Obtenção de um sistema de liberação modificada contendo

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO

Obtenção de um sistema de liberação modificada contendo clorexidina e

avaliação de seu efeito em biofilmes orais patogênicos

Maria Carolina Bonjovanni de Paiva

Ribeirão Preto

2017

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO

Obtenção de um sistema de liberação modificada contendo clorexidina e

avaliação de seu efeito em biofilmes orais patogênicos

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas para obtenção do Título de

Mestre em Ciências

Área de Concentração: Medicamentos e

Cosméticos

Orientada: Maria Carolina Bonjovanni de

Paiva

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Carolina Patrícia

Aires

Versão corrigida da Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas em 29/09/2017. A versão original encontra-se

disponível na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto/USP.

Ribeirão Preto

2017

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO,

POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E

PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Bonjovanni, Maria Carolina

Obtenção de um sistema de liberação modificada contendo

clorexidina e avaliação de seu efeito em biofilmes orais patogênicos.

Ribeirão Preto, 2017. 41 p.; 30cm.

Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de Ciências

Farmacêuticas de Ribeirão Preto/USP – Área de concentração:

Medicamentos e Cosméticos.

Orientador: Aires, Carolina Patrícia.

1. Sistema de liberação. 2. Biofilmes orais. 3. Clorexidina.

FOLHA DE APROVAÇÃO

Maria Carolina Bonjovanni de Paiva

Obtenção de um sistema de liberação modificada contendo clorexidina e avaliação de seu

efeito em biofilmes orais patogênicos

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas para obtenção do Título de

Mestre em Ciências

Área de Concentração: Medicamentos e

Cosméticos.

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Carolina Patrícia Aires

Aprovado em:

Banca Examinadora

Prof. Dr. ____________________________________________________________

Instituição: _____________________________ Assinatura:____________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________


Prof. Dr. ____________________________________________________________


Prof. Dr. ____________________________________________________________


Dedico este trabalho, primeiramente, à minha família que com

muito esforço, amor e companheirismo fez com que essa

realização se tornasse possível.

Dedico também, à professora e amiga Carolina Patrícia Aires que

contribuiu enormemente, tanto para a minha formação

profissional, como pessoal.

Obrigada por tudo!

AGRADECIMENTOS

À Universidade de São Paulo e à Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto pela

oportunidade e pela infraestrutura para o desenvolvimento do trabalho.

Ao Programa de Pós Graduação, na pessoa da sua coordenadora Prof.ª Dr.ª Renata Fonseca

Vianna Lopez, pelo apoio institucional e científico.

Aos funcionários da secretaria de Pós-Graduação, pelo apoio institucional.

Agradeço a Deus por todo o amor que cerca minha vida, por me proteger de todo o mal e estar

presente em todos os momentos iluminando meus passos, me enchendo de esperança nos

momentos difíceis e de humildade a cada vitória.

Agradeço ao meu pai, Sebastião de Paiva Filho, por todo esforço para me proporcionar a

melhor educação, bem-estar e conforto. Por estar sempre ao meu lado não só como pai, mas

como amigo e companheiro para todas as horas. Agradeço à minha mãe, Carla Bonjovanni de

Paiva, por toda a dedicação, amizade, paciência, e por cuidar de mim com tanto carinho e

amor. Agradeço ao meu irmão Giuseppe Bonjovanni de Paiva e à minha prima-irmã Giulia

Moreira Paiva por todos os momentos compartilhados. Obrigada a vocês por me ensinarem o

que é certo e o que é errado, por permitirem que eu caminhasse sempre com meus próprios

pés nunca me deixando desamparada, por me mostrarem todos os dias o que realmente tem

valor na vida. Espero que um dia eu seja pelo menos a metade do que vocês são.

Agradeço à minha orientadora Carolina Patrícia Aires e ao professor Osvaldo de Freitas pela

enorme oportunidade, por todos os ensinamentos profissionais e pessoais, pela confiança,

amizade e dedicação.

Agradeço às técnicas Ana Cristina Morseli Polizello e Maíra Peres Ferreira Duarte por todos

os ensinamentos, momentos compartilhados e amizadade sincera. Vocês fizeram meus dias

mais felizes.

Agradeço às companheiras de laboratório Ana Carolina dos Santos Ré e Erika Kawakita

Hashimoto que cresceram comigo durante esses anos e me ajudaram na realização deste

projeto.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Fundação

de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (2015/17712-9) pelo apoio

científico e financeiro que possibilitou a realização desta pesquisa.

Ainda que eu fale as línguas dos homens e dos anjos, se não tiver amor, serei como o bronze

que soa ou como o címbalo que retine.

Ainda que eu tenha o dom de profetizar e conheça todos os mistérios e toda a ciência; ainda

que eu tenha tamanha fé, a ponto de transportar montes, se não tiver amor, nada serei.

(Coríntios, 13)

i

RESUMO

BONJOVANNI, M. C. Obtenção de um sistema de liberação modificada contendo

clorexidina e avaliação de seu efeito em biofilmes orais patogênicos. 2017. 41f.

Dissertação (Mestrado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto –

Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2017.

Considerando que a obtenção de uma formulação farmacêutica pode ser melhor planejada se

algumas condições biológicas inerentes à cavidade oral forem contempladas e que os sistemas

de liberação modificada podem ser ferramentas para o controle de doenças orais, o objetivo

do trabalho é obter uma formulação contendo clorexidina, avaliando seu efeito sobre os

mesmos. Este trabalho foi dividido em duas etapas, sendo que a primeira envolveu a obtenção

da formulação mais adequada aos experimentos biológicos e a segunda avaliou seus efeitos

sobre biofilmes patogênicos orais. Assim, formulações com diferentes concentrações de

clorexidina foram preparadas e avaliadas visualmente em relação à sua integridade física

nas condições de crescimento dos biofilmes, seguido de ensaio de liberação em meio

estático utilizando tampão como meio de dissolução (meio de dissolução convencional).

A formulação selecionada foi submetida a ensaios de liberação em meio estático

contendo os diferentes caldos de cultura bacterianos como meio de dissolução. Na

segunda etapa do trabalho, o efeito da formulação selecionada foi avaliado em biofilmes

cariogênicos de Streptococcus mutans ou biofilmes periodontopatogênicos de Porphyromonas

gingivalis. Biofilmes de S. mutans (n=6) ou P. gingivalis (n=3) foram formados em caldos de

cultura sob lâminas de vidro por 6 e 3 dias, respectivamente, sendo expostos a um dos

seguintes tratamentos: 1) Formulação contendo 92% de quitosana e 8% de hidroxipropil

metilcelulose (CV, como controle do veículo) ou 2) Formulação contendo 82% de quitosana,

8% de hidroxipropil metilcelulose e 10% de clorexidina (CHX, grupo experimental). Um

grupo sem exposição à formulação foi incluído como controle negativo (CN). Após o período

experimental, a viabilidade bacteriana, o pH dos biofilmes e a quantificação de clorexidina

liberada para os caldos de cultura foram determinados. Os dados foram analisados

estatisticamente por teste de Tukey-Kramer e Tukey, sendo o nível de significância

estabelecido em 5%. Os resultados sugerem que ainda que a liberação de clorexidina da

formulação nos caldos de cultura de S. mutans e P. gingivalis tenha sido menor se comparada

ao meio de dissolução convencional (p<0,05), o efeito biológico promovido foi observado

para ambos os biofilmes. Para o pH dos biofilmes de S. mutans, os grupos CN e CV não

apresentaram diferença entre si (p>0,05), mas apresentaram quedas de pH maiores se

comparados à CHX (p<0,05). CHX também resultou em menor viabilidade bacteriana dos

biofilmes se comparada aos controles (p<0,05), que não apresentaram diferença entre si

(p>0,05). Para P. gingivalis também houve mais morte celular nos biofilmes expostos à CHX

(p<0,05) mas CV também apresentou perda de viabilidade em comparação à CN (p<0,05).

Apesar da liberação de clorexidina da formulação ter sido dificultada pela presença dos

microrganismos, os resultados sugerem que o sistema de liberação obtido foi capaz de

diminuir a patogenicidade dos biofimes de Streptococcus mutans e de Porphyromonas

gingivalis. Assim, o presente estudo sugere a importância de aliar os estudos de diferentes

áreas de conhecimento de forma a contribuir no planejamento das formulações, vislumbrando

futuros benefícios clínicos para o controle das doenças orais.

Palavras-chave: Sistema de liberação; Biofilmes orais;

ii

ABSTRACT

BONJOVANNI, M. C. Obtention of a modified release system containing chlorhexidine

and evaluation of its effect on pathogenic oral biofilms. 2017. 41f. Dissertation (Master).

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo,

Ribeirão Preto, 2017.

Considering that obtaining a pharmaceutical formulation can be better planned if some

biological conditions inherent to the oral cavity are contemplated and that the modified

release systems may be tools for the control of oral diseases, the aim of the work is to obtain a

formulation containing chlorhexidine and evaluate its effect in pathogenic biofilms. This work

was divided in two stages, the first involved obtaining the most appropriate formulation for

biological experiments and the second evaluate its effect on oral pathogenic biofilms. Thus,

formulations with different concentrations of chlorhexidine were prepared and evaluated

visually for their physical integrity under the biofilm growth conditions, followed by the static

media release assay using buffer as the dissolution medium (conventional dissolution

medium). The selected formulation was subjected to static release tests containing the

different bacterial culture broths as the dissolution medium. In the second stage of the work,

the effect of the selected formulation was evaluated in cariogenic biofilms of Streptococcus

mutans or periodontopathogenic biofilms of Porphyromonas gingivalis. Biofilms of S. mutans

(n = 6) or P. gingivalis (n = 3) were formed in culture broths under glass slides for 6 and 3

days respectively, being exposed to one of the following treatments: 1) Formulation

containing 92 % of chitosan and 8% of hydroxypropyl methylcellulose (CV, vehicle control)

or 2) Formulation containing 82% of chitosan, 8% of hydroxypropyl methylcellulose and

10% of chlorhexidine (CHX, experimental group). A group without exposure to the

formulation was included as negative control (CN). After the experimental period, bacterial

viability, biofilms pH and quantification of chlorhexidine released into the culture broths were

determined. Data were statistically analyzed by Tukey-Kramer and Tukey test with a level of

significance of 5%. Results suggest that although chlorhexidine release from formulation in

the culture broths of S. mutans and P. gingivalis was lower compared to the conventional

dissolution medium (p <0.05), the treatment promoted biological effect for both biofilms.

Regarding S. mutans biofilms pH, CN and CV groups showed no difference (p> 0.05), but

showed higher pH drops when compared to CHX (p <0.05). CHX also resulted in lower

bacterial viability of biofilms compared to controls (p <0.05), which did not show any

difference (p> 0.05). For P. gingivalis, there was higher cell death in the biofilms exposed to

CHX (p <0.05) and CV presented loss of viability compared to CN (p <0.05). Although the

release of chlorhexidine from the formulation has been hampered by the presence of

microorganisms, results suggest that the release system was able to reduce the pathogenicity

of Streptococcus mutans and Porphyromonas gingivalis biofilms. Thus, the present study

suggests the importance of combining studies from different areas of knowledge in order to

contribute to the design of formulations aiming future clinical benefits for the oral diseases

control.

Keywords: Drug delivery system; Oral biofilms; Chlorhexidine.

iii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Cárie dental após tratamento ortodôntico ................................................................... 5

Figura 2 - Periodontite avançada com presença de biofilme, cálculo, migração dental

patológica e grave perda de inserção dental ............................................................................... 6 Figura 3 - Estrutura química da clorexidina ............................................................................... 7 Figura 4 - Inserção do Periochip® na bolsa periodontal ............................................................. 9 Figura 5 – Delineamento experimental do trabalho ................................................................. 12

Figura 6 – Formação do biofilme de S. mutans e exposição aos tratamentos .......................... 17 Figura 7 – Formação do biofilme de P.gingivalis e exposição aos tratamentos ...................... 19 Figura 8 – Perfis cromatográficos (CLAE-DAD) obtidos pela análise de: a) solução

preparada em tampão contendo 50 µg/mL de clorexidina; b) caldo de cultura na presença

de bactérias e do controle do veículo da formulação do biofilme de S.mutans; c) caldo de

cultura na presença de bactérias e do controle do veículo da formulação do biofilme de P.

gingivalis .................................................................................................................................. 22 Figura 9 – Concentração de clorexidina liberada das formulações-teste 2, 3 e 4 contendo,

respectivamente, 10, 20 e 40% de ativo ................................................................................... 23 Figura 10 – Concentração de clorexidina liberada em cada tempo a partir da formulação-teste

2 utilizando diferentes meios de dissolução ............................................................................. 23 Figura 11 – Viabilidade do biofilme de S. mutans de acordo com os tratamentos .................. 25

Figura 12 – Viabilidade do biofilme de P. gingivalis de acordo com os tratamentos .............. 27

iv

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Composição das formulações-teste preparadas com concentrações variáveis de

digluconato de clorexidina na presença ou ausência do HPMC ............................................... 13

Tabela 2 – Mensuração do pH dos biofilmes de S. mutans de acordo com os tratamentos ..... 24 Tabela 3 – Porcentagem de clorexidina quantificada em relação à quantidade inicial de

fármaco na formulação (média + dp) em tampão fosfato de sódio, caldo de cultura sem

bactérias e caldo de cultura dos biofilmes de S. mutans ........................................................... 25 Tabela 4 - Concentração do fármaco em porcentagem nos diferentes meios de liberação

(média ± dp).............................................................................................................................. 26 Tabela 5 – Porcentagem de clorexidina quantificada em relação à quantidade inicial de

fármaco na formulação (média ± dp) em tampão fosfato de sódio, caldo de cultura sem

bactérias e caldo de cultura dos biofilmes de P. gingivalis ...................................................... 28 Tabela 6 – Concentração do fármaco nos diferentes meios de liberação (média ± dp) ........... 29

SUMÁRIO

RESUMO .................................................................................................................................... i ABSTRACT .............................................................................................................................. ii LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................. iii

LISTA DE TABELAS ............................................................................................................. iv 1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 1 2 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................................ 3

2.1 BIOFILMES ......................................................................................................... 3 2.2 DOENÇAS ORAIS .............................................................................................. 4

2.2.1 Cárie .............................................................................................................. 4 2.2.2 Doença periodontal ...................................................................................... 5

2.3 CLOREXIDINA ................................................................................................... 7

2.4 SISTEMAS DE LIBERAÇÃO MODIFICADA DE FÁRMACOS ..................... 8 3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 10 4 MATERIAIS E MÉTODO ................................................................................................. 11

4.1 MATERIAIS ....................................................................................................... 11 4.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ............................................................. 11

4.3 OBTENÇÃO DO SISTEMA DE LIBERAÇÃO MODIFICADA ..................... 13

4.4 ENSAIO DE LIBERAÇÃO DO FÁRMACO EM MEIO ESTÁTICO

(TAMPÃO) ........................................................................................................................... 14 4.5 QUANTIFICAÇÃO DE DIGLUCONATO DE CLOREXIDINA .................... 14

4.6 ENSAIO DE LIBERAÇÃO EM MEIO ESTÁTICO (CALDO DE CULTURA)

.............................................................................................................................................. 15

4.7 BIOFILMES ....................................................................................................... 15 4.7.1 Biofilme de Streptococcus mutans ............................................................. 16

4.7.2 Biofilme de Porphyromonas gingivalis ..................................................... 17 4.7.3 Análises ....................................................................................................... 19

4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................. 20 5 RESULTADOS .................................................................................................................... 21

5.1 SELETIVIDADE DO MÉTODO ....................................................................... 21

5.2 ENSAIO DE LIBERAÇÃO EM MEIO ESTÁTICO (TAMPÃO) .................... 21 5.3 ENSAIO DE LIBERAÇÃO EM MEIO ESTÁTICO (CALDO DE CULTURA)

.............................................................................................................................................. 23 5.4 BIOFILMES ....................................................................................................... 24

5.4.1 Biofilme de Streptococcus mutans ............................................................. 24 5.4.2 Biofilme de Porphyromonas gingivalis ..................................................... 27

6 DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 30 7 CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 34

REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 35 ANEXO I ................................................................................................................................. 41

1

1 INTRODUÇÃO

A cavidade oral apresenta uma variada e exuberante colonização microbiana

(DEWHIRST et al., 2010; MANCL; KIRSNER; AJDIC, 2013; MYSAK et al. 2014;

ARWEILER; NETUSCHIL, 2016). Estes microrganismos colonizam naturalmente tanto as

superfícies dentais quanto os tecidos moles mas uma disbiose pode contribuir para a formação

de biofilmes patogênicos supra e subgengivais relacionados à doenças como cárie e a doença

periodontal, respectivamente (BEIKLER; FLEMMIG, 2011). De acordo com a indicação

clínica, o uso de antimicrobianos como a clorexidina podem auxiliar no controle de tais

doenças (RODE et al., 2012).

Antimicrobianos são comumente administrados na cavidade oral na forma de

enxaguatórios (SENEL et al., 2000; RIBEIRO; HASHIZUME; MALTZ, 2007; VARONI et al.,

2012; YENGOPAL; MICKENAUTSCH, 2012; PITHON et al., 2015; SMILEY et al., 2015;

LEE et al., 2016) mas a tecnologia farmacêutica tem contribuído para prolongar seus efeitos,

desenvolvendo sistemas de liberação modificados que podem estender o tempo de liberação

do fármaco. Entretanto, as condições biológicas encontradas na cavidade bucal tornam o

desenvolvimento das formulações orais um verdadeiro desafio (SANKAR et al., 2011) e

muitas vezes o benefício clínico não pode ser evidenciado como preconizado

laboriatorialmente.

Uma das condições biológicas mais desafiadoras encontradas na cavidade oral é a

presença de enzimas bacterianas, que podem interagir com componentes específicos da

formulação (SANKAR et al., 2011). Além disso, o metabolismo dos microrganismos pode

produzir altos níveis de ácidos (VAN HOUTE, 1994) ou bases orgânicas (TAKAHASHI et

al., 1997), causando oscilações de pH que podem comprometer a liberação de determinados

fármacos. Em acréscimo, há que se considerar os biofilmes, comunidades bacterianas

altamente organizadas que promovem proteção física contra antimicrobianos pela formação

de uma matriz polimérica, produzindo suas próprias enzimas para adaptação fisiológica

celular (JOLIVET-GOUGEON; BONNAURE-MALLET, 2014; FLEMMING et al., 2016).

Analisados em conjunto, estes fatores podem implicar na degradação precoce ou na menor

liberação do fármaco da formulação, comprometendo sua eficácia clínica. Entretanto,

formulações farmacêuticas como os sistemas de liberação modificada contendo

antimicrobianos raramente são delineadas na presença de tais condições.

Sistemas de liberação modificada de fármacos são formulações que proporcionam uma

atividade a longo prazo, pois liberam o princípio ativo em concentração terapêutica por um

2

período estendido (LAVOINE et al., 2014). Em acréscimo, tais sistemas podem ser utilizados

como ferramenta para aumentar as propriedades biofarmacêuticas do fármaco aumentando

sua solubilidade, biodistribuição e estabilidade, além de melhorar sua atividade biológica

(MARTIN et al., 2015). Assim, a veiculação de um antimicrobiano em uma formulação

farmacêutica de liberação modificada poderia trazer inovações para o controle dos biofilmes

orais patogênicos.

Um dos antimicrobianos mais prescritos na Odontologia é a clorexidina, considerada

padrão ouro no controle de biofilmes (VARONI et al., 2012). Seu amplo espectro de ação

antibacteriano permite sua indicação tanto como coadjuvante na redução do biofilme

supragengival cariogênico em pacientes que utilizam aparelhos ortodônticos (PITHON et al.,

2015) quanto no controle do biofilme subgengival em pacientes com periodontite (SMILEY

et al., 2015). Entretanto, sua veiculação em sistemas de liberação modificada é considerada

controversa, ao menos para o tratamento da periodontite (TABARY et al., 2014; MEDAIAH

et al., 2014).

Neste contexto, considerando que a obtenção de uma formulação farmacêutica pode

ser melhor planejada se algumas condições biológicas inerentes à cavidade oral forem

contempladas e que os sistemas de liberação modificada podem ser ferramentas para o

controle de doenças orais, o objetivo do trabalho é obter uma formulação contendo

clorexidina na presença de biofilmes patogênicos, avaliando seu efeito sobre os mesmos.

3

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 BIOFILMES

Os biofilmes são comunidades de microrganismos associados entre si, protegidos por

uma matriz polimérica extracelular e aderidos à superfícies biológicas ou sintéticas

(BEIKLER; FLEMMIG, 2011; JOLIVET-GOUGEON; BONNAURE-MALLET, 2014;

HURLOW et al., 2015; MARTIN et al, 2015; FLEMMING et al., 2016). O processo de

formação dos biofilmes se inicia com a deposição dos microrganismos, seguida de sua

adsorção reversível à superfície de adesão (MONROE, 2007). Esta adsorção é facilitada pela

presença de moléculas que revestem as superfícies ou que estão no meio líquido circundante

como, por exemplo, as proteínas salivares (MONROE, 2007; PAPAIOANNOU et al., 2012;

MARTIN et al., 2015). A adesão se torna irreversível a partir da produção bacteriana de uma

matriz viscosa de substâncias poliméricas extracelulares (JOLIVET-GOUGEON;

BONNAURE-MALLET, 2014), composta por macromoléculas como proteínas, ácidos

nucleicos, lipídeos, polissacarídeos, componentes sanguíneos entre outros (MARTIN et al,

2015). Além disso, estas substâncias favorecem a adsorção de colonizadores secundários,

iniciando o estágio de formação do biofilme denominado maturação (MONROE, 2007;

JOLIVET-GOUGEON; BONNAURE-MALLET, 2014).

No estágio de maturação, as bactérias se comunicam por quorum sensing e ocorrem

trocas de substâncias (oxigênio, nutrientes) entre o biofilme e o meio, além da replicação dos

microrganismos e metabolização de substrato circundante (MARTIN et al., 2015). Por fim,

esta estrutura permite a dispersão de agregados bacterianos que podem aderir e colonizar

novas superfícies, iniciando outro ciclo de formação do biofilme (MONROE, 2007). Em

acréscimo, a alta densidade celular dos biofilmes aliada à presença das substâncias

extracelulares poliméricas diminuem a susceptibilidade do biofilme ao antimicrobiano na

ordem de 10 a 1000 vezes se comparado às mesmas bactérias em sua forma planctônica

(MONROE, 2007; WU et al., 2014; FLEMMING et al., 2016). Em conjunto, estas

características contribuem para o desenvolvimento da doença, dificultando seu controle

(MONROE, 2007). Segundo Bleikler e Flemmig (2010), os biofilmes são responsáveis por

mais de 75% das doenças microbianas encontradas em humanos e, na Odontologia, as

doenças orais tem sido relacionadas diretamente à qualidade de vida, saúde geral e gastos em

saúde pública (BEIKLER; FLEMMIG, 2011).

4

2.2 DOENÇAS ORAIS

As doenças orais representam um problema de saúde pública mundial afetando,

principalmente, locais com menos recursos financeiros (WHO, 2012; JIN et al., 2016). Além

disso, estão frequentemente associadas à doenças sistêmicas crônicas como doenças

cardiovasculares, câncer, diabetes e doenças respiratórias (WHO, 2012). Atualmente, os

gastos para tratamento das doenças orais estão entre os maiores, tendo sido o mais alto dos

EUA no ano de 2006 quando comparado com todas as outras doenças (BEIKLER;

FLEMMIG, 2011). Na União Europeia os gastos anuais com saúde oral entre 2008 e 2012

chegaram a 79 bilhões de euros e estima-se que em 2020 os gastos cheguem a 93 bilhões de

euros (JIN et al., 2016).

O microbioma da cavidade oral compreende cerca de 700 espécies de bactérias

(DEWHIRST et al., 2010; MANCL; KIRSNER; AJDIC, 2013; MYSAK et al. 2014;

ARWEILER; NETUSCHIL, 2016), favorecendo a formação de biofilmes que se aderem

naturalmente às mucosas e aos dentes (LAUDENBACH; SIMON, 2014). A presença do

biofilme patogênico, considerado um dos principais fatores etiológicos das doenças orais,

aumenta a susceptibilidade do hospedeiro para o desenvolvimento de doenças como a cárie e

a periodontite (DEWHIRST et al, 2010; BEIKLER; FLEMMIG, 2011; JIN et al., 2016).

2.2.1 Cárie

A cárie dental tem sido apontada como a maior responsável pela perda de dentes em

crianças e pode ter graves consequências para a saúde (WHO, 2012; JIN et al., 2016). Esta

doença afeta 60-90% das crianças em idade escolar e grande parte dos adultos no mundo já

apresentou ao menos um episódio de cárie (BEIKLER; FLEMMIG, 2011; WHO, 2012).

Dentre os microrganismos presentes na lesão, a bactéria Gram-positiva Streptococcus

mutans é a principal responsável pela formação do biofilme cariogênico supragengival

(LEMOS et al., 2013; KRZYŚCIAK et al., 2014). Estudos sugerem que S. mutans tem maior

habilidade de formar biofilme se comparado isoladamente a outros tipos de Streptococcus que

colonizam a cavidade oral (KRZYŚCIAK et al., 2014). Além disso, o S. mutans tem a

capacidade de produzir grandes quantidades de ácidos orgânicos e de competir com bactérias

não-cariogênicas em pHs baixos, tornando-o o microrganismo mais cariogênico (LEMOS et

al., 2013).

5

Bactérias orais como o S. mutans promovem a desmineralização do dente devido à

produção de altos níveis de ácidos orgânicos produzidos a partir de carboidratos fermentáveis,

como a sacarose (PAES LEME et al., 2006). A sacarose é considerado o carboidrato mais

cariogênico da dieta, pois favorece a formação de um biofilme com uma matriz rica em

polissacarídeos extracelulares insolúveis do tipo glucano (CURY et al., 2000; AIRES et al.,

2008). A produção de glucanos insolúveis favorece a integridade estrutural do biofilme

(DUARTE et al., 2008), aumentando o tempo de exposição aos ácidos bacterianos,

ocasionando a desmineralização dental ou cárie (LAUDENBACH; SIMON, 2014). Assim, o

consumo de carboidratos fermentáveis apresenta relação direta com o aumento da doença

(BEIKLER; FLEMMIG, 2011; JIN et al., 2016).

O protocolo utilizado no tratamento da lesão de cárie com cavitação inclui a remoção

da mesma pela escavação das superfícies afetadas, seguida de restauração (LAUDENBACH;

SIMON, 2014). Já a prevenção da doença é feita pelo controle mecânico do biofilme,

podendo ser associado o uso de antimicrobianos de uso tópico, de acordo com a indicação

clínica (RODE et al., 2012). A gravidade da cárie pode variar desde o desenvolvimento de

lesões brancas opacas ou descalcificação, até a perda da integridade da superfície do esmalte

seguida de cavitação. A Figura 1 ilustra um caso de cárie dental, mais especificamente as

lesões brancas, após tratamento ortodôntico.

Figura 1- Cárie dental após tratamento ortodôntico

Fonte: RICHTER et al., 2011.

2.2.2 Doença periodontal

A doença periodontal refere-se a diferentes quadros clínicos, denominados doenças

gengivais ou gengivite quando limitados aos tecidos periodontais de proteção (gengiva e

mucosa alveolar) e periodontite quando acometem os tecidos periodontais de suporte do

elemento dentário (osso alveolar, cemento e ligamento periodontal) (LAUDENBACH;

6

SIMON, 2014). Na gengivite, ocorre a inflamação nos tecidos moles que circundam o dente

provocando o inchaço, a vermelhidão e o sangramento destes tecidos. Com o agravamento da

gengivite, o quadro pode evoluir para a periodontite e o hospedeiro pode apresentar diferentes

graus de perda óssea, mobilidade e migração patológica do dente podendo ocasionar a perda

do elemento dental (LAUDENBACH; SIMON, 2014).

A doença periodontal é responsável pela perda de dentes em cerca de 20% dos adultos

entre 35 e 44 anos (WHO, 2012). Esta doença, predominantemente subgengival, inclui a

presença da bactéria Porphyromonas gingivalis, detectada em mais de 85% dos tecidos

afetados pela periodontite, sendo raramente encontrada em tecidos saudáveis (SLOTS;

GENCO, 1984; BOSTANCI; BELIBASAKIS, 2012; MYSAK et al., 2014). Desta forma, a

presença de P. gingivalis pode predizer a progressão da doença periodontal e a sua redução

após o tratamento é associada à resolução da doença no local afetado (BOSTANCI;

BELIBASAKIS, 2012).

Esta bactéria Gram-negativa, assacarolítica e anaeróbia é capaz de fermentar

aminoácidos como fonte de energia e pode apresentar diversos fatores de virulência, como

cisteína proteinases, lipopolissacarídeos, cápsulas e fímbrias (BOSTANCI; BELIBASAKIS,

2012). Além disso, a P. gingivalis é uma bactéria fastidiosa e requer hemina (fonte de ferro) e

menadiona (vitamina K) para seu crescimento (LAMONT; JENKINSON, 1998).

O tratamento da doença periodontal consiste na remoção mecânica profissional do

biofilme e do cálculo por raspagem/alisamento radicular, podendo ser associado a

prodecimentos cirúrgicos e a utilização de antibióticos de uso sistêmico ou tópico (BEIKLER;

FLEMMIG, 2011; MANCL; KIRSNER; AJDIC, 2013; LAUDENBACH; SIMON, 2014). A

Figura 2 - mostra um caso de periodontite avançada.

Figura 2 - Periodontite avançada com presença de biofilme, cálculo, migração dental

patológica e grave perda de inserção dental

Fonte: LAUDENBACH; SIMON, 2014.

7

2.3 CLOREXIDINA

A estratégia fundamental para o controle dos biofilmes patogênicos é a sua remoção

mecânica (WHO, 2012; ARWEILER; NETUSCHIL, 2016). Entretanto, considerando

possíveis deficiências nesta remoção pelo controle mecânico e a presença de hábitos

deletérios como dieta rica em açúcares refinados (VARONI et al., 2012), o controle químico

do biofilme tem sido uma estratégia muito discutida na literatura (CURY, 1997; HAAS et al.,

2014). Dentre os antimicrobianos mais prescritos na Odontologia encontra-se a clorexidina

(VARONI et al., 2012). Esta molécula (Figura 3) é uma bisbiguanida catiônica que pode ser

apresentada na forma de sal como o digluconato, que apresenta boa solubilidade em água

(VARONI et al, 2012). Seu amplo espectro de ação antibacteriano permite que possa ser

indicado tanto como coadjuvante na redução do biofilme cariogênico em pacientes que

utilizam aparelhos ortodônticos (PITHON et al., 2015) como em pacientes com periodontite

(SMILEY et al., 2015). Em acréscimo, é indicada para tratamentos tópicos em pequenas

cirurgias orais e sua utilização no período pós-operatório pode reduzir riscos de osteíte

alveolar (SENEL et al., 2000; YENGOPAL; MICKENAUTSCH, 2012).

Figura 3 - Estrutura química da clorexidina

Fonte: Varoni et al, 2012.

O digluconato de clorexidina (conhecida na Odontologia como clorexidina) é

comumente utilizado como enxaguatório bucal, apresentando efeitos bacteriostáticos em

baixas concentrações (0,012 – 0,06%) e efeitos bactericidas em concentrações maiores (0,12 –

0,2%) (RIBEIRO; HASHIZUME; MALTZ, 2007; VARONI et al., 2012; LEE et al., 2016),

sendo considerada padrão-ouro no controle dos biofilmes orais.

O tempo de permanência desta molécula na cavidade oral é alto em comparação a

outros antimicrobianos devido à sua capacidade de se ligar às mucinas, proteínas salivares que

revestem as superfícies dos tecidos orais (VARONI et al., 2012). Apesar disto, em um

trabalho de revisão, Ribeiro, Hashizume e Maltz (2007) relataram que clorexidina na forma de

gel apresenta resultados mais promissores se comparado à clorexidina na forma de

8

enxaguatório. Estes autores relatam redução nos níveis de S. mutans do biofilme dental por

um período de até 26 semanas após uso do gel enquanto os enxaguatórios apresentaram

redução apenas durante o tratamento, que pode variar com a utilização de uma única aplicação

ou de aplicações consecutivas por até 6 semanas, de acordo com o protocolo estabelecido.

Segundo Senel e colaboradores (2000), os géis podem prolongar o tempo de permanência da

formulação na cavidade oral, o que poderia explicar o aumento de seu efeito terapêutico.

Além disso, os géis podem ter características de liberação modificada de fármacos devido às

propriedades de seus polímeros (SENEL et al., 2000).

2.4 SISTEMAS DE LIBERAÇÃO MODIFICADA DE FÁRMACOS

Os sistemas de liberação modificada de fármacos são formulações que proporcionam

uma atividade a longo prazo, visto que liberam o princípio ativo em concentração terapêutica

por um período estendido (LAVOINE et al., 2014). Em acréscimo, estes sistemas de liberação

podem ser utilizados como ferramenta para aumentar as propriedades biofarmacêuticas do

fármaco diminuindo sua toxicidade, aumentando sua solubilidade, biodistribuição e

estabilidade, além de melhorar sua atividade biológica (MARTIN et al., 2015).

Para a cavidade oral, um dos sistemas de liberação mais estudado é o sistema de

liberação semissólido (géis e pomadas) (SENEL et al.; 2000; BRUSCHI; FREITAS, 2005;

VERRAEDT et al., 2010; SHARPE et al., 2014), pois promove o contato íntimo entre a

formulação e o tecido, resultando em alta concentração de fármacos no local de aplicação

(BRUSCHI; FREITAS, 2005). Em particular, um sistema de liberação semissólido que

apresenta propriedades ajustáveis e diversidade de polímeros naturais e sintéticos disponíveis

são os géis (SHARPE et al., 2014). Entretanto, as condições biológicas encontradas na

cavidade bucal podem contribuir para a rápida eliminação de tais sistemas, tornando o

desenvolvimento das formulações orais um verdadeiro desafio (SANKAR et al., 2011).

Um dos desafios é a presença de enzimas bacterianas que podem degradar

precocemente a formulação (SANKAR et al., 2011). Além disso, os microrganismos podem

produzir altos níveis de ácidos ou bases orgânicas, causando na cavidade oral uma oscilação

de pH intermitente (VAN HOUTE, 1994; TAKAHASHI et al., 1997). Há também que se

considerar a colonização das superfícies orais pelos biofilmes, que promovem proteção física

contra antimicrobianos pela formação de uma matriz extracelular, produzindo suas próprias

enzimas para adaptação fisiológica celular (JOLIVET-GOUGEON; BONNAURE-MALLET,

2014). Outro aspecto pouco estudado é o quanto tais características biológicas interfeririam na

9

liberação do fármaco presente na formulação. Este pode ser um dos motivos pelo qual o

PerioChip®, um dos sistemas de liberação de fármacos mais estudados no tratamento da

periodontite, apresenta resultados controversos sobre sua eficácia clínica.

O PerioChip® (Figura 4) é um chip de gelatina hidrolisada contendo clorexidina na

forma de filme (TABARY et al., 2014). De acordo Jeffcoat e colaboradores (1998), Killoy

(1998) e Grover e colaboradores (2011) seu uso associado ao procedimento mecânico de

raspagem e alisamento radicular resultou em redução da bolsa periodontal, melhorando

significativamente os resultados do tratamento da periodontite adulta. Por outro lado, Grisi e

colaboradores (2002), Daneshmand e colaboradores (2002) e Medaiah e colaboradores (2014)

utilizando delineamentos experimentais semelhantes, mostraram não haver benefícios clínicos

com a sua aplicação.

Figura 4 - Inserção do Periochip® na bolsa periodontal

Fonte: MEDAIAH et al., 2014.

Outra questão apontada como limitação clínica dos sistemas de liberação modificada é

a baixa degradabilidade dos carreadores poliméricos, bem como severas irritações na mucosa

(AMEYE et al., 2005; TABARY et al., 2014). Neste contexto, a quitosana tem recebido

destaque pois é um material não-tóxico, biocompatível e biodegradável (SHARPE et al.,

2014), sendo o carreador selecionado para o sistema de liberação deste estudo.

10

3 OBJETIVOS

Obtenção de um sistema de liberação modificada contendo clorexidina e avaliação de

seu efeito antimicrobiano em biofilmes orais patogênicos de Streptococcus mutans e

Porphyromonas gingivalis.

11

4 MATERIAIS E MÉTODO

4.1 MATERIAIS

Os materiais utilizados foram: solução de digluconato de clorexidina 20% (Fagron®,

Saint Paul, MN, USA), hidroxipropil metilcelulose (HPMC) (Methocel™K100LV, Colorcon®,

Harleysville, PA, USA). Quitosana (médio peso molecular), cloreto de sódio, fosfato de sódio

monobásico, fosfato de sódio dibásico, sulfato de magnésio e dietilamina foram adquiridos da

Sigma-Aldrich® (Sant Louis, MO, USA). Ácidos acético e fórmico foram adquiridos da

Synth® (Labsynth, Diadema, SP, BR), metanol (grau cromatográfico) da J.T. Baker®

(Phillipsburg, NJ, USA), fosfato de potássio dibásico da Vetec (Rio de Janeiro, RJ, BR),

sacarose da Merck® (Darmstadt, HE, GE) e glicose da Fluka™ (St. Gallen, SZ). Triptona,

Brain Heart Infusion (BHI), Brain Heart Infusion ágar (BHI-ágar) e base para ágar sangue

foram adquiridos da marca Oxoid® (Basingstoke, Hampshire, UK) e o extrato de levedura foi

adquirido da BD Diagnostics (Sparks, MD, USA).

4.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este trabalho foi dividido em duas etapas (Figura 5), sendo que a primeira envolveu a

obtenção da formulação mais adequada aos experimentos biológicos. Isto foi necessário pois,

tal como as situações clínicas, os experimentos biológicos requerem um tempo de

permanência relativamente prolongado da formulação em um meio líquido circundante.

Desta forma, houve a necessidade de garantir que o sistema de liberação mantivesse sua

integridade física durante o tempo de exposição aos caldos de cultura nos quais

cresceram os biofilmes. Em acréscimo, é imprescindível que a formulação estudada

apresente um perfil de liberação do fármaco condizente com a necessidade clínica para o

qual foi idealizado. Assim, formulações-teste com diferentes concentrações de

clorexidina foram preparadas e avaliadas visualmente em relação à sua integridade física.

As formulações-teste selecionadas à partir destes resultados iniciais foram submetidas a

um ensaio de liberação em meio estático utilizando tampão como meio de dissolução

(meio de dissolução convencional). Este ensaio em tampão possibilitou a escolha da

formulação-teste com maior liberação de ativo para os experimentos utilizando os

diferentes caldos de cultura bacterianos como meio de dissolução. Na segunda etapa do

trabalho, o efeito da formulação-teste selecionada foi avaliado em biofilmes patogênicos de S.

12

mutans ou P. gingivalis, bactérias representativas da cárie (biofilme supragengival) e doença

periodontal (biofilme subgengival), respectivamente. A viabilidade bacteriana e o pH dos

biofilmes foram determinados, assim como a quantificação da clorexidina liberada da

formulação para os caldos de cultura.

Figura 5 – Delineamento experimental do trabalho

13

4.3 OBTENÇÃO DO SISTEMA DE LIBERAÇÃO MODIFICADA

A base do sistema de liberação foi preparada com quitosana de peso molecular médio

(Sigma-Aldrich®, Sant Louis, Missouri, USA) a 4% em ácido acético 0,1 M, em temperatura

ambiente sob agitação constante. Após estabilização da dispersão, hidroxipropil metilcelulose

(HPMC) foi adicionada, seguida do digluconato de clorexidina previamente liofilizado. A

liofilização da solução de digluconato de clorexidina a 20% (p/v) foi a estratégia utilizada

para atingir a elevada concentração de fármaco exigida pela proposta da formulação. O teor

do liofilizado foi corrigido pela umidade residual. Ao final do preparo, as formulações

permaneceram em repouso por 24 horas em temperatura ambiente e o pH final das mesmas

foi igual a 7.

Após o preparo de quatro formulações-teste com quantidades variáveis de digluconato

de clorexidina (Tabela 1) na presença ou ausência do HPMC, as mesmas foram

acondicionadas em seringas e esterilizadas por raios-X (130 Gy, 160 kV, 25 mA, 0.3 mm de

filtro de Cobre) por 30 minutos (Rad Source’s RS 2000 Biological Research Irradiator,

Shanghai Medicilon, Shanghai, China).

Tabela 1 – Composição das formulações-teste preparadas com concentrações variáveis de

digluconato de clorexidina na presença ou ausência do HPMC

Formulação-

teste

Gel de quitosana

a 4%

Digluconato de

clorexidina HPMC

1 90% 10% -

2 82% 10% 8%

3 72% 20% 8%

4 52% 40% 8%

Para simular o meio líquido circundante nos quais os biofilmes permanecem, as

formulações-teste foram aplicadas nas paredes de tubos estéreis de 50 mL e, após adição de

45 mL de tampão fosfato de sódio 30 mM (pH 6,9), foram incubadas a 37° C e 5% de CO2

por 4 dias. Apenas as formulações-teste 2, 3 e 4 mantiveram-se aderidas ao tubo e, por este

motivo, foram selecionadas para o ensaio de liberação em meio estático em tampão fosfato,

descrito a seguir.

14

4.4 ENSAIO DE LIBERAÇÃO DO FÁRMACO EM MEIO ESTÁTICO (TAMPÃO)

As formulações-teste 2, 3 e 4, previamente esterilizadas, foram aplicadas nas paredes

de tubos estéreis de 50 mL e avaliadas em relação ao perfil de liberação através de um ensaio

em meio estático, contendo tampão fosfato como meio de dissolução. Este é o meio de

dissolução mais utilizado para estudo de liberação de fármacos, sendo denominado neste

estudo de meio de dissolução convencional. Assim, aos tubos contendo cada formulação-teste

foram adicionados 45 mL de tampão fosfato de sódio 30 mM (pH 6,9), sendo incubados a 37°

C em estufa com 5% de CO2 durante 4 dias. Uma formulação sem digluconato de clorexidina

foi utilizada como controle e o meio de liberação foi trocado diariamente. Nos tempos 24, 48,

72 e 96 horas após o início do experimento, alíquotas de 2 mL do meio de liberação de todos

os grupos foram coletados para quantificação de digluconato de clorexidina liberado das

formulações (n=3).

O preparo das amostras foi realizado por filtração em membrana de acetato de celulose

de 0,22 µm (Millipore®, Billerica, Massachusetts, EUA). Estas amostras foram comparadas a

curvas analíticas preparadas utilizando uma solução de digluconato de clorexidina a 20%

(p/v) (Sigma-Aldrich®, Sant Louis, MO, USA) diluída em fase móvel no intervalo de

concentração de 5 a 50 µg/mL.

4.5 QUANTIFICAÇÃO DE DIGLUCONATO DE CLOREXIDINA

As quantificações foram realizadas em cromatógrafo líquido de alta eficiência

(CLAE)(PROEMINENCE, Shimadzu®, Nakagyo-ku, Kyoto, Japão), com detector

espectrofotométrico de arranjo de diodos (DAD)(SPDM20A, Shimadzu®, Nakagyo-ku,

Kyoto, Japão). A coluna de fase reversa C-18 (modelo Shim-pack VP-ODS, Shimadzu®,

Nakagyo-ku, Kyoto, Japão) com 4,6 mm x 25 cm e diâmetro de partícula de 5 µm foi

utilizada e acoplada a uma pré coluna C18, a 40° C, com vazão de 0,8 mL/min, utilizando

como fase móvel metanol (65%) – água ultrapurificada pH 3,5 (35%) (corrigido com ácido

fórmico) (v/v) e 0,4% de dietilamina, modo isocrático e detecção em 254 nm. O volume

injetado de amostra foi de 20 µL. Os resultados foram obtidos através do Software

LabSolutions (Shimadzu®, Nakagyo-ku, Kyoto, Japão). Os resultados foram expressos em

concentração de clorexidina liberada da formulação de acordo com o tempo.

Após as quantificações, os resultados sugeriram que a formulação-teste 2, contendo

10% de digluconato de clorexidina, apresentou o melhor perfil de liberação do fármaco (vide

15

“Resultados”, página 21). Assim, esta formulação foi selecionada para o ensaio de liberação

em meio estático utilizando os caldos de cultura de S. mutans ou P. gingivalis como meio de

dissolução, descrito a seguir.


Considerando que a liberação de clorexidina à partir da formulação pode ser

influenciada pelo meio de dissolução no qual se encontra, um ensaio de liberação em meio

estático semelhante ao descrito no item 4.4 avaliou tanto o caldo de cultura utilizado nos

experimentos de S. mutans (preparado com triptona e extrato de levedura ultrafiltrado) quanto

o caldo de cultura utilizado no experimento de P. gingivalis (preparado com meio brain heart

infusion, BHI, suplementado com hemina e menadiona). A liberação de clorexidina da

formulação utilizando tampão fosfato como meio de dissolução foi utilizada como controle.

As amostras foram preparadas adicionando-se metanol na proporção 1:2 (1000 µL) em

alíquotas previamente acondicionadas em tubos de microcentrífuga (500 µL) por 24 horas, a -

20° C, visando a otimização do processo de precipitação de proteínas. Após este período, os

tubos foram deixados em temperatura ambiente por 30 minutos, e em seguida, centrifugados

durante 15 minutos a 10.000 g (5810 R, Eppendorf, Hamburgo, Alemanha), sendo o

sobrenadante submetido à filtração por membrana de 0,22 µm (Millipore®, Billerica,

Massachusetts, USA).

Para assegurar que o método de precipitação de proteínas não promoveu perda do

fármaco, foram utilizadas amostras dos grupos do controle do veículo. Assim, na

ausência do fármaco, foram preparadas curvas analíticas em triplicata utilizando as

matrizes sem o fármaco (superposição de matriz) e o procedimento de precipitação antes da

análise. Estas curvas analíticas foram chamadas de curvas extraídas e a quantificação de

clorexidina foi realizada de acordo com o descrito no item 4.5.

4.7 BIOFILMES

Após a seleção da formulação-teste 2, contendo 82% de quitosana, 8% de HPMC e

10% de clorexidina, os experimentos biológicos com biofilme tiveram início, sendo descritos

a seguir.

16

4.7.1 Biofilme de Streptococcus mutans

4.7.1.1 Reativação bacteriana e preparo do inóculo

Streptococcus mutans UA 159 foi gentilmente cedida pelos professores Jaime

Aparecido Cury e Livia Maria Andaló Tenuta da FOP-UNICAMP. Após descongelamento

em banho de gelo, as bactérias foram reativadas a partir da transferência de 100 µL da

suspensão bacteriana para meio de cultura preparado com triptona e extrato de levedura

ultrafiltrado contendo glicose 1% (p/v) (pH 7,0), sendo incubadas a 37° C e 5% de CO2. Após

18 horas, a suspensão foi semeada em placas de BHI-ágar e incubadas a 37° C e 5% de CO2

por 24 horas. As colônias de S. mutans foram transferidas da placa para o meio de cultura

ultrapurificado contendo 1% de glicose (p/v) e incubadas por 18 horas para a formação do

inóculo (KOO et al., 2003).

4.7.1.2 Formação do biofilme e exposição aos tratamentos

Os biofilmes de Streptococcus mutans UA 159 foram formados por 6 dias em lâminas

de vidro (26 x 76 x 1,2 mm) (Figura 6). Assim, 100 µL do inóculo bacteriano descrito no item

anterior foram transferidos para tubos de 50 mL contendo caldo de cultura ultrapurificado

(extrato de levedura e triptona) e sacarose 1%. Após o acondicionamento das lâminas de

vidro, o conjunto foi incubado a 37° C e 5% de CO2 (KOO et al., 2003). No terceiro dia de

formação do biofilme, as lâminas de vidro foram transferidas para outros tubos de 50 mL aos

quais foram aderidas as seguintes formulações (515 mg + 10): 1) Formulação contendo 92%

de quitosana e 8% de HPMC como controle do veículo (CV) ou 2) Formulação contendo 82%

de quitosana, 8% de HPMC e 10% de clorexidina (CHX). Um grupo sem exposição à

formulação foi incluído como controle negativo (CN). Após adição de caldo de cultura

contendo sacarose, o conjunto foi incubado novamente. Os caldos de cultura foram trocados

diariamente. Tanto os biofilmes quanto os caldos de cultura foram analisados 24, 48, 72 e 96

horas após a exposição às formulações.

Após cada período experimental (24, 48, 72 ou 96 horas após exposição às

formulações), os biofilmes foram lavados três vezes em solução salina para desprendimento

de células não aderidas. Em seguida, os biofilmes foram coletados e alíquotas de 15 mg foram

distribuídas em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 1 mL de solução salina. As

amostras foram analisadas em relação à viabilidade bacteriana como descrito no item 4.7.3.2.

17

Os caldos de cultura foram analisados para determinação do pH dos biofilmes (item 4.7.3.1),

sendo posteriormente armazenados para a quantificação de fármaco liberado pela formulação

(item 4.7.3.3). Dois experimentos independentes foram realizados em triplicata (n=6).

Figura 6 – Formação do biofilme de S. mutans e exposição aos tratamentos

4.7.2 Biofilme de Porphyromonas gingivalis

4.7.2.1 Película de saliva

A adesão de P. gingivalis é dependente da película de saliva (PAPAIOANAOU et

al., 2012). Assim, no primeiro dia de experimento, lâminas de vidro (26 x 76 x 1,2 mm),

sobre as quais cresceriam os biofilmes, foram imersas em saliva humana estéril por 2 horas

a 37° C. A saliva foi coletada de 5 voluntários adultos saudáveis e com fluxo salivar normal

que não haviam utilizado antibióticos ou quaisquer medicações durante 3 meses antes da

coleta. Os participantes mastigaram um filme (Parafilm® M; American Can Co., Neenah, US)

devidamente higienizado e a coleta da saliva foi realizada em um frasco estéril. As salivas

foram centrifugadas (12000 g durante 20 minutos a temperatura de 4° C) e filtradas em

membrana filtrante de acetato de celulose de 0,22 µm (Millipore®, Billerica, Massachusetts,

18

US) antes da sua utilização. A participação dos voluntários foi aprovada pelo Comitê de

Ética da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo –

FCFRP/USP (protocolo nº. 376) (Anexo I).

4.7.2.2 Reativação bacteriana e preparo do inóculo

As colônias de P. gingivalis W83, gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Sérgio Luiz de

Souza Salvador do Departamento de Análises Clínicas, Toxicologia e Bromatologia da

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto-USP (FCFRP/USP), foram reativadas

em placas de ágar sangue suplementado com hemina (5 μg/mL), menadiona (1 μg/mL) e 5%

de sangue de carneiro desfibrinado (PAPAIOANNOU et al., 2012). As placas foram

incubadas em jarras de anaerobiose a 37° C em atmosfera contendo 80% de N2, 10% de H2 e

10% de CO2. Após 7 dias, as bactérias foram coletadas e ressuspendidas em solução salina,

sendo ajustadas na escala 0,5 de McFarland (1,5.108 UFC/mL) por densidade ótica em

espectrofotômetro a 625 nm (UV Cary 50 Varian, Melbourne, Victoria, Austrália). A

suspensão obtida foi utilizada para a formação do biofilme.

4.7.2.3 Formação do biofilme e exposição aos tratamentos

O biofilme foi formado por 3 dias de acordo com Papaioannou e colaboradores (2012),

utilizando lâminas de vidro (26 x 76 x 1,2 mm) ao invés de brackets ortodônticos (Figura 7).

Assim, o inóculo foi transferido para tubos de 50 mL contendo BHI suplementado com

hemina (5 μg/mL) e menadiona (1 μg/mL) aos quais foram previamente aderidas as seguintes

formulações (515 mg + 10): 1) Formulação contendo 92% de quitosana e 8% de HPMC como

controle do veículo (CV) ou 2) Formulação contendo 82% de quitosana, 8% de HPMC e 10%

de clorexidina (CHX). Um grupo sem exposição à formulação foi incluído como controle.

As lâminas contendo a película de saliva foram adicionadas ao tubo e conjunto foi

incubado em jarras de anaerobiose a 37° C em atmosfera contendo 80% de N2, 10% de H2 e

10% de CO2. Os caldos de cultura foram trocados diariamente. Tanto os biofilmes quanto os

caldos de cultura foram analisados 24, 48 e 72 horas após a exposição às formulações.

Após cada período experimental (24, 48 ou 72 horas após exposição às formulações),

os biofilmes foram lavados três vezes em solução salina, sendo coletados com swab estéril.

Após o esfregaço na lâmina de vidro, a ponta do swab foi cortada e transferida para tubos de

1,5 mL contendo 1 mL de solução salina. Assim como no experimento com S. mutans, a

19

viabilidade bacteriana (item 4.7.3.2), pH dos biofilmes (item 4.7.3.1) e quantificação de

fármaco liberado pela formulação (item 4.7.3.3) foram determinados. O experimento foi

realizado em triplicata (n=3).

Figura 7 – Formação do biofilme de P.gingivalis e exposição aos tratamentos

4.7.3 Análises

4.7.3.1 Mensuração dos pHs dos biofilmes

Os pHs dos biofilmes foram determinados nos caldos de cultura de acordo com Duarte

e colaboradores (2008) utilizando-se um pHmetro digital (PG2000, Gehaka, São Paulo).

4.7.3.2 Viabilidade bacteriana

Para a determinação da viabilidade bacteriana as amostras foram sonicadas com 1

pulso com 20% de amplitude, durante 15 segundos (sonicador FB505, Fischer Scientific,

Pittsburgh, Pensilvânia, USA) (AIRES et al., 2008). Após sonicação, uma alíquota de 100 μL

20

da suspensão obtida na coleta foi diluída em salina e diluições seriadas foram inoculadas em

duplicata pela técnica da gota (TENUTA et al., 2008).

No experimento com S. mutans a inoculação foi realizada em placas de BHI-ágar,

sendo incubadas a 37° C e 5% de CO2 por 48 horas. No experimento com P. gingivalis, a

inoculação foi realizada em placas de BHI-ágar sangue suplementado com hemina (5 μg/mL)

e menadiona (1 μg/mL), sendo incubadas em jarras de anaerobiose a 37° C em atmosfera

contendo 80% de N2, 10% de H2 e 10% de CO2 por 7 dias. Após o tempo de incubação para

cada espécie, as contagens das UFC foram realizadas com o auxílio de uma lupa

estereoscópica (Stemi DV4, Zeiss, Göttingen, Germany). Os resultados da contagem de S.

mutans foram expressos em UFC/mg de biofilme úmido enquanto os resultados de P.

gingivalis foram expressos em UFC/área da lâmina (mm²).

4.7.3.3 Quantificação de clorexidina nos caldos de cultura dos biofilmes de S. mutans e P.

gingivalis

As amostras foram preparadas de acordo com o descrito no item 4.6 e a quantificação

do fármaco foi realizada por CLAE/DAD (item 4.5). Os resultados foram expressos em

porcentagem de clorexidina liberada da formulação em função do tempo.

4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados foram analisados com o auxílio do software SAS System (SAS Institute Inc.

The SAS System, release 9.3. SAS Institute Inc., Cary, NC, USA, 2012). Um modelo linear

de análise de variância foi ajustado e a aderência dos resíduos à distribuição Gaussiana foi

avaliada pelo teste de Shapiro-Wilk, coeficiente de assimetria, curtose e análise gráfica. O

teste de Tukey-Kramer (viabilidade de S. mutans, pH dos biofilmes, quantificação de

clorexidina no experimento de P. gingivalis) e Tukey (viabilidade de P. gingivalis,

quantificação de clorexidina no experimento de S. mutans) foram utilizados para comparar as

médias dos efeitos significativos. O nível de significância foi estabelecido em 5%.

21

5 RESULTADOS

5.1 SELETIVIDADE DO MÉTODO

Previamente aos experimentos de quantificação de clorexidina, foram realizadas

análises para a verificação da confiabilidade e seletividade da metodologia proposta. As

curvas analíticas utilizadas para a quantificação da clorexidina em tampão fosfato e nos caldos

de cultura utilizados apresentaram linearidade satisfatória para os intervalos de concentrações

avaliadas (5 a 50 µg/mL) e os coeficientes de determinação foram superiores ao recomendado

pela literatura R2 > 0,99 (ANVISA, 2003).

O tempo de retenção do analito foi de 6,4 minutos (Figura 8a). A presença de outros

componentes da formulação e dos diferentes meios utilizados não interferiu na quantificação

do ativo, apresentando tempo de retenção menor do que o do analito (Figura 8b e 8c).

5.2 ENSAIO DE LIBERAÇÃO EM MEIO ESTÁTICO (TAMPÃO)

As formulações-teste 2, 3 e 4 contendo respectivamente, 10, 20 e 40% de clorexidina

foram avaliadas em relação à liberação de clorexidina. Os resultados da análise (Figura 9)

mostraram que, apesar de dobrar a concentração de fármaco na formulação 3, a liberação se

manteve muito próxima daquela obtida pela formulação 2. Em acréscimo, apesar de conter a

maior quantidade inicial de fármaco, a formulação 4 apresentou liberação de clorexidina

muito menor do que as demais formulações nas primeiras 24 horas, justificando a escolha da

formulação-teste número 2 para o estudo com os biofilmes.

22

Figura 8 – Perfis cromatográficos (CLAE-DAD) obtidos pela análise de: a) solução

preparada em tampão contendo 50 µg/mL de clorexidina; b) caldo de cultura na presença

de bactérias e do controle do veículo da formulação do biofilme de S.mutans; c) caldo de

cultura na presença de bactérias e do controle do veículo da formulação do biofilme de P.

gingivalis

23

Figura 9 – Concentração de clorexidina liberada das formulações-teste 2, 3 e 4 contendo,

respectivamente, 10, 20 e 40% de ativo

Resultados obtidos por CLAE-DAD do ensaio de liberação realizado com (●) Formulação-teste 2; (■)

Formulação-teste 3 e (▲) Formulação-teste 4


A avaliação da liberação de clorexidina a partir da formulação-teste 2 mostrou que a

utilização de diferentes caldos de cultura como meio de dissolução diminui a liberação do

fármaco em comparação ao tampão (Figura 10). Em acréscimo, a concentração de clorexidina

liberada no caldo de cultura utilizado para o crescimento de S. mutans foi menor se

comparada ao caldo de cultura utilizado para o crescimento de P. gingivalis no tempo 24

horas.

Figura 10 – Concentração de clorexidina liberada em cada tempo a partir da formulação-teste

2 utilizando diferentes meios de dissolução

Resultados obtidos por CLAE-DAD do ensaio de liberação realizado utilizando como meio de dissolução o (●)

Tampão fosfato de sódio; (■) Caldo de cultura para o crescimento de S. mutans ;(▲) Caldo de cultura para o

crescimento de P. gingivalis

50

100

150

200

250

300

24 48 72 96

[clo

rexid

ina]

µg

/mL

Tempo (horas)

50

100

150

200

250

300

24 48 72 96

[clo

rexid

ina]

µg

/mL

Tempo (horas)

24

5.4 BIOFILMES

5.4.1 Biofilme de Streptococcus mutans

5.4.1.1 Mensuração do pH dos biofilmes

Antes da exposição aos tratamentos, o pH dos biofilmes apresentou valores de 4,0 ±

0,1 indicando metabolização bacteriana dos carboidratos e produção de ácidos (dados não

mostrados). A Tabela 2 mostra os resultados pH dos biofilmes de S. mutans nos diferentes

tempos de exposição após a exposição aos tratamentos. Os grupos CN e CV não apresentaram

diferença entre si (p>0,05), mas apresentaram quedas de pH maiores se comparados à CHX

em todos os tempos (p<0,05). Os valores de pH entre os tempos de 24, 48 e 72 foram

crescentes em CHX (p<0,05) e não houve diferença significativa entre 72 e 96 horas (p>0,05).

Tabela 2 – Mensuração do pH dos biofilmes de S. mutans de acordo com os tratamentos

Tempo após

incubação com as

formulações (horas)

CN CV CHX

24 3,9 ± 0,0 A 4,0 ± 0,1 A 5,77 ± 0,1 B

48 3,9 ± 0,0 A 3,9 ± 0,0 A 6,72 ± 0,0 C

72 4,0 ± 0,0 A 3,9 ± 0,0 A 6,84 ± 0,1 D

96 3,9 ± 0,1 A 3,9 ± 0,1 A 6,84 ± 0,0 D

CN= controle negativo (sem tratamento); CV= controle do veículo da formulação; CHX= formulação contendo

clorexidina. Dados expressos com média ± desvio (n=6). Os valores que não partilham a mesma letra (A, B, C,

D) são significativamente diferentes entre si; Teste de Shapiro-Wilk seguido pelo teste post-hoc Tukey-Kramer,

p<0,05.


A Figura 11 mostra os resultados de viabilidade bacteriana em biofilmes de S. mutans

de acordo com os tratamentos. Para o controle negativo (CN) houve um decréscimo na

viabilidade bacteriana nos tempos 72 e 96 horas se comparado a 24 horas (p<0,05). O grupo

controle do veículo (CV) apresentou a mesma tendência que CN nos referidos tempos

(p<0,05). A exposição do biofilme à formulação experimental contendo clorexidina (CHX)

resultou em menor viabilidade bacteriana se comparada aos controles em todos os tempos

(p<0,05), não apresentando diferença entre si (p>0,05).

25

Figura 11 – Viabilidade do biofilme de S. mutans de acordo com os tratamentos


clorexidina. Dados expressos com média ± desvio padrão em escala logarítmica (n=6). Os valores que não

partilham a mesma letra (A, B, C, D, E) são significativamente diferentes entre si; Teste de Shapiro-Wilk

seguido pelo teste post-hoc Tukey-Kramer, p<0,05.

5.4.1.3 Quantificação de clorexidina no caldo de cultura dos biofilmes de S. mutans

Os dados de liberação da clorexidina corroboram com os resultados de viabilidade

bacteriana e de mensuração de pH do biofilme de S. mutans. A Tabela 3 mostra os valores de

porcentagem de clorexidina em relação à quantidade inicial em tampão fosfato de sódio, caldo

de cultura sem bactérias e caldo de cultura dos biofilmes de S. mutans.

Tabela 3 – Porcentagem de clorexidina quantificada em relação à quantidade inicial de

fármaco na formulação (média + dp) em tampão fosfato de sódio, caldo de cultura sem

bactérias e caldo de cultura dos biofilmes de S. mutans

Tempo após

incubação

com as

formulações

(horas)

Meio de liberação

Tampão fosfato de sódio

Caldo de cultura sem

bactéria

Caldo de cultura dos

biofilmes de S. mutans

24 22,8 ± 0,9A 13,6 ± 0,6B 6,9 ± 1,2EF

48 11,9 ± 0,8BC 10,6 ± 1,4CD 3,4 ± 0,2GH

72 9,0 ± 0,2DE 7,8 ± 0,3E 1,9 ± 0,1H

96 8,9 ± 1,3DE 5,1 ± 0,5FG 1,8 ± 0,2H

Dados expressos com média ± desvio padrão (n=3). Os valores que não partilham a mesma letra (A a H) são

significativamente diferentes entre si; Teste de Shapiro-Wilk seguido pelo teste post-hoc Tukey, p<0,05.

ABBCD D D

A ABC CDD

E E

1E+0

1E+2

1E+4

1E+6

1E+8

24 48 72 96

log

UFC

/mg

de

bio

film

e ú

mid

o

Tempo (horas)

CN

CV

CHX

E E

26

Nas primeiras 24 horas, a maior e a menor liberação de clorexidina foi observada na

formulação exposta ao tampão e ao caldo de cultura dos biofilmes de S. mutans,

respectivamente (p<0,05). A formulação exposta ao caldo de cultura sem bactérias apresentou

maior teor de clorexidina se comparada ao caldo de cultura dos biofilmes em todos os tempos

(p<0,05).

Nas primeiras 24 horas, todas as formulações apresentaram maior teor de clorexidina

em relação aos demais tempos (p<0,05). Ao longo do tempo, a liberação de clorexidina em

tampão diminui significativamente até 72 horas (p<0,05) não havendo diferença estatística em

comparação ao tempo de 96 horas (p>0,05). Já no caldo de cultura sem bactérias a quantidade

de clorexidina diminuiu significativamente ao longo do tempo (p<0,05). No caldo de cultura

dos biofilmes o teor de clorexidina não foi significativamente diferente nos tempos de 48, 72

e 96 horas (p>0,05).

A partir dos resultados do ensaio de liberação foi realizado um cálculo para a obtenção

da concentração de clorexidina em porcentagem (p/v) quantificada nos diferentes meios de

dissolução (Tabela 4). Estes cálculos poderiam auxiliar a comparação dos dados com as

concentrações de clorexidina descritas na literatura. A concentração variou nos tempos 24 a

96 horas de 0,025 a 0,010% no tampão, de 0,016 a 0,006% no caldo de cultura sem bactérias e

de 0,008 a 0,002% no caldo de cultura dos biofilmes de S. mutans.

Tabela 4 - Concentração do fármaco em porcentagem nos diferentes meios de liberação

(média ± dp)

Tempo após

incubação

com as

formulações

(horas)

Meio de liberação



bactérias


biofilmes de S. mutans

24 0,025 ± 0,001 0,016 ± 0,000 0,008 ± 0,001

48 0,013 ± 0,001 0,012 ± 0,001 0,004 ± 0,000

72 0,010 ± 0,000 0,011 ± 0,010 0,002 ± 0,000

96 0,010 ± 0,002 0,006 ± 0,004 0,002 ± 0,000

Dados expressos com média ± desvio padrão (n=3).

27

5.4.2 BIOFILME DE Porphyromonas gingivalis

5.4.2.1 Mensuração do pH dos biofilmes

O pH dos biofilmes de P. gingivalis foi de 7,1 ± 0,1, não diferindo entre os grupos ou

tempos estudados.


A Figura 12 mostra os resultados de viabilidade bacteriana em biofilmes de P.

gingivalis de acordo com os tratamentos. Para o CN houve um aumento na viabilidade

bacteriana em 72 horas se comparado aos tempos de 24 e 48 horas (p<0,05). A viabilidade das

bactérias no grupo CV também aumentou durante o experimento, mas foi menor se

comparada ao CN em todos os tempos (p<0,05), sendo igual ao grupo CHX nas primeiras 24

horas (p>0,05). O grupo CHX resultou em menor viabilidade bacteriana se comparada ao CN

em todos os tempos e ao CV nos tempos de 48 e 72 horas (p<0,05), não apresentando

diferença entre si (p>0,05).

Figura 12 – Viabilidade do biofilme de P. gingivalis de acordo com os tratamentos


clorexidina. Dados expressos com média ± desvio padrão em escala logarítmica (n=3). Os valores que não

partilham a mesma letra (A, B, C, D, E) são significativamente diferentes entre si; Teste de Shapiro-Wilk

seguido pelo teste post-hoc Tukey, p<0,05.

AB

AC

D

BD

1E+0

1E+2

1E+4

1E+6

1E+8

24 48 72

log

UFC

/mm

2

Tempo (horas)

CN

CV

CHX

E E E E

28

5.4.2.3 Quantificação de clorexidina no caldo de cultura dos biofilmes de P. gingivalis

A Tabela 5 mostra os valores em porcentagem de clorexidina a partir da formulação

nos diferentes meios. Os resultados descritos na tabela corroboram com os obtidos na análise

da viabilidade do biofilme de P. gingivalis.

Tabela 5 – Porcentagem de clorexidina quantificada em relação à quantidade inicial de

fármaco na formulação (média ± dp) em tampão fosfato de sódio, caldo de cultura sem

bactérias e caldo de cultura dos biofilmes de P. gingivalis

Tempo após

incubação

com as

formulações

(horas)

Meio de liberação



bactérias


biofilmes de P.

gingivalis

24 22,8 ± 0,9A 17,6 ± 0,3B 11,3 ± 0,3C

48 11,9 ± 0,8C 10,8 ± 0,2C 7,2 ± 0,11EF

72 9,0 ± 0,2D 6,5 ± 0,1F 4,1 ± 0,4G

Dados expressos com média ± desvio padrão (n=3). Os valores que não partilham a mesma letra (A a G) são

significativamente diferentes entre si; Teste de Shapiro-Wilk seguido pelo teste post-hoc Tukey-Kramer, p<0,05.

Em todos os meios de dissolução houve decréscimo na porcentagem de clorexidina

liberada ao longo dos dias, diferindo entre si em todos os tempos (p<0,05). No tempo 24

horas, a maior e a menor liberação de clorexidina foi observada na formulação exposta ao

tampão e ao caldo de cultura dos biofilmes, respectivamente (p<0,05). Em acréscimo, as

porcentagens de teor de clorexidina no caldo de cultura dos biofilmes foram cerca de 1,5

vezes menores em comparação ao caldo sem bactérias em todos os tempos (p<0,05) .

Assim como realizado para S. mutans, a partir dos resultados do ensaio de liberação

foi realizado um cálculo para a obtenção da concentração de clorexidina em porcentagem

(p/v) quantificada nos diferentes meios de dissolução (Tabela 6). A concentração variou nos

tempos 24 a 72 horas de 0,025 a 0,010% no tampão, de 0,020 a 0,007% no caldo de cultura

sem bactérias e de 0,013 a 0,005% no caldo de cultura com bactérias.

29

Tabela 6 – Concentração do fármaco nos diferentes meios de liberação (média ± dp)

Tempo após

incubação

com as

formulações

(horas)

Meio de liberação



bactérias


biofilmes de P.

gingivalis

24 0,025 ± 0,001 0,020 ± 0,000 0,013 ± 0,001

48 0,013 ± 0,001 0,012 ± 0,000 0,008 ± 0,000

72 0,010 ± 0,000 0,007 ± 0,000 0,005 ± 0,000

Dados expressos com média ± desvio padrão (n=3).

30

6 DISCUSSÃO

Clorexidina é um agente antimicrobiano comumente utilizado como enxaguatório

bucal, apresentando efeitos bacteriostáticos em baixas concentrações (0,012 – 0,06%) e

efeitos bactericidas em concentrações maiores (0,12 – 0,2%) (RIBEIRO; HASHIZUME;

MALTZ, 2007; VARONI et al., 2012; LEE et al., 2016). Apesar de apresentar um tempo de

permanência alto em comparação a outros antimicrobianos orais, a possibilidade de estender

este tempo utilizando uma formulação farmacêutica pode trazer vantagens no controle de

biofilmes patogênicos. Em acréscimo, a obtenção da formulação na presença de condições

biológicas, mesmo que minimamente desafiadoras se comparadas às situações clínicas, pode

trazer limitações quanto à liberação do fármaco. De fato, isto foi observado no presente

trabalho.

De uma forma geral, a liberação de clorexidina da formulação foi menor quando a

mesma foi exposta aos caldos de cultura se comparada ao meio convencional (tampão

fosfato). Entretanto, enquanto o meio convencional é composto de tampão fosfato em pH 7,

os caldos de cultura microbiológicos contém substratos essenciais para o pleno

desenvolvimento bacteriano como peptona, proteínas, carboidratos, enzimas, leveduras

autolisadas, sais, vitaminas, entre outros. A liberação de clorexidina foi menor ainda ao se

comparar estes dados com os caldos de cultura contendo as bactérias (S. mutans ou P.

gingivalis). Isto pode ser explicado devido à presença de várias moléculas provenientes do

ambiente de formação dos biofilmes. É bem estabelecido que nos biofilmes as bactérias se

comunicam por quorum sensing, processo pelo qual os microrganismos regulam a densidade

populacional por sinalização química (JOLIVET-GOUGEON; BONNAURE-MALLET;

2014). Além disso, ocorrem trocas de substâncias (oxigênio, nutrientes) entre o biofilme e o

meio, além de haver replicação dos microrganismos e metabolização de substrato circundante

(MARTIN et al., 2015). Provavelmente, estas substâncias interferiram com a liberação de

fármaco da formulação devido ao aumento da força iônica do meio de dissolução

(BONFERONI et al., 2000; BAATI et al, 2015). Assim, a utilização de meios de dissolução

mais complexos que o meio convencional pode contribuir para os estudos de obtenção de

sistemas de liberação modificada.

Neste contexto, a utilização de um meio de liberação de fármaco mais próximo ao

meio fisiológico para onde a formulação é idealizada – no caso, a cavidade oral - poderia

predizer o possível desempenho clínico de tal formulação. Ou seja, há necessidade de

modelos que avaliem a quantificação do fármaco em um meio que possa prever o

31

comportamento in vivo da forma farmacêutica. Isto é apontado na literatura como um dos

principais motivos para o insucesso clínico de grande parte das formulações

farmacêuticas (PATEL; LIU; BROWN, 2012). Ainda que com limitações inerentes ao

modelo biológico utilizado, o presente trabalho propõe alguns desafios biológicos

constantes na cavidade oral como presença de macromoléculas, enzimas, bactérias ,

biofilme e oscilações de pH. Estas variáveis podem ser consideradas interferentes tanto

na manutenção da integridade física quanto na liberação do fármaco da formulação e

modelos biológicos mais complexos devem ser propostos no futuro de forma a

contemplar o ambiente oral em sua totalidade. Assim, a formulação e a carga total de

fármaco incorporada a ela poderia sofrer adequações antes mesmo dos ensaios clínicos.

Ainda que a quantificação de clorexidina nos caldos de cultura de S. mutans e P.

gingivalis tenha sido menor se comparada ao meio de dissolução convencional, o efeito

biológico promovido foi observado tanto para os biofilmes supra quanto para os subgengivais.

Apesar de não terem sido observadas mudanças de pH nos biofilmes de P. gingivalis,

provavelmente por limitação da metodologia adotada, os resultados mostram que o pH dos

biofilmes de S. mutans expostos à formulação foi maior se comparado aos controles em todos

os tempos estudados. A produção de ácidos pelas bactérias S. mutans é um fatores que

contribuem para o desenvolvimento e estabelecimento de biofilmes cariogênicos (KOO et al.,

2003) e o efeito da clorexidina na diminuição da acidogenicidade destes biofilmes é bem

estabelecida na literatura (LEE et al., 2016; CCAHUANA-VASQUEZ; CURY, 2010).

Entretanto, as concentrações de clorexidina que apresentam este efeito são maiores do que

aquelas encontradas no presente estudo. Enquanto Lee e colaboradores (2016) mostraram que

houve diminuição na acidogenicidade após exposições a uma solução de clorexidina a 0,04%

e Ccahuana-Vasquez e Cury (2010) observaram este efeito utilizando clorexidina a 0,012%,

este trabalhou mostrou que concentrações variando de 0,002 a 0,008% já atenuam a

acidogenicidade dos biofilmes de S. mutans. Entretanto, por se tratar de uma proposta de

sistema de liberação modificada, este estudo expôs continuamente a formulação contendo o

antimicrobiano enquanto os trabalhos citados fizeram exposições ocasionais à clorexidina-

solução, simulando uso deste antimicrobiano como enxaguatório. Em acréscimo, há que se

considerar que a quantificação do fármaco foi realizada apenas no caldo de cultura, o que não

exclui a possibilidade da clorexidina estar ligada à componentes específicos do biofilme.

Estudos futuros devem ser delineados para estudar esta variável.

A baixa concentração de clorexidina durante períodos prolongados também diminuiu a

viabilidade celular dos biofilmes de S. mutans e P. gingivalis em todos os tempos analisados.

32

Esta molécula se liga à superfície celular bacteriana carregada negativamente, rompendo a

membrana celular e causando morte bacteriana (VARONI et al., 2012). Na presença de

biofilmes de S. mutans, cerca de 7% e 2% de clorexidina foi liberada da formulação em 24 e

96 horas após o primeiro contato com o biofilme, respectivamente. Assim, para os biofilmes

de S. mutans, a formulação contendo clorexidina pode ser considerada bactericida, pois foi

capaz de inviabilizar as bactérias no biofilme e diminuir sua acidogenicidade. Para o estudo

com P. gingivalis, a formulação proposta apresentou efeito na inibição da formação dos

biofilmes, sendo a liberação de clorexidina da formulação de 11% e 4% em 24 e 72 horas,

respectivamente. Estes valores são maiores do que a concentração inibitória mínima (CIM)

determinada para esta bactéria em sua forma livre (PARK et al., 2014), o que poderia

justificar estes resultados já que em um biofilme a susceptibilidade ao antimicrobiano

aumenta na ordem de 10 a 1000 vezes (MONROE, 2007; WU et al., 2014; FLEMMING et

al., 2016). Neste contexto, os modelos de biofilme podem contribuir para o desenvolvimento

de sistemas de liberação modificada já que tanto a liberação do fármaco como seu efeito

antibacteriano pode ser monitorados ao mesmo tempo.

A quitosana, utilizada como veículo da formulação proposta, é um polissacarídeo

extraído dos crustáceos e obtido pela deacetilação parcial da quitina (RINAUDO, 2006).

Considerado um polímero de destaque na área farmacêutica, esta molécula bioadesiva é capaz

de prolongar tanto a retenção da formulação na mucosa oral como a liberação do fármaco

(SENEL et al., 2000; KHOR; LIM, 2003; RINAUDO, 2006; RODRIGUEZ-GARCIA;

GALAN-WONG; AREVALO-NIÑO, 2010; GARD et al., 2012). Estas características únicas

da quitosana, aliadas a sua não toxicidade, promove sua ampla utilização como carreador

polimérico em sistemas de liberação de fármacos (JI et al., 2010; ELVIRI et al., 2015

SHARPE et al., 2014). De fato, os resultados do presente estudo confirmam tal perfil pois o

sistema de liberação apresentado foi capaz de liberar a clorexidina lentamente da formulação,

conforme demosntrado pelos efeitos biológicos e pelos resultados de quantificação tanto em

tampão quanto nos caldos de cultura bacterianos. Além destas propriedades, os resultados

mostram que este polissacarídeo apresentou efeitos de inibição bacteriana em biofilmes de P.

gingivalis. De acordo com a literatura, a quitosana apresenta atividade antimicrobiana

(DUTTA; TRIPATHI; DUTTA, 2011) e dispersões de quitosana podem inibir células

planctônicas e halos de crescimento bacteriano de P. ginigivalis (IKINCI et al., 2002;

RODRIGUEZ-GARCIA; GALAN-WONG; AREVALO-NIÑO, 2010). Assim, a utilização de

quitosana como carreador polimérico poderia potencializar os efeitos de um sistema de

liberação modificada, além de garantir biocompatibilidade com os tecidos orais. Entretanto,

33

estudos futuros devem contemplar condições de cultivo mais complexas como presença de

mais de uma bactéria (biofilmes multiespécie) e presença de saliva em fluxo contínuo.

Apesar da existência de protocolos de tratamento clínico bem estabelecidos para cárie

e peridontite, a realização das pesquisas para o controle destas doenças biofilme-dependentes

utilizando os antimicrobianos atualmente disponíveis é relevante para a Odontologia (WU et

al., 2014; DARRENE; CECILE; 2016). Por outro lado, a utilização de modelos

microbiológicos que possam minimamente contribuir para estudar formulações farmacêuticas

passíveis de serem utilizadas na cavidade oral pode ser extremamente relevante para a área

farmacêutica. Assim, o presente estudo sugere a importância de aliar os estudos de diferentes

áreas de forma a vislumbrar o benefício clínico almejado para o tratamento e controle das

doenças orais.

34

7 CONCLUSÃO

Os resultados sugerem que o sistema de liberação obtido foi eficiente na liberação do

ativo. O modelo proposto para a avaliação da formulação mostrou que componentes do meio

de dissolução como nutrientes, microrganismos e seus metabólitos podem interferir na

liberação do ativo do sistema. Apesar disso, o sistema de liberação obtido foi capaz de

diminuir a patogenicidade dos biofilmes de Streptococcus mutans e de Porphyromonas

gingivalis, mostrando que essa formulação pode apresentar relevância clínica na área da

odontologia.

35

REFERÊNCIAS

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starch/Carbopol® 974P mixtures as buccal bioadhesive carriers. International Journal of

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RE_899_2003.pdf/10773d22-ab7f-473c-ab4e-6827dd5f4d42>. Acesso em: 30 jul. 2017.

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ESTÈVE, M.A. An ultrasensitive LC–MS/MS method with liquid phase extraction to

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41

ANEXO I

- Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da FCFRP/USP

Documents

Obtenção de um sistema de liberação modificada contendo