Para avaliação da absorção cutânea:Método OECD TG 428 - Absorção Cutânea método in vitro.V - Para avaliação do potencial de sensibilização cutânea:Método OECD TG 429 - Sensibilização Cutânea: Ensaio do Linfonodo Local; eMétodo OECD TG 442A e 442B - Versões não radioativas do Ensaio do Linfonodo Local.VI - Para avaliação de toxicidade aguda:Método OECD TG 420 - Toxicidade Aguda Oral – Procedimento de Doses Fixas;Método OECD TG 423 - Toxicidade Aguda Oral – Classe Tóxica Aguda;Método OECD TG 425 - Toxicidade Aguda Oral – procedimento "Up and Down"; eMétodo OECD TG 129 - estimativa da dose inicial para teste de toxicidade aguda oral sistêmica.VII - Para avaliação de genotoxicidade:Método OECD TG 487 - Teste do Micronúcleo em Célula de Mamífero in vitro.

Concea & ANVISA set/14

Métodos in silico

• Simulações feitas por computador• Avalia propriedades farmacológicas por

comparações com substâncias já conhecidas• Utiliza extensas bases de dados disponíveis• É rápido e barato

Edital RENAMA 01

• Única Educacional• Cristália• Eurofarma• FIOCRUZ – Farmanguinhos• Natura• Boticário

Development of a Successful New Drug (Total Cost ~$900 mm)

0

15 Colocação

Registro

Desenvolvimento

PesquisaBásica

1

2

2-5

5

250Substâncias

5,000 - 10,000Substâncias

Vigilância Sanitária

Testes Clínicos(Humanos)

Testes Pré Clínicos(Animaisl)

SinteseExame &Escolha

Fase IV

FaseIII

Fase II

Fase I

ANOS

Source: PhRMA

Fonte: Tufts University - 2003

Depósito da Patente4

Farmacocinética

Lipinski, C.A. et al. (1997) Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Adv. Drug Deliv. Rev. 23, 3–25

Toxicidade

Projeto eTOX

MetaDrug™ • Mecanismo de ação, toxicidade e efeitos em outros alvos,• Banco de dados com mais de 600.000 compostos • Prediz os metabólitos gerados com base em regras empíricas.

ACD/Toxicity• Predição de efeitos nos sistemas: cardiovascular, digestório,

urinário, hematopoiético, respiratório e endócrino.• Predição de genotoxicidade• Predição da interação com o canal de potássio (hERG) –

(toxicidade cardiovascular).• Predição de irritação da pele.

MetaDrug

Tanimoto prioritization (TP), a maior similaridade estrutural com alguma molécula do set de treinamento.

ACD/Labs Percepta Predictors

PhysChem Modules Absolv Aqueous Solubility Boiling Point LogD LogP pKa Sigma Other PhysChem Descriptors

ADME Modules Blood Brain Barrier Permeation Cytochrome P450 Inhibitors Cytochrome P450 Substrates Distribution Maximum Recommended Daily

Dose Oral Bioavailability Passive Absorption P-gp Specificity PK Explorer Regioselectivity of Metabolism

Toxicity Modules Acute Toxicity Aquatic Toxicity Endocrine System

Disruption Genotoxicity Health Effects hERG Inhibition eye and skin Irritation

Resultados

Métodos in vitro

1- Vias de ToxicidadeTox21

A maioria das toxinas conhecidas age em poucas vias:

• A maioria das hepatotoxinas atua na apoptose induzida pelo TNF.• Muitas neurotoxinas interferem com o metabolismo do cálcio.• Muitas imunotoxinas interferem com o receptor Aryl Hydrocarbon (AhR)

linfocitário.• Muitas substâncias que interferem com o sistema endócrino se ligam a

receptores esteroidais.• A maioria das interações medicamentosas ocorre por interferência com o

citocromo P450.• Muitos compostos mutagênicos possuem grupos aldeídos ou são

metabolizados em substâncias que os possuem.

Leist M, Hartung T, Nicotera P. The dawning of a new age of toxicology. ALTEX. 2008;25(2):103-14. PubMed PMID: 18551234.

Toxicology in the 21st Century (Tox21)

• Federal collaboration between NIH, EPA and FDA.

• Aimed at developing better toxicity assessment methods.

• Established in 2008, on Pathways of Toxicity (PoT) concept.

• Completed HTS in 2800 compounds > 50 assays. • Data published at PubChem and ToxCast.• The second phase is testing 10,000 compounds

at NCGC.• Consortium partners will develop a range of

secondary and tertiary follow-up assays to further define and characterize activities identified in initial high-throughput screens.

2- Toxicidade local

Pele Humana Reconstituída

http://www.skinethic.com/pageLibre000101af.asp

Métodos Alternativos Validados - OECD• Absorção pela Pele

– Test No. 428; 23 Nov 2004: Skin Absorption: In Vitro Method

• Corrosão da Pele– Test No. 430; 26 July 2013: In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance Test Method

(TER) – Test No. 431; 26 July 2013: In Vitro Skin Corrosion: Reconstructed Human Epidermis (RHE) Test Method– Test No. 435; 17 Aug 2006: In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion

• Irritação da Pele– Test No. 439; 26 July 2013: In Vitro Skin Irritation - Reconstructed Human Epidermis Test Method

• Irritação Ocular– Test No. 437; 26 July 2013: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method for Identifying i)

Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage

– Test No. 438; 26 July 2013: Isolated Chicken Eye Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage

• Fototoxicidade– Test No. 432; 23 Nov 2004: In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test

• Genotoxicidade– Test No. 476; 21 July 1997: In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test

3- Toxicidade Sistêmica

Principais Áreas da Toxicologia Sistêmica

Altex 31, 3/14

Alergia

• Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA)• KeratinoSens - Nrf2/Keap1/ARE Pathway • SenCeeTox® Skin Sensitisation Assay -Toxicogenômica

Toxicidade reprodutiva

Toxicidade Doses RepetidasToxicocinética & Farmacocinética

Cultura de Tecidos Humanos

Pele Humana Reconstituída

http://www.skinethic.com/pageLibre000101af.asp

Pulmão

https://www.youtube.com/watch?v=52IL9gemyDw

Rim

Coração

Videos

https://www.youtube.com/watch?v=S6t30-abqCY

https://www.youtube.com/watch?v=52IL9gemyDw

Human on a Chip

Profissionais envolvidos

• Biólogos moleculares e celulares• Microbiologistas• Fisiologistas• Farmacologistas• Imunologistas• Biotecnólogos• BioEngenheiros• Bioinformatas• Clínicos

Perspectivas

Altex 31, 3/14

In Vitro Testing Industrial Platform Recomendations May, 2013

• Industry and regulatory bodies should not wait for complete suites of alternative tests to become available, but should begin working with methods available right now

• Share information (communication), harmonization and standardization (coordination), commitment

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eduardo.pagani@lnbio.cnpem.brFone: 19 3512 1099

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