Mtodos diagnsticos em parasitologia

Prof Carolina ZinnMtodos diagnsticos em parasitologiaExame parasitolgico de fezes (EPF)Grande importncia para o diagnstico de parasitoses intestinais, causadas por helmintos e protozoriosEPF no o nome de uma tcnica, e sim do pedido para a realizao de um exame de fezes em busca de parasitosGrande desafio do diagnstico na parasitologia a baixa sensibilidade das tcnicas quando no realizadas corretamenteFalta de conhecimento sobre a coleta da amostra, os fundamentos de conservao e da execuo do mtodo, levam frequentemente a resultados falso-negativos!!!Exame parasitolgico de fezes (EPF)Outro erro indicao de anti-helmnticos sem solicitar EPF para verificar a real necessidadeO profissional responsvel por escolher a tcnica deve ter claramente delimitado o objetivo do examePacientes assintomticos tcnica capaz de detectar o maior nmero possvel de espciesExistem tcnicas preferenciais para a busca de determinadas estruturas fundamental que o mdico indique a suspeita clnica e, se possvel, a tcnica desejada

Exame parasitolgico de fezes (EPF)Tem como objetivo diagnosticar os parasitos intestinais, por meio da pesquisa das diferentes formas parasitrias que so eliminadas nas fezes.O exame macroscpico permite a verificao da consistncia das fezes, do odor, da presena de elementos anormais, como muco ou sangue, e de vermes adultos ou partes deles.O exame microscpico permite a visualizao dos ovos ou larvas de helmintos, cistos, trofozotos ou oocistos de protozorios. Pode ser quantitativo ou qualitativo.Exame parasitolgico de fezes (EPF)A grande maioria dos mtodos apenas QUALITATIVO = apenas indica a presena do parasita ou noExistem mtodos QUANTITATIVOS (Kato-Katz) = se faz a contagem dos ovos nas fezes, permitindo, assim, avaliar a intensidade do parasitismo.

Mtodos QUALI rotinaMtodos QUANTI pouco utilizados, pois a dose dos medicamentos antiparasitria no leva em conta a carga parasitria e sim o peso corporal do paciente. Estudos epidemiolgicos e/ou controle de cura

Coleta da amostraDeve ser colhida sem contato com o vaso sanitrio

Utilizar recipientes limpos, isentos de gua (pode conter microorganismos de vida livre), urina (destri a mobilidade e os trofozoitas) ou outro material que possa contaminar pinico

Jornais e outros tipos de papis tambm devem ser evitados a fim de no contaminar

Transferir a amostra para o frasco coletor cedido pelo laboratrioColeta da amostraIdentificar o frasco com letra legvel, indicando nome do paciente, data e hora da coleta lpis (no borrar com o conservante)Tempo de entrega do material depende da suspeita clnica Fezes diarreicas Giardia 30 min estrongiloidase com exame de larvas vivas imediatamente aps a emisso das fezesDe preferncia coleta pela manh no laboratrio ou enviada rapidamenteCaso no seja possvel enviar imediatamente o material ser necessrio conservar o materialConservantes MIF (mercrio, iodo e formol) mais popularFormol 10% - proibio do mercrioFormol tamponadoSAF (acetado de sdio, cido actico glacial, formol e gua destilada) bom para trofozotos em fezes diarreicasEmbrulhar em papel e armazenar na geladeira (5-10C) ou isopor com gelo at 48hs

Semanas Conservantes Colocar o conservante, a amostra, homogeneizar bem e colocar mais conservante

Quando so feitas vrias coletas em dias alternados, elas podem ser misturadas no mesmo recipienteCuidados fundamentaisUsar luvasTrabalhar com calma, identificando corretamenteUsar material descartvel evita falso-positivosEscolha do mtodoNo existe um mtodo capaz de diagnosticar, ao mesmo tempo, todas as formas parasitrias.

Alguns mtodos so mais gerais, permitindo o diagnstico de vrios parasitos intestinais, outros so mtodos especficos, indicados para um parasito em especial.

Mtodos gerais mtodo de Hoffman, Pons e Janer e o os mtodos de centrifugao (MIFC, Ritchie e Coprotest).

Na maioria dos pedidos de EPF, a suspeita clnica no relatada, e o exame feito por um dos mtodos gerais, acima citados.

Quando solicitada a pesquisa de um parasito que exige a execuo de um mtodo especfico mtodo especfico e mtodo geral devem ser executados o EPF ficar mais completo, pois ser feita a pesquisa dos vrios parasitos intestinais e no apenas daquele solicitado.Escolha do mtodoExecuo de vrios mtodos com cada amostra fecal um mtodo geralum especfico para larvas de helmintosum especfico para cistos de protozorios. Procedimento invivel - quantidade insuficiente de fezes, ou pelo elevado nmero de exames a serem realizados por diaInterao mdico-laboratrio contribuiria para que o EPF fosse o mais exato possvel.Automao ainda no uma realidade na parasitologiaTestes imunolgicos Testes molecularesEscolha do mtodoImunoenzimticos - EIA ou ELISAEntamoeba histolytica/ disparGiardia lambliaCryptosporidiumImunofluorescentes-IFAsCyclosporaIsosporaPCRdeteco e subtipagemCryptosporidiumEscolha do mtodoA fim de obter mais qualidade no EFP, devemos sempre ter em mente que 1. algumas espcies de parasitos s so evidenciadas por tcnicas especiais; 2. um exame isolado, onde o resultado negativo, no deve ser conclusivo, sendo recomendvel a sua repetio com outra amostra; 3. a produo de cistos, ovos ou larvas no uniforme ao longo do dia ou do ciclo do parasito.

Mtodos Exame de fezes direto a frescoTcnicas de concentrao - Muitas vezes o nmero de formas parasitrias eliminadas com as fezes pequeno, havendo necessidade de recorrer a processos de enriquecimento para concentr-las.Espontnea ou por centrifugaoFlutuao ou sedimentaoTcnicas para buscas de larvas

Existem diversas tcnicas semelhantes, baseadas no mesmo fundamento, com nome diferenteUm mtodo ser mais ou menos utilizado na rotina do EPF, quando, alm de permitir o diagnstico de vrios parasitos intestinais, tambm de fcil execuo e pouco dispendioso.Helmintos - Formas evolutivas eliminadas via analOVOSAscaris lumbricoidesTrichuris trichiuraEnterobius vermicularisAncylostoma duodenaleNecator americanusTaenia soliumTaenia saginataHymenolepis nanaSchistosoma mansoni

LARVASStrongyloides stercoralis

VERMES ADULTOSAscaris lumbricoidesTaenia sp. (proglotes)Enterobius vermicularis

Protozorios - Formas evolutivas eliminadas via analCISTOS/TROFOZOTOSGiardia lambliaEntamoeba histolytica/E. disparEntamoeba coliEndolimax nanaIodamoeba btschliiChilomastix mesniliBlastocystis hominis (apenas cisto)Mtodo diretoProcedimento simples

Permite visualizar trofozotos vivos

Obtida diretamente da amostra fecal, sem conservante, pouco material (falso-negativo)

Mtodos de concentrao so melhores mais amostra, maior sensibilidade

Mtodo diretoRecolhe-se uma poro bem pequena (cabea do palito de fsforo) e coloca-se sobre a lminaAdiciona-se salinaHomogeiniza Coloca lamnulaAnlise em microscpio em 10 e 40X

Processos de concentraoSedimentao espontnea: mtodo de Hoffman, Pons e Janer, tambm conhecido como mtodo de Lutz. Permite o encontro de ovos e larvas de helmintos e de cistos de protozorios;

Sedimentao por centrifugao: mtodo de Blagg (tambm conhecido por mtodo de MIFC), mtodo de Ritchie, Coprotest. Usados para a pesquisa de ovos e larvas de helmintos, cistos e alguns oocistos de protozorios;

Flutuao espontnea: mtodo de Willis. Indicado para a pesquisa de ovos leves (principalmente ancilostomdeos);

Centrfugo-flutuao: o teste de Faust. Usado para a pesquisa de cistos e alguns oocistos de protozorios, permitindo, tambm, o encontro de ovos leves.

Concentrao de larvas de helmintos por migrao ativa, devido ao hidrotropismo e termotropismo positivos: mtodo de Baermann-Moraes e mtodo de Rugai. Indicados para a pesquisa de larvas de Strongyloides stercoralis.Sedimentao espontnea, Mtodo de Lutz ou de Hoffman, Pons e Janer (HPJ)Mtodo de concentraoCistos, oocistos, ovos ou larvasProcedimento:Colocar aproximadamente 2g de fezes em um frasco de Borrel (pode ser substitudo por copo plstico descartvel), com cerca de 5mL de gua, e triturar bem com basto de vidro (ou "palito de picol").Acrescentar mais 20mL de gua.Filtrar a suspenso para um clice cnico de 200 mL de capacidade, por intermdio de tela metlica ou de nilon com cerca de 80 a 100 malhas por cm2, ou gaze cirrgica dobrada em quatro; os detritos retidos so lavados com mais 20mL de gua, agitando-se constantemente com o basto de vidro, devendo o lquido da lavagem ser recolhido no mesmo clice.Completar o volume do clice com gua.Sedimentao espontnea, Mtodo de Lutz ou de Hoffman, Pons e Janer (HPJ)Deixar essa suspenso em repouso durante 2 a 24 horas

Sedimentao espontnea, Mtodo de Lutz ou de Hoffman, Pons e Janer (HPJ)Existem duas tcnicas para se colher o sedimento para exame:a. introduzir uma pipeta obliterada pelo dedo indicador at o sedimento contido no fundo do clice, retirar o dedo e deixar subir uma pequena poro do sedimento; recolocar o dedo e retirar a pipeta;b. desprezar o liquido sobrenadante cuidadosamente, homogeneizar o sedimento e colher uma gota do mesmo (esse procedimento melhor, pois a gota colhida mais representativa do sedimento).Colocar parte do sedimento numa lmina com uma gota de lugol e fazer um esfregao. O uso de lamnulas facultativo. Examinar com as objetivas de 10x e 40x. Deve-se examinar, no mnimo, duas lminas de cada amostra.Sedimentao espontnea, Mtodo de Lutz ou de Hoffman, Pons e Janer (HPJ)Mtodo mais utilizadoBaratoSensvel para cistos de protozorios, ovos e larvas de helmintosDesvantagem: demoradoCoprotest formol 10% - facilita o procedimento paciente coleta j com o conservante e homogeiniza por 2 minutos o laboratorista somente continua o procedimento anteriorParatest formol 5% com sistema de filtragem eficincia reduzida devido a quantidade pequena de amostraCentrfugo-sedimentao, Mtodo de Ritchie, de Blagg ou formol-terBaseia-se na sedimentao forada pela centrifugaoOvos e larvas de helmintos, cistos e alguns oocistos de protozoriosProcedimento:Colher as fezes recm-emitidas em liquido conservador de MIF.Homogeneizar bem.Filtrar a suspenso de fezes em gaze dobrada em quatro ou em filtro descartvel, num copo plstico descartvel.Transferir 1 a 2mL do filtrado para um tubo cnico de centrifugao, com capacidade para 15mLAcrescentar 4 a 5mL de ter sulfrico e agitar vigorosamente (importante para desengordurar o material).Centrifugar por um minuto a 1.500rpm.Se formaro 4 camadas no fundo est o sedimento com os parasitosCom o auxlio de um basto, descolar a camada de detritos da parede do tubo.Inverter o tubo para desprezar o liquido, mantendo-o com a boca voltada para baixo, at limpar a parede do mesmo, utilizando um basto de vidro (ou palito de picol) contendo algodo na extremidade.Inverter o tubo em uma lmina, deixando escoar todo o sedimento. Se a quantidade de sedimento for excessiva, utilizar uma pipeta para colh-lo e preparar as lminas.Colocar uma gota de lugolCobrir com lamnula e examinar com as objetivas de 10 e 40X em zig-zagCentrfugo-sedimentao, Mtodo de Ritchie, de Blagg ou formol-terMtodo dos mais recomendadosRpidoFcil SensvelDesvantagem: necessita de centrfugaCentrfugo-sedimentao, Mtodo de Ritchie, de Blagg ou formol-terCentrfugo-flutuao ou Mtodo de FaustIndicado para pesquisa de cistos de protozorios; ovos leves de helmintos podem ser detectados algumas vezesProcedimentoDiluir 10g de fezes em 20mL de gua filtrada.Homogeneizar bem.Filtrar atravs de gaze dobrada em quatro, num copo plstico, e transferir para um tubo de centrfuga.Centrifugar por um minuto a 2.500rpm.Desprezar o lquido sobrenadante e ressuspender o sedimento em gua.Repetir as operaes 4 e 5 mais duas ou trs vezes, at que o lquido sobrenadante fique claro.30Desprezar a gua sobrenadante e ressuspender o sedimento com uma soluo de sulfato de zinco a 33%, densidade de 1,18g/mL.Centrifugar novamente por um minuto a 2.500rpm.Os cistos e alguns oocistos de protozorios e os ovos leves, presentes na amostra fecal, estaro na pelcula superficial. Recolher a pelcula com ala de platina, colocar numa lmina, acrescentar uma gota de lugol e cobrir com lamnula.Examinar com as objetivas de 10x e 40 x.

Observao: O material deve ser examinado imediatamente, pois o contato com a soluo de sulfato de zinco pode deformar as formas parasitrias, especialmente os cistos de protozorios.Centrfugo-flutuao ou Mtodo de FaustFlutuao espontnea ou Mtodo de WillisBom para pesquisa de ovos leves como de ancilostomdeosProcedimento:Colocar 10g de fezes em um frasco Borrel (pode ser usado o prprio frasco no qual as fezes foram enviadas).Diluir as mesmas em soluo saturada de acar ou sal (NaCl).Completar o volume at a borda do frasco.Colocar na boca do frasco uma lmina, que dever estar em contato com o lquido.Deixar em repouso por cinco minutos.Findo esse tempo, retirar rapidamente a lmina, voltando a parte molhada para cima.Levar ao microscpio e examinar com objetiva de 1ox e 40x. Mtodo para demonstrao de larvas de helmintoAvaliao de larvas de helmintosBaseado no hidrotropismo e termotropismo das larvasNecessidade de fezes frescas e sem uso de conservantesImportante redobrar os cuidados a fim de evitar contaminao no laboratrio.Necessrio ter preparado o aparelho de Baermann suporte de madeira com orifcios para os funis que sero utilizados ProcedimentoUtilizar 8 a 10g de fezes.Colocar numa gaze dobrada em quatro ou em uma peneira.Colocar o material assim preparado sobre um funil de vidro, contendo um tubo de borracha conectado a extremidade inferior de sua haste.Obliterar o tubo de borracha com uma pina de Hoffhan e adicionar, ao funil, gua aquecida (45C) em quantidade suficiente para entrar em contato com as fezes.Deixar uma hora em repouso.Findo esse tempo, colher 5 a 7mL da gua, em um tubo de centrfuga, abrindo-se a pina.Centrifugar a 1.000rpm por um minuto.Colher o sedimento, sem desprezar o liquido sobrenadante e examinar ao microscpio (10x). Caso se detecte a presena de larvas, essas devero ser coradas com lugol e observadas com a objetiva de 40x, para identificaoMtodo de Baermann-MoraesMtodo de Baermann-Moraes

Mtodo de RugaiRetirar a tampa do recipiente que acondiciona as fezes e envolv-lo em uma gaze dobrada em quatro, fazendo uma pequena "trouxa".Colocar o material assim preparado, com a abertura voltada para baixo, num clice de sedimentao, contendo gua aquecida (45C), em quantidade suficiente para entrar em contato com as fezes.Deixar uma hora em repouso.Retirar cuidadosamente a trouxaColher o sedimento no fundo do clice, com a ajuda de uma pipeta.Examinar no microscpio, com a objetiva de 10x.Corar as larvas com o lugol e observ-las com o maior aumento, para identificao.Mtodo de Rugai

Mtodo quantitativo Kato-KatzPreparar uma soluo de verde malaquita (essa soluo tem a finalidade de conservar as fezes e clarificar as formas parasitrias), de acordo com a seguinte frmula: Glicerina 100mL, gua destilada 100mL, Verde-malaquita a 3% 1 mLCortar papel celofane semipermevel em pedaos de 24mm por 30mm e deix-los mergulhados na soluo de verde malaquita por pelo menos 24 horas.Colocar, sobre um papel higinico, uma poro da amostra de fezes frescas sem conservantes.Comprimir as fezes com um pedao de tela meilica (marca IBRAS - So Bemardo do Campo - no 120 fios, urdume e trama: 0,091nm) ou similar de nilon. Nesta malha passam ovos de helmintos e detritos menores do que eles.Retirar as fezes que passaram para a parte superior da tela e transferi-las, com o auxlio de um palito, para o orificio (6mm de dimetro) de um carto retangular de plstico, colocado sobre uma lmina de microscopia.Mtodo quantitativo Kato-KatzAps encher completamente o orificio, retirar o carto, cuidadosamente, deixando sobre a lmina de vidro.Cobrir as fezes com a lamnula de papel celofane embebida na soluo de verde malaquita, inverter a lmina, sobre uma folha de papel absorvente e comprimi-la.Aguardar uma a duas horas e examinar ao microscpio, contando todos os ovos presentes na preparao.O nmero de ovos encontrados no esfregao fecal, multiplicado por 23, corresponder ao nmero de ovos por grama de fezes (OPG).

Situao atual do diagnstico parasitolgicoMdico s vezes pouco capacitado na indicao do exame, na orientao coleta de material e na interpretao dos resultados. Pouca confiana no resultado do laboratrio. Tratamento prvio.Paciente Coleta incorreta, atribui pouca importncia infeco parasitria, questes culturais. Auto-medicao.Laboratrio exame trabalhoso, pouco padronizado, no automatizado, variabilidade intra e interobservadores, profissional pouco valorizado, qualificao profissional insuficiente, pouco compromisso/envolvimento, sobrecarga, mtodos adaptados (no originais)Informaes Importantes na SolicitaoDados scio-demogrficos (sexo,idade, escolaridade, ocupao, procedncia)Indicao clnica: sintomatologia, investigao diagnstica, acompanhamento do tratamento, controle de cura, tratamento prvio ao diagnstico, rotina pr-natal/ pr-operatria.Questionamentos Importantes na entrega do materialIngesto prvia de medicao, compostos qumicos na semana anterior ao exameForma de coleta, tempo de coleta, preservao do material, intercorrncias na coleta.Sensibilidade X EspecificidadeSENSIBILIDADEUm teste sensvel quando seu resultado positivo em indivduos doentes. Pouco falso-negativo

ESPECIFICIDADEUm teste especfico quando seu resultado negativo em indivduos no doentes. Pouco falso-positivo

EPF - BAIXA SENSIBILIDADE (muitos falsos negativos) e ALTA ESPECIFICIDADE (poucos falsos positivos)Causas de negatividade no exame parasitolgicoEVITVEIS PROFISSIONAIS TreinamentoEscolha do mtodo (sensibilidade)Inadequao do mtodoLeitura parcial da lminaSobrecarga de trabalhoINEVITVEIS - BIOLGICASA) Protozorios - perodos de negatividadeB) Helmintosinfeco unissexual por espcimes machosfmeas sexualmente imaturasaps eliminao do verme adultocarga parasitria leveirregularidade na postura/eliminaoCausas de negatividade no exame parasitolgicoControle de qualidadeTreinamento dos profissionaisControle externo de qualidade:CONTROL- LAB SBPC/MLPNCQ SBACINTERLABORATORIAISINTERNACIONAIS: CAPControle interno de qualidadeAmostra cega amostra j processada no diaPool de amostras positivas ( COCOTECA )Amostras conservadas com parasita nicoLminas com colorao permanenteLminas da rotina.Laudo finalReportar todos os parasitas encontradosSempre com os nomes cientficos: grifados, ou em itlico, ou em negritoColocar o estgio de diagnstico identificadoExemplo:Foram encontrados:Ovos de Hymenolepis nana Ovos de Hymenolepis nanaOvos de Hymenolepis nana

Larvas de Strongyloides stercoralisLarvas de Strongyloides stercoralisLarvas de Strongyloides stercoralis

Laudo finalPara ausncia de parasitos, reportar:Exemplo Negativo - No foram visualizadas formas diagnsticas de parasitasOu Negativo - No foram visualizadas formas diagnsticas de parasitas, na amostra enviadaLaudo finalReportar o(s) mtodo(s) utilizado(s).

Reportar nmero de amostras analisadas:Ex. resultado positivo ou negativo e na Obs. o n de amostras

Reportar parasitas que no foram diferenciadosEx. cistos de Entamoeba histolytica /dispar