“O PAPEL DA VIA HEDGEHOG NAS DOENÇAS INFLAMATÓRIAS INTESTINAIS”

““O PAPEL DA VIA HEDGEHOG NAS O PAPEL DA VIA HEDGEHOG NAS DOENÇAS INFLAMATÓRIAS DOENÇAS INFLAMATÓRIAS

INTESTINAIS”INTESTINAIS”

Projeto de Tese de MestradoProjeto de Tese de Mestrado

Agnes Naomi YoshimotoAgnes Naomi Yoshimoto

Orientador: Orientador:

Heitor Siffert Pereira de SouzaHeitor Siffert Pereira de Souza

Prof. Adjunto de Clínica Médica da Faculdade de Medicina da UFRJProf. Adjunto de Clínica Médica da Faculdade de Medicina da UFRJ

Programa de Pós-graduação em Ciências MédicasInstituto de Ciências BiomédicasUniversidade Federal do Rio de JaneiroHospital Universitário Clementino Fraga Filho

Doença inflamatória intestinalDoença inflamatória intestinal

Doenças inflamatórias intestinais, de Doenças inflamatórias intestinais, de etiologia multifatorial não totalmente etiologia multifatorial não totalmente conhecida, podendo ter acometimento conhecida, podendo ter acometimento extra-intestinal, curso crônico e variável, extra-intestinal, curso crônico e variável, com períodos de atividade e de remissãocom períodos de atividade e de remissão

Doença inflamatória intestinalDoença inflamatória intestinal

> 90%> 90%

Grande impacto na sociedade:Grande impacto na sociedade: Bimodal : acomete mais jovens dos 20 aos 40 anos e > 60 anos Bimodal : acomete mais jovens dos 20 aos 40 anos e > 60 anos

(15%)(15%)

Incidência : RCU 10 a 20 /100000 e DC 5 a 10 /100000, vem Incidência : RCU 10 a 20 /100000 e DC 5 a 10 /100000, vem aumentandoaumentando

Etiologia desconhecidaEtiologia desconhecida

Resposta terapêutica imprevisívelResposta terapêutica imprevisível

Doença de crohn Retocolite ulcerativa

Caracterizando RCU e DCCaracterizando RCU e DC

UC CD

Local Cólon Em todo Aparelho GI

Extensão da Inflamação

Mucosa e Submucosa

Transmural

Idade de Início 15-25 15-25

Prevalência (por 100.00)

35-100 10-100

Cirurgia/Ressecção Curativo Não curativo

Manifestações clínicasManifestações clínicas

RetocRetocolite Ulcerativaolite Ulcerativa

– Diarréia HemorrágicaDiarréia Hemorrágica

– Cólica abdominalCólica abdominal

– TenesmoTenesmo

– Perda de pesoPerda de peso

– Sintomas sistêmicosSintomas sistêmicos

– Manifestações extraintestinaisManifestações extraintestinais

– Os sintomas dependem da Os sintomas dependem da

extensão e gravidade da extensão e gravidade da

inflamaçãoinflamação

Doença de CrohnDoença de Crohn

– DiarréiaDiarréia

– ConstipaçãoConstipação

– Dor abdominal crônicaDor abdominal crônica

– Perda de pesoPerda de peso

– FebreFebre

– Doença perianalDoença perianal

– Manifestações extraintestinaisManifestações extraintestinais

– Os sintomas variam de acordo Os sintomas variam de acordo

com a localização da doençacom a localização da doença

Achados endoscópicos da DIIAchados endoscópicos da DII

RCURCU DCDC

Reprinted by permission of Blackwell Science, Inc. Lashner BA, Brzezinski A. In: Di Marino AJ,

Benjamin SB (eds). Gastrointestinal Disease: An Endoscopic Approach. 1997:582-592.

Localização e extensão DIILocalização e extensão DII

RCURCU DCDC

30%Proctite

40%Colite Distal/ Lateral Esquerda

30%Extensa/Pancolite

40%Ileocolite

30%Ileíte/Jejunoileíte

25%Colite

5% Gastroduodenite

Achados histopatológicosAchados histopatológicosCU DC

Todas as amostras inflamadas Biópsia distal de espécime mais severa Doença mucosa Abcesso cripto Ingurgitação capilar e venular Sem tecido/fibrose de granulação

Amostras normais Nenhuma amostra de inflamação Doença transmural Infiltrado mononuclear Linfangiectasia Tecido/fibrose de granulação

Coliten transmural do cólonInfiltrado mononuclear e microabscesso cripta

Adaptado de: Fiocchi C, Gastroenterology 1998; 115: 182

ETIOPATOGENIA DAS DIIETIOPATOGENIA DAS DIIFATORESFATORES

GENÉTICOS e GENÉTICOS e AMBIENTAISAMBIENTAIS

COMENSAISCOMENSAISALIMENTOSALIMENTOSPATPATÓÓGENOGENO

SISTEMASISTEMAIMUNITÁRIOIMUNITÁRIO

SISTEMASISTEMANÃO-LINFÓIDENÃO-LINFÓIDE

ENZIMASENZIMAS PROTEOLÍTICASPROTEOLÍTICAS

ESTIMULAÇÃO

MEDIADORES SOLÚVEISMEDIADORES SOLÚVEIS

MOLÉCULAS DE ADESÃOMOLÉCULAS DE ADESÃO

INFLAMAÇÃO

NEUROPEPTÍDIOSNEUROPEPTÍDIOSMROMRONONO

FATORES DEFATORES DECRESCIMENTOCRESCIMENTOANTICORPOSANTICORPOS

AUTOANTICORPOSAUTOANTICORPOS

EICOSANÓIDESEICOSANÓIDES

CITOCINASCITOCINAS

GenéticaGenética Etiologia poligEtiologia poligêênicanica

Identificados Identificados lociloci de suscetibilidade IBD1-IBD9 de suscetibilidade IBD1-IBD9

Maioria requer confirmação e validação funcionalMaioria requer confirmação e validação funcional

Polimorfismos do CARD15/NOD2 no Polimorfismos do CARD15/NOD2 no locuslocus IBD1 predispõem a DC IBD1 predispõem a DC

((Hugot et al. 2001; Ogura et al., 2001Hugot et al. 2001; Ogura et al., 2001))

Variantes do SLC22A4/A5 no Variantes do SLC22A4/A5 no locuslocus IBD5 predispõem a DC IBD5 predispõem a DC ((Petekova Petekova

et al., 2004et al., 2004))

Variantes do DLG5 no Variantes do DLG5 no locuslocus IBD5 predispõem a DC IBD5 predispõem a DC ((Stoll et al., Stoll et al.,

20042004))

Variantes do ICAM-1 no Variantes do ICAM-1 no locuslocus IBD6 t IBD6 têêm associação com DII m associação com DII ((Neville Neville

et al., 2004et al., 2004))

Associação de variantes com DC tAssociação de variantes com DC têêm influm influêência sobre fenótipo, mas ncia sobre fenótipo, mas

sofrem variação populacionalsofrem variação populacional

Normal ou anormal ?

Microflora entéricaMicroflora entérica

Aumento de bactérias anaeróbicasAumento de bactérias anaeróbicas

Redução de Redução de Bifidobacterium Bifidobacterium e e LactobacillusLactobacillus

Perda da tolerância para bactérias normais?

Reposta imunitária contra bactérias de baixa patogenicidade?

Alterações quantitativas e qualitativas Alterações quantitativas e qualitativas

Genética Ambiental/Infecciosa

Fatores imunitários e não imunitários

Etiologia

Inflamação intestinal crônica: Inflamação intestinal crônica: desequilíbrio de mediadores imunológicosdesequilíbrio de mediadores imunológicos

Pró-inflamatóriosPró-inflamatórios

Anti-inflamatóriosAnti-inflamatórios

Polarização da reposta imunitária nas DII

Doença de Doença de CrohnCrohn

Retocolite Retocolite ulcerativaulcerativa

INFLAMAINFLAMAÇÃÇÃO O FISIOLFISIOLÓÓGICAGICA

INFLAMAINFLAMAÇÃÇÃO O CONTROLADACONTROLADA

DOENDOENÇÇA DE A DE CROHNCROHN

COMENSAISCOMENSAIS PATPATÓÓGENOSGENOSALIMENTOSALIMENTOS

PROLIFERAÇÃOPROLIFERAÇÃO APOPTOSEAPOPTOSE

Linf. TLinf. T Linf. TLinf. T

DécadaDécada MedicamentoMedicamento

19401940 SulfassalazinaSulfassalazina

19501950 CorticCorticóóides, ACTHides, ACTH

19601960 AzatioprinaAzatioprina

19701970 5-ASA5-ASA

19801980 6-MP, metronidazol, dieta elemental6-MP, metronidazol, dieta elemental

1990 (in1990 (iníício)cio) Ciclosporina, metotrexate, budesonida Ciclosporina, metotrexate, budesonida

1990 (final)1990 (final) T. biológicas, prT. biológicas, pró-ó-bibióóticos, leucafereseticos, leucaferese

20002000 Modulação da sobrevida celularModulação da sobrevida celular

Evolução da terapia das DII: Evolução da terapia das DII: resultado da resultado da compreensão dos mecanismos patogênicoscompreensão dos mecanismos patogênicos

Via de sinalizaçãoVia de sinalização Hedgehog Hedgehog

Via de sinalização – HedgehogVia de sinalização – Hedgehog

pertencem a uma família de moléculas de pertencem a uma família de moléculas de sinalização intracelular originalmente sinalização intracelular originalmente identificadas na identificadas na DrosophilaDrosophila, gene descoberto , gene descoberto 19921992

Com 3 homólogos em vertebrados (Ihh, Dhh, Com 3 homólogos em vertebrados (Ihh, Dhh, Shh), dentre os quais Shh tem sido a mais Shh), dentre os quais Shh tem sido a mais bem estudadabem estudada

Sintetizada como uma proteína precursora Sintetizada como uma proteína precursora de 45 kDa, Shh sofre autoproteólise gerando de 45 kDa, Shh sofre autoproteólise gerando um domínio C-terminal e outro N-terminal um domínio C-terminal e outro N-terminal (atividade sinalizadora). O domínio Shh-C (atividade sinalizadora). O domínio Shh-C atua como colesterol-transferase, atua como colesterol-transferase, modificando a estrutura de Shh-Nmodificando a estrutura de Shh-N

Physiol Rev • VOL 87 • OCTOBER 2007

Shh interage com um complexo receptor composto de duas proteínas trans-Shh interage com um complexo receptor composto de duas proteínas trans-membrana, membrana, patchedpatched (ptc) (ptc) e e smoothenedsmoothened (smo). (smo). Ptc constitui a sub-unidade de Ptc constitui a sub-unidade de ligação, enquanto que smo é responsável pela transdução do sinal que, por ligação, enquanto que smo é responsável pela transdução do sinal que, por sua vez, é mediada pela família sua vez, é mediada pela família GliGli de fatores de transcrição (Gli1, 2 e 3). de fatores de transcrição (Gli1, 2 e 3).


A via de sinalização Shh é fundamental na regulação de processos de A via de sinalização Shh é fundamental na regulação de processos de desenvolvimento embrionário de vários órgãos e tecidos (morfogênese do desenvolvimento embrionário de vários órgãos e tecidos (morfogênese do TGI), e sua reativação estaria associada ao aparecimento de tumores TGI), e sua reativação estaria associada ao aparecimento de tumores malignos (pâncreas).malignos (pâncreas).

A via também atua na homeostasia do cólon adulto. Evidências sugerem A via também atua na homeostasia do cólon adulto. Evidências sugerem seu envolvimento na maturação dos enterócitos.seu envolvimento na maturação dos enterócitos.

Enterócitos de ratos tratados com ciclopamina ( inibidor do Smo), Enterócitos de ratos tratados com ciclopamina ( inibidor do Smo), apresentou aumento Bmp4 ( alvo epitelial Wnt ) das bases da cripta em apresentou aumento Bmp4 ( alvo epitelial Wnt ) das bases da cripta em direção ao topo das criptasdireção ao topo das criptas

Acredita-se que a via hegdeghog atuaria restringindo a atividade Wnt na Acredita-se que a via hegdeghog atuaria restringindo a atividade Wnt na base da criptabase da cripta


Recentemente, foi demonstrado a presença da via Shh como componente Recentemente, foi demonstrado a presença da via Shh como componente fisiológico da resposta de linfócitos T periféricos e também em processos fisiológico da resposta de linfócitos T periféricos e também em processos imunopatológicosimunopatológicos

A análise do ciclo celular de linfócitos T CD4 isolados do sangue e A análise do ciclo celular de linfócitos T CD4 isolados do sangue e estimulados com Shh, revelou que a adição exógena de Shh aumenta a estimulados com Shh, revelou que a adição exógena de Shh aumenta a proliferação celular de células ativadas via TCR e o bloqueio com anticorpo proliferação celular de células ativadas via TCR e o bloqueio com anticorpo anti-Shh diminui a proliferação .anti-Shh diminui a proliferação .

Os mecanismos pelos quais Shh contribui para a homeostase de células Os mecanismos pelos quais Shh contribui para a homeostase de células imunitárias e a neovascularização são pouco compreendidos. É possível imunitárias e a neovascularização são pouco compreendidos. É possível que a via Shh esteja envolvida na patogênese das DII. que a via Shh esteja envolvida na patogênese das DII.


ProjetoProjeto

A via de sinalização Shh está envolvida na A via de sinalização Shh está envolvida na proliferação de células inflamatórias da proliferação de células inflamatórias da mucosa intestinal e na angiogênese,mucosa intestinal e na angiogênese, constituintes fundamentais do processo constituintes fundamentais do processo inflamatório crônico das DIIinflamatório crônico das DII

Objetivos e metasObjetivos e metas1) Investigar a expressão 1) Investigar a expressão e modulação da via Shh e modulação da via Shh na mucosa intestinal de na mucosa intestinal de pacientes com DII.pacientes com DII.

1.1 localizar, identificar e 1.1 localizar, identificar e quantificar as células que quantificar as células que expressam Shh na mucosa expressam Shh na mucosa intestinal de pacientes com DII intestinal de pacientes com DII e em controles;e em controles;

1.2 estudar a expressão e 1.2 estudar a expressão e modulação de Shh em modulação de Shh em mononucleares isolados da mononucleares isolados da lâmina própria intestinal;lâmina própria intestinal;

2) Investigar a atividade 2) Investigar a atividade biológica de Shh nas DII.biológica de Shh nas DII.

2.1 analisar proliferação e apoptose de 2.1 analisar proliferação e apoptose de células mononucleares da lâmina própria células mononucleares da lâmina própria isoladas da mucosa intestinal e tratadas isoladas da mucosa intestinal e tratadas com adição ou bloqueio de Shh;com adição ou bloqueio de Shh;

2.2 analisar a expressão de citocinas 2.2 analisar a expressão de citocinas pró-inflamatórias e regulatórias, e de pró-inflamatórias e regulatórias, e de fatores angiogênicos, da mucosa fatores angiogênicos, da mucosa intestinal tratada com adição ou bloqueio intestinal tratada com adição ou bloqueio de Shh;de Shh;

2.3 analisar as vias de sinalização que 2.3 analisar as vias de sinalização que regulam a transdução de Shh. regulam a transdução de Shh.

Material e métodosMaterial e métodos PacientesPacientes

Espécimens cirúrgicos e biópsias endoscópicas de áreas inflamadas e não-Espécimens cirúrgicos e biópsias endoscópicas de áreas inflamadas e não-inflamadas da mucosa intestinal de pacientes com DII e de controles inflamadas da mucosa intestinal de pacientes com DII e de controles

Adultos de qualquer origem etnica que tenham concordado e assinado o termo Adultos de qualquer origem etnica que tenham concordado e assinado o termo de consentimento já aprovado pelo CEPde consentimento já aprovado pelo CEP

O diagnóstico de DII será baseado em critérios clínicos, laboratoriais, O diagnóstico de DII será baseado em critérios clínicos, laboratoriais, radiológicos, endoscópicos, e histológicos usuais.radiológicos, endoscópicos, e histológicos usuais.

Variáveis relacionadas com o diagnóstico de DII (atividade clínica da doença, Variáveis relacionadas com o diagnóstico de DII (atividade clínica da doença, extensão do acometimento intestinal, tempo de doença, tipo de tratamento) extensão do acometimento intestinal, tempo de doença, tipo de tratamento) serão registradas e consideradas na análise final de resultados .serão registradas e consideradas na análise final de resultados .

Serão utilizados os índices de atividade de doença Harvery e Bradshaw para Serão utilizados os índices de atividade de doença Harvery e Bradshaw para DC, e o de Truelove & Witts, para RCUI .DC, e o de Truelove & Witts, para RCUI .

Material e métodosMaterial e métodos PacientesPacientes

Critérios de exclusão: risco teórico excessivo de sangramento, ou de intolerância Critérios de exclusão: risco teórico excessivo de sangramento, ou de intolerância a procedimentos endoscópicos prolongados e pacientes em uso de AntiTNF.a procedimentos endoscópicos prolongados e pacientes em uso de AntiTNF.

20 ml de sangue periférico poderão ser coletados no momento do procedimento 20 ml de sangue periférico poderão ser coletados no momento do procedimento endoscópico ou cirúrgico após terem assinado termo de consentimento livre e endoscópico ou cirúrgico após terem assinado termo de consentimento livre e informado.informado.

O estudo apresentará um caráter confidencial durante todas as etapas do O estudo apresentará um caráter confidencial durante todas as etapas do projeto, sendo os dados pessoais conhecidos apenas pelo investigador principal. projeto, sendo os dados pessoais conhecidos apenas pelo investigador principal.

Material e métodosMaterial e métodos 1) Investigar a expressão e modulação da via Shh na mucosa 1) Investigar a expressão e modulação da via Shh na mucosa

intestinal de pacientes com DIIintestinal de pacientes com DII

1.1 1.1 localizar, identificar e quantificar as células que expressam Shh localizar, identificar e quantificar as células que expressam Shh na mucosa intestinalna mucosa intestinal..

técnicas de imunohistoquímica, (anticorpos monoclonais tais como o anti-Shh técnicas de imunohistoquímica, (anticorpos monoclonais tais como o anti-Shh N-19, anti-ptc C-20 e anti Gli1) N-19, anti-ptc C-20 e anti Gli1) A análise das lâminas será feita ao A análise das lâminas será feita ao microscópio óptico, com o auxílio de um programa computadorizado para microscópio óptico, com o auxílio de um programa computadorizado para captura e análise de imagens captura e análise de imagens

estudos de imunofluorescência dupla serão analisados com microscopia estudos de imunofluorescência dupla serão analisados com microscopia confocal (identificar as principais células que expressam as proteínas da via confocal (identificar as principais células que expressam as proteínas da via Shh). Shh).

Material e métodosMaterial e métodos 1.2 1.2 estudar a expressão e modulação de Shh em estudar a expressão e modulação de Shh em

mononucleares isolados da lâmina própria intestinalmononucleares isolados da lâmina própria intestinal. .

Células mononucleares da lâmina própria intestinal (LPMC) são isoladas de Células mononucleares da lâmina própria intestinal (LPMC) são isoladas de biópsias endoscópicas ou tecido cirúrgicobiópsias endoscópicas ou tecido cirúrgico

Células mononucleares do sangue periférico (PBMC) serão separadas por Células mononucleares do sangue periférico (PBMC) serão separadas por centrifugação de 20 ml de sangue em gradientes de Ficol-Hypaque.centrifugação de 20 ml de sangue em gradientes de Ficol-Hypaque.

As LPMC e as PBMC isoladas serão analisadas a fresco e em culturas As LPMC e as PBMC isoladas serão analisadas a fresco e em culturas estimuladas com fatores de crescimento (IL-2, através do receptor de estimuladas com fatores de crescimento (IL-2, através do receptor de linfócitos T (TCR), utilizando anti-CD3, com ou sem co-estimulação com linfócitos T (TCR), utilizando anti-CD3, com ou sem co-estimulação com anti-CD28, e a exposição a produtos bacterianos (LPS). anti-CD28, e a exposição a produtos bacterianos (LPS).



As células serão analisadas com relação à mensagem (mRNA) e à As células serão analisadas com relação à mensagem (mRNA) e à expressão de proteínas da via Shh. expressão de proteínas da via Shh.

LPMC terão RNA extraído para a análise por RT-PCR de RNA mensageiro LPMC terão RNA extraído para a análise por RT-PCR de RNA mensageiro (mRNA), que codifica Shh, ptc, Smo ou Gli1. (mRNA), que codifica Shh, ptc, Smo ou Gli1. PrimersPrimers especificos para especificos para Shh, ptc, smo, e Gli1 serão desenhados.Shh, ptc, smo, e Gli1 serão desenhados.

Western blot e imunohistoquímica/imunofluorescência de slides de Western blot e imunohistoquímica/imunofluorescência de slides de cytospin com LPMC. cytospin com LPMC.

Material e métodosMaterial e métodos

2) Investigar a atividade biológica de Shh nas DII2) Investigar a atividade biológica de Shh nas DII

2.1 2.1 analisar a expressão de citocinas e fatores analisar a expressão de citocinas e fatores angiogênicosangiogênicos..

Sobrenadantes de cultura de órgãos ou de culturas de LPMC, Sobrenadantes de cultura de órgãos ou de culturas de LPMC, tratados por 24 horas com peptídeo Shh amino-terminal, ou do tratados por 24 horas com peptídeo Shh amino-terminal, ou do anticorpo anti-Shh, ou de ciclopamina, serão coletados para a anticorpo anti-Shh, ou de ciclopamina, serão coletados para a análise de citocinas (IFN-g, TNF-alpha, IL-17 e IL-10, VEGF e análise de citocinas (IFN-g, TNF-alpha, IL-17 e IL-10, VEGF e TGFβ) por meio de ELISA. TGFβ) por meio de ELISA.

Material e métodosMaterial e métodos 2.2 2.2 analisar proliferação e apoptose de células mononucleares analisar proliferação e apoptose de células mononucleares

isoladas da lâmina própria intestinal tratadas com adição ou bloqueio isoladas da lâmina própria intestinal tratadas com adição ou bloqueio de Shh.de Shh.

As LPMC isoladas são colocadas em cultura na presença ou ausência do peptídeo As LPMC isoladas são colocadas em cultura na presença ou ausência do peptídeo biologicamente ativo Shh amino-terminal (5 e 20 ug/ml), ou do anticorpo anti-Shh biologicamente ativo Shh amino-terminal (5 e 20 ug/ml), ou do anticorpo anti-Shh (50 e 2500 ug/ml), ou de ciclopamina (5uM), um inibidor especifico da via Shh, com (50 e 2500 ug/ml), ou de ciclopamina (5uM), um inibidor especifico da via Shh, com ou sem estimulação adicional.ou sem estimulação adicional.

Para a análise da proliferação celular utilizaremos marcador intracelular (Vybrant Para a análise da proliferação celular utilizaremos marcador intracelular (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit). Após a marcação as células são colocadas em cultura CFDA SE Cell Tracer Kit). Após a marcação as células são colocadas em cultura sem estimulação ou com anti-CD3 mAb (OKT3; 10 µg/ml), anti-CD28 (5µg/ml) e IL-sem estimulação ou com anti-CD3 mAb (OKT3; 10 µg/ml), anti-CD28 (5µg/ml) e IL-2 (20 U/ml). 2 (20 U/ml).

No quarto dia, as células coletadas serão analisadas por citometria de fluxo. Para a No quarto dia, as células coletadas serão analisadas por citometria de fluxo. Para a avaliação da viabilidade celular e fases precoce e tardia de apoptose, células serão avaliação da viabilidade celular e fases precoce e tardia de apoptose, células serão marcadas com Annexin-V/7-AAD Kit .marcadas com Annexin-V/7-AAD Kit .


2.3 2.3 analisar as vias de sinalização que regulam a analisar as vias de sinalização que regulam a transdução de Shhtransdução de Shh..

Para a avaliação das vias de sinalização que regulam a transdução de Para a avaliação das vias de sinalização que regulam a transdução de Shh, trataremos células em cultura com os inibidores LY294002, da Shh, trataremos células em cultura com os inibidores LY294002, da phosphoinositide 3-kinase phosphoinositide 3-kinase (PI3-kinase), ou PD98059, da (PI3-kinase), ou PD98059, da mitogen-mitogen-activated protein kinasesactivated protein kinases (MAPK), na presença ou ausência de anti- (MAPK), na presença ou ausência de anti-CD3+anti-CD28, IL-2, ou LPS. Lisados celulares serão analisados por CD3+anti-CD28, IL-2, ou LPS. Lisados celulares serão analisados por Western blot para a avaliação dos níveis de pAkt, p38, pErk, e de Shh. Western blot para a avaliação dos níveis de pAkt, p38, pErk, e de Shh.

Material e métodosMaterial e métodosAnálise estatísticaAnálise estatística

Os dados obtidos em cada etapa do projeto serão armazenados em Os dados obtidos em cada etapa do projeto serão armazenados em planilhas diferentes para posteriormente serem analisados com o auxílio de planilhas diferentes para posteriormente serem analisados com o auxílio de um programa de análise estatística por computador um programa de análise estatística por computador (SPSS for Windows). (SPSS for Windows).

Será realizada estatística descritiva para cada variável de desfecho. Os Será realizada estatística descritiva para cada variável de desfecho. Os resultados de diferentes grupos serão comparados pelo teste-t, ou pelo resultados de diferentes grupos serão comparados pelo teste-t, ou pelo teste t-pareado para comparações antes e após tratamento, ou de áreas teste t-pareado para comparações antes e após tratamento, ou de áreas acometidas e não-acometidas dos mesmos indivíduos, e por tabelas de acometidas e não-acometidas dos mesmos indivíduos, e por tabelas de contingência, ou por contingência, ou por ANOVAANOVA com comparações múltiplas pareadas. com comparações múltiplas pareadas.

Coeficientes de correlação serão utilizados para análise de variáveis Coeficientes de correlação serão utilizados para análise de variáveis numéricas quantitativas. O nível de significância será estabelecido em numéricas quantitativas. O nível de significância será estabelecido em

p<0,05.p<0,05.

Resultados preliminaresResultados preliminares 1) Investigar a expressão e modulação da via Shh na mucosa intestinal de 1) Investigar a expressão e modulação da via Shh na mucosa intestinal de

pacientes com DIIpacientes com DII 1.1 1.1 localizar, identificar e quantificar as células que expressam Shh na localizar, identificar e quantificar as células que expressam Shh na

mucosa intestinalmucosa intestinal..

técnicas de imunohistoquímica, (anticorpos monoclonais tais como o anti-Shh técnicas de imunohistoquímica, (anticorpos monoclonais tais como o anti-Shh N-19, e anti Gli1) N-19, e anti Gli1) A análise das lâminas foi feita ao microscópio óptico, com o A análise das lâminas foi feita ao microscópio óptico, com o auxílio de um programa computadorizado para captura e análise de imagensauxílio de um programa computadorizado para captura e análise de imagens

estudos de imunofluorescência dupla serão analisados com microscopia estudos de imunofluorescência dupla serão analisados com microscopia confocal (identificar as principais células que expressam as proteínas da via confocal (identificar as principais células que expressam as proteínas da via Shh) : Shh) : 36 casos (11 pacientes controle/ 11 com DC e 14 com RCU) de lâminas 36 casos (11 pacientes controle/ 11 com DC e 14 com RCU) de lâminas já cortadasjá cortadas

Controle DC RCU

Anti Gli 1 6 8 7

Anti Shh 3 3 3

Resultados preliminaresResultados preliminaresimunohistoquimica Shh - controleimunohistoquimica Shh - controle

Resultados preliminaresResultados preliminaresimunohistoquimica Shh - DCimunohistoquimica Shh - DC

Resultados preliminaresResultados preliminaresimunohistoquimica Shh - DCimunohistoquimica Shh - DC

Resultados preliminaresResultados preliminaresimunohistoquimica Shh - RCUimunohistoquimica Shh - RCU

Resultados preliminaresResultados preliminaresimunohistoquimica Shh - RCUimunohistoquimica Shh - RCU

Resultados preliminaresResultados preliminarescontagem de célulascontagem de células

333N =

RCUICrohncontrol

Sh

h

30

20

10

0

% de células positivas na totalidade da lâmina própria

4.5

17.6

9.6

P<0.046 entre grupo controle e DC

Resultados preliminaresResultados preliminaresimunohistoquimica Gli1 - controleimunohistoquimica Gli1 - controle

Resultados preliminaresResultados preliminaresimunohistoquimica Gli1 - DCimunohistoquimica Gli1 - DC

Resultados preliminaresResultados preliminaresimunohistoquimica Gli1 - DCimunohistoquimica Gli1 - DC

Resultados preliminaresResultados preliminaresimunohistoquimica Gli1 - RCUimunohistoquimica Gli1 - RCU

Resultados preliminaresResultados preliminaresimunohistoquimica Gli1 - RCUimunohistoquimica Gli1 - RCU

Resultados preliminaresResultados preliminarescontagem de célulascontagem de células

786N =

RCUICrohncontrol

gli-

1

40

30

20

10

0

% de células positivas na totalidade da lâmina própria

10.7

29.5

22

P<0.02 entre grupo controle e DC

Resultados preliminaresResultados preliminares

Shh – marcação periféricaShh – marcação periférica

Shh / controle Shh / DC Shh / RCU

Epitélio superficial

presente ++ Presente + Presente +

Base criptas Presente ++ Presente +

Lâmina própria Presente ++ Presente +

Resultados preliminaresResultados preliminares

Gli 1 – marcação forte nuclearGli 1 – marcação forte nuclear

Gli / controle Gli / DC Gli / RCU

Epitélio superficial

presente +++ Presente + Presente +

Base criptas Presente ++ Presente +

Lâmina própria Presente +++ Presente +

Resultados preliminaresResultados preliminares Sabemos que a via hedgehog encontra-se presente na homeostasia Sabemos que a via hedgehog encontra-se presente na homeostasia

dos enterócitos de cólon adulto e nos linfócitos T. dos enterócitos de cólon adulto e nos linfócitos T.

Marcação do Anti-Gli 1 é nuclear e Anti Shh é periférica.Marcação do Anti-Gli 1 é nuclear e Anti Shh é periférica.

Nas lâminas analisadas de cólon com Doença de Crohn marcadas Nas lâminas analisadas de cólon com Doença de Crohn marcadas

com Anti Shh e Anti Gli1 observam-se maior marcação na lâmina com Anti Shh e Anti Gli1 observam-se maior marcação na lâmina própria, assim como na RCU, ou seja há marcação das proteínas da própria, assim como na RCU, ou seja há marcação das proteínas da via hedghog nas células mononucleares que encontram-se via hedghog nas células mononucleares que encontram-se aumentados nessa patologia e também nas bases das criptas.aumentados nessa patologia e também nas bases das criptas.

A demonstração do aumento da expressão da via Shh na mucosa A demonstração do aumento da expressão da via Shh na mucosa intestinal apóia a hipótese do aumento da proliferação celular das intestinal apóia a hipótese do aumento da proliferação celular das LPMC e ainda sustenta o fenômeno de angiogênese local.LPMC e ainda sustenta o fenômeno de angiogênese local.



As células serão analisadas com relação à mensagem (mRNA) e à As células serão analisadas com relação à mensagem (mRNA) e à expressão de proteínas da via Shh. expressão de proteínas da via Shh.

LPMC terão RNA extraído para a análise por RT-PCR de RNA mensageiro LPMC terão RNA extraído para a análise por RT-PCR de RNA mensageiro (mRNA), que codifica Shh, ptc, Smo ou Gli1. (mRNA), que codifica Shh, ptc, Smo ou Gli1. PrimersPrimers especificos para especificos para Shh, ptc, smo, e Gli1 serão desenhadosShh, ptc, smo, e Gli1 serão desenhados

15 amostras coletadas (8 controles, 4 RCU e 3 DC)15 amostras coletadas (8 controles, 4 RCU e 3 DC)


2) Investigar a atividade biológica de Shh nas DII2) Investigar a atividade biológica de Shh nas DII

2.1 2.1 analisar a expressão de citocinas e fatores analisar a expressão de citocinas e fatores angiogênicosangiogênicos..

Sobrenadantes de cultura de órgãos ou de culturas de LPMC, Sobrenadantes de cultura de órgãos ou de culturas de LPMC, tratados por 24 horas com peptídeo Shh amino-terminal, e do tratados por 24 horas com peptídeo Shh amino-terminal, e do anticorpo anti-Shhanticorpo anti-Shh, ou de ciclopamina, serão coletados para a , ou de ciclopamina, serão coletados para a análise de citocinas (IFN-g, TNF-alpha, IL-17 e IL-10, VEGF e análise de citocinas (IFN-g, TNF-alpha, IL-17 e IL-10, VEGF e TGFβ) por meio de ELISA. TGFβ) por meio de ELISA.

Material de 8 controles, 4 RCU e 3 DCMaterial de 8 controles, 4 RCU e 3 DC

CronogramaCronogramaAtividades / Bimestre 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Pesquisa bibliográfica X X X X X X X X X X X X

Coleta de material X X X X

Histologia X X X

Imunohistoquímica X X X X

Imunofluorescência/confocal X X X X X

Culturas/ELISA X X X

RT-PCR X X X

Citometria de fluxo X X X X

Western blot/Cytospin X X X X

Tabulção e análise estatística X X X X

Redação de artigos I X X X

Apresentação de resultados I X X

BibliografiaBibliografia Murone M, Rosenthal A, de Sauvage FJ

. Hedgehog signal transduction: from flies to vertebrates. Exp Cell Res 1999;253:25-33.

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angiogenic growth factors. Nat Med 2001;7:706-711angiogenic growth factors. Nat Med 2001;7:706-711..

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“O PAPEL DA VIA HEDGEHOG NAS DOENÇAS INFLAMATÓRIAS INTESTINAIS”