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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
NAYARA MACÊDO PEIXOTO
OBTENÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS A PARTIR DAS
SEMENTES DE Adenanthera pavonina L. UTILIZANDO EXTRAÇÃO
ASSISTIDA POR ENZIMAS
CAMPINAS
2017
NAYARA MACÊDO PEIXOTO
OBTENÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS A PARTIR DAS
SEMENTES DE Adenanthera pavonina L. UTILIZANDO EXTRAÇÃO
ASSISTIDA POR ENZIMAS
Dissertação apresentada à Faculdade de
Engenharia de Alimentos da Universidade
Estadual de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do título de
Mestra em Ciência de Alimentos.
Orientador (a): Prof.ª Dr.ª Glaucia Maria Pastore
Coorientador: Prof. Dr. Ruann Janser Soares de Castro
Este exemplar corresponde à versão final da dissertação
defendida pela aluna Nayara Macêdo Peixoto, e orientada pela
Prof.ª Dr.ª Glaucia Maria Pastore.
CAMPINAS
2017
BANCA EXAMINADORA
________________________________________
Prof.a Dr.a Glaucia Maria Pastore
Orientadora
DCA/FEA/UNICAMP
________________________________________
Dr.a Renata Aparecida Soriano Sancho
Membro Titular
________________________________________
Prof.a Dr.a Fabíola Aliaga de Lima
Membro Titular
DEQ/EPUSP
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida
acadêmica do aluno.
“Tenho em mim todos os sonhos do mundo. ”
Fernando Pessoa
Dedico esse trabalho primeiramente a Deus por
sua infinita bondade, aos meus pais, as minhas
irmãs, aos meus sobrinhos e cunhados, e também a
todos os meus amigos.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, que foi o grande responsável por todas as minhas conquistas e
que cuidou de todos os detalhes para que esse momento fosse tão especial. Não me
abandonando em nenhum momento durante toda essa jornada, me dando força e coragem para
enfrentar todos os desafios. Me abriu caminhos, me permitiu desfrutar de momentos tão
enriquecedores, colocou no meu caminho pessoas tão generosas e acolhedoras, me fez crescer
profissionalmente e pessoalmente, e me fez ver que eu sou capaz de tudo ao seu lado.
Se há algo que faz diferença na formação da personalidade e na vida de uma pessoa é
o amor que ela recebe durante a vida. Entender a diferença entre ter e ser foi algo que aprendi
desde cedo, já que seus valores e princípios me foram ensinados em cada ação e em todos os
momentos que você abdicou dos seus sonhos para viver os meus. Mainha, Elba Maria Macêdo
Peixoto, te dedico todas as minhas vitórias. A senhora é a principal responsável pela minha
felicidade diária e por toda motivação que tenho em cada desafio. A SENHORA É A MINHA
PESSOA FAVORITA NO MUNDO.
À Painho, Francisco Peixoto Pinheiro, por sempre me ensinar qual o melhor caminho
a seguir, por ser uma referência de integridade, honestidade e amor, pela serenidade e sacrifícios
dedicados as suas filhas e pela sua incrível capacidade de ser a força e segurança da nossa
família. Sou uma filha orgulhosa do homem que o senhor é, da sua capacidade de ser tão forte
diante das dificuldades de criar 6 filhas e por fazer isso com tanta sabedoria. Lhe devo por todas
as coisas boas que só me trazem a certeza de que ser sua filha foi a maior sorte que eu tive.
À minha irmã, Tatiany Macêdo Peixoto Correia, por me incentivar na realização
deste sonho, pela sua capacidade de se reinventar cada vez que a vida nos prega uma peça e
mais ainda por ser meu maior exemplo força, fé e esperança.
À minha irmã, Viviany Macêdo Peixoto Silva, por seu apoio incondicional em todas
as fases da minha vida, por me encorajar a enfrentar meus medos e ser forte nas minhas decisões
e além de tudo isso, ainda encontrar tempo para ser meu exemplo de mãe, esposa e amiga.
À minha irmã, Cristiany Macêdo Peixoto Vasconcelos, pela sua generosidade e por
cuidar tão bem de mim, por sua bondade infinita e inspiradora, por me tranquilizar todas as
vezes que eu tive medo, por ser meu principal exemplo de profissionalismo e dedicação com
todos.
À minha irmã, Naiany Macêdo Peixoto, por desde pequena ter por mim os
sentimentos mais lindos e puros que uma irmã pode sentir por outra: amor e proteção, por
sempre me motivar e acreditar em mim, mesmo quando eu não acreditava. Por me fazer sentir
tão especial e única em sua vida. Se eu pudesse escolher outra forma de ser, eu escolheria ser
você.
À minha irmã, Nayra Larissa Macêdo Peixoto, por ser a melhor amiga e confidente
que eu poderia ter na vida. Você está no topo da lista das irmãs porque minha vida sempre foi
totalmente ligada à sua, sempre estivemos juntas em todos os momentos, só você me entende
perfeitamente. Te amo como minha filha, pois encontro em você todas as respostas da minha
vida.
Aos meus cunhados, Haroldo Máximo, Leonardo Holanda e Carlos Eduardo
(Cadu), pelos momentos de diversão e serenidade, pelos conselhos e cuidados que vocês sempre
tiveram comigo, mas principalmente por unirem ainda mais nossa família.
Aos meus sobrinhos, Júlia, Leonardo, Lucca e Gustavo por me mostrarem que eu
sou capaz de amar muito além do que eu conhecia, vocês são as pessoas mais puras e bondosas
de coração que eu conheço, amo todos os nossos momentos de brincadeira, com vocês me sinto
completamente realizada.
À minha orientadora, Prof.ª Dr.ª Glaucia Maria Pastore, por ter sido sempre tão
generosa e atenciosa comigo. Pela incrível capacidade que a senhora tem de ser tão paciente e
parceira dos seus alunos, pela confiança dedicada a mim e pela oportunidade e apoio no
desenvolvimento deste projeto.
Ao meu coorientador e amigo, Prof. Dr. Ruann Janser Soares de Castro, por me
motivar em todas nossas reuniões, por suas correções e incentivo, por ser tão paciente e
generoso, por acreditar em mim em todos os momentos e por me inspirar tanto
profissionalmente.
Aos meus revisores, Hélia Sato, Fabíola Lima, Renata Sancho e Cinthia Bau, pelos
conselhos, ensinamentos e paciência na correção deste projeto.
Ao Gustavo Araujo Pereira, que foi a melhor surpresa que esse mestrado me trouxe.
Obrigada pela paciência, segurança e amor dedicados a mim com tanta verdade, por seu jeito
incrível de ser e pela paz, calma e serenidade que você me transmite.
Ao meu amigo, Henrique Silvano Arruda, que durante todo este projeto se manteve
sempre a disposição, me ensinando e auxiliando em todas as fases desse momento tão
desafiador, com você compartilhei várias horas de trabalho e também momentos de estudos e
diversão.
À minha amiga, Livia Prado, por ser tão presente na minha vida, por me ensinar tanto,
por me ajudar nas minhas dúvidas durante o desenvolvimento deste projeto, pelos conselhos e
dicas e pelos momentos de diversão.
À Angel, pelo incentivo, comprometimento, ajuda e paciência ao me ensinar tudo que
eu sempre precisei. Obrigada pela amizade e generosidade que você sempre teve por mim.
Às minhas melhores amigas, Vivianny Jácome, Alice Pinheiro, Joice Barreira, Larissa
Félix e Renata Castro, que desde pequenas são minhas principais referências de amizade. Em
vocês encontro refúgio, calmaria, felicidade e, principalmente, cumplicidade. E foi através
dessa cumplicidade que nós nos fizemos irmãs de vida.
À minha amiga, Lais Marinho Aguiar, por ser minha família em Campinas, por dividir
comigo diariamente as alegrias e conquistas, pelos segredos compartilhados, por sermos tão
amigas e parceiras de vida. Obrigada pelos conselhos e pela sua amizade que é tão importante
para mim.
À minha amiga, Laísa Dias, por cuidar de mim nos momentos de solidão e medo, por
ser sempre tão presente na minha vida. Obrigada por todas as vezes que você cuidou de mim e
por me proporcionar momentos de tanta amizade e companheirismo.
Aos meus amigos, Tiago, Líbia, Mayra, Marina, Letícia, Felipe, Luis, Murilo, Marcela,
Carol, Viny, Valquíria por toda apoio e companheirismo durante essa jornada e pelos momentos
de distração tão necessários nessa fase tão importante da minha vida.
As minhas companheiras do Projeto de Estágio à Docência (PED), Marília Crivelari,
Beatriz Melo (Bia) e Karla Martins por todo ensinamento transmitido com tanta sabedoria e
paciência e, mais do que isso, pela amizade construída com tanta verdade.
Aos meus alunos do Projeto de Estágio à Docência (PED), em especial Giovanna,
Gabriel, Guilhermo, Luciana, Bruna, Marina e Vanessa, por me ajudarem no meu crescimento
profissional, pela amizade que construímos ao longo do meu estágio e por todos os momentos
de aprendizado e diversão durante nossas aulas.
Às amigas Carol e Carine Almada, Ana Carine e Lia Maristela pela receptividade,
apoio e amizade, principalmente, durante os primeiros meses de chegada a Campinas.
Aos meus amigos, Larissa Vieira, Nathana Cristofoli, Marcelo Sousa, Denis Lima,
Alan e Renata Guerreiro que mesmo distantes se fazem presentes diariamente, me incentivando
e acreditando nos meus sonhos.
As minhas primas Beatriz e Isabela Peixoto pelo incentivo mesmo à distância, pela
inspiração profissional e pessoal (força e dedicação) que vocês sempre me trouxeram e pela
disponibilidade que vocês sempre tiveram para me ajudar em tudo que eu precisei.
À minha tia Gorete Peixoto por ser tão presente na minha vida, pelas orações, pelas
ligações tão motivadoras e, principalmente, pelos momentos de tanta alegria que sempre tenho
ao seu lado.
Aos meus amigos, Renato e Natalia, por me ajudarem na coleta das sementes utilizadas
neste projeto, pela amizade e por todo apoio.
Aos meus tios, Italvan Milfont Macêdo e Dorreino Maria Macêdo, por acreditarem no
meu sonho, por serem tão presentes em minha vida e por me inspirarem com seu exemplo de
garra, força e esperança.
À minha professora e amiga, Lucicléia Barros de Vasconcelos, pelos ensinamentos e
amizade durante tantos anos. Todos seus conselhos foram tão importantes para mim.
Aos meus companheiros de caminhada do Laboratório de Bioaromas e Compostos
Bioativos: Nadir, Leo, Alexsandra, Tailleah, Ana Paula, Bruno, Marina, Débora, Dora, Rose
que contribuíram positivamente para o sucesso deste projeto.
Aos colaboradores, Ana Lúcia Ruiz e Marcos Nogueira Eberlin pela disponibilidade e
atenção durante o desenvolvimento deste trabalho.
Aos funcionários da FEA, em especial ao Camila, Andrea, Cosme, Rose, Marcia,
Claudia, Geraldo e Bianca pela disponibilidade, ajuda e atenção, facilitando assim todo meu
trabalho durante este ano.
Aos professores do Programa de Mestrado em Ciência de Alimentos da UNICAMP
que foram tão importantes na minha vida acadêmica, por todo ensinamento, paciência e
dedicação ao meu aprendizado e crescimento profissional.
À Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas
(FEA-UNICAMP), pela oportunidade e por fornecerem os recursos necessários para a
realização deste projeto.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela
bolsa concedida durante a realização do mestrado. À Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Muito obrigado a todos que direta ou indiretamente contribuíram para o
desenvolvimento deste trabalho e para meu crescimento profissional.
RESUMO
O presente trabalho teve por objetivo estudar os compostos bioativos das sementes de
Adenanthera pavonina L. utilizando extração assistida por enzimas. O tratamento enzimático
foi realizado utilizando α-amilase (Termamyl® de Bacillus licheniformis), protease (Neutrase®
de Bacillus amyloliquefaciens), e celulase (Optimase® CX 56L de Bacillus subtilis) nas
seguintes condições: 0 a 250 µL de mistura de enzimas, 5 g da semente triturada em 45 mL de
tampão fosfato 100Mm pH 7,0, 50 ºC, 100 rpm por 2 horas de incubação. A proporção de cada
enzima foi otimizada por meio de um planejamento de misturas, onde foi observado que o uso
de protease e celulase (1:1, v/v) aumentou o conteúdo de compostos bioativos e atividade
antioxidante da semente de Adenanthera pavonina L. Após o tratamento enzimático, o efeito
do solvente extrator (água, etanol, metanol, etanol: água (1:1, v/v) e metanol: água (1:1, v/v))
sobre a recuperação de compostos antioxidantes a partir dos hidrolisados da semente de
Adenanthera pavonina L. foi avaliado utilizando três métodos antioxidantes, ORAC, TEAC e
DPPH. A água foi o melhor solvente extrator. O uso de solventes polares (água) para a extração
de compostos antioxidantes pode aumentar a recuperação de compostos mais polares, tais como
fenólicos glicosilados, vitaminas hidrossolúveis e peptídeos bioativos. O extrato aquoso
apresentou elevada atividade antioxidante (221,84, 100,08 e 13,49 µmol TE/g de extrato seco
para os ensaios ORAC, TEAC e DPPH, respectivamente). O extrato aquoso das sementes de
Adenanthera pavonina L. atuou de maneira mais eficiente por meio do mecanismo de
transferência de átomos de hidrogênio do que pela transferência de elétrons. Os compostos
fenólicos catequina (6,08 µg/g), quercetina (0,18 µg/g), naringenina (1,31 µg/g), ácido
protocatecuico (3,35 µg/g), ácido gentísico (2,81 µg/g), ácido 4-hidroxibenzóico (0,53 µg/g) e
ácido ferúlico (0,45 µg/g) foram identificados no extrato aquoso do hidrolisado por CLUAE-
EM/EM. O flavanol catequina foi o principal composto fenólico encontrado no extrato aquoso
do hidrolisado. Assim, o extrato aquoso do hidrolisado foi selecionado para os ensaios de
atividade antiproliferativa e apresentou resultados significativos para as linhagens tumorais de
próstata (GI50 = 2,5 µg/mL) e rim (GI50 = 29,9 µg/mL), enquanto a amostra controle (não tratada
enzimaticamente) apresentou resultado relevante apenas para a linhagem tumoral de rim (GI50
= 67,5 µg/mL). Os valores de GI50 do extrato aquoso do hidrolisado para as linhagens de rim e
próstata foram menores quando comparados ao controle, sugerindo que o tratamento
enzimático realizado foi necessário para evidenciar atividade antiproliferativa das sementes de
A. pavonina L.
Palavras-chave: Atividade antioxidante, compostos bioativos, extração assistida por enzimas,
atividade antiproliferativa, sementes de Adenanthera pavonina L.
ABSTRACT
The aim of this study was to investigate the bioactive compounds of Adenanthera pavonina L.
seeds using enzyme assisted extraction. The enzymatic treatment was performed using
commercial α-amylase from Bacillus licheniformis (Termamyl®), protease from Bacillus
amyloliquefaciens (Neutrase®) and cellulase from Bacillus subtilis (Optimase®) in the
following conditions: 0 to 250 µL of enzyme mixture, 5 g of the seed powder in 45 mL of
phosphate buffer 100 mM pH 7.0, 50 °C, 100 rpm for 2 hours of incubation. The proportion of
each enzyme was optimized by response surface methodology, which was observed that the use
of protease and cellulase (1:1, v/v) increased the content of bioactive compounds and
antioxidant activity of Adenanthera pavonina L. seeds. After the enzymatic treatment, the effect
of extraction solvent (water, ethanol, methanol, ethanol: water (1:1, v/v) and methanol: water
(1:1, v/v)) on the recovery of antioxidant compounds from hydrolysates of Adenanthera
pavonina L. seeds was evaluated using different assays, namely, ORAC, TEAC and DPPH.
Water was the best solvent extractor. The use of polar solvents (water) for the extraction of
antioxidant compounds can increase the recovery of more polar compounds, such as
glycosylated phenolics, water soluble vitamins and bioactive peptides. The aqueous extract
from hydrolysate (AEH) showed high antioxidant activity (221.84, 100.08 and 13.49 μmol/g of
dry extract for the ORAC, TEAC and DPPH, respectively). The AEH of Adenanthera pavonina
L. seeds was more efficiently through the transfer mechanism of hydrogen atoms than the
transfer of electrons. The phenolic compound such catechin (6.08 µg/g), quercetin (0,18 µg/g),
naringenin (1,31 µg/g), protocatechuic acid (3,35 µg/g), gentisic acid (2,81 µg/g), 4-
hydroxybenzoic acid (0,53 µg/g), and ferulic acid (0,45 µg/g) were identified in the AEH by
UHPLC-MS/MS. The flavanol catechin was the main phenolic compound found in the AEH.
Therefore, AEH was chosen for antiproliferative activity assays, and showed significant results
for the tumoral lineage of prostate (GI50= 2,5 µg/mL) and kidney (GI50= 29,9 µg/mL), while
the control sample (non-enzymatically treated) showed only relevant results for the tumoral
lineage of kidney (GI50= 67.5 µg/mL). The GI50 values of the AEH for the tumoral lineage of
kidney and prostate were lower than control, which suggest that the enzymatic treatment was
necessary to evidence the antiproliferative activity of A. pavonina L. seeds.
Keywords: antioxidant activity, bioactive compounds, enzyme-assisted extraction,
antiproliferative activity, Adenanthera pavonina L. seeds.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Aspectos gerais da árvore e sementes da Adenanthera pavonina L. A) Árvore,
B) Folhas C) Vagem e semente D) Sementes. Fonte: Maurício Mercadante. .................. 24
Figura 2. Estrutura de compostos fenólicos comumente encontrados nas plantas. ................. 29
Figura 3. Preparação da amostra. A) Semente in natura, B) Sementes após o procedimento de
lavagem, C) Sementes trituradas e armazenadas em embalagens seladas à vácuo. ......... 39
Figura 4. Fluxograma geral do processo de extração assistida por enzimas de compostos
bioativos das sementes de Adenanthera pavonina L. Abreviações: TPC, conteúdo total de
compostos fenólicos; TFC, conteúdo total de flavonoides. .............................................. 42
Figura 5. Representação gráfica da distribuição das amostras na placa de 96 compartimentos
utilizada no teste de atividade antiproliferativa. ............................................................... 47
Figura 6. Curva de contorno (A) e valores observados versus valores previstos (B) para a
capacidade antioxidante, avaliada pelo ensaio TEAC, do extrato aquoso das sementes de
A. pavonina L. ................................................................................................................. 60
Figura 7. Curva de contorno (A) e valores observados versus valores previstos (B) para a
capacidade antioxidante, avaliada pelo ensaio ORAC, do extrato aquoso das sementes de
A. pavonina L. ................................................................................................................. 60
Figura 8. Atividade antiproliferativa in vitro da doxorrubicina em painel de linhagens celulares
humanas. ........................................................................................................................... 67
Figura 9. Atividade antiproliferativa in vitro do extrato aquoso das sementes de Adenanthera
pavonina L. em painel de linhagens celulares humanas. .................................................. 67
Figura 10. Atividade antiproliferativa in vitro da amostra controle das sementes de
Adenanthera pavonina L. em painel de linhagens celulares humanas. ............................ 68
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Atividades biológicas in vitro e in vivo da Adenanthera pavonina L. ................... 26
Tabela 2 - Composição química da semente de carolina (Adenanthera pavonina L.) ............ 27
Tabela 3 - Principais métodos e seus princípios de ação utilizados na determinação da atividade
antioxidante de componentes alimentares. ....................................................................... 35
Tabela 4 - Exemplos do uso de extração assistida por enzimas para extração de compostos
antioxidantes a partir de diferentes partes de plantas. ...................................................... 38
Tabela 5 - Matriz do planejamento experimental de misturas para obtenção de compostos
bioativos das sementes de Adenanthera pavonina L. utilizando diferentes preparações
enzimáticas. ...................................................................................................................... 41
Tabela 6 - Linhagens celulares tumorais e não tumoral (HaCaT) utilizadas nos ensaios de
atividade antiproliferativa in vitro e suas densidades de inoculação (DI). ....................... 45
Tabela 7 - Parâmetros de espectrometria de massas para as transições MRM ........................ 51
Tabela 8 - Valores médios de parâmetros físico-químicos e composição centesimal das
sementes in natura de A. pavonina L. ............................................................................. 53
Tabela 9 - Capacidade antioxidante (µmol TE/g de liofilizado), avaliada pelo ensaio ORAC,
das sementes de A. pavonina L. tratadas enzimaticamente utilizando diferentes solventes*
.......................................................................................................................................... 55
Tabela 10 - Capacidade antioxidante (µmol TE/g de liofilizado), avaliada pelo ensaio TEAC,
das sementes de A. pavonina L. tratadas enzimaticamente utilizando diferentes solventes*
.......................................................................................................................................... 55
Tabela 11 - Capacidade antioxidante (µmol TE/g de liofilizado), avaliada pelo ensaio DPPH,
das sementes de A. pavonina L. tratadas enzimaticamente utilizando diferentes solventes*
.......................................................................................................................................... 55
Tabela 12 - Coeficientes de regressão para capacidade antioxidante avaliada pelo método
DPPH das sementes de A. pavonina L. ........................................................................... 57
Tabela 13 - Coeficientes de regressão para capacidade antioxidante avaliada pelo método
TEAC das sementes de A. pavonina L. ........................................................................... 58
Tabela 14 - Coeficientes de regressão para capacidade antioxidante avaliada pelo método
ORAC das sementes de A. pavonina L............................................................................ 58
Tabela 15 - ANOVA do modelo quadrático para a capacidade antioxidante, avaliada pelo
método TEAC, das sementes de A. pavonina L. ............................................................. 59
Tabela 16 - ANOVA do modelo cúbico especial para a capacidade antioxidante, avaliada pelo
método ORAC, das sementes de A. pavonina L. ............................................................ 59
Tabela 17 – Análise da atividade antioxidantes dos extratos aquosos das sementes de A.
pavonina . L. tratadas com protease e celulase................................................................. 61
Tabela 18 - Conteúdo de fenólicos totais, flavonoides e taninos condensados para os extratos
aquosos das sementes de A. pavonina . L. tratadas com protease e celulase. .................. 63
Tabela 19 - Perfil de compostos fenólicos para o extrato aquoso das sementes de A. pavonina
. L. tratadas com protease e celulase. ............................................................................... 64
Tabela 20 - Valores de GI50 (em µg/mL) para as amostras controle e extrato das sementes de
carolina (Adenanthera pavonina L.) frente a um painel de linhagens celulares humanas69
LISTA DE EQUAÇÕES
Equação 1. Equação de transferência de átomos de hidrogênio (APAK et al., 2007). ........... 33
Equação 2. Equação de transferência de elétrons (APAK et al., 2007). ................................. 34
Equação 3. Equação para definição dos modelos das variáveis estudadas ............................. 40
Equação 4. Área da curva de decaimento da fluoresceína com adição da substância
antioxidante ...................................................................................................................... 44
Equação 5. Área sob a curva de decaimento da fluorescência corrigida................................. 44
Equação 6. Porcentagem de inibição do radical DPPH ........................................................... 45
Equação 7. Modelo quadrático para a capacidade antioxidante, avaliada pelo método TEAC,
das sementes de A. pavonina L. P: protease; A: α-amilase; C: celulase. ........................ 57
Equação 8. Modelo cúbico especial para a capacidade antioxidante, avaliada pelo método
ORAC, das sementes de A. pavonina L. P: protease; A: α-amilase; C: celulase. ........... 58
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
786-0: Linhagem celular de adenocarcinoma de rim
AAPH: 2,2’-azobis (2’-metilpropionamidina) dihidrocloreto
AC: Ácido cítrico
ABTS: 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)
ANOVA: Análise de variância
ATT: Acidez total titulável
AUC: Área de decaimento sobre a curva
CE: Equivalentes de catequina
CLUAE: Cromatografica líquida de ultra alta eficiência
CPQBA: Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas
CTAAE-DAP (HPAEC-PAD): Cromatografia de Troca Aniônica de Alta Eficiência acoplada
ao Detector Amperométrico Pulsado
DI: Densidades de inoculação
DMSO: Dimetilsulfóxido
DPPH: 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
EAE: Extração assistida por enzimas
EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético
ERN: Espécies reativas de nitrogênio
EROs: Espécies reativas de oxigênio
FUFOSE: The European Commission’s Concerted Action on Functional Food Science in
Europe
GAE: Equivalente de ácido gálico
GI50: Growth Inhibition 50 – concentração necessária para inibição de 50% da viabilidade
celular
HaCaT: Linhagem celular de queratinócito humano
HbA1c: Hemoglobina glicosilada
HCl: Ácido clorídrico
HHDP: Ácido hexahidroxidifênico
HT-29: Linhagem celular de adenocarcinoma colorretal
K-562: Linhagem celular de leucemia
IE: Fonte de ionização por electrospray
MCF-7: Linhagem celular de adenocarcinoma de mama
MS: Massa seca
MRM: Monitoramento de reações múltiplas
NaOH: Hidróxido de sódio
NAUC: Área útil, calculada pela diferença entre as AUC do extrato e do branco
NCI: National Cancer Institute
NCI-ADR/Res: Linhagem celular de adenocarcinoma de ovário resistente a múltiplas drogas
NCI-H460: Linhagem celular de adenocarcinoma de pulmão tipo não pequenas células
ORACFL: Capacidade de absorção do radical oxigênio
OVCAR-3: Linhagem celular de adenocarcinoma de ovário
PBS: Solução salina tamponada
PC-3: Linhagem celular de adenocarcinoma de próstata
pH: Potencial hidrogeniônico
RNS: Espécie reativa de nitrogênio
RPMI-1640: Roswell Park Memorial Institute 1640
SFB: Soro fetal bovino
SNC: Sistema nervoso central
SRB: Sulforrodamina B
SST: Sólidos solúveis totais
TCA: Ácido tricloroacético
TE: Equivalentes de Trolox
TEACABTS: Capacidade antioxidante equivalente ao trolox
TGI: Inibição total do crescimento
TPC: Conteúdo total de compostos fenólicos
TFC: Conteúdo total de flavonoides
Trolox: Ácido (±) -6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromama-2-carboxílico
U-251: Linhagem celular de glioblastoma
UACC-62: Linhagem celular de melanoma
UV: Ultravioleta
Sumário 1 - INTRODUÇÃO GERAL .................................................................................................. 21
2 – OBJETIVOS ..................................................................................................................... 23
2.1 - Objetivo geral ................................................................................................................. 23
2.2 - Objetivos específicos ...................................................................................................... 23
3 - REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................................ 24
3.1 - Adenanthera pavonina L. ............................................................................................. 24
3.2 - Características da semente de Adenanthera pavonina L. relevantes para abordagem
investigativa .......................................................................................................................... 27
3.3 - Compostos bioativos antioxidantes .............................................................................. 27
3.4 - Capacidade antioxidante ............................................................................................... 32
3.5 - Extração assistida por enzimas ..................................................................................... 35
4 - MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 39
4.1 - Coleta e preparação das amostras ................................................................................. 39
4.2 - Caracterização e composição centesimal da semente de Adenanthera pavonina L. .... 39
4.3 - Tratamento enzimático do pó das sementes de Adenanthera pavonina L. .................. 40
4.4 - Procedimento de extração ............................................................................................. 41
4.5 - Atividades biológicas in vitro ....................................................................................... 43
4.5.1 - Avaliação da capacidade antioxidante ....................................................................... 43
4.5.1.1 - Capacidade antioxidante equivalente ao trolox (TEAC) ........................................ 43
4.5.1.2 - Capacidade de absorção do radical oxigênio (ORAC) ........................................... 43
4.5.1.3 - Atividade sequestradora do radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil (DPPH•) ......... 44
4.5.2 - Ensaio de atividade antiproliferativa com células tumorais humanas ....................... 45
4.5.2.1 - Cultivo celular ........................................................................................................ 46
4.5.2.2 - Preparo das suspensões celulares ........................................................................... 46
4.5.2.3 - Preparo e aplicação das amostras ........................................................................... 47
4.5.2.4 - Análise dos Resultados dos ensaios antiproliferativos ........................................... 48
4.6 - Determinação e identificação dos compostos bioativos ............................................... 49
4.6.1 - Compostos fenólicos totais ........................................................................................ 49
4.6.2 - Determinação de taninos condensados ...................................................................... 49
4.6.3 - Determinação do conteúdo de flavonoides ................................................................ 50
4.6.4 - Cromatografia líquida de ultra alta eficiência acoplado ao espectrômetro de massas
(CLUAE – EM/EM) ............................................................................................................. 50
4.7 - Análise estatística ......................................................................................................... 52
5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 53
5.1 – Análise físico-química e centesimal ............................................................................ 53
5.2 - Otimização do tratamento enzimático e extração de compostos com potencial
antioxidante a partir das sementes de A. pavonina L. .......................................................... 54
5.3 - Análise das curvas de contorno .................................................................................... 57
5.4 - Conteúdo de compostos fenólicos ................................................................................ 62
5.5 - Perfil de compostos fenólicos do extrato aquoso do hidrolisado das sementes de A.
pavonina L. .......................................................................................................................... 64
5.6 - Atividade antiproliferativa ............................................................................................ 66
6 - CONCLUSÃO ................................................................................................................... 71
PERSPECTIVAIS FUTURAS .............................................................................................. 72
7 - REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 73
21
1 - INTRODUÇÃO GERAL
Nos últimos anos, os consumidores tornaram-se ainda mais exigentes na busca por
uma alimentação saudável, uma vez que estão cada vez mais conscientes da associação entre a
alimentação e seu impacto à saúde. Atualmente, os alimentos não visam apenas satisfazer a
fome e fornecer os nutrientes necessários para os seres humanos, eles também podem prevenir
doenças e melhorar o bem-estar físico e mental dos consumidores. Por isso, a consciência a
respeito da correlação entre a dieta, saúde e prevenção de doenças está cada vez maior
(MENRAD, 2003; ROBERFROID, 2000). Nas últimas décadas, a indústria alimentar investiu
muitos esforços em pesquisa e desenvolvimento de alimentos mais saudáveis e nutritivos
(LAGOS et al., 2015). Devido à busca crescente dos consumidores por alimentos mais
saborosos e atrativos além de saudáveis e seguros.
Nesse contexto é possível observar que a nutrição evoluiu da prevenção de
deficiências dietéticas e do estabelecimento do conceito de dieta equilibrada para a promoção
do bem-estar, saúde e redução do risco de doenças (ROBERFROID, 2000). O termo alimento
funcional foi utilizado pela primeira vez no Japão, na década de 1980, em referência aos
alimentos utilizados na dieta normal que apresentam benefícios fisiológicos e/ou reduzem o
risco de doenças, tais como doenças cardiovasculares, câncer, diabetes melito, obesidade,
osteoporose e outras doenças crônicas não transmissíveis, além de suas funções básicas
nutricionais (HARDY, 1998; KWAK; JUKES, 2001; STANTON et al., 2005).
Embora o termo alimento funcional tenha sido definido várias vezes
(ROBERFROID, 2002), até agora não existe uma definição consensual para este grupo de
alimentos (ALZAMORA et al., 2005). De acordo com a The European Commission’s
Concerted Action on Functional Food Science in Europe (FUFOSE), um produto alimentar
pode ser considerado funcional se, juntamente com o impacto nutricional básico, tenha efeitos
benéficos em uma ou mais funções do organismo humano, melhorando assim as condições
gerais e físicas e/ou diminuindo o risco de doenças. Um alimento é considerado funcional
quando apresentar compostos biologicamente ativos naturalmente presentes ou adicionados
intencionalmente nos alimentos, além disso, a bioatividade deve ser comprovada em ensaios
clínicos. Assim, pílulas ou cápsulas contendo moléculas bioativas não são considerados como
alimentos funcionais (DIPLOCK et al., 1999).
Os compostos bioativos são constituintes extra nutricionais e ocorrem em pequenas
quantidades nos alimentos e podem ser obtidos por meio de uma dieta equilibrada, reduzindo o
22
estresse oxidativo e o risco de doenças, especialmente câncer e aterosclerose, pois podem
neutralizar as espécies reativas de oxigênio e nitrogênio resultantes dos processos oxidativos
intracelulares. Especialistas afirmam que pelo menos um terço dos casos de câncer e cerca da
metade das doenças cardiovasculares podem ser prevenidas por meio da dieta (LUZIA; JORGE,
2013; VOLP; RENHE; STRINGUETA, 2009).
Nos últimos anos, estudos avaliaram a composição química de frutos e sementes
exóticas a fim de encontrar fontes naturais de componentes bioativos que podem auxiliar na
prevenção de doenças (HOLSER; BOST; VAN BOVEN, 2004; GONG et al., 2012; LUZIA;
JORGE, 2013). As diferentes partes das plantas têm sido utilizadas na medicina popular para o
tratamento de doenças e suas características medicinais têm sido investigadas cientificamente
em todo o mundo (SINGH; SHARMA; SARKAR, 2012). Dentre as plantas utilizadas na
medicina popular destaca-se a Adenanthera pavonina L. No entanto, poucos estudos abordaram
sua composição química e seus benefícios à saúde.
Adenanthera pavonina L. é uma espécie exótica pertencente ao grupo da família
Fabaceae e subfamília Mimosoideae (JOLY, 2002; JUDD et al., 2009). É uma árvore tropical
originária da Índia, tendo sido introduzida em diversos países, como Malásia e Brasil.
Popularmente conhecida como semente de carolina, olho-de-pavão e falso pau brasil, a
Adenanthera pavonina L. apresenta porte médio e pode ter tamanho variável entre 6 e 20 metros
de altura (JAROMIN; KORYCIŃSKA; KOZUBEK, 2011). As sementes de Adenanthera
pavonina L. foram muito utilizadas para pesar ouro, devido a exatidão de 4 unidades
corresponderem a 1 grama. Atualmente, devido a sua textura e beleza, de colocação vermelho
brilhante, as sementes são utilizadas artesanalmente para produção de bijuterias.
Várias partes da planta Adenanthera pavonina L., tais como semente, folha e
madeira, têm sido utilizadas na medicina popular para o tratamento de gota, inflamações, febre
e reumatismo (JAROMIN; KORYCIŃSKA; KOZUBEK, 2011). A semente de Adenanthera
pavonina L. apresenta capacidade anti-inflamatória (OLAJIDE et al., 2004) e sua atividade
anticancerígena foi mencionada por Mujahid et al. (2016). No entanto, para estabelecer o
potencial funcional desta semente são necessários mais estudos para valorizar e preservar a
espécie.
23
2 – OBJETIVOS
2.1 - Objetivo geral
O objetivo geral deste trabalho foi estudar os compostos bioativos das sementes de
Adenanthera pavonina L. utilizando extração assistida por enzimas.
2.2 - Objetivos específicos
• Determinar a composição centesimal das sementes da Adenanthera pavonina L.;
• Avaliar o tratamento enzimático mais adequado para a obtenção de compostos
bioativos antioxidantes das sementes da Adenanthera pavonina L.
• Avaliar qual o melhor solvente, dentre os propostos no trabalho, para a obtenção
de compostos bioativos antioxidantes presentes nas sementes da Adenanthera pavonina L.;
• Avaliar a capacidade antioxidante dos extratos das sementes da Adenanthera
pavonina L pelos métodos TEAC (capacidade antioxidante equivalente ao Trolox), DPPH
(atividade sequestradora do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil) e ORAC (capacidade de absorção
do radical oxigênio);
• Determinar o perfil de compostos fenólicos no extrato das sementes de
Adenanthera pavonina L. por meio de cromatografia líquida de ultra alta eficiência (CLUAE);
• Determinar espectrofotometricamente o conteúdo total de compostos fenólicos,
taninos condensados e flavonoides;
• Avaliar a atividade anticancerígena utilizando o ensaio de atividade
antiproliferativa com células tumorais humanas.
24
3 - REVISÃO DA LITERATURA
3.1 - Adenanthera pavonina L.
Adenanthera é uma palavra de origem grega formada pelos termos adeno
(glândulas) e antera (antera), ou seja, a presença de uma glândula aderida a antera que é o local
onde são produzidos os grãos de pólen (SILVA; DE SOUZA; CARREIRA, 2004).
Conhecida popularmente como semente de carolina, olho-de-pavão e falso pau
brasil, a Adenanthera pavonina L. (Figura 1) é uma árvore pertencente à família Fabaceae que
apresenta porte médio e pode ter tamanho variável entre 6 e 20 metros de altura (JAROMIN;
KORYCIŃSKA; KOZUBEK, 2011). Adenanthera pavonina L. é uma árvore de crescimento
rápido incluída no Global Compedium of Weeds como uma erva natural e agrícola (RANDALL,
2012). A classificação taxonômica da planta Adenanthera é mostrada como segue: Classe
Magnoliopsida; Ordem Fabales; Família Fabaceae; Subfamília Mimosoideae; Gênero
Adenanthera; Espécie Adenanthera pavonina; Tribo Mimoseae; Adenanthera pavonina.
Figura 1. Aspectos gerais da árvore e sementes da Adenanthera pavonina L. A) Árvore,
B) Folhas C) Vagem e semente D) Sementes. Fonte: Maurício Mercadante.
No Brasil, a Adenanthera pavonina L. foi incorporada como planta ornamental,
para arborização urbana, paisagismo e pela sua madeira nobre. Devido a sua fácil adaptação e
rápido crescimento, pode ser encontrada em quase todo o território nacional, em regiões de
clima tropical, como nos Estados do Mato Grosso, São Paulo e Mato Grosso do Sul e na Região
Nordeste, entre outros (D´AGOSTINI et al., 2009).
Sua madeira possui coloração avermelhada e apresenta elevada qualidade para a
construção civil e marcenaria. Suas folhas são pecioladas e paripinadas devido a sua ligação
A B C D
25
com um pecíolo e pelo número de folíolos no ápice serem pares, respectivamente, contendo de
dois a cinco pares de pinas em lados contrários e de seis a dez folíolos curtos. As flores possuem
coloração amarelo-pálida e suas vagens são estreitas, compridas e de coloração marrom que ao
se abrirem liberam as sementes maduras. O tronco da árvore apresenta coloração marrom escuro
na superfície externa e branco acinzentado na parte interna (ALVES; KUBOTA, 2013;
MUJAHID et al., 2016).
As sementes moídas de Adenanthera pavonina L. são utilizadas popularmente na
Índia no tratamento de inflamações, enquanto o líquido obtido após o cozimento das folhas é
empregado no tratamento de reumatismo e gota (JAROMIN; KORYCIŃSKA; KOZUBEK,
2011). Na medicina popular as sementes cozidas são utilizadas para o tratamento de infecções
pulmonares e aplicadas no tratamento de oftalmia crônica (GHANI, 2003). Na Índia,
Adenanthera pavonina L. tem sido tradicionalmente utilizada no tratamento de diabetes
mellitus e desordens no metabolismo lipídico (PANDHARE et al., 2012). Além disso, existem
vários relatos na literatura a respeito das atividades anti-inflamatória (OLAJIDE et al., 2004),
antioxidante (MUJAHID et al., 2015; RODRIGO; JAYASINGHE e BANDARA, 2007),
antimicrobiana (CHAUHAN et al., 2015), antidiabética (PANDHARE e
SANGAMESWARAN, 2012), anticancerígena (CHAUHAN et al., 2015), anticonvulsivante
(ONI et al., 2009), antidepressiva (ONI et al., 2009) e antifúngica (MUJAHID et al., 2016) de
extratos de folhas, sementes casca e tronco de Adenanthera pavonina L.. As atividades
biológicas da Adenanthera pavonina L. reportadas na literatura estão apresentadas na Tabela
1.
Adenanthera pavonina L. é uma árvore alimentícia, pois se consome suas sementes
e folhas após o cozimento. Na Índia, as sementes são assadas ou cozidas antes de serem usadas
como complemento alimentar com arroz para crianças e adultos (MUJAHID et al., 2016).
Segundo Howes (1974) e Yadav et al. (1976), as sementes e as vagens da Adenanthera
pavonina L. contém diversos fitoquímicos com destaque para os glicosídeos, saponinas e
esteroides. As sementes apresentam o composto O-acetiletanolamina como princípio ativo anti-
inflamatório (PANDHARE et al., 2012). As folhas possuem octacosanol, dulcitol, e os
fitoesteróis glicosídeos de β-sitosterol e estigmasterol, e a casca contém glicosídeo
estigmasterol (KHARE, 2007). O composto β-sitosterol apresenta ampla variedade de
benefícios reconhecidos cientificamente contra doenças inflamatórias, disfunções imunes e
artrite reumatoide (BOUIC et al., 1996). No entanto, as sementes exóticas ainda são pouco
26
exploradas comercialmente, sendo necessários mais estudos para melhor compreensão de suas
atividades biológicas bem como seus benefícios à saúde humana.
Tabela 1 - Atividades biológicas in vitro e in vivo da Adenanthera pavonina L.
Atividade
biológica Exemplo
Dose resposta
ou
concentração
do extrato
Referência
Atividade anti-
hipertensiva
O extrato metanólico das sementes reduziu a pressão
sanguínea em camundongos após um período de 4
semanas.
200 mg/kg Adedapo et
al. (2009)
Atividade
antidiabética
Extrato aquoso das sementes reduziu o conteúdo de
proteinúria, albuminúria, níveis de lipídios e HbA1c
em ratos diabéticos.
50 mg/kg Pandhare et
al. (2012)
Atividade anti-
inflamatória
Extrato metanólico das sementes reduziu
significativamente a inflamação de edema de pata em
ratos.
200 mg/kg Olajide et
al. (2004)
Extrato metanólico da casca da árvore inibiu a
inflamação de edema de pata em ratos. 400 mg/kg
Ara et al.
(2010)
Extrato metanólico das folhas inibiu a biossíntese de
prostaglandina e reduziu células inflamatórias em
ratos.
200 mg/kg Jayakumari
et al. (2012)
Atividade
anticonvulsivante
Extrato metanólico das sementes reduziu
significativamente a incidência e a duração da
convulsão induzida em ratos.
50 mg/kg Oni et al.
(2009)
Atividade
antimicrobiana
Extratos metanólicos da semente apresentaram
atividade antimicrobiana contra Salmonella sp,
Serretia sp, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcuus aureus e Klebsiella pneumoniae,
enquanto o extrato metanólico das folhas inibiu o
crescimento de Salmonella sp, Shigella sp e Proteus
Mirabili.
50 mg/mL Chauhan et
al. (2015)
Atividade
antioxidante
Extrato metanólico das folhas neutralizou os danos
causados por espécies reativas de oxigênio (EROs).
Além disso, o extrato foi eficiente no sequestro de
radical DPPH.
IC50 = 425
μg/mL
Mujahid et
al. (2015)
Atividade
anticancerígena
Extrato metanólico das sementes apresentaram
eficácia contra a linhagem tumoral de câncer de osso
(MG 63). No entanto, o extrato metanólico das folhas
não apresentaram efeito anticancerígeno contra
hepatocarcinoma.
GI50 = 73.48
μg/mL
Chauhan et
al. (2015)
Dose resposta, extrato/peso corpóreo (mg/kg); IC50, concentração em μg/mL de extrato metanólico das folhas de
Adenanthera pavonina L. requerida para diminuir 50% da concentração inicial do radical DPPH; GI50,
concentração necessária para inibição de 50% da viabilidade celular
27
3.2 - Características da semente de Adenanthera pavonina L. relevantes para abordagem
investigativa
As sementes de Adenanthera pavonina L. apresentam uma quantidade significativa
de proteína e lipídios (Tabela 2), sendo a farinha desta semente uma alternativa como fonte de
proteínas na alimentação animal. Uma pequena quantidade de compostos que podem apresentar
alguma característica antinutricional foram encontrados nas sementes, tais como taninos (1,91
g/100 g), fitatos (0,13 g/100 g) e L-DOPA (2,86 g/100 g), sendo estes valores similares a outros
alimentos consumidos, como feijão e ervilha (APATA; OLOGHOBO, 1994; EZEAGU et al.,
2004; SIDDHURAJU; VIJAYAKUMARI; JANARDHANAN, 1996
Tabela 2 - Composição química da semente de carolina (Adenanthera pavonina L.)
Parâmetros Conteúdo
Composição Centesimal (g/100g MS)
Proteína 29,44
Lipídios 17,99
Cinzas 2,37
Carboidratos 50,20
Açúcares totais 8,22
Amido 41,95
Valor energético (kJ/g) 19,20
Minerais (mg/100g MS)
Sódio 512,53
Potássio 1252,85
Ferro 10,25
Cobre 2,28
Zinco 4,56
Manganês 2,28
Fonte: Adaptado de (EZEAGU et al., 2004).
3.3 - Compostos bioativos antioxidantes
Os compostos bioativos em alimentos são classificados como substâncias extra
nutricionais que ocorrem em pequenas quantidades e que oferecem benefícios à saúde além do
valor nutricional básico (NIRMALA; BISHT; LAISHRAM, 2014). Os compostos bioativos são
produzidos como metabólitos secundários de plantas e são conhecidos como substâncias que
têm efeito em sistemas biológicos por apresentam potencial terapêutico e contribuir para as
28
atividades biológicas (AZMIR et al., 2013; SINGH et al., 2016). Os produtos naturais ricos em
compostos bioativos são promissoras fontes para o desenvolvimento de novos medicamentos,
alimentos funcionais e aditivos alimentares (REN et al., 2013). Extratos de plantas contendo
compostos bioativos podem ser usados como ingredientes funcionais na produção de
medicamentos e cosméticos (BITENCOURT et al., 2014).
Os vegetais produzem uma grande variedade de compostos orgânicos essenciais
para o crescimento e para a reprodução vegetal que estão envolvidos diretamente na função
estrutural e de armazenamento de energia, tais como os carboidratos, aminoácidos e lipídios.
Por outro lado, outros compostos não estão associados diretamente aos processos de
crescimento, desenvolvimento e reprodução dos organismos vegetais. Esses compostos são
conhecidos como metabólitos secundários, cuja função é defender os vegetais contra o ataque
de herbívoros e patógenos, além de atuarem como atrativos para animais polinizadores e
dispersores de sementes (TAIZ; ZEIGER, 2006). Os metabólitos secundários de plantas podem
ser divididos em três grupos quimicamente distintos: terpenos, compostos fenólicos e
compostos nitrogenados (CROTEAU; KUTCHAN; LEWIS, 2000; SHAHIDI, 1997;
SHAHIDI; HO, 2005; SHAHIDI; NACZK, 2004; TAIZ; ZEIGER, 2006). Os compostos
bioativos mais estudados e comumente encontrados em fontes naturais são os compostos
fenólicos, que apresentam inúmeros benefícios para a saúde (GUINÉ et al., 2011), bem como
diversas aplicações na ciência e indústria de alimentos.
Quimicamente, os compostos fenólicos contêm pelo menos um anel aromático com
um ou mais substituintes hidroxílicos (APAK et al., 2007; HAMINIUK et al., 2012), e podem
estar associados com carboidratos (simples ou complexos), lipídios, ácidos orgânicos e
componentes da parede celular (celulose, hemiceluloses e lignina) (QUIROS-SAUCEDA et al.,
2014; VELDERRAIN-RODRÍGUEZ et al., 2014). A estrutura dos compostos fenólicos varia
de moléculas simples (ácidos fenólicos) até polímeros (proantocianidinas). Exemplos de
estruturas de compostos fenólicos comumente encontrados nas plantas estão apresentadas na
(Figura 2). Os compostos fenólicos são sintetizados durante o desenvolvimento normal da
planta, bem como em resposta a diferentes condições de estresse, radiação UV e ferimentos
(NACZK; SHAHIDI, 2004). Esses compostos são metabólitos secundários abundantemente
encontrados em plantas e podem ser classificados como compostos solúveis em água, tais como
os ácidos fenólicos, fenilpropanoides, flavonoides e quinonas, ou compostos insolúveis em
água, tais como os taninos, lignanas e ácidos hidroxicinamínico ligados à parede celular
(RISPAIL; MORRIS; WEBB, 2005).
29
Figura 2. Estrutura de compostos fenólicos comumente encontrados nas plantas.
Fonte: Adaptado de Apak et al. (2007). As estruturas químicas foram obtidas com o auxílio do
banco de dados ChemSpider (http://www.chemspider.com) e do software ACD/ChemSketch
versão 2015.2.5 (ACD LABS, Toronto, Canadá).
30
Apesar da grande variedade de compostos fenólicos que ocorrem na natureza, os
principais são ácidos fenólicos, flavonoides e taninos (KING; YOUNG, 1999). Os ácidos
fenólicos ocorrem nas matrizes vegetais na forma de ésteres ou como glicosídeos conjugados
com outros compostos como flavonoides, álcoois, esteróis e glicosídeos (GUINÉ et al., 2011).
Os ácidos fenólicos são classificados em dois subgrupos, conhecidos como ácidos
hidroxibenzoicos que possuem em comum a estrutura C6-C1 e os ácidos hidroxicinâmicos que
são compostos aromáticos de cadeia lateral com três carbonos C6-C3 (BRAVO, 1998). Os
ácidos hidroxibenzoicos incluem o ácido gálico, p-hidroxibenzoico, ácido protocatecuico,
vanílico e siríngico, os quais estão frequentemente presentes na forma ligada e são componentes
de estruturas complexas como ligninas e taninos hidrolisáveis, sendo encontrados como
derivados de açúcares e ácidos orgânicos em alimentos vegetais. Os ácidos hidroxicinâmicos
incluem o ácido cafeíco, ferúlico, p-cumárico e sinápico que estão presentes principalmente na
forma insolúvel, ligados a componentes estruturais da parede celular, como celulose, lignina e
proteínas através de ligações éster (LIU, 2007).
Os flavonoides são uma grande família de compostos fenólicos sintetizados por
plantas que apresentam na sua estrutura três anéis na forma C6-C3-C6 que constituem diferentes
classes de compostos, tais como, antocianinas, chalconas, flavanois, isoflavonas, flavonas,
flavononas e flavonois com base em diferentes padrões de substituição como os grupos
metoxila e hidroxila (SHAHIDI; YEO, 2016). Entre as propriedades dos flavonoides, a ação
anti-inflamatória, a capacidade de eliminação de radicais livres e inibição de enzimas
hidrolíticas e oxidativas estão entre as mais conhecidas (FRANKEL, 1997; KUMAR;
PANDEY, 2013).
Os taninos são compostos fenólicos solúveis em água com massas moleculares
entre 500 e 3000 Da (BATE-SMITH; SWAIN, 1962) que possuem propriedades especiais,
como a capacidade de formar complexos insolúveis em água com os alcalóides, gelatina e
outras proteínas (SANTOS-BUELGA; SCALBERT, 2000). Baseados na estrutura química e
propriedades, os taninos podem ser divididos em dois principais grupos: taninos hidrolisáveis
e condensados. Os taninos hidrolisáveis são compostos que contém um núcleo central de glicose
ou outro poliol esterificado, com ácido gálico, também chamado de galotaninos ou ácido
hexahidroxidifênico (HHDP) (KOLECKAR et al., 2008) e são encontrados em menor
concentração em plantas que os taninos condensados (CLIFFORD; SCALBERT, 2000;
HASSANP OUR et al., 2011). Os taninos condensados são oligômeros e polímeros formados
pela policondensação de duas ou mais unidades de flavon-3-ol (SCHOFIELD; MBUGUA;
31
PELL, 2001). Os taninos também são conhecidos como proantocianidinas devido a capacidade
em se decompor em antocianidinas quando aquecidos em soluções etanólicas. As unidades
básicas mais frequentes dos taninos condensados são derivadas dos flavan-3-ols: catequina,
epicatequina, galocatequina (KOLECKAR et al., 2008).
Os compostos fenólicos despertam grande interesse devido a sua capacidade
antioxidante observada em estudos in vitro e in vivo. Os compostos fenólicos podem ser
encontrados nas plantas, principalmente, nas formas livre (ex.: ácido gálico), glicosilados (ex.:
naringina), esterificados (ex.: proantocianidinas) e insolúveis (ex.: ácido ferúlico ligado a
parede celular) (SHAHIDI; YEO, 2016). A maioria dos compostos fenólicos insolúveis formam
ligações covalentes com substâncias da parede celular, tais como pectina, celulose,
arabinoxilana, e proteínas estruturais. Os compostos fenólicos insolúveis ligados a parede
celular representam uma grande quantidade (cerca de 20-60% em vegetais, frutas e leguminosas
– sementes) em comparação com os compostos fenólicos solúveis (livres, glicosilados e
esterificados) em alimentos (NAYAK; LIU; TANG, 2015; SHAHIDI; YEO, 2016).
Os compostos fenólicos apresentam uma grande variedade de bioatividades, tais
como efeito antialérgico (BENAVENTE-GARCIA et al., 1997), anti-inflamatório
(MIDDLETON; KANDASWAMI; THEOHARIDES, 2000), antiaterogênico
(BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006), antimicrobiano (PUUPPONEN-PIMIA
et al., 2001), antioxidante (BENAVENTE-GARCIA et al., 2000), antitrombótico,
cardioprotetor e vasodilatador (MANACH; MAZUR; SCALBERT, 2005; SAMMAN; LYONS
WALL; COOK, 1998).
Os efeitos benéficos derivados dos compostos fenólicos podem ser atribuídos, em
parte, a sua atividade antioxidante (HEIM; TAGLIAFERRO; BOBILYA, 2002). Alimentos
com alto conteúdo de compostos fenólicos geralmente apresentam elevado potencial
antioxidante (PARR; BOLWELL, 2000), portanto, alimentos ricos em fenólicos podem ser uma
importante fonte natural de antioxidantes (HAMINIUK et al., 2012).
A capacidade antioxidante dos compostos fenólicos é atribuída pelo sequestro
radicais livres, doar átomos de hidrogênio ou elétrons e quelar cátions metálicos (AFANAS’EV
et al., 1989; AMAROWICZ et al., 2004). A estrutura química dos compostos fenólicos é um
fator determinante na sua capacidade de eliminar radicais livres e de quelar íons metálicos
(BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006). A capacidade antioxidante dos ácidos
fenólicos depende do número e posições dos grupos hidroxílicos em relação ao grupo funcional
carboxil, assim a atividade antioxidante aumenta com o grau de hidroxilação, por exemplo, o
32
ácido gálico trihidrolixado apresenta alta atividade antioxidante. No entanto, a substituição do
grupo hidroxila na posição 3 e 5 com grupos metoxil reduz a atividade do ácido siríngico
(RICE-EVANS; MILLER; PAGANGA, 1996; ROBARDS et al., 1999).
3.4 - Capacidade antioxidante
A oxidação é um processo metabólico natural de organismos vivos na produção de
energia necessária para atividades vitais das células. No entanto, o metabolismo do oxigênio
nas células vivas causa a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e/ou nitrogênio
(ERN) (ROESLER et al., 2006). De acordo com Davies (1995), a oxidação consiste na
transferência de elétrons a partir de um átomo para outro e representa uma parte essencial do
metabolismo e da vida aeróbica, pois o oxigênio é o aceptor final de elétrons no sistema de
fluxo de elétrons que produz energia na forma de ATP. Dessa forma, o estresse oxidativo é um
resultado inevitável da vida em um ambiente rico em oxigênio (DAVIES, 2001).
Radicais livres ou espécies reativas de oxigênio ou nitrogênio são átomos,
moléculas ou íons altamente instáveis e reativos devido à presença de um ou mais elétrons
desemparelhados (SITTA et al., 2014), que favorece a reação de oxidação de outras moléculas,
como lipídios, proteínas e DNA, com o intuito de promover a estabilidade da molécula
(GOMES et al., 2012).
Espécies reativas de oxigênio (ERO) na forma de ânion superóxido (O2•‾), peróxido
de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxila (HO•) são subprodutos naturais do metabolismo
humano (AMAROWICZ et al., 2004). Quando em excesso no organismo, podem atacar as
moléculas biológicas, como lipídios, proteínas, enzimas, DNA e RNA, levando a lesão de
células ou dos tecidos associados a doenças degenerativas (JUNG et al., 1999; PIERGIORGIO
PIETTA; SIMONETTI; MAURI, 1998; VALENTÃO et al., 2002). Embora o organismo
apresente mecanismos de defesa no combate e redução do dano oxidativo, evidências
epidemiológicas indicam que o consumo de alimentos que contêm antioxidantes,
principalmente flavonoides e outros polifenóis, associado a um estilo de vida saudável podem
auxiliar o organismo no combate e redução dos danos oxidativos (CAO et al., 1998; PULIDO;
BRAVO; FULGENCIO, 2000).
Um antioxidante é uma molécula capaz de retardar ou reduzir a oxidação de outras
moléculas (HALLIWELL, 1996; GULCIN, 2012). Os compostos antioxidantes podem
neutralizar os radicais livres e indiretamente aumentar a vida útil de um alimento, retardando o
processo de peroxidação lipídica, que é um dos principais mecanismos de deterioração dos
33
alimentos durante o processamento e armazenamento (HALLIWELL, 1996). Os antioxidantes
protegem o organismo humano dos efeitos deletérios dos EROs (quando em excesso),
retardando o desenvolvimento de diversas doenças crônicas bem como a peroxidação lipídica.
Eles são frequentemente adicionados aos alimentos para prevenir e/ou evitar reações em cadeia
provocadas pelos radicais durante o processo oxidativo (BREWER, 2011; GULCIN, 2012).
O interesse por antioxidantes naturais também está relacionado com a possibilidade
destes compostos serem utilizados como substitutos aos antioxidantes sintéticos utilizados pela
indústria farmacêutica, cosmética e, principalmente, alimentícia (ALMEIDA et al., 2011).
Dessa forma, diversas técnicas têm sido desenvolvidas e aperfeiçoadas para avaliação e
identificação de antioxidantes em matrizes vegetais.
A capacidade de um composto antioxidante em sequestrar radicais livres pode ser
investigada por meio do uso de radicais estáveis de referência ou por métodos de competição
empregando espectrofotômetro convencional operando no UV/Visível. Nestes métodos, o
antioxidante reduz o composto cromogênico de natureza radical e, consequentemente, ocorre o
desaparecimento ou modificação da região cromófora, ou seja, perda da intensidade de
coloração do meio reacional. Assim, o grau de mudança de cor (mensurado por meio da
absorbância a um determinado comprimento de onda) está correlacionado com a concentração
de antioxidantes na matriz alimentar (THATOI; PATRA; DAS, 2014). Os métodos utilizados
para avaliar a atividade antioxidante podem ser classificados de acordo com o mecanismo de
reação, como métodos de transferência de átomos de hidrogênio ou métodos de transferência
de elétrons (APAK et al., 2007).
De acordo com Apak et al. (2007), os métodos baseados na transferência de átomos
de hidrogênio medem a capacidade que um antioxidante (AH) tem em sequestrar radicais livres
(R•) pela doação de átomo de hidrogênio (H•). Nestes métodos, tanto o indicador fluorescente
quanto os antioxidantes presentes reagem diretamente com o radical, dessa forma a atividade
antioxidante é determinada através da competição, onde é necessário medir a curva de
decaimento da fluorescência do indicador na presença e ausência de antioxidantes e integrando
a área sob a curva. Dentre os métodos está a Capacidade de Absorção do Radical Oxigênio
(ORAC).
R• + AH → RH + A•
Equação 1. Equação de transferência de átomos de hidrogênio (APAK et al., 2007).
34
Os métodos baseados na transferência de elétrons medem a capacidade de um
antioxidante (AH) em reduzir qualquer composto, normalmente íons metálicos, grupos
carbonila e radicais (R•), por meio da transferência de um elétron. Na maioria destes ensaios,
os antioxidantes reagem com um indicador fluorescente ou colorimétrico (agente oxidante). Os
ensaios espectrofotométricos baseados na transferência de elétrons medem a capacidade de um
antioxidante em reduzir um agente oxidante, o qual muda de cor quando reduzido, sendo que o
grau de mudança de cor (um aumento ou redução da absorbância a um dado comprimento de
onda) é correlacionado à concentração de antioxidantes presentes na amostra (APAK et al.,
2007). Dentre os métodos incluem-se o método de Capacidade Antioxidante Equivalente ao
Trolox (TEAC) e de Atividade Sequestradora do Radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH•);
R• + AH → R‾ + AH•+
AH•+ + H2O → A• + H3O+
R‾ + H3O+ → RH + H2O
AH + M3+ → AH+ + M2+
Equação 2. Equação de transferência de elétrons (APAK et al., 2007).
No entanto, não há procedimento padronizado para avaliar a capacidade
antioxidante, por isso, é necessário realizar diferentes ensaios, com fundamentos e mecanismos
de ação diferentes (OLIVEIRA et al., 2009). DPPH, TEAC e ORAC estão entre as técnicas
mais utilizadas para avaliação da capacidade antioxidante de extratos de plantas e alimentos.
Na Tabela 3 estão apresentados os métodos mais utilizados para determinação da capacidade
antioxidante in vitro de matrizes vegetais.
35
Tabela 3 - Principais métodos e seus princípios de ação utilizados na determinação da atividade
antioxidante de componentes alimentares.
Método Princípio Referências
Capacidade de
Absorção do Radical
Oxigênio (ORAC)
O método ORAC mede a habilidade que um antioxidante tem
contra o radical peroxila, onde o antioxidante e um marcador
fluorescente (normalmente fluoresceína) competem cineticamente
por radicais peroxila gerados através da decomposição de
compostos nitrogenados tais como AAPH (2,2’-azobis-(2-
metilpropionamidina)-dihidroclorado) a 37 °C e pH fisiológico. A
atividade antioxidante pode ser determinada calculando a curva de
decaimento da fluorescência de um indicador na presença e
ausência de antioxidantes, integrando a área sob essas curvas
(emissão 520 nm e excitação 485 nm).
Apak et al.
(2007)
Capacidade
Antioxidante
Equivalente ao
Trolox (TEAC)
No método TEAC, o composto ABTS é oxidado por oxidantes
(normalmente K2S2O8) à sua correspondente forma radical cátion
(ABTS•+), que absorve a 734 nm (coloração verde-azulado), por
meio da perda de um elétron pelo átomo de nitrogênio do ABTS.
Na presença de qualquer antioxidante ocorre descoloração da
solução acompanhada pelo decréscimo da absorbância que é
proporcional à concentração de sequestradores de radicais
adicionados na solução reagente de ABTS.
Gülçin (2012);
Thatoi, Patra &
Das (2014)
Atividade
Sequestradora do
Radical 2,2-difenil-
1-picrilhidrazil
(DPPH•)
Este método é baseado na redução do radical DPPH• em solução
alcoólica na presença de um antioxidante doador de elétrons devido
à formação da forma não-radical DPPH-H na reação. Neste ensaio,
o radical cromogênio púrpura (DPPH•), que absorve em um
comprimento de onda de 516 nm, é reduzido por compostos
sequestradores de radicais (antioxidantes) à sua correspondente
forma reduzida (DPPH-H), de coloração amarela, com consequente
desaparecimento da banda de absorção, sendo a mesma
acompanhada pelo decréscimo da absorbância que é proporcional à
concentração de sequestradores de radicais adicionados à solução
reagente de DPPH.
Haminiuk et al.
(2012); Thatoi,
Patra & Das
(2014)
3.5 - Extração assistida por enzimas
A extração é o estágio inicial e um dos passos mais importantes em estudo de
obtenção de compostos bioativos a partir de plantas, pois desempenha um papel significativo e
crucial no rendimento do processo de extração (AZMIR et al., 2013). Ao longo dos anos,
diversas técnicas foram criadas e melhoradas para facilitar a recuperação de compostos
bioativos de matrizes alimentares. Dentre eles, métodos não convencionais, como a extração
assistida por enzimas têm ganhado destaque.
As enzimas, catalisadores de alta especificidade, podem ser empregados na
extração, modificação ou síntese de compostos bioativos de origem natural (PURI; SHARMA;
BARROW, 2012). As enzimas hidrolisam os componentes da parede celular de vegetais e,
consequentemente, ocorre a liberação de compostos bioativos, o que promove o aumento na
36
recuperação destes compostos a partir da matriz vegetal (PINELO; ARNOUS; MEYER, 2006).
O processo de extração assistida por enzima (EAE) consiste em um método inovador para o
uso de enzimas. Primeiramente, essa técnica foi utilizada para facilitar a extração de lipídios e
proteínas a partir de sementes oleaginosas (LIU et al., 2016). A água é utilizada como meio
reacional na EAE, assim, essa técnica é uma alternativa promissora aos métodos convencionais
de extração que empregam solventes orgânicos (BAIANO, 2014). A EAE baseia-se na
capacidade das enzimas de catalisar reações com especificidade e regiosseletividade em
condições de processamento suave e em meio aquoso (GARDOSSI et al., 2010)
A EAE apresenta mais vantagens em relação aos métodos de extração
convencionais por possuir apelo ecológico já que nessa técnica não são utilizados solventes
orgânicos, apresenta maior rendimento e menor gasto de tempo na extração, o produto final
apresenta maior qualidade devido à ausência de resíduos de solventes e baixo consumo de
energia. Para a eficiência do processo, é necessário compreender parâmetros bioquímicos
relacionados às enzimas, como modo de ação, propriedade catalítica, condições ótimas de
atuação e quais enzimas ou combinação delas são mais adequadas para a obtenção dos
compostos de interesse (PURI; SHARMA; BARROW, 2012).
Devido as suas vantagens, a EAE tem despertado o interesse de vários
pesquisadores na busca por combinações de diferentes enzimas (carboidrases e proteases) para
a degradação da parede celular de sementes e frutos (LIU et al., 2016). No entanto, essa é uma
técnica que apresenta limitações, devido ao elevado custo para o processamento de grandes
volumes de matéria-prima, a disponibilidade de preparações enzimáticas que não podem
hidrolisar completamente as paredes celulares de vegetais, a dificuldade do uso em escala
industrial já que as enzimas se comportam de forma diferente nas condições do meio ambiente
(porcentagem de oxigênio, temperatura e disponibilidade de nutrientes) (BAIANO, 2014).
A liberação de compostos bioativos de células vegetais por degradação e extração
pode ser otimizada usando preparações enzimáticas únicas ou combinadas (BAIANO, 2014).
A combinação das enzimas amilase, celulase e protease foi mencionada (SHARMA; GUPTA,
2001; FANG; MOREAU, 2014) por melhorar o rendimento da extração de óleo a partir do
farelo de arroz e do trigo. A combinação das enzimas α-amilase e celulase tem sido usada para
a recuperação de ácidos fenólicos a partir da cevada (YU; VASANTHAN; TEMELLI, 2001).
As enzimas podem ser de origem bacteriana, fúngica, animal e de vegetal. Para aumentar o
rendimento da extração as condições operacionais, tais como temperatura, tempo, pH e relação
enzima-substrato, podem ser otimizadas (BAIANO, 2014).
37
A enzima celulase é uma carboidrase que hidrolisa as ligações β-1,4 glicosídicas da
celulose e pode romper a integridade da parede celular de plantas. As preparações de enzimas
celulolíticas hidrolisam os componentes da parede celular, como a hemicelulose, celulose e
lignina, aumentando o rendimento da extração (PURI; SHARMA; BARROW, 2012) de
compostos, por exemplo, antioxidantes, polissacarídeos, óleos, pigmentos naturais e aromas
(DE MOURA et al., 2008). Celulase de Thermobifida fusca foi empregado para a extração de
compostos fenólicos a partir de casca de maçã (KIM et al., 2005). Além disso, celulase foi
empregada para melhorar a extração de oligossacarideos a partir de arroz branco, no qual foi
observado um rendimento de aproxidamente 40% (PATINDOL et al., 2007).
As proteases são enzimas que hidrolisam as ligações peptídicas entre os
aminoácidos das proteínas, podendo assim liberar peptídeos bioativos e outros compostos
complexados às proteínas (WEIHOFEN; MARTOGLIO, 2003). O aumento na recuperação de
compostos fenólicos a partir do bagaço de groselha preta foi observado com o uso de proteases
(LANDBO; MEYER, 2001).
A adição de amilase durante o processo de extração melhora a recuperação de
alguns compostos bioativos de interesse que estão ligados a parede celular da planta (AZMIR
et al., 2013). Uma combinação de α-amilase, pectinase, protease e celulase aumentou o
rendimento da extração de oleoresinas e gingerol a partir de gengibre (Zingiber officinale
Roscoe) (NAGENDRA et al., 2013).
Enzimas únicas, por exemplo, celulase, pepsina, pectinase e β-glicosidase, ou
combinadas (ex.: misturas comerciais) foram empregadas na extração de diferentes compostos
antioxidantes, tais como naringenina, antocianinas e carotenoides e outros compostos bioativos
(oligossacarídeos) a partir de diferentes partes de plantas, principalmente, casca e sementes de
frutas (Tabela 4). As cascas e sementes de frutas contêm elevado conteúdo de compostos
fenólicos livres e, principalmente, ligados a parede celular, material lignocelulosíco composto
de celulose, hemicelulose, pectina, proteínas e outras componentes em menor quantidade. O
uso de enzimas capazes de clivar parcial ou totalmente os componentes da parede celular
permite liberar compostos fenólicos facilmente extraíveis com potencial antioxidante, dentre
eles podemos citar o ácido ferúlico e o ácido p-coumárico. Por isso, o uso de EAE na extração
de compostos antioxidantes a partir de subprodutos ou das partes não-comestíveis de plantas
têm sido amplamente estudados nos últimos anos (PURI et al. 2011; KAMMERER et al. 2005;
KIM et al. 2005; PATINDOL et al. 2007; FERRUZZI; GREEN 2006; RUIZ-TERAN et al.
2001; STOLL et al. 2003; MUÑOZ et al. 2004; LI et al. 2006; LANDBO; MEYER 2001).
38
Tabela 4 - Exemplos do uso de extração assistida por enzimas para extração de compostos
antioxidantes a partir de diferentes partes de plantas.
Fonte Enzima Origem Composto Rendimento
(%) Referência
Casca de
laranja
α-L-
Ramnosidase
Escherichia
coli Naringenina n.d
Puri et al.
(2011)
Bagaço de
uva
Enzimas
pectinolíticas e
celulolíticas
n.d
Antocianina e
outros compostos
fenólicos
98,1 Kammerer et
al. (2005)
Casca de
maça Celulase
Thermobifida
fusca
Compostos
fenólicos n.d
Kim et al.
(2005)
Arroz branco Celulase n.d Oligossacarídeos 39,9 Patindol et al.
(2007)
Chá Pepsina n.d Catequina 80 Ferruzzi;
Green (2006)
Vagens β-glicosidase e
pectinase n.d Vanilina 14-21
Ruiz-Teran et
al. (2001)
Bagaço de
cenoura
Pectinex
Ultra SP-L
Aspergillus
aculeatus Carotenoides 0,0064
Stoll et al.
(2003)
Pele de uva Pectinex
BE3-L n.d Antocianinas n.d
Muñoz et al.
(2004)
Casca de
frutas citrícas
Celluzyme
MX n.d
Compostos
fenólicos 65,5
Li et al.
(2006)
Bagaço de
groselha preta Protease Aspergillus niger
Compostos
fenólicos n.d
Landbo;
Meyer (2001)
n.d: não definido
39
4 - MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Bioaromas e Compostos
Bioativos (LBCB) em parceria com os Laboratórios de Bioquímica de Alimentos da
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas
Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA) e do Laboratório Thomson de Espectrometria de
Massas (UNICAMP).
4.1 - Coleta e preparação das amostras
As sementes in natura de Adenanthera pavonina L. foram obtidas no Campus da
Universidade de Fortaleza (UNIFOR), localizada em Fortaleza no Estado do Ceará, Brasil. As
amostras foram coletadas entre os meses de setembro e novembro de 2016 e transportadas para
o LBCB - Universidade Estadual de Campinas (FEA-UNICAMP), Campinas, São Paulo /
Brasil, congeladas em caixas térmicas (isopor), até 36 horas após a coleta. As sementes foram
lavadas com água deionizada e secas com papel toalha. Em seguida, as sementes foram
trituradas em moinho de facas (Marconi, model MA340, Brasil) até a obtenção de um pó fino
(≤ 1mm). O pó das sementes foi embalado à vácuo e armazenado em freezer (-20°C) até o
momento das análises (Figura 2).
Figura 3. Preparação da amostra. A) Semente in natura, B) Sementes após o procedimento de
lavagem, C) Sementes trituradas e armazenadas em embalagens seladas à vácuo.
4.2 - Caracterização e composição centesimal da semente de Adenanthera pavonina L.
As amostras foram descongeladas, homogeneizadas e caracterizadas em relação ao
pH (método n° 970.21), sólidos solúveis totais (SST) (método n° 932.12) e acidez total titulável
(ATT) (método n° 942.15) conforme os métodos descritos pela AOAC (Association of Official
40
Analytical Chemists) (HORWITZ e LATIMER, 2012). Os resultados de ATT foram expressos em
g de ácido cítrico (AC) por 100 g de amostra (g AC 100 g-1).
As análises de umidade, proteína (fator de conversão de nitrogênio da proteína
bruta: 6,25), lipídios, fibras e cinzas foram realizadas de acordo com os métodos oficiais da
AOAC (HORWITZ; LATIMER, 2012). Todas as análises foram realizadas em triplicata. O
conteúdo de carboidratos das amostras foi obtido por diferença considerando o conteúdo total
dos demais componentes.
4.3 - Tratamento enzimático do pó das sementes de Adenanthera pavonina L.
Três preparações enzimáticas foram utilizadas no presente estudo: α-amilase
(Termamyl® de Bacillus licheniformis), protease (Neutrase® de Bacillus amyloliquefaciens),
e celulase (Optimase® CX 56L de Bacillus subtilis). Os efeitos isolados e de misturas das
diferentes enzimas foram avaliados utilizando planejamento experimental de misturas (NETO;
SCARMINIO; BRUNS, 2010).
A quantidade e a proporção da mistura das enzimas foram pré-determinadas de
acordo com o designer experimental apresentado na Tabela 5. Para o tratamento enzimático,
amostras contendo 5 g do pó das sementes, 45 mL de tampão fosfato 100 mM pH 7,0 e enzimas
foram incubadas a 50°C sob agitação de 100 rpm (New Brunswick Scientific Classic Series,
model C76, USA) durante 2h. Após o tratamento enzimático, as soluções foram congeladas
imediatamente a - 20 °C para paralisação das reações enzimáticas e, em seguida, foram
liofilizadas.
O processo de hidrólise enzimática utilizando o planejamento experimental de
misturas englobou sete ensaios com os componentes avaliados em 4 níveis: 1) 0 (0%), 1/3
(33%), 1/2 (50%), e 1 (100%) (Tabela 5).
Todos os experimentos realizados foram analisados comparativamente com as suas
respectivas amostras não tratadas enzimaticamente (controle). Equações quadráticas ou cúbicas
foram utilizadas para definição de modelos para cada variável estudada, como mostrado a
seguir:
Equação 3. Equação para definição dos modelos das variáveis estudadas
𝑌𝑖 = 𝛽𝑖𝑋𝑖 + 𝛽𝑖𝑗
𝑞
𝑖<𝑗
𝑞
𝑖=1
𝑋𝑖𝑋𝑗 + 𝛽𝑖𝑗𝑘𝑋𝑖𝑋𝑗𝑋𝑘
𝑞
𝑖<𝑗<𝑘
41
Onde ‘Yi’ representa a resposta estimada pelo modelo, ‘q’ representa o número de
componentes do sistema; ‘Xi, Xj, Xk’ são as variáveis independentes codificadas, ‘βi’ representa
os coeficientes de regressão linear para o efeito de cada termo, ‘βij'’ e ‘βijk’ correspondem aos
efeitos de interação entre as misturas binárias e ternárias. O coeficiente de correlação múltipla
(R2) e o teste de Fisher (análise de variância - ANOVA) foram utilizados para verificar a
adequação estatística dos modelos propostos codificados aos pontos reais. O software
Statistica®11 da Statsoft Inc. (Tulsa, Oklahoma, EUA) foi utilizado para o planejamento
experimental, análise de dados e construção de modelos (NETO; SCARMINIO; BRUNS,
2010).
Tabela 5 - Matriz do planejamento experimental de misturas para obtenção de compostos
bioativos das sementes de Adenanthera pavonina L. utilizando diferentes preparações
enzimáticas.
Ensaios Protease α-Amilase Celulase
Volume
protease
(μL)
Volume α-
amilase
(μL)
Volume
celulase
(μL)
Controle 0,00 0,00 0,00 0 0 0
1 1,00 0,00 0,00 250 0 0
2 0,00 1,00 0,00 0 250 0
3 0,00 0,00 1,00 0 0 250
4 0,50 0,50 0,00 125 125 0
5 0,50 0,00 0,50 125 0 125
6 0,00 0,50 0,50 0 125 125
7 0,33 0,33 0,33 85 85 85
4.4 - Procedimento de extração
A partir das amostras tratadas enzimaticamente foram realizadas as extrações com
diferentes tipos de solventes (água, etanol, metanol, etanol: água (1:1, v/v) e metanol: água (1:1,
v/v) com a finalidade de avaliar o efeito do solvente sobre a extração de compostos com
capacidade antioxidante das sementes de Adenanthera pavonina L.
As extrações foram realizadas de acordo com o método descrito por Arruda et al.
(2017), com algumas modificações. As amostras foram misturadas com os diferentes solventes
(água, etanol, metanol, etanol: água (1:1, v/v) e metanol: água (1:1, v/v) na proporção de 1:10
(p/v). Em seguida, a mistura foi incubada em agitador rotatório (New Brunswick Scientific
Classic Series, modelo C76, EUA) por 30 minutos a 25 ºC e 150 rpm. As amostras foram
42
centrifugadas (Hettich Zentrifugen, modelo Rotanta 460R, Tuttlingen, Alemanha) a 600 g por
6 minutos a 5 °C. Os sobrenadantes foram filtrados em filtro 0,20 µm e usados como extratos
de compostos bioativos. O extrato que apresentou maior capacidade antioxidante foi utilizado
para caracterização de compostos bioativos, bem como avaliação das atividades biológicas,
como pode ser observado na Figura 4.
Figura 4. Fluxograma geral do processo de extração assistida por enzimas de compostos
bioativos das sementes de Adenanthera pavonina L. Abreviações: TPC, conteúdo total de
compostos fenólicos; TFC, conteúdo total de flavonoides.
43
4.5 - Atividades biológicas in vitro
4.5.1 - Avaliação da capacidade antioxidante
4.5.1.1 - Capacidade antioxidante equivalente ao trolox (TEAC)
O ensaio TEACABTS foi realizado conforme método descrito por Leite et al. (2011),
com algumas adaptações. A solução de ABTS•+ foi preparada usando 5 mL de uma solução de
2,2’-Azinobis-[3-ethylbenzothiazoline-6-suphonic acid)-diammonium salt] – (ABTS) 7,0 mM
e 88 μL de uma solução de persulfato de potássio (K2S2O8) 145 mM. O sistema foi mantido em
repouso de 12 a 16 horas a temperatura ambiente e na ausência de luz. Uma vez formado o
ABTS•+, o mesmo foi diluído em água ultrapura (Milli-Q) para o ajuste da absorbância de 0,70
± 0,02 para 734 nm utilizando um espectrofotômetro UV/Visível (Beckman, modelo DU600,
CA, EUA). Em uma cubeta foram adicionados: 200μL de extrato (diluídos em água ultrapura)
e 1000μL de ABTS•+. O controle da reação (reagente ABTS•+) foi preparado de acordo com
o procedimento descrito anteriormente, sem a adição de extrato e adição da água ultrapura
(Milli-Q) que foi usado para corrigir a linha de base. Após 6 minutos de incubação à temperatura
ambiente e no escuro, a absorbância foi medida a 734 nm contra um branco (água ultrapura). A
curva de calibração foi preparada com padrão de Trolox (5 - 150 μM), e os resultados foram
expressos como μmol de equivalentes de Trolox (TE) por g de semente liofilizada (µmol TE/g).
4.5.1.2 - Capacidade de absorção do radical oxigênio (ORAC)
O ensaio ORACFL foi realizado conforme método descrito por Leite et al. (2011),
com algumas adaptações. As reações foram realizadas em microplacas de poliestireno,
específicas para reações de fluorescência, contendo 96 poços. Todos os reagentes e diluições
das frações hidrofílicas (ORACFL-H) dos extratos liofilizados foram preparados diariamente.
Para o ensaio ORACFL-H a cada poço da microplaca foram adicionados: 20 μL de
tampão de fosfato de potássio 75 mM, pH 7,4 (branco), do padrão Trolox ou dos extratos da
semente previamente diluídos, 120 μL de fluoresceína (0,378 μg/mL, pH 7,4) e 60 μL de AAPH
[2,2-Azobis-(2-methylamidinopropane)-dihydrochloride] (108 mg/mL). A amostra, os padrões
e os reagentes (AAPH e fluoresceína) foram preparados em tampão fosfato de potássio 75 mM,
pH 7,4. Para cada ensaio utilizando diferentes placas foi preparada uma curva padrão de Trolox
(50 – 600 µM) específica para a avaliação da fração hidrofílica, seguida das diluições
44
apropriadas. A intensidade da fluorescência foi monitorada a 37 °C logo após a adição do
AAPH a cada ciclo de 60 segundos, por 80 ciclos através de leitor de microplacas (NOVOstar,
modelo BMG Labtech, Offenburg, Alemanha), com os seguintes filtros: excitação 485 nm e
emissão a 520 nm, acompanhado com o Software de análise de dados MARS Data Analysis
versão 1.3 (BMG Labtech, Offenburg, Alemanha). Os resultados foram obtidos com base na
área sob a curva de decaimento da fluorescência ao longo do tempo (AUC) e da área útil
(NAUC), calculadas como descrito nas Equações 4 e 5. Os resultados finais foram expressos
como μmol de equivalentes de Trolox (TE) por g de semente liofilizada (µmol TE/g).
𝐴𝑈𝐶 = 1 + 𝑓𝑖/𝑓0𝑖=80
𝑖=1
Equação 4. Área da curva de decaimento da fluoresceína com adição da substância
antioxidante
Onde, f0 representa a fluorescência obtida no tempo 0 e fi a fluorescência obtida nos
tempos intermediários entre 1 e 80 minutos.
𝑁 𝐴𝑈𝐶 = 𝐴𝑈𝐶𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜 − 𝐴𝑈𝐶𝐵𝑟𝑎𝑛𝑐𝑜
Equação 5. Área sob a curva de decaimento da fluorescência corrigida
Onde, AUCExtrato é a área sob a curva para a amostra e AUCBranco para o branco.
4.5.1.3 - Atividade sequestradora do radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil (DPPH•)
O ensaio DPPH foi realizado de acordo com Roesler et al. (2007), com algumas
adaptações. Os extratos foram inicialmente diluídos em etanol (p.a.) e 200 μL de cada diluição
foram misturados a 1000 μL de solução DPPH (0,004 % m/v) em cubeta. A mistura foi incubada
por 30 minutos a temperatura ambiente e no escuro. O controle da reação (reagente DPPH) foi
preparado de acordo com o procedimento descrito anteriormente, substituindo o extrato por
etanol (p.a.). A solução de DPPH foi preparada, armazenada em frascos âmbar e mantido ao
abrigo da luz a 4 °C. A absorbância do DPPH remanescente foi determinada a 517 nm contra
um branco (etanol p.a.) usando o espectrofotômetro UV/Visível (Beckman, modelo DU600,
CA, EUA) e a capacidade de sequestrar radicais livres foi calculada de acordo com a Equação
6. A curva de calibração foi preparada com padrão de Trolox (25 - 200 μM) e os resultados
foram expressos em µmol de equivalentes de Trolox (TE) por g de amostra (µmol TE/g).
45
% 𝑑𝑒 𝐼𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 = [(𝐴𝐷𝑃𝑃𝐻 − 𝐴𝐸𝑋𝑇𝑅𝐴𝑇𝑂)
𝐴𝐷𝑃𝑃𝐻] 𝑋 100
Equação 6. Porcentagem de inibição do radical DPPH
Onde, ADPPH é a absorbância da solução de DPPH e AExtrato é a absorbância da amostra.
4.5.2 - Ensaio de atividade antiproliferativa com células tumorais humanas
Com o objetivo de evitar possíveis contaminações e garantir a viabilidade celular,
os testes foram realizados sob condições assépticas em ambiente controlado de fluxo laminar
biológico, utilizando materiais e reagentes previamente esterilizados de acordo com a natureza
de cada um. As linhagens tumorais humanas foram cedidas pelo NCI (Instituto Nacional do
Câncer, Frederick-MA, EUA) e a linhagem de queratinócitos humanos imortalizados (HaCaT)
foi doada pelo Dr. Ricardo Della Coletta (FOP, UNICAMP) (Tabela 6).
Tabela 6 - Linhagens celulares tumorais e não tumoral (HaCaT) utilizadas nos ensaios de
atividade antiproliferativa in vitro e suas densidades de inoculação (DI).
Linhagem celular Sigla DI (x 104 células /mL)
Linhagens tumorais
Glioma U251 3,0
Mama MCF-7 6,0
Ovário com fenótipo de
resistência NCI-ADR/RES 5,0
Rim 786 - 0 3,0
Pulmão NCI - H460 3,5
Próstata PC - 3 3,5
Cólon HT - 29 5,0
Leucemia K562 6,0
Melanoma UACC- 62 4,0
Ovário OVCAR - 3 7,0
Linhagens não
tumorais Queratinótico humano HaCaT 3,0
46
4.5.2.1 - Cultivo celular
As células foram cultivadas em frascos de 25 cm³ (Corning®, EUA) com 5 mL de
meio RPMI 1640 (Gibco®, EUA), suplementado com 5% de soro fetal bovino (SFB-GibcoTM,
EUA) e mantidas a 37 ºC em atmosfera úmida com 5% de CO2. Durante os experimentos, o
antibiótico na solução de penicilina: estreptomicina (Nutricell®, Campinas, 1000 U mL- 1:1000
g mL - 1) foi adicionada ao meio de cultura.
Para linhagens aderidas (com exceção da linhagem de leucemia – K562), o
desprendimento celular foi realizado mediante ação enzimática da tripsina. Para isso, o meio de
cultura foi aspirado, o frasco foi lavado com 500 μL de tampão fosfato (PBS, pH 7,0) para
eliminar resíduos de meio de cultura e, após aspiração do tampão, foram adicionados 500 μL
de tripsina - EDTA 2,5 g/L (Vitrocell®), a 37ºC, até que as células conseguissem se desprender
totalmente. A ação da tripsina foi bloqueada com RPMI + SFB 5% e uma alíquota dessa
suspensão foi transferida aos novos frascos, completando-se o volume para 5 mL.
4.5.2.2 - Preparo das suspensões celulares
Os ensaios de atividade antiproliferativa realizados com os extratos da semente de
Adenanthera pavonina L. obtidos de acordo com o item 4.4 foram realizados segundo o
protocolo descrito por Monks et al. (1991). O crescimento celular foi determinado por
espectrofotometria, utilizando-se o corante proteico sulforrodamina B (SRB, Sigma-Aldrich®)
e as análises de atividade antiproliferativa em culturas de células foram baseadas na
metodologia de triagem in vitro para drogas anticâncer realizada pelo NCI, EUA, que utiliza
um painel de 60 linhagens tumorais humanas (NCI60) (MONKS et al., 1991; SHOEMAKER,
2006). Este protocolo inclui a determinação da densidade celular no tempo 0 (momento de
adição das amostras), o que possibilita o cálculo da concentração que inibe totalmente o
crescimento celular (SHOEMAKER, 2006).
No primeiro dia de experimento, as suspensões celulares foram preparadas com
meio RPMI suplementado com 5% de SFB e penicilina-estreptomicina, em suas respectivas
densidades de inoculação (Tabela 6). Foram inoculados 100 μL/compartimento de cada
suspensão celular em placas de 96 compartimentos (Corning®, EUA), que foram incubadas por
24 horas a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2 e ambiente úmido. Do mesmo modo, a placa
controle (T0) foi preparada contendo todas as linhagens celulares utilizadas no experimento
(Tabela 6).
47
4.5.2.3 - Preparo e aplicação das amostras
Os extratos da semente liofilizados das sementes de Adenanthera pavonina L.
foram diluídos em dimetilsulfóxido (DMSO) (Merck®) na concentração de 0,1 g/mL. Para a
adição à cultura de células, estas soluções foram diluídas pelo menos 400 vezes em meio de
cultura RPMI com 5% de SFB e penicilina-estreptomicina (2 mg/L), o que evita a toxicidade
do DMSO. As amostras de extratos da semente diluídas em DMSO foram adicionadas nas
microplacas (cinco amostras por microplaca) nas concentrações de 0,25; 2,5; 25 e 250 μg/mL
(100 μL/compartimento) em triplicata e, a seguir, foram incubadas por 48 horas a 37 ºC em
atmosfera de 5% de CO2 e ambiente úmido (Figura 5). Como controle positivo, utilizou-se o
quimioterápico doxorrubicina, nas concentrações de 0,025; 0,25; 2,5 e 25 μg/mL (100
μL/compartimento) em triplicata.
Figura 5. Representação gráfica da distribuição das amostras na placa de 96 compartimentos
utilizada no teste de atividade antiproliferativa.
No momento de adição das amostras, as células inoculadas na placa controle T0
foram fixadas com a adição de 50 μL/compartimento de ácido tricloroacético (TCA) a 50%
(m/v) (Sigma- Aldrich®) para determinada indiretamente a quantidade de células presentes no
momento em que as amostras foram aplicadas, sendo este o valor basal no tempo 0.
Após 48 horas de tratamento, as células foram fixadas com 50 μL/compartimento
de ácido tricloroacético a 50% (m/v) (TCA, Sigma-Aldrich®, EUA) e incubadas por 1 hora, a 4
ºC. Em seguida, as placas foram submetidas a quatro lavagens consecutivas em água corrente
48
para a remoção dos resíduos de TCA, meio de cultura, SFB e metabólitos secundários. Em
seguida, foram mantidas à temperatura ambiente até a secagem completa.
Após a secagem, foram adicionados 50 μL/compartimento do corante proteico
sulforrodamina B (SRB) (Sigma-Aldrich®) a 0,4 % (m/v) dissolvido em ácido acético a 1 %
(v/v) e, em seguida, as placas foram incubadas à temperatura ambiente por 10 minutos.
As placas foram lavadas 4 vezes consecutivas com solução de ácido acético 1%
(v/v) e, após secagem completa à temperatura ambiente, o corante ligado às proteínas celulares
foi solubilizado com 150 μL/compartimento de Trizma Base (10 mM, pH 10,5) (Sigma-
Aldrich®, EUA). A leitura espectrofotométrica da absorbância foi realizada em leitor de
microplacas a 540 nm (Molecular Devices®, modelo VersaMax).
4.5.2.4 - Análise dos Resultados dos ensaios antiproliferativos
As médias das absorbâncias foram calculadas descontando o valor de seus
respectivos brancos e, por meio das fórmulas abaixo, foi determinada a inibição do crescimento
celular (em porcentagem) de cada linhagem celular em função das concentrações de cada
amostra testada. Os resultados obtidos foram analisados, considerando-se que:
Se T > C, a amostra estimulou o crescimento celular.
Se T0 ≤ T < C, a amostra apresentou atividade citostática e a fórmula utilizada foi
100 x [(T-T0)/ (C-T0)].
Se T< T0, a amostra foi citocida e a fórmula utilizada foi 100 x [(T- T0)/(T0)].
Onde T = representa a média das absorbâncias das células tratadas, C = corresponde
ao controle de células e T0 = controle das células no dia da adição das amostras.
Esses resultados foram expressos em curvas de crescimento celular para cada
linhagem em função da concentração da amostra e, a partir deles, foram calculadas as
concentrações efetivas de GI50 (concentração de amostra necessária para inibição de 50% do
crescimento celular), por meio da regressão não linear, tipo sigmoidal, empregando-se software
ORIGIN 8.0 (OriginLab Corporation).
49
4.6 - Determinação e identificação dos compostos bioativos
4.6.1 - Compostos fenólicos totais
O conteúdo de fenólicos totais foi determinado espectrofotometricamente pelo
método de Folin-Ciocalteau como descrito por Roesler et al. (2007), com algumas
modificações, para a amostra que apresentou maior capacidade antioxidante. Este método
envolve a redução do reagente Folin-Ciocalteau pelos compostos fenólicos, com concomitante
formação de um complexo azul em meio básico, cuja absorbância a 760 nm aumenta
linearmente com a concentração de fenólicos no meio reacional. As amostras da semente
tratadas enzimaticamente (5 g da semente triturada em 45 mL de tampão fosfato 100 mM pH
7,0, 125 µL de protease e celulase, 50 ºC, 100 rpm por 2 horas de incubação) e os padrões da
curva de calibração foram diluídos em etanol 40% (v/v). Em seguida, 100 μL das amostras
diluídas, soluções de calibração ou branco (etanol 40%) foram pipetadas em tubos teste de 10
mL juntamente com 100 μL de reagente Folin-Ciocalteau 50% (v/v). A mistura foi
homogeneizada e deixada em repouso para atingir o equilíbrio. Após 2 minutos, 800 μL de
Na2CO3 5% (m/v) foram adicionados. A mistura foi mantida a temperatura ambiente por 20
minutos. Subsequentemente, a absorbância foi mensurada em cubetas de 1 cm utilizando um
espectrofotômetro UV/Visível (Beckman, modelo DU600, CA, EUA) operando a 760 nm. As
soluções de etanol 40 % (v/v) e Folin-Ciocalteau 50 % (v/v) foram obtidas por meio da diluição
em água. A curva de calibração foi preparada com padrão de ácido gálico (10 - 80 μg/mL), e o
conteúdo de compostos fenólicos totais foi expresso como g de equivalentes de ácido gálico
(GAE) por 100 g de amostra (g GAE.100 g-1).
4.6.2 - Determinação de taninos condensados
A determinação de taninos condensados foi realizada apenas para o extrato que
apresentou maior capacidade antioxidante (item 4.4). Uma alíquota de 30 μL do extrato (diluído
em metanol) foi misturada com 900 μL de vanilina 4% (m/v) preparada com metanol e, em
seguida, foi adicionado 450 μL de HCl concentrado. A mistura foi incubada a temperatura
ambiente por 20 minutos ao abrigo da luz. Após o período de incubação, a leitura da absorbância
foi realizada a 500 nm usando o espectrofotômetro UV/Visível (Beckman, modelo DU600, CA,
EUA). A curva de calibração foi preparada com padrão de catequina (50 - 800 μg/mL), e o
50
resultado foi expresso em mg de equivalente de catequina por grama de amostra
(BROADHURST; JONE, 1978).
4.6.3 - Determinação do conteúdo de flavonoides
O teor de flavonoides totais foi determinado de acordo com o método proposto por
Zhishen et al. (1999), com algumas adaptações, para o extrato que apresentou maior capacidade
antioxidante (item 4.4). A amostra foi preparada em água na concentração de 10 mg/mL,
homogeneizada em agitador de tubos por 30 segundos, seguido de ultrasonicação a 10 °C
durante 30 minutos. Uma alíquota de 100 µL do extrato diluído e 400 µL de água ultrapura
foram homogeneizados e 30 µL de NaNO2 5% (m/v) foi adicionado. Após 5 minutos, 30 µL de
AlCl3 10% foi adicionado. Após 6 minutos, 200 µL de NaOH 1M e 240 µL de água ultrapura
foram adicionados ao sistema de reação. A absorbância da mistura foi comparada a um branco
(água) e medido a 510 nm. Uma curva de calibração foi construída com catequina (25 - 150
μg/mL) e o conteúdo de flavonoides totais foi expresso como mg de catequina equivalente por
100 g.
4.6.4 - Cromatografia líquida de ultra alta eficiência acoplado ao espectrômetro de massas
(CLUAE – EM/EM)
A identificação e a quantificação dos compostos fenólicos no extrato com maior
capacidade antioxidante (item 4.4) foram realizadas por meio de Cromatografia Líquida de
Ultra Alta Eficiência (CLUAE) acoplado ao espectrômetro de massas do tipo triplo quadrupolo,
modelo LCMS-8040 (Shimadzu, Kyoto, Japan), equipado com uma fonte de ionização por
electrospray (IE), de acordo com o método estabelecido por Bataglion et al. (2015), com
algumas adaptações.
Soluções estoque de cada padrão analítico (pureza ≥ 95%; Sigma-Aldrich, St.
Louis, EUA) na concentração de 1 mg/mL foram preparados em metanol e estocados a -80 ºC.
Os extratos e os padrões foram diluídos em água acidificada (0,1% de ácido fórmico, v/v) e
filtrados através de filtros de membrana 0,20 μm antes da injeção. Curvas de calibração foram
construídas (20-1000 ng/mL) para quantificar os compostos fenólicos identificados nos
extratos. Os resultados foram expressos em µg/g de extrato.
A análise dos compostos fenólicos foi realizada no modo negativo. Para cada
padrão analítico, os íons precursores foram determinados em experimentos de varredura e os
51
íons produtos foram escolhidos por experimentos EM/EM. As análises foram conduzidas por
monitoramento de múltiplas reações (MRM) utilizando duas das transições mais seletivas para
cada padrão analítico. As configurações do espectrômetro de massas foram utilizadas para cada
transição como pode ser observado na Tabela 7. Os parâmetros da fonte de ionização foram
voltagem capilar de 3,5 Kv; temperatura de 300 ºC; temperatura da linha de dessolvatação de
250 °C; fluxo de gás de secagem (N2) a 20 L/min; fluxo do gás nebulizador (N2) a 3 L/min);
pressão de gás (Ar) para dissociação induzida por colisão de 228 kPa.
Tabela 7 - Parâmetros de espectrometria de massas para as transições MRM
Composto Transição
(m/z)*
DP (V) CE (V) CXP (V) TR (min)
Ácido
protocatecuico
153,00>109,00 30 15 17 3,71
153,00>108,15 30 30 18
Catequina
289,10>151,00 18 22 24 4,00
289,10>123,00 19 27 28
Ácido 4-
hidroxibenzóico
137,00>93,10 26 16 14 4,35
137,00>65,05 26 28 23
Ácido ferúlico
193,10>134,00 12 17 21 5,00
193,10>178,00 12 11 30
Ácido gentísico
153,00>108,10 29 15 19 5,59
153,00>109,10 29 23 17
Quercetina
301,00>151,00 20 23 24 5,88
301,00>178,96 20 19 30
Naringenina
270,90>151,00 18 17 29 5,99
270,90>119,10 18 29 18
* Primeira linha transição usada para quantificação. Segunda linha transição usada para
identificação. DP: Potencial de orifício, CE: energia de colisão, CXP: potencial de saída da cela
de colisão, TR: tempo de retenção em minutos.
A separação cromatográfica foi realizada em coluna Shim-pack XR-ODS III
(Shimadzu, Kyoto, Japan) com partículas de 2,2 µm, diâmetro interno de 2,0 mm e
comprimento de 150 mm usando a fase binária móvel, onde a temperatura foi mantida a 40 ºC.
O solvente A foi água ultrapura com 0,1% de ácido fórmico e o solvente B foi o metanol. O
52
gradiente de eluição utilizado foi como segue: 0-1 min, 5% B; 1–4 min, 5-60% B; 4–7 min, 60–
70% B; 7–10 min, 70–100% B; 10–10.50 min, 100% B; 10.50–11 min, 100–5% B; 11–15 min,
5% B e fluxo de 0.4 mL/min. A temperatura do autoamplificador permaneceu à 10 °C e o
volume de injeção foi de 10 µL. O processo cromatográfico foi controlado pelo software
Labsolution.
4.7 - Análise estatística
Os resultados foram analisados estatisticamente por meio de análise de variância
(ANOVA). Quando verificada diferença estatística utilizando ANOVA, os tratamentos foram
comparados pelo teste de Tukey HSD. Todas as análises estatísticas foram realizadas com nível
de 5 % de significância (p ≤ 0,05) com o Software STATISTICA versão 11 (Statsoft, Oklahoma,
EUA). Os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão da triplicata.
53
5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 – Análise físico-química e centesimal
Os valores médios e parâmetros físico-químicos e composição centesimal das
sementes in natura de A. pavonina L. estão apresentados na Tabela 8. As sementes de A.
pavonina L. apresentaram valor de pH igual a 6,09, ATT de 0,51 g AC/100g e SST de 22,63
ºBrix (Tabela 8). As sementes de A. pavonina L. apresentaram maior teor de SST e menores
valores de ATT e pH quando comparada com as sementes de jabuticaba (12,60º Brix, ATT=
3,25g AC/100g e pH 4,01) (LIMA et al., 2008). As sementes de A. pavonina apresentaram
neutralidade e elevado teor de sólidos solúveis.
As sementes de A. pavonina L. apresentaram 53,12% de carboidratos totais, 18,79%
de proteína, 14,63% de lipídios, 11,8% de umidade e 1,65% de cinzas. As sementes de carolina
apresentaram composição centesimal similar a farinha de soja para os valores de carboidratos
totais (58,6%) e lipídios (14,6%), enquanto os valores de proteína (36,0%) e cinzas (5,1%) da
farinha de soja foram superiores aos das sementes de A. pavonina L. A umidade da farinha de
soja (5,8%) foi menor do que o valor encontrado para as sementes de carolina (11,8%)
(NEPA/UNICAMP, 2011).
Tabela 8 - Valores médios de parâmetros físico-químicos e composição centesimal das
sementes in natura de A. pavonina L.
Parâmetros Semente in natura
pH 6,09 ± 0,01
ATT (g AC/100g) 0,51 ± 0,07
SST (°Brix) 22.63 ± 0,56
Umidade (%) 11,8 ± 0,48
Cinzas (%) 1,65 ± 1,03
Proteína (%) 18,79 ± 0,65
Lipídios (%) 14,63 ± 1,93
Carboidratos Totais (%) 53,12 ± 2,06
54
Os valores de composição centesimal encontrados no presente estudo para as
sementes in natura de A. pavonina L. foram menores do que os previamente reportados na
literatura para os teores de proteínas (29,44%), lipídios (17,99%) e cinzas (2,37%), enquanto o
teor de carboidratos totais (50,20%) foi semelhante (Tabela 2) (EZEAGU et al., 2004). Essa
variação da composição centesimal das sementes de A. pavonina L. pode ser decorrente de
fatores sazonais, bem como dos métodos de análise empregados nos diferentes estudos.
5.2 - Otimização do tratamento enzimático e extração de compostos com potencial
antioxidante a partir das sementes de A. pavonina L.
O tratamento enzimático da farinha das sementes de A. pavonina L. foi otimizado
utilizando um planejamento experimental de misturas com três componentes: α-amilase,
protease e celulase. Diferentes solventes extratores foram utilizados (água, etanol, metanol,
etanol:água e metanol:água) para selecionar o mais eficiente para a extração de compostos
antioxidantes a partir dos hidrolisados obtidos por tratamento enzimático.
Um dos parâmetros mais importantes no processo de extração é a seleção do
solvente extrator. A diversidade estrutural e de polaridade dos compostos antioxidantes
encontrados em matrizes vegetais resulta no uso de diferentes solventes no processo de
extração, tais como água, acetona, metanol, etanol ou suas misturas com água (THOURI et al.,
2017), ou seja, não existe um solvente universal que possa ser considerado padrão (AL-FARSI;
LEE, 2008). A melhor escolha do solvente pode aumentar consideravelmente o rendimento de
extração de moléculas potencialmente antioxidantes a partir de matrizes vegetais. Assim,
diferentes solventes (água, etanol, metanol, etanol: água (1:1, v/v) e metanol: água (1:1, v/v)
foram empregados para avaliar a extração de compostos antioxidantes a partir dos hidrolisados
(Tabela 9, 10 e 11).
55
Tabela 9 - Capacidade antioxidante (µmol TE/g de liofilizado), avaliada pelo ensaio ORAC,
das sementes de A. pavonina L. tratadas enzimaticamente utilizando diferentes solventes*
Ensaio Água Etanol:Água
(1:1; v/v)
Metanol:Água
(1:1; v/v) Metanol Etanol
1 146,4±7,84 aF 109,53±1,19 bC 144, 91±0,93 aCD 22,34±2,26 cC 0,22±0,02 dC
2 172,07±1,86 aDE 73,70±0,76 cE 130,79±0,52 bDE 12,47±1,15 dD 0,14±0,01 eD
3 161,36±6,77 aE 98,65±2,08 cCD 127,12±6,59 bE 21,71±1,98 dC 0,22±0,02 eC
4 191,47±1,24 aBC 169,19±5,48 bA 186,93±0,16 aD 31,37±1,52 cA 0,29±0,01 dA
5 221,84±5,46 aA 137,84±5,74 cB 159,50±1,68 bC 33,14±0,60 dA 0,31±0,00 eA
6 184,32±4,88 aCD 92,86±6,57 cCD 143,13±9,52 bD 26,43±0,81 dB 0,25±0,01 eB
7 219,13±0,51 bA 83,01±6,69 cDE 239,43±6,44 aA 20,39±1,25 dC 0,21±0,01 eC
Controle 201,99±3,94 aB 100,28±9,18 bCD 67,13±6,81 cF 21,10±0,44 dC 0,21±0,00 eC
Tabela 10 - Capacidade antioxidante (µmol TE/g de liofilizado), avaliada pelo ensaio TEAC,
das sementes de A. pavonina L. tratadas enzimaticamente utilizando diferentes solventes*
Ensaio Água Etanol:Água
(1:1; v/v)
Metanol:Água
(1:1; v/v) Metanol Etanol
1 80,24±2,04 aDE 50,53±0,27 cA 59,72±1,49 bC 5,77±0,05 dB 0,21±0,01 eC
2 80,92±2,72 aDE 37,71±0,78 cDE 57,88±0,96 bCD 4,22±0,01 dE 0,61±0,10 dB
3 89,75±1,71 aB 46,29±3,79 cBC 55,52±1,30 bD 5,68±0,08 dBC 0,61±0,02 dB
4 84,22±0,91 aCD 41,88±0,67 cCD 60,87±1,39 bBC 5,97±0,04 dB 0,27±0,04 eC
5 100,08±0,54 aA 35,78±0,26 cE 63,43±1,14 bB 6,81±0,15 dA 0,61±0,05 eB
6 78,67±1,33 aF 34,11±0,65 cE 50,27±0,43 bE 6,47±0,28 dA 1,06±0,06 eA
7 87,59±1,46 aBC 41,65±0,32 cCD 67,98±1,59 bA 5,31±0,15 dD 0,61±0,01 eB
Controle 86,69±1,55 aBC 35,53±2,53 bE 29,37±0,87 cF 5,31±0,24 dD 1,06±0,04 eA
Tabela 11 - Capacidade antioxidante (µmol TE/g de liofilizado), avaliada pelo ensaio DPPH,
das sementes de A. pavonina L. tratadas enzimaticamente utilizando diferentes solventes*
Ensaio Água # Etanol:Água
(1:1; v/v)
Metanol:Água
(1:1; v/v) Metanol Etanol
1 12,91±0,61 a 10,34±1,17 bBC 9,02±0,29 bBC 3,44±0,05 cCD 0,55±0,03 dD
2 12,94±0,86 a 11,55±0,62 bA 10,02±0,21 cBC 2,39±0,10 dF 0,53±0,01 dD
3 12,60±0,64 a 10,32±0,39 bBC 10,11±0,44 bBC 3,40±0,12 cCD 0,51±0,02 dD
4 12,25±0,51 a 9,05±0,99 bCD 8,36±1,13 bC 3,81±0,11 cAB 0,68±0,03 dBC
5 13,49±1,70 a 10,55±0,59 bBC 9,15±0,30 bBC 4,16±0,16 cA 0,66±0,02 dC
6 12,46±0,37 a 8,88±0,37 bCD 9,04±0,34 bBC 3,68±0,12 cBC 0,75±0,03 dAB
7 14,13±0,53 a 10,79±0,32 bBC 10,72±1,21 bA 2,75±0,13 cE 0,55±0,02 dD
Controle 12,33±0,27 a 7,48±0,44 bD 5,45±0,34 cD 3,26±0,16 dD 0,77±0,04 eA
* Resultados apresentados como média (n = 3) ± desvio padrão.
# Não houve diferença significativa entre os ensaios (p = 0,1339).
Letras minúsculas diferentes na mesma linha indicam diferença estatística (p < 0,05) entre os resultados
pelo Teste de Tukey.
Letras maiúsculas diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística (p < 0,05) entre os
resultados pelo Teste de Tukey.
56
Os resultados apresentados nas Tabela 9, 10 e 11 demonstraram que a atividade
antioxidante foi maior após o tratamento enzimático independente do solvente extrator
empregado na recuperação dos compostos antioxidantes. Além disso, a água foi o melhor
solvente extrator para os compostos antioxidantes presentes nas sementes hidrolisadas de A.
pavonina L. A capacidade antioxidante para os diferentes solventes utilizados seguiu a ordem
decrescente de água > metanol:água (1:1, v/v) > etanol:água (1:1, v/v) > metanol > etanol para
todos os ensaios. A água é um solvente altamente polar, enquanto etanol e metanol apresentam
polaridade menor, mas ambos solventes podem ser misturados com água para formar uma
combinação mais eficiente na extração de antioxidantes. Solventes altamente polares foram
mais eficientes na extração de compostos fenólicos antioxidantes a partir de materiais de plantas
do que solventes de baixa polaridade (ROBY et al., 2013).
A atividade antioxidante das sementes hidrolisadas de A. pavonina L. foi
significantemente afetada pelo solvente empregado na extração. Em alguns casos, a adição de
solventes polares como a água para extração de compostos antioxidantes pode aumentar a
recuperação de compostos mais polares, tais como fenólicos glicosilados, vitaminas
hidrossolúveis, peptídeos bioativos, entre outros (PURI; SHARMA; BARROW, 2012;
WEIHOFEN; MARTOGLIO, 2003), o que pode parcialmente explicar a elevada atividade
antioxidante dos extratos aquosos. Além disso, durante o tratamento enzimático das sementes
de A. pavonina L. pode ter ocorrido a liberação de compostos antioxidantes polares ligados à
parede celular e/ou a hidrólise de polímeros, tais como polipeptídeos e polissacarídeos (AZMIR
et al., 2013), que são mais facilmente extraídos em sistemas aquosos e, portanto, também podem
contribuir para a maior capacidade antioxidante observada nestes extratos.
O tratamento enzimático das sementes de A. pavonina L. foi realizado em meio
aquoso e o melhor solvente extrator de compostos antioxidantes a partir dos hidrolisados
liofilizados foi a água. Desta maneira, os compostos antioxidantes obtidos por meio do
tratamento enzimático das sementes podem ser recuperados apenas com o uso de centrifugação
(recuperação do sobrenadante), o que elimina a etapa de extração com solventes e,
consequentemente, diminui os custos e aumenta a eficiência do processo. A extração assistida
por enzimas é reconhecida como uma tecnologia ambientalmente amigável para a extração de
compostos antioxidantes devido à substituição de solventes orgânicos (PURI; SHARMA;
BARROW, 2012). Assim, a água foi considerada como o mais adequado solvente extrator para
os diferentes ensaios antioxidantes, sendo selecionada para dar continuidade aos estudos.
57
5.3 - Análise das curvas de contorno
A partir dos valores experimentais, modelos quadráticos ou cúbicos foram ajustados
às respostas (DPPH, TEAC e ORAC) e os coeficientes de regressão foram calculados e
avaliados estatisticamente por análise de variância (ANOVA). Nas Tabelas 12, 13 e 14 são
apresentados os coeficientes de regressão e análise dos modelos matemáticos para DPPH,
TEAC e ORAC, respectivamente.
Os coeficientes de regressão linear e de interação ternária foram significativos (p ≤
0,1) para o método de DPPH (Tabela 12), enquanto os coeficientes de interação binária não
foram significativos. O ensaio de DPPH apresentou R2 menor que 0,8, valor mínimo sugerido
para um bom ajuste, o que indica que o modelo matemático para DPPH não está bem ajustado
aos dados experimentais (BAE et al., 2015; MAŠKOVIĆ et al., 2016). Portanto, o modelo
obtido para o método DPPH não foi utilizado para estimar a atividade antioxidante dos
hidrolisados.
Tabela 12 - Coeficientes de regressão para capacidade antioxidante avaliada pelo método
DPPH das sementes de A. pavonina L.
Fatores Coeficiente Erro padrão tCalc (14) p-valor
Protease (P) 12,91 0,49 26,29 < 0,0001
α-Amilase (A) 12,94 0,49 26,37 < 0,0001
Celulase (C) 12,60 0,49 25,67 < 0,0001
P×A -2,69 2,40 -1,12 0,2827
P×C 2,93 2,40 1,22 0,2427
A×C -1,23 2,40 -0,51 0,6160
P×A×C 38,33 16,92 2,27 0,0399
R2: 0,43
Os coeficientes de regressão linear e de interação foram significativos (p ≤ 0,1) para
os ensaios antioxidantes TEAC e ORAC (Tabelas 13 e 14). Assim, as regressões contendo os
termos significativos para TEAC e ORAC foram estabelecidas como seguem:
Y (TEAC) = 80,33P + 81,01A + 89,85C + 12,66PA + 58,42PC – 28,57AC
Equação 7. Modelo quadrático para a capacidade antioxidante, avaliada pelo método TEAC,
das sementes de A. pavonina L. P: protease; A: α-amilase; C: celulase.
58
Y (ORAC) = 146,48P + 172,071A + 161,36C + 128,77PA + 271,67PC + 70,39AC +
184,92PAC
Equação 8. Modelo cúbico especial para a capacidade antioxidante, avaliada pelo método
ORAC, das sementes de A. pavonina L. P: protease; A: α-amilase; C: celulase.
Tabela 13 - Coeficientes de regressão para capacidade antioxidante avaliada pelo método
TEAC das sementes de A. pavonina L.
Fatores Coeficiente Erro padrão tCalc (15) p-valor
Protease (P) 80,33 0,97 83,08 < 0,0001
α-Amilase (A) 81,01 0,97 83,78 < 0,0001
Celulase (C) 89,85 0,97 92,92 < 0,0001
P×A 12,66 4,44 2,85 0,0122
P×C 58,42 4,44 13,14 < 0,0001
A×C -28,57 4,44 -6,43 < 0,0001
R2: 0,96
Tabela 14 - Coeficientes de regressão para capacidade antioxidante avaliada pelo método
ORAC das sementes de A. pavonina L.
Fatores Coeficiente Erro padrão tCalc (14) p-valor
Protease (P) 146,48 2,81 52,08 < 0,0001
α-Amilase (A) 172,07 2,81 61,18 < 0,0001
Celulase (C) 161,36 2,81 57,37 < 0,0001
P×A 128,77 13,78 9,35 < 0,0001
P×C 271,67 13,78 19,72 < 0,0001
A×C 70,39 13,78 5,11 0,0002
P×A×C 184,92 96,94 1,91 0,0772
R2: 0,98
O coeficiente de determinação (R2) e a análise de variância – ANOVA (teste de F)
foram utilizados para verificar a qualidade do ajuste dos modelos aos valores experimentais.
Nas Tabelas 15 e 16 estão apresentados os valores de R2 e de F, assim como os valores de p
para cada modelo. Os valores de R2 para TEAC e ORAC foram de 0,96 e 0,98, respectivamente,
indicando que os modelos foram capazes de explicar 96% e 98% das variações dos resultados
e que os modelos propostos são preditivos e podem ser utilizados para estimar respostas para a
atividade antioxidante dos hidrolisados das sementes de A. pavonina L. com diferentes
preparações enzimáticas e suas combinações.
59
Tabela 15 - ANOVA do modelo quadrático para a capacidade antioxidante, avaliada pelo
método TEAC, das sementes de A. pavonina L.
Fonte de Variação Soma de
quadrados
Grau de
liberdade
Quadrado
médio
FCalc FTab p-valor R2
Modelo 988,49 5 197,70 69,95 2,273 < 0,0001 0,96
Resíduos 42,39 15 2,83
Total 1030,88 20 51,54
Tabela 16 - ANOVA do modelo cúbico especial para a capacidade antioxidante, avaliada pelo
método ORAC, das sementes de A. pavonina L.
Fonte de Variação Soma de
quadrados
Grau de
liberdade
Quadrado
médio
FCalc FTab p-valor R2
Modelo 14322,01 6 2387,00 100,58 2,243 < 0,0001 0,98
Resíduos 332,24 14 23,73
Total 14654,25 20 732,71
Em adição aos resultados previamente apresentados, as análises das curvas de
contorno facilitam a interpretação dos dados, assim como a verificação dos efeitos das variáveis
independentes e de suas interações. As curvas de contorno foram geradas a partir dos
coeficientes de regressão das equações 7 e 8 e utilizados para apresentar a relação entre as
concentrações das enzimas α-amilase, protease e celulase utilizadas na hidrólise de amido,
proteínas e celulose para a liberação de compostos antioxidantes das sementes de A. pavonina
L. e a atividade antioxidante (TEAC e ORAC) dos hidrolisados (Figuras 6 e 7). Nas curvas de
contorno, cada fator (enzima) é representado no vértice de um triângulo equilátero, sendo cada
ponto localizado dentro do triângulo uma proporção diferente dos componentes da mistura. A
porcentagem máxima de cada componente considerado pela regressão é colocada no vértice
correspondente, enquanto o mínimo está posicionado no segmento do lado oposto ao vértice do
triângulo e o centro representa a mistura dos três componentes em partes iguais. Como pode ser
observado nas Figura 6 e 7, as combinações das enzimas protease e celulase demonstraram
maior eficiência na liberação de compostos antioxidantes. As celulases hidrolisam as ligações
β-1,4 glicosídicas da celulose e podem romper a integridade da parede celular de plantas,
aumentando o rendimento da extração de compostos antioxidantes (PURI; SHARMA;
BARROW, 2012). As proteases promovem a degradação das proteínas estruturais que
60
fortalecem a estrutura dos polissacarídeos da parede celular, além de contribuir para a liberação
dos fenóis contidos nos vacúolos das células (PINELO, M.; MEYER, A. S, 2008).
As Figuras 6B e 7B representam uma análise comparativa entre os valores de
atividade antioxidante previstos pelos modelos e os observados experimentalmente. Os
resultados demonstraram que as respostas estão razoavelmente alinhadas, indicando adequação
dos dados previstos aos valores experimentais.
Figura 6. Curva de contorno (A) e valores observados versus valores previstos (B) para a
capacidade antioxidante, avaliada pelo ensaio TEAC, do extrato aquoso das sementes de A.
pavonina L.
Figura 7. Curva de contorno (A) e valores observados versus valores previstos (B) para a
capacidade antioxidante, avaliada pelo ensaio ORAC, do extrato aquoso das sementes de A.
pavonina L.
A partir das curvas de contorno e dos modelos quadráticos e cúbicos, as condições
ótimas do tratamento enzimático dos componentes da semente de A. pavonina para a liberação
dos compostos bioativos foram estimadas pela determinação da capacidade antioxidante. A
61
validação experimental dos modelos matemáticos foi realizada com ensaios em triplicata nas
seguintes condições: 5 g da semente triturada em 45 mL de tampão fosfato 100 mM pH 7,0,
125 µL de protease e celulase, 50 ºC, 100 rpm por 2 horas de incubação. A atividade
antioxidante obtida pelo procedimento de validação experimental foi de 221,84 ± 5,46 µmol/g
para ORAC e 100,08 ± 0,54 µmol/g para TEAC, que são valores muito próximos aos valores
previstos pelos modelos matemáticos nas condições ótimas (ORAC: 221,84 µmol/g e TEAC:
99,695 µmol/g). O extrato aquoso das sementes de A. pavonina obtido nas condições ótimas foi
utilizado para as análises de compostos fenólicos totais, flavonoides totais, taninos condensados
e conteúdo individual de compostos fenólicos por CLUAE-ESI-MS/MS. Além disso, a
atividade antioxidante e antiproliferativa em cultura de células foram avaliadas. O extrato
aquoso obtido com a semente triturada de A. pavonina tratada com as enzimas protease e
celulase foi comparado com o ensaio controle, no qual a amostra foi tratada nas mesmas
condições descritas no item 4.3, porém sem a adição de enzimas (amostra não tratada
enzimaticamente).
A atividade antioxidante das amostras controle e extrato aquoso das sementes de A.
pavonina . L. tratada com protease e celulase foi mensurada por meio dos ensaios DPPH, TEAC
e ORAC (Tabela 17). O extrato aquoso apresentou atividade antioxidante maior do que a
amostra controle nos ensaios TEAC e ORAC, enquanto para o ensaio de DPPH as amostras não
apresentaram diferença significativa (p > 0,05).
Tabela 17 – Análise da atividade antioxidantes dos extratos aquosos das sementes de A.
pavonina L. tratadas com protease e celulase.
Análise Extrato aquosoa Controle
DPPH (µmol TE/g) 13,49 ± 1,70 a 12,33 ± 0,27 a
TEAC (µmol TE/g) 100,08 ± 0,54 a 86,69 ± 1,55 b
ORAC (µmol TE/g) 221,84 ± 5,46 a 201,99 ± 3,94 b
Resultados apresentados como média (n = 3) ± desvio padrão.
Letras minúsculas diferentes na mesma linha indicam diferença estatística (p < 0,05) entre os
resultados pelo Teste t Student. a Extrato aquoso das sementes de A. pavonina tratadas com protease e celulase.
Comparando os valores obtidos pelos diferentes ensaios para determinar a
capacidade antioxidante, pode-se observar que o maior valor foi para o ensaio de ORAC,
seguido de TEAC e DPPH. Este fato pode indicar que os compostos presentes nas sementes de
62
A. pavonina L. atuam de maneira mais eficiente através do mecanismo de transferência de
átomos de hidrogênio do que pela transferência de elétrons (REBELLO et al., 2014). Os
extratos aquosos de A. pavonina apresentaram alta atividade em sequestrar radicais peroxil, que
são radicais produzidos naturalmente pelo metabolismo celular (APAK et al., 2013).
A atividade antioxidante avaliada pelo ensaio ORAC obtido nesse estudo para o
extrato aquoso de A. pavonina foi maior do que para as amostras de grão de bico (10,00 µmol
TE/g), feijão preto (21,40 µmol TE/g) e lentilha (46,83 µmol TE/g). Enquanto que os valores
de DPPH para o extrato das sementes de A. pavonina L. foi maior do que grão de bico (0,98
µmol TE/g) e menor do que no feijão preto (19,23 µmol TE/g) e lentilha (19,61 µmol TE/g)
(XU; CHANG, 2007).
5.4 - Conteúdo de compostos fenólicos
Os compostos fenólicos são formados a partir do metabolismo secundário das
plantas e são importantes para sua reprodução e crescimento, sendo formados em resposta a
condições de estresse, tais como infecções, ferimentos e radiações UV. Esses compostos
contribuem para a pigmentação das plantas e podem atuar como agentes antioxidantes
(NACZK; SHAHIDI, 2004). Dentre as classes de compostos fenólicos, os flavonoides, ácidos
fenólicos e taninos destacam-se como os antioxidantes mais abundantemente encontrados na
natureza e, consequentemente, presentes na dieta. Assim, muitos estudos são realizados na
identificação e quantificação desses compostos em matrizes vegetais (KING; YOUNG, 1999).
A partir do método Folin-Ciocalteau é possível estimar a quantidade de flavonoides,
taninos e compostos fenólicos não-flavonoides, ou seja, as diferentes formas de compostos
fenólicos encontrados na natureza (ROESLER et al., 2006). O conteúdo de compostos fenólicos
seguiu uma tendência semelhante ao da atividade antioxidante, no qual ocorreu aumento da
atividade antioxidante após o tratamento enzimático.
O conteúdo total de compostos fenólicos extraídos a partir do controle e do extrato
aquoso das sementes de A. pavonina L. tratadas com as enzimas protease e celulase (Tabela
18) foram maiores do que valores encontrados por Ezeagu et al. (2004) para as sementes de A.
pavonina . L. (1,91 g/100g) colhidas na Nigéria.
63
Tabela 18 - Conteúdo de fenólicos totais, flavonoides e taninos condensados para os extratos
aquosos das sementes de A. pavonina L. tratadas com protease e celulase.
Análise Extrato aquosoa Controle
Conteúdo de fenólicos totais
(mg GAE/100 g) 1183,20 ± 2,30 a 884, 82 ± 2,68 b
Flavonoides
(mg CE/100 g) 366,98 ± 1,66 a 249,69 ± 6,36 b
Taninos condensados
(mg CE/100 g) 220,09 ± 7,07 a 180,67 ± 2,94 b
Resultados apresentados como média (n = 3) ± desvio padrão.
Letras minúsculas diferentes na mesma linha indicam diferença estatística (p < 0,05) entre os
resultados pelo Teste t Student. a Extrato aquoso das sementes de A. pavonina tratadas com protease e celulase.
O extrato aquoso de A. pavonina apresentou aumento de 34% no conteúdo de
fenólicos totais, 47% no conteúdo de flavonoides e 22% no conteúdo de taninos condensados
após o tratamento enzimático. A extração assistida por enzimas tem sido considerada como um
método alternativo para melhorar a extração de compostos fenólicos nos alimentos,
especialmente os fenólicos insolúveis que estão ligados a carboidratos e proteínas na parede
celular de matrizes vegetais (DE CAMARGO et al., 2016). Dessa forma, o tratamento
enzimático da farinha das sementes de A. pavonina pode ter contribuído para o aumento do
conteúdo de compostos fenólicos presentes no extrato. O rompimento da parede celular por
enzimas pode expor mais a superfície para o solvente, facilitando a extração de compostos
fenólicos insolúveis (LANDBO; MEYER, 2001; SHAHIDI; YEO, 2016). A maioria dos
compostos fenólicos ligados de forma insolúvel formam quimicamente ligações covalentes com
substâncias da parede celular, como pectina, celulose e proteínas estruturais, representando uma
quantidade relativamente grande (20-60% em vegetais, frutas e leguminosas/sementes) em
comparação com os compostos fenólicos solúveis em alimentos (NAYAK; LIU; TANG, 2015).
Flavonoides e taninos condensados são os compostos fenólicos predominantes em sementes de
leguminosas e são encontrados em lentilhas, ervilhas, soja e feijão comum (ZHANG et al.,
2015). Os valores de flavonoides do extrato aquoso das sementes de A. pavonina L. foram
semelhantes aos encontrados na farinha da semente de Moringa oleífera (366,96 mg CE/ 100g)
(GOVARDHAN SINGH; NEGI; RADHA, 2013) e no grão de bico (316,00 mg CE/ 100g)
(XU; CHANG, 2007).
O conteúdo de taninos condensados para o extrato da semente de A. pavonina foi
menor que os valores mencionados na literatura para lentilha (878,00 mg CE/100g), feijão preto
64
(529,00 mg CE/100g) e soja preta (468,00 mg CE/100g) (XU; CHANG, 2007). No entanto, o
conteúdo de fenólicos no extrato das sementes de A. pavonina L. foi maior que os reportados
na literatura para farinha da semente de Moringa oleífera (780, 0 mg GAE/100g)
(GOVARDHAN SINGH; NEGI; RADHA, 2013), semente de tremoço (696,212 mg
GAE/100g) (DALARAM; SULAIMAN, 2017) e para quatro variedades de ervilha (2,57-30,56
mg GAE/100g) (STANISAVLJEVIC et al., 2016).
5.5 - Perfil de compostos fenólicos do extrato aquoso do hidrolisado das sementes de A.
pavonina L.
Os compostos fenólicos presentes no extrato aquoso das sementes de A. pavonina
L. tratadas com protease e celulase foram identificados utilizando Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência acoplado a espectrômetro de massas com fonte de ionização por electrospray
(CLUAE - IE - EM/EM). O conteúdo de cada composto fenólico identificado está apresentado
na Tabela 19.
Tabela 19 - Perfil de compostos fenólicos para o extrato aquoso das sementes de A. pavonina
L. tratadas com protease e celulase.
Compostos Concentração (μg/g extrato)
Controle Extrato aquosoa
Catequina 52,61 ± 1,24 aA 6,08 ± 0,36 bB
Quercetina n.d. 0,18 ± 0,04 d
Naringenina 1,09 ± 0,05 cdA 1,31 ± 0,17 cA
Ácido protocatecuico 2,77 ± 0,28 bA 3,35 ± 0,33 bA
Ácido gentísico 2,34 ± 0,25 bcA 2,81 ± 0,24 bA
Ácido 4-hidroxibenzóico 0,43 ± 0,04 dA 0,53 ± 0,03 dA
Ácido ferúlico 0,28 ± 0,10 dB 0,45 ± 0,08 dA
Fenólicos totais 59,52 ± 1,25 14,71 ± 0,28
Letras minúsculas diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística (p < 0,05) entre os
resultados pelo Teste de Tukey.
Letras maiúsculas diferentes na mesma linha indicam diferença estatística (p < 0,05) entre os
resultados pelo Teste t Student.
n.d: não detectado a Extrato aquoso das sementes de A. pavonina tratadas com protease e celulase.
A catequina foi o principal composto fenólico encontrado na amostra controle e no
extrato aquoso das sementes de A. pavonina seguido de ácido protocatecuico e ácido gentísico.
65
Naringenina, ácido 4-hidroxibenzóico e ácido ferúlico também foram identificados em menores
quantidades em ambas as amostras. No entanto, quercetina foi identificada apenas após o
tratamento enzimático. Pela primeira vez no presente estudo os compostos fenólicos das
sementes de A. pavonina L. foram caracterizados.
O conteúdo de catequina diminuiu após o tratamento enzimático, enquanto o
conteúdo dos outros compostos fenólicos identificados foi maior no extrato aquoso das
sementes de A. pavonina tratadas com protease e celulase. A redução do conteúdo de catequina
pode ter ocorrido devido à degradação oxidativa ou outro mecanismo, por exemplo,
polimerização e precipitação por proteínas (MARTINS et al., 2016). No entanto, o tratamento
enzimático pode favorecer a liberação de compostos fenólicos nos alimentos, principalmente
os ligados a parede celular das matrizes vegetais, como carboidratos e proteínas (DE
CAMARGO et al., 2016). Carboidrases, tais como celulase, β-glucanase e pectinase
aumentaram o conteúdo de compostos fenólicos totais de maçãs verdes, no entanto alguns dos
fenólicos, como ácido clorogênico e floridzina reduziram seu conteúdo após o tratamento
enzimático (ZHENG; HWANG; CHUNG, 2009).
Os dois principais flavonoides encontrados no presente estudo também foram
identificados na farinha da semente de Moringa oleífera com 7490 e 18,7 μg/g, respectivamente
(GOVARDHAN SINGH; NEGI; RADHA, 2013). No entanto, nos hidrolisados das sementes
de A. pavonina L. os conteúdos desses compostos foram inferiores. A soja apresentou valor
relativamente alto (101,0 μg/g) de quercetina (WANG et al., 2016) quando comparado com o
extrato das sementes de A. pavonina L. (0,18 μg/g) (Tabela 19).
O ácido ferúlico ocorre primariamente nas sementes e folhas de plantas,
principalmente conjugados covalentemente com mono-, di- e polissacarídeos de paredes
celulares vegetais, como glicoproteínas, poliaminas, lignina, polímeros de carboidratos
insolúveis e fibras (LIU, 2007), o que pode justificar o aumento do conteúdo de ácido ferúlico
após o tratamento enzimático.
Embora o conteúdo total de compostos fenólicos no extrato aquoso do hidrolisado
de A. pavonina seja menor do que na amostra controle, a atividade antioxidante do extrato
aquoso do hidrolisado foi superior (Tabela 18). Isso pode ser parcialmente explicado devido à
presença de um maior conteúdo de ácidos fenólicos e flavonóis, e também de outros compostos
antioxidantes que podem ter sido liberados após o tratamento enzimático, como peptídeos
bioativos (não analisados). Além disso, diversos estudos têm demonstrado que a capacidade
antioxidante dos compostos fenólicos é influenciada pela interação com outros compostos ou
66
com eles mesmos, sendo que estas interações podem ser sinérgicas ou antagônicas, dependendo
das condições e compostos (PAZ et al., 2015)
5.6 - Atividade antiproliferativa
A atividade antiproliferativa dos extratos aquosos das sementes de Adenanthera
pavonina L. foi estudada utilizando linhagens tumorais humanas, com o objetivo de acrescentar
informações sobre outras possíveis atividades biológicas das sementes.
Para análise da proliferação (crescimento) celular, foram empregados dois controles
de células não tratadas. O primeiro, denominado T0, representou a quantidade de células
presentes em cada compartimento no início do experimento, enquanto o controle T1 representa
a quantidade de células por compartimento após 48h de incubação. A proliferação das células
(100%) foi obtida através da diferença de absorbância entre os controles T1 e T0 (MONKS et
al., 1991).
Para avaliação final das células o método colorimétrico (não-clonogênico) utilizado
foi o da sulforrodamina B (SRB). A SRB é um corante fluorescente que se liga aos resíduos
dos aminoácidos básicos das proteínas (lisina, arginina e histidina) de células viáveis no
momento da fixação. Quanto maior for a quantidade de SRB presente no compartimento menor
a atividade antiproliferativa da amostra em teste. Ácido tricloroacético foi empregado como
solução fixadora de células viáveis, precipitando proteínas. Assim, as células viáveis
permaneceram fixadas a placa, enquanto as células não viáveis foram removidas por lavagem.
Esse é um método independente do metabolismo celular, no qual é possível quantificar as
proteínas de um modo linear com o número de células da cultura. Além disso, esse método é
rápido, simples e apresenta sensibilidade comparável às metodologias fluorescentes (MONKS
et al., 1991). Outra vantagem apresentada nesse método de avaliação está relacionada com a
estabilidade da placa para leitura, pois as células são primeiramente fixadas, coradas e a medida
da absorbância pode ser realizada várias semanas após o término do experimento
(HOUGHTON et al., 2007; KEEPERS et al., 1991; MONKS et al., 1991; RUBINSTEIN et al.,
1990; SKEHAN et al., 1990; VICHAI; KIRTIKARA, 2006).
A Figura 8 correlaciona o crescimento celular em função da concentração do
quimioterápico de referência doxorrubucina. A doxorrubicina tem apresentado grande potencial
no tratamento de diversos tipos de câncer, sendo uma das drogas quimioterápicas mais potentes
aprovadas pelo FDA (Food and Drug Administration) (CARVALHO et al., 2009). As Figuras
9 e 10 gerados correlacionam o crescimento celular em função da concentração das amostras
67
testadas. Os valores entre 0 e 100% representam a proliferação celular, sendo a linha 0 o marco
para a inibição total de crescimento (quando a quantidade de células no final do experimento
for igual ao do T0 (adição das amostras; placa T0). Valores negativos representam morte celular,
porque a quantidade de células (inferida através da dosagem de proteínas coradas) foi menor
do que no tempo inicial do experimento (adição das amostras; placa T0) (MONKS et al., 1991).
Figura 8. Atividade antiproliferativa in vitro da doxorrubicina em painel de linhagens celulares
humanas.
Figura 9. Atividade antiproliferativa in vitro do extrato aquoso das sementes de Adenanthera
pavonina L. em painel de linhagens celulares humanas.
68
Figura 10. Atividade antiproliferativa in vitro da amostra controle das sementes de
Adenanthera pavonina L. em painel de linhagens celulares humanas.
Legenda para as Figuras 8, 9 e 10: Linhagens tumorais humanas = U251 (glioma), UACC-62
(melanoma), MCF7 (mama), NCI-ADR/RES (ovário com fenótipo de resistência a múltiplos
fármacos), 786-0 (rim), NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células), PC-3 (próstata);
OVCAR-03 (ovário), HT29 (colón), K562 (leucemia); Linhagem não tumoral humana =
HaCaT (queratinócitos imortalizados); Tempo de exposição: 48h; Concentração da amostra:
0,25; 2.5; 25 e 250 μg/mL.
A amostra controle o extrato aquoso do hidrolisado da semente de A. pavonina não
apresentaram atividade antiproliferativa para a maioria das linhagens tumorais humanas.
Considerando os critérios de avaliação descritos por Fouche et al. (2008), segundo os quais
considera-se ativo o extrato que apresentar log GI50 ≤ 1.50 (≈ 35 µg/mL), a amostra controle
(extrato obtido sem tratamento enzimático) foi inativa de maneira geral, apresentando efeito
citostático fraco sobre linhagem tumoral de rim (786-0, GI50= 67,5 µg/mL), ao passo que o
extrato demonstrou ter atividade antiproliferativa sobre as linhagens próstata (PC-3, GI50= 2,5
µg/mL) e rim (786-0, GI50= 29,9 µg/mL). Como o efeito da amostra controle sobre a linhagem
PC-3 foi inversamente proporcional à concentração testada (Figura 10), não foi possível
calcular adequadamente o valor de GI50, sendo considerado então o valor de concentração
experimental que resultou em proliferação celular próxima a 50% (PC-3, GI50= 250 µg/mL)
(Tabela 20). Considerando-se principalmente a diferença na resposta frente à linhagem tumoral
de rim, é possível propor que o tratamento enzimático realizado com celulase e protease
possibilitou uma melhora na atividade antiproliferativa do extrato das sementes de A. pavonina
(Tabela 20). A melhora na atividade antiproliferativa frente as linhagens de rim e próstata pode
69
estar relacionada com o aumento da capacidade antioxidante e do conteúdo de ácidos fenólicos
e flavonols após o tratamento enzimático das sementes e/ou a liberação de outros compostos
não identificados (ver item 5.5).
Tabela 20 - Valores de GI50 (em µg/mL) para as amostras controle e extrato das sementes de
carolina (Adenanthera pavonina L.) frente a um painel de linhagens celulares humanas
2 u m a 7 4 p o h k q
Doxorrubicina <0,025 <0,025 0,025 0,1 21,8 <0,025 <0,025 0,053 0,19 0,16 0,034
Extratoa >250 >250 >250 >250 29,9 >250 2,5 >250 >250 >250 >250
Controle >250 >250 >250 >250 67,5 >250 250* >250 >250 >250 >250
Linhagens tumorais humanas: 2 = U251 (glioma), u = UACC-62 (melanoma); m = MCF-7
(mama); a= NCI-ADR/RES (ovário com fenótipo de resistência a múltiplos fármacos); 7 = 786-
0 (rim); 4 = NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células); p = PC-3 (próstata); o = OVCAR-
03 (ovário); h = HT-29 (cólon); k = K562 (leucemia); Linhagem não tumoral humana: q =
HaCaT (queratinócito).
Doxorrubicina: Quimiterápico de referência; GI50: Growth Inhibition 50 – concentração
necessária para inibir 50% do crescimento celular; * Valor aproximado de GI50.
a Extrato aquoso das sementes de A. pavonina tratadas com protease e celulase.
O tratamento do câncer utilizando plantas tem um longo histórico. Diversas drogas
sintéticas e semissintéticas são elaboradas com base em compostos presentes em produtos
naturais e a necessidade de desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento do câncer é
contínua (CRAGG; NEWMAN, 2013). Teste em cultura de células, como o teste de atividade
antiproliferativa é um importante passo para a descoberta de plantas que possam ser fontes de
compostos bioativos para o desenvolvimento futuro de medicamentos (KLINGHAMMER;
WALTHER; HOFFMANN, 2017; SHOEMAKER, 2006). Os resultados observados neste
estudo sugerem uma possível ação dos extratos das sementes de A. pavonina no tratamento de
tumores, principalmente de próstata e rim.
As sementes de A. pavonina são utilizadas na medicina popular para tratar
inflamações (ARA et al., 2010; KHARE, 2007; MUJAHID et al., 2016). O potencial anti-
inflamatório desta semente foi observado em ensaios de edema de pata induzido por carragenina
em ratos (ARA et al., 2010; OLAJIDE et al., 2004). Considerando-se o efeito antiproliferativo
contra a linhagem PC-3 (Tabela 20) dos extratos de semente de A. pavonina com e sem
tratamento enzimático aliado à ação anti-inflamatória de diferentes extratos de A. pavonina
70
mediada principalmente pela inibição de histamina, serotonina e da enzima ciclooxigenase
(ARA et al., 2010) e aos relatos de estudos clínicos realizados avaliando o uso de inibidores de
ciclooxigenase (COX-2) no tratamento do câncer de próstata (VENDRAMINI-COSTA; E.
CARVALHO, 2012), pode-se sugerir que os extratos das sementes de A. pavonina poderiam
ser promissores candidatos para o tratamento desse tipo de câncer.
71
6 - CONCLUSÃO
A água foi o solvente mais eficiente na recuperação de compostos antioxidantes a
partir das sementes hidrolisadas nas condições ótimas. O tratamento enzimático nas condições
ótimas (125 µL de protease e celulase, 5 g da semente triturada em 45 mL de tampão fosfato
100Mm pH 7,0, 50 ºC, 100 rpm por 2 horas de incubação) aumentou a recuperação de
compostos antioxidantes presentes nas sementes de A. pavonina L. As sementes de A. pavonina
L. apresentaram elevada atividade antioxidante para os ensaios de ORAC (221,84 µmol TE/g),
TEAC (100,08 µmol TE/g), e DPPH (13,49 µmol TE/g). Os compostos fenólicos catequina
(6,08 µg/g), quercetina (0,18 µg/g), naringenina (1,31 µg/g), ácido protocatecuico (3,35 µg/g),
ácido gentísico (2,81 µg/g), ácido 4-hidroxibenzóico (0,53 µg/g) e ácido ferúlico (0,45 µg/g)
foram identificados no extrato aquoso do hidrolisado por CLUAE-EM/EM. Além disso, o
tratamento enzimático realizado com celulase e protease possibilitou uma melhora na atividade
antiproliferativa do extrato das sementes de A. pavonina L. frente as linhagens tumorais de
próstata e rim.
72
PERSPECTIVAIS FUTURAS
➢ Avaliar o uso de outras combinações enzimáticas a fim de aumentar a recuperação de
compostos antioxidantes a partir das sementes de Adenanthera pavonina L.
➢ Avaliar os custos e a viabilidade econômica do tratamento enzimático.
➢ Identificar outros compostos potencialmente antioxidantes, por exemplo, os peptídeos
bioativos presentes nas sementes de Adenanthera pavonina L.
➢ Identificar os pigmentos das sementes de Adenanthera pavonina L.
➢ Avaliar outras propriedades das sementes de Adenanthera pavonina L. in natura e após
o tratamento enzimático, tais como antimicrobiana, anti-inflamatória e antidiabética.
➢ Investigar os efeitos do consumo das sementes de Adenanthera pavonina L. na
prevenção e/ou tratamento de doenças.
73
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