MÉTODOS LABORATORIAIS UTILIZANDO ANTICORPOS

1- INTRODUÇÃO

POR QUE UTILIZAR ANTICORPOS?

QUAIS AS CARACTERÍSTICAS BÁSICAS E FUNDAMENTOS DOS ENSAIOS QUE

UTILIZAM ANTICORPOS?

1- INTRODUÇÃO

1.1- Principais características das Respostas Imunes Adquiridas:-Especificidade-Diversidade-Memória-Especialização-Autolimitação-Não reatividade ao próprio

1- INTRODUÇÃO

1.1- Principais características das Respostas Imunes Adquiridas:-Especificidade – conferida por duas moléculas principais:

- TCR – presente na membrana de linfócitos;

- Anticorpos – produzidos por linfócitos B, presentes na membrana de linfócitos B e na forma secretada, solubilizados em diversos fluidos corporais.

1- INTRODUÇÃO

1.2- Principais isotipos de anticorpos-IgM-IgG-IgA-IgE-IgD

1- INTRODUÇÃO

1.2- Principais isotipos de anticorpos:-IgMIgM-IgG – encontrado em maior concentração no soro, de obtenção mais fácil, sofre maturação de afinidade-IgAIgA-IgEIgE-IgDIgD

1- INTRODUÇÃO

1.3- Principais características dos Ensaios que utilizam Anticorpos:-Especificidade: Característica que indica que o teste em questão identificará somente o antígeno ou o anticorpo desejado.

-Quanto MAIOR a especificidade, MENOR a ocorrência de resultados falsos-positivos, MENOR a ocorrência de reações cruzadas.

- Dependente do tipo de anticorpo e antígeno empregado no teste, e do sistema de detecção da interação Ag-Ac.

1- INTRODUÇÃO

1.3- Principais características dos Ensaios que utilizam Anticorpos:-Sensibilidade: Característica inerente ao método estreitamente relacionada com a quantidade mínima de antígeno ou anticorpo que poderá ser detectada

-Estreitamente ligada ao sistema de amplificação e detecção da interação Ag-Ac.

-Métodos enzimáticos, radioativos, fluorescentes, quimioluminescentes.

1- INTRODUÇÃO

1.4- Fatores a serem analisados na escolha do método:-Sensibilidade;-Especificidade (confiabilidade de resultados);-Custo;-Disponibilidade de material;-Segurança;-Aplicabilidade à amostra disponível, Ag/Ac a ser detectado e espécie animal a ser analisada;-Tempo de realização do método.

1- INTRODUÇÃO

1.5 – Aplicações dos métodos:

- Identificação e/ou quantificação de moléculas específicas em fluidos biológicos;-Purificação de proteínas;-Diagnóstico de doenças auto-imunes, infecciosas e hipersensibilidades;-Identificação de genes e seus produtos;-Localização de moléculas específicas em células e tecidos.

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

HISTÓRICO

CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS QUE EMPREGAM

ANTICORPOS

VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MÉTODOS

dede

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.1 - Imunoaglutinação/Imunoprecipitação: Primeiros testes a serem desenvolvidos:- Realizados em meio líquido;- Exigem alta quantidade de Ac/Ag para sua realização – Baixa Especificidade;- Não possuem metodologias eficazes para a detecção da interação Ag/Ac – Baixa Sensibilidade.

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.2- Imunodifusão: Interação Ag/Ac realizada em meio sólido (gél de ágar).

- Diversos tipos:

- Imunodifusão Radial Simples - Ag ou Ac imobilizado no gel – Migração do Ag ou Ac da solução teste no gel, até atingir região de concentração equivalente;

- Imunodifusão Dupla e Outcherlony – Ambos Ag e Ac migram no gel, formação de banda na região de equivalência.

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.2- Imunodifusão: MemóriaMemória

-Não reatividade ao próprioNão reatividade ao próprio

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.2- Imunodifusão:-Vantagens – Método de fácil execução, tempo curto de realização, baixo custo, não necessita de aparato sofisticado

-Desvantagens – Baixa sensibilidade, especificidade, difícil preservação do gel, não aplicável a alguns isotipos de imunoglobulinas.

-- Pouco utilizado atualmente como ferramenta de imunodiagnóstico. Empregado como controle em produção de policlonais.

-Não reatividade ao próprioNão reatividade ao próprio

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.3- Hemoaglutinação – Utiliza hemácias sensibilizadas com Ags na membrana, que formam complexos de alto peso molecular quando incubadas com Acs específicos para os antígenos.

- Permite maior diluição da solução teste que a Imunodifusão. Forma complexos mais pesados, que precipitam com maior velocidade e facilidade: Melhoria da detecção da interação entre Ag-Ac;- Variações no método: Inibição da Hemoaglutinação.

-Não reatividade ao próprioNão reatividade ao próprio

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.3- Hemoaglutinação:-MemóriaMemória

-Não reatividade ao próprioNão reatividade ao próprio

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.3- Hemoaglutinação:- Vantagens: Método simples, de fácil execução, baixo custo, rápido;- Desvantagens: Baixa sensibilidade e especificidade, devido a mal armazenamento das hemácias, pode-se obter resultados falso-negativos.-MemóriaMemória

-Não reatividade ao próprioNão reatividade ao próprio

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.4- Fixação do Complemento: Variação da técnica de Hemoaglutinação, onde utiliza-se a capacidade citolíca do Sistema de Complemento para amplificar a detecção da interação Ag/Ac.-Variações da técnica: Inibição da Fixação do Complemento.

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.4- Fixação do Complemento:

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.4- Fixação do Complemento: -Vantagens: Maior sensibilidade do que a Hemoaglutinação, rápida execução, baixo custo;-Desvantagens: Devido a problemas na preservação do Complemento, e na sua estabilidade, problemas de falso negativos podem ocorrer.

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.5- ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) – Técnica que utiliza Ag/Ac imobilizado em placa de polímero de carbono, e anticorpo conjugado a uma enzima, a qual, após agir sobre seu substrato em presença de substância cromógena, amplificará a detecção da interação Ag/Ac através da formação de cor;

-Variações da Técnica: ELISA Quimioluminescente, ELISA Fluorescente, ELISA Radioativo

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.5- ELISA:

Sanduíche

Competição

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.5.1- ELISA Indireto:

Outros componentes do soro

ELISA “SANDWICH”

Antígeno a ser dosado Anticorpo primário

Anticorpo conjugado

TMB

Enzima Peroxidase

ELISA DE COMPETIÇÃO

Outros componentes do soro

Antígeno a ser dosado Anticorpo primário

Antígeno biotinilado

TMB

ST-AV- Peroxidase

ELISA DE CAPTURA

Anticorpo anti-IgM

IgM a ser detectada

IgM inespecífica

Antígeno biotinilado

TMB

ST-AV- Peroxidase

ELISA INDIRETA

Antígeno purificadoIgM a ser detectada

IgM inespecífica

Anticorpo conjugado

TMB

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.5.2- Quantificação de Ag/Ac em ELISA:

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.5- ELISA:

- Vantagens: Método altamente sensível e específico, com alto grau de confiabilidade como ensaio quantitativo, custo baixo a médio.

- Desvantagens: Devido a alta sensibilidade, pequenas variações de pipetagem e tempo de incubação podem ocasionar resultados alterados; em extratos de antígenos, não se pode precisar a qual antígeno houve a resposta; ELISA de competição muito susceptível a erros de manipulação.

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica: Utilizados para detecção e localização de antígenos em células e tecidos e para detecção de anticorpos específicos em fluidos biológicos.- Métodos de alta especificidade e alta especificidade- Utilização de anticorpos conjugados com substâncias fluorescentes (FITC, FAC) na IFA, e de anticorpos conjugados com enzimas (Imunohistoquímica).

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica:

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica:

- Vantagens: Alta especificidade e sensibilidade; possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização, bem como do tráfico intracelular.

-- Desvantagens: “variação individual” na leitura de resultados de IFA; alto custo de microscópio de fluorescência; técnicas especiais de fixação e inclusão de tecidos para Imunohistoquímica nem sempre disponíveis.

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.7- Western-Blot: Associação de técnica de Eletroforese em Gel de SDS-PAGE com técnicas imunológicas

- Permite a identificação do reconhecimento de antígenos com peso molecular definido

- Identificação de anticorpos que reconhecem determinado antígeno em solução contendo diversos antígenos

- Permite a realização de cinética de expressão de proteínas celulares.

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.7- Western-Blot:

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.7- Western-Blot:

2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

2.7- Western-Blot:- Vantagens: alta sensibilidade e especificidade; reconhecimento de antígenos individuais em um extrato; realização de perfil de reconhecimento de antígenos e determinação de proteínas imunodominantes;- Desvantagens: Custo médio a alto; procedimento longo e propenso a erros em diversos pontos; dependendo do sistema de revelação, pode-se ter problemas de segurança.

3- BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA

- Imunologia Celular e Molecular. Abbul K. Abbas & Andrew H. Lichtman. Quinta Edição, Elsevier Editora

- Imunologia Médica. Abba I. Terr, Daniel P. Sittes & Tristam. Décima Edição. Guanabara Koogan Editora.

- Imunologia Veterinária. Ian R. Tizard. Quinta Edição. Roca Editora.

- Imunologia. David Male, Ivan Roitt & Jonathan Brostoff. Sexta Edição. Manole Editora.

- Imunobiologia: O Sistema Imune na Saúde e na Doença. Charles Janeway, Paul Travers & Mark Walport & J. Donald Capra. Quinta Edição. Artmed Editora.

-Immunodiagnostics, A Practical Approach. Ray Edwards. Oxford University Press.

-Antibodies, A Laboratory Manual. Ed Harlow & David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory Press.