IMUNOLOGIA

Anticorpos

Profª Cláudia ValleProfª Cláudia Valle

Anticorpos

Definição: são glicoproteínas séricas da

fração gamaglobulina.

ANTICORPOS

DEFINIÇÃO / CARACTERÍSTICAS

- Glicoproteínas solúveis produzidas por linfócitos B e células plasmáticas após a

estimulação com um antígeno.

- Por convenção estabelecida pela OMS, devem ser chamados de imunoglobulinas (abreviado como Ig)

- Pertencem a um grupo de polipeptídeos chamados imunoglobulinas (separação

eletroforética).

- Interação Ag – Ac se dá através de forças não covalentes

(ligações de hidrogênio, atração eletrostática e força de van der Waals).

IMUNOGLOBULINAS

A – albumina

B – alfa-globulina

C - beta globulina

D – gama-globulina

ELETROFORESE DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS

PLASMÓCITO PATÓGENOS

EFEITOS PROTETORES DA

IMUNIDADE HUMORAL SÃO

MEDIADOS POR UMA FAMÍLIA DE

GLICOPROTEÍNAS DENOMINADAS

ANTICORPOS

B

Plasmócito

anticorpos

Imunidade humoral

Anticorpos

Estrutura molecular

Anticorpos (Ac) ou Imunoglobulinas (Ig)

- São moléculas com receptores específicos para o

mesmo antígeno que estimulou a sua síntese, e

apresentam a mesma estrutura básica.

- Porção Fab (fragment antigen binding): liga-se ao

antígeno e varia segundo a especificidade de cada ly B.

- Porção Fc (fragment crystalizable): interage com

células, principalmente fagócitos, através de receptores

Fc ou ativa o complemento.

ANTICORPOS

• REGIÃO VARIÁVEL ( Fab)

• REGIÃO CONSTANTE ( Fc)

• CADEIAS PESADAS

• CADEIAS LEVES

Anticorpos

Estrutura

Quatro cadeias polipeptídicas ligadas por pontes dissulfeto. * Cadeias pesadas (55 a 70 Kd) - Zona de dobradiça – prolina – até 180o

* Cadeias leves (25 Kd)

* Enzimas proteolíticas (papaina)): - fragmento cristalizável (Fc) - fragmento que se liga ao antígeno (Fab): variabilidade ext. aminoterminal

2 leves (L)

2 pesadas (H)

ESTRUTURA

- 4 cadeias polipeptídicas

- 2 isotipos de cadeia leve: (kapa), (lâmbida)

- 5 isotipos de cadeia pesada:

(alfa), (delta) , (gama) (epsilon) (mi)

* Cada cadeia tem segmentos relativamente estáveis ou constantes (C), que controlam as funções efetoras da molécula.

* Zonas onde a sequência de aminoácidos varia enormemente: regiões variáveis

(V).

- Conteúdo de carboidrato: 2 – 12%

- Ligações dissulfeto

Seres humanos: * Isotipo apresenta quatro subtipos: e

sotipo apresenta dois subtipos: e

O anticorpo é constituído por quatro cadeias polipeptídicas, possuindo dois sítios

de ligação para o antígeno

Antígeno

cadeias

sítios de ligação

O anticorpo é formado de duas cadeias leves e duas cadeias pesadas unidas por pontes dissulfeto

CADEIA PESADA

C

C

N

N

N

NCADEIA LEVE

CC

CADEIA PESADA

C

C

N

N

N

NCADEIA LEVE

CC

PONTES DISSULFETO

ESTRUTURA DAS IMUNOGLOBULINAS

Região amino terminal

Dobradiça

Região Carboxi terminal

Cadeia leve

Cadeia pesada

Ponte dissulfeto

Cadeia leve

Cadeia pesada

aminoácidos

aminoácidos

aminoácidos

Tratamentos enzimáticos

Papaína: 3 fragmentos

(2 Fab, 1Fc).

Pepsina: 2 fragmentos Fab.

ESTRUTURA

Duas porções:

Fab: ligação com o Ag.

Fc: cristalizável.

INTERAÇÃO COM O ANTÍGENO

Afinidade refere-se à força individual da ligação Ac-Ag (um epítopo e um sítio combinatório). É proporcional ao grau de complementaridade entre o epítopo e o sítio combinatório.

Especificidade refere-se a especificidade dos sítios combinatórios de um Ac. Quando o Ac reage apenas com o Ag A, e não com o B, diz-se que ele é específico. Quando alguns epítopos de um antígeno C são também reconhecidos, diz-se que ocorre uma reatividade cruzada.

• Antígenos

- Substância capaz de induzir e reagir com a resposta imunológica.

• Epítopos ou Determinantes antigênicos

- São fragmentos da molécula do antígeno que induzem ou reagem com a resposta imunológica.

- Porção específica que liga-se ao anticorpo.

Podem ser:

- Determinantes lineares: formados por resíduos de aminoácidos adjacentes na sequência covalente.

- Determinantes conformacionais: formados por resíduos de aminoácidos de partes separadas da sequência linear . Estão justaposos espacialmente na pela estrutura terciária protéica.

Modelo para EPÍTOPO CONFORMACIONAL

EPÍTOPOS

• LINEARES E CONFORMACIONAIS

Diferenças/marcadores (polimorfismo)

Isotípicas

- Entre indivíduos de espécies diferentes;

- Mamíferos: 5 tipos de cadeia pesada (, , , e

Alotipicas

- Entre indvíduos da mesma espécie;

- Geralmente demonstra diferenças raciais;

- Pequenas variações nas regiões constantes.

Idiótipos

- Regiões determinantes de complementaridade (CDR) ;

- Local nos anticorpos complementares para o antígeno;

- Na porção Fab - chamadas regiões hipervariáveis

- Existem entre anticorpos de clones diferentes de plasmócitos.

ISÓTIPOS ALÓTIPOS IDIÓTIPOS

Anticorpos

Funções

1. Na defesa do hospedeiro

marcação de organismos infecciosos;

recrutamento, no hospedeiro de mecanismos efetores de destruição;

neutralização de toxinas;

remoção de antígenos estranhos da circulação.

2. Na medicina clínica

níveis de Ac específicos antipatógeno usados no diagnóstico/monitoramento

de uma doença;

conjunto de Ac administrados passivamente para a terapia/proteção do

hospedeiro.

3. Em laboratórios científicos

diagnóstico e pesquisa.

Funções

- Inativação de toxinas e outros agentes químicos

- Inativação de vírus

- Lise de bactérias

- Citotoxicidade

- Transferência de imunidade para fetos (IgG)

- Transferência de imunidade a lactantes (IgA>IgG)

- Fixação do complemento

- Regulação da resposta imune

- Participação em reações auto-imunes e alérgicas

AÇÃO DOS ANTICORPOS

• NEUTRALIZAÇÃO

Ligação ao patógeno impedido interação deste com a membrana celular.

•OPSONIZAÇÃO

Revestimento do patógeno por proteínas sistema imune.

•AGLUTINAÇÃO

•ATIVAÇÃO DO SISTEMA COMPLEMENTO

•DEGRANULAÇÃO

NeutralizaçãoNeutralização

Neutralização Neutralização

NeutralizaçãoNeutralização

OpsonizaçãoOpsonização

OpsonizaçãoOpsonização

Ativação do Sistema ComplementoAtivação do Sistema Complemento

DEGRANULAÇÃO DE

MASTÓCITOS

BASÓFILOS

ESOSÍNÓFILOS

(IgE)

AGLUTINAÇÃO (IgM, IgG)

Passagem e proteção em epitélios de mucosas (IgA)

Tabela: FUNÇÕES DOS ANTICORPOS

Neutralização

Opsonização

Sensibilização de NK

Ativação de complemento

Sensibilização de MASTÓCITO

ATIVIDADE

DISTRIBUIÇÃO

Transporte através do epitélio

Transporte através da placenta

Difusão extravascular

mg/mL

Anticorpos Classes

CLASSES DE ANTICORPOS

Dobradiça

Ponte dissulfeto

Cadeia J

SUBCLASSES DE ANTICORPOS

PONTE DISSULFETO

SUBCLASSES DE ANTICORPOS

IgA1 IgA2

ANTICORPO IgM

A IgM constitui cerca de 5-10% do soro total .

Primariamente nos espaços intravasculares.

É o 1º anticorpo a ser produzido na resposta imune primária

ATIVA COMPLEMENTO !!

- Principalmente sob forma de pentâmero (cinco monômeros)

- Redução a monômero de peso molecular 180kDa

- Principal imunoglobulina da resposta primária aos antígenos

- Primeira classe ao elevar-se na fase aguda dos processos imunológicos

-Aglutinante e citolítico

-Fixação complemento melhor que IgG3

- Maturação de célula B, atuando como receptor e interagindo com o antígenoquanto ao controle da ativação ou supressão do linfócito

-Sintetizada à partir do 5 meses de vida fetal

- Não neutraliza vírus ou toxinas

* Níveis elevados de IgM normalmente indicam uma infecção recente ou uma exposição recente do Ag

IgM

IgM

ANTICORPO IgG

É a Ig mais abundante no sangue (80%), em particular na resposta secundária a um antígeno

A IgG1, IgG3 e a IgG4 são capazes de atravessar a placenta

A IgG3 é a mais eficiente ativadora de Complemento.

IgG- Principal Ig sintetizada na resposta secundária- Neutraliza toxinas bacterianas, vírus- Opsonina- Liga-se aos microorganismos para facilitar a fagocitose - Responsável pela memória imunológica

- Atravessa a barreira placentária humana- Monômero: 4 subclasses IgG1, 2, 3 e 4 (constituem 70, 20, 8 e 2%, respectivamente, do total de IgG)

- IgG3 fixa complemento com mais eficiência- PM 160kD

- Geralmente forma monomérica

IgG

ANTICORPO IgA

É a imunoglobulina presente em maior quantidade (10-15%) nas secreções externas como leite, saliva e lágrimas onde existe na forma de dímero.

Estrutura da IgA secretora

Cadeia J

Componente secretor

ANTICORPO IgA secretora

Formação da IgA secretória

Submucosa

Submucosa

Plasmócito

Dímero IgA

IgAs

IGA– 2ª mais abundante no soro (monomerica)– Ocorre como monômero e como dímero

– IgA secretora (mais encontrada secreções exócrinas)

– Principal Ig secretada para superfícies externas (mucosas)• lágrimas, saliva, leite, suco gástrico e secreções pulmonares• confere imunidade local-barreira contra vírus, micróbios, alérgenos

– Não fixa complemento– Neutraliza vírus

– Bactericida contra Gram-negativas, na presença de lisozima

– PM 160kDa (monômero) ou 360kDa (dímero)

– Importante papel impedindo a penetração, no organismo de substâncias alergênicas e de partículas microbianas

IgA

ANTICORPO IgE

•A IgE está presente em baixas concentrações no soro (0,004%), mas tem um papel significante no início da resposta inflamatória aguda, na proteção contra parasitas e nas reações alérgicas.

ANTICORPO IgE

– Monômero longo com 4 domínios CH

– Baixa concentração no soro• Liga via porção Fc em basófilos e mastócitos • Não requer a presença do antígeno para se ligar

– Reações alérgicas - Níveis aumentam na resposta a parasitas ou pacientes com reações alérgicas (hipersensibilidade do tipo I)

– Interação mastócito / IgE / Ag, causa a ativação do mastócito com efeitos vasculares potentes localizados

– Infecções parasitárias (helmintos)• Ligação via Fc aos eosinófilos

– Não fixa complemento

IgE

IgE

ANTICORPO IgD

É uma imunoglobulina presente em baixas concentrações na circulação ( 0,3mg/ml), cuja função primária é o de receptor da célula B.

Não possui funções biológicas conhecidas.

– Concentrações séricas baixas– Meia-vida curta– Menos caracterizada das imunoglobulinas do ponto de vista

funcional– Sensível à proteólise– Está na superfície do linfócito B– Não liga complemento– Forma monomérica– PM 160kDa– Sensível a lise (lábil à degradação)– Existe como receptor na superfície de todo linfócito B em

determinado momento de sua ontogenia

IgD

• Inicialmente linfócitos B expressam IgM

• Durante a resposta imune, ocorre liberação de citocinas por células T que induzem a troca de isotipo para IgG, IgA ou IgE;

• Recombinação somática na célula B.

“Switching” / Troca de classe

GERAÇÃO DE DIVERSIDADE NA RESPOSTA HUMORAL

O Papel das Citocinas

Citocina

Inibe Inibe

Inibe

Inibe Inibe

Inibe

Inibe

Inibe

Induz

Induz

Induz

Induz

Induz

Aumenta produÇão

Induz

Anticorpos

Resposta Imune Primária e Secundária

Resposta primária e secundária

Primeiro contato com Ag- Estimulo para linfócitos B que se diferenciam em plasmócito e liberam Ac- produção de Ac

Segundo contato (mesmo Ag)- Células receptoras (células de memória)- Resposta imunológica mais rápida- produção de Ac

RESPOSTA IMUNE PRIMÁRIA E SECUNDÁRIA Resposta humoral

Declínio

Tempo(dias)

Resposta primária

Resposta secundária (maturação de afinidade)

Tempo(dias)

Con

cent

raçã

o de

A

ntic

orpo

Con

cent

raçã

o de

A

ntic

orpo

Anticorpos monoclonais

• Produzidos pelo mesmo clone de linfócito B (mesma especificidade)

• Produção de Ac específico para um determinado epítopo (tecnologia dos anticorpos monoclonais)

Anticorpos Monoclonais

ANTICORPO MONOCLONAL - PRODUÇÃO

Imunização com antígeno X

Células de baço ativadas

Linhagem de mieloma mutante

FUSÃO

Cultivo de hibridomas em meio HAT

SELEÇÃO DOS HIBRIDOMAS

Sem produção de anticorpos desejados

Com produção de anticorpos desejados

Cultivo dos hibridos para produção de anticorpo mococlonal

Anticorpo purificado

ANTICORPOS MONOCLONAIS - HIBRIDOMA

OBTENÇÃO DO HIBRIDOMA

ANTICORPOS MONOCLONAIS - APLICAÇÕES

TERAPIA CONTRA CÂNCER

Bloqueio dos receptores de

células cancerosas

Merci !

GLOSSÁRIO IMUNOLOGIA

Citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) Lise de células-alvo através da ação de anticorpos e neutrófilos, macrófagos ou células nulas. IgG.

Fagocitose É o ato de comer realizado pelas células. O termo compreende vários processos, inclusive quimiotaxia, aderência ingestão e digestão ede partículas.

Hapteno Molécula não protéica que pode se ligar a sítios específicos de combinação de anticorpos mas não pode, pôr si só, iniciar uma resposta imune.

Hemaglutinação Agregação de eritrócitos pôr anticorpo ou vírus.

Monocinas São produtos protéicos de fagócitos mononucleares que influenciam as atividades de outras populações celulares.

Opsonina Substância que se liga a partículas e facilita sua fagocitose.

Pinocitose Literalmente é o ato de beber realizado pelas células.

Precipitação Agregamento de moléculas de antígenos solúveis pelos anticorpos para produzir um precipitado visível. Este contém tanto Ag como Ac.

PPG Im

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIAINSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDEPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA

PRODUÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-AMASTIGOTAS DE Leishmania chagasi

Cláudia Valle Cabral Dias dos Santos MESTRANDA

Laboratório de Imunologia Molecular e Celular - LIMC Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz - CPqGMFundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZSalvador - BA

OBJETIVO GERAL

Produzir anticorpos monoclonais anti-amastigotas de

Leishmania chagasi, visando o desenvolvimento

futuro de técnicas imunodiagnósticas que permitam a

identificação de moléculas de Leishmania específicas

para o diagnóstico da infecção no homem e no cão.

Testar diferentes protocolos de imunização de camundongos com Leishmania chagasi ou seus antígenos, visando a obtenção de melhor resposta humoral anti-amastigota

Produzir hibridomas utilizando esplenócitos do animal que melhor respondeu às imunizações

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

PROTOCOLO DE PURIFICAÇÃO DE AMASTIGOTAS DE Leishmania chagasi

sacrifício e

coleta de baço

hamster infectado

separação de células

lise de hemácias em

NH4Cl a 0,85 %

purificação de amastigotas em gradiente de Percoll

lavagem de amastigotas e armazenamento à - 70oC

GRAU DE PURIFICAÇÃO DE AMASTIGOTAS

O melhor rendimento foi de 3.4 x 10 9 parasitos por hamster

““Imprint” do baçoImprint” do baço Amastigotas após Amastigotas após gradiente de Percollgradiente de Percoll

ESTRATÉGIA DE PRODUÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI - AMASTIGOTAS DE

Leishmania chagasi

células pós-fusão

mieloma SP2/0

esplenócitos

+

promastigotas metacíclicos vivos

ELISA para amastigotas

seleção do animal melhor respondedor

seleção das células secretoras de anticorpos anti-amastigotas

fusão

RESUMO DA PRODUÇÃO DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI- AMASTIGOTAS DE

Leishmania chagasi

Número de poçosutilizados

Número de poçostestados com crescimento

de células

Números de poçospositivos para L. chagasi

em ELISA

1920 141 (7,3%) 05 (3,6% dos poçospositivos)

CLONAGEM DE CÉLULAS HÍBRIDAS

Diluição limitante

Distribuição em placas de 96 poços com cinco ou uma célula/poço

Seleção dos poços contendo apenas uma colônia

Expansão desses clones

CARACTERIZAÇÃO POR WESTERN BLOT DOS ANTÍGENOS DE AMASTIGOTAS DE Leishmania chagasi

a. 4B6E11; b. 4B6F7; c. 5A9H8; d. 5A9H10; e. 5A9H11; f. 5A9H12; g. 9A7E12; h. salina; i. anticorpo monoclonal irrelevante. A- antígeno sob condições não desnaturantes; B- antígeno sob condições desnaturantes

a b c d e f g h i a b c d e f g h i

112KDa

84KDa

53KDa

35KDa29KDa21KDa

A B

CLASSES E SUBCLASSES DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS E PESO MOLECULAR DAS

PROTEÍNAS DE AMASTIGOTAS DE Leishmania chagasi

Clone Peso molecularClasse e subclassede imunoglobulinas

9A7E1260 kDa

4B6F735 e 68 kDa

5A9H8

A inoculação de camundongos com promastigotas metacíclicos

vivos de Leishmania chagasi demonstrou ser de fácil execução e

eficiente na obtenção de resposta imune humoral anti-amastigota

de Leishmania chagasi.

Um anticorpo monoclonal obtido pertencente à subclasse de

imunoglobulina IgG2a foi espécie e estágio específico,

reconhecendo dois antígenos de 35 e 68 kDa de proteína nativa

apenas das formas amastigotas de Leishmania chagasi.

Outro anticorpo monoclonal da classe IgM reconheceu uma banda

de 60 kDa de antígeno de amastigotas e promastigotas de quatro

diferentes espécies do gênero Leishmania.

Merci !