O arroz a cultura mais importante do mundo, sendo a fonte ... · 1.1.1 – Origem e importância do arroz ... baseado na Teoria Centro do Gene. Porém, bem antes de qualquer evidência

Dissertação de mestrado

1. INTRODUÇÃO

1.1 – O Arroz (Oryza sativa L.)

1.1.1 – Origem e importância do arroz

Diversos historiadores e cientistas apontam o sudeste da Ásia como o

local de origem do arroz (EMBRAPA ARROZ E FEIJÃO, 2008). Os dados que

culminaram em tal conclusão foram, inicialmente, publicados por NAKAGAHRA e

HAYASHI, em 1977. Neste trabalho, análises sobre variações nos genótipos de

isoenzimas em variedades nativas de arroz

mostraram que o centro da diversidade

genética encontrava-se na área de Assam, na

Índia, e Yunnan, na China (NAKAGAHRA e

HAYASHI, 1977). A figura ao lado ilustra a

origem e a possível rota de difusão dos

diferentes tipos de arroz presentes na Ásia,

baseado na Teoria Centro do Gene. Porém,

bem antes de qualquer evidência histórica, o

arroz foi, provavelmente, o principal alimento e a primeira planta cultivada na Ásia.

As mais antigas referências ao arroz são encontradas na literatura chinesa, há cerca

de 5.000 anos. (EMBRAPA ARROZ E FEIJÃO, 2008).

National Institute of Crop Science (http://www.nics.go.kr/english/eng_index.htm)

Alguns autores apontam o Brasil como o primeiro país a cultivar esse

cereal no continente americano. Consta que integrantes da expedição de Pedro

Álvares Cabral, após uma peregrinação por cerca de 5 km em solo brasileiro,

traziam consigo amostras de arroz, confirmando registros de Américo Vespúcio que

trazem referência a esse cereal em grandes áreas alagadas do Amazonas. A prática

da rizicultura no Brasil, de forma organizada e racional, aconteceu em meados do

século XVIII e daquela época até a metade do século XIX, o país foi um grande

exportador de arroz (EMBRAPA ARROZ E FEIJÃO, 2008).

Lourenço, G. F. (2009) Dissertação de mestrado – LBT / CBB / UENF 1


Atualmente, o arroz constitui uma das mais importantes culturas do

mundo, sendo a fonte primária de alimento para mais da metade da população

mundial. Para tanto, a rizicultura ocupa, anualmente, cerca de 154 milhões de

hectares, o que corresponde a 11% das terras cultivadas no mundo. Mais de 90% de

todo o arroz produzido no mundo é crescido e consumido na Ásia, onde vive 60% da

população do planeta (KHUSH, 2005).

De acordo com as estimativas da Organização das Nações Unidas (ONU),

a população mundial passará de 6 bilhões em 2000 para 8 bilhões em 2025 (KHUSH,

2005). Com o aumento populacional, a produção de arroz deverá aumentar 40% até

2030 para satisfazer a crescente demanda dos países consumidores do grão. Para

que seja alcançado o objetivo de produzir mais arroz, é necessária a obtenção de

variedades com um maior potencial de rendimento e melhor estabilidade do

rendimento. Em prol disso, várias estratégias têm sido empregadas, incluindo

hibridação convencional e procedimentos de seleção, criação de ideotipos, criação

de híbridos, e engenharia genética (KHUSH, 2005).

1.1.2 – O arroz na era da genômica

O início do século XXI marca a era da genômica funcional. Este evento é

devido, principalmente, ao enorme fluxo de informação gerado pela decodificação do

genoma de muitos organismos de vida livre (BERNAL et al., 2001). Haemophilus

influenzae foi o primeiro organismo cujo genoma foi completamente seqüenciado,

em 1995 (FLEISCHMANN et al., 1995). O impressionante progresso nessa área levou

Philip H. Abelson a chamar a genômica – a análise da estrutura do genoma e da

função do gene no contexto do conjunto genético completo de um organismo – de “a

terceira revolução tecnológica” (ABELSON, 1998). Até o início de 2006, o

seqüenciamento dos genomas de 216 organismos já havido sido concluído e

publicado, e outros 965 genomas completos estavam a caminho, sendo 524 de

organismos procariotos e 441 de eucariotos (AGRAWAL e RAKWAL, 2006).

O primeiro “rascunho” da seqüência do genoma do arroz foi anunciado

pela gigante empresa agrícola Monsanto em 2000 (BARRY, 2001). Em 2002, outra

conquista notável foi a conclusão das “seqüências-rascunho” do genoma de dois dos



principais cultivares de arroz, o cultivar Nipponbare, do tipo japonica (GOFF et al.,

2002) e o cultivar 93-11, do tipo indica (YU et al., 2002).

O completo seqüenciamento do genoma do arroz foi concluído no ano de

2005 (INTERNATIONAL RICE GENOME SEQUENCING PROJECT, 2005), e a partir do

número total de loci expressos e clones de cDNAs inteiros (FL-cDNA) não mapeados

foi estimado que o número de genes de arroz seria de, aproximadamente, 32.000

(RICE ANNOTATION PROJECT, 2007). Entre esses genes, 28.540 são candidatos a

genes que codificam para proteínas. Cerca de 25% (7.189 loci) das potenciais

regiões abertas de leitura (ORFs), tiveram suas funções designadas por buscas

através de BLASTX (RICE ANNOTATION PROJECT, 2007). Porém abordagens

adicionais são necessárias para a elucidação das funções dos genes

remanescentes (NAKAMURA et al., 2007).

Com o intuito de acelerar a identificação e a caracterização dos genes de

arroz com funções até agora desconhecidas, vários recursos têm sido produzidos

(LIN et al., 1998; EBITANI et al., 2005). A infra-estrutura para as análises de

bioinformática em arroz (revisada por SASAKI et al., 2005), incluindo bancos de

dados integrados como RAP-DB (TANAKA et al., 2008; OHYANAGI et al., 2006; RICE

ANNOTATION PROJECT, 2007), TIGR Rice Genome Annotation Database (OUYANG et

al., 2007), BGI-RIS (ZHAO et al., 2004) e MOsDB (KARLOWSKI et al., 2003), tem sido

continuamente desenvolvida e tais ferramentas encontram-se publicamente

disponíveis. Os FL-cDNAs, agrupados em 28.469 clones não-redundantes (RICE

FULL-LENGTH CDNA CONSORTIUM, 2003), e o banco de dados de proteômica em

arroz (KOMATSU, 2005) também apresentam grande potencial para promover a

descoberta e a elucidação da função gênica (NAKAMURA et al., 2007).

A quantidade de informação gerada a partir destes recursos,

inevitavelmente, levará a um ritmo sem precedentes (e eficiente) na análise e

dedução da função gênica em um curto período de tempo, no nível de transcrito

(transcriptômica: análise paralela da expressão do gene), proteína (proteômica:

análise do polipeptídeo complementar), e metabólito (metabolômica: análise paralela

dos metabólitos primários e secundários), que são os pilares integrais da genômica

funcional (AGRAWAL e RAKWAL, 2006).



1.2 – Regulação gênica em resposta a estresses ambientais em plantas

1.2.1 – Estresses abióticos

Estresses abióticos, tais como seca, salinidade, temperaturas extremas,

toxicidade química e estresse oxidativo, desencadeiam uma série de mudanças

moleculares, bioquímicas, fisiológicas e morfológicas que afetam negativamente o

crescimento e a produtividade das plantas (WANG et al., 2001). Por esse motivo, este

tipo de estresse ambiental é considerado grande ameaça para agricultura (GAO et

al., 2007), sendo responsável por reduzir em até 50% os rendimentos anuais

(BOYER, 1982; BRAY et al., 2000). Porém, durante a evolução, as plantas

desenvolveram sofisticados mecanismos para perceber sutis mudanças nas

condições de crescimento e desencadear respostas necessárias para sua

adaptação às diversas condições ambientais (GAO et al., 2007).

Seca, salinidade, temperaturas extremas e estresse oxidativo estão

geralmente interconectados, e devem induzir danos celulares similares. Por

exemplo, seca e/ou salinização são manifestados, inicialmente, como estresse

osmótico, resultando na interrupção da homeostase e da distribuição iônica na célula

(SERRANO et al., 1999; ZHU, 2001a). O estresse oxidativo, que freqüentemente está

associado aos estresses de alta temperatura, salinidade ou seca, deve causar

desnaturação de proteínas funcionais e estruturais (SMIRNOFF, 1998).

Conseqüentemente, esses diversos estresses ambientais ativam vias de sinalização

e respostas celulares similares (SHINOZAKI e YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2000; KNIGHT e

KNIGHT, 2001; ZHU, 2001b; ZHU, 2002), tais como a produção de proteínas de

estresse, indução de antioxidantes e acúmulo de solutos compatíveis (VIERLING e

KIMPEL, 1992; ZHU et al., 1997; CUSHMAN e BOHNERT, 2000). A figura 1 ilustra a

complexa resposta da planta ao estresse abiótico, que envolve muitos genes e

mecanismos bioquímicos e moleculares. Os mecanismos de controle molecular da

tolerância ao estresse abiótico são baseados na ativação e regulação de genes

específicos relacionados ao estresse (WANG et al., 2003). Esses genes englobam



três principais categorias: (1) genes envolvidos nas cascatas de sinalização, tais

como MYC, MAP kinases e SOS kinase (SHINOZAKI e YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 1997;

MUNNIK et al., 1999; ZHU, 2001b), fosfolipases (CHAPMAN, 1998; FRANK et al., 2000),

e fatores de transcrição como HSF, e as famílias CBF/DREB e ABF/ABAE

(STOCHINGER et al., 1997; SCHÖFFL et al., 1998; CHOI et al., 2000; SHINOZAKI e

YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2000); (2) genes que funcionam diretamente na proteção de

membranas e proteínas, como proteínas heatshock (HSPs) e chaperonas, proteínas

LEA (late embryogenesis abundant) (VIERLING, 1991; INGRAM e BARTELS, 1996;

THOMASHOW, 1998; THOMASHOW, 1999; BRAY et al., 2000), osmoprotetores, e

removedores de radicais livres (BOHNERT e SHEVELEVA 1998); e (3) genes envolvidos

na absorção e transporte de água e íons, como aquaporinas e transportadores de

íons (MAUREL, 1997; SERRANO et al., 1999; TYERMAN et al., 1999; ZIMMERMANN e

SENTENAC, 1999; BLUMWALD, 2000).

Portanto, para manter o crescimento e a produtividade, as plantas devem

adaptar-se às condições do estresse ativando mecanismos específicos de

tolerância. Dessa forma, a modificação de plantas visando aumentar a tolerância

está baseada, principalmente, na manipulação desses genes, que protegem e

mantêm a função e a estrutura dos componentes celulares (WANG et al., 2003).

1.2.2 – Estresses bióticos

Estresses bióticos podem ser causados por uma vasta gama de potenciais

patógenos. Fungos, bactérias, nematódeos e insetos interceptam os produtos da

fotossíntese produzidos pelas plantas, e os vírus utilizam a maquinaria de replicação

a custo do hospedeiro. Porém ao longo da evolução, as plantas desenvolveram

sofisticados mecanismos para perceber tais ataques, e traduzir essa percepção em

uma resposta adaptativa (DANGL e JONES, 2001).



Transporte de água e íons (aquaporinas e

transportadores de íons)

Função chaperonas(Hsp, SP1, LEA, COR)

Osmoproteção(prolina, glicina-

betaína)

Detoxificação(SOD, PX)

Controle da transcrição

Detecção, percepção e transdução de sinal

Osmossensores, Enzimas de clivagem de fosfolipídios, Mensageiros secundários, MAP kinases, Sensores de Ca2+, Proteínas kinases

dependentes de cálcio.

Estresse secundárioEstresse osmóticoEstresse oxidativo

Seca

Frio

Salinidade

Calor

Poluentesquímicos

Rompimento da homeostase iônica e osmótica; danificação

de proteínas funcionais e estruturais e membranas

Fatores de transcrição(Ex.: CBF/DREB, ABF, HSF, bZIP, MYC/MYB)

Ativação de genes

Re-estabelecimento da homeostase celular, proteção estrutural e funcional de proteínas e

membranas

Tolerância ao estresse ou Resistência

Mecanismos de resposta a estresse Transporte de água e

íons (aquaporinas e transportadores de íons)

Função chaperonas(Hsp, SP1, LEA, COR)

Osmoproteção(prolina, glicina-

betaína)

Detoxificação(SOD, PX)

Controle da transcrição

Detecção, percepção e transdução de sinal







Seca

Frio

Salinidade

Calor

Poluentesquímicos

Rompimento da homeostase iônica e osmótica; danificação

de proteínas funcionais e estruturais e membranas



Ativação de genesAtivação de genes

Re-estabelecimento da homeostase celular, proteção estrutural e funcional de proteínas e

membranas

Tolerância ao estresse ou Resistência

Mecanismos de resposta a estresse

Figura 1. A complexidade da resposta da planta ao estresse abiótico. Estresses primários, como seca, salinidade, frio, calor e poluição química, estão normalmente interconectados, e causam dano celular e estresses secundários, como estresse oxidativo e osmótico. Os sinais iniciais de estresse (por exemplo, efeitos osmóticos e iônicos, e mudanças na fluidez da membrana) disparam um processo de sinalização em cadeia e controles de transcrição que ativam mecanismos de resposta ao estresse a fim de restabelecer a homeostase e proteger e reparar proteínas e membranas defeituosas. Uma resposta inadequada a um ou muitos passos na sinalização e ativação do gene deve resultar em mudanças irreversíveis de homeostase celular e na destruição de proteínas funcionais e estruturais, e membranas, levando a morte celular. Adaptação de WANG et al., 2003.



A percepção envolve a detecção de moléculas do patógeno ou, algumas

vezes, da própria planta ferida. Essas moléculas, chamadas elicitores, são divididas

em dois grupos. O primeiro grupo corresponde aos elicitores intrínsecos do

organismo invasor, tais como os fragmentos de chitina da parede celular de fungos

ou a proteína flagelina que compõem a cauda flagelar de bactérias. Receptores para

esse tipo de elicitores estão presentes na membrana plasmática das plantas. O

segundo grupo corresponde aos produtos, geralmente proteínas, que são

codificadas por genes de avirulência (Avr) do patógeno. Esses produtos podem ser

secretados no espaço intercelular ou injetados diretamente na célula via um sistema

de secreção do tipo-III. Eles são reconhecidos por plantas que expressam o

correspondente gene de resistência a doença (gene R) (PECK, 2003).

Muitos dos mecanismos de defesa são ativados dentro de minutos após a

percepção e funcionam para matar o patógeno ou limitar sua dispersão na planta

(DANGL e JONES, 2001). A morte celular programada no local da invasão é um

mecanismo comum de defesa contra patógenos biotróficos e insetos sugadores, que

dependem de células vivas do hospedeiro para obter nutrientes. No entanto, a morte

celular é um pré-requisito para o crescimento de patógenos necróficos, uma vez que

estes se alimentam de tecidos mortos. É, portanto, essencial que as plantas ativem

a resposta de defesa apropriada de acordo com o tipo de patógeno (SPOEL e DONG,

2008). Nesse contexto, a resistência mediada por ácido salicílico (SA) é efetiva

contra biotrófos, enquanto respostas mediadas por ácido jasmônico (JA) ou etileno

(ET) são predominantemente contra necrótrofos ou insetos herbívoros (GLAZEBROOK,

2005).

De forma intrigante, alguns patógenos são capazes de induzir múltiplas

moléculas sinalizadoras e fitormônios. Em tais casos, a comunicação entre essas

vias de sinalização permite que a planta priorize a resposta de defesa em detrimento

de suas funções celulares normais (SPOEL e DONG, 2008). Como uma estratégia de

virulência, muitos patógenos desenvolveram mecanismos que mimetizam hormônios

e interferem na resposta imune do hospedeiro. As plantas, por sua vez, utilizam a

comunicação das vias como um mecanismo direto de defesa contra a perturbação,

desencadeada pelo patógeno, na sinalização hormonal (SPOEL e DONG, 2008).

Diversos estudos demonstraram que os fitormônios, tais como SA, JA, ET

e ácido abscísico (ABA), que são moléculas endógenas de baixo peso molecular,

participam na resposta contra ambos os estresses ambientais através de ações



sinérgicas e antagônicas, sugerindo uma comunicação cruzada entre as vias de

sinalização dos estresses bióticos e abióticos (BOSTOCK, 2005; LORENZO e SOLANO,

2005; MAUCH-MANI e MAUCH, 2005). Adicionalmente, diversos resultados de análises

de transcriptoma em larga-escala utilizando a tecnologia de microarray de DNA

suportam, fortemente, a existência de uma comunicação cruzada entre as vias de

sinalização dos estresses bióticos e abióticos (SCHENK et al., 2000; CHEONG et al.,

2002; SEKI et al., 2002; NARUSAKA et al., 2003; DAVLETOVA et al., 2005). Nos dois

tipos de estresse ambiental, conjuntos de genes diferentes, porém sobrepostos, são

regulados. Dessa forma, as elaboradas vias de sinalização, com freqüentes pontos

de intersecção, permitem que as plantas regulem tanto a tolerância a estresses

bióticos quanto a resistência a doenças (FUJITA et al., 2006). A figura 2 ilustra os

pontos de convergência molecular entre as vias de sinalização dos estresses

bióticos e abióticos (FUJITA et al., 2006).

1.3 – Regulação gênica em resposta a estresses ambientais em arroz

O arroz carrega características únicas de tolerâncias e susceptibilidades a

estresses abióticos quando comparados a outras culturas. O arroz é capaz de tolerar

solos encharcados e submersão em níveis que matariam outras culturas, é

moderadamente tolerante a salinidade e à acidez do solo, mas é altamente sensível

à seca e frio. Muito embora a resposta do arroz ao estresse seja superior à resposta

de outras culturas, contudo, muitos ambientes onde o arroz é cultivado demandam

ainda maiores níveis de tolerância que aqueles encontrados na maioria dos

germoplasmas (LAFITTE et al., 2004). Em regiões tropicais, o arroz é cultivado em

climas de monção, estando sujeito à submersão intermitente, seca e, em regiões

costeiras, salinidade. O arroz também é crescido nos trópicos, durante a estação

seca, onde a adequada irrigação está disponível, e a cultura fica exposta às baixas

temperaturas na germinação e altas temperaturas na época de floração. Nas regiões

temperadas, onde virtualmente todo o arroz é irrigado, a baixa temperatura é o

principal estresse abiótico que afeta a produção (LAFITTE et al., 2004). Já nos solos

não irrigados nos trópicos úmidos, a cultura é afetada pelo déficit de água, acidez do

solo, e deficiência de fósforo, nitrogênio e zinco (WHITE e ZASOSKI, 1999).



Figura 2. Pontos de convergência nas vias de sinalização dos estresses bióticos e abióticos. O esquema simplificado ilustra as vias de sinalização

desencadeadas pelos estresses abióticos e bióticos, bem como os pontos de

comunicação entre estas vias. Tal comunicação permite que a planta regule

tanto a tolerância a estresse quanto a resistência a doenças. Figura adaptada de

FUJITA et al., 2006.



Os conhecimentos acerca de como os genes de arroz respondem às

condições adversas vêm aumentando diariamente. Muitos estudos relataram

mudanças na expressão de genes individuais quando o arroz é desafiado tanto por

estresses bióticos quanto abióticos (LAFITTE et al., 2004). Tais mudanças incluem a

regulação de diversos genes, como MAP kinases (AGRAWAL et al., 2003), genes

DREB (DUBOUZET et al., 2003), proteína-kinase dependente de cálcio (SAIJO et al.,

2001), uma endo-1,3-beta-glucanase (AKIYAMA e PILLAI, 2001), um fator de

elongação da tradução (LI ZI e CHEN SHOU, 1999) e glutathiona redutase (KAMINAKA

et al., 1998). Estudos de transformação demonstraram que alterando a expressão de

diferentes genes de distintas vias a resposta do arroz ao déficit de água e

desidratação pode ser afetada. Tais genes incluem aqueles associados com

diversas funções, tais como absorção de água (aquaporinas) (MARTRE et al., 2002),

sinalização (kinases) (SAIJO et al., 2001; LIU et al., 2003), integridade da membrana

(proteínas LEA) (XU et al., 1996; ROHILA et al., 2002; BABU et al., 2004), e

metabolismo de carboidrato (TPS) (JANG et al., 2003). Adicionalmente, evidências

que se acumularam ao longo da última década mostraram que o arroz, assim como

outras plantas, sintetiza lectina(s) em resposta a situações de estresse como seca,

alta concentração de sal, ferimento, ou tratamento com alguns fitormônios (VAN

DAMME et al., 2008).

1.4 – O gene salT e a proteína SALT

Em 1990, CLAES e colaboradores identificaram e caracterizaram o gene

salT, bem como seu produto, a proteína SALT. Nesta ocasião, a SALT, uma proteína

de 145 resíduos de aminoácidos, ponto isoelétrico (pI) de 5.5 (CLAES et al., 1990), e

peso molecular de 14,5 kDa (CLAES et al., 1990; BRANCO et al., 2004), foi

caracterizada como uma proteína induzida por estresse salino em arroz (CLAES et

al., 1990). Posteriormente, foi demonstrado que a expressão desta proteína não está

restrita a resposta a estresses ambientais, sugerindo, desta forma, sua participação

num mecanismo global de resposta da planta (DE SOUZA FILHO et al., 2003).



Evidências bioquímicas demonstraram, ainda, que a proteína SALT exibe

atividade lectina de ligação à mannose. Adicionalmente, foi mostrado que a atividade

lectina é dependente de uma associação não-covalente de dois monômeros de 14,5

kDa (HIRANO et al., 2000; ZHANG et al., 2000). Por se tratar de uma lectina com

apenas um único domínio Jacalina, a proteína SALT pode ser considerada uma

hololectina (lectinas que contém apenas domínios de ligação ao carboidrato), mais

especificamente uma merolectina – lectinas compostas de um único domínio (VAN

DAMME et al., 2008), como mostra a figura 3.

Microarrays de DNA constituem uma das mais poderosas ferramentas

para analisar rapidamente a expressão gênica sob diversas condições ambientais,

bem como em diferentes tecidos de uma planta (SUDO et al., 2008). Com o início dos

projetos de seqüenciamento do arroz, surgiram diversos projetos de microarrays em

arroz e, até 2004, mais de 600 experimentos em 25 condições fisiológicas já haviam

sido realizados (TYAGI et al., 2004).

A proteômica, outra ferramenta de extrema importância, tornou-se uma

metodologia essencial para a análise em larga-escala de proteínas em muitos

campos da biologia de plantas (PANDEY e MANN, 2000). Assim, combinada à

disponibilidade de dados de seqüências do genoma, ela tem aberto enormes

possibilidades para identificar o grupo total de proteínas expressas, assim como

mudanças no perfil de expressão, durante o crescimento e desenvolvimento e em

resposta a estímulos bióticos e abióticos (YANG et al., 2005). Neste contexto,

diversos trabalhos têm se dedicado à construção de proteomas e caracterização

funcional das proteínas expressas em arroz, seja em tecidos, tais como

folha,embrião, endosperma, raiz, caule, broto e calos (KOMATSU et al., 1993; ZHONG

et al., 1997; KOMATSU et al., 1999a,b; TSUGITA et al., 1994; SHEN et al., 2002; IMIN et

al., 2001; KOLLER et al., 2002; TANAKA et al., 2004a), ou em organelas, como

complexo de Golgi, mitocôndria, e outros compartimentos celulares (MIKAMI et al.,

2001; HEAZLEWOOD et al., 2003; TANAKA et al., 2004b).

A expressão do gene salT e o acúmulo da proteína SALT puderam ser

detectados em inúmeros destes trabalhos, tanto naqueles de análise de microarray e

northern blotting, quanto nos de estudos proteômicos e western blotting, que

analisaram diversos cultivares de arroz sob diferentes condições fisiológicas e entre

diferentes tecidos. Sendo assim, a tabela 1 se refere aos trabalhos encontrados,

bem como os estresses e condições de cultivos, onde houve a expressão do gene



Figura 3. Ilustração da lectina SALT e seu domínio Jacalina. O esquema, gerado

através do banco de dados de Domínio Conservado (Conserved Domain Database

(NCBI): MARCHLER-BAUER et al., 2007 – acessado em 2008) ilustra o único domínio

Jacalina presente na lectina SALT, caracterizando-a como uma merolectina de ligação à

mannose da família das Jacalinas.

salT, enquanto a tabela 2 lista os trabalhos, estresses e condições de cultivo onde a

lectina SALT foi encontrada. Juntas, as tabelas 1 e 2 reúnem todos os trabalhos

publicados até 2008 que apontam a expressão do gene salT, bem como o acúmulo

da lectina SALT, quando plantas de arroz são submetidas à diversos tipos de

estresses ambientais, tais como salinidade (sais MS, NaCl, KCl), seca, calor, frio,

metais pesados (arsênico, cobre), baixos níveis de nitrogênio, ferimentos,

fitormônios (ABA, JA, SA e ET), entre outros.

Em estudos acerca da região promotora do gene salT, GARCIA (1993) revelou

a presença de um íntron de 609 pb, nomeado íntron salT, situado entre 1117 pb e

1725 pb. Adicionalmente, foi detectada a presença de elementos de transposição

das famílias Castaway e Stowaway na região 5’ flanqueadora do gene salT.

Somente nove pares de bases separam tais transposons, presentes na região

promotora deste gene (BUREAU e WESSLER, 1994; NELSON et al., 1994; BUREAU et al.,

1996). Desta forma, entre o elemento móvel Stowaway e o íntron salT encontra-se

uma região que compreende 256 pb. A Figura 4 mostra um esquema ilustrativo do

promotor do gene salT.



Íntron salTRegião 256 pbCastaway Stowaway

1 332 695 705 860 1116 1725


1 332 695 705 860 1116 1725

Figura 4. Esquema ilustrativo do promotor do gene salT. A região de 256 pb está

compreendida entre 861 pb e 1116 pb e o íntron salT localiza-se entre 1117 pb e 1725

pb. Castaway e Stowaway são elementos de transposição presentes na região

promotora salT.

Uma característica predominante na regulação da transcrição é a ligação de

proteínas regulatórias, os chamados fatores de transcrição, a sítios de ligação ao

DNA conhecidos como sítios de ligação de fatores de transcrição ou elementos

regulatórios. A identificação computacional desses sítios de ligação ao DNA através

da análise de seqüências de DNA em banco de dados tem sido, na última década, a

principal técnica utilizada na elucidação de vias regulatórias da transcrição

(THOMPSON et al., 2003).

Os elementos regulatórios são pequenos motivos conservados de

aproximadamente 5 a 20 nucleotídeos. A detecção desses motivos no promotor não

é precisa, porque estatisticamente espera-se encontrar essas pequenas seqüências

aleatoriamente a cada poucas centenas de pares de bases. Portanto, o principal

problema consiste em distinguir os elementos regulatórios falsos dos verdadeiros

(BLANCHETTE & SINHA, 2001). Comparada aos motivos desconhecidos, a detecção de

motivos conhecidos é mais favorável e consiste no rastreamento de seqüências de

DNA em bancos de dados especializados como TRANSFAC (WINGENDER et al.,

1996) e TFD (GHOSH, 2000), bem como em bancos de dados específicos para

plantas como OSIRIS (MORRIS et al., 2008), PLACE (HIGO et al., 1999) e PlantCARE

(LESCOT et al., 2002).



O OSIRIS (http://www.bioinformatics2.wsu.edu/cgi-bin/Osiris/cgi/home.pl),

escolhido para as análises realizadas nesse trabalho, é um banco de dados

integrados de promotores exclusivamente de O. sativa que contém, além de

diversas outras informações, seqüências de promotores, baseadas na anotação do

genoma do arroz, e sítios de ligação para fatores de transcrição já previamente

descritos. Com a integração de diversas ferramentas, o website OSIRIS fornece

uma compreensiva plataforma para análises de promotores, permitindo ao usuário

visualizar sítios de ligação para fatores de transcrição em múltiplos promotores, além

de outros tipos de análises (MORRIS et al., 2008). Portanto, análises in silico têm

demonstrado ser uma alternativa privilegiada de aumentar o conhecimento sobre o

promotor de forma mais rápida e com menores custos, especialmente em plantas

(ROMBAUTS et al., 2003). Nesse sentido, a análise in silico da região promotora do

gene salT torna-se de extrema relevância na elucidação dos possíveis elementos

regulatórios em cis presentes na mesma.

Além disso, outro ponto fundamental no estudo da regulação gênica

consiste em avaliar a influência do íntron do gene salT na regulação da transcrição,

já que vários trabalhos sugerem a participação de íntrons na expressão de genes.


http://www.bioinformatics2.wsu.edu/cgi-bin/Osiris/cgi/home.pl


Tabela 1. Expressão do gene salT em plantas de arroz em relação às condições e tempo de estresse, idade, tecido e cultivar utilizado.

1% de sais MS, 3 dias. Bainha de arroz. Indica cv. Taichung Native 1. CLAES et al., 1990

1% de sais MS, 3 dias. Raízes de arroz. Indica cv. Taichung Native 1. CLAES et al., 1990 Sais MS

1% de sais MS, 6 h, 2 dias e 4 dias. Bainha de arroz. Indica cv. Taichung Native 1. CLAES et al., 1990

1% de NaCl, 7 dias. Lâmina foliar de plântulas de arroz. Indica cv. Taichung Native 1. CLAES et al., 1990

1% de NaCl, 7 dias. Bainha de plântulas de arroz. Indica cv. Taichung Native 1. CLAES et al., 1990

100, 125 e 200 mM de NaCl, 24 h. Raízes de plantas com 12 dias. Indica cv. Taichung Native 1. MOONS et al., 1997

100, 125 e 200 mM de NaCl, 24 h. Bainha de plantas com 12 dias. Indica cv. Taichung Native 1. MOONS et al., 1997

1% de NaCl, 10 dias. Segmentos de 1 cm da base da bainha de plantas com 14 dias. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1998

1% de NaCl, 10 dias. Folhas jovens, em expansão, de plantas com 14 dias. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1998

1% de NaCl, 3 dias. Folhas completamente expandidas de plantas com 6 semanas. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1998

1% de NaCl, 3 dias. Folhas jovens de plantas com 3 semanas. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1998

0.5% de NaCl, 3 dias. Cultura de células de arroz em suspensão. Indica cv. Pelita I/I. GARCIA et al., 1998

0.5% de NaCl, 1 semana. Bainha de plantas com 4 semanas. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1998

250 mM de NaCl, 1, 2, 5, 10 e 24 h. Plantas com 2 semanas. cv. Nipponbare. RABBANI et al., 2003

150 mM de NaCl, 24 h. Raízes de plantas com 6 a 7 dias. cv. Pokkali e cv. PB 1. SAHI et al., 2003

250 mM de NaCl, 2, 4, 8 e 12 h. Cultura de células de arroz em suspensão. cv. Jinheung. KIM et al., 2004

NaCl

140 mM de NaCl, 20 min, 3 h, 24 h. Plantas com 12 dias. Indica cv. Nona Bokra (salt-tolerant) e IR28 (salt-susceptible). CHAO et al., 2005

NaCl + CaCl2

NaCl e CaCl2 (5:1 M), 3 dias. Plantas com 9 a 10 dias antes da iniciar a formaçao da panícula. Indica cv. IR29. WALIA et al., 2007

0.5% de NaCl + 1,5 ou 10 μM de GA3, 1 semana. Bainha de plantas com 4 semanas. cv. Taichung Native 1.

GARCIA et al., 1998 NaCl +

GA3 0.5% de NaCl + 5 ou 10 μM GA3, 1 semana. Lâmina foliar de plantas com 4 semanas. cv. Taichung Native 1.

GARCIA et al., 1998

KCl 1% de KCl, 7 dias. Bainha de plântulas. Indica cv. Taichung Native 1. CLAES et al., 1990



Tabela 1. (continuação)

Desidratação (ar), 0.5, 1 e 4 h. Raízes. cv. Taichung Native 1. CLAES et al., 1990

Desidratação (ar), 3.5 h. Bainha. Indica cv. Taichung Native 1. CLAES et al., 1990

Desidratação (5% de PEG), 3 dias. Bainha. Indica cv. Taichung Native 1. CLAES et al., 1990

Desidratação (ar), 3.5 h. Raízes. Indica cv. Taichung Native 1. CLAES et al., 1990

Desidratação (5% de PEG), 3 dias. Raízes. Indica cv. Taichung Native 1. CLAES et al., 1990

Desidratação, 2, 5, 10 e 24 h. Plantas com 2 semanas. cv. Nipponbare. RABBANI et al., 2003

Seca

Desidratação (15% de PEG), 9 h. Folhas. cv. IRAT109 (resistente a estresse hídrico). WANG et al., 2007

Choque térmico de 24°C para 37°C, 3 dias. Lâmina foliar. cv. Taichung Native 1. CLAES et al., 1990

Choque térmico de 24°C para 37°C, 3.5 h e 3 dias. Bainha, cv. Taichung Native 1. CLAES et al., 1990

Choque térmico de 24°C para 37°C, 3.5 h e 3 dias. Raízes. cv. Taichung Native 1. CLAES et al., 1990

Calor

33°C para 28°C. Grãos de 10 dias após florescimento. Japonica cv. Nipponbare. YAMAKAWA et al., 2007

4°C, 1, 2, 5, 10 e 24 h. Plantas com 2 semanas. cv. Nipponbare. RABBANI et al., 2003

Frio 10°C, 24 h. Brotos de plantas com 8 a 10 dias. Japonica cv.

CT6748-8-CA-17 (tolerante a frio). CHENG et al., 2007

Escuro Plantas mantidas no escuro por 3 a 4 dias (senescência induzida por escuridão). Folhas. Japonica cv. Tainong 67. LEE et al., 2001

Nitrogênio (baixo nível)

1,44 mM de NH4NO3 (controle) e 0.24 mM de NH4NO3 (tratamento), 20 min, 1 h e 2 h. Raízes. Indica cv. Minghui 63. LIAN et al., 2006

Ácido ascórbico

20 mM de Ácido ascórbico, 3 dias. Plantas com 10 a 14 dias. cv. Nipponbare.

TOKUNAGA e ESAKA, 2007

Falta de sacarose

Meio de cultura sem sacarose, 2 dias. Cultura de células de arroz em suspensão com 5 dias. cv. Tainan 5. TSENG et al., 1995

Cobre 10 μM, 45 μM e 130 μM de CuCl2, 24–30 h. Plantas com 6-7 semanas. cv. Nipponbare.

SUDO et al., 2008



Tabela 1. (continuação) 1, 5 e 10 de mM prolina, 10 dias. Plantas com 4 dias. cv.

Taichung Native 1. GARCIA et al., 1997

50, 100 e 200 mM de prolina, 10 dias. Bainha de plantas com 4 dias. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1997 Prolina

100 e 200 mM de prolina, 10 dias. Lâmina foliar de plantas com 4 dias. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1997

10 mM de prolina (+ 1% de NaCl), 10 dias. Bainha de plantas com 4 semanas. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1997

5 mM de prolina (+ 1% de NaCl), 10 dias. Lâmina foliar de plantas com 4 dias. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1997

1, 5 e 10 mM de prolina (+ 1% de NaCl), 10 dias. Lâmina foliar de plantas com 4 dias. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1997

5 e 10 mM de proline (+ 1% de NaCl), 10 dias. Bainha de plantas com 4 semanas. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1997

1, 5 e 10 mM de proline (+ 1% de NaCl), 10 dias. Bainha de plantas com 4 dias. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1997

50, 100 e 200 mM de proline (+ 1% de NaCl), 10 dias. Bainha de plantas com 4 dias. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1997

Prolina (+ NaCl)

100 e 200 mM de proline (+ 1% de NaCl), 10 dias. Lâmina foliar de plantas com 4 dias. cv. Taichung Native 1. GARCIA et al., 1997

Etileno 1 mM de ethephon (precursor de etileno), 1, 2, 4, 8 e 12 h. Cultura de células de arroz em suspensão. cv. Jinheung. KIM et al., 2004

20 μM de ABA, 3 dias. Bainha. Indica cv. Taichung Native 1. CLAES et al., 1990

0,4 e 20 μM de ABA, 3 dias. Raízes. Indica cv. Taichung Native 1.

CLAES et al., 1990

3, 9, 10, 20 e 40 μM de ABA, 24 h. Bainha de plantas com 12 dias. Indica cv. Taichung Native 1.

MOONS et al., 1997

3 e 9 μM de ABA, 24 h. Raízes de plantas com 12 dias. Indica cv. Taichung Taichung Native 1.

MOONS et al., 1997

9 μM de ABA, 4 e 8 h. Raízes de plantsa com 12 dias. Indica cv. Taichung Native 1.

MOONS et al., 1997

10 μM de ABA, 3 dias. Cultura de células de arroz em suspensão. Indica cv. Pelita I/I.

GARCIA et al., 1998

10 μM de ABA, 1 semana. Bainha de plantas com 4 semanas. cv. Taichung Native 1.

GARCIA et al., 1998

100 μM de ABA, 1, 2, 5, 10 e 24 h. Plantas com 2 semanas. cv. Nipponbare.

RABBANI et al., 2003

0,2 mM de ABA, 2, 4, 8 e 12 h. Folhas e cultura de células de arroz em suspensão. cv. Jinheung. KIM et al., 2004

0,05, 0,1 e 0,2 mM de ABA, 4 h. Cultura de células de arroz em suspensão. cv. Jinheung. KIM et al., 2004

ABA

100 μM de ABA, 24 h. Broto de plantas com 8-10 dias. Japonica cv. CT6748-8-CA-17 (tolerante a frio).

CHENG et al., 2007




1, 3 e 9 μM de JA, 24 h. Raízes de plantas com 12 dias. Indica cv. Taichung Native 1.

MOONS et al., 1997

3 e 9 μM de JA, 24 h. Bainha de plantas com 12 dias. Indica cv. Taichung Native 1.

MOONS et al., 1997

9 μM de JA, 6 e 8 h. Raízes de plantas com 12 dias. Indica cv. Taichung Native 1.

MOONS et al., 1997

0,2 mM de JA, 0.5, 1 e 2 h. Folhas de plantas com 2 semanas. Japonica cv. Drew. XIONG et al., 2001

Ácido jasmônico

0,25 mM de JA, 2, 4, 8 e 12 h. Folhas e cultura de células de arroz em suspensão. cv. Jinheung. KIM et al., 2004

1 μg/mL N-acetilchitooctaose, 2 h. Cultura de células de arroz em suspensão. cv. Nipponbare.

AKIMOTO-TOMIYAMA et al., 2003

Elicitor fúngico 50 μg/mL de micélio do fungo Magnaporthe grisea race KJ401 (avirulento ao cultivar Jinheung), 2, 4, 8 e 12 h.

Cultura de células de arroz em suspensão. cv. Jinheung. KIM et al., 2004

Pyricularia grisea (fungo), 1, 2, 3 e dias após infecção. Folhas de plantas com 2 semanas. Japonica cv. Drew. XIONG et al., 2001

Inoculação com microrganismo Striga hermonthica (parasita de raiz), 2, 4 e 11 dias após

infecção. Plantas com 21 dias. Japonica cv. IAC 165. SWARBRICK et al., 2008

Cultura de células de arroz em suspensão, entrando na fase logarítmica de crescimento. Indica cv. Pelita I/I. GARCIA et al., 1998

Cultura de células de arroz em suspensão, fase estacionária. Indica cv. Pelita I/I. GARCIA et al., 1998

Cultura de células de arroz em suspensão, 3 e 5 dias. Indica cv. Pelita I/I. GARCIA et al., 1998

Plantas com 5 dias. cv. Sasanishiki MATSUMURA et al., 1999

Anteras de arroz. cv. Hayayuki. YAMAGUCHI et al., 2004

Pistilos, 0–5 h após polinização. cv. Indica. LAN et al., 2004

Condição Fisiológica

Anteras de arroz. cv. Hayayuki. YAMAGUCHI et al., 2007



Tabela 2. Acúmulo da proteína SALT em plantas de arroz em relação às condições e tempo de estresse, idade, tecido e cultivar utilizado.

Sais MS 1% de sais MS, 4 dias. Raízes de plantas com 8 semanas. Indica, cv. Taichung native 1. CLAES et al., 1990

175 mM de NaCl, 60 h. Raízes de plantas com 12 dias. Indica cv. Taichung Native 1. MOONS et al., 1997

170 mM de NaCl, 24 h. Bainha de plantas com 14 dias. cvs. Taichung Native 1, IAC 4440, IAC 201, Pesagro 104, Cica 08, Metica 01, Norin Mochi, Mogami chicanari, Guarani, Tomeo

Mochi and Araguaia.

DE SOUZA FILHO et al., 2003

170 mM de NaCl, 24 h. Bainha. cv. Taichung Native 1. BRANCO et al., 2004

150 mM de NaCl, 10 h. Raízes de plantas com 20 dias. cv. Nipponbare. CHITTETI e PENG, 2007

NaCl

150 mM de NaCl, 24 h. Raízes de plantas com 20 dias. cv. Nipponbare. CHITTETI e PENG, 2007

KCl 170 mM de KCl, 24 h. Bainha de plantas com 14 dias. DE SOUZA FILHO et al., 2003

Desidratação, 24 h. Bainha de plantas com 14 dias. DE SOUZA FILHO et al., 2003

Desidratação, 24 h. Bainha. cv. Taichung Native 1. BRANCO et al., 2004

Desidratação, 2, 4, 5, e 6 dias. Bainha de plantas com 2 semanas. cv. Nipponbare. ALI e KOMATSU, 2006

Desidratação (300 mM de manitol), 2 dias. Bainha de plantas com 2 semanas. cv. Nipponbare. ALI e KOMATSU, 2006

Seca

Desidratação, 2 dias. Folhas de plantas com 2 semanas. cv. Nipponbare. ALI e KOMATSU, 2006

Calor 42°C, 24 h. Bainha de plantas com 14 dias. DE SOUZA FILHO et al., 2003

Arsênico 50 e 100 mM de arsenato de sódio (Na2HAsO4.7H2O), 4 dias. Raízes de plantas com 2 semanas. cv. Dongjin. AHSAN et al., 2008

20 e 40 μM de ABA, 60 h. Raízes de plantas com 12 dias. Indica cv. Taichung Native 1.

MOONS et al., 1997

20 μM de ABA, 24 h. Bainha de plantas com 14 dias. DE SOUZA FILHO et al., 2003

100 μM de ABA, 12 h. Raíz e parte aérea de plantas com 2 semanas. cv. Nipponbare.

HASHIMOTO et al., 2004

50 μM de ABA, 48 h. Parte aérea de plantas com 2 semanas. cv. Nipponbare.

RAKWAL e KOMATSU, 2004

ABA

10 μM de ABA, 48 h. Segmentos de raiz de plantas com 12 dias. cv Nipponbare.

KONISHI et al., 2005



Tabela 2. (continuação) 10 e 20 μM de JA, 60 h. Raízes de plantas com 12

dias. cv. Taichung Native 1. MOONS et al., 1997

250 mM de JA, 24 e 48 h. Cultura de células de arroz em suspensão. cv. Jinheung. KIM et al., 2003

100 μM de JA, 3 dias. Raízes de plantas com 20 dias. Indica cv. IR36.

MICHÉ et al., 2006

Ácido jasmônico

100 μM de JA, 3 dias. Raízes de plantas com 20 dias. Indica cv. IR42.

MICHÉ et al., 2006

Ferimento (vários pontos de lesão mecânica ao longo da lâmina foliar e bainha), 24 h. Bainha de plantas com

14 dias. DE SOUZA FILHO et al., 2003

Ferimento Ferimento (lesão mecânica na parte aérea da planta), 12, 24 e 48 h. Parte aérea de plantas com 2 semanas.

cv. Nipponbare. SHEN et al., 2003

Elicitor fúngico

50 mg/mL de micélio de Magnaporthe grisea, cepa KJ401 (avirulenta ao cv. Jinheung), 24 e 48 h. Cultura

de células de arroz em suspensão. cv. Jinheung. KIM et al., 2003

Magnaporthe grisea cepa 70-15 (fungo), 48 h. Plântulas de arroz. cv. Nipponbare. KIM et al., 2001

Magnaporthe grisea cepa KJ401 (fungo), 24 e 48 h após infecção. Cultura de células de aroz em

suspensão. cv. Jinheung. KIM et al., 2003

Magnaporthe grisea cepa KJ401 (fungo), 48 h após infecção. Inoculação de tecido vascular de folhas. cv.

Jinheung. KIM et al., 2004

Rice yellow mottle virus (RYMV), 7 dias após infecção. Cultura de células de arroz em suspensão. Indica cv.

IR64 (susceptível a RYMV). VENTELON-DEBOUT et al., 2004

Azoarcus sp. cepa BH72 (BHGN3.1). Inoculação bacteriana em raízes de plantas com 20 dias. Indica cv.

IR36 (susceptível). MICHÉ et al., 2006

Inoculação com

microrganismo

Azoarcus sp. strain BH72 (BHGN3.1). Bacterial inoculation of 20-day-old rice roots. Indica cv. IR42

(moderately resistant). MICHÉ et al., 2006

Parte aérea com 3 cm de comprimento (bainha e folha) de plantas com 2 semanas. cv. Nipponbare. SHEN et al., 2002

Sementes com 7, 12, 18, 24 e 35 dias após florescimento. DE SOUZA FILHO et al., 2003

Parte aérea de plantas com 2 semanas. cv. Nipponbare KOMATSU et al., 2003

Condição Fisiológica

Sementes com 0, 12, 24, 48 e 72 h após inibição da germinação. Indica cv. 9311. YANG et al., 2007



1.5 – A influência de íntrons na regulação da expressão gênica

A habilidade de íntrons em aumentar a expressão de genes tem sido bem

documentada em vários organismos, incluindo mamíferos (BUCHMAN e BERG, 1988;

CHUNG e PERRY, 1989), insetos (MEREDITH e STORRI, 1993), nematóides (OKKEMA et

al., 1993) e plantas (CALLIS et al., 1987; LUEHRSEN e WALBOT, 1991; ROSE e LAST,

1997). Esse efeito é conhecido como aumento da expressão de genes mediado por

íntron (IME, do inglês “intron-mediated enhancement”) (MASCARENHAS et al., 1990).

Em plantas, estima-se que cerca de 80% dos genes nucleares contém

íntrons (GOODALL et al., 1991; INITIATIVE et al., 2000; REDDY, 2001), e já foi mostrado

que diversos deles aumentam a expressão gênica (SAMADDER et al., 2008). A

eficiência do IME difere em espécies de monocotiledôneas e dicotiledôneas (KOZIEL

et al., 1996). Sabe-se que íntrons que estimulam a expressão em monocotiledôneas

incluem os íntrons dos genes de milho Adh1, Sh1, Bz1, Hsp82, actina e GapA1

(CALLIS et al., 1987; LUEHRSEN e WALBOT, 1991; MAAS et al., 1991; SINIBALDI e

METTLER, 1992; DONATH et al., 1995) e de arroz salT, Act1 e tpi (MCELROY et al.,

1990; XU et al., 1994; RETHMEIER et al., 1997). Similarmente, íntrons de

dicotiledôneas que elevam a expressão incluem os íntrons dos genes SSU301 de

petúnia rbcS (DEAN et al., 1989), ST-LS1 de batata (LEON et al., 1991) e os genes de

Arabidopsis UBQ3, UBQ10, PAT1, atpk1, A1 EF-1α, e At eEF-1β (CURIE et al., 1993;

NORRIS et al., 1993; ZHANG et al., 1994; GIDEKEL et al., 1996; ROSE e LAST, 1997). A

intensidade do IME pode ser maior que 100 vezes (MAAS et al., 1991; ZHANG et al.,

1994), porém é mais comum na faixa entre 2 e 10 vezes e é tipicamente maior em

monocotiledôneas que em dicotiledôneas (SIMPSON e FILIPOWICZ, 1996; ROSE e

BELIAKOFF, 2000; CLANCY e HANNAH, 2002; ROSE, 2002). Em plantas, a inclusão de

um ou mais íntrons em construções genéticas, geralmente, acarreta o aumento do

acúmulo de mRNA e proteínas comparado a construções similares onde faltam

íntrons (KOZIEL et al., 1996; SIMPSON e FILIPOWICZ, 1996).

Estudos em células animais revelaram que o aumento mediado por íntron

é alcançado através de um mecanismo combinatório que aumenta a transcrição, o

acúmulo de mRNA e a tradução (FURGER et al., 2002; NOTT et al., 2003, 2004) mas



que, por outro lado, não afeta substancialmente a estabilidade do mRNA (NOTT et

al., 2003; SAMADDER et al., 2008). Sabe-se que o IME é dependente tanto da posição

quanto da seqüência do íntron (BOURDON et al., 2001; CLANCY e HANNAH, 2002;

ROSE, 2002, 2004), porém, muito pouco é conhecido sobre o mecanismo de tal

aumento, e diferentes íntrons devem afetar a expressão por diferentes maneiras

(ROSE e BELIAKOFF, 2000).

Evidências sugerem que os íntrons atuam pós-transcricionalmente,

aumentando o nível de mRNA por facilitar a maturação e aumentar a estabilidade de

transcritos nascentes (ROSE, 2004). Uma sugestão para essa função pós-

transcricional é provido pelos achados que os íntrons devem estar contidos dentro

de seqüências transcritas e na orientação apropriada para elevar a expressão do

gene (CALLIS et al., 1987; MASCARENHAS et al., 1990; CLANCY et al., 1994; DONATH et

al., 1995; DEAN et al., 1989; ROSE e LAST, 1997), diferentemente dos enhancers

transcricionais, que geralmente são independentes de posição e orientação (CALLIS

et al., 1987; MASCARENHAS et al., 1990; SNOWDEN et al., 1996).

Alguns trabalhos sugerem que o IME requer o splicing do íntron, porém,

esta ainda é uma questão a ser esclarecida (SINIBALDI e METTLER, 1992; SULLIVAN e

GREEN, 1993; LUEHRSEN e WALBOT, 1994; ROSE e BELIAKOFF, 2000). Outros autores

tentam explicar o mecanismo de IME avaliando características necessárias ao

íntron. Desta forma, a partir de deleções feitas em sua seqüência, foi visto que a

maioria das seqüências dos íntrons é dispensável para o IME (CLANCY et al., 1994;

LUEHRSEN e WALBOT, 1994; ROSE e BELIAKOFF, 2000). Percebe-se assim, que são

inúmeros os trabalhos que sugerem, de alguma forma, uma importante participação

de íntrons na regulação da expressão gênica. Portanto, para uma avaliação mais

acurada acerca da regulação do gene salT, torna-se interessante analisar o grau de

influência que íntron salT exerce sobre a atividade do promotor do gene salT. Para

tanto, faz-se necessário uma comparação entre os níveis de expressão

apresentados pelo íntron salT e por outro íntron cuja capacidade de aumentar a

expressão já foi amplamente caracterizado na literatura, como o íntron Act1 de

arroz.



2. OBJETIVOS

O presente trabalho teve como objetivo geral caracterizar funcionalmente

a região regulatória e estudar a influência do íntron salT na regulação do gene salT

de arroz (Oryza sativa L.). Para tanto, foram concluídos os seguintes objetivos

específicos:

2.1 – Estudo da influência dos elementos de transposição Castaway e Stowaway

sobre a atividade do promotor do gene salT de O. sativa. Foram determinados quais

os cultivares possuíam tais inserções, e o nível de indução do gene salT na bainha

destes cultivares foi mensurado através de ensaios de PCR em Tempo Real.

Adicionalmente, foi avaliado o perfil de acúmulo da proteína SALT nos diferentes

cultivares através de western blotting.

2.2 – Identificação de sítios de ligação para fatores de transcrição presentes na

região de 256 pb do promotor do gene salT através de análises in silico no banco de

dados de promotores de arroz OSIRIS.

2.3 – Construção de três vetores de expressão em plantas induzidos por estresses

ambientais contendo as fragmentos “Região de 256 pb”, “Região de 256 pb + Íntron

salT” e “Região de 256 pb + Íntron Act1”.

2.4 – Estudo da influência do íntron salT sobre a atividade promotora da região de

256 pb através da análise de expressão transiente do gene GUS em tecido foliar de

Arabidopsis thaliana.

2.5 – Análise do perfil transcricional do gene salT em diferentes tecidos de O. sativa

através de ensaios de microarrays desenvolvidos pelo banco de expressão da

Universidade de Yale. O perfil transcricional do gene salT em tecidos e tipos

celulares de embrião, broto, lâmina foliar e raiz foi avaliado por Northern eletrônico.



3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 – Materiais Utilizados

- Para obtenção da seqüência completa do gene salT de arroz foi utilizado o banco

internacional de seqüências NCBI (National Center for Biotechnology Information,

www.ncbi.nlm.nih.org). Para a demonstração do domínio Jacalina, foi utilizado o

Banco de Dados de Domínios Conservados do NCBI (Conserved Domain Database,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml). A identificação de sítios de

ligação de fatores de transcrição foi realizada utilizando o banco de dados OSIRIS

(http://www.bioinformatics2.wsu.edu/cgi-bin/Osiris/cgi/home.pl) e o perfil

transcricional do gene salT foi analisado em diversos tecidos e tipos celulares de

arroz através do Centro Virtual da Universidade de Yale para o Perfil de Expressão

Celular em Arroz (Yale Virtual Center for Cellular Expression Profiling of Rice Yale

Project, http://bioinformatics.med.yale.edu/riceatlas/overview.jspx);

- As plantas de arroz (O. sativa) utilizadas nos ensaios de extração de DNA

genômico, RNA e proteína, foram germinadas e cultivadas na casa de vegetação do

Laboratório de Biotecnologia (CBB/UENF). Foram utilizadas sementes dos cultivares

Cica 8, Guarani, IAC 201, IAC 4440, Metica-1, Minami Hata Mochi e Taichung Native

1 (TN1). Todas as sementes foram gentilmente cedidas pelo Centro Nacional de

Pesquisa Arroz e Feijão – EMBRAPA (Goiânia, GO, Brasil);

- As plantas de Arabidopsis thaliana L. (Heyn), ecótipo Wassilewskija, utilizadas nos

ensaios de expressão transiente do gene GUS foram germinadas e cultivadas em

câmara de cultivo no Laboratório de Biotecnologia (CBB/UENF). As sementes

utilizadas foram obtidas em colaboração com INRA-Versailles (França);

- A bactéria Escherichia coli linhagem DH5α foi utilizada nos trabalhos de

transformação e clonagem dos fragmentos de DNA;


http://www.ncbi.nlm.nih.org/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml

http://www.bioinformatics2.wsu.edu/cgi-bin/Osiris/cgi/home.pl

http://bioinformatics.med.yale.edu/riceatlas/overview.jspx


- A bactéria Agrobacterium tumefaciens linhagem LBA 4440 foi utilizada nos ensaios

de eletroporação e transformação transiente de tecido foliar de Arabidopsis thaliana;

- Vetor utilizado como base para a construção dos vetores de expressão foi o

plasmídeo pA19-GUS, gentilmente cedido pelo Dr. Gilberto Sachetto Martins, do

Laboratório de Genética Molecular Vegetal – Departamento de Genética, Instituto de

Biologia, Centro de Ciências e Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro

(UFRJ).

3.2 – Metodologia

3.2.1 – Avaliação dos elementos de transposição Castaway e Stowaway sobre a atividade do promotor do gene salT de O. sativa

3.2.1.1 – Detecção dos transposons Castaway e Stowaway na região do gene salT em diferentes cultivares de arroz através de amplificação por PCR

3.2.1.1.1 – Cultivo das plantas de arroz e realização do estresse

Sementes de arroz dos cultivares Cica 8, Guarani, IAC 201, IAC 4440,

Metica-1, Minami Hata Mochi e Taichung Native 1 foram germinadas e cultivadas em

substrato embebido em solução nutritiva pH 5,8 (YOSHIDA, 1976). A germinação e o

crescimento das plantas ocorreram a 27°C, com fotoperíodo de 16 h de luz e 8 h no

escuro, durante 21 dias. As plantas de arroz, utilizadas para a extração de RNA total

e proteínas, foram transferidas, e permaneceram por 24 h, em potes de vidro

contendo 100 mL da solução nutritiva acrescida, ou não, do agente estressante,

NaCl 1% (170 mM).



3.2.1.1.2 – Extração de DNA genômico de plantas de arroz

Folhas de arroz dos cultivares Cica 8, Guarani, IAC 201, IAC 4440, Metica-

1, Minami Hata Mochi e Taichung Native 1 foram maceradas em nitrogênio líquido.

Em seguida, aproximadamente 0,1 g dos materiais foi transferido para um tubo de

microcentrífuga, onde foi adicionado 1 mL do tampão de extração (100 mM NaCl; 10

mM Tris-HCl pH 7.5; 1 mM EDTA pH 8.0; 1% SDS). Após, as amostras foram

agitadas vigorosamente e centrifugadas por 2 min a 12.000 x g. As fases aquosas

(sobrenadantes) foram coletadas, divididas em dois tubos e a cada um foi

adicionado igual volume de fenol:clorofórmio, seguido de agitação. Os tubos foram

centrifugados por 5 minutos a 10.000 x g e a fase aquosa de cada tubo foi

transferida para outro tubo, no qual foi adicionado 0,1 volume de acetato de sódio

pH 5,2 3 M. As amostras foram misturadas por inversão e, imediatamente após, a

cada tubo foram adicionados 2 volumes de etanol absoluto gelado (ou 1 volume de

isopropanol). Depois de misturados por inversão, os tubos foram incubados por 1 h à

-20°C ou 30 min à -70°C e então centrifugados por 10 min a 12.000 x g. Os

sobrenadantes foram descartados, os sedimentos lavados duas vezes com etanol

70% gelado e, em seguida, os tubos foram centrifugados por 2 min a 12.000 x g. Os

sobrenadantes foram descartados e os sedimentos de DNA secos em estufa a 37°C.

Após secos, os materiais foram ressuspensos em 200 µL de TE-RNAse e incubados

por 1 h a 37°C. As amostras obtidas foram quantificadas usando o sistema Qubit™

(Invitrogen), segundo recomendação do fabricante.

3.2.1.1.3 – Ensaios de amplificação por Reação em Cadeia da Polimerase

(PCR)

Os ensaios de amplificação por PCR foram utilizados na amplificação de

fragmentos correspondentes ao promotor salT inteiro e à região de 256 pb,

adicionada do íntron ou não, com a finalidade de detectar em quais cultivares havia

a presença dos elementos de transposição na região promotora do gene salT.

Adicionalmente, a técnica de PCR foi utilizada para a obtenção dos fragmentos

utilizados na construção dos vetores de expressão.



Desta forma, para o ensaio de PCR foram utilizados 20 ng de DNA

genômico, tampão para enzima Taq DNA Polimerase (10 mM de Tris-HCl pH 9,0 e

50 mM de KCl), 1,5 mM de cloreto de magnésio, 0,4 mM de dNTP, 20 pmoles de

cada oligonucleotídeo seguindo a combinação descrita na tabela 3, 1U de Taq DNA

Polimerase e água ultra pura q.s.p. 25 µL. As condições de amplificação foram: 95°C

por 1 min, 42°C por 1 min e 72°C por 90 seg (1 ciclo) e 95°C por 1 min, 55°C por 1

min e 72°C por 90 seg (39 ciclos). A combinação de primers utilizado em cada

reação está indicada na tabela 3.

Para facilitar a clonagem dos fragmentos obtidos por PCR no vetor pA19-

GUS digerido, foram desenhados iniciadores contendo sítios para enzimas de

restrição. A tabela 4 mostra a seqüência dos iniciadores, e o destaque em azul

corresponde ao sítio de restrição. O iniciador “Gus 5’ Rev” foi utilizado apenas nas

reações de amplificação para a confirmação da clonagem dos insertos nos vetores.

Tal iniciador anela na extremidade 5’ do gene repórter GUS e, dessa forma, o

fragmento amplificado confirma a clonagem do inserto na porção 5’ do gene GUS. A

figura 5 ilustra o local de anelamento e a direção de cada primer no promotor do

gene salT.

Tabela 3. Combinações de primers utilizados nos ensaios de PCR.

Fragmento Par de primers utilizados no PCR Sítios de Restrição

Promotor salT inteiro Bea 01 e Bea 04 Bam ----

Região de 256 pb Pro 250 Eco e Bea 02 Bam EcoRI e BamHI

Região de 256 pb Pro 250 Eco e Bea 02 Xho EcoRI e XhoI

Região de 256 pb + íntron salT Pro 250 Eco e Bea 04 Bam EcoRI e BamHI



Tabela 4. Seqüência dos iniciadores contendo sítios de enzimas de restrição.

Primer Seqüência de nucleotídeos Enzimas

Bea 01 5’ – GAA GAT CTG TAA CGC GTG GTC TTT C – 3’ -

Bea 02 Bam 5’ – CGG GAT CCA CTC TTC GTG GTC GCT TAA AT – 3’ BamHI

Bea 02 Xho 5’ – CCG CTC GAG ACT CTT CGT GGT CGC TTA AAT – 3’ XhoI

Bea 04 Bam 5’ – CGG GAT CCA CTC TGT TTA GTA AAT AC – 3’ BamHI

Pro 250 Eco 5’ – GGA ATT CTA GAG TAG CAT CAC CAG CT – 3’ EcoRI

Gus 5’ Rev 5’ – GAT TTC ACG GGT TGG GGT TTC TA – 3’ -

Bea 01


Pro 250 Bea 04

1 332 695 705 860 1116 1725

Bea 02Bea 01


Pro 250 Bea 04

1 332 695 705 860 1116 1725

Bea 02 Figura 5. Local de anelamento e direção de cada primer no promotor do gene salT. O

esquema ilustrativo mostra a região de anelamento de cada primer utilizado. A combinação

de primers Bea 01 / Bea 04 amplifica o promotor salT inteiro, a combinação Pro 250 / Bea

02 amplifica a Região de 256 pb, e o par Pro 250 / Bea 04 amplifica a Região de 256 pb +

Íntron salT.



3.2.1.2 – Análise do nível de indução do gene salT em cultivares de O. sativa expostos ao estresse salino através de RT-PCR e western blotting

3.2.1.2.1 – Obtenção de RNA total de bainhas de plantas de arroz para

ensaios de RT-PCR

Bainhas de plantas normais e estressadas (NaCl 1%) dos cultivares

Guarani, IAC 201, IAC 4440, Metica-1, Minami Hata Mochi e Taichung Native 1

foram maceradas em nitrogênio líquido e as amostras foram utilizadas para extração

de RNA total. Para tanto, 300 mg de tecido foram utilizados para extração de RNA

com o reagente Trizol (Invitrogen), de acordo com as recomendações do fabricante.

As amostras obtidas foram quantificadas usando o sistema Qubit™ (Invitrogen),

segundo recomendação do fabricante.

3.2.1.2.2 – Síntese de cDNA e ensaio de RT-PCR

Para síntese de cDNA foram utilizados 1 μg de RNA total, 100 pmoles de

poli-T e 250U da enzima SuperScript III (Invitrogen). A reação ocorreu à 50ºC

durante 1 h.

Ensaios de RT-PCR foram realizados utilizando o kit Power SYBR Green

(Applied Biosystems), 3 pmoles de cada oligonucleotídeo, 1 ng de cDNA (obtidos a

partir do RNA total) e 7 μg de BSA (New England Biolabs) em um volume final de 10

μL. As reações foram realizadas em capilares na máquina LightCycler 1.0 (Roche).

Em tais ensaios foram analisado a expressão dos seguintes genes: salT

(SalT-Fw: 5’ – CAG ATC CAT TGC CTT CAA CT – 3’ e SalT-Rev: 5’ – AGA TCA

TAG ACT GGG CCA TG – 3’) e 18S (Rice18s-Fw: 5’ – ATG ATA ACT CGA CGG

ATC GC – 3’ e Rice18s-Rev: 5’ – CTT GGA TGT GGT AGC CGT TT – 3’). O gene

18S foi utilizado como controle interno para normalização da quantidade de amostra

utilizada em cada reação. Os ensaios de RT-PCR foram realizados em dupicada.



3.2.1.2.3 – Obtenção de extrato protéico de bainhas de plantas de arroz

Bainhas de plantas normais e estressadas (NaCl 1%) dos cultivares Cica

8, Guarani, IAC 201, IAC 4440, Metica-1, Minami Hata Mochi e Taichung Native 1

foram maceradas, inicialmente, em nitrogênio líquido e logo depois maceradas

novamente com 500 μL de solução PBS 1x pH 7,2 (0,13 M NaCl; 5 mM Na2HPO4) e

0,1 mM PMSF. As amostras foram transferidas para tubos de microcentrífuga e

centrifugadas a 12000 x g por 10 min. Os sobrenadantes foram transferidos para

novos tubos e estocados a -20°C. As amostras obtidas foram quantificadas usando o

sistema Qubit™ (Invitrogen), segundo recomendação do fabricante.

3.2.1.2.4 – Eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-glicina

Os extratos protéicos foram separados em SDS-PAGE 12,5% (LAEMMLI,

1970). A eletroforese ocorreu durante 2 h a 100 V em 12,5% SDS-PAGE. Os géis

obtidos foram corados pelo método de Azul de Commassie. Para a remoção do

corante não ligado à proteína, os géis foram incubados em solução descorante sob

agitação constante.

3.2.1.2.5 – Ensaios de western blotting

Os extratos protéicos foram separados em SDS-PAGE 12,5% (LAEMMLI,

1970). Em seguida, as proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose,

que foi então bloqueada durante 1 h em tampão TS-20 (10 mM Tris-HCl pH 7,4; 150

mM NaCl; 0,05% Tween-20), contendo 0,3% de leite desnatado, sob agitação. Após

3 lavagens de 5 min com TS-20, a membrana foi incubada durante 1 h em tampão

TS-20, contendo 0,1% de leite desnatado e o anticorpo anti-SALT, na diluição 1:500.

Em seguida, a membrana foi novamente lavada 3 vezes, por 5 min, em TS-20. A

membrana foi incubada durante 2 h em tampão TS-20 contendo 0,1% de leite

desnatado e o anticorpo secundário, anti-coelho IgG conjugado à proteína A

peroxidase, na diluição 1:2000. Após 3 lavagens de 5 min, com a solução TS-20, o

ensaio foi revelado através da incubação da membrana com o tampão de revelação

por DAB (6,5 mL ácido acético 0,1 M; 7,9 mL Na2HPO4 0,2 M; 5,0 mL H2O2 30v

(30% v/v); H2O q.s.p. 25 mL; OPD (orto-fenil-diamina) 10 mg). O anticorpo anti-SALT



foi produzido no Laboratório de Biotecnologia do Centro de Biociências e

Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro pelo

aluno Marcos Vinícius Viana de Oliveira.

3.2.1.3 – Identificação de sítios regulatórios presentes na Região de 256 pb do promotor do gene salT através de análises in silico

O locus correspondente ao gene salT de arroz foi submetido às análises

de visualização de elementos em cis do banco de dados de promotores de arroz

OSIRIS. As regiões para ligação de proteínas regulatórias identificadas dentro da

região de 256 pb do promotor salT foram avaliadas, uma a uma, e as informações

obtidas foram organizadas em uma tabela.

3.2.2 – Avaliação da influência do íntron salT na regulação do gene salT

3.2.2.1 – Construção de vetores de expressão em plantas

3.2.2.1.1 – Cultivo das plantas de arroz.

Metodologia descrita no item 3.2.1.1.1.

3.2.2.1.2 – Extração de DNA genômico de plantas de arroz

Ensaios descritos no item 3.2.1.1.2.

3.2.2.1.3 – Ensaios de amplificação dos fragmentos de interesse por PCR

Ensaios descritos no item 3.2.1.1.3.



3.2.2.1.4 – Restrição enzimática dos fragmentos obtidos por PCR com as

enzimas EcoRI + BamHI e EcoRI + XhoI

Os três fragmentos amplificados nas reações de PCR foram digeridos com

as enzimas de restrição específicas para abrir os sítios de restrição e permitir a

clonagem dos mesmos em seus vetores correspondentes. Sendo assim, os

fragmentos obtidos foram digeridos com as seguintes enzimas: (1) Região de 256

pb – EcoRI e BamHI; (2) Região de 256 pb – EcoRI e XhoI; (3) Região de 256 pb +

Íntron SalT – EcoRI e BamHI. Para reação de digestão dos fragmentos foram

utilizados aproximadamente 300 ng de DNA para 2,5U de cada enzima de restrição,

tampão da enzima para uma concentração final de 1X (33 mM Tris-acetato pH 7,9;

10 mM acetato de magnésio; 66 mM acetato de potássio; 0,1 mg/mL BSA) e água

ultra pura para um volume final de 80 µL. As amostras foram misturadas com auxílio

de uma micropipeta e incubadas em banho à 37ºC durante 1 h.

3.2.2.1.5 – Extração do plasmídeo PA19-GUS de bactérias Escherichia

coli DH5α

Uma colônia isolada de uma placa foi inoculada em 10 mL de meio LB (5 g

de extrato de levedura; 10 g de NaCl; 10 g de triptona; q.s.p. 1 L de água) contendo

50 μg/mL de ampicilina e mantida sob agitação durante 16 h à 37°C. Transcorrido

esse período as células foram coletadas através de centrifugação. O material foi

ressuspenso em 200 μL solução I gelada (50 mM de glicose; 25 mM de Tris-HCl pH

8,0; 10 mM de EDTA pH 8,0) e transferido para um tubo de microcentrífuga. Em

seguida, para lise das células, 400 μL de solução II (0,2 N de NaOH e 1% de SDS)

foram adicionados à amostra e a mesma foi agitada gentilmente por 30 segundos.

Posteriormente, foram adicionados 300 μL de solução III gelada (acetato de potássio

3 M pH 5,2) ao tubo. A amostra foi homogeneizada e incubada em gelo durante 5

min. O material foi centrifugado a 12.000 x g durante 15 min e 600 µL do

sobrenadante transferido para um tubo novo. A esse foram acrescentados 600 μL de

fenol:clorofórmio (1:1), agitado vigorosamente e centrifugado a 12.000 x g durante 2

min. A fase superior foi coletada e o DNA precipitado com igual volume de

isopropanol durante 10 min a temperatura ambiente. O material foi centrifugado a

12.000 x g por 5 min, o sobrenadante descartado e o sedimento lavado com etanol



70%. A amostra foi novamente submetida à centrifugação a 12.000 x g durante 3

min e a fase líquida descartada. Em seguida o DNA foi seco em estufa a 37°C,

ressuspenso em TE-RNase e incubado a 37°C por 1 h. Após esse período a

amostra foi armazenada a -20°C.

3.2.2.1.6 – Restrição enzimática do vetor pA19-GUS com as enzimas

EcoRI + BamHI e EcoRI + XhoI

Para as reações de digestão do plasmídeo pA19-GUS foram utilizados

aproximadamente 300 ng de DNA para 2,5U de cada enzima de restrição, tampão

da enzima (33 mM Tris-acetato pH 7,9; 10 mM acetato de magnésio; 66 mM acetato

de potássio; 0,1 mg/mL BSA) e água ultra pura para um volume final de 80 µL.

O plasmídeo foi digerido com combinações distintas de enzimas de

restrição. Na primeira combinação, o DNA foi tratado simultaneamente com as

enzimas EcoRI e BamHI. Utilizando essa combinação o promotor CaMV 35S e o

íntron Act1 foram liberados, dando origem ao plasmídeo pA19-GUS-1. Na segunda

abordagem, somente o promotor CaMV 35S foi retirado do plasmídeo pA19-GUS, e

para tal, o DNA plasmidial foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI e XhoI,

dando origem ao plasmídeo PA19-GUS-2. As amostras foram misturadas com

auxílio de uma micropipeta e incubadas em banho à 37ºC durante 1 h.

3.2.2.1.7 – Ligação dos fragmentos ao vetor de clonagem

Para reação de ligação foi utilizado o vetor de clonagem pA19-GUS

tratado previamente com enzimas de restrição visando produzir extremidades

compatíveis com os insertos, conforme descrito anteriormente. Dessa forma, foram

feitos três ensaios de ligação: (1) Região de 256 pb EcoRI/BamHI + pA19-GUS

EcoRI/BamHI, (2) Região de 256 pb com íntron salT EcoRI/BamHI + pA19-GUS

EcoRI/BamHI e (3) Região de 256 pb EcoRI/XhoI + pA19-GUS EcoRI/XhoI. O ensaio

foi realizado utilizando a proporção de 1:3 de plasmídeo e fragmento a ser inserido,

tampão de reação da enzima T4 DNA Ligase para uma concentração final de 1X

(300 mM Tris-Hcl pH 7,8, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT e 10 mM ATP) e 3U da

enzima T4 DNA Ligase. O volume da reação foi ajustado para 10 µL com água ultra

pura e a amostra incubada por 16 h à 16ºC.



3.2.2.1.8 – Produção de células competentes de E. Coli DH5α utilizando

cloreto de rubídio

Uma colônia de bactéria isolada de uma placa recente de LB foi inoculada

em 10 mL de meio SOB líquido sem antibiótico (20 g/L de triptona; 5 g/L de extrato

de levedura; 0,585 g/L de NaCl; 0,186 g/L de KCl. Corrigir o pH para 7,0 com KOH).

A cultura foi incubada por 16 h à 37°C sob agitação moderada (250 x g). Após este

período, 1 mL desta cultura foi transferido para 100 mL de meio SOB líquido fresco e

incubado à 37°C sob agitação moderada (250 x g) até atingir densidade celular de

aproximadamente 5 x 107 células/mL (DO600 nm para bactéria DH5α de 0,45 – 0,55

Abs). Após atingir a densidade desejada, a cultura foi transferida para dois tubos de

centrífuga com volume de 50 mL e resfriado por 10 min em gelo. Os tubos foram

centrifugados à 1.500 x g durante 10 min à 4°C e o sobrenadante descartado.

Posteriormente, em cada tubo foi acrescentado 16 mL de solução RF1 gelada (30

mM de acetato de potássio; 100 mM de cloreto de rubídio; 50 mM de cloreto de

manganês; 100 mM de cloreto de cálcio; 15% de glicerol (m/v). Ajustar o pH para 5,8

com ácido acético 0,2 M e esterilizar com filtro de 0,22 µm). A amostra foi agitada

gentilmente à 4ºC até total e uniforme ressuspensão do precipitado. Os tubos foram

novamente centrifugados a 1.500 x g por 10 minutos à 4°C e o sobrenadante

descartado. As células foram ressupensas lentamente em 4 mL de solução RF2 (10

mM de MOPS (3-[N-morpholino] propane-sulfonic acid), 10 mM de cloreto de

rubídio, 75 mM de cloreto de cálcio e 15% de glicerol (m/v). Ajustar o pH para 6,8

com NaOH 2 N e esterilizar com filtro de 0,22 µm) à 4°C até obter-se uma aparência

homogênea. Os tubos foram deixados em gelo por 15 min e alíquotas de 200 µL

foram distribuídas em tubos de 1,5 mL, congeladas em nitrogênio líquido e

armazenadas à -70°C. Todo o processo foi conduzido em condições estéreis.

3.2.2.1.9 – Transformação de E. coli linhagem DH5α

Tubos contendo alíquotas de 200 µL de E. coli DH5α competentes,

armazenadas em freezer à -70ºC, foram mantidas em gelo por 10 min. Em seguida

foram acrescentados, em ambiente esterilizado, 10 µL da reação da ligação. As

mesmas foram agitadas lentamente e submetidas a um choque térmico de 5 min em



gelo, 90 seg à 42ºC e imediatamente transferidas para gelo e mantidas por 3 min.

Posteriormente, foram adicionados 800 µL de meio SOC à amostra (20 g/L de

triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 0,585 g/L de NaCl, 0,186 g/L de KCl e 20 mM

de glicose. Corrigir o pH para 7,0 com KOH) e esta incubada por 30 min à 37ºC.

Após este período, 200 µL da cultura de bactérias foram plaqueadas em meio LB

sólido (10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de NaCl e 15 g/L de

ágar. Corrigir o pH para 7,4 com NaOH) contendo 60 µg/mL de ampicilina. As placas

de cultura foram colocadas invertidas em estufa à 37ºC e mantidas por

aproximadamente 16 h.

3.2.2.2 – Expressão transiente do gene GUS em tecido foliar de A. thaliana

Todos os experimentos desta etapa foram conduzidos em colaboração

com a aluna de iniciação científica Fernanda Barbosa Bueno.

3.2.2.2.1 – Cultivo de plantas de A. thaliana selvagem

As sementes de Arabidopsis thaliana foram resfriadas por pelo menos 48

h em a 4ºC. Em seguida, estas foram hidratadas por 1 h em água esterilizada com

moderadas agitações para uniformizar a embebição. Posteriormente, as sementes

foram desinfetadas através de duas lavagens de 15 min, utilizando 15% hipoclorito

de sódio (v/v) diluído em água esterilizada. Posteriormente, para eliminar o excesso

de hipoclorito de sódio, as sementes foram lavadas 6x com água esterilizada em

ambiente estéril. Ao final do processo, as sementes foram distribuídas em Jiffy Pellet

reutilizado hidratado com água destilada e autoclavado. As plantas foram cultivadas

em câmara de cultivo apropriada a 19°C, com intensidade luminosa de 120 μmol m-

2.s-1, e hidratadas de 15 em 15 dias com solução nutritiva de Hoagland (OSTREM et

al., 1987).



3.2.2.2.2 – Preparação de células eletrocompetentes de A. tumefaciens

linhagem LBA 4440

As bactérias A. tumefaciens que seriam utilizadas nos ensaios de

transformação transiente de tecido foliar de A. thaliana deveriam conter os vetores

de expressão construídos. Para tanto, foi necessário preparar células de A.

tumefaciens eletrocompetentes. Brevemente, 50 mL de células foram cultivadas em

erlenmeyer com chicana (500 mL) até alcançar o meio da fase exponencial em meio

YEB (OD600 nm: 0,6 Abs) e então coletadas por centrifugação a 4°C sob 2.880 x g. As

células foram lavadas 6 x com 40 mL de água ultra pura, sendo mantidas sempre a

4°C. Ao final, as células foram ressuspensas em água ultra-pura em um volume

equivalente a 20x o volume de células obtido.

3.2.2.2.3 – Eletroporação de bactérias A. tumefaciens

Células de A. tumefaciens LBA 4440 eletrocompetentes (50 μL) e 1 μL dos

vetores de expressão (~100 ng) foram misturados, mantidos por 30 minutos a 4°C e,

em seguida, eletroporados a 1,5 kV por 5 ms, usando TransPorator Plus (BTX) em

uma cubeta 0,1 cm (Epicentre). Meio YEB sem antibiótico foi adicionado

imediatamente após o pulso e as células foram incubadas a 28ºC sob agitação

constante. Após 2 h, as células foram plaqueadas em meio YEB sólido,

suplementado com rifampicina (100 μg mL-1) e incubadas à 37°C por 24 h para

seleção dos transformantes. Foram feitos diferentes ensaios de eletroporação para

cada um dos três vetor utilizados.

3.2.2.2.4 – Detecção da expressão do gene GUS em A. tumefaciens

As cepas de A. tumefaciens, contendo as três construções e o plasmídeo

original pA19-GUS, que seriam utilizadas nos ensaios de transformação transiente

de tecido foliar de A. thaliana foram testadas quanto à capacidade de expressar o

gene GUS. Para tanto, foram inoculados 150 μL de cada cepa de A. tumefaciens em

20 mL de meio YEB contendo os antibióticos rifampicina (100 μg mL-1) e ampicilina

(50 μg mL-1), e os frascos foram colocados sob agitação a1500 RPM, a 28°C por 48



h. Após esse tempo, 1 mL de cada cultura crescida foi transferido para tubos de

microcentrífugas e os tubos foram centrifugados a 1000 RPM por 2 min. O

sobrenadante foi descartado e o material precipitado foi ressuspenso em 1 mL do

tampão x-gluc (0,1 mM Fosfato de sódio pH 7,0; 10 mM EDTA pH 8,0; 0,1% (v/v)

Triton X-100; 1 mM K3Fe(CN)6; 2 mM X-gluc; água ultra-pura). Os tubos foram

centrifugados a 1000 RPM durante 2 min, o material precipitado foi novamente

ressuspenso no tampão x-gluc (sem adicioná-lo outra vez) e os mesmos foram

incubados em temperatura ambiente por 24 h.

3.2.2.2.5 – Infecção das diferentes cepas de A. tumefaciens em folhas de

A. thaliana

Para os ensaios que tiveram como objetivo analisar a influência do íntron

salT sobre a atividade do promotor salT foram utilizadas folhas de A. thaliana

infectadas com diferentes cepas de A. tumefaciens. Para tanto, foram inoculados

150 μL de cada cepa de A. tumefaciens em 20 mL de meio YEB contendo os

antibióticos rifampicina (100 μg mL-1) e ampicilina (50 μg mL-1), e os frascos foram

colocados sob agitação a1500 RPM, a 28°C até que a DO600 nm atingisse 1.5. De

cada cultura crescida, 5 mL foram transferidos para tubos estéreis de 15 mL e

centrifugados a 1000 RPM por 10 min. O sobrenadante foi descartado, o material

precipitado de cada tudo foi ressuspenso em 5 mL de Solução de Infecção fresca

(10 mM MgCl2; 10 mM MES; 20 μM Acetoseringona; água ultra pura), e os tubos

foram incubados a 25°C por 3 h. As folhas escolhidas para infecção pertenciam à

parte inferior de plantas de A. thaliana com 28 dias, e foram selecionadas segundo

tamanho e localização semelhantes. Apenas uma folha em cada planta foi utilizada.

A inoculação de 1 mL da solução de infecção ocorreu ao longo da região abaxial da

folha, partindo da ponta até o final do limbo, pressionando a folha contra uma

seringa de 5 mL sem agulha contendo a solução. As plantas com as folhas

infectadas permaneceram isoladas por 48 h, à 25°C. Após este tempo, as folhas

infectadas foram cortadas das plantas e imediatamente submetidas a tratamento

com tampão x-gluc.



3.2.2.2.6 – Detecção da expressão do gene GUS em tecido foliar de A.

thaliana

As folhas infectadas foram cortadas das plantas e imediatamente

transferidas para tubos de 1,5 mL contendo 1 mL de tampão x-gluc fresco (0,1 mM

Fosfato de sódio pH 7.0; 10 mM EDTA pH 8.0; 0,1% (v/v) Triton X-100; 1 mM

K3Fe(CN)6; 2 mM X-gluc; água ultra-pura). Os tubos foram incubados em estufa a

37°C por 20 h. Após isto, as folhas foram retiradas dos tubos e fotografadas.

3.2.2.3 – Análise do perfil transcricional do gene salT em diferentes tecidos de O.

sativa através de northern eletrônico

As análises do nível de transcrição do gene salT em diversos tecidos e

tipos celulares de arroz foi realizada através do Centro Virtual da Universidade de

Yale para o Perfil de Expressão Celular em Arroz (do Yale Virtual Center for Cellular

Expression Profiling of Rice Yale Project,

http://bioinformatics.med.yale.edu/riceatlas/overview.jspx). O locus correspondente

ao gene salT de arroz foi submetido ao campo de procura disponibilizado no website

do banco de dados. As informações geradas pelo banco foi organizada em tabelas,

que receberam cores de acordo com a intensidade do nível de transcrição do gene

no local indicado.




4. RESULTADOS

4.1 – Estudo da influência dos elementos de transposição Castaway e Stowaway sobre a atividade do promotor do gene salT de O. sativa

4.1.1 – Detecção dos transposons Castaway e Stowaway na região promotora do gene salT dos diferentes cultivares de arroz através de amplificações por PCR

A presença de elementos de transposição na região promotora do gene

salT pode ser sugerida a partir de diferenças no tamanho dos promotores de

diferentes cultivares. Desta forma, a amplificação através de PCR do promotor

inteiro, e de partes dele, consiste em uma eficiente estratégia para avaliar e

comparar esta região promotora de cada cultivar.

Com tal finalidade, os ensaios iniciais dedicaram-se à germinação e cultivo

de plantas dos cultivares de arroz Cica 8, Guarani, IAC 201, IAC 4440, Metica-1,

Minami Hata Mochi e Taichung Native 1. Posteriormente, foi realizada a extração do

DNA genômico dos diferentes cultivares. As amostras obtidas foram quantificadas

usando o sistema Qubit™ (Invitrogen) e sua integridade foi avaliada em gel de

agarose 1% (dados não mostrados). Os fragmentos correspondentes ao promotor

do gene salT inteiro e à “região de 256 pb + íntron salT” foram amplificados por

PCR, em todos os cultivares, utilizando o DNA genômico extraído como molde e

uma combinação específica de oligonucleotídeos previamente deduzidos. A tabela 3

(Materiais e Métodos) mostra o par de primers utilizado em cada amplificação por

PCR e a figura 5 (Materiais e Métodos) indica o local de anelamento e a direção de

cada primer no promotor do gene salT.

As amostras foram avaliadas em gel de agarose 1%. A figura 6 apresenta

o resultado da análise do promotor salT inteiro. Através desta análise foi possível

verificar que os cultivares de arroz Cica 8, Guarani, IAC 201, IAC 4440 e Metica-1

possuem promotor salT com tamanho em torno de 1200 pb, e que os cultivares

Minami Hata Mochi e Taichung Native 1 possuem promotores de maior tamanho,



com cerca de 1700 pb, sugerindo a presença dos elementos de transposição nos

dois cultivares cujo promotor apresenta maior tamanho. Com o intuito de certificar

que a diferença no tamanho dos promotores não é inerente a diferenças em outras

regiões do mesmo, foi realizada a amplificação do fragmento que corresponde a

“região de 256 pb + íntron salT”. A figura 7 mostra que todos os cultivares de arroz

analisados possuem tal região com o mesmo tamanho.

2 Kb1.650 pb

1 Kb

1 2 3 4 5 6 7 M

2 Kb1.650 pb

1 Kb

1 2 3 4 5 6 7 M

Figura 6. Visualização eletroforética do resultado da amplificação por PCR do promotor do gene salT nos diferentes cultivares de arroz. O fragmento correspondente ao promotor salT

foi amplificado a partir do DNA molde dos sete cultivares. 1 – Cica

8; 2 – Guarani; 3 – IAC 201; 4 – IAC 4440; 5 – Metica-1; 6 – Minami

Hata Mochi; 7 – Taichung Native 1. M – Marcador de peso

molecular 1 kb Plus DNA Ladder™ (Invitrogen). Todos os géis de agarose mostrados no presente trabalho foram corados com brometo de etídio e correspondem à imagens negativas.



M 1 2 3 4 5 6 7

850 pb650 pb

M 1 2 3 4 5 6 7

850 pb650 pb

Figura 7. Visualização eletroforética do resultado da amplificação por PCR da região de 256 pb + íntron salT nos diferentes cultivares. O fragmento correspondente à região de

256 pb + íntron salT foi amplificado a partir do DNA molde dos sete

cultivares. 1 – Cica 8; 2 – Guarani; 3 – IAC 201; 4 – IAC 4440; 5 –

Metica-1; 6 – Minami Hata Mochi; 7 – Taichung Native 1. M –

Marcador de peso molecular 1 kb Plus DNA Ladder™ (Invitrogen).



4.1.2 – Análise do nível de indução do gene salT em cultivares de arroz expostos ao estresse salino através de ensaios de PCR em Tempo Real

Para avaliar se a atividade do promotor salT, no que diz respeito à sua

capacidade de induzir a transcrição do gene, possui alguma relação com a

presença/ausência dos elementos de transposição na sua região promotora, o nível

de indução deste gene em bainhas de plantas em condições normais e de estresse

salino foi avaliado através de PCR em Tempo Real (RT-PCR).

Com tal finalidade, os ensaios iniciais dedicaram-se à germinação e cultivo

de plantas de arroz dos cinco cultivares sem os transposons no promotor salT – Cica

8, Guarani, IAC 201, IAC 4440 e Metica-1 – e dos dois cultivares com transposons –

Minami Hata Mochi e Taichung Native 1. Com 21 dias de idade, metade das plantas

de cada cultivar foi submetida ao estresse salino (NaCl 1%) durante 24 h. As

amostras de RNA total extraídas da bainha de plantas em condição normal

(controle) e estressadas foram quantificadas usando o sistema Qubit™ (Invitrogen) e

sua integridade foi avaliada em gel de agarose 1% (dados não mostrados), e

posteriormente, tais amostras serviram de molde para a síntese de cDNA.

Adicionalmente, para a realização do RT-PCR são necessários pares de primers

específicos, previamente deduzidos, para a amplificação do gene salT e do gene

18S, cuja expressão não é alterada em diferentes condições fisiológicas (controle

interno). Tais pares de primers foram submetidos a um teste de especificidade a fim

de garantir a ausência de amplificações inespecíficas (dados não mostrados).

O resultado apresentado pela figura 8 demonstra que os cultivares de

arroz que não possuem a inserção de elementos móveis no promotor salT – IAC

201, IAC 4440 e Metica-1 – e os cultivares que possuem tal inserção – Minami Hata

Mochi e Taichung Native 1 – apresentaram diferentes níveis transcricionais do gene

salT em condições de estresse porém, aparentemente, não há correlação entre a

presença dos elementos de transposição e o perfil transcricional do gene salT em

tais condições. Adicionalmente, foi possível observar que os cultivares, cujos

resultados puderam ser avaliados, apresentam diferentes níveis basais de

transcrição do gene salT, indicando a transcrição deste gene mesmo na ausência do

fator estressante. O cultivar Guarani não apresentou indução da transcrição na

situação de estresse, porém apresentou um alto nível transcricional na situação

normal, e o cultivar Cica 8 foi desconsiderado do presente ensaio devido à um



aparente erro nas amostras-controle do controle interno (18S) de uma das réplicas

que inviabilizou tal análise neste cultivar.

0

60

120

180

240

300

360

420

480

540

Guarani IAC 201 IAC 4440 Metica-1 MinamiHataMochi

TaichungNative 1

Nív

el d

e In

duçã

o

Controle Estresse (NaCl 1%)

Figura 8. Análise do nível de indução transcricional do gene salT de arroz através de PCR em Tempo Real das bainhas de diferentes cultivares de arroz. Guarani, IAC 201,

IAC 4440 e Metica-1 – Cultivares cujo promotor do gene salT não possui a inserção dos

elementos de transposição Castaway e Stowaway. Minami Hata Mochi e Taichung Native 1 – Cultivares que não possuem tais elementos de transposição. Os cultivares apresentaram

diferentes níveis transcricionais do gene salT em condições de estresse, mostrando a não

correlação entre a presença dos transposons e o perfil transcricional do gene em estudo.



Parte dos tecidos macerados – bainhas foliares de plantas dos diferentes

cultivares de arroz, na situação controle e estresse (NaCl 1%) – que seriam

utilizados para a extração do RNA total, foi reservada para a obtenção de extrato

protéico total. Após quantificação usando o sistema Qubit™ (Invitrogen), as amostras

de proteína foram utilizadas em ensaios de western blotting com a finalidade de

detectar o nível de acúmulo da proteína SALT nas mesmas amostras utilizadas para

a análise de indução da transcrição do gene salT. Interessantemente, os resultados

obtidos (figura 9) demonstram claramente que os níveis basais (controle) e finais

(estresse) da proteína SALT não refletem os níveis de transcrição do gene salT nas

mesmas situações.

1 2 3 4 5 6

7 8 9 10 11 12 13 14

1 2 3 4 5 6

7 8 9 10 11 12 13 14

Figura 9. Ensaio de western blotting utilizando anticorpo monoclonal contra a proteína SALT de diferentes cultivares de arroz. 1, 3, 5, 7, 9, 11 e 13 – Amostras controles dos

cultivares Cica 8, Guarani, IAC 201, IAC 4440, Metica-1, Minami Hata Mochi e Taichung

Native 1. 2, 4, 6, 8, 10, 12 e 14 – Amostras estressadas por NaCl 1% dos cultivares Cica 8,

Guarani, IAC 201, IAC 4440, Metica-1, Minami Hata Mochi e Taichung Native 1. O anticorpo

anti-SALT foi produzido no LBT/CBB/UENF pelo aluno Marcos Vinícius Viana de Oliveira.

‘



4.2 – Identificação de sítios regulatórios presentes na região de 256 pb do promotor do gene salT através de análises in silico

Com o objetio de analisar a região de 256 pb quanto à presença de

possíveis elementos regulatórios em cis, o nome referente ao gene salT, baseado no

Projeto de Anotação do Arroz, foi submetido ao banco de dados OSIRIS, que reúne

e analisa promotores contidos no genoma de O. sativa (MORRIS et al., 2008). O fato

relevante inicialmente observado foi a detecção da presença do elemento TATA Box

nesta região na posição indicada pela figura 10. Para fins de confirmação deste

importante dado, a mesma seqüência foi submetida a outros bancos de dados de

elementos regulatórios encontrados em promotores de plantas, PlantCARE (LESCOT

et al., 2002) e PLACE (HIGO et al., 1999), que confirmaram a presença de tal sítio na

posição indicada pelo OSIRIS (dados não mostrados).

De acordo com essa informação, os 53 nucleotídeos a partir do sítio de

início da transcrição foram desconsiderados para análise pelo banco e, desta forma,

somente a seqüência de 203 pb que precede o sítio de início da transcrição foi

analisada. O resultado da análise in silico desta região de 203 pb através do banco

de dados OSIRIS revelou a presença de 10 diferentes potenciais sítios de ligação

para fatores de transcrição, como ilustra a figura 10. Dentre estes, foi possível

observar a presença de regiões conservadas para a ligação de proteínas

regulatórias relacionadas à resposta de plantas a estresses ambientais, tais como os

elementos em cis MYB1AT, MYCATERD1, MYCATRD22, MYBCORE (relacionados

à resposta ao estresse provocado pela desidratação), AGC Box (relacionado à

resposta ao etileno) e ACGT Box (sitio de ligação de proteínas bZIP, que participam

de diversos processos nas plantas, como sinalização de estresses). Nenhum

potencial sítio regulatório foi encontrado entre o TATA Box e o ponto inicial da

transcrição. Informações adicionais sobre os sítios de ligação de fatores de

transcrição presentes na seqüência de 203 nucleotídeos, encontrados pelo banco de

dados OSIRIS, são descritos na tabela 5.



TAGCACTCACCAGCTTGTCAAAAACCAAGGCTTGGTGACGGCGGCT

TCAGAATGAAGGATAGATGGATAAATGTCTAGAATATTATAAAGTCC

AACAAAAGATGGAGCACATGCATGAAAGATTACGTACACGAATG

CAGGTGATACAGTGGATGTTAGGCATAAGAAGCACTATAAATAGAG

GGTGCAATCCCCATTGCCCTACACAACTACACAAGCCGACTATCATC

ACAAGAAAATTTAAGCGACCACGAAG

TAGCACTCACCAGCTTGTCAAAAACCAAGGCTTGGTGACGGCGGCT

TCAGAATGAAGGATAGATGGATAAATGTCTAGAATATTATAAAGTCC

AACAAAAGATGGAGCACATGCATGAAAGATTACGTACACGAATG

CAGGTGATACAGTGGATGTTAGGCATAAGAAGCACTATAAATAGAG

GGTGCAATCCCCATTGCCCTACACAACTACACAAGCCGACTATCATC

ACAAGAAAATTTAAGCGACCACGAAG

Figura 10. Identificação in silico de diferentes sítios de ligação para fatores de transcrição através banco de dados OSIRIS. Os dez sítios para proteínas regulatórias

encontrados na região de 203 pb (até a região sublinhada) estão representados por caixas

coloridas. A relação dos sítios é apresentada na tabela 5. O TATA Box encontra-se na

região circulada. A seta vermelha indica o sítio de início da transcrição e, por isso, a

seqüência sublinhada foi desconsiderada na análise de sítio de fatores de transcrição.



Tabela 5. Descrição dos sítios de ligação para fatores de transcrição identificados na região de 203 pb através de análises in silico no banco de dados OSIRIS.






4.3 – Construção de vetores de expressão induzidos por estresses ambientais

As análises in silico da região de 256 pb do promotor do gene salT,

através do banco de dados OSIRIS, revelaram a presença de sítios de ligação para

fatores de transcrição envolvidos com resposta de plantas a estresses ambientais,

sugerindo sua regulação. Outra forma de regulação, que tem sido sugerida em

diversos trabalhos, é o aumento da expressão gênica mediado por íntrons. Neste

contexto, é possível que a presença de um íntron na porção 5’ do gene salT esteja

envolvida, de alguma forma, na regulação de sua expressão.

Com a finalidade de avaliar esta possível influência do íntron na regulação

do gene salT, portanto, tornou-se interessante a construção dos seguintes vetores

de expressão em plantas – o primeiro contendo somente a Região de 256 pb e o

segundo contendo a Região de 256 pb seguida do Íntron salT. Adicionalmente, um

terceiro vetor foi construído utilizando a Região de 256 pb seguida do íntron Act1,

amplamente caracterizado como ativador de expressão gênica em vetores deste

tipo. Tal abordagem permitiu, além de avaliar o grau de influência que o íntron salT

exerce sobre a atividade promotora da região de 256 pb, comparar os níveis de

expressão obtidos com o vetor que possui tal íntron e com outro que possui um

íntron com atividade já descrita na literatura. Essa avaliação foi realizada através da

detecção da atividade da enzima β-glucuronidase codificada pelo gene repórter

GUS, tornando-se, então, essencial a presença desse gene no vetor.



4.3.1 – Obtenção dos fragmentos utilizados na construção dos vetores de expressão em plantas

A etapa inicial dos estudos que tiveram como objetivo avaliar a influência

do íntron salT sobre a atividade promotora da região de 256 pb consistiu no

desenvolvimento de três vetores de expressão em plantas “Região de 256 pb”,

“Região de 256 pb + Íntron salT” e “Região de 256 pb + Íntron Act1”. Tais

construções moleculares utilizaram como “base” o plasmídeo pA19-GUS. Como

ilustrado pela figura 11A, este plasmídeo comporta em sua estrutura o gene repórter

GUS, o gene Amp que confere resistência ao antibiótico ampicilina e sítios para

diversas enzimas de restrição. Além disso, a presença do íntron Act1 do gene da

actina de arroz na porção 5’ do gene GUS foi decisiva na escolha desse plasmídeo

para “base” dos vetores.

Desta forma, o DNA plasmidial foi extraído de bactérias E. coli DH5α, e,

após sua integridade ter sido avaliada em gel de agarose 1% (dados não

mostrados), o material obtido foi submetido ao tratamento com enzimas de restrição

para a liberação dos fragmentos correspondentes a região promotora 35S e a região

promotora 35S mais o íntron Act1. O primeiro tratamento consistiu na utilização das

enzimas de restrição EcoRI e BamHI para liberar um fragmento de 855 pb contendo

o promotor 35S e o íntron Act1. Tal procedimento resultou na linearização do

plasmídeo pA19-GUS sem a região regulatória do gene repórter. Tal vetor linear foi

denominado pA19-GUS-1. O segundo tratamento consistiu na utilização das

enzimas de restrição EcoRI e XhoI para liberar um fragmento 350 pb correspondente

apenas ao promotor 35S. Esse procedimento resultou na linearização do plasmídeo

pA19-GUS, e a conservação do íntron Act1 na porção 5’ do gene repórter. O vetor

linearizado contendo o íntron Act1 foi denominado pA19-GUS-2 (figura 11B).

Os dois plasmídios lineares obtidos foram utilizados em diferentes

abordagens. O plasmídeo pA19-GUS-1 foi utilizado para a clonagem do fragmento

correspondente a região de 256 pb do promotor do gene salT, e nessa condição foi

chamado de plasmídeo pA19-GUS-1A. Dessa forma, será possível avaliar a

funcionalidade dessa região, que regulará a expressão do gene repórter GUS. Numa

segunda abordagem, foi feita a ligação do mesmo plasmídeo linear ao fragmento

correspondente a região de 256 pb acompanhada do íntron salT, e nessa condição

foi chamado de pA19-GUS-1B. Assim, será avaliada a possível influência do íntron



salT na ativação da região de 256 pb do promotor salT. Foi realizada ainda a ligação

do fragmento correspondente a região de 256 pb do promotor do gene salT ao

plasmídeo pA19-GUS-2. Como este comporta o íntron Act1 na porção 5’ do gene

GUS, será possível analisar a influência desse íntron na atividade da região de 256

pb, bem como a análise comparativa com a expressão obtida pelo vetor contendo o

íntron salT.

A)

B)

500 pb

250 pb

750 pb1 kb

M 1 2 3

10 kb

A)

B)

500 pb

250 pb

750 pb1 kb

M 1 2 3

10 kb

Figura 11. Esquema ilustrativo e visualização eletroforética do resultado da restrição enzimática do plasmídeo pA19-GUS. Em (A) Esquema do plasmídeo pA19-Gus. Em (B)

Linearização do plasmídeo pA19-GUS através de restrição enzimática. 1 – plasmídeo pA19-

GUS não digerido (indicado pela seta vermelha). 2 – plasmídeo pA19-GUS digerido com as

enzimas EcoRI e BamHI. A seta vermelha indica o plasmídeo linear pA19-GUS-1 e a seta

azul indica o fragmento liberado correspondente ao promotor 35S + Act1. 3 – plasmídeo

pA19-GUS digerido com as enzimas EcoRI e XhoI. A seta vermelha indica o plasmídeo

linear pA19-GUS-2 e a seta azul indica o fragmento liberado correspondente ao promotor

35S. M – Marcador de peso molecular 1 kb DNA Ladder™ (Fermentas).



Os fragmentos de interesse que seriam utilizados para a construção de

tais vetores de expressão foram amplificados a partir de DNA genômico,

previamente extraído de folhas de arroz do cultivar IAC 4440 (dados não

mostrados), utilizando combinações específicas de primers. O fragmento

correspondente a região de 256 pb que seria clonado no vetor pA19-GUS-1A foi

amplificado utilizando os primers Pro 250 Eco e Bea 02 Bam. Como os primers

possuíam sítios de restrição, os fragmentos gerados com essa abordagem tiveram

extremidades coesivas com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI, compatíveis

com as extremidades do vetor linear onde foram clonados. Outra abordagem utilizou

os primers Pro 250 Eco e Bea 04 Bam. Essa combinação amplificou o fragmento

correspondente a região de 256 pb acompanhada do íntron salT. Os fragmentos

gerados por esta abordagem também tiveram sítios de restrição compatíveis com as

enzimas EcoRI e BamHI, e assim, foram clonados no vetor linear pA19-GUS-1B.

Adicionalmente, o fragmento correspondente à região de 256 pb foi amplificado

utilizando os primers Pro 250 Eco e Bea 02 Xho. O resultado dessa amplificação

foram fragmentos com extremidades compatíveis com as enzimas EcoRI e XhoI, que

puderam ser então clonadas no plasmídeo linear pA19-GUS-2. A tabela 3 (Materiais

e Métodos) mostra o par de primers utilizado em cada amplificação e os sítios de

restrição gerados nos fragmentos, e a figura 5 (Materiais e Métodos) indica o local

de anelamento e a direção de cada primer no promotor do gene salT.

Após a amplificação por PCR, as amostras foram tratadas com as enzimas

de restrição correspondentes aos primers utilizados, no intuito de gerar

extremidades coesivas, e os materiais foram avaliados em gel de agarose 1%.

Como demonstrado na figura 12, os fragmentos de interesse foram eficientemente

amplificados. Embora tenha ocorrido amplificação inespecífica, a eficácia do

procedimento é verificada pela intensidade dos fragmentos alvos. As bandas foram,

então, isoladas diretamente do gel e o DNA purificado para posteriores ensaios de

clonagem.



500 pb

250 pb

750 pb

1 kb

M 1 2 3

500 pb

250 pb

750 pb

1 kb

M 1 2 3

Figura 12. Visualização eletroforética da amplificação por PCR dos fragmentos de interesse. M – Marcador de peso molecular 1 kb DNA Ladder™ (Fermentas); 1 –

Fragmento de 256 pb EcoRI/BamHI; 2 – Fragmento de 256 pb EcoRI/XhoI; 3 – Fragmento

256 pb + íntron salT EcoRI/BamHI. As setas vermelhas indicam a posição dos fragmentos

amplificados em cada raia.



4.3.2 – Ligação dos insertos aos seus respectivos vetores de clonagem e

transformação de E. coli DH5α

O primeiro ensaio de ligação foi realizado utilizando o plasmídeo pA19-GUS-1A, digerido com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI, e o fragmento correspondente a região de 256 pb do promotor salT com as extremidades compatíveis EcoRI e BamHI. Em seguida, bactérias E. coli competentes linhagem DH5α foram transformadas com o DNA obtido e plaqueadas. Foi observado o crescimento de 31 colônias nas placas, e tais colônias foram, então, analisadas quanto à presença do clone “pA19-GUS-1 + 256 pb EcoRI / BamHI” pela amplificação do inserto através de PCR, onde a combinação de primers utilizada foi Pro 250 Eco e Gus 5’ Rev e as próprias colônias da bactéria transformada foram utilizadas como DNA molde. A figura 13 mostra que das 31 colônias obtidas, 11 colônias tiveram o inserto amplificado, indicando que receberam o clone.

A construção do segundo vetor de expressão seguiu as mesmas etapas. Foi utilizado o plasmídeo pA19-GUS-1B, digerido com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI. O fragmento correspondente a região de 256 pb do promotor salT, seguida do íntron salT, também foi digerido com as mesmas enzimas. Após a ligação e transformação de E. coli DH5α foi observado o crescimento de 177 colônias nas placas, das quais 39 foram escolhidas aleatoriamente para serem analisadas quanto à presença do clone “pA19-GUS-1 + 256 pb + íntron salT EcoRI / BamHI” pela amplificação do inserto utilizando a mesma combinação de primers da construção anterior. A figura 14 mostra que 28 colônias tiveram o inserto amplificado, indicando que receberam o clone.

O terceiro vetor foi construído utilizando a mesma abordagem, porém com uma pequena modificação. A ligação foi realizada utilizando o plasmídeo pA19-GUS-2, digerido com as enzimas de restrição EcoRI e XhoI, e o fragmento correspondente a região de 256 pb do promotor salT com as extremidades compatíveis EcoRI e XhoI. Após a ligação e transformação de E. coli DH5α foi observado o crescimento de diversas colônias, das quais 65 foram escolhidas aleatoriamente para serem analisadas quanto à presença do clone “pA19-GUS + 256 pb EcoRI / XhoI” pela amplificação do inserto utilizando a mesma combinação de primers das construções anteriores. Os resultados mostraram 45 colônias apresentaram resultado positivo, indicando que receberam o clone. Porém, neste caso, o fragmento amplificado corresponde a região de 256 pb + íntron Act1 (figura 15).



M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

M 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

27 28 29 30 31 M

500 pb

250 pb

500 pb

250 pb

500 pb

250 pb

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

M 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

27 28 29 30 31 M

500 pb

250 pb

500 pb

250 pb

500 pb

250 pb

Figura 13. Confirmação da clonagem do inserto “256 pb EcoRI/BamHI” através de PCR das 31 colônias crescidas. As posições 5, 6, 7, 9, 14, 19, 24, 26, 27, 28 e 29 indicam

as colônias positivas. M – Marcador de peso molecular 1 kb DNA Ladder™ (Fermentas). 1 –

Controle negativo (ausência de fita molde). As setas vermelhas indicam o inserto

amplificado.



M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

M 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

M 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39

500 pb250 pb

750 pb1 kb

500 pb250 pb

750 pb1 kb

500 pb250 pb

750 pb1 kb

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

M 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

M 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39

500 pb250 pb

750 pb1 kb

500 pb250 pb

750 pb1 kb

500 pb250 pb

750 pb1 kb

Figura 14. Confirmação da clonagem do inserto “256 pb + íntron salT EcoRI/BamHI” através de PCR de 39 colônias formadas. As posições 10 a 30 e 33 a 39 indicam as

colônias positivas. M – Marcador de peso molecular 1 kb DNA Ladder™ (Fermentas). 1 –

Controle negativo (ausência de fita molde). As setas vermelhas indicam o fragmento

amplificado.



M 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10 11 12

M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

M 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38

500 pb250 pb

750 pb1 kb

500 pb250 pb

750 pb1 kb

500 pb250 pb

750 pb1 kb

M 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10 11 12

M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

M 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38

500 pb250 pb

750 pb1 kb

500 pb250 pb

750 pb1 kb

500 pb250 pb

750 pb1 kb

Figura 15 (1ª parte).



M 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51

M 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63

M 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74

500 pb250 pb

750 pb1 kb

500 pb250 pb

750 pb1 kb

500 pb250 pb

750 pb1 kb

M 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51

M 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63

M 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74

500 pb250 pb

750 pb1 kb

500 pb250 pb

750 pb1 kb

500 pb250 pb

750 pb1 kb

Figura 15 (continuação). Confirmação da clonagem do inserto “256 pb EcoRI/XhoI” através de PCR de 65 colônias crescidas. Os fragmentos amplificados correspondem ao

“256 pb + íntron Act1”. Muito embora 45 colônias tenham sido positivas, as posições 10, 15,

16, 18, 19, 22, 25, 27, 29, 30, 31, 34, 38, 40, 42, 44, 48, 49, 52, 61, 64, 65, e 74 indicam as

colônias com as melhores amplificações. M – Marcador de peso molecular 1 kb DNA

Ladder™ (Fermentas). 1 a 5 – Controles negativos (ausência de fita molde). As posições 6,

13, 26 e 39 são amostras erradas que foram carregadas no gel, não fazendo, portanto, parte

das colônias positivas. As setas vermelhas indicam os produtos amplificados.



4.4 – Estudo da influência do íntron salT através da análise de expressão transiente do gene GUS em tecido foliar de Arabidopsis thaliana

Com o intuito de avaliar a influência do íntron salT sobre a atividade

regilatória da região de 256 pb do promotor do gene salT, bem como comparar os

níveis de expressão obtidos com a presença dos diferentes íntrons, os três vetores

de expressão em plantas previamente construídos – “Região de 256 pb”, “Região de

256 pb + Íntron salT” e “Região de 256 pb + Íntron Act1” – foram extraídos das

bactérias E. coli DH5α, tiveram sua integridade avaliada em gel de agarose 1%

(dados não mostrados) e, posteriormente, tais moléculas foram eletroporados em A.

tumefaciens LBA 4440. O plasmídeo original pA19-GUS, utilizado como “base” para

a construção dos vetores, também foi inserido por eletroporação em A. tumefaciens.

A presença do promotor constitutivo CaMV 35S dirigindo a expressão do gene GUS

em tal plasmídeo permitiu sua utilização como controle positivo nos ensaios

posteriores.

Inicialmente, as quatro cepas transformadas com os vetores de expressão

(três construções e o plasmídeo original), bem como a Agrobacterium tumefaciens

selvagem, foram submetidas à análise de detecção da expressão do gene GUS

através da reação enzimática da β-glucuronidase com seu substrato x-gluc. A figura

16 demonstra que apenas a cepa de A. tumefaciens contendo o plasmídeo pA19-

GUS apresentou a coloração azul, indicando a expressão do gene GUS. Se as

cepas contendo cada um das três construções fossem capazes de expressar o gene

GUS, a análise histoquímica em A. thaliana seria inviável, pois implicaria em um

resultado falso-positivo.

Os experimentos in vivo foram conduzidos utilizando folhas da parte

inferior de plantas de Arabidopsis thaliana com 28 dias de idade. As soluções de

infecção, contendo as cepas transformadas, foram injetadas em diversos pontos da

superfície abaxial dos tecidos foliares de A. thaliana com o auxílio de uma seringa.

Após dois dias de infecção, as folhas que tiveram as cepas injetadas foram

excisadas das plantas de origem e incubadas durante 20 h em tampão contendo o

substrato x-gluc. Como demonstrado na figura 17, a análise histoquímica da

expressão transiente do gene GUS em tecidos foliares de Arabidopsis thaliana

revelou, através da coloração azul, a expressão deste gene repórter nas folhas

transformadas com as cepas de A. tumefaciens contendo os vetores com o íntron



salT e o íntron Act1. Aparentemente, não houve expressão do gene GUS na folha

infectada com a cepa que possuía o vetor “Região de 256 pb”.

1 2 3 4 51 2 3 4 5

Figura 16. Detecção da expressão do gene GUS em diferentes cepas de

Agrobacterium tumefaciens. A expressão da enzima β-glucuronidase (GUS) foi

mensurada através do tratamento das cepas com tampão contendo seu substrato, x-

gluc. 1 – A. tumefaciens transformada com o plasmídeo original pA19-GUS, que contém o

promotor 35S dirigindo a expressão do gene repórter (controle positivo); 2 – A. tumefaciens

selvagem (não transformada); 3 – A. tumefaciens contendo o vetor de expressão “Região de

256 pb”; 4 - A. tumefaciens contendo o vetor “Região de 256 pb + Íntron salT”; 5 – A.

tumefaciens contendo o vetor “Região de 256 pb + Íntron Act1”.



1 2 3 41 2 3 4

Figura 17. Análise histoquímica da expressão transiente do gene GUS em tecidos foliares de Arabidopsis thaliana. As folhas infectadas com as cepas transformadas foram

excisadas das plantas de origem e submetidas ao tratamento com tampão contendo o

substrado x-gluc. A intensidade da cor azul está relacionada ao nível de expressão do gene

repórter GUS. 1 – Folha injetada com a cepa de A. tumefaciens contendo o vetor plasmidial

pA19-GUS (controle positivo); 2 – Folha transformada com a A. tumefaciens contendo a

construção “Região de 256 pb”; 3 – Folha transformada com a A. tumefaciens contendo a

construção “Região de 256 pb + Íntron salT”; 4 – Folha transformada com a A. tumefaciens

contendo a construção “Região de 256 pb + Íntron Act1”.



4.5 – Análise do perfil transcricional do gene salT em diferentes tecidos de O.

sativa através de northern eletrônico

A identificação, através de análise in silico, do sítio “RY Repeat” na região

de 256 pb do promotor do gene salT sugeriu uma possível participação deste gene

em processos que ocorrem nas sementes. Poranto, com a finalidade de investigar o

perfil de expressão deste gene nos diferentes tecidos desta parte da planta, foi

utilizado o Projeto de Arroz da Universidade de Yale (Yale Rice Project). Tal projeto

tem como objetivo a construção, ainda em andamento, de um banco de dados do

perfil transcricional de todo o genoma de arroz em diversos tipos de células e tecidos

isolados por micro dissecação, o Centro Virtual da Universidade de Yale para o Perfil

de Expressão Celular em Arroz (Yale Virtual Center for Cellular Expression Profiling

of Rice Yale Rice Project: http://bioinformatics.med.yale.edu/riceatlas/overview.jspx).

A figura 18 mostra os resultados obtidos pelos ensaios de microarray

desenvolvidos pelo banco da Universidade de Yale para o perfil transcricional do

gene salT em cinco diferentes tecidos do embrião de sementes, em três momentos –

semente seca (0h) e 12 h e 24 h após a embebição. Os valores expressos dentro

das células representam a intensidade do sinal, após a normalização dos dados, e

determinam os níveis de transcrição do gene. Segundo os dados gerados, o gene

salT possui alto nível de transcrição nas células do escutelo, coleóptilo, epiblasto e

radícula após 12 h, e baixo nível transcricional nas células da plúmula de sementes.

Adicionalmente, foram realizadas análises dos níveis de transcrição do

gene salT em outros tecidos de plantas. De acordo com os dados gerados pelo

banco da Universidade de Yale, mostrados na figura 19, o gene salT apresenta alto

nível de transcrição somente em amostras de folha inteira e na raiz inteira.




Figura 18. Perfil transcricional do gene salT em cinco diferentes tecidos do embrião de sementes. Análises de microarray de escutelo, coleóptilo, epiblasto, plúmula e radícula

em três momentos [semente seca (0hr), 12 h e 24 h após embebição] desenvolvidos pelo

banco de expressão da Universidade de Yale (Yale Virtual Center for Cellular Expression

Profiling of Rice Yale Rice Project). Acima é fornecida uma chave mostrando a abundância

relativa de RNA, sendo a cor amarela para baixas concentrações e vermelho e marrom para

altas concentrações.



Figura 19. Perfil transcricional do gene salT em tecidos de plantas de arroz. Análises

de microarray de diversos tecidos e tipos celulares de broto, folha e raiz de plantas de arroz

desenvolvidos pelo banco de expressão da Universidade de Yale (Yale Virtual Center for

Cellular Expression Profiling of Rice Yale Rice Project). Acima é fornecida uma chave

mostrando a abundância relativa de RNA, sendo a cor amarela para baixas concentrações e

vermelho e marrom para altas concentrações.



5. DISCUSSÃO

5.1 – Estudo da influência dos elementos de transposição Castaway e Stowaway sobre a atividade da região regulatória do gene salT de arroz

Em trabalho prévio de comparação de seqüências em bancos de dados

(NCBI – GenBank), BUREAU e colaboradores (1996) analisaram a ocorrência de

elementos de transposição em genes já seqüenciados de A. thaliana e O. sativa.

Nesta ocasião, foi detectada a presença de transposons pertencentes às famílias

Castaway e Stowaway, os quais encontram-se separados por apenas nove pares de

bases, na região promotora do gene salT de arroz. Elementos de transposição são

seqüências capazes de se replicar e se mover dentro do genoma (FESCHOTTE,

2008), e além do gene salT, diversos outros genes de arroz tiveram relatada a

presença de tais elementos em suas regiões regulatórias 5’ flanqueadoras (BUREAU

et al., 1996). Estas inserções, muitas vezes conservadas entre diferentes

organismos, impulsionaram diversos estudos acerca de suas possíveis funções

regulatórias (FESCHOTTE, 2008).

Nas tabelas 1 e 2, previamente apresentadas, foi possível observar que

diversos cultivares de arroz foram utilizados em análises de diferentes estresses,

porém não há informações a cerca da presença/ausência dos elementos de

transposição no promotor salT de tais cultivares. Tal constatação despertou o

interesse sobre uma possível correlação entre presença de tais transposons com a

atividade do promotor salT, que até então não havia sido relatada. Portanto, com a

finalidade de determinar se a presença dos elementos móveis afetam de alguma

forma a transcrição do gene salT, mediante resposta ao estresse provocado por

salinidade, foi necessário, inicialmente, determinar quais cultivares de arroz

apresentavam tais inserções na região promotora através de amplificações por PCR.

Uma vez que o promotor salT inteiro (com os dois elementos de

transposição) consiste de 1725 pb (GARCIA et al., 1998; NCBI – acesso n° Z25811),

e os transposons Castaway e Stowaway juntos (sem os nove pares de bases que os

separam) correspondem a 520 pb, a região promotora sem os elementos de

transposição deveria corresponder a 1205 pb. Sendo assim, o resultado de

amplificação por PCR sugeriu a presença dos transposons apenas nos cultivares



Minami Hata Mochi e Taichung Native 1 (figura 6). Adicionalmente, foi demonstrado

que a região de 256 pb + íntron salT possui exatamente o mesmo tamanho em todos

os cultivares (figura 7), o que corrobora a idéia que a diferença no tamanho dos

fragmentos correspondentes aos promotores nos diferentes cultivares é devido à

presença dos elementos de transposição. Tomados juntos, então, os resultados

obtidos pelo presente trabalho indicaram a presença dos elementos de transposição

Castaway e Stowaway no promotor salT somente dos cultivares Minami Hata Mochi

e Taichung Native 1, enquanto que Cica 8, Guarani, IAC 201, IAC 4440 e Metica-1

não apresentaram tais inserções.

A detecção dos transposons tanto em cultivares da subespécie Japônica,

como Guarani e Minami Hata Mochi, quanto em cultivares da subespécie Indica,

como IAC 4440, Metica 1 e TN1, indicou que a inserção de tais elementos de

transposição ocorreu, na escala evolutiva, em algum ponto antes da diferenciação

em subespécies, permanecendo conservada em ambas. Visto que teorias recentes

têm postulado que a persistência evolucionária de alguns elementos de transposição

deve-se ao papel chave que tais elementos vêm exercendo sobre a evolução da

regulação gênica (FESCHOTTE, 2008), torna-se ainda mais interessante a análise de

uma possível participação dos transposons Castaway e Stowaway na regulação do

gene salT.

Tem sido amplamente mostrado que os transposons são capazes de

influenciar diretamente, de forma benéfica ou não, a regulação da expressão de

genes localizados fisicamente próximos a eles, tanto em níveis transcricionais

quanto pós-transcricionais (MASIDE et al., 2002; SILVA et al., 2003; SCHLENKE et al.,

2004; CHUNG et al., 2007; FESCHOTTE et al., 2007). No nível transcricional, elementos

de transposição inseridos na região 5’ flanqueadora de um gene podem influenciar

sua expressão de três diferentes formas – inserindo seqüências promotoras e

introduzindo um sítio alternativo de inicio da transcrição; interrompendo seqüências

que compreendiam importantes elementos regulatórios em cis; ou introduzindo

novos elementos em cis, tais como sítios de ligação para fatores de transcrição

(FESCHOTTE, 2008).

Uma vez que o promotor de um gene compreende os sítios de ligação a

fatores de transcrição, a inserção dos transposons nesta região regulatória implica

em um possível distanciamento de 520 pb entre potenciais sítios e o ponto de início

da transcrição, e portanto, tal inserção poderia afetar negativamente a transcrição do



gene. Porém, a partir da determinação de cultivares de arroz com e sem a inserção

de transposons e posteriores ensaios conduzidos através de RT-PCR em bainhas

de plantas em condições normais e submetidas a estresse salino, foi mostrado que

as inserções não prejudicaram a habilidade do promotor salT em induzir a

transcrição do gene salT (figura 8). Contudo, muito embora tenha ficado claro que a

inserção dos elementos de transposição não afeta negativamente a transcrição do

gene, o pequeno número de cultivares analisados neste trabalho não permite afirmar

que a presença de tais elementos possua função benéfica na regulação do gene

salT. Apenas análises moleculares mais apuradas, como a identificação in silico de

elementos regulatórios em cis e a utilização de vetores repórteres, contendo tais

transposons, em ensaios de expressão, poderão fornecer maiores informações

sobre a participação dos elementos de transposição na regulação gênica e confirmar

possíveis funções benéficas.

Adicionalmente, os resultados obtidos nos ensaios de western blotting,

demonstraram que o acúmulo da proteína SALT, nas mesmas condições, não

refletem os níveis de transcrição do gene salT (figura 9). O fato de haver grande

discrepância entre o acúmulo de transcritos e de proteínas, como mostrada pelo

cultivar Minami Hata Mochi, sugere fortemente uma intensa regulação pós-

traducional da proteína SALT.

5.2 – Estudo dos potenciais sítios regulatórios identificados na região de 256 pb do promotor do gene salT através de análises in silico

A diversidade de respostas apresentadas pelo gene salT de arroz pode

estar relacionada à presença de diferentes sítios para ligação de fatores de

transcrição na sua região promotora. Visto que os resultados obtidos pelos ensaios

de PCR em Tempo Real demonstraram que a inserção dos elementos de

transposição não influencia a atividade do promotor quanto à sua capacidade de

induzir a transcrição do gene salT, foi possível inferir que os potenciais sítios de

ligação para fatores de transcrição estejam situados na região de 256 pb do

promotor salT. Tendo em vista que uma das aplicações da bioinformática consiste

em localizar possíveis sítios para proteínas regulatórias em seqüências de DNA, e a

identificação de regiões conservadas pode sugerir os possíveis meios de regulação

do gene em estudo, a análise in silico da região de 256 pb do promotor salT tornou-



se de extrema relevância na elucidação dos possíveis elementos regulatórios em cis

presentes na mesma.

Tal análise, realizada no trabalho aqui apresentado, consistiu na

submissão do nome referente ao gene salT de arroz, baseado no Projeto de

Anotação do Arroz (RAP-DB: TANAKA et al., 2008), no banco de dados OSIRIS, que

reúne e analisa promotores contidos no genoma de O. sativa (MORRIS et al., 2008).

Este banco de dados gera uma imagem da região promotora do gene submetido,

bem como os sítios de ligação para fatores de transcrição presentes no mesmo.

Inicialmente, tal abordagem permitiu a confirmação da presença do TATA Box nesta

região. O TATA Box é uma seqüência de DNA (elemento regulatório em cis)

encontrada na região promotora da maioria dos genes de eucariotos. Considerado a

seqüência essencial do promotor, é geralmente encontrado como sítio de ligação da

RNA polimerase II, responsável por dar início ao complexo processo de transcrição

25 pares de bases após o seu sítio de ligação. A presença deste elemento em cis

nesta posição já havia sido relatada por GARCIA e colaboradores (1998), porém,

através do avanço tecnológico das ferramentas de bioinformática, do acúmulo de

informações in vivo e da utilização combinada de três diferentes banco de dados de

elementos regulatórios encontrados em promotores de plantas – OSIRIS (MORRIS et

al., 2008), PlantCARE (LESCOT et al., 2002) e PLACE (HIGO et al., 1999) – foi

possível afirmar de forma mais consistente tratar-se do elemento TATA Box.

De acordo com os dados obtidos pelo OSIRIS, os 53 nucleotídeos a partir

do sítio de início da transcrição fazem parte do transcrito primário e, desta forma,

não houve análise quanto à presença de sítios de fatores de transcrição nesta

seqüência. Somente os 203 pb precedentes ao sítio inicial da transcrição são

considerados pelo banco. O resultado da análise in silico desta região de 203 pb

através do banco de dados OSIRIS revelou a presença de 10 diferentes potenciais

sítios de ligação para de proteínas regulatórias. Dentre estes, pelo menos seis

elementos em cis – MYB1AT, MYCATERD1, MYCATRD22, MYBCORE, AGC Box e

ACGT Box – referem-se a regiões conservadas para a ligação de proteínas

regulatórias relacionadas à resposta de plantas a estresses ambientais.

MYB1AT e MYCATRD22 são sítios de reconhecimento das proteínas

regulatórias MYB e MYC encontrados nos promotores dos genes rd22, e de muitos

outros genes de A. thaliana, e funciona como elemento em cis na expressão

induzida por ABA e seca de tais genes (ABE et al., 1997, 2003, BUSK e PAGES, 1997).



O fitormônio ABA é produzido sob condições de estresse hídrico, o que causa

fechamento do estômato e tolerância a seca, e estresse salino (BRAY, 1997; BUSK e

PAGES, 1998; SHINOZAKI e YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2000) estando, portanto,

relacionado a uma variedade de processos fisiológicos, incluindo respostas aos

estresses provocados pela seca e pela salinidade (ABE et al., 2003). MYBCORE

também funciona como sítio de reconhecimento para proteínas MYB de Arabidopsis,

funcionando, portanto, da mesma forma (URAO et al., 1993), e MYCATERD1 foi

descrito como sítio necessário para a expressão do gene erd1 de Arabidopsis, que

participa dos processos de resposta à desidratação (TRAN et al., 2004) e à

senescência induzida pelo escuro (SIMPSON et al., 2003) em Arabidopsis. Juntos,

esses dados apontam a presença de elementos em cis relacionados ao estresse

provocado pela desidratação e ABA e, uma vez que diversos trabalhos relataram a

expressão do gene salT sob condições de seca e ABA, é possível que tais sítios

regulatórios sejam funcionais na regulação do gene salT.

O elemento AGC Box consiste na seqüência de ligação para fatores

AtERFs de Arabidopsis, que são fatores que se ligam a elementos responsivos à ET

(FUJIMOTO et al., 2000). Tal elemento é também encontrado em genes de defesa

cuja transcrição é induzida por ET (OHME-TAKAGI et al., 2000) e em genes cujos

promotores são induzidos por patógenos e ferimentos (RUSHTON et al., 2002). O fato

da expressão do gene salT ter sido induzida por ET (KIM et al., 2004), por patógenos

(XIONG et al., 2001; AKIMOTO-TOMIYAMA et al., 2003; KIM et al., 2001, 2003, 2004;

VENTELON-DEBOUT et al., 2004; MICHÉ et al., 2006; SWARBRICK et al., 2008) e por

ferimento (DE SOUZA FILHO et al., 2003; SHEN et al., 2003) indica a possível influência

do elemento AGC Box na regulação do gene salT. Já o sítio ACGT Box ligam

proteínas regulatórias da família bZIP. Em plantas, os fatores de transcrição bZIP

regulam diversos processos, tais como defesa de patógenos, sinalização de

estresse e luz, maturação de sementes e desenvolvimento da flor.

O motivo conservado RY Repeat consiste em um elemento em cis

presente em genes de proteínas de estoque de sementes. Está envolvido na

regulação gênica específica em sementes (DICKINSON et al., 1988; BÄUMLEIN et al.,

1992; HATTORI et al., 1992). O fato de este ter sido o único sítio tecido-específico

encontrado na região de 256 pb levou à posterior análise do perfil transcricional do

gene salT tecido-específica. Nenhum potencial sítio regulatório foi identificado pelo

banco de dados OSIRIS entre o TATA Box e o ponto inicial da transcrição.



A regulação gênica ocorre em todas as etapas que constituem este

complexo processo, e muitos são os fatores envolvidos em cada um destes cruciais

pontos da regulação. Nesse contexto, diversos trabalhos sugerem uma importante

participação de íntrons na regulação da expressão gênica. Uma vez que o gene salT

possui um íntron na sua porção 5’, tornou-se interessante analisar se a presença

deste íntron influencia, de alguma forma, a expressão gênica do gene em estudo.

5.3 – Estudo da influência do íntron salT sobre a atividade promotora da região de 256 pb através da análise de expressão transiente do gene GUS em tecido foliar de A. thaliana

A expressão de qualquer gene é regulada por sua seqüência promotora

através da interação desta com fatores de transcrição específicos, permitindo que o

gene responda a vários estímulos, dependendo do gene em questão. Em 1987,

JEFFERSON e colaboradores utilizaram o gene β-glucuronidase (GUS) de E. coli como

uma fusão de gene marcador para análise de expressão gênica em plantas

transformadas, e até o ano de 2003 mais de 3500 trabalhos já citavam a utilização

do sistema repórter GUS para tal finalidade (VAIN, 2007). Seqüências promotoras

têm sido testadas mensurando a expressão deste gene repórter uidA, que codifica a

enzima β-glucuronidase (GUS). Tal enzima é facilmente mensurada utilizando o

substrato x-gluc para produzir uma cor azul no ensaio histoquímico e o substrato 4-

methyllumbelliferyl-glucuronide (MUG) que produz um composto fluorescente no

ensaio sensitivo quantitativo in vitro (INABA et al., 2007).

Diversos trabalhos avaliaram seqüências promotoras através da análise

histoquímica da expressão transiente do gene GUS em tecidos de plantas e,

adicionalmente, estudos que demonstraram a influência de íntrons sobre promotores

utilizaram a mesma abordagem (LU et al., 2008). Portando, com o intuito de avaliar a

atividade da região de 256 pb do promotor do gene salT e a influência do íntron salT

sobre a regulação deste gene, foram construídos três vetores de expressão em

plantas contendo fragmentos correspondentes à “Região de 256 pb”, “Região de 256

pb + Íntron salT” e “Região de 256 pb + Íntron Act1” regulando a expressão do gene

GUS. Adicionalmente, tornou-se possível uma análise comparativa dos níveis de

expressão obtidos pelos vetores contendo o íntron salT e o íntron Act1 do gene da

actina de arroz.



A transferência gênica mediada por Agrobacterium tem sido amplamente

utilizada como uma poderosa ferramenta para análise de genomas e melhoramento

de culturas (POTRYKUS, 1990; HOOYKAAS e SCHILPEROORT, 1992; TZFIRA e CITOVSKY,

2006; CITOVSKY et al., 2007; DAFNY-YELIN et al., 2008), e durante os últimos 30 anos,

a transformação mediada por Agrobacterium constitui o principal sistema de

transferência de DNA para novas tecnologias de obtenção de transgênicos (VAIN,

2007). Sendo assim, cada uma das construções obtidas pelo presente trabalho foi

introduzida em A. tumefaciens linhagem LBA 4440 via eletroporação. Visto que o

protocolo de transformação da planta modelo A. thaliana foi estabelecido na década

de 80 (ZAMBRYSKI et al., 1983) e desde então é amplamente utilizado (VAIN, 2007),

as diferentes cepas de A. tumefaciens foram infiltradas na superfície abaxial de

folhas de A. thaliana com o auxílio de seringas sem agulhas. Acredita-se que os

ferimentos gerados no processo de infecção poderiam induzir as vias de resposta a

estresses ambientais nas plantas, e desta forma, o promotor salT seria ativado.

Após a infecção, as plantas foram mantidas em câmara de cultivo por dois dias,

quando as folhas infectadas foram excisadas das plantas de origem e incubadas

com tampão x-gluc para a detecção da atividade do gene GUS.

A análise histoquímica da expressão transiente do gene GUS em tecidos

foliares de A. thaliana revelou a expressão deste gene repórter nas folhas

transformadas com as cepas de A. tumefaciens que portavam os vetores com o

íntron salT e o íntron Act1. Visto que a intensidade da cor azul está relacionada ao

nível de expressão do gene, os dados obtidos sugeriram que a região de 256 pb

sozinha não induziu a expressão do gene GUS, pelo menos não em níveis

detectáveis pelos ensaios histoquímicos. Os resultados sugeriram, ainda, que o

íntron salT exerce forte influência sobre a atividade promotora da região de 256 pb,

uma vez que sua presença na porção 3’ desta região ativou a expressão do gene

repórter (figura 17).

O efeito do aumento da expressão gênica mediado por íntrons (IME) já foi

demonstrado para diversos íntrons de plantas (SAMADDER et al., 2008), porém a

eficiência do IME difere em espécies de monocotiledôneas e dicotiledôneas (KOZIEL

et al., 1996). Íntrons que estimulam a expressão em monocotiledôneas incluem os

íntrons dos genes de milho Adh1, Sh1, Bz1, Hsp82, actina e GapA1 (CALLIS et al.,

1987; LUEHRSEN e WALBOT, 1991; MAAS et al., 1991; SINIBALDI e METTLER, 1992;

DONATH et al., 1995) e de arroz salT, Act1 e tpi (MCELROY et al., 1990; XU et al.,



1994; RETHMEIER et al., 1997). Similarmente, íntrons de dicotiledôneas que elevam a

expressão incluem os íntrons dos genes SSU301 de petúnia rbcS (DEAN et al.,

1989), ST-LS1 de batata (LEON et al., 1991) e os genes de Arabidopsis UBQ3,

UBQ10, PAT1, atpk1, A1 EF-1α, e At eEF-1β (CURIE et al., 1993; NORRIS et al.,

1993; ZHANG et al., 1994; GIDEKEL et al., 1996; ROSE e LAST, 1997). Em plantas, a

inclusão de um ou mais íntrons em construções genéticas, geralmente, acarreta o

aumento do acúmulo de mRNA e proteínas comparado a construções similares onde

faltam íntrons (KOZIEL et al., 1996; SIMPSON e FILIPOWICZ, 1996).

Particularmente, o aumento da expressão gênica mediado pelo íntron salT

foi avaliado por RETHMEIER e colaboradores, em 1997. Nesta ocasião, o mecanismo

de IME foi estudado em milho utilizando os genes cat (chloramphenicol acetyl

transferase synthase gene) e bar (bialaphos resistence gene), flanqueados por

seqüências regulatórias idênticas. A inclusão do primeiro íntron do gene salT de

arroz na região 5’ não traduzida de ambos os genes, estimulou a expressão apenas

do gene cat. A presença do íntron salT não aumentou os níveis de proteína e do

mRNA codificados pelo gene bar, indicando que o aumento da expressão mediada

pelo íntron é um processo dependente do gene. Adicionalmente, seus resultados

mostraram que o processo de IME não tem um componente traducional, não tendo

efeito na estabilidade citoplasmática do mRNA de cat em células de milho

cultivadas, sugerindo que o IME atua no núcleo (RETHMEIER et al., 1997). Portanto,

os resultados apresentados pelo presente trabalho, corroboram os estudos prévios,

indicando que o íntron salT possui a habilidade de aumentar a expressão gênica.

Adicionalmente, a partir dos dados gerados pela expressão transiente do

gene GUS em tecidos foliares de A. thaliana tornou-se possível a análise

comparativa dos níveis de expressão obtidos pelos íntrons salT e Act1. Tais estudos

revelaram que o íntron salT apresenta maior capacidade de aumentar a expressão

gênica quando comparado ao íntron da actina de arroz, Act1. Porém, para que tais

hipóteses sejam confirmadas, será necessária a utilização de técnicas mais

sensíveis, como PCR em Tempo Real. Outra abordagem interessante será a

utilização de tecidos foliares de O. sativa para o estudo da expressão do gene GUS.

Desta forma, a identificação da melhor região regulatória consistirá em um sistema

de expressão induzível apropriado para a utilização em engenharia genética de

plantas, a fim de se obter plantas transgênicas tolerantes a estresses abióticos.



5.4 – Análise do perfil transcricional do gene salT em diversos tipos de células e tecidos de O. sativa através de northern eletrônico

O estudo acerca dos sítios de ligação para fatores de transcrição

presentes na região de 256 pb, realizado através de análises in silico utilizando o

banco de dados OSIRIS, revelou a presença de 10 diferentes possíveis locais para

ligação de elementos regulatórios nesta região do promotor salT. Dentre este

resultado, que sugere a forma pela qual o gene é regulado, foi possível observar a

presença de uma única seqüência conservada relacionada à expressão tecido-

específica. Tal sítio, conhecido como “RY Repeat”, tem sido caracterizado em genes

cuja expressão é regulada especificamente em sementes e, portanto, o motivo RY

Repeat é considerado tecido-específico (DICKINSON et al., 1988; BÄUMLEIN et al.,

1992; HATTORI et al., 1992).

O Projeto de Arroz da Universidade de Yale (Yale Rice Project) tem como

objetivo a construção, ainda em andamento, de um banco de dados do perfil

transcricional de todo o genoma de arroz em diversos tipos de células e tecidos

isolados por micro dissecação, o Centro Virtual da Universidade de Yale para o Perfil

de Expressão Celular em Arroz (Yale Virtual Center for Cellular Expression Profiling

of Rice Yale Rice Project: http://bioinformatics.med.yale.edu/riceatlas/overview.jspx).

Uma vez que foi identificada a presença do elemento RY Repeat na região

promotora do gene salT, tornou-se interessante a utilização desta ferramenta de

bioinformática para a análise do perfil transcricional do gene salT nos tecidos de

semente de arroz.

Segundo os resultados obtidos pelos ensaios de microarray desenvolvidos

pelo banco da Universidade de Yale, o gene salT apresenta alto nível de transcrição

em quatro tecidos de embrião de sementes, 12 h após a embebição – escutelo,

coleóptilo, epiblasto e radícula (figura 18). Nas células da plúmula o nível

transcricional do gene salT é baixo. Juntos, o escutelo (que absorve nutrientes do

tecido nutritivo) e o coleóptilo (que envolve e protege a plúmula) formam o

cotilédone, cuja função é transferir reservas alimentares do endosperma da semente

para o embrião até que as raízes e folhas estejam formadas, dando início aos

processos de fotossíntese e respiração. O epiblasto é uma formação de pequenas

dimensões em sementes, tida como um segundo cotilédone rudimentar, e a radícula

é o primórdio da raiz embrionária. O banco ainda não disponibilizou informações




para as outras partes da semente (casca e endosperma), porém, este estudo

preliminar permitiu sugerir que a transcrição do gene salT ocorre em tecidos de

reserva e meristemáticos.

Muito embora o banco ainda não esteja completo, já encontram-se

disponíveis publicamente informações acerca do perfil transcricional em alguns

tecidos e células de plantas de arroz. Sendo assim, foram analisados os microarrays

de diferentes tipos celulares provenientes de brotos, folhas e raízes. Os dados

gerados mostraram que o gene salT apresenta alto nível de transcrição na folha

inteira e na raiz inteira (figura 19). A folha de monocotiledôneas, como o arroz,

compreende os tecidos do limbo (lâmina foliar) e bainha. Então, muito embora não

sejam fornecidas informações no website do banco sobre o que consistem as

amostras de folha inteira, é possível que correspondam aos tecidos da lâmina e

bainha foliar. Uma vez que nenhum nível significante de transcrição foi detectado

nos tecidos da lâmina foliar, este dado pode sugerir que o alto nível transcricional do

gene salT encontrado na folha seja proveniente dos tecidos da bainha, que

corresponde à porção basal alargada, que une a lâmina foliar ao caule. Além disso,

os resultados obtidos nos ensaios de PCR em Tempo Real, anteriormente

apresentados pelo presente trabalho, que demonstraram que mesmo em situações

normais os tecidos da bainha foliar possuem elevados níveis de transcrição do gene

salT, corroboram tal hipótese. Desta forma, a presença de células meristemáticas na

região basal da bainha foliar (MATSUKURA et al., 1998) sugere, mais uma vez, que a

transcrição do gene salT pode ocorrer em tecidos meristemáticos. Porém, não se

deve descartar a possibilidade da transcrição deste gene ocorrer em algum tipo

celular específico presente nesta parte da folha.

O mesmo fato pôde ser observado nos resultados para raiz. O gene salT

apresentou um forte nível de transcrição somente nas amostras de raiz inteira, mas

como os tecidos meristemáticos não foram avaliados, pode ser que a sua

transcrição ocorra de forma mais intensa neste tipo de tecido. Além disso, o elevado

nível de transcrição observado na radícula de sementes, que possui tecido

meristemático na sua extremidade, corrobora tal hipótese.

As hipóteses aqui apresentadas só poderão ser confirmadas quando as

informações sobre o perfil transcricional nestes tecidos da raiz forem

disponibilizadas pelo banco, ou através de ensaios de PCR em Tempo Real.



6. CONCLUSÕES

6.1 – Foi detectada a presença dos elementos de transposição Castaway e

Stowaway na região promotora do gene salT dos cultivares Minami Hata Mochi e

Taichung Native 1. Em contrapartida, os cultivares Cica 8, Guarani, IAC 201, IAC

4440 e Metica-1 não possuem tais inserções;

6.2 – A transcrição do gene salT ocorre na bainha de plantas de arroz mesmo na

ausência do fator estressante;

6.3 – Não há correlação entre a presença dos elementos de transposição Castaway

e Stowaway e o perfil transcricional do gene salT em condições de estresse, o que

indica que tais inserções não afetam negativamente a atividade do promotor salT;

6.4 – Os níveis basais (controle) e finais (estresse) da proteína SALT não refletem

os níveis de transcrição do gene salT nas mesmas situações, sugerindo uma intensa

regulação pós-traducional de tal proteína;

6.5 – Foram identificados 10 potenciais sítios de ligação para fatores de transcrição

na região de 256 pb do promotor do gene salT através de análise in silico utilizando

o banco de dados OSIRIS;

6.6 – Foram construídos três plasmídios vetores repórteres contendo a “região de

256 pb + GUS”, “região de 256 pb + íntron salT + GUS” e “região de 256 pb + íntron

Act1 + GUS”;

6.7 – Somente a cepa de Agrobacterium tumefaciens contendo o plasmídeo original

pA19-GUS foi capaz de expressar o gene GUS, excluindo a possibilidade de

resultados falso-positivos nos tecidos de plantas;

6.8 – As análises de expressão transiente do gene GUS em tecido foliar de

Arabidopsis thaliana demonstraram a capacidade do íntron salT em aumentar a



expressão gênica, e mostrou, ainda, que tal capacidade é superior àquela obtida

pelo íntron Act1;

6.9 – A análise do perfil transcricional do gene salT no banco de expressão da

Universidade de Yale mostrou que tal gene é preferencialmente transcrito em

tecidos do embrião de semente. Adicionalmente, sugeriu-se sua intensa transcrição

na bainha das folhas e nos tecidos meristemáticos de raiz.



7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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O arroz a cultura mais importante do mundo, sendo a fonte ... · 1.1.1 – Origem e importância do arroz ... baseado na Teoria Centro do Gene. Porém, bem antes de qualquer evidência