microbiolgico_APOSTILA

5/10/2018 microbiolgico_APOSTILA - slidepdf.com

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TESTE DE PIROGÊNIO

Escolher 3 coelhos sadios para cada amostra a ser ensaiada.Pesar e colocá-los nos contendores. Deixá-los ambientar por 30 minutos.Decorrido este período, medir a temperatura retal pela introdução de termômetro veterinário

numa profundidade de 7,5 cm. Deixar por pelo menos 1 minuto.Manter novamente os animais em repouso durante 30 minutos e repetir a leitura de temperatura.Anotar os pesos, temperaturas basais em fichas próprias. Calcular a média das temperaturas basais, iniciar a administração da amostra pela injeção na veia marginal da orelha do animal.Injetar lentamente o volume.Deixar o animal em repouso e medir a temperatura dos animais após 1 h; 2h e 3 horas após ainjeção.Anotar os valores da temperatura, calcular as elevações de temperatura e emitir o resultado daanálise da amostra.

Exigências

Peso dos coelhos = 2,0 a 3,5 KgTemperatura basal = 38,9.ºC a 39,8.ºCAmbientados em laboratório climatizado e controlado.

Aprovado : Se a diferença das temperaturas for inferior a 0,6.ºC em um dos animais, e se asomatória das temperaturas for inferior a 1,4.ºC.Reteste : Se a diferença das temperaturas for superior a 0,6.ºC em um dos animais, e se asomatória das temperaturas for superior a 1,4.ºC. Testar com 5 novos coelhos;Aprovado : Se a diferença das temperaturas dos oito animais for superior a 0,6.ºC em até dois

animais, e se a somatória das temperaturas dos oito animais for inferior a 3,7ºC.Reprovado : Não atender as exigências descritas acima.

TESTE DE INOCUIDADE

Este teste tem por objetivo a detecção de elementos tóxicos proveniente do material empregadona elaboração do produto.

1. Material necessário• Pool de amostra do produto;• Seringas de 1 e 5 ml; agulhas de 15x5 mm( para via intraperitoneal ou endovenosa); 10x5

mm (subcutânea) e sonda gástrica (via oral), esterilizados;• Camundongos pesando entre 17 a 23 g ;• Cobaias de 250 a 350 g ( teste de sensibilidade cutânea, imunoterápicos);• Balança

2. Técnica



3. Registrar os pesos iniciais;4. Inocular 0,5 ml do produto (3 vezes a dose terapêutica proporcional por Kg) em 5

camundongos. Para via subcutânea inocular 0,2 ml.5. Observar os animais por 48 horas após inoculação

Para teste com imunoterápicos• Inocular 0,2 ml via subcutânea em 5 camundongos• Inocular 0,5 ml via subcutânea do mesmo produto em 2 cobaias;• Proceder o teste controle inoculando-se salina;• Observar os animais por 7 dias e registrar o peso final no 70 dia do teste

3. Interpretação do TesteO teste é considerado satisfatório quando:

1. Todos os animais sobrevivem ao período mínimo de 48 horas, ou 7 dias paraimunoterápicos;

2. nenhum animal apresentar qualquer resposta inespecífica e/ou inesperada;3. O peso final dos animais (para imunoterápicos) for igual ou superior ao peso inicial.

Se o produto em teste não preencher os requisitos acima citados, o teste deverá ser repetido como dobro do número de animais.

TESTE DE ESTERILIDADE

1. IntroduçãoO termo Esterilidade é utilizado para designar um produto livre de qualquer microrganismoviável, excetuando-se os casos de produtos, como certas vacinas (BCG, sarampo, poliomielite eoutra), que possuem microrgansimos vivos, em sua constituição. Neste caso, o teste de esterilidadevisa a detecção de microrganismos viáveis estranhos aos constituintes da vacina.O teste de esterilidade é feito segundo as farmacopéias indicadas para comprovar ausência demicrorganismos, aeróbios e anaeróbios, capazes de se reproduzir em um número definido deamostras de um lote. A probabilidade de detectar microrganismos viáveis no teste de esterilidadeaumenta com o número de organismos presentes numa determinada quantidade da preparação aser testada e varia de acordo com a espécie de microrganismo.A amostragem, ao acaso, de um lote não pode detectar, com certeza, níveis muitos baixos decontaminação que seja uniforme em todo o lote e por conseguinte, o teste de esterilidade por si só não fornece segurança absoluta sobre a ausência de contaminação microbiana em todas as

amostras do lote. O teste de esterilidade é destinado a revelar a presença de microrganismos nasamostras utilizadas no lote . A interpretação dos resultados é baseada na suposição de que oconteúdo de cada recipiente do lote, se testados, também teriam resultado equivalente. Como éevidente que cada recipiente do lote não pode ser testado, um número suficiente de recipientesdeve ser analisado, de modo a fornecer um grau adequado de confiança no resultado do teste.Deve-se ter como avaliação que os resultados obtidos sem controles prévios não podem ser levados em conta.



2. AmostragemQuando um teste de esterilidade é realizado em amostras cujo número não representaestatisticamente um dado lote, os resultados obtidos com as mesmas, não podem ser extrapoladoscom segurança para caracterizar a condição de esterilidade do lote. Isto significa que um númeroexcessivamente pequeno de amostras serviriam apenas para detectar um alto índice de unidades

contaminadas. Em vista disso, o número de amostras a serem ensaiadas, deve representar uma porção estatisticamente significativa do lote final.Para cada processo de enchimento (ou envase) de cada lote, deverá ser testado um número deamostras correspondente à fórmula empírica 0,4Ö n , onde n representa o número total de envasedo lote. Casos em que o lote apresenta número inferior a 100 frascos envasados, a amostragemdeve ser correspondente a 10% do total, não podendo ser inferior a cinco. A tabela I mostra valoresde amostragem s serem recolhidos para os teste de esterilidade, para o controle do lote produzido.

Tabela I Número de amostras necessárias para teste de Esterilidade

Número de frascos envasados

no lote final

Quantidade de amostras

no de frascos

100 5

100-500 10

501- 1.000 13

1.001- 5.000 28

5.001 -10.000 40

10.001- 20.000 56

> 20.000 63

3. Tipos de medicamentos submetidos ao ensaio de esterilidade• Medicamentos de uso parenteral;• Oftálmicos;• Medicamentos empregados nos tratamentos de queimaduras e feridas abertas;

Materiais com aplicação em cirurgia, ginecologia e urologia.

4. Descrição de uma sala assépticaA primeira exigência para execução de trabalhos assépticos é uma sala propriamente estruturadae designada para funcionar corretamente para tal atividade. Isto envolve condições adequadas de paredes e pisos que possam ser de fácil limpeza e desinfetados, pré-camaras para troca de roupasda equipe, filtros biológicos de ar e pressão positiva, havendo ainda diferença de pressão entre a

câmara e a antecâmara, esta devendo possuir pressão inferior à primeira. O fluxo de ar deve ser o mais direcionado possível de modo a eliminar a turbulência na sala. A eficiência do processoé elevada através do uso de cabines de fluxo laminar. Para testes de esterilidade pelo método defiltração por membrana é recomendado uso de cabine de fluxo laminar vertical e para o métodode inoculação direta, o horizontal. o uso de lâmpadas U.V. nas salas assépticas, embora seja um ponto bastante discutível com relação à eficácia nos processos de descontaminação ambiental,constituem material de apoio para a redução nos níveis de contaminação, e principalmente são



de extrema importância para o processo de descontaminação externa dos materiais que serãointroduzidos nas salas assépticas, através de túneis de lâmpadas U.V.O uso de lâmpadas U.V. deve ser controlado através de registros periódicos, quer seja de radiaçãoemitida ou do no de horas de utilização. É importante também manter as lâmpadas sempre limpas, pois a deposição de películas de poeira irá funcionar como barreiras para a radiação. A limpeza

deve ser feita com gaze embebida em álcool, suavemente e com freqüência semanal.A temperatura e umidade da sala asséptica devem ser devidamente controladas, pois o excesso deumidade e altas temperaturas facilitam a proliferação de microrganismos, enquanto que umidadee temperaturas baixas são prejudiciais aos operadores que trabalharão nestas áreas. Recomenda-semanter a sala em torno de 20o C e 53% de umidade relativa.

5. Constituição dos meios de cultura• Caldo de caseína e soja : proteínas e carbohidratos• Caldo de tioglicolato: proteinas, carbohidratos, ácido tioglicólico, cisteína, resazurina e

ágar em baixa concentração.Os agentes redutores (ácido tioglicólico e cisteína) tendem a diminuir a concentração de oxigênio.O ágar também contribui para diminuição da tensão de oxigênio, propiciando a anaerobiose. A parte superior em contato com o ar é oxidado apresentando coloração avermelhada e a parteinferior é reduzida, apresentando coloração amarela.

6. Controles Prévios ao teste de Esterilidade6.1. Meios de CulturaOs meios de cultura utilizados nas provas de esterilidade bacteriana e fúngica deverão ser testados preliminarmente quanto à sua esterilidade e viabilidade.

A. Controle negativo: Para satisfazer os critérios de esterilidade, utiliza-se o meio líquido de

tioglicolato, incubado na faixa de temperatura de 30 a 37o

C por 7 dias, para evidenciar ocrescimento de bactérias aeróbias e anaeróbias, e o meio de caseina e soja, incubado na faixa detemperatura de 20 a 27oC para evidenciar o crescimento de fungos. Pode-se utilizar qualquer outromeio com propriedades nutritivas equivalentes. Não deve haver crescimento microbiano.

B. Controle Positivo. O teste de viabilidade é avaliado utilizando-se um pequeno inóculo ( menosde 100 germes) de microrganismos apropriados. O meio deverá ser incubado nas temperaturasutilizadas na realização do teste propriamente dito (Tabela II).

Tabela IIMicrorganismos usados nos testes de

fertilidade dos meios para teste deesterilidade

MicrorganismoMeio deCultura

MetabolismoRespiratório

B. subtilis (ATCC 6633)

Tioglicolato aeróbio



B. vulgatus

(ATCC 8482)Tioglicolato anaeróbio

C. albicans (ATCC10231)

Caseina esoja

aeróbio

A. niger Caseina esoja aeróbio

No caso destes testes resultarem positivos, o meio é viável para o teste e pode ser utilizado para oteste de rotina.6.2. Material de EnsaioTodo material desconhecido deverá ser feito exame prévio quanto à ausência de atividade bacteriostática ou fungistática, fazendo-se a comparação:

• Meio sem inóculo + material de análise• Meio com inóculo + material de análise

Caso não haja crescimento, elege-se um dos seguintes métodos:a) Dilui-se o material de análise no meio de cultura até uma concentração inativa do inibidor; b) Adiciona-se um inativante apropriado (Tabela III);c) Utiliza-se o processo de filtração.

Tabela III

Substâncias Inibidoras Inativantes

PenicilinaPenicilinase, cloreto dehidroxilamônio

Estreptomicina cisteína, cloreto de hidroxilamônio, penicilinase

Compostos de mercúrioe chumbo

compostos com -SH ( cisteína,glutation, dimercaptol)

Sulfonamidas PABACompostos de amônio4ario lecitina, polisorbato 80

Compostos de Arsênio cisteína e tioglicolato

TESTE DE ESTERILIDADE – Prática

1. IntroduçãoO teste de esterilidade tem como finalidade comprovar a ausência de microrganismo capazes dese reproduzirem em um número definido de amostras de um determinado lote.



2. Técnicas Empregadas3. Método Indireto; este método consiste na filtração de uma amostra líquida através de uma

membrana filtrante e esta é inoculada no meio de cultura apropriado.4. Método Direto: Consiste na inoculação direta da amostra diretamente no meio de cultura

apropriado.

3. Material Necessário4. Caldo de tioglicolato: preparar segundo o fabricante5. Caldo caseina e soja; preparar segundo o fabricante.6. Solução peptonada a 0,15 (para lavagem): Dissolver quantidade de peptona

correspondente a 0,1% em água destilada; distribuir em erlenmeyer ou frasco de 100 ml eesterilizar em autoclave a 121.ºC por 20 minutos. Esfriar e incubar em estufa a 35.ºC por 48 horas para certificar que o material está estéril.

7. Solução de cloreto de benzalconeo: Dissolver quantidade de cloreto de benzalconeoequivalente a 0,4g com 5 ml de etanol 96.º G.L. Completar com água destilada para 100ml.

8. Aparelhagem de filtração: lavar cuidadosamente todos os componentes da aparelhagem,enxaguar em água corrente e secar ao ar ou estufa a 40.ºC. Montar o aparelho de filtraçãocolocando uma membrana de porosidade de 0,22 mm. Embrulhar o conjunto em folha de papel Kraft formolizado e esterilizar em autoclave por 30 minutos a 121.ºC.

9. Acessórios; os acessórios como pinças, agulhas hipodérmicas e seringas devem ser embrulhadas em papel alumínio individualmente e colocados em um único envelope de papel Kraft. Esterilizar em autoclave.

10. Avental, gorros, luvas, máscaras e gaze: As luvas devem ser limpas, secas e polvilhadascom talco; o avental, a gaze, máscaras, luvas e gorrosdevem ser embrulhados em

envelopes de papel kraft, e esterilizar em autoclave.

4. Preparo da Sala AssépticaDeve-se proceder a desinfeção da sala com solução de cloreto de benzalconeo a 0,4%(piso,parede) no mínimo 2 horas antes do teste. Limpar o fluxo laminar e a bancada com soluçãoanti-séptica diferente do cloreto de benzalconeo.

5. Preparo das Amostras6. Ampolas e Frasco-Ampolas: manter imersos em solução de cloreto de benzalconeo a

0,4%, 30 minutos antes do início do teste.7. Amostras a granel: Na sala asséptica, sob proteção do fluxo laminar, coletar as amostras

em frascos estéreis e mantê-los fechados até o momento do teste.

6. Preparo do Material para TesteColocar todo o material proveniente da autoclave, (já esterilizado), dentro da capela do fluxolaminar e dispor de forma adequada para a execução do teste.

7. Procedimento8. Método por Filtração em Membrana



9. Montagem do aparelho de filtração: Conectar a mangueira da bomba à vácuo,devidamente desinfectada, ao copo de filtração;

10. Filtração das AmostrasAmpolas: com auxílio de uma gase estéril, quebrar as ampolas e retirar o líquido com o auxílio deuma seringa e verter no copo de filtração.

Frasco-Ampola: retirar a tampa com auxílio de um alicate e colocar a amostra em erlenmeyer contendo água peptonada; dissolver e verter no copo de filtração. No caso de amostras líquidasou preparações extemporâneas não há necessidade de retirar as tampas. Retirar a amostragemcom auxílio de uma seringa com agulha estéril e perfurar a tampa de borracha. Para amostrasextemporâneas, injetar água destilada estéril ou diluente adequado, dissolver e retirar a amostracom seringa.Matéri-prima: colocar uma quantidade representativa da amostra no erlenmeyer contendo água peptonada, dissolver bem e verter no copo de filtração.Reservar sempre um copo de filtração para o controle negativo, realizando a filtração de água peptonada estéril.Todos os copos de filtração contendo a membrana filtrante (durante a execução do teste) devemser lavados com água peptonada. Retirar, assépticamente, a membrana com auxílio de uma pinçaestéril. Cortar a membrana e inocula-la em caldo de tioglicolato (pesquisa de bactérias) e caldocaseína e soja (pesquisa de fungos). Identificar os tubos, colocando nome, lote e data de execuçãodo teste. Incubar em estufa.

2. Método por Inoculação Direta em Meio de Cultura3. Mostras insolúveis ou líquidos: Se a amostra é solúvel (pó), dissolver previamente em

solução peptonada estéril. Se for líquida, com auxílio de seringa e agulha estéril, transferir a amostra diretamente no tubo contendo meio de cultura, nunca excedendo 15 ml por tubo.

4. Amostras Insolúveis: Sob proteção de fluxo laminar, retirar cuidadosamente umaamostragem média e transferir para os tubos com meio de cultura.

Na preparação dos meios de cultura para substâncias insolúveis, incorporar 0,25% de polisorbato80 antes da autoclavação. No caso de amostras com inibidores, adicionar agente inativanteadequado . Ex: Penicilina - penicilinase.Após 7 dias de incubação ou no caso de dúvidas, realizar sub-cultivo em 10 tubos, inoculando-se1,0 ml do tubo duvidoso e incubar.

8. Incubação Leitura e Interpretação dos ResultadosIncubar os tubos contendo caldo de tioglicolato em estufa a 35.ºC e os tubos contendo caldo

caseína e soja em estufa a 25.ºC. Observar diariamente os tubos.

APROVADO: Decorrido 14 dias de observação, não houve formação de filamentos, turvação oucrescimento microbiano.

RETESTE: No decorrer de 14 dias houve crescimento ou turvação, realiza-se o teste com o dobrodo número de amostras do teste original. Realiza-se identificação pelo método de Gram. Apósreteste, se houver nova contaminação realiza-se nova coloração de Gram e se o microganismo



identificado for diferente do teste original, realiza-se um novo reteste. Caso o microrganismoidentificado no primeiro reteste seja o mesmo do teste original, a amostra é considerada reprovada. No segundo reteste se a amostra não apresentar turvação, ela é considerada aprovada.

REPROVADO: Após sucessivos retestes a amostra apresentou turação ou crescimento.

CONTAGEM MICROBIANA

(ANÁLISE QUANTITATIVA E QUALITATIVA)

INTRODUÇÃO:Este método destina-se a indicar o nível de contaminação microbiana (viáveis) existentes nas áreas produtivas, laboratório de controle biológico, no pessoal envolvido diretamente com o processo produtivo, matérias-primas, produtos acabados, águas de diversas fontes, assim como pesquisa eidentificação de microrganismos existentes.

MATERIAL NECESSÁRIO:1. Meio de Cultura:• Ágar Caseína e soja (TSA) ou PCA ( Plate Count Agar) - preparar segundo o fabricante.• Ágar Sabouraud: prepara segundo o fabricante.

Preparar para cada placa de Petri de 100x20mm de dimensões, o equivalente a 15 ml de meio, ou35 ml para placas de 200x20mm.Esterilizar os meios em autoclave a 121o.C por 15 minutos.

2. Diluente:• Água peptonada a 0,1 % : Pesar 0,09g de peptona, em erlenmeyer ou balão de fundo

chato, e diluir em 90 ml de água destilada.• Água peptonada a 0,1% com agente neutralizante para parabenos: Preparar a água

peptonada conforme descrito acima e adicionar 0,7 g de lecitina e 8g de Tween 80.• Tampão fosfato pH=7,4 : Dissolver 0,5g de hidrogênio fosfato dipotássio com 0,302g de

dihidrogênio fosfato de potássio em quantidade suficiente para 1000 ml.

3. Vidraria e Acessórios:• Placas de Petri estéril ;• Erlenmeyer ou balão de fundo chato;• Pipetas estéreis;

PROCEDIMENTO:• Limpar o fluxo laminar com solução de cloreto de benzalcôneo a 0,4%;• Limpar todos os materiais com álcool 70% e colocar dentro da capela de fluxo laminar.• Caso as amostras contenham conservantes utilizar erlenmeyer contendo água peptonada

e neutralizante.Realizar assepsia externa dos frascos do mesmo lote e realizar um “pool ” da amostra em frascoestéril.



Amostras LíqudasPipetar um volume de 10,0 ml do pool da amostra e diluir em erlenmeyer contendo 90 ml de água peptonada. Homogeneizar, e pipetar 3 ml da amostra diluída, sendo que 1ml será distribuído emum tubo contendo 9,0 ml de água peptonada 0,1%, os outros 2 ml restantes serão distribuídos em

duas placas de Petri, onde cada placa receberá apenas 1 ml. Diluição 10-1

Realizar diluição subsequente para 10-2 e 10-3.

Amostras SólidasPesar em torno de 10,0 g da amostra e dissolver em 90 ml de água peptonada 0,15 e seguir damesma forma para amostras líquidas. No caso de comprimidos ou drágeas, deve-se pulverizar, assépticamente, os comprimidosutilizando gral e pistilo estéril.Seguir o mesmo procedimento das amostras líquidas.

INCUBAÇÃO E RESULTADOContagem Microbiana:

• As placas contendo TSA + amostra devem ser incubadas em estufa a 35o.C durante 48horas;

• As placas contendo SAB = amostra devem ser incubadas em estufa a 25o.C durante 120horas.

Contar as colônias formadas, anotar o número e multiplicar pela diluição realizada (vide exemploabaixo). Calcular a média de colônias por placas e reportar o resultado final

Exemplo:

Diluição = 10-1

Número de colônias formadas (UFC) = 290Diluição = 10-2 Número de colônias formadas (UFC) = 30Diluição = 10-3 Número de colônias formadas (UFC) = 1

Resultado: (290 x 101) + (30 x 102) = 29502Total de UFC/ml ou g de produto = 2950

Pesquisa de Microrganismos

Caldo Lactosado e TSB: incubar os erlenmeyers durante 48 horas e prosseguir à pesquisa em

meios específicos para identificação de cada microrganismo segundo metabolismo de cada um.



LIMITES ACEITÁVEIS DE CONTAGEM MICROBIANA

Material Limites Microbianos (UFC / ml ou g )

Bactérias Fungos Pesquisa (ausência)

Matéria-Prima

vegetal e animal< 1000 < 100 E. coli; Salmonella;, S.aureus; P. aeruginosa; C. albicans; A. niger; Clostridium

Produto Uso Tópico -

Sólidos< 1000 < 100 S.aureus; Gram negativos; Enterobacteriacea

Produto Uso Tópico -

líquidos< 500 < 50 S.aureus; Gram negativos; Enterobacteriacea

Uso Oral - Sólidos < 1000 <100 E. coli; Salmonella; Enterobacteriacea

Uso Oral - Líquidos < 500 < 50 E. coli; Salmonella; Enterobacteriacea

Oftálmicos < 100 < 10 S.aureus; Paeruginosa; A. niger

Produtos para Bebês <100 < 10 S.aureus; P. aeruginosa;EnterobacteriaceaSupositórios < 1000 < 100 E. coli; Salmonella ; S.aureus

Cremes vaginais < 1000 < 100 E. coli; C.albicans

Água potável < 100 <10 E. coli; Salmonella

TÉCNICA DE CONTAGEM EM PLACAS - “POUR PLATE”

É um procedimento para estimar o número de bactérias viáveis em placas contendo meio decultura sólido. As colônias podem surgir em pares, cadeias ou células simples, sendo que todassão denominadas como Unidades Formadoras de Colônias ( UFC).

1. Materiais Necessários

1.1. Vidrarias• Pipetas graduadas de 10,0 ml e 5,0 ml e 1,0 ml: selecionar a quantidade necessária para

o volume de análise, colocar algodão em todas as pipetas (na extremidade oposta ao bicoda pipeta) e acondicionar em papel Kraft;

• Placas de Petri 100 x 20 mm de vidro - Acondicionar as placas individualmente com papel

Kraft. Preparar um número suficiente para o volume de amostras a serem analisadas.Todos as vidrarias devem ser esterilizadas em autoclave por 15 minutos a 121oC.

1.2. Meios de Cultura e Diluentes• Caldo de peptona a 0,1 % (Diluente): Pesar 0,1 g de peptona desidratada e dissolver em

100 ml de água recém destilada e dispor 9,0 ml em tubos. Fechar com tampão de algodãoe autoclavar por 15 minutos a 121 oC.



• Agar Caseina e soja (TSA ou Agar Casoy): Preparar (segundo indicação do fabricante)quantidade de meio de cultura suficiente para o volume de amostras a serem analisadas.Esterilizar em autoclave a 121oC por 15 minutos

• Ágar Sabouraud: Preparar (segundo indicação do fabricante) quantidade de meio decultura suficiente para o volume de amostras a serem analisadas. Esterilizar em autoclave

a 121oC por 15 minutos.

2. Procedimento2.1. Procedimento de Análise para Contagem de Bactérias Viáveis ( Figura 1)Identificar em cada placa de Petri, o nome da amostra, lote, data, meio de cultura e temperaturade incubação. Preparar as placas em duplicata para cada diluição. Realizar assépticamente asdiluições de 10-1 , 10-2 e 10-3 .- Matéria-Prima: Pesar 10,0g da amostra sólida finamente pulverizada e dissolver em erlenmeyer contendo 90 ml de água peptonada a 0,1%.- Produto: Utilizando-se pipeta ou espátula estéril, dispor uma quantidade de 10,0 ml ou g deamostra em um erlenmeyer contendo 90 ml de caldo Letheen, homogenizar e deixar em repouso por 15 minutos para que possa ocorrer a neutralização do agente conservante.Assépticamente, pipetar 2,0 ml de amostra e dispor 1,0 ml em 2 placas de petri estéreisidentificadas como diluição de 10-1.Pipetar 1,0 ml do erlenmeyer com a amostra para um tubo contendo 9 ml de água peptonada.Homogenizar e dispor 1,0 ml da amostra nas placas de petri identificadas como diluição 10-2 , e1,0 ml para um tubo de ensaio contendo 9,0 ml de água peptonada 0,1%.Homogenizar a diluição do tubo de ensaio e transferir 1,0 ml para as placas identificadas comodiluição 10-3.Utilizando o diluente como controle negativo, pipetar 2,0 ml do diluente e dispor 1,0 ml em 2 placas de petri estéreis.

Resfriar o meio de cultura de Caseina e soja (TSA ou Ágar Casoy) esterilizado à temperaturaentre 44 a 48oC e verter sobre as placas num volume aproximado de 12 a 15 ml. Homogenizar cuidadosamente a amostra e o meio de cultura por rotação em forma 8.Deixar as placas em repouso durante 10 a 15 minutos e inverte-las após completa solidificação domeio de cultura. Incubar em estufa.

2.2. Procedimento de Análise para Contagem de Bolores e Leveduras:Proceder segundo descrita acima, conforme figura 1.Assépticamente, pipetar 2,0 ml de amostra dissolvida e dispor 1,0 ml em 2 placas de petriestéreis identificadas como diluição de 10-1.Resfriar o meio de cultura Sabouraud esterilizado à temperatura entre 44 a 48oC e verter sobre as

placas num volume aproximado de 12 a 15 ml. Homogenizar cuidadosamente a amostra e o meiode cultura por rotação em forma 8.Deixar as placas em repouso por 10 a 15 minutos e inverte-las após completa solidificação domeio de cultura. Incubar em estufa.Checar esterilidade do diluente e meio de cultura pipetando-se 2,0 ml do diluente em 2 placas de petri estéreis. Recobrir as placas com meio de TSA ou Sabouraud.Observação: Caso haja suspeita de alta contagem microbiana na amostra, realizar diluiçõesmaiores.



3. Condições de IncubaçãoPara contagem total de bactérias incubar as placas contendo as amostras e meio de cultura àtemperatura de 35-37oC, durante um período de 24 a 48 horas.Para contagem total de fungos (bolores e leveduras) incubar as placas contendo as amostras com

Sabouraud à temperatura de 22-25oC, durante um período de 120 horas ou 5 dias.

4. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOSContar o número de colônias formadas nas placas, multiplicar pela diluição realizada e calcular a média de colônias por ml de amostra. Reportar na ficha de análise a média da contagemtotal. Contar somente as placas que tiverem número de colônias entre 30 a 300 colônias. Caso acontagem dê menor que 30 reportar o valor encontrado.

Análise Microbiológica de Água

Referência Bibliográfica:U.S. Pharmacopoeia XXIIIFarmacopéia Brasileira 4a. EdiçãoStandard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 17ed., 1989.

1. AMOSTRAGEM1.1. Frasco de ColetaOs frascos de coleta para análise microbiológica da água devem ser de vidro ou NalgeneÒ ecapacidade mínima de 500 ml. Lavar cuidadosamente, sendo o último enxague feito com água

destilada. Esterilizar o frasco de vidro por calor seco a 170o

C por 60 minutos (ou 105o

C por nomínimo 4 horas), ou por calor úmido em autoclave a 121oC por 15 minutos o frasco de vidro ou NalgeneÒ.

1.2. Remoção do Cloro ativo:Para amostras cloradas adicionar quantidade suficiente de tiosulfato de sódio (Na2S2O3) paraobter uma concentração final de 100 mg/L na amostra, ou seja, adicionar 0,1 ml de tiossulfato desódio a 10% para cada 100 ml de amostra.

1.3. Procedimento de Coleta de Amostra:-Antes de iniciar o trabalho, limpar as superfícies externas da torneira com solução antisséptica

(álcool 70 % ou Hipoclorito de sódio 0,1%);-Abrir a torneira e deixar escorrer durante 2-3 minutos ou em torno de 500 ml de água;- Reduzir o fluxo de saida de água, abrir o frasco de coleta somente no momento em que for colher a amostra;-Coletar a amostra de água (em torno de 300 ml) em frasco de 500 ml e fechar imediatamente como lacre de alumínio ou tampa;-Anotar o ponto, data e horário de coleta, volume amostrado, nome do amostrador e levar aolaboratório para análise;



Observação: A amostra deve ser submetida à análise dentro de um período de 8 horas após acoleta. Caso não seja possível, armazenar a amostra em geladeira a 10oC. Não exceder o períodomáximo de 24 horas para a condução da análise.

2. PROCEDIMENTO GERAL DE ANÁLISE-Abrir uma ficha de análise preenchendo os dados da amostra a ser analisada (assegurar que aficha de análise seja preenchida em duplicata utilizando folha de carbono);-Limpar a bancada ou a capela de Fluxo laminar com solução antiséptica onde será executada oensaio;- Realizar a assepsia externa do frasco contendo a amostra e de todo material não estéril que seráutilizado para análise;-Executar as análises assépticamente, sob a proteção de chama (Bico de Bunsen) ou dentro dacapela de Fluxo laminar;

2.1. Técnicas analíticas:A. Método de Tubos Múltiplos ou Número Mais Provável (NMP)Consiste na inoculação de amostras em 3 séries de diluições em triplicata contendo meio decultura líquido estéril, onde o resultado é dado pela turvação ou formação de gás nos tubos devidoao crescimento microbiano.

A.1. Materiais Necessários:A.1.1. Vidraria

• Pipetas graduadas de 10,0 ml e 5,0 ml e 1,0 ml: selecionar a quantidade necessária para ovolume de análise, colocar algodão em todas as pipetas (na extremidade oposta ao bico da pipeta) e acondicionar em papel Kraft; Esterilizar em autoclave por 15 minutos a 121 oC.

• Preparar o caldo lauriltriptose segundo fabricante e distribuir o meio de cultura em tubosda seguinte forma:1a. série: 18 ml de caldo lauriltriptose em dobro da concentração normal indicado pelofabricante e dispor 5 ml em 3 tubos de 150 x 20 mm.2a. série: 40 ml de caldo lauriltriptose na concentração indicada pelo fabricante e dispor 9 mlem 3 tubos de 150 x 20 mm.3a. série: 40 ml de caldo lauriltriptose na concentração indicada pelo fabricante e dispor 9,9 mlem 3 tubos de 150 x 20 mm

- O volume restante de meio de cultura da 2a e 3a série deverão ser distribuidos em tubos de 150x 20 mm para realização do controle negativo (1 ml);- Em todos os tubos introduzir tubos invertidos de Durhan;

- Fechar com tampão de algodão e autoclavar por 15 minutos a 121oC.

Observação: Caso não tenha disponível todos os componentes do meio de cultura Lauriltriptose,substituir pelo Caldo Lactosado, preparado segundo descrição a seguir:

A.2. ProcedimentoA.2.1. Procedimento de Análise para Contagem de Bactérias Viáveis:



- Com pipeta estéril, dispor um volume de 10,0 ml de amostra em cada tubo da 1a série de tuboscontendo caldo de lauriltriptose, obtendo-se assim a diluição de 101;- Com pipeta de 5 ml, dispor 1,0 ml de amostra em cada tubo da 2a série, obtendo-se assim adiluição 100;- Com pipeta estéril de 1,0 ml , dispor um volume de 0,1 ml em cada tubo da 3a série, obtendo-se

assim a diluição de 10-1

;- Homogenizar todos o tubos e incubar em estufa ou banho-maria.

A.2.2 Procedimento de Análise para Contagem de Bolores e Leveduras:- Identificar em cada placa o nome da amostra, lote, data, meio de cultura e temperatura deincubação. Preparar as placas em duplicata para cada diluição utilizada;- Assépticamente, pipetar 2,0 ml de amostra e dispor 1,0 ml em 2 placas de petri estéreisidentificadas como diluição de 100;- Resfriar, o meio de cultura Sabouraud esterilizado, à temperatura entre 44 a 48oC e verter sobreas placas num volume aproximado de 12 a 15 ml;- Homogenizar cuidadosamente a amostra e o meio de cultura por rotação em forma 8, evitando aformação de bolhas;- Deixar as placas em repouso por 10 a 15 minutos e inverte-las após completa solidificação domeio de cultura;- Incubar em estufa;- Checar esterilidade do diluente e meio de cultura pipetando-se 2,0 ml do diluente em 2 placas de petri estéreis. Recobrir as placas com meio de TSA ou Sabouraud;Observação: Caso haja suspeita de alta contagem microbiana na amostra, realizar diluiçõesmaiores.

3. CONDIÇÕES DE INCUBAÇÃO

- Para contagem total de bactérias incubar as placas ou os tubos contendo as amostras e meio decultura à temperatura de 35-37oC, durante um período de 24 a 48 horas;- Para contagem total de fungos (bolores e leveduras) incubar as placas contendo as amostras comSabouraud à temperatura de 22-25oC, durante um período de 120 horas ou 5 dias;

4. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS4.1. Método de NMPDecorrido o período de incubação de 24h, verificar os tubos turvos ou com filamentos e anotar onúmero de tubos positivos na ficha de análise, comparar na tabela de NMP e calcular o númerototal de colônias, segundo a fórmula a seguir: NMP tabelado x diluição do tubo médio

100Se houver formação de gás ou turbidez nos tubos dentro de 24h, deve-se proceder imediatamenteà pesquisa para coliformes totais e fecais. Proceder o mesmo teste caso ocorra turbidez, formaçãode gás ou ácido após 48 h de incubação.

5. PESQUISA DE COLIFORMES TOTAIS E FECAIS



O grupo coliforme inclui todas as bactérias aeróbias, anaeróbias facultativas, gram-negativas,formas não esporuladas, com formato circular que fermentam lactose com produção de gás eformação de ácido após incubação por 48 h à 35oC.

Teste Presuntivo: O teste de tubos múltiplos utilizado em rotina pode ser considerado como teste

presuntivo.• Procedimento:- Pipetar 10,0 ml de amostra em 5 tubos contendo lauriltriptose e tubos invertidos de Durhan,incubar por 48 h a 35 ± 0,5oC;- Decorrido este período, caso haja produção de gás ou formação de ácido, considera-se reação presuntiva positiva para coliformes. Deve-se proceder ao teste confirmatório;

Teste Confirmatório:Usar tubos de fermentação contendo caldo de lactose-bile-verde brilhante para a faseconfirmatória.

• Procedimento- Introduzir os tubos invertidos de Durhan e quantidade de meio BGLBB suficiente para cobrí-los.Esterilizar em autoclave a 121oC por 15 minutos;- Submeter todos os tubos (tubos positivos) do teste presuntivo que mostraram formação de gásou ácido ao teste confirmatório;- Agitar levemente o tubo positivo para ressuspender os organismos. Com uma alça de Coli estéril,transferir uma alçada da cultura para o meio de fermentação contendo BGLBB;- Repetir este procedimento com todos os tubos positivos;- Incubar os tubos de fermentação BGLBB por 48 ± 3 h a 35 ± 0,5 oC;- A formação de gás em qualquer tubo de fermentação dentro de 48 horas consiste em resultado positivo para o teste confirmatório;

6. LIMITES MICROBIANOS:• Água Destilada: contagem bacteriana menor que 1,5 CFU/ml e ausência total

fungos.Ausência de Coliformes totais e fecais• Água Potável : contagem bacteriana menor que 2,2 CFU de coliformes / ml, e contagem

de fungos menor que 10 CFU/ml.Aprovado: As amostras que apresentarem contagem inferior aos limites acima serão aprovadase a ficha de análise orignal deve ser encaminhada ao Controle fisico-químico, a ficha carbonadadeve ser arquivadaReprovado: As amostras que apresentarem contagem superior aos limites acima devem ser realizada reanálise.

reanálise Caso a contagem de bactérias ou de fungos seja superior aos limites permitidos, realizar uma nova amostragem. Verificar todos os controles ambientais e os controles negativos.



Tabela de Contagem do Método de Tubos Múltiplos (NMP) 95% de confiação Número de Combinações observadas de tubos

apresentando turvaçãoem cada série.

Número de mg ( ou mL) de espécies por tubo

Número mais provável

de microrganismos

100 mg ou 100 mL 10 mg ou10 mL 1mg ou 1 mL por grama ou mL

0 0 0 <3

0 0 1 3

0 1 0 3

1 0 0 4

1 0 1 7

1 1 0 7

1 1 1 11

1 2 0 11

2 0 0 9

2 0 1 14

2 1 0 15

2 1 1 20

2 2 0 21

2 2 1 28

3 0 0 233 0 1 39

3 0 2 64

3 1 0 43

3 1 1 75

3 1 2 120

3 2 0 93

3 2 1 150

3 2 2 210

3 3 0 240

3 3 1 460

3 3 2 1.100

3 3 3 > 2.400

PRODUTO: SOLUÇÃO ORAL - GOTAS



1. AMOSTRAGEMRecolher durante a fase de envase 10 frascos dos produtos a serem analisados. Caso haja históricode contaminação, realizar amostragens nas etapas de início, meio e fim de envase, recolhendo 10frascos em cada etapa.

2. PROCEDIMENTO GERALAbrir uma ficha de análise, registrar o número de análise segundo a sequência de codificação e preencher os dados da amostra a ser analisada (assegurar que a ficha de análise seja preenchidaem duplicata utilizando folha de carbono).

3. PROCEDIMENTO DE ANÁLISESeguir técnica descrita no Procedimento Geral de Contagem Microbiana para amostras líquidas.

4. PESQUISA DE COLIFORMES TOTAIS E FECAISO grupo coliforme inclui todas as bactérias aeróbias, anaeróbias facultativas, gram-negativas,formas não esporuladas, com formato circular que fermentam lactose com produção de gás eformação de ácido após incubação por 48 h à 35oC.

Teste Presuntivo: O teste de tubos múltiplos utilizado em rotina pode ser considerado como teste presuntivo.

Procedimento:Pipetar 10,0 ml de amostra em 5 tubos contendo lauriltriptose e tubos invertidos de Durhan,incubar por 48 h a 35 ± 0,5oC.Decorrido este período, caso haja produção de gás ou formação de ácido, considera-se reação presuntiva positiva para coliformes. Deve-se proceder ao teste confirmatório.

Teste Confirmatório:Usar tubos de fermentação contendo caldo de lactose-bile-verde brilhante para a faseconfirmatória.

Composição do caldo lactose-bile-verde brilhante (BGLBB):• Peptona................................10,0 g• Lactose.................................10,0 g• Oxgall .................................20,0 g• Verde Brilhante ....................0,0133 g• Água destilada ......................1 L

pH final de 7,2 ± 0,2 após esterilização.

ProcedimentoIntroduzir os tubos invertidos de Durhan e quantidade de meio BGLBB suficiente para cobrí-los.Esterilizar em autoclave a 121oC por 15 minutos.Submeter todos os tubos (tubos positivos) do teste presuntivo que mostraram formação de gás ouácido ao teste confirmatório.



Agitar levemente o tubo positivo para ressuspender os organismos. Com uma alça de Coli estéril,transferir uma alçada da cultura para o meio de fermentação contendo BGLBB. Repetir este procedimento com todos os tubos positivos.Incubar os tubos de fermentação BGLBB por 48 ± 3 h a 35 ± 0,5 oC.A formação de gás em qualquer tubo de fermentação dentro de 48 horas consiste em resultado

positivo para o teste confirmatório.

5. LIMITES MICROBIANOS

• Solução oral : contagem bacteriana menor que 100 CFU/ml e 10 CFU/ml de fungos.Ausência de Coliformes totais e fecais.

Aprovado: As amostras que apresentarem contagem inferior aos limites acima serão aprovadase a ficha de análise orignal deve ser encaminhada ao Controle fisico-químico, a ficha carbonadadeve ser arquivadaReprovado: As amostras que apresentarem contagem superior aos limites acima devem ser realizada reanálise.reanálise Caso a contagem de bactérias ou de fungos seja superior aos limites permitidos, realizar uma nova amostragem com o dobro de frascos da amostragem inicial. Verificar todos os controlesambientais e os controles negativos.

CONTROLE DE PROCESSO ESTERILIZANTE

1. Filtração : Remoção e separação de partículas de uma solução ou gás que dependem danatureza dos materiais.

• Amostragem antes e depois dos processos (Teste de Caldo ou média fill) para verificar todo o percurso do líquido - máximo 0,1 %. Para 3000 unidades = 14 dias

• Ponto de Bolha = Quanto > pressão < porosidade P= k.4v.cós.jD

j=ângulo líquido/parede do capilar k= fator de correção v= tensão superficial2 litros de água destilada d = diâmetro N2= 3,5 kg/cm2 = 5 min

2. Autoclavação: Alteração da estrutura genética, inativação de enzima, coagulação de proteína.

• Controle de pressão• Indicadores Químicos: induz alteração de cor, entretanto não garante por quanto tempo semantém a exposição.

• Indicadores Biológicos: cepa B.stearothermophillus.

3. Esterilização Química• Gasosa por Óxido de Etileno (pode deixar resíduos), extremamente explosivo, é

misturado à um gás inerte (10-12 %) com gás freon ou dióxido de carbono.



• Indicadores Físicos { Temperatura 55oC ( t=0 ) Umidade Relativa = 60-70 %}• Indicadores Químicos: substâncias submetidas ao efeito alquilante muda de cor.• Indicador Biológico: B. subtilis

4. Radiação { g , cobalto, elétron acelerado): Absorve energia radiante, altera a molécula

do DNA. Dose de radiação 2,5 Mrad• Indicadores Químicos• Indicadores Biológicos : Bacillus pumilus

Esporos Condição Tempo

B. stearothermophilus Vapor saturado, 121o

.C 15 minutos

B. subtilis121

o.C

171o.C

60 minutos

1 minuto

B. pumilusg - via úmida

Via seca

0,2 Mrad

0,15 Mrad

C. sporogens

vapor saturado 112o

.C

vapor saturado 121o.C

3,5 minutos

0,7 minutos

B. subtilisETO 54

o.C

600 mg/L 50%U.R.3 minutos

Brevundimonas diminuta Filtração10

7cel/ cm

2area

filtrante

MONITORAMENTO AMBIENTAL

1. IntroduçãoDesenho de Instalação de Processos Assépticos - salas limpasProcessamento Asséptico (Manter fora da barreira primária - fonte de contaminação)

2. Monitoramento do Ar: microrganimos aeróbios ( bactérias e fungos)• Partículas viáveis:

1. Passivo (Ensaio qualitativo): periodicidade diária, quando há produçãoClasse 100 = número de partículas viáveis de 0,1 CFU/ft3.Tempo de exposição 30 minutos a 60 minutosincubação em estufa e leitura após 48 horas

2. Ativo (Ensaio quantitativo): Captação ativa de ar (mensalmente)A . Impacto com líquido “liquid Impingement” : captação do ar através de orifício limitado sobrea unidade de vácuo.Contagem = n º de CFU / volume de ar amostradoVolume do ar amostrado = tempo de amostragem / fluxo de ar através do orifícioContagem Microbiana = Microscopia, Ensaio de ATP ; Impedância; filtração em membrana



B. Impacto com o ágar: impacto de microrganismos sobre o ágar:• Slit to Agar (1ft3/min = 28L/min) impacto rotatório sobre a placa a uma velocidade

constante. Risco de ressecamento a períodos longos• Amostrador Centrífuga (Reuter Centrifugal Sampler): Impactação de ar diretamente em

meio de cultura por sistema de centrifugação. Sistema portátil a bateria.

Contagem Microbiana - Incubação em estufa durante 48 horas e contagem/ m2

ou volume de ar amostrado.

C. Impacto em Membrana Filtrante ( Sistema de rotâmetros)Contagem Microbiana - meio sólido- incubação em estufa durante 48 horas meio líquido -Microscopia, Ensaio de ATP, impedância

III. Monitoramento de Superfícies ( Após manutenção e limpeza )1. Placas de Contato (RODAC)2. Swabb : esfregar um quadrante de 2,54 cm aproximadamente de uma polegada, primeiro

lado a lado, acima e abaixo e novamente, lado a lado. Embeber em 1 ml de salina estéril.

IV. Monitoramento de PessoalA. Placas de Contato (RODAC): periodicidade mensal e quinzenal para o pessoal envolvidadiretamente na área asséptica.B. Swabb

TÉCNICAS RÁPIDAS DE DETERMINAÇÃO DE MICRORGANISMOS VIÁVEIS

1. Microscopia: Contagem direta com alaranjado de acridina (1:60 diluido de 300 mg/ml de

solução de alaranjado de acridina em tampão fosfato pH=8,2. Lente de aumento de 1000, microscópio de epifluorescência (melhor para superfícies).

2. Ensaio de ATP ou bioluminescência

imageATP + D-luciferina + O2 Oxiluciferina + AMP + CO2 + LUZ

Contagem de 1000 Células aproximadamente

3. ImpedânciaA resistência de uma corrente em um líquido contendo microrganismo viável é medida conformeas células respiram e se reproduzem, alterando a resistência pela formação de ácidos orgânicos.

Medição pela introdução de dois eletrodos.

4. Contagem Direta do Número de Colônias em Placas

Eficiência de Conservantes

Microrganismo : S. aureus



Preparo do Inóculo : Semear em estrias em tubo inclinado contendo Antibiotic Medium 1(AM1). Incubar por 48 horas em estufa a 350C. Recolher o crescimento com 3 ml de água peptonada 0,1% . Ressuspender para 10 ml em tubo e diluir até turbidez 0,5 da Escala deMacFarland (106 UFC). Adicionar para cada 20 ml de produto ou controle, um volume de 0,2 mlde inóculo.

Amostra:• Selecionar os frascos do produto na embalagem final.• Identificar cada frasco com o tempo a que será submetido o contato do microrganismo

com o conservante.• Tempos a serem pesquisados : 0 h de contato, 6 horas, 24 horas, 48 horas, 7 dias, 14 dias

e 28 dias.• Armazenar os frascos em estufa a 22 - 250 C• Realizar o mesmo procedimento com amostra sem conservante e com diluente como

controle positivo.• Realizar contagem pelo método “Pour Plate”, utilizando Caldo Letheen para neutralizar

o conservante, água peptonada 0,1% como diluente e Ágar Caseína e Soja para o plaqueamento.

• Incubar as placas em estufa a 350C durante 48 horas.

Teste de Eficácia de Conservantes

Critério USP XXII CTFA

Organismo Teste

C. albicans (# 10231)

A. niger (# 16404)

E. coli (# 8739) P. aeruginosa (# 9027)

S.aureus (# 6538)

C. albicans (# 10231)

A. niger (# 9642)

E. coli (# 8739)

P. aeruginosa (# 15442)

S.aureus (# 8538)

P. luteum # 9644

B.subtilis # 6633

Meio de Cultura Agar Caseína e Soja Agar Caseína e Soja

Crescimento de Inóculo

preparação e densidade

final de inóculo

Bactéria: 370

C, 18 a 24 h

C.albicans: 250

C, 48h

A. niger : 250

C, 1 semana 1x 10-8

Células em produtos sem conservantes:

32-370

C para bactéria e 25-300C para

fungos

Procedimento do Teste

Conduzir o teste, se possível, em 5

frascos originais. Por outro lado,

transferir 20 ml para cada 5 tubos

estéreis.

Cada frasco ou tubo inoculado com 105

-106

org/ ml. Incubar a 20-250

C

106org./ ml de produto (20 ml)

Usar neutralizantes: Tween 80, lecitina,Triton-X-100

Resultado requerido para

aprovação

Não aumentar em C.albicans ou A.

niger.

£ 0,1% da concentração bacteriana

inicial permanecendo por 14 dias e

Amostragem em 0, 1-2,7, 14, 28, > 28dias;

Efetividade em 7 dias e reinocular.



manter ou abaixar os níveis durante o

período do teste.

Condições de Teste para Método de Eficácia de Conservantes

Condição de Teste Britanica Alemã Americana Italiana

Tamanho do Inóculo (CFU/ml

ou g)10

610

5-10

610

5-10

610

5

Volume de Inóculo £ 1% £ 1% £ 1% £ 1%

Armazenamento do produto 20-250

C 250

C± 10C 20-25

0C 25

0C± 1

0C

Microrganismos Desafiados para Produtos Tópicos com Conservantes

Produto Microrganismo

Cremes e Loções P. aeruginosa, Klebsiella, S.faecalis, S.aureus, coliformes, Aspergillus, cladosporium,

Candida

Pasta de dente Streptococci, Pseudomonas, Herpes virus, enterovirus

Shampoos Pseudomonas, Klebsiella, coliformes, Proteus, Alcaligens, Acinetobacter,

Cladosporium

Cosméticos para os

olhos e pomadas

P. aeruginosa, P.stutzeri, P.putida, S.aureus, S. faecalis, Aspergillus, Penicilium,

cladosporium

Produtos vaginal

P.aeruginosa, Pseudomonas KO-1, E.coli, E.faecalis, Klebsiella, Proteus, Candida

albicans

Critérios para Interpretação do Resultado do Teste de Eficácia de Conservantes

Farmacopéia Alemã (1986) Farmacopéia Britânica (1988)

Tipo de

produtoOrganismo Hora Redução de contagem Organismo Hora

Redução

de

contagem

Parenterais

e

Oftálmicos

P.aeruginosa

S.aureus

24 h

7 d

28 d

102

103

103

P.aeruginosa

S.aureus6 h, 24 h, 7d;14 d; 28d

103

(6h)

ND

ND

C. albicans

A. niger

14 d

28 d

101

101

C. albicans

A. niger

7 d

14 d

28 d

102

NA

NA

Formulação

Tópico

P.aeruginosa

S.aureus

14 d

28 d

103

103

P.aeruginosa

S.aureus48 h; 7d; 14d; 28d

103

(48h)

ND



C. albicans

A. niger

14 d

28 d

101

101

C. albicans

A. niger

14 d;

28 d

102

NA

Solução

Oral

P.aeruginosa

S.aureus

14 d

28 d

103

103 P.aeruginosa

S.aureus7 d; 14 d; 28 d

102

NA

C. albicans

A. niger

14 d

28 d

10

10

C. albicans

A. niger 14 d; 28 d NA

Farmacopéia Americana (1990) Farmacopéia Italiana (1985)

Tipo de

produtoOrganismo Hora

Redução de

contagemOrganismo Hora

Redução de

contagem

Parenterais

e

Oftálmicos

P.aeruginosa

S.aureus

14 d

28 d

103

NA

P.aeruginosa

S.aureus6 h, 24 h, 7d; 10

2 ;10

3e 10

5

C. albicans

A. niger

14 d

28 d

NA

NA

C. albicans

A. niger

24 h

7 d

14 d

NA

102

NA

Formulação

Tópico

Nenhuma

recomendação

P.aeruginosa

S.aureus

48 h; 7d; 14d;

28d NA,10

2; 10

3 NA

C. albicans

A. niger

7 d;

28 d

102

NA

Solução

Oral

Nenhuma

recomendação

P.aeruginosa

S.aureus

E.coli

48 h; 7 d; 21d;

42d

102

; 103

NA,NA

C. albicans

A. niger 21 d; 42 d

101

NA

MÉTODO DE TURBIDIMETRIA - DOSEAMENTO DETETRACICLINA

Padrão de Tetraciclina = Teor declarado = 968 mg/mg

Tomada de ensaio = 103,3 mg = 968 x 103,3 = 100.000 mgAmostra de cápsula de Tetraciclina = 250 mg de princípio ativoPeso médio cápsula cheia = 365,7 mgPeso médio capsula vazia = 55,2 mgTomada de ensaio = 310,5 mg de pó (250 mg de p.a)

Diluição do Padrão Diluição da Amostra



103,3 mg (100 mg) / 100 ml = 1 mg / ml

1 ml (1000mg) / 100 ml = 10 mg/ ml

10 ml (10 mg) /100 ml = 1mg / ml

310,5 (250 mg) / 250 ml = 1mg / ml

1 ml (1000 mg) / 100 ml = 10 mg / ml

10 ml (10mg) / 100 ml = 1m / ml

P1= 1,0 ml (1mg) / 20 ml = 0,05 mg / ml

P2= 2,0 ml (1mg) / 20 ml = 0,10 mg / mlP3= 3,0 ml (1mg) / 20 ml = 0,15 mg / ml

P4= 4,0 ml (1mg) / 20 ml = 0,20 mg / ml

P5= 5,0 ml (1mg) / 20 ml = 0,25 mg / ml

A2= 2,0 ml (1mg) / 20 ml = 0,10

A3= 3,0 ml (1mg) / 20 ml =0,15

A4= 4,0 ml (1mg) / 20 ml = 0,20

Curva PadrãoConcentração (mg/ml) Leitura a 580 nm Média

P1 = 0,05 45,0 44,0 45,0 44,67

P2 = 0,10 52,0 52,5 53,0 52,50

P3 = 0,15 60,0 61,0 59,0 60,00

P4 = 0,20 70,0 71,5 70,5 70,33

P5 = 0,25 80,0 81,0 80,5 80,5

Amostra

Concentração (mg/ml) Leitura a 580 nm Média

A1 = 0,10 53,0 51,5 52,0 52,17

A2 = 0,15 62,0 61,0 60,5 61,17

A3 = 0,20 71,0 70,8 70,5 70,77

Relação Leitura vs Concentração

A1 = 0,09875= 0,9875 A2 = 0,1508 = 1,0053 A3= 0,2016 = 1,0080,1 0,15 0,20

Média L vs C ( Fc ) = (0,985 + 1,0053 + 1,008) = 1,0033

Potência da Amostra = Potência P x LvsC x PP x DA x 100 =DP x PAonde,

Potência P = Potência declarada do PadrãoL vs C (Fc) = Média FcPP = Peso do PadrãoPA = Peso da amostraDP = Diluição do PadrãoDA = Diluição da Amostra

Potência da Amostra



= 968 x 1,008 x 103,3 x 1 x 10 x 250 x 100 x 100 = 999,9 mg/ml100 x 100 x 100 x 250 x 1 x 10

FICHAS DE ANÁLISE E CONTROLES DE PROCESSOS

TESTE DE PIROGÊNIO

Produto: Lote:

N.º Análise: Data de análise:

N.º coelho Peso Volume 1.ª T.ºC 2.ª T.ºC 1 h 2 h 3 h D t

1

2

3

Observação:

Resultado:

Data de saída: Analista: Chefe:

Protocolo para Teste de Inocuidade

Produto:_______________________ Lote n0 _______________N.º Análise:_________

Volume de inóculo para cobaias:_ _mL/ Via:____________________

Volume de inóculo para camundongos: ml/ Via:____________________

Data de Início: ____/____/____ Data de término: ____/____/____

Lote N.º:_______Caixa N.º:__ Controle N.º :________ Caixa N.º _____

CONTROLE DE ÁREA ASSÉPTICA - PROCESSO PASSIVO

PRODUÇÃO

Pontos de Amostragem

Dia/Mês 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10



HISTÓRICO DAS ÁREAS ASSÉPTICAS - SLIT TO AGAR

PRODUÇÃO

Data: Área:

PLACA HORÁRIO N COLÔNIAS COLÔNIA / M3 GERMES IDENTIFICADOS

OBSERVAÇÕES Meio:

Incubação:

Temp. Ambiente:

Umidade Ambiente:

No. Pessoas:

Analista:

Data: / /

CONTROLE BIOLÓGICO - PROCESSO PASSIVO

BIOLÓGICO

Data: Período:

No. da Placa T.exposição No. Colônias Germes Identificados - Gram MEIO:

T°C Incubação

Tempo Incubação:

Umidade Relativa:

No.PessoasTotal de Colônias:

Resultados:

HISTÓRICO DAS ÁREAS ASSÉPTICAS - SLIT TO AGAR

BIOLÓGICO

Data Área



PLACA HORÁRIO N COLÔNIAS COLÔNIA / M3 GERMES IDENTIFICADOS

OBSERVAÇÕES Meio:

Incubação:

Temp. Ambiente:

Umidade Ambiente:

No. Pessoas:

Analista:

Data: / /

CONTROLE DE AUTOCLAVE

PRODUÇÃO x CONTROLE

Bioindicador: B. stearothermophillus Lote No

:

Tempo de Exposição: Temperatura de Exposição:

Tempo de incubação: Temperatura de incubação;

Data: Horário:

PONTOS AMOSTRADOS RESULTADOS

PRODUÇÃO CONTROLE x

Bioindicador: B. stearothermophillus Lote No

:Tempo de Exposição: Temperatura de Exposição:

Tempo de incubação: Temperatura de incubação;

Data: Horário:

PONTOS AMOSTRADOS RESULTADOS

• TREINAMENTO DE PESSOAL: NORMAS HIGIÊNICAS

• CONTROLE DE PESSOAL - TÉCNICA DE SWAB

CONTROLE DOS SUBSTRATOS NUTRITIVOS PARA O TESTE DE ESTERILIDADE

Substrato:

Controle Negativo Data Lote UFC Crescimento

Controle Positivo Data Germe Diluição UFC/ crescimento

AFERIÇÃO DE TEMPERATURA E UMIDADE RELATIVA



PRODUÇÃO

Aparelho: Termohigrômetro SUNDO

Modelo: 4463 HT - 100 mm diâmetro

Data Hora TO

C UR % Responsável

BIOLÓGICO

Aparelho: Termohigrômetro SUNDO

Modelo: 4463 HT - 100 mm diâmetro

Data Hora TO

C UR % Responsável

CONTROLE DO BANHO AZUL

Data da Preparação:

Data da Coleta:

Horário de Coleta:

Temperatura do Banho:

Data do Ensaio:

Analista:

RESULTADOS:

Bactérias:

Fungos:Patogênicos: P.aeruginosa: E. coli: Salmonella:

OBSERVAÇÃO:

Troca do Banho:

Quando apresentar microrganismo patogênico;

Quando apresentar contagem microbiana acima do especificado;

Após fabricação de hormônios

TESTE DE CALDO: EFICIÊNCIA DE FILTRAÇÃO

Inóculo: Pseudomonas diminuta Bioburden: 107

CFU

Caldo Nutriente: TSB Volume Total: 30 L

Temperatura de Incubação: 35.ºC Tempo de Incubação: 48 horas

Volume Envasado: 20 ml Número de frascos: 1500

Data: Analista:

Resultado: Nenhum frasco contaminado

TESTE DE CALDO: ENVASE ESTÉRIL

Caldo Nutriente: TSB Volume Total: 30 L

Temperatura de Incubação: 35.ºC Tempo de Incubação: 48 horas

Volume Envasado: 20 ml Número de frascos: 1500



Data: Analista:

Resultado: Nenhum frasco contaminado

TESTE DE ESTERILIDADE

Produto: Lote: N.º Análise: Data de análise:

Bactérias Bolores e Leveduras

Meio de cultura: Meio de Cultura:

Tempo de incubação: Tempo de incubação:

Temperatura de incubação: Temperatura de incubação:

1o. Teste: 1

o. Teste:

Coloração de Gram: Coloração de Gram:

2o

. Teste 2o

. Teste:

Coloração de Gram: Coloração de Gram:

Resultado: Resultado

TESTE BIOLÓGICO

Produto: Lote:

N.º Análise: Data de análise:

TESTE DE PIROGÊNIO RESULTADO

Água para injeção (“In vitro”) Negativo

Água para injeção ( ‘In vivo”) Negativo

Produto envasado ( “In vivo”) Negativo

TESTE DE INOCUIDADE RESULTADOProduto envasado ( camundongos ) Negativo

CONTROLE DOS FILTROS (FLUXO LAMINAR) :

Controle de partícula: DOP Tamanho poros: 0,3 mm

Velocidade de fluxo: 90 ft/min Temperatura de dispersão: 398,89 º C ou 750 F

Classe : 100 Temperatura da sala asséptica: 21,0 º C ou 70F

Data: Periodicidade: 3 meses

APOSTILA DE CONTROLE MICROBIOLÓGICO

UEM– DFF -KIMURA

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