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PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO PARANÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
EFEITOS DO TRANSPLANTE AUTÓLOGO DE CÉLULAS -TRONCO
MONONUCLEARES DA MEDULA ÓSSEA NA MIOCARDIOPATIA INDUZIDA
PELA DOXORRUBICINA EM RATOS WISTAR
CURITIBA
2006
ROSSANA BAGGIO SIMEONI
EFEITOS DO TRANSPLANTE AUTÓLOGO DE CÉLULAS-TRONCO
MONONUCLEARES DA MEDULA ÓSSEA NA MIOCARDIOPATIA INDUZIDA
PELA DOXORRUBICINA EM RATOS WISTAR
Dissertação apresentada ao Programa Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Pontifícia Universidade Católica do Paraná, como pré-requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.
Orientador e Diretor Adjunto do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde:Prof. Dr. Waldemiro Gremski Co-orientador: Prof. Dr. Nelson Itiro Miyague
CURITIBA
2006
ii
Dedico,
Aos meus pais, pelo apoio e preocupação com meu futuro e acima de tudo pelo verdadeiro amor que me passaram ao longo de minha vida.
Aos meus irmão (Fabiola, Priscila e Paulo Ricardo) pelo incentivo, apesar da
distância.
Ao meu marido, pela verdadeira dedicação e carinho com minha vida profissional e pessoal.
iii
AGRADECIMENTOS
Em especial e como primeiro agradecimento, ao Julio César Francisco pela sua ajuda incessante em meu projeto. À minha co-orientadora Profa. Dra. Katherine Athayde T. de Carvalho pelos conselhos e sugestões e principalmente importantes ensinamentos sobre terapia celular. Ao meu co-orientador Prof. Dr. Nelson Itiro Miyague pela responsabilidade das análises ecocardiográficas e pela sua importante e decisiva orientação em meu projeto. Ao Prof. Dr. Luiz César Guarita pela responsabilidade dos transplantes celulares. À Profa. Dra. Márcia Olandoski pela sua dedicação nas análises estatísticas. À bióloga Ana Paula Mattos, por sua importante ajuda na realização das lâminas dos cortes histológicos. A todos os funcionários do biotério por estarem à disposição sempre que foi solicitado. Aos meus amigos: Alf Rodrigues Nogueira, Nancy Nogueira, Marcelo Saldanha e Paulo Vinícius Baggio pelas suas importantes ajudas na finalização do trabalho. A Coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior (CAPES) pelo apoio financeiro.
iv
“Feliz é o homem que encontra a sabedoria,
adquirindo conhecimento”. Provérbios 3-13.
v
SUMÁRIO RESUMO...................................................................................................................xii ABSTRACT..............................................................................................................xiii 1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................01 1.1 OBJETIVOS .......................................................................................................04
1.1.1 Objetivo Geral................................................................................................04
1.1.2 Objetivos Específicos ....................................................................................04
2. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................05 2.1 DOXORRUBICINA ...........................................................................................05
2.1.1 Descrição.....................................................................................................05
2.1.2 Mecanismo de Ação ....................................................................................06
2.1.3 Cardiotoxicidade..........................................................................................07
2.2 TERAPIA CELULAR NA CARDIOLOGIA.........................................................10
2.3 CÉLULAS-TRONCO MONONUCLEARES.......................................................11
2.3.1 Origem.........................................................................................................11
2.3.2 Classificação ...............................................................................................12
2.3.3 Células-tronco da Medula Óssea .................................................................13
2.3.4 Uso Terapêutico: Reparo do Miocárdio ..........................................................14
3. MÉTODOS ............................................................................................................17 3.1 AMOSTRA........................................................................................................17
3.2 CUIDADOS GERAIS PARA OS ANIMAIS........................................................17
3.2.1 Condições do Biotério..................................................................................17
3.2.2 Condições de Laboratório............................................................................18
3.2.3 Pesagem .....................................................................................................18
3.2.4 Anestesia.....................................................................................................18
3.2.5 Ventilação....................................................................................................19
3.2.6 Materiais Operatórios...................................................................................19
3.2.7 Sistema de Ventilação Mecânica .................................................................20
3.2.8 Eutanásia.....................................................................................................21
vi
3.3 ESTUDO PILOTO.............................................................................................21
3.4 FLUXOGRAMA DO PROJETO ........................................................................25
3.5 OBTENÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO MONONUCLEARES............................27
3.5.1 Punção-aspiração da Medula Óssea...........................................................27
3.5.2 Isolamento de Células-tronco Mononucleares.............................................28
3.5.3 Congelamento de Células-tronco Mononucleares.......................................30
3.6 INDUÇÃO DA CARDIOMIOPATIA PELA DOXORRUBICINA..........................30
3.6.1 Avaliações Ecocardiográficas.......................................................................31
3.6.2 Aplicação de Cloridrato de Doxorrubicina.....................................................33
3.6.3 Avaliação do Estado Funcional do Coração pela Ecocardiografia Pré
Transplante.....................................................................................................33
3.6.4 Avaliação do Estado Patológico do Coração pela Histologia .......................27
3.7 TRANSPLANTE DE CÉLULAS-TRONCO MONONUCLEARES......................33
3.7.1 Descongelamento das Células-tronco Mononucleares................................33
3.7.2 Transplante das Células-tronco Mononucleares .........................................34
3.8 AVALIAÇÃO CARDIOLÓGICA PÓS-TRANSPLANTE .....................................35
3.8.1 Avaliação Ecocardiográfica Pós-Transplante ..............................................35
3.8.2 Avaliação Histopatológica Pós-Transplante ................................................35
3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA .....................................................................................37
4. RESULTADOS......................................................................................................38 4.1 MORTALIDADE ................................................................................................40
4.2 VIABILIDADE CELULAR...................................................................................40
4.3 PESO DOS ANIMAIS........................................................................................40
4.4 FREQUÊNCIA CARDÍACA ...............................................................................41
4.5 RESULTADOS NO MOMENTO PRÉ-TRANSPLANTE......................................42
4.5.1 Resultados Estatísticos Ecocardiográficos...............................................42
4.5.1.1 Volume Diastólico Pré Transplante ..........................................................42
4.5.1.2 Volume Sistólico Pré Transplante.............................................................43
4.5.1.3 Fração de Ejeção Pré Transplante ...........................................................43
4.6 RESULTADOS NO MOMENTO PÓS-TRANSPLANTE ......................................44
4.6.1 Resultados Estatísticos Ecocardiográficos..................................................44
vii
4.6.1.1 Volume Diastólico Pós Transplante..........................................................45
4.6.1.2 Volume Sistólico Pós Transplante ............................................................45
4.6.1.3 Fração de Ejeção Pós Transplante ..........................................................46
4.6.2 Resultados Histopatológicos ..........................................................................47
4.6.3 Resultados Imunohistoquímico : Brdu............................................................50
5. DISCUSSÃO.........................................................................................................51 5.1 INDUÇÃO DA CARDIOMIOPATIA......................................................................51
5.2 TRANSPLANTE AUTÓLOGO DE CÉLULAS-TRONCO MONONUCLEARES ...54
6. CONCLUSÃO .......................................................................................................59 REFERÊNCIAS.........................................................................................................60 ANEXOS ...................................................................................................................74
viii
LISTA DE FIGURA
FIGURA 1 – Estrutura química do Cloridrato de Doxorrubicina..............................06
FIGURA 2 – Respirador a volume utilizado ............................................................19
FIGURA 3 – Material operatório utilizado ...............................................................20
FIGURA 4 – Intubação orotraqueal ........................................................................20
FIGURA 5 – Média + desvio padrão dos pesos do estudo piloto ...........................22
FIGURA 6 – Média + desvio padrão da área do ventrículo da diástole e volume
diastólico do estudo piloto..................................................................22
FIGURA 7 – Média + desvio padrão da área do ventrículo da sístole e volume
sistólico do estudo piloto ....................................................................23
FIGURA 8 – Média + desvio padrão da fração de ejeção do estudo piloto ............23
FIGURA 9 – Corte histológico normal de cardiomiócitos (coloração: HE – 100X)..24
FIGURA 10 – Núcleos Picnóticos de cardiomiócitos (coloração: HE – 20X)............24
FIGURA 11 – Hipertrofia da fibra muscular cardíaca (coloração: HE – 40X)............25
FIGURA 12 – Vacuolização intracitoplasmática de Cardiomiócitos (coloração: HE
– 40X) ................................................................................................25
FIGURA 13 – Fluxograma do projeto .......................................................................26
FIGURA 14 – Punção-aspiração da medula óssea .................................................27
FIGURA 15 – Esfregaço do sangue da medula óssea (coloração: Maygrunwal-
Giemsa – 40X) ...................................................................................28
FIGURA 16 – Anel formado de células-tronco mononucleares ................................29
FIGURA 17 – Momentos de realização das análises ecocardiográficas e
histopatológicas ................................................................................30
FIGURA 18 – Aparelho ecocardiográfico bi-dimensional..........................................32
FIGURA 19 – Imagem ecocardiográfica...................................................................32
FIGURA 20 – Microscópio óptico Olympus® RX 50 utilizado ...................................36
FIGURA 21 –Organograma do projeto de mestrado com a análise ecocardiográfica39
FIGURA 22 – Média + desvio padrão dos pesos dos grupos do experimentos nos
três momentos ..................................................................................41
ix
FIGURA 23 – Média da freqüência cardíaca dos grupos nos três momentos ..........41
FIGURA 24 – Volume diastólico do ventrículo esquerdo dos grupos pré-transplante
...........................................................................................................42
FIGURA 25 – Volume sistólico do ventrículo esquerdo dos grupos pré-transplante 43
FIGURA 26 – Fração de ejeção do ventrículo esquerdo dos grupos pré-transplante
...........................................................................................................44
FIGURA 27 – Volume diastólico do ventrículo esquerdo dos grupos .......................45
FIGURA 28 – Volume sistólico do ventrículo esquerdo dos grupos .........................46
FIGURA 29 – Fração de ejeção do ventrículo esquerdo dos grupos ........................47
FIGURA 30 – Células-tronco mononucleares transplantadas no coração
(coloração: HE aumento: 40x)............................................................48
FIGURA 31 – Organização das células-tronco mononucleares no coração
(coloração: HE aumento: 100x) ........................................................48
FIGURA 32 – Acúmulo celular no coração (coloração: HE aumento: 20x) ...............49
FIGURA 33 – Evidência de neo-vasos, lúmen e células endoteliais no coração
(coloração: HE aumento: 100x) .........................................................49
FIGURA 34 – Vaso, lúmen e células endoteliais em um corte histológico de
coração normal (coloração: HE aumento: 100x) ...............................49
FIGURA 35 – Marcação positiva do BrdU em imunohistoquímica (aumento: 40x) ...50
x
LISTA DE ABREVIATURAS
DNA: Ácido Dexoxiribonucleico.
RNA: Ácido Ribonucléico.
GM-CSF: Fator de Estimulação macrófago-granulócito.
SCF: Fator de Célula Tronco.
G-CSF: Fator de estimulação de colônia de granulócito.
CFU-F: Unidade Formadora de Colônia-fibroblasto.
F: Fraquência Cardíaca.
FE: Fração de Ejeção do Ventrículo Esquerdo.
VD: Volume Diastólico do Ventrículo Esquerdo.
VS: Volume Sistólico do Ventrículo Esquerdo.
AVD: Área do Ventrículo Esquerdo na Diástole.
AVS: Área do Ventrículo Esquerdo na Sístole.
H&E: Hematoxilina e Eosina.
PVPI: Polivinilpirrolidona-iodo.
SBF: Soro Bovino Fetal.
DMSO: Dimetil Sulfóxido.
PBS: Phosphate Buffered Saline.
IMDM: Iscove´s Modified Dulbecco´s Media.
BRDU: Bromodeoxiuridina
xi
RESUMO
INTRODUÇÃO: As células-tronco derivadas da medula óssea (CTM) apresentam grande potencial terapêutico para regeneração tecidual. Pouco se tem estudado sobre o transplante celular com relação à cardiomiopatia não isquêmica dilatada. O antinéoplásico cloridrato de doxorrubicina é muito utilizado e com extrema cautela devido a seu potencial cardiomiopata. OBJETIVO: Avaliar o efeito do transplante autólogo de células-tronco mononucleares da medula óssea na miocardiopatia induzida pela doxorubicina. MÉTODO: As CTM foram isoladas conforme a técnica descrita por Böyum e criopreservadas. Os ratos receberam por via peritonial, uma dose acumulativa de 15mg/kg de doxorrubicina por 2 semanas, em dias intercalados. Após 2 semanas de espera, após a aplicação da doxorrubicina, os animais foram randomizados em dois grupos, onde o grupo estudo (n=11) recebeu CTM autóloga e o grupo controle (n=12) recebeu PBS (tampão fosfato salina). Foi realizado exames ecocardiográficos e avaliação histopatológica. Os parâmetros ecocardiográficos avaliados pré e pós o transplante foram: volume diastólico, volume sistólico e fração de ejeção do ventrículo esquerdo. . RESULTADOS: Dos animais sobreviventes, n=5 para o grupo estudo e n=6 para o grupo controle, os resultados ecocardiográficos foram estatisticamente significante entre os grupos, Dentre os achados histopatológicos pós-transplante demonstraram em ambos os grupos a presença de vacuolização celular, núcleos picnóticos e área de fibrose intersticial. Além disso, observou-se no grupo estudo um rearranjo das CTM, indicativo de neoformação de vasos. CONCLUSÃO: O transplante de CTM em cardiomiopatia induzida por doxorrubicina, não foi efetivo funcionalmente se comparado com o grupo controle, porém análises histopatológicas indicam neoformação de vasos entre os cardiomiócitos no grupo transplantado com células-tronco mononucleares da medula óssea. Palavra chave: doxorrubicina, células-tronco, miocardiopatias, transplante, ratos.
xii
ABSTRACT
INTRODUCTION: The bone marrow derived stem cell (BMSC) has a great therapeutic potential for the myocardial regeneration. Few studies of cell transplantation in a non-ischemic dilated cardiomyopathy have been published. The anti-neoplasic drug doxorubicin chlorydrate is very used with extreme caution for being a potential cardiomyopathy. OBJECTIVE: To evaluate the effect of autologous bone marrow stem cell mononuclear transplant in doxorubicin – induced cardiomyopathy. METHOD: the BMSC has been isolated accordingly the technique described by Böyum and cryopreserved. The animals received by intraperitoneal administration, 15mg/kg of doxorubicin for two weeks on intercalated days. After four weeks of doxorubicin application, the animals were divided in two groups, when study group (n=11) had received BMSC and the control group (n=12) had received PBS (phosphate saline). Echocardiography and histopathology parameters were analyzed. The echocardiography parameters analysed before and after drug administration were: diastolic volume, systolic volume and ejection fraction of the left ventricle. RESULTS: The survival animals, n=5 from the study group and n=6 from the control group, the echocardiographic results weren’t significant among the groups. The histopathologic analysis post transplantation had shown the presence of the vacuolization cellular, nucleous picnotics and fibrosis interstitial. A re-arrangement had been observed on the study group of BMSC, indicating the new formation of vessels. CONCLUSION: the BMSC transplant in induced cardiomyopathy by doxorubicin wasn’t effective functionally if compared to the control group, however histopathologics analyzes indicate the new formation of the vessels among the cardiomyocytes. Key Words: Doxorubicin, Stem-Cells, Myocardial Diseases, Transplantation, Rats.
xiii
1
1 INTRODUÇÃO
A biotecnologia médica surge como ciência promissora do século
XXI expondo um novo conceito de cura para pacientes que esperam em filas
de transplante de órgãos por uma chance de sobrevivência ou mesmo, uma
terapia conjunta para potencializar sua melhora.
A Engenharia de Tecidos que apresenta potencial de uma nova
terapia, está revolucionando a área médica e prometendo ser a responsável
pelo principal avanço nos próximos anos, oferecendo esperanças aos
pacientes.
Das enfermidades que estão sendo estudadas, serão beneficiadas
as doenças auto-imunes, nas quais o sistema de defesa do organismo entra
em disfunção; como a diabetes, doença considerada incurável; como também
lesões no sistema nervoso (doença de Parkinson e epilepsia); mas o sucesso
mais relevante, por enquanto, tem sido conseguido no combate as doenças
cardiovasculares.
Estudos extensivos já foram realizados em diferentes áreas de
terapia celular: com a cardiomioplastia celular, no transplante de medula óssea
em pacientes com leucemia1, no transplante de ilhotas de Langerhans para a
diabete tipo I 2, transplante de mioblastos na Distrofinopatia de Duchenne 3,
transplante de hepatócitos em pacientes portadores de insuficiência hepática4
e transplantes de células neurais na terapêutica das doenças neuro-
degenerativas como a Doença de Parkinson 5. No entanto é na área cardíaca
que os resultados demonstraram ser mais promissores, sobretudo nas
miocardiopatias isquêmica: crônica e aguda.
As doenças cardíacas são as responsáveis pelas maiores
morbidade e mortalidade no mundo. No Brasil, morrem em média 300 mil
pessoas por ano, segunda a Sociedade Brasileira de Cardiologia. Os números
de transplantes realizados no ano de 2005 chegam a 110. No Paraná foram
realizados 16 transplantes cardíacos versus 60 pacientes que se encontram na
fila de espera. Especificamente para a insuficiência cardíaca há 240 mil novos
casos ao ano, sendo a terceira causa de internamento pelo SUS, e para o
2
grupo de pacientes mais graves o tratamento existente atualmente é somente o
transplante cardíaco 6.
Importante salientar que a alta mortalidade devido à disfunção cardíaca
e o baixo número de doadores de órgãos como o do coração demandam
pesquisas constantes para encontrar novas alternativas de tratamento e
recuperação da falência miocárdica 7 .
O uso de células-tronco propõe repor células destruídas em decorrência
do infarto no miocárdio ou de reações inflamatórias, se adaptando no tecido
hospedeiro, objetivando a recuperação da função contrátil como a de
desenvolvimento de novos vasos para melhorar a perfusão sangüínea na área
lesada. Esta técnica proporciona uma tentativa de tratar junto à disfunção do
coração na sua origem, que é a perda das células contráteis ao músculo
cardíaco. Além de ser uma alternativa mais econômica do que transplante
cardíaco é também uma técnica sem riscos de rejeição porque utiliza células
autólogas 8.
Existem vários tipos celulares que estão sendo requisitadas para
recuperar a capacidade de contração do miocárdio: são células do músculo
esquelético (mioblastos) – primeira célula a ser utilizada com capacidade
conhecida de regeneração; células co-cultivadas; mesenquimais; células-
tronco mononucleares; as células-tronco adultas; as células mesoteliais; as
células-tronco derivadas de tecido adiposo; cardiomiócitos fetais e células-
tronco embrionárias 9. As duas últimas apresentam controvérsias éticas.
As células-tronco apresentam grande potencial terapêutico para a
insuficiência cardíaca por apresentar propriedades exclusivas: potencial de
diferenciação em qualquer tipo celular (pluripotência) e capacidade de se dividir
(clonogênica). As células-tronco embrionárias são aquelas isoladas até o quinto
dia de fecundação (blastocisto), têm a capacidade de diferenciar-se em
qualquer tipo de tecido do organismo (totipotente), inclusive nos tecidos
germinativos e placentários. Após este período, as células reduzem a sua
capacidade de replicação, mas mantêm a sua plasticidade. Quanto mais
precoces são as células, maior o potencial proliferativo e de adaptação ao
tecido transplantado 10.
As células-tronco adultas são pluripotentes encontradas em vários sítios
do organismo. O sítio mais freqüente é o sangue da medula óssea, e dentre
3
este a medula óssea da crista ilíaca é a região preferencial, devido ao fácil
acesso e maior volume de sangue. No sangue da medula óssea existem vários
componentes: o sangue periférico e as células mononucleares. As células
mononucleares se dividem em duas linhagens: linhagens hematopoiética (1-
2%) e mesenquimal (0,01- 0,05%) 11.
A linhagem hematopoiética apresenta: as células progenitoras
hematopoiéticas e as células progenitoras endoteliais. A linhagem
mesenquimal: as células-tronco mesenquimais. As células-tronco
mesenquimais, também chamadas de estromais, apresentam potencial de
diferenciação em diversos tecidos de origem do mesênquima como: ossos,
cartilagem, adipócitos, tendões e músculos12.
Tanto os progenitores hematopoiéticos quanto mesenquimais são
capazes de promover regeneração tecidual quando liberados na circulação 13.
Experiências in vitro com células-tronco mesenquimais derivadas do
mesênquima da medula óssea demonstram que quando cultivadas em
determinadas condições diferenciam-se em células contráteis, contribuindo a
regeneração de áreas lesadas do miocárdio 14 15.
Estudo realizado com pacientes onde um grupo de dez pacientes
recebeu terapia padrão e outro grupo recebeu a terapia padrão mais
transplante de células-tronco cultivadas “in vitro” e comparando-se resultados
funcionais, demonstrou que o grupo transplantado apresentava melhora
significativa na funcionalidade e contratibilidade cardíaca. Atribui-se a melhora
às angiogênese e cardiomiogênese obtidas das células transplantadas 16.
Por outro lado, a terapia por transplante de células-tronco
mononucleares da medula óssea em pacientes após infarto agudo do
miocárdio, tem demonstrado resultados satisfatórios, sugerindo que estes tipos
de células podem contribuir para o restabelecimento funcional do miocárdio 17 18 19 20 21
.
Além de todos os resultados experimentais e humanos já demonstrados,
as células-tronco adultas da medula óssea apresentam as vantagens de fácil
obtenção, origem autóloga, fácil expansão in vitro, potencial de diferenciação
em múltiplas linhagens e sensibilidade elevada a moléculas sinalizadoras
específicas 22 .As pesquisas dos processos regenerativos no miocárdio através
das células-tronco, reparando o músculo e havendo angiogênese, expõe a
4
engenharia tecidual como alternativa promissora de terapia na área
cardiológica.
Os experimentos citados sugerem que esta nova terapia celular possa
recuperar a estrutura e função do coração debilitado, o que motivou a
elaboração desse projeto de pesquisa, com o objetivo de discutir, expondo um
novo modelo de doença miocárdica: a miocardiopatia dilatada não isquêmica
induzida por medicamento.
Uma possibilidade de induzir a cardiomiopatia é através do efeito tóxico
de certas drogas que interferem na organização celular do músculo cardíaco.
Muitas destas drogas são utilizadas como terapêuticas para doenças diversas.
Algumas destas drogas são: furazolidina, etanol, antraciclinas (daunorrubicina
e doxorrubicina), 5-fluorouracil, entre outras 23. A utilização do medicamento
doxorrubicina para indução desta doença foi escolhida em função de seu uso
regular na terapêutica anti-neoplásica.
1.1 OBJETIVO
1.1.1 Objetivo Geral Avaliar os efeitos do transplante autólogo de células-tronco mononucleares da
medula óssea na cardiomiopatia induzida pela doxorrubicina.
1.1.2 Objetivos Específicos Avaliar ecocardiográficamente e histopatológicamente a indução da
cardiomiopatia pela doxorrubicina.
Comparar as alterações histopatológicas entre os grupos: estudo e controle
após trinta dias.
Testar a hipótese de que o transplante celular autólogo com células-tronco
mononucleares altera os parâmetros funcionais ecocardiográficos.
5
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 DOXORRUBICINA
2.1.1. Descrição
A doxorrubicina (ou adriamicina), utilizada desde 1960, surgiu com a
promessa de ser uma droga poderosa para a área médica oncológica, mas por
apresentar grande toxicidade em vários órgãos, foi limitado o seu uso no
tratamento de muitos carcinomas 24.
Esta substância é um antibiótico antracíclico (figura 1) isolado da cultura
do fungo Streptomyces peucetius var. caesius , utilizado com grande êxito na
regressão de várias neoplasias como carcinomas de mama, pulmões, bexiga,
tireóide e também carcinomas ovarianos; sarcomas ósseos e dos tecidos
moles, linfomas de Hodgkin e não Hodgkin, neuroblastoma, tumor de Wilms e
leucemia linfoblástica aguda 25 26. Outros tipos de câncer como o gástrico, de
fígado, do ducto biliar, o pancreático e endometrial, que respondem menos à
droga, ainda estão sendo tratados com a doxorrubicina devido aos benefícios
aceitáveis ao paciente 24 27.
O anel da antraciclina é lipolítico, mas a extremidade saturada do
sistema de anéis contém grande quantidade de grupos hidroxila, juntamente
com aminoaçúcares, formando um centro hidrofílico. Devido a esta
propriedade, a molécula é anfotérica, apresentando características ácidas no
grupo fenólico do anel e características básicas no grupo dos aminoaçúcares.
Com isto sua passagem na membrana plasmática é facilitada e sua
permanência no corpo é relativamente longa 28. Além disso, apresenta um anel
de quinona e de hidroquinona em anéis adjacentes, que lhes permite funcionar
como aceptor e doador de elétrons. A importância principal é dada ao anel de
quinona, porque é um potente gerador de radicais livres. A redução por um
elétron deste anel leva a formação de radicais relativamente estáveis,
chamados radicais livres de semiquinonas, ativados pela enzima mitocondrial,
6
NADH desidrogenase 29. As reações intramoleculares de transferências de
elétrons intermediários das semiquinonas resultam na produção de outros
radicais e, por conseguinte, de compostos alquilantes potentes. O fator
proposto, responsável por esta toxicidade inclui O2-, H2O2, ferro, OH e cálcio 30.
A produção de radicais livres altamente reativos e tóxicos é
significativamente estimulada pela interação da doxorrubicina com o ferro 31.
Estes radicais de quinona e semiquinonas são relativamente estáveis
em condições anaeróbias, mas sobre condições aeróbicas há
desemparelhamento de elétrons, doando oxigênio, havendo a formação de
radicais superóxidos e radicais hidroxilas 32 33 34 35. A redução de oxigênio para
formação de superóxido é uma reação regenerativa, juntamente com a
molécula de doxorrubicina. Isto gera uma seqüência de reações, formando um
ciclo redox, que causa muitos danos às células expostas 28.
Figura 1- Estrutura química do Cloridrato de Doxorrubicina.
2.1.2 Mecanismo de Ação
O mecanismo de ação antitumoral da doxorrubicina envolve a inibição
da enzima topoisomerase II (responsável pela abertura do DNA) e RNA
polimerases, relacionadas com a síntese de DNA e proliferação celular. A
doxorrubicina se liga aos ácidos nucléicos pela intercalação específica do
7
núcleo planar da antraciclina com a dupla hélice do DNA, ocorrendo quebras
uni ou bifilamentares, bem como trocas entre cromátides irmãs.
A presença da doxorrubicina e dos radicais livres formados são
responsáveis pela quebra do DNA originando distúrbios sérios na estrutura
terciária do DNA 36. Esta droga é ativada durante todo o ciclo celular, incluindo
na interfase. Sua toxicidade máxima ocorre durante a fase S do ciclo celular e
as células morrem na fase G2.
Além disto, apresenta atividade sobre a membrana lipídica celular,
permitindo à molécula se ligar à membrana celular bem como às proteínas
plasmáticas, podendo alterar suas funções. Com isto desempenha um papel
importante nas ações tumorais, contudo também é responsável pela
cardiotoxicidade da droga 37.
Um estudo realizado com células cultivadas demonstram que ocorre
uma rápida penetração da doxorrubicina nas células e sua localização ocorre
principalmente na cromatina perinuclear e nas mitocôndrias. Observa-se rápida
inibição da atividade mitótica, síntese do ácido nucléico e alterações na
produção de energia 38.
Células tratadas com doxorrubicina têm manifestado alterações nas
características morfológicas associadas a apoptose 30.
2.1.3 Cardiotoxicidade
A doxorrubicina apresenta muitos efeitos colaterais imediatos, tais como
náusea, vômito, febre, diarréia, arritmia, alopécia, flebite e mucosas com
inflamação todas reversíveis ou com clínica conhecida 39. Os efeitos colaterais
mais sérios do tratamento exigem longo prazo para desaparecem, como
nefropatia, mielossupressão e principalmente a cardiomiopatia, que na maioria
das vezes é irreversível.
Dando especial atenção as cardiomiopatias, podemos descrevê-las
como sendo grupo de doenças cardíacas crônicas primárias ou secundárias,
podendo evoluir para uma severa insuficiência cardíaca, levando a um possível
óbito. Conseqüentemente ocorrem danos funcionais e interferências na função
contrátil do músculo cardíaco. Esta incapacidade do coração em bombear
8
sangue e por conseqüência oxigênio, em quantidade adequada para nutrir as
necessidades do metabolismo tissular dos seres humanos, tanto no repouso,
como no exercício, leva a uma insuficiência cardíaca e determina uma
disfunção ventricular resultando em anormalidades onde vários mecanismos
celulares estão envolvidos. Há uma perda de cardiomiócitos por necrose
celular e apoptose, havendo também alterações estruturais nestes,
determinando a hipertrofia celular e alterações ultra-estruturais. Estas
alterações interferem no padrão da matriz extracelular, anormalidades no
complexo contração-excitação, deficiência na utilização de energia e da
responsividade neuro humoral celular. Todos estes mecanismos contribuem de
forma isolada ou associada a uma falência cardíaca 8.
Com relação à cardiotoxicidade da doxorrubicina, o prognóstico das
complicações cardiomiopatas geralmente é grave. Esta cardiomiopatia pode se
desenvolver a posteriori, podendo ser identificada 4 a 20 anos depois do
término da terapia, devido à dose acumulativa administrada no paciente 40 24.
Estima-se que a probabilidade de prejuízo da função miocárdica varie de 1 a
20%, dependendo da dose acumulativa total da droga. Entretanto, outros
autores elevam estes valores de 1 a 30% de comprometimento do miocárdio 41 42
.
A cardiotoxicidade da doxorrubicina foi pela primeira vez reportada em
1970, e desde então estudos extensivos têm sido realizados para entender sua
fisiopatologia e prevenir suas conseqüências 43. Vários mecanismos
bioquímicos já foram utilizados para justificar a cardiotoxicidade, que leva ao
desenvolvimento de uma cardiomiopatia e possível insuficiência cardíaca.
Singal e colaboradores demostraram em seu trabalho tais mecanismos,
os quais podem ser: inibição da replicação de ácidos nucleicos e síntese de
proteinas 44 45 e liberação de aminas vasoativadoras, 46 mudanças nas funções
adrenérgicas, 47 anormalidades nas mitocôndrias,48 redução da atividade
enzimática de antioxidante 49 e apoptose 50 51.
A ação da droga no coração é evidenciada pela formação de radicais
livres envolvidos com sua estrutura química, ação redox da droga,
conseqüentemente gerando estresse oxidativo, aumentando injúria celular,
conduzindo a variadas mudanças celulares no miocárdio, incluindo perda lenta
de miofibrilas, vasta vacuolização, e alterações mitocôndriais. Além disto, a
9
doxorrubicina é responsável pela diminuição dos níveis de antioxidantes
endógenos, que apresentam função de retirar da circulação os radicais livres
circulantes. Em conseqüência da diminuição de níveis de antioxidante, há um
estresse oxidativo, desenvolvendo uma cardiomiopatia e insuficiência cardíaca.
Esta cardiomiopatia pode ser piorada com a evolução da idade, onde os
mecanismos compensatórios já não agem tão bem.
Um dos motivos porque o músculo do coração é muito suscetível à
oxidação, é a presença de níveis baixos de catalase nos cardiomiócitos e
rápida inativação da glutationa peroxidase-1 (GPx1) dependente de selênio 52.
Há um acúmulo da droga nas organelas citoplasmáticas, principalmente nas
mitocôndrias dos cardiomiócitos. A concentração intracelular da doxorrubicina é
duas vezes mais alta que a concentração extracelular de células em cultivo.
Em uma pesquisa clínica, foi demonstrado que a concentração plasmática da
droga é de 0,5 – 1 μΜ, sendo que a concentração intra mitocondrial é de
aproximadamente 50 - 100μM 30 .Sabe-se que as mitocôndrias são as
primeiras a sofrerem sinais da toxicidade.
Observou que a produção de peróxido de hidrogênio, vinda do ânion
superóxido, é responsável pela indução de apoptose em células endoteliais e
cardiomiócitos. A mitocôndria apresenta papel de reguladora apoptótica,
mediante o mecanismo relacionado com o citocromo C que resulta na ativação
das caspases e subseqüente morte celular. As mitocôndrias respondem com
severos sinais como: formação de espécies reativas de oxigênio, alterando
estado redox e aumentando nos níveis de cálcio, desencadeando a ativação
das caspases. A liberação do citocromo C pelas mitocôndrias no citosol pode
resultar em ativação da caspase-9, responsável pela ativação do efeito das
outras caspases, induzindo a morte celular 52.
Há dois tipos de cardiomiopatia tóxica: (1) a forma aguda, caracterizada
por alterações elétrocardiográficas: distúrbios de repolarização e do ritmo,
havendo uma manifestação exagerada de lesão miocárdica 53; (2) e a forma
crônica decorrente do acúmulo de doses sucessivas da doxorrubicina que
manifesta-se por insuficiência cardíaca congestiva. O índice de mortalidade é
superior a 50%. A toxicidade miocárdica pode ser causada por uma dose total
de doxorrubicina de apenas 250mg/m2, conforme demonstrado por biópsia. A
freqüência de cardiomiopatia grave é de 1 a 10% com doses totais inferiores a
10
450mg/m2. O risco aumenta sobremaneira (para mais de 20% dos pacientes)
com doses totais superiores a 550mg/m2, de modo que esta posologia total não
deveria ser ultrapassada, a não ser em circunstâncias excepcionais.
2.2 TERAPIA CELULAR NA CARDIOLOGIA
A medicina vem sofrendo modificações nos últimos anos, devido a
pesquisas promissoras que identificam linhagens celulares com potencialidade
de diferenciação em diversos tipos celulares.
A principal proposta desta linha de pesquisa na cardiologia é abordar a
causa principal da disfunção, a perda de cardiomiócitos. Esta terapia está
sendo empregada principalmente em casos de cardiomiopatias isquêmicas
aguda e crônica, mas outras diferentes etiologias também estão sendo
estudadas como a cardiomiopatia dilatada decorrente da doença de Chagas.
A proposta é utilizar diferentes células para reconstruir o tecido cardíaco
e encontrar a que melhor se adapte a estas novas funções, tanto a de
contração como a de desenvolver novos vasos para melhorar a perfusão
sangüínea na área lesada.
As pesquisas com células foram inicialmente investigadas utilizando
cardiomiócitos fetais para reparo da área infartada em modelo experimental54
.Em seguida, outras pesquisas experimentais avaliaram os efeitos do
transplante de cardiomiócitos fetais versus mioblastos esqueléticos (células
satélites) bem como células-tronco com potencial cardiomiogênico 55 56 57 58 59 60 61 62 63
. Há também estudos associando dois tipos celulares em co-cultivo de
mioblastos esqueléticos e células-tronco mesenquimais para a regeneração
angio-muscular 64.
Busca-se então o conceito da célula ideal para transplante, tendo que
apresentar a capacidade de diferenciar-se em músculo cardíaco ou/e em vasos
sangüineos; e adequando-se ao tipo celular proposto e a etiopatogenia da
miocardiopatia. A célula-tronco por seu potencial clonogênico é um dos tipos
celulares, mais destacado 65.
As promissoras pesquisas com células-tronco mononucleares da medula
óssea apontaram a possibilidade de promover a angiogênese em torno da
11
cicatriz do infarto a fim de limitar o crescimento da área isquêmica. Os
resultados demonstraram a indução de angiogênese, prevenindo o
remodelamento e a falência cardíaca.
O tratamento com células-tronco mesenquimais versus mioblastos em
cardiomiopatia isquêmica crônica em ratos, demonstrou miogênese e aumento
da função ventricular em contraste com as células-tronco mesenquimais que
demonstraram angiogênese e ausência de efeitos funcionais 66.
Pesquisas em cardiomiopatia não isquêmica foram realizadas através de
indução por drogas, como o antineoplásico, cloridrato de doxorrubicina em
coelhos. Os pesquisadores obtiveram resultados satisfatórios no transplante de
células tronco mesenquimais, onde foi observado uma melhora funcional 67.
Na busca de aperfeiçoar tipos celulares para terapia, pesquisas
correlacionando variadas funções de diversos tipos celulares, e até a utilização
de dois tipos diferentes celulares em co-cultivo foram transplantadas:
mioblastos esqueléticos e células-tronco mesenquimais. Os resultados com
este modelo demonstram ser superiores funcionalmente quando comparados
com os mesmos tipos celulares transplantados isoladamente, superando as
expectativas do ponto de vista histológico: regeneração angio-muscular. Este
modelo foi estudado nas cardiomiopatias crônicas: isquêmica 68 65 69 e dilatada
chagásica 67. Tais células são de fácil obtenção, autólogas e facilmente
expandidas “in vitro” 23.
2.3 CÉLULAS-TRONCO MONONUCLEARES
2.3.1 Origem
Durante o desenvolvimento embrionário, os diferentes tipos de células
são determinados, dando origem a um organismo multicelular complexo. No
período após o crescimento, as células podem limitar a sua capacidade
12
proliferativa com certas restrições moduladas e sua característica específica
permanece possivelmente fixada na expressão gênica. A proliferação celular
ocorre, mas não mais com a eficiência e rapidez de um organismo embrionário
ou fetal.
A maioria das células-tronco adultas mantém a mesma taxa de
proliferação e caráter especializado, mesmo transferindo-a em um novo
ambiente. Porém, as células especializadas podem retomar um potencial
proliferativo, mas de forma limitada. Em um tecido adulto, surgem
freqüentemente células diferenciadas devido a continua renovação celular,
originárias de duas fontes: formar-se pela simples duplicação de células
diferenciadas, que se dividem para dar outras células filhas do mesmo tipo; ou
elas podem ser geradas a partir de células-tronco relativamente indiferenciadas
por um processo que envolve situações pouco conhecidas apresentando um
direcionamento do seu fenótipo celular para um fenótipo semelhante ao tecido
que sofreu injúria.
Estas células-tronco são encontradas na maioria dos órgãos, mas o local
mais freqüente é o sangue da medula óssea, e dentre este a medula óssea da
crista ilíaca é a região preferencial de coleta, devido ao volume maior de
sangue e fácil acesso.
2.3.2 Classificação
As células-tronco apresentam notada capacidade de originar tecidos a
partir de sua forma indiferenciada. Estas células em seus sítios passam do
estado quiescente, diferenciando-se em tipos celulares diversos quando
necessário.
Existem dois tipos de células-tronco: as células-tronco embrionárias e as
células-tronco adultas.
As células-tronco embrionárias originam da massa celular interior do
blastocisto (do 4º ao 5º dia) nos estágios iniciais de desenvolvimento e
apresentam capacidade de compor todos os tecidos, incluindo as células
13
germinativas e tecido placentário, possuindo um grande potencial de
transformação, consideradas totipotentes.
As células-tronco adultas são pluripotentes e surgem na fase tardia da
embriogênese e do desenvolvimento fetal. Podem fornecer cópias idênticas
delas mesmas por longo período de tempo ou podem também dar origem a
vários tipos celulares maduros que possuam características especializadas.
Sua função é manter o estado de homeostase do organismo e dos tecidos,
preservando as suas funções, através da reposição de células destruídas por
lesões ou doenças.
As células-tronco oriundas do cordão umbilical são também
consideradas adultas, pois são retiradas do recém nascido à termo; no entanto
com o diferencial de uma capacidade proliferativa maior do que as células-
tronco adultas de um indivíduo adulto, porém podem apresentar potencial de
teratogenicidade 70.
2.3.3 Células-tronco da Medula Óssea
As células mononucleares da medula óssea apresentam linhagens
celulares distintas tendo funções específicas: as células-tronco
hematopoiéticas, células progenitoras endoteliais e células-tronco não
hematopoiéticas 71.
As células-tronco hematopoiéticas de (1-2%) apresentam a função de
dar origem a componentes do sangue. Já as células progenitoras endoteliais
apresentam função de secretar diversos fatores de crescimento endotelial,
promovendo angiogênese nos tecidos patológicos72. As células-tronco não
hematopoiéticas demonstram grande plasticidade e aderência nos frascos de
cultivo e foram primeiramente descritas como células estromais, mas muito
recentemente elas têm sido designadas como células-tronco mesenquimais
(<0,05%), porque é delas a capacidade para diferenciação para linhagens
mesodermas: miogênicas, osteogênicas, condrogênicas e adipogênicas11.
Além disto, as células-tronco mesenquimais são capazes de diferenciar em
células não mesenquimais incluindo células do fígado e células da glia. Muito
14
recentemente, foram observadas células-tronco de medula óssea se
diferenciando em células neuronais “in vitro” 73 74 75.
Diferenças importantes ocorrem entre as células-tronco mesenquimais e
as hematopoiéticas. Embora estes dois tipos celulares são de fácil obtenção in
vitro e seus isolamentos são realizados por gradiente de concentração, as
células-tronco mesenquimais apresentam alta capacidade de aderência em
superfícies plastificadas, o que ajuda na distinção destas células 76.
Uma das considerações que deve ser feita também é a propriedade que
as células-tronco mesenquimais apresentam de se diferenciarem de meio para
meio. Ela deve se diferenciar em fibroblasto se implantarmos em regiões
fibróticas. Assim, revela-se a importância da implantação no microambiente. A
aparente transdiferenciação das células-tronco deve ter dois caminhos: a célula
fusiona com células do parênquima, ou então as células-tronco apresentam
específica função de diferenciação 77.
As extensas pesquisas referentes às células-tronco oriundas da medula
óssea projetam seus benefícios na regeneração tecidual, bem como na
formação de novos vasos sanguíneos, o que motiva pesquisadores a realizar
exaustivas pesquisas experimentais e clínicas na tentativa de efetivar seu uso
nas terapias de diversas doenças 8 .
2.3.4 Uso Terapêutico: Reparo do Miocárdio
Grande parte das pesquisas básicas e descobertas sobre células-tronco
foram realizadas em modelos animais, principalmente em camundongos. Em
1867, o patologista Cohnhein sugeriu pela primeira vez a existência de células
não hematopoiéticas na medula óssea. Em 1970, Friedenstein e colaboradores
consolidaram a hipótese, demonstrando a capacidade de aderência das células
estromais da medula óssea, cultivadas em frascos de plásticos, e que estas
células aderentes possuíam pluripotencialidade e rápida diferenciação em
tecidos mesenquimais 75 .
15
Estudos “in vitro”, demonstram que células-tronco da medula óssea
diferenciam-se em cardiomiócitos, quando extraídas de ratos e colocadas em
cultivo. Sob cultura observou-se formação de miotubos e contração
espontânea, após adição de 5-azactidina 78.
Embora controverso, estudos realizados utilizando células da medula
óssea demonstraram a ocorrência de diferenciação cardiomiogênica das
células-tornco da medula óssea quando transplantadas bem como sua
sobrevivência e efeitos funcionais do tecido miocárdio após infarto 18.
O transplante de células cultivadas ou não em tecidos cardíacos
lesados tem sido proposto como uma alternativa para tratamento de
insuficiência cardíaca, principalmente pós-infarto, limitando a extensão do
tecido cicatricial 79.
Uma das possibilidades sugeridas é que o transplante de células-tronco
pluripotentes, as quais têm potencial de mutiplicação e diferenciação em
células contráteis e células endoteliais na cicatriz do infarto, promovam uma
angiogênese e uma capacidade de regeneração tecidual 80.
Os resultados levaram a crer que, na medula óssea, tanto precursores
hematopoiéticas quanto os mesenquimais são capazes de promover
regeneração cardíaca. Podem ser obtidas por punção medular ou isoladas do
sangue periférico. Diferentes modos têm sido propostos e utilizados para
promover a chegada de células-tronco no miocárdio, tais como: injeção
intravenosa periférica, injeção intracoronária e injeção intramiocárdica; além da
mobilização de angioblastos autólogos da medula óssea por citoquinas e
diversos fatores de crescimento (fator de estimulação macrófago-granulácito-
GM-CSF, fator de célula tronco-SCF, fator de estimulação de colônia de
granulôcitos-G-CSF, unidade formadora de colônia-fibroblasto-CFU-F) para
auxiliar na revascularização do miocárdio. A terapia celular em conjunto com
terapias tradicionais, oferece potencial de melhora aos pacientes 81 82.
Como toda nova terapia, muitas perguntas estão sendo feitas e ainda
poucas respostas estão sendo obtidas. Questiona-se muito o tipo de célula que
melhor se adaptaria em transplante celular no coração, qual a melhor via de
administração destas células, qual a linhagem mais eficiente na área lesada,
quais as células precursoras que estariam envolvidas na possível melhora da
16
função cardíaca, quais doenças cardíacas poderiam ser beneficiadas com esta
terapia.
17
3 MÉTODOS 3.1 AMOSTRA
Todos os animais receberam cuidados em concordância com os
Princípios de Cuidados com Animais de Laboratório, formulado pela Sociedade
Nacional de Pesquisa Médica e Guia de Cuidados com animais de laboratório,
preparada pela Academia Nacional de Ciências e publicado pelo Instituto
Nacional de Saúde. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
da Pontifícia Universidade Católica do Paraná (registro na CEPA/PUCPR N°
66), com animais provenientes do biotério da PUC - PR, segundo os princípios
do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA,1999).
Para a realização deste projeto de pesquisa foram utilizados 70 ratos
machos (Rattus Norvegicus Albinus. Rodentia Mammalia), da linhagem Wistar,
com idade aproximada de 3 meses, com pesos variando de 240 a 360g.
3.2 CUIDADOS GERAIS PARA OS ANIMAIS
3.2.1 Condições do Biotério
Os animais experimentais foram acomodados no Biotério da Pontifícia
Universidade Católica do Paraná. No biotério foi fornecida água ad libitum,
rações (Nuvilab CR-1®, Nuvital, Colombro – PR, Brasil) foram alojados em
caixas com grade, com no máximo cinco animais em cada caixa. Esta foi
mantida uma jornada de 12 horas com luz e 12 horas no escuro, sob sala
submetida a aquecimento. O cepilho foi trocado em dias alternados.
18
3.2.2 Condições de Laboratório
O isolamento do material foi obtido pela técnica de punção-aspiração e
foram realizados os seguintes processos: o isolamento de células-tronco
mononucleares, o congelamento, a armazenagem em nitrogênio, o
descongelamento e o preparo das células-tronco mononucleares para o
transplante. Os procedimentos foram realizados no Laboratório Experimental
de Cultivo Celular – PUC - PR
Todos estes procedimentos foram executados sob condição asséptica
em cabine de segurança biológica classe II, sendo todas as soluções utilizadas
no processo foram rigorosamente controladas quanto à esterilidade e
composição.
3.2.3 Pesagem
Os animais foram pesados durante três períodos, sempre antes da
realização do exame da ecocardiografia. Os períodos são os seguintes: basal;
pré - transplante e pós - transplante.
Foi utilizada balança de precisão marca (Marte modelo ASF11), com três
casas decimais e sensibilidade de 0,01g aferida pelo Instituto Nacional de
Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial (Inmetro).
3.2.4 Anestesia
Todos os animais foram submetidos à anestesia geral com a associação
de 50mg/kg/peso de ketamina (sedativo e bloqueador neuro-
muscular),(Ketalar® Laboratorios Parke & Davis) e 10mg/kg/peso xilazina
(sedativo e analgésico), (Xilazina ®) ambos via intramuscular83. Para
19
certificação do efeito da anestesia, foi observada a ausência de reflexo neuro-
muscular.
3.2.5 Ventilação
Foram utilizados dois respiradores a volume (HARVARD®, Inc.,
respirador modelo 683, Massachusetts, USA) para animais de pequeno porte
com oxigênio a 21% (ar ambiente) (figura 2).
Figura 2- Respirador a volume utilizado .
3.2.6 Materiais Operatórios
Os materiais utilizados para punção-aspiração do sangue da medula
óssea da crista ilíaca e transplante do animal, bem como para o transplante
das células-tronco mononucleares foram: pinças vasculares, portas-agulhas,
tesouras, auto-estático pequeno, e fio monofilamentar de náilon 4.0, seringas,
heparina, agulhas, gases, luvas cirúrgicas, polivinilpirrolidona-iodo (Povidine) e
solução salina (soro fisiológico 0,9%) (figura 3).
20
Figura 3 - Material operatório utilizado.
3.2.7 Sistema de Ventilação Mecânica
Após anestesia, a via aérea definitiva foi obtida através da intubação
orotraqueal (figura 4) com cateter venoso periférico número 14. O cateter foi
conectado ao sistema de ventilação mecânica com volume de 2,5mL com
freqüência de 50 ciclos por minuto observando-se a expansão dos pulmões.
Esta técnica foi utilizada para o transplante de células-tronco mononucleares
da medula óssea.
Figura 4 – Intubação orotraqueal.
21
3.2.8 Eutanásia
Todos os animais que foram submetidos a eutanásia receberam a dose
letal (DL50) (148 mg/kg) do anestésico ketamina 84.
3.3 ESTUDO PILOTO
Embora a literatura já descreva dados basais da patologia induzida pela
doxorrubicina necessário para começarmos este projeto, opta-se por realizar
um estudo piloto para conhecer e estudar na prática a doença que esta droga
causa no animal rato Wistar. Foi satisfatório este estudo piloto, pois
proporcionou uma visão mais especifica do assunto e expôs as dificuldades
inerentes da estrutura deste projeto.
Com o objetivo de avaliar o efeito funcional e histopatológico da
doxorrubicina em vários momentos de aplicação em ratos, foi realizado o
projeto piloto determinando o melhor momento para transplante das células-
tronco mononucleares.
Oito ratos Wistar machos de peso médio 300g receberam por via intra
peritonial uma dose acumulativa de 15mg/kg de cloridrato de doxorrubicina por
duas semanas, em dias intercalados, sendo acompanhado o peso dos animais 85. A ecocardiografia foi realizada: antes da aplicação da droga, vinte e quatro
horas após a última dose, duas e quatro semanas após o término das
aplicações. Foram analisados: fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FE%),
volume diastólico final do ventrículo esquerdo (VDF), volume sistólico final do
ventrículo esquerdo (VSF), área do ventrículo esquerdo diastólico (AVD) e área
do ventrículo esquerdo sistólico (AVS).
Os resultados médios nos quatro momentos de avaliação foram
comprovados por análise de variância com medidas repetidas - ANOVA
(p<0,05).
Na análise histopatológica, seis ratos foram utilizados com a mesma
dosagem repetida, eutanasiados em quatro momentos e retirados fragmentos
transversais do coração e cortados em criostato. Logo após, corados por: H&E,
tricrômio de gomori e sírus red.
22
Os resultados demonstraram homogeneidade da média dos pesos
durante a aplicação da droga, ocorrendo ganho de peso duas semanas após a
aplicação, alcançando uma média de 329 g, e logo após este tempo, um
declínio considerável (figura 5).
Figura 5– Média+ desvio padrão dos pesos do estudo piloto.
A AVD e o VD final mantiveram os valores durante a aplicação da droga,
e logo após elevaram suas medidas significativamente (figura 6). O mesmo
aconteceu com a AVS e o VS final (figura 7).
Figura 6– Média+ desvio padrão da área do ventrículo na diástole e volume diastólico do estudo piloto.
23
Figura 7– Média+ desvio padrão da área do ventrículo na sístole
e volume sistólico do estudo piloto.
A FE demonstrou um declínio durante todo o momento de avaliação,
sendo que entre 2 semanas e 4 semanas após a aplicação da doxorrubicina, o
declínio foi menor, não significativo (figura 8).
Figura 8 – – Média+ desvio padrão da fração de ejeção do estudo piloto.
24
Os resultados histopatológicos não demonstraram alterações nos
fragmentos avaliados logo após o término da aplicação da droga. Nos cortes de
2 e 4 semanas após a droga ter sido interrompida, demonstraram anomalias
progressivas ao que se refere a vacuolização de cardiomiócitos, hipertrofia
miocárdica, fibrose intersticial e o aparecimento de núcleos picnóticos (figuras
9, 10, 11, 12).
Figura 9–Corte Histológico Normal de Cardiomiócitos (coloração: HE – 100x).
Figura 10– Núcleos Picnóticos de Cardiomiócitos (coloração: HE – 20x).
25
Figura 11– Hipertrofia da fibra muscular cardíaca (coloração: HE – 40x).
Figura 12– Vacuolização Intracitoplasmática de Cardiomiócitos (coloração: HE – 40x). A conclusão da análise estatística dos achados funcionais demonstrou
cardiomiopatia dilatada não isquêmica dose dependente e piora progressiva.
Os achados histopatológicos demonstraram a citotoxicidade da droga.
E o melhor momento para a realização da avaliação do estudo funcional
do coração antes do transplante cardíaco é de duas semanas.
3.4. FLUXOGRAMA DO PROJETO
Para melhor interpretação do projeto, apresentamos um fluxograma com as
seguintes fases: obtenção das células-tronco mononucleares, indução da
cardiomiopatia, seleção dos animais com fração de ejeção menor de 40% e
26
transplante de células-tronco mononucleares, e estudos ecocardiográficos e
histopatológicos após trinta dias de transplante.
Figura 13 – Fluxograma do projeto.
27
3.5 OBTENÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO MONONUCLEARES
3.5.1 Punção-aspiração da Medula Óssea
Para extração do sangue da medula óssea foi utilizado o método de
punção aspiração realizado na técnica operatória da PUC - PR.
A punção-aspiração foi realizada antes de começar a indução da
cardiomiopatia, por ser esta droga indutora de efeitos mielossupressores 41 e
devido à proposta do transplante ser autólogo (figura 14).
Os 70 animais foram separados em grupos de 35 unidades para maior
exeqüibilidade prática. Primeiramente, os animais foram identificados com
numerações seqüenciais registradas através de tatuagem na cauda do animal.
Figura 14 – Punção-aspiração da medula óssea
Os animais foram anestesiados para o procedimento de punção-
aspiração da medula óssea. Logo após, o animal foi colocado em posição de
decúbito lateral com um dos membros inferiores flexionados e a outra
28
extendida, imobilizando-o. A assepsia do local a ser puncionado foi realizada
com polivinilpirrolidona-iodo (PVPI - Presist®) e sendo realizada a punção-
aspiração da medula óssea da crista ilíaca posterior do fêmur com seringa
descartáveis (BD-Plastipak®) de 5mL heparinizada (Clexane® - laboratório
Aventis) contendo agulha de 25x07(BD-Precision Glide®).
De cada rato foi puncionado na crista ilíaca 0,5 mL de sangue de medula
óssea (figura 15) e levadas para o Laboratório Experimental de Cultivo Celular
da PUC-PR.
Figura 15 - Esfregaço do sangue da medula óssea
(coloração: Maygrunwal-Giemsa aumento:40x)
3.5.2 Isolamento de Células-tronco Mononucleares
O material coletado de cada rato foi colocado em tubo estéril de
centrífuga de plástico de 15 mL. Logo após, completado este tubo até 12ml,
com meio de cultura IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Media),
suplementado com solução tampão 4% e antibiótico (penicilina e streptomicina)
1% e homogenizado.
Em um tubo de plástico de 15mL, foi colocado 3mL de solução de
separação por gradiente densidade (d: 1,077) (Ficoll-Hypaque) e logo em
seguida colocado neste tubo o homogenizado contendo a medula óssea do
29
animal e meio de cultura IMDM, cuidadosamente para que esta não se
misturasse.
Este tubo foi levado à centrífuga e submetido a 1400rpm rotações por
minuto durante 40 minutos á 22°C. Logo após, levado ao fluxo novamente, e
retirado o anel formado entre o meio e o gradiente (figura 16).
Figura 16 – Anel formado de células-tronco
mononucleares
Este homogenizado retirado, onde se encontram as células-tronco
mononucleares, foram colocados em outro tubo de plástico de 15mL. Foi
completado com meio IMDM até 15mL e centrifugado novamente por 1500rpm
por 10 minutos a 22°C.
Retirado da centrifuga o tubo, foi realizado um descarte rapidamente do
sobrenadante. Observaram-se um precipitado no fundo do frasco, sendo este
as células-tronco mononucleares.
Repetida a etapa anterior e colocando 13mL de meio no tubo, foi
ressuspendido o precipitado e centrifugado novamante a 1500rpm, por mais 10
minutos a 22°C.
Após esta fase, foi descartado o sobrenadante, colocado 3mL de meio
no tubo, ressuspendido as células, para contagem destas. Esta contagem foi
realizada em câmara de Neubauer e lida em microscópio óptico Olympus®
CX31 em objetiva de 40X.
30
3.5.3 Congelamento de Células-tronco Mononucleares
Para congelamento das células, a solução de congelamento contendo
70% de meio IMDM, 10% de DMSO (dimetilsulfoxido) e 20% de soro bovino
fetal foi preparada anteriormente.
A seguir, sob fluxo laminar foi colocada uma cuba de gelo contendo gelo
e entre estes os tubos de congelação identificados. Em seguida, as células
foram centrifugadas a 1500rpm, durante 10 minutos a 22°C. Retirado e
desprezado o sobrenadante, deixando as células suspensas em 0,5mL de meio
IMDM. As células foram retiradas dos tubos com o auxílio de uma pipeta
Pasteur e transferidas para o tubo criogênico. Logo após, adicionou-se uma
aliquota 0,5mL de DMSO e com auxilio da pipeta Pasteur foram
homogenizados, fechados e transferidos para o congelador automático.
Os tubos de criopreservação foram congelados gradativamente durante
70 minutos, até atingir –90°C, indicado pelo sensor de temperatura. Os tubos
foram levados e armazenados no reservatório de nitrogênio líquido, de –196°C
e mantidos até a utilização das células para o transplante.
3.6 INDUÇÃO DA CARDIOMIOPATIA PELA DOXORRUBICINA
Ecocardiografia
Animais Normais
(basal)
Indução da Cardiomiopatia
Ecocardiografia
Patologia
Seleção dos
Animais (Fração
de Ejeção< 40%)
Transplante do Grupo Estudo e do Grupo
Controle
Ecocardiografia e
Histopatologia
Pós Transplante
31
Figura 17 - Momentos de realização das análises ecocardiográficas e histopatológicas
3.6.1 Avaliações Ecocardiográficas
Para obtermos a situação (basal) dos corações no estágio inicial do
experimento, foram realizados os exames de ecocardiografia transtorácica na
técnica operatória da instituição.
Os animais foram analisados antes da aplicação da droga com
equipamento de ecocardiografia bi-dimensional modelo Agilent Sonos 5500
(Hewlet Packard, USA), com transdutores setorial S12 (5-12 mHZ) e linear
15L6 (7-15 mHZ) (figura 18).
Todos os animais eram pesados e submetidos à anestesia antes do
exame e quando estavam em plano anestesico, foram submetidos a tricotomia
em região pré-cordial e realizados os exame.
Todos os animais foram monitorizados nas derivações periféricas com
eletrodos pediátricos, obtendo-se a freqüência cardíaca com visualização
cardioscópica. A cada exame foi colocado o transdutor na porção anterolateral
esquerda da parede torácica, as imagens foram vistas em duas dimensões, e
as câmaras ventriculares visualizadas em duas dimensões, a transversal e a
longitudinal. Nos cortes longitudinais se obtinham uma visão axial do ventrículo
esquerdo incluindo as válvulas: mitral e aórtica, a parede anterior, posterior e o
ápice do ventrículo esquerdo. Enquanto que nas dimensões transversais, foram
observadas a parede septal, anterior, lateral e posterior na região basal média
e apical do ventrículo esquerdo.
A área, o comprimento e o volume do ventrículo esquerdo foram
medidos pelo método Simpson, utilizando o software do computador, tanto na
sístole como na diástole. O comprimento sempre em maior eixo (da base para
o ápice), e a área por uma delimitação das paredes do ventrículo. Todas as
medidas foram realizadas três vezes pelo mesmo profissional, tendo como
resultado final uma média dos três resultados.
O examinador era cego para os grupos randomizados.
32
Foram analisados os seguintes dados do ventrículo esquerdo: área do
ventrículo em diástole (AVD – unidade: cm3), volume diastólico (VD – unidade:
mL), área ventricular em sístole (AVS – unidade: cm3), volume sistólico (VS –
unidade: mL), fração de ejeção (FE – unidade: %) e freqüência cardíaca (F-
unidade: bpm) (figura 19).
Após o exame, os animais foram observados até sua recuperação pós
anestesia.
Todos os exames ecocardiográficos realizados utilizaram os mesmos
parâmetros.
Figura 18 - Aparelho ecocardiográfico Bi-dimensional
Figura 19- Imagem Ecocardiográfica.
33
3.6.2 Aplicação de Cloridrato de Doxorrubicina
Para induzirmos a uma cardiomiopatia dilatada não isquêmica tóxica, foi
utilizado o antibiótico antitumoral cloridrato de doxorrubicina (Eurofarma®).
Os animais receberam uma dose acumulativa de 15mg/kg de cloridrato
de doxorrubicina por 2 semanas, em dias intercalados 85.
Para que houvesse um desenvolvimento da cardiomiopatia, foi esperado
2 semanas após o término da aplicação da droga. Este período foi determinado
pelas conclusões do projeto piloto.
3.6.3 Avaliação do Estado Funcional do Coração pela Ecocardiografia Pré
Transplante
Após 4 semanas, de administração com doxorrubicina foi realizada a
segunda ecocardiografia dos animais (pré transplante), para identificar quais os
animais que adquiriram a cardiomiopatia.
Neste momento, todos os animais com fração de ejeção abaixo de 40%,
considerado um valor referencia para insuficiência cardíaca, foram distribuídos
em dois grupos aleatórios: grupo estudo (transplante de células-tronco
mononucleares) e grupo controle (transplante de solução salina).
3.7 TRANSPLANTE DE CÉLULAS - TRONCO MONONUCLEARES
3.7.1 Descongelamento das Células-tronco Mononucleares
34
As células-tronco mononucleares preservadas em nitrogênio líquido
foram descongeladas duas horas antes do procedimento de transplante.
As células retiradas dos tubos criogênicos foram trasnferidas para outro
tubo de 15 mL, contendo 12 mL de meio IMDM e centrifugados a 1500rpm
durante 10 minutos, no qual foram transferidos para o fluxo e descartados os
sobrenadantes, sendo os pellets ressuspensos.
Os pellets foram diluídos em 3 mL de meio IMDM e quantificados de
maneira diluída em câmara de Neubauer.
A viabilidade das células criopreservadas foi verificada, utilizando o
corante vital azul de Trypan em uma diluição de 1:1, homogeneizados, e
contados em câmara de Neubauer.
3.7.2 Transplante das Células-tronco Mononucleares
Ainda no laboratório, em uma amostra foi acrescido o BrdU
(bromodeoxiuridina), um marcador de proliferação celular no péllet de células já
devidamente descongeladas. Este marcador auxilia na identificação do local do
transplante no tecido hospedeiro86.
As seringas de insulina com agulha ultrafina foram preparadas contendo
300μL de meio com 106 de células mononucleares, o grupo de animais doentes
foi randomizado em dois grupos. O primeiro grupo (I) recebeu transplante de
células tronco mononucleares e o segundo grupo recebeu transplante de
solução tampão PBS para caracterizar grupo controle (II).
Todos os animais foram anestesiados, ventilados e submetidos à
tricotomia na região ventral do abdômen, no tórax, na porção antero-lateral
esquerda, imediatamente antes do procedimento cirúrgico.
Posicionou-se em decúbito dorsal com uma leve inclinação para a
direita, facilitando desta maneira a exposição da área a ser abordada, fixando
os membros anteriores e posteriores com fita adesiva. Foi realizada a assepsia
do tórax com iodopovedina tópico. Após a abertura da pleura esquerda, o
animal é conectado ao sistema de ventilação mecânica. O pericárdio é retirado
para a luxação e melhor visualização da área abordada.
35
Devido à cardiomiopatia instalada atingir globalmente o músculo do
coração, foi aplicado em regiões cardíacas antero lateral as células
previamente preparadas em seringa, assim como a solução tampão para o
grupo controle.
Em seguida, o coração foi recolocado em seu local anatômico, no tórax,
os pulmões hiperinflados e a parede torácica suturada por planos com fio de
sutura de nilon monofilamentar não absorvível 4.0. Após recuperação
anestesica, os animais foram retirados da ventilação artificial e mantidos em
suas caixas. Os grupos foram previamentes randomizados.
3.8 AVALIAÇÃO CARDIOLÓGICA PÓS-TRANSPLANTE
3.8.1 Avaliação Ecocardiográfica Pós-Transplante
Um mês após o transplante foram realizadas as ecocardiografias dos
animais que sobreviveram ao transplante de acordo com o protocolo.
3.8.2 Avaliação Histopatológica Pós-Transplante
Todos os animais foram submetidos à eutanásia e seus corações
retirados para análise histopatológica pós-transplante.
Os corações foram preservados em frascos contendo formol 10%
durante 24 horas. Após este período os corações foram clivados em 4 partes
iguais transversais no micrótomo (Leica modelo RM2145) com espessura de
5μm.
Realizado a desidratação dos cortes, sendo estes submetidos a banhos
sucessivos em álcool 70%, 80%, 90%, 3 banhos em álcool 100% no (Leica
modelo TP1020), durante 1 hora. Logo após, impregnada parafina líquida nos
cortes através de 3 banhos a 65°C no mesmo aparelho. Então os cortes
36
histológicos foram montados em lâminas e corados com solução de H&E e
tricrômio de Gomori. De cada fragmento foram feitas duas lâminas com os
quatro cortes e com as colorações citadas.
Os cortes obtidos foram avaliados por sua morfologia, realizando
comparações entre cortes de corações normais e cortes do grupo estudo e
controle.
Foram realizados cortes para procedimentos padrões e
imunohistooquímicos.
Os cortes histológicos foram montados em lâminas e corados com
solução de H&E, tricrômio de Gomori e sirus red. De cada fragmento foi feito
lâminas com os quatro cortes e com as colorações citadas. Outras lâminas
foram utilizadas para analise do BrdU.
As análises foram avaliadas em microscópio óptico (Olympus®RX50)
(figura 20) que estava acoplado a uma câmera de vídeo, que captura a imagem
digital a um computador, que possui um programa de análise de imagens
digitais Image Pro-plus (Média Cybermetics, Silver Spring, Mayland, USA).
Para análise destas lâminas foram observadas nos aumentos de 20x, 40x,
100x.
Os cortes foram avaliados por sua morfologia e realizados comparações
entre cortes de corações normais e cortes do grupo estudo e controle.
Figura 20 - Microscópio óptico Olympus® RX 50 utilizado
37
3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise descritiva dos dados através do agrupamento das informações
coletadas foram dispostas em quadros, gráficos e figuras.
Foi utilizado o teste não paramétrico Mann-Whitney para comparar os
grupos em cada momento de avaliação.
O nível de significância menor que 0,05 indicou a significância
estatística.
Para cada uma das variáveis do estudo, inicialmente, os grupos controle
e estudo foram comparados em cada momento de avaliação (basal pré e pós).
Para tanto, testou-se a hipótese nula de que os resultados do grupo controle é
igual aos resultados do grupo estudo, versus a hipótese alternativa de
resultados diferentes.
38
4 RESULTADOS
Neste estudo foram incluídos, inicialmente, 70 ratos submetidos à
indução da cardiomiopatia por doxorrubicina. Após a indução, sobreviveram 61
ratos correspondendo a 87,2%. Estes 61 animais foram avaliados por
ecocardiografia após 2 semanas do final da indução (que durou 2 semanas).
Os resultados indicaram que apenas 23 haviam desenvolvido a cardiomiopatia
(critério de definição: ter FE < 40%), correspondendo a 37,7% dos 61
sobreviventes. Estes animais prosseguiram no estudo e foram distribuídos
aleatoriamente em dois grupos: grupo controle (n=12) e grupo estudo (n=11).
Os animais do grupo controle receberam solução tampão (PBS) no coração e
os animais do grupo estudo foram submetidos a transplante cardíaco autólogo
de células-tronco mononucleares da medula óssea. Após 30 dias, observou-se
que haviam sobrevivido 6 animais do grupo controle (50,0%) e 5 animais do
grupo transplantado (45,4%). A análise estatística comparativa dos grupos
considerou somente estes animais, ou seja, 6 do grupo controle e 5 do grupo
transplantado.
39
Ecocardiografia Basal 4 semanas (indução: 2 semanas) (evolução: 2 semanas) Ecocardiografia de Avaliação da Cardiomiopatia (Pré Transplante) Ecocardiografia Pós Transplante Figura 21- Organograma do projeto de mestrado com a análise ecocardiografica
Basal n = 70
FE%:48,00+4,6
Sobreviventes n= 61 (87,2%)
FE%: 42,36+6,9
FE < 40% n=23 (37,7%)
FE%: 35,27+5,15
Grupo Estudo (Céls.-Tronco Mononucleares)
n= 11 FE%: 35,46+3,66
TRANSPLANTE
Grupo Controle (Solução Tampão – PBS)
n= 12 FE%: 34,67,55+ 4,41
FE ≥ 40% n=38 (63,3%)
FE%: 46,32+4,3
Sobreviventes n= 6 (50,0%)
Sobreviventes n= 5 (45,4%)
40
4.1 MORTALIDADE
Foi observado que durante o período do experimento foram perdidos
muitos animais devido ao protocolo determinado. Muitos animais foram
excluidos na fase de indução da doença, por não demonstrarem valores de
fração de ejeção menores que 40%.
De sessenta e um animais que foram submetidos à indução da
cardiomiopatia somente vinte e três dos animais estavam com disfunção
ventricular, detectado pelo ecocardiograma, o que equivale a 37,7%. Foi
observada também a perda significativa de animais por mortalidade na fase de
transplante, dos vinte e três animais submetidos a transplante, somente onze
resistiram a todo experimento (47%).
4.2 VIABILIDADE CELULAR Foi verificada a viabilidade celular utilizando o corante azul de Tripan,
onde nós obtivemos resultados satisfatórios acima de 85% de células viáveis,
após seu descongelamento para serem transplantadas.
4.3 PESO DOS ANIMAIS Todos os animais durante o experimento demonstraram estabilidade nos
valores de seus pesos durante os três momentos, podendo ser observado no
gráfico dos dados obtidos (figura 22).
41
Controle(n=6)Estudo(n=5)
PESO DOS RATOSMédia ± dp
Peso
(g)
0306090
120150180210240270300330360390
Basal Pré-transpl Pós-transpl
p=0,7922 p=0,7922 p=0,9307
Figura 22 – Média+ desvio padrão dos pesos dos grupos do experimentos nos três momentos.
4.4 FREQÜÊNCIA CARDÍACA Não foram observadas variações estatísticas entre os resultados da
freqüência cardíaca. Os batimentos cardíacos foram equivalentes tanto no
grupo controle quanto no grupo estudo, com p não significativos (figura 23).
Controle(n=6)Estudo(n=5)
FREQÜÊNCIA CARDÍACAMédia ± dp
Freq
üênc
ia c
ardí
aca
(bpm
)
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
Basal Pré-transpl Pós-transpl
p=0,1775 p=0,7922 p=0,5368
Figura 23 – Média da freqüência cardíaca dos grupos nos três momentos.
42
4.5 RESULTADOS NO MOMENTO PRÉ-TRANSPLANTE 4.5.1 Resultados Estatísticos Ecocardiográficos
Analisamos os resultados dos vinte e três animais obtidos após a
indução da cardiomiopatia, o que se referem aos onze ratos do grupo estudo e
doze do grupo controle. Estes resultados apresentados demonstram
homogeneidade entre os grupos nos parâmetros analisados, para
posteriormente serem submetidos ao transplante.
Para cada uma das variáveis do estudo, testou-se a hipótese nula de
que os resultados do grupo controle são iguais aos resultados do grupo estudo,
versus a hipótese alternativa de resultados diferentes.
4.5.1.1 Volume Diastólico Pré Transplante Na análise dos grupos submetidos ao transplante, observamos que o
volume diastólico do grupo controle foi de 0,72mL+0,11 e do grupo estudo foi
de 0,65mL+0,11. Foram encontrados resultados não significativos com p=
0,1497 (figura 24).
Média ± dpMédia
VOLUME DIASTÓLICOPré-transplante
Vol
ume
dias
tólic
o (m
L)
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Controle(n=12)
Estudo(n=11)
p = 0,1497
Figura 24– Volume diastólico do ventrículo equerdo dos grupos pré-transplante.
43
4.5.1.2 Volume Sistólico Pré Transplante
O volume sistólico do grupo controle se comportou com um valor de
0,47mL+0,08 e do grupo estudo foi de 0,42mL+0,08. Foi encontrado resultados
não significativos com p= 0,1612 (figura 25).
Média ± dpMédia
VOLUME SISTÓLICOPré-transplante
Vol
ume
sist
ólic
o (m
L)
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Controle(n=12)
Estudo(n=11)
p = 0,1612
Figura 25 – Volume sistólico do ventrículo esquerdo dos grupos pré-transplante.
4.5.1.3 Fração de Ejeção Pré Transplante Foi observado que o valor da média da fração de ejeção dos animais do
grupo controle apresentou-se com 34,67% + 4,41 no momento pré-transplante,
e para o grupo estudo apresentou-se um valor de 35,46% + 3,66 , com p=
0,6440 (figura 26).
44
Média ± dpMédia
FRAÇÃO DE EJEÇÃOPré-transplante
Fraç
ão d
e ej
eção
(%)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Controle(n=6)
Estudo(n=5)
p = 0,6440
Figura 26– Fração de ejeção do ventrículo esquerdo dos grupos pré-transplante.
4.6 RESULTADOS NO MOMENTO PÓS-TRANSPLANTE
4.6.1 Resultados Estatísticos Ecocardiográficos
Foram observados os resultados das médias dos parâmetros
ecocardiograficos, tanto do grupo controle (grupo que recebeu tampão PBS)
quanto do grupo estudo (grupo que recebeu células mononucleares) no
momento pós-transplante.
Os resultados obtidos no estudo foram expressos por médias e desvios
padrões. Para comparar os grupos em cada momento de avaliação foi usado o
teste não paramétrico de Mann-Whitney. Em todos os testes, valores de p<
0,05 indicaram significância estatística.
45
4.6.1.1 Volume Diastólico Pós Transplante
O volume diastólico do grupo controle no momento de pós-transplante
demonstrou o seguinte valor: VD pós-transplante= 0,598 + 0,149. E o volume
diastólico do grupo estudo no momento de pós-transplante, demonstrou o
seguinte valor: VD pós-transplante= 0,555 + 0,069.
Analisando os valores comparativos dos dois grupos no momento pós-
transplante, observamos p= 1, o que não demonstra significância (figura 27).
Média ± dpMédia
VOLUME DIASTÓLICOPós-transplante
Vol
ume
dias
tólic
o (m
L)
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Controle(n=6)
Estudo(n=5)
p = 1
Figura 27 – Volume diastólico do ventrículo esquerdo dos grupos.
4.6.1.2 Volume Sistólico Pós Transplante
O volume sistólico do grupo controle no momento de pós-transplante
demonstrou o seguinte valor: VS pós-transplante= 0,366 + 0,109. E o volume
sistólico do grupo estudo no momento de pós-transplante, demonstrou o
seguinte valor: VS pós-transplante= 0,324 + 0,048.
46
Analisando os valores comparativos dos dois grupos no momento pós
transplante, demonstrou-se p= 0,7922, não significativo (figura 28).
Média ± dpMédia
VOLUME SISTÓLICOPós-transplante
Vol
ume
sist
ólic
o (m
L)
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Controle(n=6)
Estudo(n=5)
p = 0,7922
Figura 28 – Volume sistólico do ventrículo esquerdo dos grupos.
4.6.1.3 Fração de Ejeção Pós Transplante
Com relação ao grupo controle, foi observado que o valor da média da
fração de ejeção (FE) dos animais apresentou-se 38,80% + 9,22 no momento
pós-transplante. E o grupo estudo demonstrou um valor de 42,16% + 3,66.
Comparando os dois grupos no momento de pós-transplante observamos um p
não significativo de 0,5368 (figura 29).
47
Média ± dpMédia
FRAÇÃO DE EJEÇÃOPós transplante
Fraç
ão d
e ej
eção
(%)
0
10
20
30
40
50
Controle(n=6)
Estudo(n=5)
p = 0,5368
Figura 29 – Fração de ejeção do ventrículo esquerdo dos grupos.
4.6.2 Resultados Histopatológicos
Na análise histopatológica foram observados nos fragmentos analisados:
área de fibrose intersticial, núcleos picnóticos intra-miocárdicos e a presença
de cardiomiócitos com vacúolos intracitoplasmáticos. Nas regiões epicárdicas
do ventrículo esquerdo, observou-se por seu aspecto morfológico a presença
de um grupo de células mononucleares organizando-se em vasos: com a
formação de camada de células de aspecto endotelial e a presença de lúmen
caracterizando a neo-angiogênese ( figura 30,31,32,33,34)
48
Figura 30 – Células-tronco mononucleares transplantadas no coração
(coloração: HE aumento: 40x).
Figura 31 – Organização das células-tronco mononucleares no coração
(coloração: HE aumento: 100x).
49
Figura 32 – Acúmulo celular no coração (coloração: HE aumento: 20x).
Figura 33- Evidência de neo-vasos, lúmen e células endoteliais no coração
(coloração: HE aumento: 100x).
Figura 34- Vaso, lúmen e células endoteliais em um corte
histológico de coração normal (controle) (coloração: HE aumento: 100x).
50
4.6.3 Resultados Imunohistoquímicos Brdu Com o uso do análago da timidina, Brdu, pode observar a presença das
células transplantadas através de sua marcação (figura 35).
Figura 35- Marcação positiva do brdu em imunohistoquímica
(aumento: 40x).
51
5 DISCUSSÃO 5.1 Indução da Cardiomiopatia
O cloridrato de doxorrubicina (doxo) é um medicamento antinéoplásico
utilizado rotineiramente em hospitais e clínicas especializadas. Verificando as
diretrizes para tratamento de variados tipos de cânceres na American Cancer
Society (ACS), observa-se que a doxo ainda é uma das escolhas de tratamento
da doença, mesmo com seus efeitos colaterais.
No final da década de 60, iniciaram-se estudos experimentais com este
medicamento com intuito de conhecer melhor seu potencial. Muitos estudos
surgiram apontando a cardiotoxidade da droga 43 24.
A escolha do modelo animal para experimentos foi uma das primeiras
preocupações dos pesquisadores. O rato sempre foi considerado o modelo
ideal, mas apontam-se limitações com relação ao tempo para conseguir a
indução da cardiotoxidade, levando de 10 a 20 semanas 87. Mas estudos mais
recentes, diminuem estes valores para 4 semanas e até mesmo 2 semanas88 89 .Foi realizado uma revisão bibliográfica analisando os melhores modelos
animais para indução da cardiomiopatia por drogas. Conclui-se que ratos e
camundongos são os modelos mais usados para demonstrar a cardiotoxicidade
aguda e crônica da doxorrubicina 23 90 91.
Outros animais também foram estudados e apontados como uma
possível escolha experimental: coelhos, cães e camundongos são alguns
animais indicados como modelo 92. Cita-se o interesse maior pelos animais
menores, como ratos e camundongos, devido às restrições financeiras,
equipamentos especiais para os experimentos e a necessidade às vezes de
animais transgênicos 91.
Este estudo preocupou-se em reproduzir corretamente a
cardiotoxicidade para que não houvesse contradições com relação ao resultado
do transplante. Para a escolha do animal foi levado em consideração: a
estrutura do biotério da instituição, as verbas da pós-graduação, e até mesmo
os equipamentos já existentes para transplantes na instituição, como
respiradores, materiais cirúrgicos e aparelho de ecocardiografia adequado.
52
Um projeto piloto de indução da cardiomiopatia pela doxorrubicina foi
realizado antes do início do projeto, o que proporcionou um melhor
entendimento da evolução da doença cardíaca, suas dificuldades e análise de
valores que suportaram o procedimento do transplante de células-tronco. Este
pré-projeto confirmou que a segunda semana após o término da aplicação da
droga é o melhor momento para realização do transplante. Este resultado é
suportado por outros trabalhos já realizados 85 89 .
A doxorrubicina é uma droga que debilita muito o organismo do animal, e
devido a isto se obteve muita dificuldade de reprodução do protocolo
determinado. A mortalidade dos animais no decorrer do processo foi muito
grande. Foi verificado nos animais presença de ascite, mucosas agredidas,
letargia e deficiência no funcionamento do aparelho intestinal do animal. Outros
estudos também demonstram dificuldades em projetos semelhantes a este 89 91
A mortalidade é muito alta tanto em experiências onde se utiliza a droga
crônica quanto nas agudas. Comenta-se que a mortalidade em um experimento
onde aplica a droga durante 10 semanas, a mortalidade na décima semana é
de 11% e este número cresce consideravelmente para 52% na décima terceira
semana 91. Outro experimento onde aplicou a droga durante 3 semanas, foi
avaliado mortalidade de 35,8% após doze semanas 91.
Outro aspecto a ser discutido é o das diferentes dosagens da
doxorrubicina apresentada na literatura. Há estudos com indução crônica e
também aguda. Observa-se que não há um padrão na dosagem utilizada nos
experimentos. Autores utilizam baixas dosagens em largo período de tempo, e
outras dosagens acumulativas com indução rápida. Optamos por utilizar uma
indução rápida, mas segura para os animais, de acordo com a literatura.
Em humano, estudos são cada vez mais realizados para detectar
precocemente a possível cardiomiopatia instalada. Sabe-se que a realização
da ecocardiografia com parâmetros sistólicos M-mode e Doppler transmitral é
um importante exame para este caso 93. Crianças usuárias do tratamento com
doxorrubicina submetidas a ecocardiografia Doppler demonstraram que a
função diastólica do ventrículo esquerdo se deteriora antes que a função
sistólica, e que parâmetros diastólicos deve ser usados para indicativo de
cardiomiopatia 94.
53
Na análise ecocardiográfica de nossos resultados durante a fase do
projeto (indução da cardio miopatia) partimos do princípio que os animais
submetidos ao transplante estavam com resultados semelhantes, tanto para
nosso grupo controle (n=12) como para nosso grupo estudo (n=11). Os
resultados desta fase do experimento demonstraram diferenças não
significativas se testando a hipótese nula de que os resultados do grupo
controle são iguais aos resultados do grupo estudo para os seguintes
parâmetros: volume diastólico, área do ventrículo na diástole, volume sistólico e
área do volume na sístole e fração de ejeção dos grupos demonstram ser
homogêneo. Já a área do volume na diástole apresentou diferenças entre os
grupos.
A análise histológica demonstrou áreas de necrose, fibroses intersticiais
e núcleos picnóticos após quatro semanas da aplicação da droga. A droga
causa degeneração progressiva e crônica apresentando anomalias
progressivas causadas por vacuolização de cardiomiócitos, hipertrofia
miocárdica, necrose e início de fibrose intersticial e aparecimento de alguns
núcleos picnóticos.
A vacuolização, muitas vezes perinuclear de cardiomiócitos, demonstrou
que as células tentam se proteger dos radicais livres formados pela
doxorrubicina juntamente com água, atraída por estes íons. Observamos
muitos vacúolos perinucleares devido a maior concentração de mitocôndrias se
localizarem em torno do núcleo. Além disto, encontramos a presença de
núcleos dilatados, reação compensatória da célula para suprir a sua
degeneração e compensar esta dificuldade, aumentando a quantidade de
produção de proteínas miofibrilar da célula. Isto faz com que o coração se
mobilize, tentando reagir às alterações, com hipertrofia dos cardiomiócitos e
aumento das câmaras. Não ocorre nesta cardiomiopatia presença de células
inflamatórias, estando de acordo por outros autores 95.
54
5.2 Transplante Autólogo de Células-tronco Mononucleares A terapia celular começa a ganhar potencial significativo de um novo
tratamento para paciente com avançada falência cardíaca. Estudos recentes
têm sugerido benefícios do transplante de células tronco da medula óssea para
recuperação do tecido cardíaco e melhora do funcionamento nas regiões
infartadas (isquêmicas) do coração 18 96 97 98 99 19 100 101.
É através de células-tronco pluripotentes com potencial de multiplicação
e diferenciação para a formação de novos vasos no tecido isquêmico. Acredita-
se que é no pool de células mononucleares extraídos da medula óssea, onde
se encontra duas linhagens celulares: a hematopoiética (1-2%) que possui
precursores de células endoteliais e de células hematopoiéticas, e a
mesenquimal (< 0,05%) e apresenta pluripotencialidade para células derivadas
do mesoderma, que possam proporcionar estes benefícios 11.
Mas pouco se tem estudado com relação à falência global do coração
mais especificamente com a cardiomiopatia dilatada não isquêmica 102. Ainda
pouco se sabe sobre o efeito do transplante de tipos celulares com potencial
regenerativo neste tipo de doença.
Mais especificamente com relação a cardiomiopatia induzida pela
doxorrubicina existem já alguns estudos preliminares com relação à terapia
celular.
Estudaram o transplante de cardiomiócitos fetais em ratos para
recuperação do tecido lesado pela droga 85; transplante de cultura de
mioblastos 103; transplante de células- tronco mesenquimais 68; administração
de fatores celulares estimulantes de colônias granulocitosas para o coração 104 107 e transplante cardíaco de células mononucleares 105 106.
Estes resultados demonstram com menos otimismo do que a literatura,
pois não foi observada uma melhora funcional cardíaca no grupo estudado em
relação ao grupo controle, com ressalvas de que, o número final dos animais
no estudo, não permitiu uma melhor análise estatística.
Os protocolos de outros estudos relacionados aos efeitos da terapia
celular no tratamento da cardiomiopatia dilatada induzida pela doxorrubicina,
embora com certas similaridades, diferem em alguns aspectos fundamentais.
55
O trabalho de pesquisa de Ishida e colaboradores é o que mais se
assemelha ao nosso 105.
Salientamos que o tipo de células é o mesmo, assim como o número de
células é da mesma ordem do nosso estudo: 106, sendo o método de obtenção
das células neste trabalho: a eutanásia, seguida de lavado dos fêmures e o
nosso com punção-aspiração da crista ilíaca.
O seu isolamento semelhante, quanto ao uso do gradiente de densidade
e difere quanto ao tempo de centrifugação dos tubos. No entanto, neste
trabalho deduzimos que o transplante de células foi com células frescas e
heterólogo, enquanto o nosso foi de células criopreservadas, com viabilidade
superior a 85%. Em nosso trabalho realizamos o transplante autólogo, por isto
a necessidade de não sacrificar o animal e criopreservar as células, pois a
droga é mielotóxica. A dose utilizada por este grupo é a mesma de 15mg/kg de
peso e durante o mesmo período, diferindo na raça: rato Lewis e o nosso é o
rato Wistar.
O número total dos animais foi de 52 e a mortalidade total: só ocorreu
após os transplantes: 11,5%, sendo 16,7% para o grupo tratado, 5,6% para o
grupo controle com injeção de solução salina e 12,5% para o grupo controle
com toracotomia. O que nos sugere que as nossas condições de manutenção
dos cuidados dos animais, talvez no Biotério, deixam a desejar interferindo no
número, mortalidade de antes do transplante: 22,8 % e chegamos com 11 ratos
no final do estudo.
O trabalho de pesquisa de Ishida conclui: efeitos funcionais benéficos na
cardiomiopatia dilatada induzida pela doxorrubicina, utilizando parâmetros
indiretos como a ascite, peso do coração e a diminuição do hormônio
natriurético. Com respeito à ascite, sabe-se que esta pode estar relacionada ao
próprio efeito da doxorrubicina no parênquima hepático, sabidamente
hepatotóxica ou ser secundária a uma insuficiência cardíaca; quanto ao peso
dos corações não se refere, se peso úmido ou peso seco para ser valorizado e
quanto ao hormônio natriurético, surpreendeu-nos, porque para a execução da
elaboração de nosso protocolo, não conseguimos encontrar tal substância para
ratos 105.
No entanto, quando é realizada a análise estatística dos dados
funcionais por ecocardiografia à semelhança de nosso estudo, no mesmo
56
momento após transplante: quatro semanas; os resultados, para a fração de
ejeção, não demonstram significância estatística entre o grupo tratado com as
células-tronco mononucleres e os dois outros grupos controles: um com
transplante de solução tampão e outro com apenas a toracotomia (p> 0,05).
Quanto à avaliação histológica, concluímos também pela presença de
angiogênese no grupo transplantado por técnicas padrões: H&E e não
utilizamos o Fator VIII, assim como não procedemos a microscopia eletrônica.
Com relação à confirmação de que as células foram transplantadas no
local, nosso trabalho pode demonstrar através da técnica com o BrdU.
Comparando com os resultados funcionais do transplante de mioblastos
esqueléticos obtidos por Suzuki e colaboradores, na cardiomiopatia dilatada,
induzida pela doxorrubicina, estes autores, obtiveram resultados funcionais
significativos (p= 0,02) 103.
No entanto, diferem de nosso estudo em vários aspectos: rato Lewis,
tipo celular diferente, via de administração das células por infusão
intracoronariana e dose final de 15 mg/Kg da doxorrubicina para a indução da
cardiomiopatia. E os achados histopatológicos são da presença de células
musculares esqueléticas com o aspecto miotubular. Observa-se neste trabalho
a não identificação do número total de animais que, iniciaram o estudo, sendo o
término com 08 ratos, distribuídos em dois grupos de quatro: controles e
tratados.
Zhang e colaboradores 67 avaliaram o transplante autólogo de células
mesenquimais na cardiomiopatia dilatada, induzida pela doxorrubicina em 32
coelhos, sendo 18 foram transplantadas células mesenquimais e 18 injeção de
meio e 6 coelhos foram apenas realizada a toracotomia, sem a indução de
cardiomiopatia; os 32 coelhos que receberam a doxorrubicina foram por injeção
endovenosa, na dose de 1mg/kg duas vezes por semana durante 8 semanas,
diferindo dois demais estudos, inclusive do nosso. Os 6 coelhos restantes
receberam solução tampão. O transplante ocorreu três semanas após a última
injeção, sendo o número total de células transplantadas na ordem de 106 e
marcadas com o BrdU. Os resultados funcionais ecocardiográficos para o
grupo transplantado demonstraram ser benéficos para o grupo transplantado,
sendo significativos para a fração de ejeção e para pressão sistólica do
ventrículo esquerdo, quando comparados com o grupo controle (p< 0.05).
57
Neste estudo em particular, devido ao porte do animal, foi também realizada
uma avaliação hemodinâmica pré e após o transplante, sendo os resultados
benéficos e significativos para o grupo transplantado (p<0.05).
Também neste estudo a mortalidade foi alta: 33.3% no grupo que sofreu
indução da cardiomiopatia, sendo que 12, antes do transplante.
Os achados benéficos funcionais deste estudo, aliados aos achados
histopatológicos de células cardíacas marcadas com o BrdU, sugerem que, o
transplante com este tipo celular possa potencializar, concentrando as células-
tronco mesenquimais e pluripotentes para a transdiferenciação em miocárdio
após o transplante, pois no pool de células-tronco mononucleares estas são
apenas uma fração inferior a 0.05%. Saliento que neste trabalho, não há
menção da presença de angiogênese.
Estes autores enfatizam em seu trabalho que a melhora funcional,
embora significativa, é limitada, e atribui o fato a morte de células após o
transplante e conseqüente diminuição do seu número.
Scorsin e colaboradores 83 realizaram um estudo semelhante ao anterior:
célula contrátil, diferindo em relação ao tipo celular e a utilização de células
transgênicas para a ß-galactosidase: cardiomiócitos fetais, assim como em
relação ao número de células transplantadas: 5 milhões versus 1 milhão do
grupo anterior e na via de administração, por injeção intra- miocárdica após
toracotomia; tendo utilizado camundongas, divididas em três grupos aleatórios:
grupo com células, grupo apenas com toracotomia e grupo com injeção de
meio de cultivo. Este estudo iniciou com 88 animais e terminaram com 37
(mortalidade total: 42%). Os resultados funcionais significativos para a fração
de ejeção (p< 0,05) e semelhantes ao descrito por Suzuki 103.
Os resultados funcionais do estudo proposto “Efeito do transplante
autólogo de células-tronco mononucleares da medula óssea na miocardiopatia
induzida pela doxorrubicina em ratos wistar” têm sustentação, quando
analisados pelo aspecto fisiopatológico da cardiomiopatia dilatada induzida
pela doxorrubicina, onde não há evidências de mecanismos de isquemia do
miocárdio, sendo a lesão decorrente dos efeitos tóxicos da droga sobre a
célula: o cardiomiócito e de maneira difusa no miocárdio, havendo uma perda
de cardiomiócitos. E a presença da angiogênese não supre a perda de
cardiomiócito.
58
Nas análises histopatológicas após o transplante de células-tronco
mononucleares foi demonstrado a presença de angiogênese, e estão de
acordo com os achados da literatura tanto para as cardiomiopatias: dilatada,
induzida pela doxorrubicina quanto isquêmicas crônicas e agudas. Sugerindo e
enfatizando que o transplante de células-tronco mononucleares poderá ser
utilizado como opção terapêutica nas miocardiopatias cujos mecanismos
fisiopatológicos das isquêmia de grande e de pequena circulação, estejam
envolvidos para a melhoria da perfusão no tecido miocárdio.
59
6 CONCLUSÃO
• Analisando a cardiomiopatia induzida pela doxorrubicina, houve
muita dificuldade de reprodução da doença, embora os resultados
foram os esperados, como função cardiológica gradativamente
debilitada e achados histopatológicos como vacuolização
intracitoplasmática, hipertrofia da fibra muscular cardíaca e
núcleos picnóticos, característicos desta doença.
• Após trinta dias do transplante, foram observados diferenças
histopatológicas entre o grupo controle e o grupo estudo. O grupo
controle demonstrou a citotoxicidade da droga nos achados
histopatológicos que é característica da doença e o grupo estudo
observamos ao lado da citotoxicidade a neoformação de vasos no
miocárdio.
• O transplante celular não alterou os parâmetros ecocardiográficos
se compararmos o grupo controle com o grupo estudo.
O transplante autólogo de células-tronco mononucleares na
cardiomiopatia dilatada não isquêmica induzida pelo medicamento antitumoral
cloridrato de doxorrubicina, não foi efetivo funcionalmente se comparado com o
grupo controle, porém análises histopatológicas indicaram neoformação de
vasos no miocárdio.
60
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74
ANEXO 1) Dados da análise funcional do projeto piloto:
2) Número de células-tronco mononucleares obtidas no isolamento:
Quantidade de Células Transplantadas
Grupo Estudo (n=5) Grupo Controle (n=6) – não foi
transplantado células
Rato 8 (1) 1,65 x 106céls/mL Rato 4 (1) 9,30 x 106 céls/mL
Rato 29 (1) 2,70 x 106céls/mL Rato 20 (1) 1,68 x 106 céls/mL
Rato 11 (2) 8,10 x 106céls/mL Rato 28 (1) 2,25 x 106 céls/mL
Rato18 (2) 8,96 x 106céls/mL Rato 30 (1) 1,65 x 106 céls/mL
Rato 33 (2) 8,46 x 106céls/mL Rato 29 (2) 5,52 x 106 céls/mL
- - Rato 34 (2) 3,69 x 106 céls/mL
75
3) Análise considerando 12 ratos do controle e 11 ratos do grupo de
células tronco no momento pré-transplante. Verificação se os grupos: estudo e
controle estavam homogêneos.
Para cada uma das variáveis do estudo, testou-se a hipótese nula de
que os resultados do grupo controle são iguais aos resultados do grupo estudo,
versus a hipótese alternativa de resultados diferentes. Na tabela abaixo são
apresentados os resultados descritivos obtidos no estudo e os valores de p dos
testes estatísticos.
Variável Grupo n Mínimo Máximo Mediana Média Desvio padrão
Valor de p
Controle 12 1,04 1,45 1,21 1,21 0,11 AVD Célula tronco 11 1,00 1,33 1,09 1,11 0,10 0,0446
Controle 12 0,58 0,96 0,71 0,72 0,11 VD Célula tronco 11 0,55 0,92 0,61 0,65 0,11 0,1497
Controle 12 0,79 1,08 0,88 0,91 0,09 AVS Célula tronco 11 0,72 1,01 0,81 0,84 0,09 0,0939
Controle 12 0,37 0,65 0,46 0,47 0,08 VS Célula tronco 11 0,34 0,59 0,39 0,42 0,08 0,1612
Controle 12 22,40 39,10 35,60 34,67 4,41 FE Célula tronco 11 27,60 39,80 36,30 35,46 3,66 0,6440
4) Resultado das análises estatísticas da ecocardiografia dos animais
que sobreviveram até o final do experimento:
Variável: peso
Variável Grupo n Mínimo Máximo Mediana Média Desvio padrão
Valor de p*
Controle 6 249 363 272,5 292,00 47,12 Peso basal Célula tronco 5 246 349 279 288,20 42,52 0,7922
Controle 6 268 352 310 309,17 33,35 Peso pré Célula tronco 5 274 362 281 303,20 37,65 0,7922
Controle 6 236 337 283 288,83 37,85 Peso pós Célula tronco 5 248 332 294 292,80 33,63 0,9307
(*) Teste não-paramétrico de Mann-Whitney
76
Variável: Freqüência
Variável Grupo n Mínimo Máximo Mediana Média Desvio padrão
Valor de p
Controle 6 225 243 234 234,33 6,06 Freq basal Célula tronco 5 209 258 219 224,80 20,09 0,1775
Controle 6 180 229 204 204,67 19,03 Freq pré Célula tronco 5 180 228 204 208,40 20,22 0,7922
Controle 6 105 244 221,5 203,50 52,65 Freq pós Célula tronco 5 200 287 221 237,00 40,77 0,5368
(*) Teste não-paramétrico de Mann-Whitney
Variável: AVD
Variável Grupo n Mínimo Máximo Mediana Média Desvio padrão
Valor de p
Controle 6 0,822 1,140 0,963 0,977 0,137 AVD basal Célula tronco 5 0,887 1,060 0,945 0,977 0,079 0,9307
Controle 6 1,130 1,450 1,225 1,250 0,109 AVD pré Célula tronco 5 0,957 1,100 1,080 1,059 0,058 0,0043
Controle 6 0,911 1,340 0,988 1,066 0,174 AVD pós Célula tronco 5 0,917 1,180 1,020 1,024 0,100 0,9307
(*) Teste não-paramétrico de Mann-Whitney
Variável: VD
Variável Grupo n Mínimo Máximo Mediana Média Desvio padrão
Valor de p
Controle 6 0,372 0,681 0,507 0,515 0,124 VD basal Célula tronco 5 0,428 0,579 0,493 0,510 0,065 0,9307
Controle 6 0,644 0,962 0,716 0,758 0,113 VD pré Célula tronco 5 0,524 0,649 0,612 0,595 0,047 0,0087
Controle 6 0,473 0,811 0,533 0,598 0,149 VD pós Célula tronco 5 0,479 0,668 0,544 0,555 0,069 1
(*) Teste não-paramétrico de Mann-Whitney
77
Variável: AVS
Variável Grupo n Mínimo Máximo Mediana Média Desvio padrão
Valor de p
Controle 6 0,478 0,767 0,649 0,639 0,124 AVS basal Célula tronco 5 0,556 0,732 0,599 0,630 0,082 0,7922
Controle 6 0,824 1,080 0,936 0,941 0,095 AVS pré Célula tronco 5 0,756 0,814 0,782 0,783 0,021 0,0043
Controle 6 0,610 1,000 0,734 0,776 0,156 AVS pós Célula tronco 5 0,628 0,802 0,693 0,705 0,063 0,6623
(*) Teste não-paramétrico de Mann-Whitney
Variável: VS
Variável Grupo n Mínimo Máximo Mediana Média Desvio padrão
Valor de p
Controle 6 0,162 0,352 0,269 0,261 0,080 VS basal Célula tronco 5 0,205 0,322 0,224 0,256 0,056 0,9307
Controle 6 0,393 0,653 0,496 0,506 0,091 VS pré Célula tronco 5 0,361 0,392 0,384 0,379 0,014 0,0043
Controle 6 0,240 0,516 0,336 0,366 0,109 VS pós Célula tronco 5 0,269 0,396 0,320 0,324 0,048 0,7922
(*) Teste não-paramétrico de Mann-Whitney
Variável: FE%
Variável Grupo n Mínimo Máximo Mediana Média Desvio padrão
Valor de p
Controle 6 41,70 59,40 48,55 49,80 5,85 FE% basal Célula tronco 5 43,70 54,60 51,90 50,10 5,06 0,9307
Controle 6 22,40 38,90 35,05 33,37 5,83 FE% pré Célula tronco 5 31,20 39,80 36,30 36,42 3,30 0,4286
Controle 6 24,50 52,10 37,70 38,80 9,22 FE% pós Célula tronco 5 36,50 46,30 43,40 42,16 3,66 0,5368
(*) Teste não-paramétrico de Mann-Whitney
78
5) Declaração da Comitê de Ética Puc-Pr:
