i

MINISTÉRIO DA CIÊNCIA E TECNOLOGIA - MCT INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA

Programa de Pós-Graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais Programa de Genética, Conservação e Biologia Evolutiva/INPA – PPG-GCBEv

DISTRIBUIÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA DA PESCADA, Plagioscion

squamosissimus (HECKEL, 1840) NA CALHA DO RIO AMAZONAS

ELIZABETE SIMÃO GALLETTI

Manaus - Amazonas

Julho, 2009

  

ii

ELIZABETE SIMÃO GALLETTI

DISTRIBUIÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA DA PESCADA, Plagioscion

squamosissimus (HECKEL, 1840) NA CALHA DO RIO AMAZONAS

Orientador: AYLTON SATURNINO TEIXEIRA

Co-orientadora: IZENI PIRES FARIAS

Manaus - Amazonas Julho, 2009

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva/INPA como parte dos requisitos para obtenção do titulo de Mestre em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.

  

iii

FICHA CATALOGRÁFICA

Sinopse: Estudou-se a distribuição da variabilidade genética da pescada, Plagioscion squamosissimus em cinco localidades da calha principal do rio Amazonas. Níveis de diversidade genética e estruturação genético-populacional foram avaliados. Palavras-chave: Plagioscion squamosissimus, Genética de População, Região controle, Bacia Amazônica.

 G167               Galetti, Elizabete Simão                             Distribuição da variabilidade genética da pescada, Plagioscion                          squamosissimus (Heckel, 1840) na calha do Rio Amazonas /                          Elizabete Simão Galetti.‐‐‐ Manaus : [s.n.], 2009.                               xiv, 67f. :  il. color.                                                     Dissertação(mestrado)‐‐ INPA, Manaus, 2009                                Orientador :  Aylton Saturnino Teixeira                                Co‐orientador :  Izeni Pires Farias                                Área de concentração :  Genética, Conservação e Biologia Evolutiva                                                1.Plagioscion squamosissimus. 2. Genética de população. 3. Pescada ‐                            Bacias hidrográficas – Amazônia.  I. Título.                                                                                                                                                                                                              CDD 19. ed.  597.580415 

  

iv

À minha mãe Verônica

Ao meu irmão Vitor

Ao meu amor Ricardo

  

v

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente à Deus, que não permitiu que eu me desviasse do

caminho, me dando forças nas horas mais difíceis, após cada queda. Me

ajudando a compreender o porquê de cada acontecimento e de cada pessoa,

boas e ruins, colocada em meu caminho.

À minha mãe, para a qual o agradecimento não consigo expressar em palavras.

Tudo o que ela representou durante esta fase de minha vida... Como tem sido a

vida toda... Pelo AMOR INCONDICIONAL.

Ao meu maninho querido, que comprava as minhas dores a cada lágrima que

alguém arrancava dos meus olhos (como tem sido a vida toda) a fim de evitar

meu sofrimento nas horas difíceis. E por ser sempre meu fã número um, apesar

das minhas limitações.

À minha vó, por tantas orações.

Ao meu pai, por estar sempre na torcida para que o sucesso bata a minha porta

por meio das minhas conquistas.

À Doutora Izeni Pires Farias, por ter me recebido em seu laboratório com tanto

carinho logo no primeiro dia. E pelas contribuições como co-orientadora, não

permitindo que alguma monstruosidade pudesse passar aos meus olhos durante

minhas escritas.

Ao Doutor Aylton Saturnino Teixeira, pela gentileza com que sempre me tratou

durantes todos estes meses, mesmo em situações adversas ao bom humor. E

pelas contribuições como orientador, dispensando horas preciosas do seu tempo

investindo no meu “saber” e acreditando em mim.

  

vi

Aos mestres desta fase, pelas grandes influências na minha formação. Que

muito mais que aulas, foram exemplos de profissional que quero (e devo) e que

não quero ser.

Ao Ministério da Ciência e Tecnologia (MCT)/Instituto Nacional de Pesquisas da

Amazônia (INPA), e à Universidade Federal do Amazonas (UFAM) pela infra-

estrutura e apoio cedidos, para a realização desta dissertação.

Ao Curso de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva

(GCBEV/INPA), pela oportunidade do aprendizado profissional e pessoal.

À CAPES pela bolsa de estudo concedida, tornando possível a realização do

curso de Mestrado.

Ao CNPq/CT-Amazônia/N⁰ 554057/2006-9, sob coordenação da Dra. Izeni Pires

Farias, projeto de financiamento que tornou possível a realização deste estudo.

Aos colegas de turma, Arlison, Rodrigo, Leila, Suzana, Fabíola e Alessandra, que

de alguma forma contribuíram para a minha formação.

À Alessandra pelo carinho e por toda ajuda concedida na secretaria do GCBEv.

Aos amigos e companheiros profissionais do LEGAL (Laboratório de Evolução e

Genética Animal) que sempre me instruíram desde os processos técnicos mais

simples, e partilharam discussões complexas com paciência, dedicação e

interesse. Em especial, à Valéria, Concy e Natasha, que estiveram ao meu lado,

me orientando e partilhando as fases mais difíceis desse trabalho. A essas

pessoas mais que “legais”, o meu muito obrigada!!!

Aos companheiros e amigos de república, durante os anos que vivi aqui em

função desse mestrado, Cristina, Nathalia, Mírian, Daiane, Letícia, Mário e

Herbert, que colaboraram para que eu pudesse estudar em casa. Isso foi muito

importante!!!

  

vii

À Suzana e Letícia, por serem minhas irmãs.

E a todas as pessoas que torceram por mim, e que em nenhum momento

acreditaram no meu fracasso. Amigos daqui de Manaus, e de minha terrinha

Dourados, que ficaram na torcida sempre.

E ao meu amor, Ricardo que cuidou de mim durante minhas estafas e angústias,

foi meu enfermeiro, cozinheiro, companheiro, pessoa insubstituível na minha

vida, que nunca me deixou abater. Eu te amo muito!!!

  

viii

“Nunca se sabe até onde vai a influência de um mestre”

(autor desconhecido)

  

ix

RESUMO

A pescada Plagioscion squamosissimus, é um scianídeo de água doce restrito à América do Sul, com ampla distribuição no território brasileiro, originário da bacia amazônica e introduzido nas regiões nordeste e sudeste. Esta espécie apresenta importância para a economia pesqueira da região amazônica, por ser um pescado considerado nobre e de grande valor comercial. No entanto, não há ainda para a pescada, um projeto de manejo de seus estoques pesqueiros, que permita sua conservação. Os estudos genético-populacionais aplicados a espécies de peixes de importância comercial têm gerado importantes dados para uma delimitação mais adequada dos estoques pesqueiros. O conhecimento da distribuição da diversidade genética da pescada branca no canal principal do rio Amazonas pode ser uma importante contribuição para um manejo apropriado da espécie e consequentemente de sua conservação. Cinco localidades do rio Amazonas foram amostradas, com um total de 81 indivíduos coletados. O DNA genômico foi extraído de nadadeiras via CTAB 2%, e a região controle do DNA mitocondrial foi amplificada e sequenciada no sequenciador automático ABI 3130 XL. Os 727 pares de bases obtidos foram alinhados e editados no programa BioEdit v. 5.0.6 e evidenciaram a existência de 54 haplótipos. Resultados provenientes do programa Arlequin 3.1 tambem sugerem altos níveis de diversidade genética para a pescada, verificados pelo elevado índice da média de diversidade gênica (Ĥ=0.9778), e diversidade nucleotídica (π=0.016300). Tais resultados indicam ausência de sobrepesca nas populações de pescada, especialmente, no nível da região controle do DNA mitocondrial. Nos resultados de AMOVA, de toda variabilidade genética observada, 93,68% foi verificada dentro das localidades, e apenas 6,32% encontra-se entre as localidade amostradas. O valor de ΦST (0,06319), apesar de baixo, indica alguma diferenciação entre as localidades (P=0,00673). A ausência de diferenciação entre as localidades foi inferida pela falta de valores significantes das comparações par-a-par de ΦST após a correção de Bonferroni. Estes resultados mostraram que a única comparação significante foi entre Tabatinga – Soure as quais são as localidades dos extremos de distribuição da presente análise. Tais resultados evidenciam que a pescada provavelmente forma uma única população na calha do rio Amazonas em pelo menos uma faixa de aproximadamente 2300Km de distância. A diferenciação genética para essas localidades pode ser o resultado de isolamento por distância, entretanto, pelo teste de Mantel, não observou-se nenhuma correlação entre distância genética e distância geográfica. Uma expansão populacional foi observada entre os pontos extremos da distribuição amostral.

  

x

ABSTRACT

The South American silver croaker Plagioscion squamosissimus, is a sciaenid restricted to freshwaters of South America. It has a wide distribution within the Brazilian territory, originally found in the Amazonian basin and introduced in northeast and southeast of Brazil. This species is important for the fishing economy of the Amazonian area, being considered a noble fish species and being of great commercial value. However, there is still no fisheries management project that would allow its conservation. Applied genetic-population studies to species of fish of commercial importance have been generating data of extreme importance for a more appropriate delimitation of fishery stocks. Knowing the distribution of genetic diversity of populations of South American silver croaker in the main channel of the river Amazon, one can obtain data that contribute to the appropriate management of this species in this area, and, consequently, its conservation. Five localities of the Amazon River were sampled, with a total of 81 individuals collected. The genomic DNA was extracted from fins using 2% CTAB, and the control region of the mitochondrial DNA was amplified and sequenced on the ABI 3130 XL automatic sequencer. A total of 727 base pairs (bp) were aligned and edited in the program BioEdit v. 5.0.6. resulting in 54 haplotypes. Results generated in the program Arlequin v. 3.1 also showed the existence high levels of genetic diversity for this specie as seen in elevated value of average genic diversity (Ĥ=0.9778), and in the high values of the average nucleotide diversity (π=0.016300). These results suggest absence of overexploitation of the South American silver croaker populations, specially at the mitochondrial DNA control region. The results of AMOVA indicate that 93,68% of the total genetic variance was observed within sampling localities, and only 6,32% explains between-locality variance. The ΦST value of 0,06319 indicates low but significant (P=0,00673) differentiation among localities. The absence of differentiation between localities was inferred based on the lack of significant pair-wise ΦST values after Bonferroni correction. These results showed that the only significant comparison was between Tabatinga – Soure which are the two extreme-most localities in our analysis. These results imply that P. squamosissimus most likely forms a single population in the main channel of the Amazon River along a distance of at least 2300 km. Genetic differentiation of the two extreme localities may be the result of isolation-by-distance, however, we did not observe significant correlation between genetic and geographic distances. Population expansion was observed among the most distant points of the sample distribution.

  

xi

SUMÁRIO

I. INTRODUÇÃO 01

I. 1. Considerações gerais sobre a bacia amazônica e sua ictiofauna 01

I. 2. O gênero Plagioscion Gill 1861 02

I. 3. A espécie Plagioscion squamosissimus (Heckel, 1840) 05

I. 3. a. Aspectos biológicos 06

I. 3. b. Recursos alimentares 07

I. 3. c. Reprodução 08

I. 3. d. Recurso pesqueiro e importância comercial na região

amazônica

10

I. 4. O DNA mitocondrial e estudos moleculares em peixes 11

I. 5. Justificativa 17

II. OBJETIVOS 19

II. 1. Objetivo geral 19

II. 2. Objetivos específicos 19

III. HIPÓTESES TESTADAS 20

IV. MATERIAL E MÉTODOS 21

IV. 1. Coletas e material biológico 21

IV. 2. Procedimentos laboratoriais 22

IV. 2. a. Extração do DNA 22

IV. 2. b. Amplificação do fragmento de mtDNA (região D-loop) 23

IV. 2. c. Purificação do produto amplificado da PCR 24

IV. 2. d. Reação de sequenciamento 25

IV. 2. e. Precipitação do produto de reação de sequência 26

IV. 3. Análises genéticas computacionais 26

IV. 3. a. Alinhamento e edição das sequências 26

IV. 3. b. Análise dos haplótipos e polimorfismo de DNA 26

IV. 3. c. Teste de Neutralidade 27

IV. 3. d. Análise de Variância Molecular e Estimativa do Índice de

Fixação (ФST)

27

IV. 3. e. Teste de Mantel 28

V. RESULTADOS 29

  

xii

VI. DISCUSSÃO 34

VI. 1. Caracterização genética das populações de pescada 34

VI. 2. Estrutura populacional 37

VI. 3. Considerações finais 41

VII. BIBLIOGRAFIA 43

  

xiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Componentes da reação de PCR 23

Tabela 2 – Lista dos primers utilizados para amplificação 24

Tabela 3 – Componentes da reação de sequenciamento 25

Tabela 4 – Primer utilizado para reação de sequenciamento 25

Tabela 5 – Distribuição dos 54 haplótipos de P. squamosissimus em função

das localidades

29

Tabela 6 – Parâmetros genéticos para Plagioscion squamosissimus 31

Tabela 7 – Valores de ΦST das comparações par-a-par entre as localidades 32

Tabela 8 – Valores de Nm das comparações par-a-par entre as localidades 32

  

xiv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Distribuição de Plasgioscion spp. 04

Figura 2 – Distribuição de P. montei 05

Figura 3 – Distribuição de P. auratus 05

Figura 4 – Distribuição de P. ternetzi e P. magdalenae 05

Figura 5 – Distribuição de P. squamosissimus 05

Figura 6 – Plagioscion squamosissimus 07

Figura 7 – Mapa esquemático do genoma mitocondrial completo de Arapaima

gigas, no qual estão evidenciados os genes e a região controle (CR)

13

Figura 8 – Mapa dos pontos de coleta 21

Figura 9 – Gel de extração do DNA genômico 22

Figura 10 – Gel do produto de PCR da região controle do mtDNA (D-loop) 24

Figura 11 – Árvore Neighbour-Joining sem raiz apresentando o

relacionamento de 54 haplótipos de P. squamosissimus

33

  

1

I. INTRODUÇÃO

I.1. Considerações gerais sobre a bacia amazônica e sua ictiofauna

A bacia amazônica é formada por um contingente de rios, lagos e igarapés,

destacando-se o majestoso rio Amazonas, o maior rio tropical do mundo, tanto em

vazão como em área. Em termos de extensão, o rio Amazonas possui 6.518 km, só

sendo ultrapassado pelo rio Nilo com 6.671 km, e sua largura varia entre 1.8 km (em

Óbidos) até 20 km (Sioli, 1984; Santos & Ferreira, 1999), fora do estuário – podendo

aumentar consideravelmente durante as grandes cheias.

Uma importante característica desta bacia consiste em uma alta pluviosidade

que é distribuída desigualmente ao longo do ano nas diferentes sub-regiões,

fazendo com que existam épocas de secas (chamadas de verão) e chuvosas

(chamadas de inverno), sendo que os afluentes da margem direita (como os rios:

Madeira, Tapajós e Xingu) não seguem a mesma dinâmica de chuvas que os

afluentes da margem esquerda (como o rio Negro) (Santos & Ferreira, 1999).

A formação do sistema fluvial amazônico foi moldada por profundas

transformações que consistiram no surgimento da cadeia andina, na interação dos

escudos cristalinos das Guianas e do Brasil e no envolvimento de uma planície

sedimentar situada na região central. Dentre elas, a mais notável transformação

geológica ocorreu quando os Andes emergiram formando uma importante barreira

com o oceano Pacífico, fazendo com que a comunicação existente entre o sistema

de rios da região amazônica e o oceano Pacífico fosse interrompida e um novo

mecanismo de drenagem foi estabelecido passando do sentido leste-oeste para

oeste-leste, desembocando no Atlântico (Lundberg et al., 1998).

A história geológica da Amazônia resulta na formação do maior sistema de

rios do planeta, entrelaçado por um incontável número de grandes e pequenos rios,

que drenam 7.050.000 km2 de terra, caracterizados pela heterogeneidade de águas

claras pretas e brancas, e variação nos valores de pH (Sioli, 1984).

Esta heterogeneidade de ambientes mantém uma ictiofauna de água doce

com peixes bem adaptados ao ecossistema amazônico, espécies de variados

tamanhos, formas e estratégias de vida, constituindo-se em ambientes propícios ao

  

2

desenvolvimento de estoques pesqueiros abundantes, que são explorados desde os

tempos pré-coloniais (Soares et al., 2007).

Reis et al. (2003) apresentam uma lista de catalogação de quase 4.500

espécies de peixes de água doce neotropical. Eles ainda apontam para um grande

número de epécies (1.550) que ainda esperam decrição científica. No entanto, o

número de espécies da bacia amazônica ainda é incerto, sendo comum a descrição

de novas espécies, mesmo sendo algumas delas já exploradas pela pesca

comercial, com diversos grupos ainda carecendo de uma revisão mais atualizada

(Barthem & Fabré, 2003).

Lovejoy et al., (2006) consideram, nesta bacia, a possível influência de

incursões marinhas do Mioceno e conexões na evolução da fauna de peixes da

Amazônia, e a possibilidade dessas incursões terem iniciado a transição evolutiva de

ambientes marinhos para ambientes de água doce, como ocorreu para as espécies

continentais de scianídeos da América do Sul.

Os peixes da família Sciaenidae são primariamente marinhos, no entanto

algumas espécies fazem parte da ictiofauna de água doce neotropical. Nesta família

estão incluídos 78 gêneros e 287 espécies que habitam a costa, estuários e águas

doces de regiões tropicais e temperadas. Seis gêneros são restritos a água doce,

mas também podem ocorrer em estuários, onde Pachyurus La Cepède, Pachypops

Gill, Plagioscion Gill, e Petilipinnis Casatti, são peixes de água doce endêmicos da

América do Sul, e conhecidos no Brasil como pescadas. Com as várias revisões no

nível de espécie para estes scianídeos, 20 espécies são reconhecidas na América

do Sul (Casatti, 2003), sendo cinco delas do gênero Plagioscion (Casatti, 2005).

I. 2. O gênero Plagioscion Gill 1861

As espécies de água doce da família Sciaenidae, possuem, provavelmente,

duas linhagens de origem marinha, que seriam Plagioscion e

Pachyurus/Pachypops/Petilipinnis. Uma possível, e mais provável, porta de entrada

para ancestrais marinhos de peixes no alto Amazonas, teria sido o Caribe ou o

Pacífico (ou ambas), e ainda, para Plagioscion, até mesmo a boca do Paraná teria

servido de entrada na América do Sul no processo de transição para água doce.

Como estas hipóteses se baseiam em estudos de relacionamento dessas espécies

  

3

com espécies irmãs marinhas, a situação de Plagioscion ainda não é bem definida,

pois sua colocação nos relacionamentos filogenéticos ainda não é muito clara

(Lovejoy, 2006)

De acordo com Casatti (2003) o gênero Plagioscion compreende sete

espécies de peixes de água doce da região neotropical sulamericana, no entanto,

apenas cinco espécies são consideradas como válidas, pois Plagioscion heterolepis

(Bleeker) e P. microps Steindachner estão atualmente incluídas nos gêneros Johnius

(Sasaki, 1992) e Nebris, respectivamente. As cinco espécies consideradas válidas

(baseadas em características merísticas e morfométricas) são Plagioscion

squamosissimus (Heckel 1840), P. auratus (Castelnau 1855), P. magdalenae

(Steindachner 1878), P. ternetzi Boulenger 1895, e P. montei Soares & Casatti 2000.

Tais espécies não são geralmente fáceis de separar apenas por caracteres

merísticos ou coloração. De acordo com Casatti (2005), ainda existem oito nomes

sinônimos para estas mesmas espécies: Johnius crouvina Castelnau (sin. de P.

squamisissimus), Johnius amazonicus Castelnau (sin. de P. squamosissimus),

Corvina monacantha Cope (sin. de P. auratus), Pseudosciaena surinamensis

Bleeker (sin. de P. squamosissimus), P. auratus iquitensis Nakashima (sin. de P.

squamosissimus), P. squamosissimus iquitensis Nakashima (sin. de P.

squamosissimus), P. macdonaghi Daneri (sin. de P. ternetzi), e P. casattii Aguilera &

Aguilera (sin. de P. squamosissimus). Com isso, Casatti (2005) providenciou uma

chave de identificação para as espécies de Plagioscion baseada em dados

morfométricos, com o intuito de tentar resolver a situação da taxonomia pouco

definida do gênero, atualmente incluído na subfamília Cynoscioninae.

Além das espécies viventes citadas (todas de água doce), duas novas

espécies (fósseis) foram descritas por Aguilera & Aguilera (2003) baseadas em

mensurações que comparam o comprimento total do peixe com o tamanho do

otólito. Elas são P. marinus e P. urumacoensis, na costa norte da América do Sul e

no Peru e Bolívia (Setas, Figura – 1).

Os peixes do gênero Plagioscion estão originalmente distribuídos nas bacias

dos rios Magdalena, Amazonas, Orinoco, Essequibo, na parte baixa da bacia do rio

Paraná e rios das Guianas (Casatti, 2003). Membros do gênero também têm sido

introduzidos nas bacias do rio São Francisco e alto rio Paraná e em reservatórios

artificiais do nordeste do Brasil (Casatti, 2005) (Figura – 1).

  

4

Figura 1 – Distribuição de Plasgioscion spp (setas – espécies fósseis). De acordo com Aguilera & Aguilera, 2003.

As Figuras 2, 3, 4 e 5 mostram os mapas de distribuição das cinco espécies

de Plagioscion sp. (Casatti, 2005), onde é possível observar a ampla distribuição de

P. squamosissimus em relação às outras espécies congêneres, abrangendo bem

mais que a bacia amazônica, onde é natural. Essa espécie é amplamente distribuída

nas bacias do Orinoco, Amazonas e Parnaíba, introduzida em reservatórios do

nordeste do Brasil durante os anos de 1970, e na bacia do Paraná por volta de 1950,

desenvolvendo rapidamente hábito lêntico. Atualmente, está entre as espécies

dominantes do reservatório de Itaipú (Benedito-Cecilio & Agostinho, 2000).

  

5

Figura 2* – Distribuição de P. montei Figura 3* – Distribuição de P. auratus

Figura 4*- Distribuição de P. ternetzi Figura 5*- Distribuição de e P. magdalenae P. squamosissimus (*) De acordo com Casatti, 2005.

I.3. A espécie Plagioscion squamosissimus (Heckel 1840)

Plagioscion squamosissimus faz parte do Reino Animalia, Phylum Chordata,

Classe Actinopterygii, Ordem Perciformes e da Familia Scianidae. Foi descrito pela

primeira vez por Heckel (1840) com o nome de Sciaena squamosissima com

amostras do rio Negro e rio Branco, e recebeu a nomenclatura atual por Jordan &

  

6

Eigenmann (1889) em trabalho de revisão. Após a descrição por Heckel, a espécie

já foi estudada por vários autores, e mesmo depois de ter sido enquadrada no

gênero Plagioscion recebeu outros nomes para a espécie em diferentes trabalhos;

no entanto, P. squamosissimus até hoje permanece (Casatti, 2005).

No rio Amazonas, todas as espécies do gênero Plagioscion são denominadas

“pescadas”, embora possam receber nomes diferentes, conforme a espécie e/ou

região do Brasil (Annibal, 1983).

Os quatro nomes populares mais conhecidos são: pescada branca (nome

pelo qual é conhecida em quase toda sua distribuição); corvina (Bacia do Paraná e

nordeste brasileiro); pescada-do-Piauí (nordeste brasileiro); e South American silver

croaker (como é conhecida fora da América) (Parente & Batista, 2005; Pinheiro &

Frédou, 2004; Santos et al, 2003).

I.3.a. Aspectos biológicos

Em uma descrição da pescada (P. squamosissimus) feita por Wallace entre

1850 e 1852 em coleta realizada no rio Uaupés, a espécie apresenta colorido grafite

metálico, com alguns reflexos violeta no dorso, branco prateado no abdômen,

cabeça prateada e escura com reflexos metálicos no topo, nadadeiras brancas e

escuras. Uma mancha preta sobre e abaixo da base da nadadeira peitoral, escamas

delicadas quase cobrindo a caudal e a base da nadadeira dorsal, primeiro raio da

nadadeira anal um espinho – opérculo externo pontiagudo com uma margem larga

de pele. Cabeça e opérculo inteiramente cobertos por escamas. Maxila superior

ligeiramente prolongada, dentes em uma única fileira em cada maxila pontiagudos,

aciculares, distantes, com vários dentes diminutos entre eles, em cima e embaixo na

faringe, língua grande livre. Narinas, dois pares próximos aos olhos. Primeiro raio da

ventral um espinho livre adpresso. Linha lateral ondulada, elevada, desenhando um

contorno até a extremidade da cauda. Escamas ligeiramente elípticas, dispostas em

fileiras diagonais, horizontalmente, um tanto maiores embaixo do que acima da linha

lateral. Duas pedras opalinas são encontradas na cabeça destes peixes abaixo do

cérebro. Come peixes [predominantemente], produz um grunhido alto no fundo

d’água. (Ragazzo, 2002).

  

7

Há internamente, nos machos, uma musculatura timpânica que produz sons

semelhantes a roncos. Esse tecido compõe-se de duas camadas de musculatura

elástica que provocam a estridulação por contração e extensão muscular. Tendo

sido notado também que as placas faringeanas denteadas produzem sons de efeito

diferenciado ou composto ao dos músculos timpânicos, sendo esta uma função

sonora, tanto nos machos quanto nas fêmeas (Annibal, 1983).

O adulto da espécie pode chegar a mais de 25 cm de comprimento e 0,35 Kg.

Os comprimentos e pesos máximos observados são de 59 cm e 5,45 Kg para as

fêmeas, e 55,5 cm e 3,73 Kg para os machos. Na maior parte dos espécimes

analisados, as fêmeas alcançam tamanhos e pesos mais elevados que os dos

machos (Loubens, 2003), o que também foi observado por Annibal (1983) para as

pescadas da Amazônia Central.

Normalmente, as pescadas podem ser capturadas em áreas relativamente

profundas nos lagos de várzea, e há também maior atividade da espécie durante o

período noturno (Annibal, 1983).

Figura 6 – Plagioscion squamosissimus. (foto: Daniela Leroy)

I.3.b. Recursos alimentares

 

Esta espécie é um predador de topo, e o peixe é o principal componente de

sua dieta (Loubens, 2003). Em regiões onde é invasora, pode tornar-se ameaça

para a comunidade nativa, como para a espécie endêmica da Bacia do Paraná P.

  

8

ternetzi, onde pescadores locais têm notificado declínio na abundância desta

espécie e das espécies-presas (Torres, 2006).

Bennemann, et al. (2006), estudando a dinâmica trófica de P.

squamosissimus, observaram que a composição dos recursos alimentares

consumidos, puderam ser agrupados em seis categorias: peixes, camarão, Odonata,

Ephemeroptera, outros grupos de insetos e diversos (constituída de restos de

vegetais, detritos e organismos que foram raramente encontrados). Mesmo os

alimentos principais dessa espécie sendo peixes, com a redução na sua

disponibilidade ela se torna oportunista, substituindo-os por outro alimento que

esteja abundante, no caso deste estudo, o recurso que substituiu os itens da

categoria peixes foi o camarão, que aumentou em número, atingindo os maiores

valores em composição percentual, que pôde estar sendo mais consumido pela

corvina após a redução da abundância das espécies de peixes-presa.

I.3.c. Reprodução

 

A tendência de proporção entre os sexos da pescada do Lago do Rei – AM foi

verificada por Annibal (1983), que encontrou a proporção próxima de 1 para 1 entre

os sexos, com capturas relativas crescentes de fêmeas em torno dos meses de

novembro e junho.

Loubens (2003) estudando a população de P. squamosissimus de Trindade –

rio Mamoré – calculou que aproximadamente 50% da população de adultos

(maduros sexualmente) contribuem na reprodução. Esse autor identificou quatro

fases de maturação sexual para as fêmeas e três para os machos, e comprimento

médio total na primeira maturação de 24 cm para as fêmeas e 21 cm para os

machos, com tamanhos mínimos observados de 19cm para fêmeas e 18,2 cm para

os machos. No entanto, Santos et al. (2003), analisando os aspectos reprodutivos da

espécie em um açude do Ceará, verificou que a espécie não apresenta dimorfismo

sexual aparente, nem mesmo no período reprodutivo, apresenta cinco fases de

maturação para fêmeas e três para machos, com comprimento médio na primeira

maturação de 24,7 e 24,2 cm para fêmeas e machos, respectivamente. A época de

reprodução é caracterizada por picos de desova em fevereiro e junho, embora se

reproduza o ano todo.

  

9

A dificuldade de detectar dimorfismo sexual na espécie também foi verificada

por Viana et al. (2006) em estudo de comparação de métodos de análise de

variação morfométrica, no qual observaram que o método de morfometria

geométrica foi ligeiramente mais eficiente para verificar dimorfismo sexual, não

identificado no método tradicional.

A reprodução da pescada também foi alvo de estudos em ambientes que

sofreram modificações drásticas provocadas pelo homem. Agostinho (2000),

aplicando uma metodologia que lhe permitiu estimar o tamanho da primeira

maturação sexual em peixes, verificou que as fêmeas de P. squamisissimus do

reservatório de Itaipú apresentaram comprimento de 17,8 ±1,63 cm. No mesmo

reservatório, Carnelós & Benedito-Cecilio (2002), com amostras da espécie dos

anos 80, observaram que o tamanho da primeira maturação de machos foi de 16,2

cm e de fêmeas foi de 17,8 cm. Esse tamanho aumentou durante o período de

estudo, chegando a 22,5 cm para ambos os sexos quando toda a população

participou efetivamente do processo reprodutivo, mostrando estratégia reprodutiva

adaptativa que garante o sucesso da espécie. Com período de reprodução da

primavera ao outono, e picos na primavera e verão.

A análise dos estágios de maturidade efetivada sobre as fêmeas da espécie

por Annibal (1983), de espécimes do Lago do Rei no Amazonas, demonstraram um

período amplo de desova, que aliado à observação de diferentes graus de semi-

desova, induz a caracterizar a desova como parcelada. Ele também verificou que a

época de maior intensidade reprodutiva se deu no período de vazante-seca (entre

agosto e outubro), quando inicia fortemente o processo, que se estende até o

período de inicio da enchente (entre dezembro e fevereiro).

Larvas de P. squamosissimus dos rios Paranapanema, Paraná, Ivinhema e

Baía foram analisadas por Baumgartner et al. (2003), que verificaram maiores

densidades médias de dezembro/93 a fevereiro/94, relacionadas à elevada

temperatura e nível da água, com tamanhos (maiores freqüências) na classe de 4,0

mm de comprimento.

A emissão sonora tem evidentemente uma função importante na atividade

reprodutiva, havendo nítido aumento da incidência e abundância desta nos meses

próximos ao início da reprodução (agosto e setembro), apesar de ser verificado

  

10

durante todos os meses do ano, podendo estar relacionado também com agregação,

desagregação e movimentos dos cardumes (Annibal, 1983).

I.3.d. Recurso pesqueiro e importância comercial na região amazônica

 

Nos anos de 2001 e 2002, Pinheiro & Frédou (2004), numa análise dos

principais recursos pesqueiros desembarcados no Estado do Pará, de embarcações

que trabalham com a Piramutaba Brachyplatystoma vaillantii como peixe alvo,

observaram que o grupo dos scianídeos apresentou-se entre as oito famílias de

peixes mais diversificadas em espécies (cinco espécies), e que na Baía do Marajó,

uma importante área do estuário amazônico, apareceu entre as duas famílias mais

diversificadas (sete espécies). Em especial, P. squamosissimus apresentou uma

porcentagem de 0,68 (estuários) e 0,51 (água doce) da pesca total nesta região,

ficando entre as espécies dominantes da fauna acompanhante da piramutaba e da

dourada Brachyplatystoma rousseauxii.

A pescada é um peixe que pode ser capturado com rede ou anzol, e faz parte

das três principais espécies que comandam a atividade pesqueira do reservatório da

UHE-Tucuruí no rio Tocantins. Foi o principal pescado desembarcado em Marabá-

PA no período de 1992 a 1999, e o terceiro em Tucuruí, onde, juntamente com o

tucunaré, é mais valorizado no mercado, tendo rendido milhões para a economia

pesqueira neste período para a região. É uma das espécies consideradas mais

nobres, preferida pelos pescadores, seus familiares e população urbana do entorno

do reservatório (Camargo & Petrere-Jr., 2004).

Na Amazônia boliviana, a espécie não tem muito histórico de exploração por

causa das técnicas normalmente usadas na atividade pesqueira da região. No

entanto, nas últimas décadas ela tem se tornado alvo pelo método de pesca fácil,

ser um peixe sem espinhos (fácil de descarnar), e muito apreciado. A única

dificuldade técnica para se investir na produção é o acondicionamento, pois a carne

é frágil (Loubens, 2003).

Com relação ao comércio em Manaus, dados sobre o pescado da década de

90 foram analisados por Parente & Batista (2005) e mostraram que a pescada

(Plagioscion spp.), no ano de 1995, apresentou-se entre os peixes de maior valor

comercial (preço no varejo), depois do tambaquí (Colossoma macropomum) e do

  

11

pirarucu (Arapaima gigas), e igualado ao do tucunaré (Cichla spp.), considerado um

pescado nobre e preferido pela população de maior poder aquisitivo.

Genericamente, em diversas partes do mundo se tenta fazer a avaliação dos

estoques pesqueiros (unidades básicas de recursos pesqueiros), objetivando

orientar principalmente a administração e a legislação da pesca. As investigações

têm como objetivo determinar: qual, quanto, onde, como e quando utilizar de

maneira sustentável os recursos naturais existentes (Annibal, 1983).

Diante deste importante recurso pesqueiro da região amazônica, uma política

de manejo se faz necessária para a conservação dos estoques. E para isso, estudos

populacionais são indispensáveis na identificação de diferentes estoques

pesqueiros.

Um exemplo de estudo populacional para a espécie foi o de Worthmann

(1979), que utilizou o desenvolvimento do otólito da pescada (P. squamosissimus)

de diferentes lagos e rios da Amazônia Central (lago Janauacá, rio Jari, rio Negro e

rio Branco) para diferenciar unidades populacionais desta espécie. Foram

determinadas diferenças significativas entre os locais, concluindo-se que as

populações podem ser diferenciadas pela velocidade de crescimento individual.

Estudos baseados no conhecimento da biologia, dinâmica e estrutura das

populações, ajudam a estabelecer critérios para a exploração das unidades de

manejo de estoques pesqueiros, bem como vários estudos populacionais, que, nos

últimos anos, por meio da análise do mtDNA (e outros marcadores moleculares),

contribuem com dados indispensáveis para o devido manejo de diversas espécies.

I.4. O DNA mitocondrial e estudos moleculares em peixes

A molécula de DNA presente na mitocôndria dos animais é pequena, de

aproximadamente 16.500 ± 500 pb (os vertebrados são os que geralmente

apresentam os menores tamanhos), e constituída de uma dupla fita de DNA

complementar, disposta de maneira circular (Avise et al., 1984; Meyer, 1993; Ballard

& Whitlock, 2004) (Figura 7).

Existem múltiplas cópias de DNA dentro da mitocôndria. Dependendo do tipo

de célula, milhares de genomas mitocondriais são encontrados por célula (Meyer,

1993). Coletivamente, as mitocôndrias, podem ocupar até 25% do volume do

  

12

citoplasma, e seu genoma corresponder a aproximadamente 1/10.000 do menor

genoma nuclear animal (Ballard & Whitlock, 2004).

Dos 37 genes codificados pelo mtDNA, dois codificam para RNAs ribosomais,

22 codificam para RNAs transportadores e 13 codificam para subunidades da cadeia

de transporte de elétrons, onde carboidratos e gorduras são oxidados gerando gás

carbônico, água e ATP (Meyer, 1993; Ballard & Whitlock, 2004). Também há

subprodutos tóxicos da fosforilação oxidativa (superóxido, peróxido de hidrogênio e

hidroperóxidos ogânicos) que podem danificar o DNA, lipídeos e proteínas (Ballard &

Whitlock, 2004), além da ineficiência dos mecanismos de reparo da replicação

(Wilson, et al., 1985), contribuindo para que a taxa de mutação do mtDNA seja de

cinco a dez vezes maior que os genes codificantes do genoma nuclear (Ballard &

Whitlock, 2004; Brown et al., 1982), o que resulta em evolução muito mais rápida

que em cópias únicas de DNA nuclear (Brown et al., 1979) e alta variabilidade

(Meyer, 1993). Além de grandes variações intraespecíficas que são freqüentes

devido a duplicações em tandem que envolvem a região controle. Em peixes,

diferenças intraespecíficas podem ser tão grandes quanto diferentes entre as

espécies (Meyer, 1993).

O DNA mitocondrial (mtDNA) tem sido extensivamente usado nas últimas

três décadas como ferramenta para estudos de evolução e passado demográfico de

populações e espécies. Esta ferramenta mostrou-se inestimável para os campos

novos de ecologia molecular e filogeografia (Ballard & Whitlock, 2004).

A região controle um marcador mitocondrial muito utilizado, localizada entre

as regiões responsáveis pela codificação do RNAt da prolina e do RNAt da

fenilalanina (Lee et al., 1995). Apresenta variações no tamanho nas diferentes

espécies de peixes estudas, como por exemplo, no pirarucu Arapaima gigas, esta

região foi seqüenciada e se apresentou relativamente pequena, com 787 pb (Hrbek

& Farias, 2008), ou do tambaqui Colossoma macropomum para o qual, a mesma

região, chegou a apresentar 1176 pb (Santos et al., 2007).

Esta região controle do DNA mitocondrial consiste em uma região não

codificante do genoma. Por não ter função de expressão gênica, esta região tanto

em vertebrados quanto em invertebrados está sobre baixa influência de mecanismos

evolutivos e, por isso, apresenta um alto grau de variabilidade gênica em níveis

  

13

interespecíficos (Meyer, 1994). Por esse motivo, a variabilidade intraespecífica tem

sido freqüentemente acessada a partir de estudos com essa região.

Por apresentar acúmulo de substituições nucleotídicas a região controle

fornece algumas das melhores informações para estudar níveis de fluxo gênico entre

as populações, inclusive as de peixes (Brown et al., 1993).

Figura 7 – Mapa esquemático do genoma mitocondrial completo de Arapaima gigas, no qual estão evidenciados a região controle (azul) os genes que codificam para RNAs ribosomais (amarelo), para RNAs transportadores (cinza) e para subunidades da cadeia de transporte de elétrons (branco). Modificado de Hrbek e Farias (2008).

Em revisão das aplicações moleculares nos estudos de populações de peixes,

Ferguson et al (1995) mostraram que a utilização do mtDNA vem ocorrendo desde o

fim da década de 70, antes mesmo do uso do DNA nuclear (nDNA). Essas

informações de acesso direto à molécula de DNA só foram conseguidas pelo

desenvolvimento da técnica de amplificação do DNA usando a reação em cadeia da

polimerase (PCR). Essa técnica abriu um “leque” de possibilidades [utilizando-se

vários tipos de marcadores, como RAPD, RFLP, AFLP, minissatélites,

microssatélites, e sequencias de genes nucleares e mitocondriais], tornando

possível, por exemplo, examinar mudanças genéticas em populações de peixes de

até cem anos atrás, ou mais, usando material arquivado em coleções de laboratórios

de peixes e espécimes de museus. Desde então, significativas contribuições têm

  

14

sido feitas, especialmente no que tange o manejo adequado de várias espécies de

água doce.

Por suas características especiais, o mtDNA tem sido aplicado como um

marcador genético ideal à pesquisa de população e biologia evolutiva de peixes,

onde as pesquisas sobre este marcador progridem em sua estrutura e

características, sequenciamento do genoma completo, estrutura da região controle e

polimorfismos (Guo et al., 2004). Um exemplo desses trabalhos foi o apresentado

por Hrbek & Farias (2008) sobre o sequenciamento do genoma completo do

Pirarucu (Arapaima gigas), um importante recurso pesqueiro para a economia da

região amazônica, com sugestão até de uma possível heteroplasmia do mtDNA da

espécie. Geralmente, um único tipo de DNA mitocondrial é encontrado nos

organismos. No entanto, há relatos de heteroplasmia, a presença de mais de um tipo

de mtDNA no indivíduo, que tem sido encontrado na maioria dos principais grupos

de organismos, incluindo várias espécies de peixes (Meyer, 1993).

Vários trabalhos têm sido realizados no grupo dos peixes utilizando tal

marcador, com o objetivo de responder a várias questões.

Formiga-Aquino (2004) em estudo populacional da piramutaba

Brachyplatystoma vaillantii no sistema estuário Amazonas-Solimões com o uso da

análise da região controle (D-loop), de 100 indivíduos, identificou 92 haplótiplos,

dentre eles, 87 singletons, caracterizando uma única população que migra

sazonalmente na Amazônia, não havendo correlação entre a distância genética e a

distância geográfica.

Num estudo de genética de populações com o pirarucu Arapaima gigas por

Hrbek et al. (2005) utilizando seqüências de DNA mitocondrial de 120 indivíduos

com amostras de sete localidades da calha principal da bacia amazônica, foi

observada maior diversidade haplotípica nas áreas distantes dos grandes centros

urbanos da Amazônia. Também foi evidenciado baixo nível de diferenciação

populacional, suportando uma contínua conectividade entre as populações na calha

principal, formando uma grande população panmítica.

Uma espécie que apresentou ampla variabilidade na bacia do rio Negro (com

análise da região controle do mtDNA) foi Hypopygus lepturus, em trabalho de

Schmitt (2005). Estes peixes elétricos foram coletados em vários tributários entre

São Gabriel da Cachoeira e Barcelos, no Estado do Amazonas, tendo sido

  

15

observado que os haplótipos encontrados estão agrupados em clados, com tamanha

diferença entre eles (7% em média), cujos indivíduos podem estar formando um

complexo de espécies.

Um estudo genético populacional com a pescada-gó (Macrodon ancylodon),

um scianideo marinho, utilizando análises do mtDNA e morfométricas, foi feito na

costa do Atlântico sul, no qual as diferenças genéticas inferem a presença de duas

espécies diferentes (conceito filogenético) para os dois grupos separados por 23

mutações, além de fornecer informações de migração e estimativa de expansão

populacional para os grupos (Santos et al., 2006).

Ribeiro (2006) verificou populações geneticamente estruturadas, com análise

de genes mitocondriais, de espécies de arraias-de-água-doce do gênero

Potamotrygon da bacia amazônica, com baixo poder de dispersão e isolamento por

distância. A metodologia usada por esse autor, chamada “DNA barcoding”

(seqüências do gene COI), baseada nos níveis de diferenciação encontrados nas

seqüências dos haplótipos, também foi testada para a família Potamotrygonidae,

que foi válida para alguns casos, com exceções de algumas espécies, que

necessitam de outros padrões acessórios.

Batista & Alves-Gomes (2006), em estudo populacional da dourada

(Brachyplatystoma rousseauxii), também sugerem uma única população migradora

no eixo Estuário-Amazonas-Solimões, por meio de análise da região controle do

mtDNA de amostras de três localidades (Tabatinga, Manaus e Belém). Esses

autores verificaram que a espécie não é formada de populações geneticamente

diferentes ao longo da calha, mas exibe uma variabilidade genética mais alta na

região estuária (Belém) em comparação com a região mais próxima da cabeceira

(Tabatinga), o que é característico do padrão de migração da espécie, que passa a

maior parte da vida, crescendo e se alimentando ao longo da calha, e voltam aos

tributários para se reproduzir.

Santos et al. (2007) estimaram a variabilidade genética do tambaqui

(Colossoma macropomum) ao longo do rio Solimões-Amazonas, com a análise da

região controle do mtDNA, e não encontrou populações diferenciadas, mas elevado

fluxo gênico entre as amostras populacionais estudadas, observado no grande

número de valores infinito de Nm.

  

16

Schneider (2007) estudou a variabilidade genética (ATPase 8/6) do peixe

borboleta Carnegiella strigata, em várias localidades nas bacias de três rios de água

preta da Amazônia central (Negro, Uatumã e Urubú) e verificou diferença

significativa entre os pontos amostrados (populações estruturadas) com baixos

índices de fluxo gênico entre a maioria das localidades, e ainda, a evidência de duas

unidades evolutivas para a espécie, dada a elevada distância genética entre elas

(10,80 a 11,50%).

Haplótipos da região controle do mtDNA também foram usados por Farias &

Hrbek (2008) na análise populacional de peixes discos (Symphysodon spp.) para

determinar as diferenças entre os grupos de diferentes fenótipos destes peixes,

revelando alta variação genética (87,54%), que corroboraram com as variações nas

freqüências alélicas para o gene nuclear RAG1 (mais baixas, porém significativas).

O mtDNA também é utilizado em estudos de filogenia molecular, como no dos

Clupeiformes, no qual resolveu melhor clados intermediários dentro das cinco

famílias analisadas, que o marcador nuclear utilizado na mesma análise (Li & Ortí,

2007). Para os Gymnotiformes, que, juntamente com dados de eletrofisiologia, foram

mais informativos no nível de famílias, do que os dados morfológicos (Alves-Gomes

et al., 1995). E muito úteis para o grupo dos ciclídeos, ajudando não só a

compreender os processos evolutivos, mas contribuindo com a sistemática do grupo

(Farias et al., 1999; 2000; 2001; Willis et al., 2007).

Com relação a estudos moleculares com a espécie P. squamosissimus, pode-

se dizer que são, ainda, insuficientes para se traçar um perfil genético da mesma.

Torres (2006) analisou RFLPs para o gene citocromo b de mtDNA em Plagioscion,

testando a técnica como marcador de espécies invasoras, mas não encontrou

diferenciação molecular para o nível específico entre a suposta amostra de P.

ternetzi (rio Paraná – Foz do Iguaçu) e a de P. squamosissimus (rio Negro –

Manaus).

Um estudo populacional para P. squamosissimus na calha do rio Amazonas

utilizando polimorfismo de transferrina identificou subpopulações geneticamente

distintas para quatro localidades, mostrando a evidência de distinção populacional

para a espécie na região da Amazônia Central (Teixeira et al., 2002), bem como

estudos citogenéticos baseados no heteromorfismo da região do organizador

nucleolar (NOR), em amostras coletadas no rio Tefé, Lago Catalão e rio Pitinga

  

17

(Feldberg et al., 1999). Tal heteromorfismo está associado à caracterização de

estoques intraespecíficos ou populações em alguns grupos de peixes, que no caso,

foi o primeiro estudo a apresentar esta situação em Perciformes neotropicais.

I.5. Justificativa

A pesca [predatória] pode afetar a composição ou mesmo a variabilidade de

uma espécie, podendo atuar tanto sobre uma espécie alvo, como sobre as espécies

acompanhantes. Assim, para as espécies de valor comercial, e de outras removidas

como subproduto da captura, a pesca é um dos fatores principais de mortalidade de

animais adultos, muitas vezes comprometendo o recrutamento dos estoques

(Hilsdorf et al., 2006).

O potencial que uma espécie possui de se adaptar às constantes

modificações ambientais depende, em grande parte, do nível de diversidade

genética encontrada na mesma, de modo que a variabilidade genética dentro e entre

populações pode ser um componente decisivo para a sobrevivência de uma espécie

a médio e longo prazo (Frankham et al., 2002).

Com o crescimento e importância, cada vez mais evidente, dos estudos de

genética pesqueira, espera-se que seus dados alcancem os programas de manejo e

contribuam para a delimitação dos estoques pesqueiros de captura.

Conhecer a estruturação genética de um conjunto de indivíduos que se

distribuem naturalmente no meio ambiente é importante para sabermos se os

mesmos compõem uma única população ou mais de uma. Para isso, é necessário

saber se há populações geneticamente estruturadas ou não.

Populações geneticamente estruturadas compõem estoques segundo o

“conceito genético de estoques” de Ovenden (1990), que se trata de uma unidade

reprodutivamente isolada e geneticamente diferente de outros estoques.

Tal análise foi realizada no presente estudo em populações de P.

squamosissimus, na calha principal do rio Amazonas. Conhecida como pescada, é

uma espécie amplamente distribuída nos rios brasileiros, mas que se originou na

bacia amazônica (Casatti, 2003, 2005), a qual possui relevante importância na

economia pesqueira (Camargo e Petrere-Jr., 2004; Parente & Batista, 2005),

requerendo um melhor direcionamento das políticas de manejo aplicadas a esta

  

18

espécie. O que pode ser feito com a contribuição de estudos de análise genético-

populacional.

Já foi detectada a evidência de populações geneticamente distintas desses

animais na calha do rio Amazonas com análise do polimorfismo da transferrina

(Teixeira et al., 2002), e em diferentes rios da bacia amazônica com análises

morfométricas (Worthmann, 1979) e citogenéticas (Feldberg et al., 1999).

Este estudo propôs a utilização de um marcador molecular bastante variável,

o sequenciamento da região controle (D-loop) do DNA mitocondrial, bastante usado

para estudos da estruturação genética em populações naturais (Hrbek et al.,2005;

Batista & Alves-Gomes, 2006; Santos et al., 2007; etc.), como ferramenta para

avaliar como a variabilidade genética da pescada se distribui na calha principal do

rio Amazonas.

Os dados gerados neste estudo vêm a contribuir para uma melhor elucidação

a respeito da estruturação genético-populacional para esta espécie na calha deste

rio, e assim gerar subsídios para o desenvolvimento de projetos de conservação e

manejo, que associado a outros estudos (dinâmica e estrutura das populações,

história natural e outros) podem delimitar melhor os estoques sob captura.

Estes dados auxiliam na administração e legislação da pesca, pois levam à

geração de critérios de exploração (manejo) das unidades de estoques que visam

uma conservação a longo prazo dos recursos naturais pesqueiros.

  

19

II. OBJETIVOS

II.1 Objetivo geral

• Caracterizar geneticamente as populações da pescada branca Plagioscion

squamosissimus da calha principal do rio Amazonas pela estimativa dos

níveis de diversidade genética e fluxo gênico, visando gerar informações para

futuros planos de conservação e gerenciamento pesqueiro deste importante

recurso para a região amazônica

II.2 Objetivos específicos

1. Caracterizar a variabilidade genética inter e intrapopulacional

2. Detectar se a espécie apresenta estrutura genética populacional

3. Se houver diferenciação genética entre as populações, verificar se está

relacionada com a distribuição geográfica

  

20

III. HIPÓTESES TESTADAS

1. H0 – Plagioscion squamosissimus apresenta níveis de variabilidade genética

homogêneos ao longo da calha principal do rio Amazonas

2. H0 – As populações de P. squamosissimus não apresentam estruturação

genética nos pontos amostrados

3. H0 – Não existe relação entre a distância genética e a distância geográfica

nas populações estudadas

  

21

IV. MATERIAL E MÉTODOS

IV.1 Coletas e material biológico.

Foram utilizadas entre 12 e 22 amostras de tecido (nadadeira ou tecido

muscular) de espécimes coletadas durante a pesca artesanal (a maioria por

pescadores da região) de cada uma das cinco regiões distribuídas ao longo da calha

principal do rio Amazonas.

Uma amostra de tecido de cada peixe foi retirada e fixada em etanol 95% em

tubo de eppendof, e etiquetados conforme coletor, localidade e data de coleta.

Para representar a população da calha principal do Rio Amazonas, as seguintes

regiões foram escolhidas como pontos de coleta (mapa figura 8) com os respectivos

números de indivíduos sequenciados (entre parênteses): Tabatinga (14), Lago Tefé

(12), Lago Janauacá (entorno Manaus) (13), Soure – Rio Paracatú (Ilha de Marajó)

(22), e Macapá (20).

Figura 8 – Mapa dos pontos de coleta.

  

22

IV.2. Procedimentos laboratoriais

IV.2.a. Extração do DNA.

 Com uso de pinça e bisturi estéril, uma amostra de tecido foi extraída e após

retirado todo o excesso de álcool, colocada em tudo de eppendorf (2 ml) para a

extração do DNA. Para tal, foi utilizado tampão CTAB 2% (NaCl, EDTA 0,5 M, Tris

HCl 1 M, PVP polivinil) (Doyle & Doyle, 1987), com algumas modificações, e

proteinase K a 1%, levados a “banho-maria” a 60 ⁰C overnight, ou até que o material

estivesse completamente dissolvido, para o rompimento das células. RNAase foi

utilizada para impedir que moléculas de RNA interferissem nos processos de

amplificação e sequenciamento. Foram feitas lavagens com clorofórmio para a

remoção dos restos celulares e separação dos ácidos nucléicos. Para a precipitação

do DNA, foram utilizadas lavagens com isopropanol e álcool etílico a 70%. Com a

visualização do pellet, o DNA foi colocado para secar a temperatura ambiente e

ressuspendido com água deionizada autoclavada (miliq).

Para verificação do material extraído, 2 µl do corante Bromofenol misturado a 2

µl do DNA total foram aplicados em gel de agarose a 1% e levado a cuba de

eletroforese horizontal com tampão Tris-Borato-EDTA 1X onde a corrida do material

foi feita a 70 V iniciais, passados para 90 V. Posteriormente, o gel de agarose foi

corado com brometo de etídeo (EtBr, 0,5 µg/mL) e levado a um transluminador de

luz UV Image Master (Pharmacia Biotech) para visualização do DNA (Figura 9).

Figura 9 – Gel de extração do DNA genômico.

  

23

IV.2.b. Amplificação do fragmento de mtDNA (região D-loop)

A região controle do mtDNA (D-loop) foi amplificada por meio da Reação em

Cadeia da Polimerase (PCR) (Saiki et al., 1988), técnica que permite a obtenção de

um grande número de cópias de um fragmento de interesse a partir do DNA

genômico extraído do tecido.

Para que a reação acontecesse, foi utilizado, para cada amostra, os seguintes

reagentes (Tabela 1): 1,2 µl de tampão de reação 10 X (Tris-KCl 200 mM pH 8,5);

1,5 µl de MgCl2 (25 mM); 1,5 µl de dNTP (10 mM); 1,2 µl do primer 1 (PsDLF1 –

forward – não publicado/desenvolvido neste trabalho) (2 µM); 1,2 µl do primer 2

(12SR4 – reverse – Hrbek & Farias, 2008) (2 µM), 0,4 µl de DNA polimerase (Taq)

(2,5u/ µl), 1,0 µl de DNA e 7,0 µl de água miliq, totalizando um volume final de 15,0

µl.

Tabela 1 – Componentes da reação de PCR.

Reagentes Concentração Volumes (µl)

Tampão

MgCl

dNTP

Primer1

Primer2

DNA polimerase

DNA (amostra)

Água miliq

10X

25 mM

10 mM

2 µM

2 µM

2,5 u/µL

--

--

1,2

1,5

1,5

1,2

1,2

0,4

1,0

7,0

TOTAL 15,0

Cada conjunto de reação foi colocado em tubo de 0,2 µl e levado a um

termociclador Eppendorf onde se processou a reação de amplificação que se deu

conforme os passos descritos abaixo:

• Desnaturação inicial a 93°C por 1 minuto (uma única vez);

35 ciclos de:

• Desnaturação a 93 °C por 40 segundos;

• Anelamento a 50 °C por 40 segundos;

• Extensão a 72 °C por 1,5 minuto;

• Extensão final a 72 °C por 5 minutos (uma única vez).

  

24

Tabela 2 – Lista dos primers utilizados para amplificação.

Primers Sequência Referência

“D-loop”

PsDLF1 (forward ) 5’-CGGTCTTGTAAACCGGATGT-3’ Não publicado*

12Sr4 (reverse) 5'-TAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTT-3' Hrbek & Farias 2008

* Primer desenvolvido neste trabalho.

Do produto final da reação (PCR) foi retirado 2 µl, adicionado a 2 µl de azul de

Bromofenol, aplicado em gel de agarose 1%, e após corrida em cuba de

eletroforese, corado com Brometo de Etídeo (EtBr, 0,5 µg/mL) e levado ao

transluminador de luz UV para visualização e verificação do tamanho do fragmento

amplificado comparado ao marcador DNA lambda (1000pb) (Figura 10).

                                            Figura 10 – Gel do produto de PCR da região controle do mtDNA (D-loop).

IV.2.c. Purificação do produto amplificado da PCR

 

A purificação do DNA foi feita via EXO-SAP (exonuclease e fosfatase

alcalina), que em temperatura ideal de ação dessas enzimas (com o uso do

termociclador) eliminaram da reação amplificada resíduos de baixo peso molecular

tais como sais, primers e dNTPs. Para cada 10 µl do produto da PCR foi utilizado

0,27 µl de EXO (10 u/µl); 0,40 µl de SAP (1 u/µl) e 2,33 µl de água deionizada

autoclavada.

1200pb

  

25

IV.2.d. Reação de sequenciamento

 

A reação de sequenciamento foi feita em uma placa específica (para

eletroinjeção no sequenciador automático), para um volume final, por amostra, de 10

µl, contendo: DNA amplificado e purificado; primer interno (PsDLF2 – forward – não

publicado/desenvolvido neste trabalho); Big Dye – um mix contendo DNA

polimerase, dNTPs e dideoxinucleotídeos (que possuem a fluorescência a ser

captada no sequenciador automático); tampão do Big Dye; e água autoclavada

deionizada.

Tabela 3 – Componentes da reação de sequenciamento.

Reagentes Volumes (µl)

Tampão

Primer

Água miliq

Big Dye

Produto da PCR purificado

2,5

2,0

2,2

0,3

3,0

TOTAL 10,0

Em seguida, as amostras foram submetidas ao termociclador Eppendorf com

ciclos programados para desnaturação das fitas complementares; anelamento dos

primers e extensão da região a ser sequenciada:

35 ciclos de:

• Desnaturação a 96 °C por 10 segundos;

• Anelamento a 50 °C por 15 segundos;

• Extensão a 60 °C por 4 minutos.

Tabela 4 – Primer utilizado para reação de sequenciamento.

Primers Sequência Referência

“D-loop”

PsDLF2 (forward ) 5’-GTAAAGCGGATGTCGGAGGT -3’ Não publicado*

* Primer desenvolvido neste trabalho.

  

26

IV.2.e. Precipitação do produto de reação de sequência

 

Após a reação de seqüenciamento, as amostras de DNA resultantes serão

precipitadas. Para isso foi utilizado 2,5µl de EDTA (125 mM); 27,5 µl de etanol

(100%), e 30 µl de etanol (70%). Seguindo protocolo de centrifugação e

temperaturas adequadas.

A ressuspensão das amostras foi feita com 10 µl de Hi-Di Formaldeído.

Em seguida, a placa contendo o DNA foi submetida a eletroinjeção no

sequenciador automático ABI 3130XL (Applied Biosystems), de acordo com a

metodologia padrão do fabricante.

IV.3. Análises genéticas computacionais

 

IV.3.a. Alinhamento e edição das seqüências

 

As seqüências da região controle (D-loop) foram conferidas e editadas no

programa BioEdit Version 5.0.6. (Hall, 1999). O alinhamento das sequências foi feito

com o auxílio da ferramenta ClustalW (Thompson et al., 1996). Após a edição

manual das seqüências, aos sítios que apresentaram deleções ou inserções (indels)

foram acrescentados gaps com a finalidade de manter a homologia entre os sítios.

Todas as seqüências obtidas e utilizadas nas análises correspondem à região

controle (D-loop) parcial do DNA mitocondrial, com 727pb, obtidos no

sequenciamento com um único primer.

IV.3.b. Análise dos haplótipos e polimorfismo de DNA

O nível de variação genética intra-específico foi medido por meio do número

de haplótipos observados em cada localidade amostrada, dos índices de diversidade

gênica (Ĥ) – probabilidade de duas seqüências tomadas ao acaso em uma

população serem diferentes entre si – e diversidade nucleotídica (π) – média das

diferenças nucleotídicas em cada sítio entre duas seqüências tomadas da população

  

27

ao acaso – calculados pelo método de Nei (1987), e número de sítios segregantes

(polimórficos), definidos como número de sítios nucleotídicos que diferem entre as

sequências alinhadas.

Análises evolutivas moleculares e filogenéticas foram conduzidas com o uso do

Mega versão 4 (Tamura et al., 2007), no qual dados de sequência nucleotídica foram

importados para a construção de uma árvore de haplótipos usando o método de

“agrupamento de vizinhos” – Neighbour-Joining (NJ).

IV. 3. c. Teste de Neutralidade

Os testes D de Tajima (Tajima, 1989) e Fs de Fu (Fu, 1997), usando o

programa Arlequim 3.1 (Excoffier et al., 2005), foram aplicados neste estudo para

avaliar se as mutações encontradas na região controle do mtDNA da pescada são

neutras ou sofrem influência de seleção, ou seja, se esta região gênica está em

desequilíbrio de mutação-deriva genética. Por se tratar de uma região não

codificadora, que, portanto, não sofre pressão de seleção, a detecção de desvios

significantes do equilíbrio genético pressupõe uma recente expansão populacional

ou bottleneck. O teste D de Tajima é baseado na relação entre o número de sítios

segregantes e a média das diferenças par-a-par, enquanto o teste Fs de Fu é

baseado na probabilidade de observar um dado número de alelos em uma amostra

de determinado tamanho, condicionado ao número médio observado das diferenças

par-a-par. Numa comparação entre os testes, em geral, a estatística Fs de Fu é mais

sensível em detectar eventos demográficos que a estatística D de Tajima.

IV.3.d. Análise de Variância Molecular e Estimativa do Índice de Fixação (ФST)

 

Com o intuito de averiguar a existência de população diferenciada

(estruturação genética) foi utilizada a Análise de Variância Molecular (AMOVA)

implementada no programa Arlequim 3.1 (Excoffier et al., 2005), pela qual é possível

determinar a variabilidade genética inter e intrapopulacional, utilizando a freqüência

dos haplótipos encontrados nas diferentes regiões amostradas, buscando os níveis

de divergência evolutiva entre os haplótipos, e estimando os níveis de diferenciação

entre populações.

  

28

A estimativa do índice de fixação (ФST) foi obtida pela razão entre os

componentes variantes, para revelar a existência ou não de diferenciação entre as

populações de pescada. Foram obtidas comparações populacionais par-a-par para

estes valores.

O índice ФST, obtido na Análise de Variância Molecular (AMOVA), para

verificar a variância entre subpopulações, é análogo ao índice FST de Wright (1978) –

que verifica a existência de estruturação gênica nas populações naturais a partir da

variância das frequências gênicas entre localidades diferentes. A variância analisada

na obtenção do índice ФST, é obtida a partir do número de mutações entre os

haplótipos. Uma das vantagens dessa análise é que pode ser usada com um

número grande de tipos de marcadores moleculares (ao contrário do FST e do GST,

que se aplicam mais a dados de marcadores co-dominantes), no entanto, a

interpretação é semelhante (Solé-Cava, 2001)

Adicionalmente foi estimado o nível de fluxo gênico Nm (número de migrantes

por geração), inferidos a partir das comparações par-a-par dos valores obtidos de

ФST, sob o modelo de migração de ilhas para haplótipos ФST = 1/Nm+1, por meio da

AMOVA.

A AMOVA testa a significância dos índices e da diversidade genética por meio

de 1000 permutações não paramétricas dos haplótipos entre as populações.

A correção de Bonferroni (Rice, 1989) foi aplicada para análises que

envolveram múltiplas comparações.

IV.3.e. Teste de Mantel

O teste de Mantel, realizado no programa Arlequin 3.1 (Excoffier et al., 2005),

por se tratar de um método estatístico que testa a significância da relação entre duas

matrizes de similaridade, foi utilizado para estimar a significância da relação entre a

distância genética (valores de ΦST) e a distância geográfica (com base na distância

em quilômetros pelo leito do rio) ajustando o nível de confiança para testes de

permutações (1000 replicações).

  

29

V. RESULTADOS

Das amostras populacionais de Plagioscion squamosissimus (Tabatinga, Tefé,

Janauacá, Macapá e Soure), foram obtidas 81 sequências parciais da região

controle (D-loop) do DNA mitocondrial, compostas por um total de 727pb cada.

Foram verificadas as seguintes composições de bases nucleotídicas: Citosina

21.01%, Timina 31.18%, Adenina 32.77%, e Guanina 15.04%.

Entre os 727pb, 71 sítios foram polimórficos, e suas mutações corresponderam a

dois sítios com inserções e 69 com substituições, sendo elas 65 transições

(substituição de uma pirimidina por outra pirimidina, ou de uma purina por outra

purina) e cinco transversões (substituição de uma purina por uma pirimidina, e vice-

versa).

De todos os 81 indivíduos analisados, obtidos das cinco populações amostrais,

foram encontrados 54 haplótipos, sendo que, destes, 43 foram singletons (haplótipos

únicos). O H7 foi, não somente o haplótipo mais frequente (nove Indivíduos), mas

também o haplótipo com maior distribuição geográfica (três das cinco localidades)

(Tabela 5).

Tabela 5 – Distribuição dos 54 haplótipos de P. squamosissimus em função das localidades. Haplótipos Tabatinga Tefé Janauacá Macapá Soure Total

H1 3 1 - - - 4 H2 1 - - - - 1 H3 1 - - - - 1 H4 1 - - - - 1 H5 1 - - - - 1 H6 1 - - - - 1 H7 1 4 4 - - 9 H8 1 - - - - 1 H9 1 - - - - 1 H10 1 - - - - 1 H11 1 - - - - 1 H12 1 - - - - 1 H13 - 1 - - - 1 H14 - 2 2 - - 4 H15 - 1 - - - 1 H16 - 1 - - - 1 H17 - 1 - - - 1 H18 - 1 - - - 1 H19 - - 1 - - 1

  

30

H20 - - 1 - - 1 H21 - - 1 - - 1 H22 - - 1 - - 1 H23 - - 1 - - 1 H24 - - 1 - 1 2 H25 - - 1 - - 1 H26 - - - 1 - 1 H27 - - - 4 2 6 H28 - - - 3 - 3 H29 - - - 2 - 2 H30 - - - 1 1 2 H31 - - - 1 - 1 H32 - - - 1 - 1 H33 - - - 1 - 1 H34 - - - 1 - 1 H35 - - - 1 - 1 H36 - - - 2 - 2 H37 - - - 1 - 1 H38 - - - 1 - 1 H39 - - - - 2 2 H40 - - - - 1 1 H41 - - - - 1 1 H42 - - - - 1 1 H43 - - - - 1 1 H44 - - - - 1 1 H45 - - - - 2 2 H46 - - - - 1 1 H47 - - - - 1 1 H48 - - - - 1 1 H49 - - - - 1 1 H50 - - - - 1 1 H51 - - - - 1 1 H52 - - - - 1 1 H53 - - - - 1 1 H54 - - - - 1 1

Total 14 12 13 20 22 81

Os níveis de variação genética intra-específicos para a pescada foram

estimados com base nos parâmetros genéticos e na análise de polimorfismo de

DNA. Quando as populações foram agrupadas, a diversidade gênica (Ĥ) total

estimada foi de 0.9778, e a diversidade nucleotídica (π) 0.016300. Já, quando as

populações foram analisadas isoladamente, a diversidade gênica (Ĥ) variou de

  

31

0.8930 em Tefé a 0.9870 em Soure, e a diversidade nucleotídica (π) de 0.009657

em Tabatinga a 0.020609 em Soure, que podem ser vistos na Tabela 6.

Com relação aos testes de neutralidade, o teste D de Tajima e o Fs de Fu não

obtiveram os mesmos resultados (P<0,05). O teste D de Tajima não foi significativo

para nenhuma localidade, porém o teste Fs de Fu (mais sensível) foi significativo

para as localidades de Tabatinga e Soure. Quando as localidades foram agrupadas,

os resultados apresentaram a mesma situação, na qual Fs de Fu também foi

significativo (Tabela 6). Valores negativos e significantes para os testes de

neutralidade geralmente são observados em populações que sofreram rápida

expansão demográfica e são interpretados como crescimento populacional.

Tabela 6 – Parâmetros genéticos para Plagioscion squamosissimus.

População Número amostral

Número de haplótipos

Sítios polimórficos

Diversidade gênica

Diversidade nucleotídica

D de Tajima

Fs de Fu

Tabatinga

Tefé

Janauacá

Macapá

Soure

TOTAL

14

12

13

20

22

81

12

8

9

13

19

54

29

34

38

45

46

71

0.9670±0.0437

0.8939±0.0777

0.9103±0.0683

0.9421±0.0340

0.9870±0.0175

0.9778±0.0079

0.009657±0.005419

0.012046±0.006736

0.011762±0.006539

0.018092±0.009494

0.020609±0.010693

0.016300±0.008259

-0.94012

-0.92504

-1.28035

0.09917

0.67935

-0.61763

-3.98737*

0.39878

-0.25774

-0.00758

-4.50358*

-

24.34593*

(*) = P<0,05

Nos dados de AMOVA, de toda variabilidade genética observada, 93,68% foi

verificada dentro das localidades, e apenas 6,32% encontra-se entre as localidade

amostradas. O valor de ΦST (0.06319), apesar de baixo, indica alguma diferenciação

entre as populações (P=0,00673) em um nível de significância de 0,05.

As Tabelas 7 e 8 apresentam a diferenciação genética representada pelos

valores de comparações par-a-par de ΦST (FST de Wright) e Nm (número de

migrantes por geração), respectivamente, obtidos para as amostras populacionais

referentes às cinco localidades analisadas.

  

32

Tabela 7 – Valores de ΦST das comparações par-a-par entre as localidades. População Tabatinga Tefé Janauacá Macapá Soure Tabatinga

Tefé

Janauacá

Macapá

Soure

----

0.12077*

0.13895*

0.06018

0.16287**

----

-0.05223

0.01234

0.06461

----

0.01952

0.07562*

----

0.01465

----

(*) Significância dos valores de ΦST (P<0,05).

(**) Significância dos valores de ΦST (P<0,005) após correções de Bonferroni para múltiplas comparações.

Tabela 8 – Valores de Nm das comparações par-a-par entre as localidades. População Tabatinga Tefé Janauacá Macapá Soure Tabatinga

Tefé

Janauacá

Macapá

Soure

----

3.64011

3.09830

7.80807

2.57001

----

∞

40.01669

7.23886

----

25.11238

6.11204

----

33.61981

----

Dentre as dez comparações par-a-par para os testes de ΦST dos dados de

AMOVA, quatro delas apresentaram valores significativos antes da correção de

Bonferroni (P<0,05), (Tabela 7). No entanto, após as correções de Bonferroni

(P<0,005), somente uma das comparações (Soure e Tabatinga) apresentou valor

significativo para o ΦST (P=0,00455). Desta forma, considerando a diferenciação

genética encontrada entre as localidades dos extremos da distribuição, a hipótese

de isolamento por distância foi testada, mas não se constatou um valor significativo

para o coeficiente de correlação do teste de Mantel (r=0,534878, P>0,05), revelando

que não existe nenhuma correlação entre a divergência genética observada (ΦST)

entre Soure e Tabatinga e a distância geográfica (Km) para as populações de

pescada analisadas.

A análise que usou o método de Neighbor Joining apresentou uma topologia

evidenciando uma distribuição aleatória dos haplótipos de diferentes localidades

geográficas sem a formação de grupos de haplótipos específicos por localidade

(Figura 11) – considerada como uma das evidências de ausência de estrutura

genético-populacional.

  

33

Figura 11 – Árvore Neighbour-Joining sem raiz apresentando o relacionamento de 54 haplótipos de P.

squamosissimus. A origem geográfica dos haplótipos é definida na legenda de cores.

  

34

VI. DISCUSSÃO

Nos últimos anos, diferentes técnicas moleculares, usando DNA nuclear ou

mitocondrial (mtDNA), polimorfismo de proteína e isoenzimas, têm fornecido novas

informações a respeito da variabilidade genética de populações naturais de várias

espécies, permitindo o delineamento de unidades de manejo e avaliação de

unidades de conservação (Ferguson et al., 1995).

Os estudos das estruturas populacionais permeados por técnicas moleculares é

parte de extrema importância da genética da conservação e tem sido útil tanto no

estudo de populações exploradas comercialmente – que podem se apresentar

abundantes, mas com riscos populacionais devido à superexploração – quanto para

auxiliar estudos de espécies ameaçadas de extinção (Frankham et al., 2002).

Os peixes são um exemplo de animais selvagens consumidos por nossa espécie

em grande escala por meio da exploração direta de populações naturais, diferente

da exploração de plantas e animais domésticos. E é graças a esse fator que a

“genética pesqueira” tem ganhado espaço e força nos estudos genético-

populacionais (Solé-Cava, 2001).

VI.1. Caracterização genética das populações de pescada

Os polimorfismos genéticos são usados na investigação de relacionamentos

genéticos entre subpopulações em uma espécie. Estas análises de estudos

genéticos populacionais em animais frequentemente têm sido focadas no DNA da

mitocôndria. Este é informativo sobre ascendências, pois na maioria das espécies

animais, é quase sempre de herança materna e raramente sofre recombinação. E

tem sido usado como marcador para estudos de subestrutura ou recente história

populacional (Hartl & Clark, 2007).

Os resultados da análise da região controle (D-loop) de P. squamosissimus

evidenciaram altos níveis de diversidade genética, verificados no elevado índice da

média de diversidade gênica (Ĥ=0.9778), e nos altos valores da média de

diversidade nucleotídica (π=0.016300) para as populações analisadas. Altos níveis

de diversidade genética na região controle de peixes da Amazônia, já foram

  

35

detectados por outros autores. Um exemplo disso é o estudo da variabilidade

genética do Tambaqui (Colossoma macropomum) feito por Santos et al. (2007), que

revelaram índices de diversidade gênica elevados (Ĥ=0.999), e o mesmo se deu

para a diversidade nucleotídica (π=0.012).

Outro exemplo de peixe amazônico, cujos níveis de diversidade genética

também foram avaliados é a dourada Brachyplatystoma rousseauxii, para o qual

Batista & Alves-Gomes (2006), também utilizando a região controle do mtDNA,

detectaram índices de diversidade gênica que variaram de 0.886 a 1.000 e

diversidade nucleotídica variando de 0.0064 a 0.0095. Os autores observaram uma

maior diversidade genética na região do baixo rio Amazonas, com valores

decrescendo no sentido leste/oeste na calha deste rio, fato este associado

possivelmente ao retorno direcionado dos indivíduos aos seus tributários de origem

para se reproduzirem.

Estudos recentes sobre a caracterização genética de populações de peixes

migradores do rio Amazonas (e alguns tributários) foram realizados para Prochilodus

nigricans (Machado, 2009) e Semaprochilodus insignis (Passos, 2009) com a região

controle do mtDNA, para os quais os autores também evidenciam altos níveis de

diversidade gênica (Ĥ=0.9114) e (Ĥ=0.9606), respectivamente.

Não há publicado até o momento, dados de diversidade genética de P.

squamosisimus, ou mesmo para outras espécies do gênero Plagioscion, utilizando-

se marcadores moleculares de DNA (mitocondriais ou nucleares). No entanto,

alguns trabalhos vêm sendo realizados caracterizando geneticamente espécies

marinhas da família Scianidae (Lankford-Jr et al., 1999; Santos et al., 2003; Vinson

et al., 2004; Santos et al., 2006; Alves-Costa et al., 2008; Rodrigues et al., 2008).

Embora a maioria dos scianídeos façam parte de um ambiente muito diferente

do ambiente de P. squamosissimus, estão fortemente relacionados, ao comparar-se

esta espéice à maioria dos peixes de água doce neotropicais, que possuem uma

associação relativamente antiga com ambientes de água doce, como os

Characiformes e Siluriformes (Lovejoy et al., 2006).

Um exemplo de estudo genético-populacional com scianídeos foi o trabalho de

Santos et al (2006) que caracterizaram populações da pescada-gó Macrodon

ancylodon na costa leste da América do Sul, onde profundas divergências genéticas

sem diferenças morfológicas foram detectadas, resultando em dois grupos

  

36

significativamente diferentes. Estes indivíduos apresentaram uma alta diversidade

gênica (Ĥ=0.906), que dentro das populações variou de moderada (Ĥ=0.515) a alta

(Ĥ=0.909), no entanto, a diversidade nucleotídica (π) variou apenas de 0.0010 a

0.0030, refletindo desse modo uma alta similaridade de sequências dentro das

populações de ambos os grupos.

A diversidade genética de Cynoscion acoupa da costa norte do Brasil, um

scianídeo marinho muito explorado, foi caracterizada por diversidade gênica

variando de moderada a alta (Ĥ=0.892), e diversidade nucleotídica muito baixa

(π=0.00288). Níveis baixos em comparação a outras espécies também exploradas já

estudadas com a região controle (D-loop). Nenhum sítio variável foi observado com

três ou mais variantes, indicando que a maior variabilidade do D-loop em C. acoupa

é relativamente recente (Rodrigues et al., 2008).

Todas estas espécies citadas são exploradas e de significativa importância

comercial. No entanto, quando altos níveis de diversidade genética são encontrados,

como no caso da pescada, fica evidente a ausência de um afunilamento

populacional que possa ser verificado no nível de diversidade genética. Este fato

pode estar relacionado ao tamanho efetivo dessas populações, pois quanto maior o

tamanho efetivo populacional, menor será o efeito da deriva genética sobre estas.

Porém, isso não elimina o efeito da pesca predatória (dado o fato de que ainda não

existe, para a pescada, um plano de manejo para as populações naturais), significa

apenas, que este efeito ainda não atingiu a diversidade genética da espécie nestas

localidades.

O teste D de Tajima não revelou valor significativo para nenhuma das

localidades aqui analisadas, e o teste Fs de Fu não foi significativo para a maioria

delas, exceto para Tabatinga e Soure (Tabela 6), que compõem as localidades dos

extremos da distribuição analisadas no presente trabalho. Estas análises

estatísticas, que testam a hipótese de mutação neutra, indicam que as amostras

populacionais de pescada se encontram em equilíbrio genético (mutação-deriva) no

que diz respeito ao mtDNA, ou seja, aparentemente não estão sob o efeito de

pressão seletiva. Para as localidades onde o teste Fs de Fu apresentou valores

significativos, são descartados os efeitos de seleção, uma vez que a região controle

do mtDNA (D-loop) não se trata de uma região gênica codificadora de proteína, e,

portanto, não sofre efeito de pressão seletiva. Esta diferença entre os resultados dos

  

37

dois testes é observada pelo fato do Fs de Fu ser um teste mais sensível, e

representa para estas localidades, que estão no extremo da distribuição amostrada,

uma expansão no seu tamanho populacional pela qual estas populações passaram

ou estão passando.

VI.2. Estrutura populacional Grande parte das populações é agrupada dentro de pequenas subpopulações

nas quais formam unidades locais intercruzantes. Tal agrupamento é chamado de

estrutura populacional ou subdivisão populacional, e é quase universal entre os

organismos. Quando existe subdivisão populacional, existe, quase inevitavelmente,

alguma diferenciação genética entre as subpopulações (Hartl & Clark, 2007).

Ao se analisar a variação genética de Plagioscion squamosissimus no presente

estudo, os resultados da análise de variância molecular (AMOVA) mostraram que a

maior porcentagem de variação genética ocorreu dentro das populações (93,68%).

Os 6,32% de variação encontrada entre as localidades (ΦST=0.06319, P<0,05) é

refletida nos valores de ΦST encontrados para as comparações par-a-par (Tabela 7),

que segundo a AMOVA apresentou diferenciação significativa para quatro, das dez

comparações antes da correção de Bonferroni (P<0,05). No entanto, ao se aplicar as

correções de Bonferroni, apenas uma diferenciação significativa (P<0,005) foi

detectada entre Tabatinga e Soure (os extremos da distribuição amostral) com valor

ΦST=0.16287, que Segundo Wright (1978) é indicativo de moderada diferenciação.

Para este estudo, a hipótese de isolamento por distância não foi confirmada

dada a falta de correlação entre as distâncias genéticas (valores de ΦST) e

geográficas (distância em Km seguindo o percurso do rio) evidenciada pelo teste de

Mantel (r=0,534878, P>0,05). Ainda assim é possível que este isolamento esteja

ocorrendo, pois o valor significativo de ΦST ocorre entre as localidades mais

distantes. Uma amostragem mais completa da calha do rio Amazonas, incluindo

também seus tributários, associado a um marcador molecular mais sensível

(microssatélites) poderiam elucidar melhor esta situação encontrada.

Divergências entre dados de marcadores foram observadas em estudo genético-

populacional do pirarucu. Hrbek et al. (2005) usando genes mitocondriais ND1 e

ATP6 e 8 para estudar a estrutura genética populacional do pirarucu Arapaima gigas

  

38

(Schinz, 1822) na bacia Amazônica não observaram estrutura populacional e

concluíram que o pirarucu provavelmente forma uma grande população panmítica.

No entanto, Hrbek et al. (2007), combinando dados de genes mitocondriais com

dados de marcadores microssatélites, também detectaram, para o pirarucu, um

intenso fluxo gênico entre as localidades, porém verificaram o efeito de isolamento

por distância, que só pôde ser observado nos dados de microssatélites, com fluxos

gênicos significantemente restritos a distâncias maiores que 2.500 Km.

Apesar da pouca diferenciação apresentada para a pescada entre os extremos

de distribuição, todos os valores de Nm observados nas comparações par-a-par

entre as localidades são maiores que 1.0, evidenciando conexões entre todas as

localidades amostradas. Esses valores de Nm, que variaram de 2.57001 (entre

Tabatinga e Soure) a infinito (entre Tefé e Janauacá), evidenciam um alto índice de

fluxo gênico entre as pescadas das 5 localidades amostradas representando a

população da calha principal do rio Amazonas.

Altos índices de fluxo gênico estão sempre associados a uma ausência de

estruturação populacional. Essa situação é comum de ser observada em peixes

migradores, e tem sido relatada para outras espécies estudadas no rio Amazonas.

Como no caso do estudo genético populacional do tambaqui Colossoma

macropomum (Cuvier, 1816) com a análise da região controle do mtDNA, para o

qual Santos et al. (2007) identificaram uma única população panmítica ocorrendo na

calha principal do rio Amazonas verificada pelos altos índices de fluxo gênico

representado por valores altíssimos para o número de migrantes por geração

(Nm=infinito) para a grande maioria das comparações.

A ausência de estruturação populacional para peixes da bacia amazônica

também foi verificada no estudo de variabilidade genética da dourada

Brachyplatystoma rousseauxii (Castelnau, 1855) e da piramutaba Brachyplatystoma

vaillantii (Valenciennes, 1840), dois grandes bagres migradores da bacia Amazônica.

Batista et al. (2005), utilizando a região controle (D-loop), para caracterizar a

variabilidade genética inter e intraespecífica desses peixes, encontraram altos níveis

de polimorfismo genético em todas as localidades amostradas ao longo do canal

principal do rio Amazonas. E apesar das diferenças de diversidade genética

observada nas duas espécies, os altos níveis de fluxo gênico entre as localidades,

  

39

apresentados por ambas as espécies, sugerem a existência de uma grande

população panmítica.

Ao se comparar os dados apresentados neste estudo, a respeito da estruturação

genética populacional da pescada, aos de outras espécies de scianídeos, nos

deparamos com alguns diferenciais, pois os trabalhos publicados nesta área têm

abrangido apenas espécies marinhas para este grupo. A estruturação genética

encontrada em organismos marinhos é mediada por processos diferentes dos que

ocorrem em ambientes de água doce. No mar, há uma ausência de barreiras

geográficas que isolem as populações, e para peixes com capacidade de migrar

livremente, outros fatores (que ainda não são muito bem explicados) atuam no

processo de diversificação. Como pôde ser observado nas populações de pescada-

gó Macrodon ancylodon na costa do Atlântico da América do Sul, por Santos et al.

(2006), que verificaram uma separação da espécie em dois grupos (denominados

pelos autores de “Tropical” e “Subtropical”) suportada pela AMOVA, com 93.09% de

toda a variação sendo dividida entre os dois grupos (sugerindo que M. ancylodon

tenha sofrido um processo de especiação), e ainda, foram detectadas estruturações

genéticas dentro de cada um dos grupos. Os autores associaram as diferenciações

genéticas, que ocorreram nesta espécie, a uma adaptação a regimes térmicos locais

e à ação das correntes marítimas como barreira ao fluxo gênico.

Em espécies de peixes de água doce, os fatores que atuam como barreira ao

fluxo gênico influenciando processos de estruturação e/ou diversificação são

variados e têm sido relatados em resultados de alguns estudos genéticos, como o

descrito por Farias & Hrbek (2008) que caracterizaram geneticamente espécies do

gênero dos acarás-dicos (Symphysodon spp.) da bacia Amazônica, para os quais,

fragmentação passada, isolamento por distância (limite na dispersão), preferências

pelas diferenças químicas da água são citados como processos que ajudam a

explicar a diferenciação representada nos clados.

A estruturação genética encontrada por Sanches & Galetti-Jr (2007) em

populações de Piraputanga Brycon hilarii, um caraciforme que ocorre na Bacia do

Paraguai, teve um fator comportamental associado a esse processo de

diferenciação na sub-bacia do rio Miranda. Os autores relatam que a estruturação

populacional foi mais evidente entre os peixes coletados no período não-reprodutivo,

que representa a época de menor deslocamento desses peixes, mostrando que eles

  

40

se organizam em unidades reprodutivas geneticamente diferenciadas, e apesar de

serem peixes migradores, fogem à regra de formar grandes populações panmíticas

em um dado sistema hidrográfico.

Estruturação genética populacional em P. squamosissimus foi descrita por

Teixeira et al. (2002) por meio da análise do polimorfismo da proteína transferrina

para quatro localidades da calha principal do rio Amazonas. Três sub-populações

geneticamente distintas foram identificadas (Careiro/Iranduba, Coari e Tefé) com

altas frequências de determinados alelos (Tf2, Tf4 e Tf3, respectivamente). Os

autores associaram essas diferenciações a um possível isolamento entre elas no

passado. Apesar de ter sido descrito baixo coeficiente de seleção para a transferrina

(Monostory et al., 1984), alguma pressão seletiva exercida pelo ambiente, que,

esteja interferindo na expressão da proteína transferrina, poderia funcionar como

uma hipótese para explicar a incongruência dos dados de Teixeira et al. (2002) em

comparação aos resultados do presente estudo – no qual nenhuma estruturação (ou

muito pouca, considerando-se os dois extremos de distribuição) foi verificada ao

nível de um marcador bastante variável e que está totalmente (ou quase) isento da

pressão de seleção do ambiente.

Há também outros relatos de estudos morfométricos (Worthmann, 1979) e

citogenéticos (Feldberg et al., 1999) que sugerem diferenciação populacional para P.

squamosissimus em rios da Amazônia central. Entretanto, nenhum desses

resultados corroboram os resultados observados no presente trabalho, o de

ausência de diferenciação genética entre as localidades com mais de 2.300Km de

distância como entre Soure e Tefé.

A ausência de populações geneticamente estruturadas na calha principal do rio

Amazonas tem sido verificada para um número crescente de espécies de peixes –

dourada Brachyplatystoma rousseauxii e piramutaba Brachyplatystoma vaillantii

(Batista et al., 2005); pirarucu Arapaima gigas (Hrbek et al., 2005; Hrbek et al.,

2007); tambaqui Colossoma macropomum (Santos et al., 2007); e recentemente

curimatã Prochilodus nigricans (Machado, 2009) e jaraqui Semaprochilodus insignis

(Passos, 2009). Grande parte desses autores relacionam essa ausência de

estruturação genética ao sistema de várzea na Amazônia, que em épocas de cheia

produzem conexões que facilitam o fluxo gênico entre os peixes de diferentes

localidades. Mas não se descarta a necessidade de mais estudos com uma

  

41

amostragem mais completa (tanto em localidades amostradas, quanto em número

de amostras de cada localidade) e utilização de outros marcadores, podendo assim,

elucidar melhor esta questão para a pescada.

VI.3. Considerações finais.

Espécies de peixes, frequentemente, são divididas em populações mais ou

menos isoladas reprodutivamente, ou seja, estoques, na terminologia de manejo de

peixes. Estoques individuais frequentemente diferem consideravelmente em suas

características biológicas, e, respondendo independentemente à exploração,

requerem manejos independentes (Ferguson et al., 1995).

A biologia pesqueira considera as unidades de estoques como uma unidade de

manejo, e as descrições genéticas produzem dados para comparar e medir a

divergência genética de diferentes estoques e ajudar a determinar a variedade de

estoques conhecidos (Jamieson, 1973).

As implicações das análises genético-populacionais para estudos de

conservação são muito importantes. Se uma espécie ameaçada, que ocupa uma

determinada área, se apresenta estruturada, então a estratégia de conservação

deve procurar preservar a diversidade da espécie naquela área, pois já podem

existir adaptações locais que se perderiam no caso de a população ser misturada

com outras. Se a população da espécie é homogênea, ao longo de toda a área de

ocorrência, então é viável concentrar a proteção da espécie em apenas uma área

para a recolonização das outras quando necessário (Haig, 1998).

Em se tratando de espécies de peixes de importância comercial, a preocupação

de conservação visa não somente a detecção de uma possível ameaça de extinção,

mas, primordialmente, a manutenção de uma exploração sustentável.

Nos dias atuais, as técnicas utilizadas como manejo de diversas espécies de

peixes exploradas comercialmente têm se baseado na proibição da pesca em

épocas de defeso, delimitação de tamanho do pescado e das técnicas utilizadas

para a pesca, entre outros. Hilsdorf et al. (2006) ressaltam que os aspectos da

genética no manejo de estoques capturados pela pesca comercial raramente está na

pauta de discussões dos programas de manejo dos estoques pesqueiros. No

entanto, estudos que visam estratégia de conservação de peixes baseados em

  

42

dados genéticos (ou tendo esses dados como ferramenta adicional) já é uma

realidade discutida (Fabré & Barthem, 2005; Hilsdorf et al., 2006; Hrbek et al., 2007)

e tendem a fazer parte desses programas de manejo pesqueiro, haja visto a

importante contribuição desses estudos para que cheguemos, ao menos, próximo de

uma política de pesca verdadeiramente sustentável.

O presente estudo avaliou a variabilidade genética da pescada P.

squamosissimus, na calha principal do rio Amazonas ao nível do marcador

mitocondrial (D-loop) e evidenciou que:

- Com exceção da pequena diferenciação populacional observada entre as

localidades dos extremos da distribuição das localidades analisadas, não há

delimitação de populações geneticamente estruturadas entre as cinco localidades

amostradas na calha principal do rio Amazonas. No entanto, uma expansão

populacional foi observada entre os pontos mais distantes da distribuição amostral;

- Os resultados de diversidade genética baseados na análise da região controle

do DNA mitocondrial mostram que a pesca predatória ainda não atingiu essas

populações;

- Apesar de não ter sido detectado estatisticamente um isolamento por distância,

o mesmo não deve ser descartado, dada a diferenciação genética encontrada entre

os indivíduos dos pontos amostrais mais distantes (Soure e Tabatinga).

Por fim, os dados deste estudo revelam que na ausência de populações

geneticamente estruturadas, não há uma área delimitada em específico, do ponto de

vista da informação genética dessas populações. Neste caso, as estratégias de

conservação para a pescada (P. squamosissimus) no rio Amazonas não devem ser

traçadas diferenciadamente.

  

43

VII. BIBLIOGRAFIA

Agostinho, C. S. 2000. Use of Otoliths to Estimate Size at Sexual Maturity in Fish.

Braz. Arch. Biol. Technol. 43 (4).

Aguilera, O. & Aguilera, D. R. de. 2003. Two new otolith-based Scianidae species of

the genus Plagioscion from South American neogene marine sediments. J.

Paleont., 77(6), pp. 1133–1138.

Alves-Costa, F. A.; Martins, C.; Matos, F. D. C.; Foresti, F.; Oliveira, C. & Wasko, A.

P. 2008. 5S rDNA characterization in twelve Sciaenidae fish species (Teleostei,

Perciformes): Depicting gene diversity and molecular markers. Genetics and

Molecular Biology. 31,1 (suppl), 303-307.

Alves-Gomes, J. A.; Ortí, G.; Haygood, M.; Heiligenberg, W. & Meyer, A. 1995.

Phylogenetic Analysis of the South American Electric Fishes (Order

Gymnotiformes) and the Evolution of Their Electrogenic System: A Synthesis

Based on Morphology, Eletrophysiology, and Mitochondrial Sequence Data.

Mol. Biol. Evol. 12(2): 298-318.

Annibal, S. R. P. 1983. Avaliação bio-ecológica e pesqueira das “pescadas”

(Plagioscion squamosissimus HECKEL, 1840 e Plagioscion montei SOARES,

1978) no “Sistema Lago do Rei”- Ilha do Careiro - AM - Brasil. Master thesis,

PPG-BTRN, INPA, Manaus, AM, Brazil.

Avise, J. C.; Niegel, J.E.; Arnold, J. 1984. Demographic influences on mitochondrial

DNA lineage survivorship in animal populations. Jour. Mol. Evol., 20: 99-105.

Ballard, W. O.; Whitlock, M. C. 2004. The incomplete natural history of mitochondria.

Mol. Eco., 13: 729-744.

  

44

Barthem, R. B. & Fabré, N. N. 2003. Biologia e Diversidade dos Recursos

Pesqueiros da Amazônia. In: A Pesca e os Recursos Pesqueiros na Amazônia

Brasileira, ed. ML Ruffino. pp. 11-55. Manaus: ProVárzea-IBAMA.

Batista, J. S. & Alves-Gomes, J. A. 2006. Phylogeography of Brachyplatystoma

rousseauxii (Siluriformes – Pimelodidae) in the Amazon Basin offers preliminary

evidence for the first case of “homing” for an Amazonian migratory catfish.

Genetics and Molecular Research 5 (4): 723-740.

Batista, J. S.; Formiga-Aquino, K.; Farias, I. P. & Alves-Gomes, J. A. 2005.

Variabilidade genética da dourada e da piramutaba na bacia Amazônica. In: O

Manejo da Pesca dos Grandes Bagres Migradores: Piramutaba e Dourada no

Eixo Solimões-Amazonas .Fabré, N. N. & Barthem, R. B., eds, pp. 15–19.

Manaus: Edicões ProVárzea/Ibama.

Baumgartner, M. S. T.; Nakatani, K.; Baumgartner, G. & Makrakis, M. C. 2003.

Spatial and temporal distribution of “Curvina” larvae (Plagioscion

squamosissimus Heckel, 1840) and its relationship to some environmental

variables in the upper Paraná rivers floodplain, Brazil. Braz. J. Biol., 63(3): 381-

391.

Benedito-Cecilio, E. & Agostinho, A. A. 2000. Distribution, abundance and use of

different environments by dominant ichthyofauna in the influence área of the

Itaipu reservoir. Acta Scientiarum, Maringá, 22 (2): 429-437.

Bennemann, S. T.; Capra, L. G.; Galves, W. & Shibatta, O. A. 2006. Dinâmica trófica

de Plagioscion squamosissimus (Perciformes, Scianidae) em trechos de

influência da represa Capivara (rios Paranapanema e Tibagi) Iheringia, Sér.

Zool., Porto Alegre, 96(1):115-119.

Brown, W. M., George Jr., M. & Wilson, A. C. 1979. Rapid evolution of mitochondrial

DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of

America, 76: 1967-1971.

  

45

Brown, W. M.; Pranger & E. M.; Wang, A. 1982. Mitochondrial DNA sequences of

primates: Tempo and mode of evolution. Jour. Mol. Evol., 18: 225-239.

Brown, J. R.; Beckenbach, A. T. & Smith, M. J. 1993. Intraespecific DNA sequence

variation of the mitochondrial control region of white sturgeon (Acipenser

transmontanus). Mol. Bio. Evol., 10 (2): 326-341.

Camargo, S. A. F. de & Petrere-Jr., M. 2004. Análise de risco aplicada ao manejo

precaucionário das pescarias artesanais na região do Reservatório da UHE-

Tucuruí (Pará, Brasil).

Carnelós, R. C. & Benedito-Cecilio, E. 2002. Reproductive Strategies of Plagioscion

squamosissimus Heckel, 1840 (Osteichthyes Scianidae) in the Itaipu Reservoir,

Brazil. Brazilian Archives of Biology and Technology. 45 (3): 317-324.

Casatti, L. 2003. Family Sciaenidae (Drums or croakers). In: R.E. Reis, S. O.

Kullander & C. J. Ferraris Jr. (orgs.), Check list of the freshwater of South and

Central America. EDIPUCRS, Porto Alegre, pp. 599–602.

Casatti, L. 2005. Revision of the South American freshwater genus Plagioscion

(Teleostei, Perciformes, Scianidae). Zootaxa, 1080: 39-64.

Castro, A. L. F.; Stewart, B. S.; Wilson, S. G.; Hueter, R. E.; Meekan, M. G.; Motta, P.

J.; Bowen, B. W. & Karl, S. A. 2007. Population genetic structure of Earth’s

largest fish, the whale shark (Rhincodon typus). Molecular Ecology, 16: 5183-

5192.

Doyle, J. J. & Doyle, J. L. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities

of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull. Bot. Soc. Amer. 19: 11-15.

Excoffier, L.; Laval, G.; Schneider, S. 2005. Arlequin ver. 3.0: An integrated software

package for population genetics data analysis. Evol. Bioin. Onl., 1: 47-50.

  

46

Fabré, N. N. & Barthem, R. B. 2005. O Manejo da Pesca dos Grandes Bagres

Migradores: Piramutaba e Dourada no Eixo Solimões-Amazonas . eds,.

Manaus: Edicões ProVárzea/Ibama. 113p.

Farias, I. P.; Ortí, G.; Sampaio, I.; Schneider, H. & Meyer, A. 1999. Mitochondrial

DNA phylogeny of the family Cichlidae: Monophyly and fast molecular evolution

of the Neotropical assemblage. Journal of Molecular Evolution. 48: 703-711.

Farias, I. P.; Ortí, G. & Meyer, A. 2000. Total evidence: Molecules, morphology, and

the phylogenetics of cichlid fishes. Journal of Experimental Zoology (Molecular

Development and Evolution). 288: 76-92.

Farias, I. P.; Ortí, G.; Sampaio, I. Schneider, H. & Meyer, A. 2001. The Cytochrome b

Gene as a Phylogenetic Marker: The Limits of Resolution for Analyzing

Relationships Among Cichlid Fishes. Journal of Molecular Evolution. 53: 89-

103.

Farias, I. P. & Hrbek, T. 2008. Patterns of diversification in discus fishes

(Symphysodon spp. Cichlidade) of the Amazon basin. Molecular Phylogenetics

and Evolution. 49: 32-43.

Feldberg, E.; Porto, J. I. R.; dos Santos, E. B. P. & Valentin, F. C. S. 1999.

Cytogenetic studies of two freshwater scianids of the genus Plagioscion

(Perciformes, Scianidae) from the Central Amazon. Genet. Mol. Biol. 22: 351-

356.

Ferguson, A.; Taggart, J. B.; Prodöhl, P. A.; McMeel, O.; Thompson, C.; Stone, C.;

McGinnity, P. & Hynes, R. A. 1995. The application of molecular markers to the

study and conservation of fish populations, with special reference to Salmo.

Journal of Fish Biology. 47 (Supplement A), 103-126.

Formiga-Aquino, K. 2004. Variabilidade genética da piramutaba – Brachyplatystoma

vaillantii (Valenciennes, 1840) (Siluriformes: Pimelodidae) no sistema Estuário-

  

47

Amazonas-Solimões. Dissertação de mestrado. Instituto Nacional de Pesquisas

da Amazônia – INPA, Manaus, Am. 75p

Frankham, R.; Ballou, J. R. & Briscoe, D. A. 2002. Introducion to Conservation

Genetics. Cambridge University Press, Cambridge, England.

Fu, Y-X. 1997. Statistical tests of neutrality of mutations against population growth,

hitchhiking and background selection. Genetics 147, 915-925.

Guo, X. H.; Liu, S. J.; Liu, Q.; Liu, Y. 2004. New progresses on mitochondrial DNA in

fish. Yi Chuan Xue Bao., 31(9):983-1000.

Haig, S. M. 1998. Molecular contributions to conservation. Ecology. 79: 413-425.

Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and

analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser, 95: 95-98.

Hartl, D. L.; Clark, A. G. 2007. Principles of Population Genetics. Sinauer Associates,

Inc. Publisher. Suderland, Massachusetts. 652p.

Hilsdorf. A. W. S.; Resende, E. K. & Marques, D. K. S. 2006. Genética e

Conservação de Estoques Pesqueiros de Águas Continentais no Brasil:

Situação Atual e Perspectivas. Documentos/Embrapa Pantanal, Corumbá. 43p.

Hrbek, T.; Farias I. P.; Crossa, M.; Sampaio, I.; Porto, J. I. R.; Meyer, A. 2005.

Population genetic analysis of Arapaima gigas, one of the largest freshwater

fishes of the Amazon basin: implications for its conservation. Animal

conservation, 8: 297-308.

Hrbek, T.; Crossa, M. & Farias, I. P. 2007. Conservation strategies for Arapaima

gigas (Schinz, 1822) and the Amazonian várzea ecosystem. Braz. J. Biol., 67

(4, suppl.): 909-917.

  

48

Hrbek, T.; Farias, I. P. 2008. The complete mitochondrial genome of the pirarucu

(Arapaima gigas, Arapaimidae, Osteoglossiformes). Genetics and Molecular

Biology. 31, 1 (suppl), 293-302.

Jamieson, A. 1973. Genetic ‘tags’ for marine fish stocks. In: Sea Fisheries Research.

Harden Jones. FR (ed) London, Elek Science. p. 91-99.

Lee, W. J.; Conroy, J.; Howell, W. H.; Kocher, T. D. 1995. Structure and evolution of

teleost mitochondrial control regions. Jour. Mol. Evol., 41: 54-66.

Li, C. & Ortí, G. 2007. Molecular phylogeny of Clupeiformes (Actinopterygii) inferred

from nuclear and mitochondrial DNA sequences. Molecular Phylogenetics and

Evolution, 44: 386-398.

Lankford-Jr, T. E.; Targett, T. E.; Gaffney, P. M. 1999. Mitochondrial DNA analysis of

population structure in the Atlantic croaker, Micropogonias undulatus

(Perciformes: Sciaenidae). Fishery Bulletin, 97: 884-890.

Loubens, G. 2003. Biologie de Plagioscion squamosissimus (Teleostei: Sciaenidae)

dans le bassin du Mamoré (Amazonie bolivienne). Ichthyological Exploration of

Freshwaters, München, 14 (4): 335-352.

Lovejoy, N. R.; Albert, J. S. & Crampton, W. G. R. 2006. Miocene marine incursions

and marine/freshwater transitions: Evidence from Neotropical fishes. Journal of

South American Earth Sciences. 21: 5-13.

Lundberg, J. G.; Marshall, L. G.; Guerrero, J.; Horton, B.; Malabarba, M. C. S. L.;

Wesseling, F. 1998. The stage for neotropical fish diversification: A history of

tropical South American Rivers. In: Malabarba, L. R.; Reis, R. E.; Vari, R. P.;

Lucena, Z. M.; Lucena, C. A. S. Phylogeny and classification of Neotropical

fishes. EDIPUCRS, Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil. p.30-36.

  

49

Machado, V. N. 2009. Análise da variabilidade genética da curimatã Prochilodus

nigricans (Agassiz, 1829) na calha do rio Amazonas e seus principais

tributários. Dissertação de mestrado. Programa de Pós-Graduação em

Ciências Pesqueiras nos Trópicos/Universidade Federal do Amazonas.

Manaus, Amazonas. 65pp.

Meyer, A. 1993. Evolution of mitochondrial DNA in fishes. In: Molecular Biology

Frontiers: Biochemistry and Molecular Biology of Fishes. Vol. 2. P. W.

Hochachka & T. P. Mommsen (eds.). Amsterdam, Holland: Elsevier.

Meyer, A. 1994. DNA Technology and phylogeny of fish: Molecular phylogenetic

studies of fish. In: Beaumont, A.R. Genetic and evolution of aquatic

organisms. Chapman and Hall, London. p.219-249

Monostory Z, Nagy A, Gervai J and Csanyi V (1984). Polymorphism and inheritance

of serum esterases and beta-globulins in the paradise fish (Macropodus

opercularis; Anabantidae). Anim. Blood Groups Biochem. Genet. 15: 1-11.

Nei, M. 1987. Molecular Evolutionary Genetics Columbia University Press, New

York, NY.

Ovenden, J. R. 1990. Mitochondrial DNA and marine stock assessment: a review.

Australian Journal of Marine and Freshwater Research. 41 (6) 835-853.

Parente, V. de M. & Batista, V. da S. 2005. A organização do desembarque e o

comércio de pescado na década de 1990 em Manaus, Amazonas. Acta

Amazônica. 35(3): 375 – 382.

Passos, K. B. 2009. Genética populacional do jaraqui de escama grossa

(Semaprochilodus insignis – Prochilodontidae, Characiformes). Dissertação de

mestrado. Programa de Pós-Graduação em Diversidade

Biológica/Universidade Federal do Amazonas. Manaus, Amazonas. 56pp.

  

50

Pinheiro, L. A. & Frédou, F. L. 2004. Caracterização geral da pesca industrial

desembarcada no Estado do Pará. Revista Científica da UFPA. Vol. 4.

Ragazzo, M. de T. 2002. Peixes do Rio Negro por Alfred Russel Wallace (1850-

1852). Livro. Organização – texto introdutório e traduções Mônica de Toledo-

Piza Ragazzo. Edusp – Editora da Universidade de São Paulo, Imprensa Oficial

do Estado, São Paulo. 1ª ed. Pág. 486-487.

Reis R. E.; Kullander S. O. & Ferraris C. J. eds. 2003. Check List of the Freshwater

Fishes of South and Central America. Porto Alegre, Brazil: EDIPUCRS. 734 pp.

Ribeiro, D. T. 2006. História evolutiva de espécies do gênero Potamotrygon Garman,

1877 (Potamotrygonidae) na Bacia Amazônica. Dissertação de Mestrado.

Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/Universidade Federal do

Amazonas. Manaus, Amazonas. 126pp.

Rice, W. R. 1989. Analyzing tables of statistical tests. Evolution 43, 223-225.

Rodrigues, R.; Schneider, H.; Santos, S.; Vallinoto, M; Sain-Paul, U. & Sampaio, I.

2008. Low levels of genetic diversity depicted from mitochondrial DNA

sequences in a heavily exploited marine fish (Cynoscion acoupa, Sciaenidae)

from the Northern coast of Brazil. Genetics and Molecular Biology. 31,2, 487-

492.

Sanches, A. & Galetti-Jr, P. M. 2007. Genetic evidence of population structuring in

the neotropical freshwater fish Brycon hilarii (Valenciennes, 1850). Braz. J.

Biol. 67 (4, Suppl.): 889-895.

Santos, G. M.; Ferreira, E. J. G. 1999. Peixes da Bacia Amazônica. In: Lowe-

McConnell, R. H. Estudos ecológicos de comunidades de peixes tropicais.

EDUSP, São Paulo, São Paulo, Brasil. p.345-37.

  

51

Santos, S.; Schneider, H.; Sampaio, I. 2003. Genetic differentiation of Macrodon

ancylodon (Sciaenidae, Perciformes) populations in Atlantic coastal waters of

South America as revealed by mtDNA analysis. Genetics and Molecular

Biology. 26, 2, 151-161.

Santos, S. B. A. F.; Silva, A. C. da & Viana, M. S. R. 2003. Aspectos reprodutivos da

pescada-do-piauí, Plagioscion squamosissimus (Heckel, 1840), capturada no

Açude Pereira de Miranda (Pentecoste - Ceará). Revista Ciência Agronômica,

Vol. 34, N⁰.1: x – y.

Santos, S.; Hrbek, T.; Farias, I. P.; Schneider, H. & Sampaio, I. 2006. Population

genetic structuring of the king weakfish, Macrodon ancylodon (Scianidae), in

Atlantic coastal Waters of South America: deep genetic divergence without

morphological change. Molecular Ecology. 15, 4361-4373.

Santos, M. C. F.; M. L. Ruffino & I. P. Farias. 2007. High levels of genetic variability

and panmixia of the tambaqui Colossoma macropomum (Cuvier, 1818) in the

main channel of the Amazon River. Journal of Fish Biology. 71: 33-44.

Saik, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S. 1988. Primer directed enzymatic amplification

of DNA with thermostable DNA polymerase. Scie., 239: 487-491.

Schmitt, R. 2005. Filogeografia de “Hypopygus lepturus” Hoedeman, 1962

(Gymnotiformes: Rhamphycthyidae) ao longo do médio rio Negro, Amazônia.

Dissertação de Mestrado. Instituto Nacional de Pesquisas da

Amazônia/Universidade Federal do Amazonas. Manaus, Amazonas. 156pp.

Schneider, C. H. 2007. Análise da variabilidade genética do peixe ornamental

Carnegiella strigata (Characiformes, Gasteropelecidae) de três rios de água

preta da Amazônia Central. Dissertação de mestrado. Instituto Nacional de

Pesquisas da Amazônia/Universidade Federal do Amazonas. Manaus,

Amazonas. 72pp.

  

52

Sioli, H. 1984. The Amazon and its main affluents: Hydrography, morphology of the

river courses, and river types. In: The Amazon Limnology and landscape

ecology of a mighty tropical river and its basin. Ed. Harald Sioli, p. 263. Springer

Verlag, New York, NY.

Soares, M. G. M. 2007. (ed.) Peixes de lagos do Médio rio Solimões. Manaus,

EDUA, 176 pp.

Solé-Cava, A. M. 2001. Biodiversidade molecular e genética da conservação. In:

Matioli, S. R. (ed.). Biologia Molecular e Evolução. Ribeirão Preto: Holos

Editora. p. 172-192.

Tajima, F. 1989. Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by

DNA polymorphism. Genetics 123, 585-595.

Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary

Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and

Evolution 24:1596-1599. (Publication PDF at

http://www.kumarlab.net/publications)

Teixeira, A. S.; Jamieson, A. & Raposo, J. C. P. 2002. Transferrin polymorphism in

Central Amazon populations of pescada, Plagioscion squamosissimus. Genet.

Mol. Res. 1 (3): 216-226.

Thompson , J. D.; Higgins, D. G. & Gibson, T. J. 1996. CLUSTAL W: improving the

sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence

weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic

Acids Research 22, 4673-4680.

Torres, R. A. 2006. Molecular taxonomy of Plagioscion Heckel (Perciformes,

Scianidae) and evidence from mtDNA RFLP markers for an invasive species in

the Paraná river, Southern Brazil. Revista Brasileira de Zoologia, 23 (4): 1235-

1242.

  

53

Viana, A. P.; Frédou, T. & Lucena, F. 2006. Aplicações de técnicas morfométricas no

estudo da morfometria de Pescada Branca, Plagioscion squamosissimus,

Heckel (1940), Perciformes, Scianidae, desembarcada na Ilha de Mosqueiro-

PA. Boletim do Laboratório de Hidrobilogia, 19: 01-012.

Vinson, C.; Gomes, G.; Schneider, H.; Sampaio, I. 2004. Sciaenidae fish of the

Caeté River estuary, Northern Brazil: mitochondrial DNA suggests explosive

radiation for the Western Atlantic assemblage. Genetics and Molecular Biology.

27,2, 174-180.

Willis, S. C.; Nunes, M. S.; Montaña, C. G.; Farias, I. P. & Lovejoy,N. R. 2007.

Systematics, biogeography, and evolution of the Neotropical peacock basses

Cichla (Perciformes: Cichlidae). Molecular Phylogenetics and Evolution. 44(1):

291-307.

Wilson, G. M.; Thomas, W. K.; Beckenbach, A. T. 1985. Intra- and interspecific

mitochondrial DNA sequences divergence in Salmo: rainbow, steelhead, and

cutthroat throuts. Can. J. Zool., 63: 2088-2094.

Worthmann, H. 1979. A relação entre o desenvolvimento do otólito e o crescimento

do peixe como auxílio na distinção de populações de pescada (Plagioscion

squamosissimus). Acta Amazonica 9: 573-586.

Wright, S. 1978. Evolution and the genetics of populations. The University of Chicago

Press, London. 580p.