POTENCIAL DA ESPÉCIE VEGETAL Jatropha mollissima (Pohl ... · redução dos níveis séricos de LDH, creatina quinase (CK), Ureia, creatinina, AST e amilase induzidas pela peçonha

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

JACYRA ANTUNES DOS SANTOS GOMES

POTENCIAL DA ESPÉCIE VEGETAL Jatropha mollissima (Pohl) Baill.

CONTRA OS EFEITOS TÓXICOS DA SERPENTE Bothrops jararaca E DO

ESCORPIÃO Tityus serrulatus

NATAL

2019

JACYRA ANTUNES DOS SANTOS GOSMES

POTENCIAL DA ESPÉCIE VEGETAL Jatropha mollissima (Pohl) Baill.

CONTRA OS EFEITOS TÓXICOS DA SERPENTE Bothrops jararaca E DO

ESCORPIÃO Tityus serrulatus

Tese apresentada à Coordenação do Programa de

Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte,

como parte dos requisitos para obtenção do título

de Doutor em Ciências Farmacêuticas.

Orientador

Prof. Dr. Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa

NATAL

2019

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS

Gomes, Jacyra Antunes dos Santos.

Potencial da espécie vegetal Jatropha molissima (Pohl) Baill.

contra os efeitos tóxicos da serpente Bothrops jararaca e do

escorpião Tityus serrulatus / Jacyra Antunes dos Santos Gomes. - 2019.

126f.: il.

Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Ciências

Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Natal, RN, 2019.

Orientador: Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa.

1. Bothrops (jararaca) - Tese. 2. Tityus serrulatus - Tese.

3. Jatropha mollissima - Tese. 4. Atividade antiofídica - Tese.

5. Atividade escorpiônica - Tese. 6. Alterações sistêmicas -

Tese. I. Pedrosa, Matheus de Freitas Fernandes. II. Título.

RN/UF/BS-CCS CDU 598.115.33

Elaborado por ANA CRISTINA DA SILVA LOPES - CRB-15/263

Dedicatória

Aos meus pais, Filipe Gomes e Inácia Antunes, por todo amor,

confiança e apoio incondicional. Vocês são para mim o modelo de

determinação, caráter e honestidade.

Amo vocês de uma forma indefinível, indescritível e imensurável!

Agradecimentos

AGRADECIMENTOS

A Deus - Meu Pai - pela vida, sabedoria, força e saúde por conseguir vencer os obstáculos e

alcançar mais uma vitória.

Ao Prof. Matheus Pedrosa, meu orientador, pela primeira oportunidade em 2008, e desde

então, me orientou com toda a sua dedicação para a realização desse sonho. Muito obrigada!

As Amigas e Colegas do “Grupo Plantas” – Juliana Félix, Júlia Passos, Jacinthia Santos

e Fabiana Yamashita - pela amizade, ajuda, apoio, carinho e por todos os momentos que passamos

juntas. Foram muitos momentos de alegria e por vezes decepções, mas tudo ficava mais leve depois

de uma fatia de pizza as 20 horas. Agradeço muito pela amizade que construímos!

Aos Alunos de Iniciação Científica da “Equipe Veneno” – Joelly Cavalcanti, Beatriz

Batista e João Silva – por toda ajuda, cuidado e tempo disponibilizados para o desenvolvimento

desse sonho. Muito obrigada!

Aos Colegas da “Equipe Veneno”, pela amizade, apoio e troca de experiências

compartilhados ao longo desses anos. Em especial, agradeço a Manoela Torres pelo tempo e

dedicação na realização dos experimentos. Agradeço aos Colegas do Laboratório de Tecnologia &

Biotecnologia Farmacêutica (TecBioFar - UFRN) por todo o conhecimento compartilhado. Muito

obrigada!

Ao Prof. Arnóbio Antônio (TecBioFar), pelo conhecimento e palavras de ânimo ao longo

dos anos. Muito obrigada!

À Profª. Silvana Zuccoloto e a doutoranda Júlia Morais, do Grupo de Pesquisa em

Produtos Naturais Bioativos (PNBio – UFRN), pelas importantes sugestões e contribuições na área

de fitoquímica e produtos naturais.

À Profª. Denise Vilarinho Tambourgi, do Laboratório de Imunoquímica (Instituto

Butantan), por ceder peçonhas liofilizadas para realização dos experimentos.

À Profª. Ivanise Rebecchi, do Laboratório de Hematologia Clínica (UFRN) e Antônio

Agradecimentos

Palmielly, do Laboratório Integrado de Análises Clínicas (LIAC - UFRN), pela contribuição na

área de Bioanálises.

À minha Família, meu porto seguro. Aos meus Pais, Filipe Andrade dos Santos Gomes e

Inácia Vicente Antunes, por todo amor, carinho, confiança, educação, dedicação, paciência,

incentivo, compreensão, apoio incondicional e acima de tudo pelo exemplo de vida. Aos meus irmãos,

Djhamel Gomes e Neldy Antunes, por toda alegria, amor e dedicação. Vocês são os pilares de toda

essa vitória. Amooooooo vocês! Muito obrigada!

Ao meu Noivo, Moisés Cacama, por todo amor, confiança, paciência, amizade e dedicação.

Me desculpe pelos momentos dos estresses kkkkkkkkkk, muito obrigada pelas palavras

compreensivas, por me proporcionar momentos inesquecíveis, por incentivar na minha vida

profissional e por me fazer muito feliz. Te amoooooo!

A todos os meus Familiares que contribuíram com essa vitória. Em especial, a Avó Engraça

Candeias, a tia Hermínia Antunes, Carolina Assunção, Romy Gomes, Lucinda Gomes e o tio

Alberto Assunção (in memoriam). As primas Vilma Antunes e Stela Guadalupe. Muito obrigada

por todo amor e apoio!

Aos meus amados Sobrinhos - Luís Fhilipe, Enzo Dherick, Lucas Sulio e Laurha Cristina

– por todas as alegrias e fofuras que vocês me proporcionaram. Amo muito vocês, meus amores!

Aos meus fiéis e queridos amigos – Douglas Mackenzie, Evelyn Mackenzie, Lucilay

Bandeira, Felizardo Almeida, Vanessa Almeida, Marilda Barros, Didoney Vilhete, Elda

Morais, Isnell Silva, Teresa Paula, Inga Rodrigues, Joacisa Couto, Beatriz Maquengo e Edna

Vilela. Em especial, a minha querida amiga/irmã Suzana Amaral, por todo o ensinamento, apoio,

todos os dias de alegria, por me ensinar a ver tudo mais leve e o significado da palavra paciência.

Vocês estarão sempre presentes no meu coração. Muito obrigada!

As amigas Judite e Maria, pela ajuda na obtenção do material vegetal. Muito obrigada por

me receber e por compartilhar experiências de vida.

Aos todos os meus Professores de Graduação em Farmácia e do Programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas (PPgCF) por todo ensinamento e conhecimento

transmitido.

Agradecimentos

Aos Funcionários da Secretaria da PPgCF, em especial a Fábia Freire e o Gibson Feitosa

pela paciência e auxílio.

Aos funcionários Dona Ana e Washington pelo importante auxílio e apoio nos cuidados com

os animais no Biotério do Centro de Ciências da Saúde da UFRN.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo auxílio

financeiro concedido na forma de bolsa de doutorado.

A todos que me apoiaram de forma direta ou indiretamente a embarcarem nessa linda e

maravilhosa aventura, o meu muito obrigado!

Epígrafe

“Estai sempre alegres. Orai continuamente. Dai

graças, em toda e qualquer circunstância, porque esta

é a vontade de Deus, no Cristo Jesus, a vosso respeito.”

1 Tessalonicenses 5:16-18

Resumo

RESUMO

Os acidentes causados por animais peçonhentos são um grave problema de saúde pública. No

Brasil, a maior parte desses acidentes são associados as serpentes do gênero Bothrops e os escorpião

do gênero Tityus. Atualmente, a principal forma de tratamento disponível é a soroterapia antiveneno,

que apresenta algumas limitações, como ineficiência quanto aos efeitos locais, riscos de reações

imunológicas, custo elevado e difícil acesso em algumas regiões. Nesse sentido, a busca por novas

alternativas complementares para o tratamento envolvendo animais peçonhentos se faz relevante.

Jatropha mollissima (Pohl) Baill., (Euphorbiaceae), popularmente conhecida no Brasil como

“pinhão-bravo” apresenta amplo uso popular na medicina tradicional como antiofídica, anti-

inflamatória, antimicrobiana, cicatrizante e antitérmica. Dada a relevância dos efeitos sistêmicos no

envenenamento por B. jararaca e T. serrulatus o objetivo do presente estudo foi avaliar a eficácia

inibitória do extrato aquoso das folhas de J. mollissima frente às toxicidades sistêmicas produzidas

por essas peçonhas. Foi avaliado in vivo o efeito do extrato de J. mollissima sobre alterações

hematológicas, hemostáticas, bioquímica e estresse oxidativo em reposta a peçonha de B. jararaca;

e o edema pulmonar, alterações bioquímicas e estresse oxidativo produzidos pela peçonha do T.

serrulatus. O extrato reduziu significativo efeito da peçonha sobre o fibrinogênio, plaquetas e tempo

de tromboplastina parcial ativada (TTPA), indicando ação do extrato sobre os efeitos hemostáticos

da peçonha de B. jararaca. O extrato também inibiu os efeitos da peçonha de B. jararaca sobre a

série leucocitária sanguínea, o que indica uma ação anti-inflamatória. O extrato também foi capaz de

reduzir significativamente a toxicidade renal, hepática, muscular e pancreática da peçonha de B.

jararaca ao reverter os efeitos sobre os níveis séricos de ureia, ácido úrico, alanina aminotransferase

(ALT), aspartato aminotransferase (AST), lactato desidrogenase (LDH) e amilase. O extrato inibiu o

estresse oxidativo hepático e renal da peçonha de B. jararaca, indicando uma possível ação

antioxidante. Além disso, o edema pulmonar induzido pela peçonha de T. serrulatus foi inibido

significativamente pelo extrato. A atividade da enzima mieloperoxidase e a expressão das citocinas

IL-6 e IL-1β foram reduzidas na presença do extrato, indicando uma ação anti-inflamatória. Houve a

redução dos níveis séricos de LDH, creatina quinase (CK), Ureia, creatinina, AST e amilase induzidas

pela peçonha de T. serrulatus com o extrato, sugerindo uma inibição de dano hepático, renal e

pancreático. O extrato inibiu o estresse oxidativo hepático e renal da peçonha de T. serrulatus,

indicando uma possível ação antioxidante. In vitro, J. mollissima foi capaz de inibir a hemólise e a

citotoxicidade frente às células MDCK, o que indica uma provável ausência de toxicidade e por fim,

apresentou uma significativa atividade antioxidante em diferentes modelos realizados. Dessa forma,

conclui-se que o extrato de J. mollissima possui compostos capazes de inibir alterações sistêmicas

Resumo

induzidas por B. jararaca e T. serrulatus o que indica a potencialidade dessa espécie vegetal como

fonte de moléculas bioativas contra peçonhas botrópicas e escorpiônica.

Palavras-chave: Bothrops jararaca, Tityus serrulatus, Jatropha mollissima, atividade antiofídica,

atividade escorpiônica, alterações sistêmicas, atividade antioxidante.

Abstract

ABSTRACT

Accidents caused by venomous animals are a serious public health problem. In Brazil, most

accidents are associated with snakes of the genus Bothrops and the scorpion of the genus Tityus.

Currently, the main available treatment is the antivenom serum therapy, which has some limitations,

such as inability to neutralize local effects, risks of immunological reactions, high cost and difficult

access in some regions. In this context, the search for new complementary alternatives to treat

venomous animals is relevant. Jatropha mollissima (Pohl) Baill., (Euphorbiaceae), a medicinal plant

popularly known in Brazil as "pinhão bravo" is very used in folk medicine as antiophidic and anti-

inflammatory. Given the relevance of systemic effects of B. jararaca venom and T. serrulatus venom

envenoming, the aim of the present work was evaluate the inhibitory efficacy of aqueous extract from

leaves of J. mollissima upon systemic effects induced by these venoms. The effect of oral treatment

with aqeous extract upon hematological, hemostatic, biochemical alterations and oxidative stress in

response to B. jararaca vemom injection was evaluated in mice; and pulmonary edema, biochemical

alterations and oxidative stress produced in response to T. serrulatus venom. Extract reduced

significantly the effect of venom upon fibrinogen, platelets and activated partial thromboplastin time

(APTT), indicating the action of extract upon hemostatic effects of B. jararaca venom. The extract

also inhibited B. jararaca venom effects on leukocyte blood series, which indicates benefitial effects

upon inflammatory processes. The extract was also able to reduce significantly the renal, hepatic,

muscular and pancreatic toxicity of B. jararaca venom, by reverting the effects upon serum levels of

urea, uric acid, alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), lactate

dehydrogenase (LDH) and amylase. The extract inhibited the hepatic and renal oxidative stress of B.

jararaca venom, indicating a possible antioxidant action. In addition, pulmonary edema induced by

T. serrulatus venom was inhibited significantly by extract. Myeloperoxidase and IL-6 and IL-1β

cytokines were reduced in the presence of extract, indicating benefitial effects upon inflammatory

processes. The extract was also able to reduce significantly the renal, hepatic, muscular and pancreatic

toxicity of T. serrulatus venom, by reverting the effects upon serum levels LDH, creatine kinase

(CK), urea, creatinine, AST and amylase suggesting an inhibition of hepatic, renal and pancreatic

damage. The extract inhibited the hepatic and renal oxidative stress of T. serrulatus venom, indicating

a possible antioxidant action. In vitro, J. mollissima was able to inhibit hemolysis and cytotoxicity

against MDCK cells, indicating that the absence of toxicity and, finally, the extract showed

antioxidant activity in different models. Thus, it is concluded that the extract of J. mollissima posseses

compounds able of decresae systemic alterations induced by B. jararaca and T. serrulatus, indicating

the potentiality of this vegetal species as a source of bioactive molecules against bothropic and

Abstract

scorpionic venoms.

Keywords: Bothrops jararaca, Tityus serrulatus, Jatropha mollissima, atividade antiofídica, Anti-

scorpion activity, systemic effects, antioxidante activity.

Lista de Figuras

LISTA DE FIGURAS FIGURA 1: CARACTERÍSTICAS DOS GÊNEROS DAS SERPENTES PEÇONHENTAS --------------------------- 23

FIGURA 2: REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICAS DOS PRINCIPAIS COMPONENTES PROTEICOS E NÃO

PROTEICOS DAS PEÇONHAS OFÍDICAS------------------------------------------------------------ 27

FIGURA 3: SERPENTE BOTROPS JARARACA -------------------------------------------------------------------- 29

FIGURA 5: MORFOLOGIA DO ESCORPIÃO TITYUS SERRULATUS --------------------------------------------- 37

FIGURA 6: ESCORPIÃO TITYUS SERRULATUS ------------------------------------------------------------------ 39

FIGURA 7: JATROPHA MOLLISSIMA (POHL) BAILL ------------------------------------------------------------ 53

FIGURA 8: NÚCLEO FUNDAMENTAL DOS FLAVONOIDES. --------------------------------------------------- 55

FIGURA 9: DESENHO EXPERIMENTAL DA PEÇONHA DE B. JARARACA -------------------------------------- 63

FIGURA 10: DESENHO EXPERIMENTAL DA PEÇONHA DE T. SERRULATUS ---------------------------------- 66

FIGURA 11: ATIVIDADE HEMOLÍTICA DO EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE J. MOLLISSIMA ---------- 72

FIGURA 12: CITOTOXICIDADE FRENTE ÀS CÉLULAS MDCK ----------------------------------------------- 73

FIGURA 13: INIBIÇÃO DAS ATIVIDADES DEFIBRINOGENANTE E TROMBOCITOPÊNICA DA PEÇONHA DE B.

JARARACA COM O EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE J. MOLLISSIMA ------------------------ 74

FIGURA 14: INIBIÇÃO DAS ALTERAÇÕES HEMATOLÓGICAS INDUZIDA DA PEÇONHA DE B. JARARACA COM

O EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE J. MOLLISSIMA ------------------------------------------ 75

FIGURA 15: INIBIÇÃO DAS ALTERAÇÕES HEMATOLÓGICAS INDUZIDA DA PEÇONHA DE B. JARARACA COM


FIGURA 16: INIBIÇÃO DO ESTRESSE OXIDATIVO HEPÁTICO INDUZIDO PELA PEÇONHA DE B. JARARACA

COM O EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE J. MOLLISSIMA ------------------------------------ 77

FIGURA 17: INIBIÇÃO DO ESTRESSE OXIDATIVO RENAL INDUZIDO PELA PEÇONHA DE B. JARARACA COM


FIGURA 18: INIBIÇÃO DO EDEMA PULMONAR INDUZIDO PELA PEÇONHA DE T. SERRULATUS COM O

EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE J. MOLLISSIMA --------------------------------------------- 79

FIGURA 19: EFEITO DO EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE J. MOLLISSIMA FRENTE AS CITOCINAS PRÓ-

INFLAMATÓRIAS IL-6 E IL-1Β INDUZIDAS PELA PEÇONHA DE T. SERRULATUS -------------- 80

FIGURA 20: INIBIÇÃO DAS ALTERAÇÕES BIOQUÍMICAS INDUZIDAS PELA PEÇONHA DE T. SERRULATUS

PELO EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE J. MOLLISSIMA -------------------------------------- 81

FIGURA 21: INIBIÇÃO DO ESTRESSE OXIDATIVO HEPÁTICO INDUZIDO PELA PEÇONHA DE T. SERRULATUS

COM O EXTRATO DE J. MOLLISSIMA -------------------------------------------------------------- 83

FIGURA 22: INIBIÇÃO DO ESTRESSE OXIDATIVO RENAL INDUZIDO PELA PEÇONHA DE T. SERRULATUS COM

O EXTRATO DE J. MOLLISSIMA -------------------------------------------------------------------- 85

FIGURA 23: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE IN VITRO DE J. MOLLISSIMA ------------------- 86

Lista de Abreviaturas e Siglas

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AChE Acetilcolinesterase

ALT Alanina aminotrasferase

ANOVA Análise de variância

AST Aspartato aminotransferase

CCS Ciências da Saúde

CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais

CK Creatina quinase

COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazil

DTNB Ácido 5,5-ditiobis-(2-nitrobenzóico)

EDTA Etilenodiamino tetra-acético

EJm / JM Extrato de Jatropha mollissima

ERNs Espécies de reativas de nitrogênio

EROs Espécies reativas de oxigênio

FUNED Fundação Ezequiel Dias

GSH Glutationa reduzida

HCl Ácido clorídrico

IFN-γ Interferon γ

IL-1β Interleucina 1β

IL-6 Interleucina 6

IL-8 Interleucina 8

LAOOs L-amino oxidases

LDH Lactato desidrogenase

MDA Malondialdeído

MDCK Células normais de rim de cachorro

MPO Enzima mieloperoxidase

MTT Brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio

PBj Peçonha de Bothrops jararaca

PBS Tampão fosfato-salino

SAAr Soro antiaracnídico

SAB Soro antibotrópico

SABC Soro antibotrópico-crotálico

Lista de Abreviaturas e Siglas

SABC Soro antibotrópico-crotálico

SABL Antibotrópico-láquetico

SAC Soro anticrotálico

SAE Soro antielapídico

SAEE Soro antiescorpiônico

SAL Soro antilaquético

SFB Soro fetal bovino

SINAN Sistema de Notificação de Informação de Agravos de Notificação

SINITOX Sistema Nacional de Informações Tóxico-Farmacológicas

SISBIO Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade

SUS Sistema Único de Saúde

SVMP Enzima metaloprotease

SVSP Enzima serinoprotease

SVTLE Enzima semelhantes à trombina

TsV / PTs Peçonha de Tityus serrulatus

TTPA Tempo de Tromboplastina parcial ativada

UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Sumário

SUMÁRIO

RESUMO .......................................................................................................................................... 10

ABSTRACT ...................................................................................................................................... 12

LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................................... 14

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ..................................................................................... 15

INTRODUÇÃO ................................................................................................................................ 21

FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .................................................................................................. 23

1 SERPENTES ................................................................................................................................. 23

2 OFIDISMO .................................................................................................................................... 25

3 SERPENTE Bothrops jararaca .................................................................................................... 28

3.1 PRINCIPAIS TOXINAS DA PEÇONHA BOTRÓPICA .................................................. 29

3.1.1 Metaloproteases (SVMPs) ................................................................................................. 29

3.1.2 Serinoproteases (SVSPs) ................................................................................................... 30

3.1.3 Fosfolipases A2 (PLA2s) .................................................................................................... 30

3.1.4 Hialuronidases ................................................................................................................... 31

3.1.5 L-aminoácido-oxidases (LAOOs) ..................................................................................... 31

4 EFEITOS LOCAIS DO ENVENENAMENTO BOTRÓPICO ................................................ 32

5 EFEITOS SISTÊMICOS DO ENVENENAMENTO BOTRÓPICO ...................................... 33

5.1 Alterações do Sistema Hemostático ...................................................................................... 33

5.1.1 Coagulação sanguínea – uma breve revisão ...................................................................... 33

5.2 Alterações Hematológicas ...................................................................................................... 36

6 ESCOPIONISMO ......................................................................................................................... 37

7 ESCORPIÃO Tityus serrulatus .................................................................................................... 39

7.1 Peçonha de Tityus serrulatus .................................................................................................. 40

8 INFLAMAÇÃO EM RESPOSTA AO ENVENENAMENTO ESCORPIÔNICO ................. 41

9 ESTRESSE OXIDATIVO ............................................................................................................ 46

10 SOROTERAPIA ......................................................................................................................... 47

11 PLANTAS MEDICINAIS: TRATAMENTO ALTERNATIVO A SOROTERAPIA .......... 50

12 ESPÉCIE VEGETAL Jatropha mollissima (Pohl) Baill .......................................................... 51

12.1 Família: Euphorbiace........................................................................................................... 51

12.2 Gênero: Jatropha .................................................................................................................. 51

12.3 Espécie Vegetal Jatropha mollissima (Pohl) Baill. ............................................................. 52

13 FLAVONOIDES ......................................................................................................................... 54

3 OBJETIVOS .................................................................................................................................. 58

3.1 OBJETIVO GERAL .............................................................................................................. 58

Sumário

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................... 58

4 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................................... 60

1 MATERIAL ................................................................................................................................... 60

1.1 Material Vegetal ..................................................................................................................... 60

1.2 Peçonhas e Soros Antivenenos .............................................................................................. 60

1.3 Animais de Experimentação .................................................................................................. 60

2 MÉTODOS .................................................................................................................................... 61

2.1 Preparação do Extrato Aquoso das Folhas de J. mollissima .............................................. 61

2.2 ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE IN VITRO .................................................................. 61

2.2.1 Atividade hemolítica .......................................................................................................... 61

2.2.2 Citotoxicidade frente às células MDCK ............................................................................ 62

2.3 AVALIAÇÃO DOS EFEITOS SISTÊMICOS INDUZIDOS PELA PEÇONHA DE

Bothrops jararaca COM O EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE J. mollissima ............ 62

2.3.1 Desenho experimental - Peçonha de B. jararaca .............................................................. 62

2.3.2 Avaliação das alterações hemostáticas e hematológicas ................................................... 63

2.3.3 Avaliação das alterações bioquímicas ............................................................................... 63

2.4 AVALIAÇÃO DO ESTRESSE OXIDATIVO HEPÁTICO E RENAL INDUZIDO

PELA PEÇONHA DE Bothrops jararaca COM O EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE

J. mollissima .................................................................................................................................. 64

2.4.1 Preparo dos homogenatos dos órgãos ................................................................................ 64

2.4.2 Dosagem de proteína dos órgãos ....................................................................................... 64

2.4.3 Dosagem de nitrito ............................................................................................................. 64

2.4.4 Dosagem de malondialdeído .............................................................................................. 65

2.4.5 Dosagem de glutationa reduzida ........................................................................................ 65


Tityus serrulatus COM O EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE J. mollissima .............. 65

2.5.1 Desenho experimental - Peçonha de T. serrulatus ............................................................ 65

2.5.2 Avaliação do edema pulmonar induzido por T. serrulatus ................................................ 66

2.5.3 Dosagem de citocinas pró-inflamatórias no tecido pulmonar ........................................... 66

2.5.4 Dosagem da enzima mieloperoxidase (MPO) no pulmão ................................................. 67

2.5.5 Avaliação das alterações bioquímicas ............................................................................... 67

2.6 AVALIAÇÃO DO ESTRESSE OXIDATIVO HEPÁTICO E RENAL INDUZIDOS

PELA PEÇONHA DE Tityus serrulatus COM O EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE

J. mollissima .................................................................................................................................. 68

2.7 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE IN VITRO DO EXTRATO

AQUOSO DAS FOLHAS DE J. mollissima ............................................................................... 68

2.7.1 Capacidade antioxidante total ............................................................................................ 68

2.7.2 Sequestro de radicais hidroxila .......................................................................................... 68

Sumário

2.7.3 Sequestro de radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) .................................................. 68

2.7.4 Quelação de ferro ............................................................................................................... 69

2.7.5 Quelação de cobre .............................................................................................................. 69

2.7.6 Poder redutor ..................................................................................................................... 69

2.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................................... 69

5 RESULTADOS.............................................................................................................................. 72

5.1 ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE IN VITRO .................................................................. 72

5.1.1 Atividade hemolítica .......................................................................................................... 72

5.1.2 Citotoxicidade frente às células MDCK ............................................................................ 72

5.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOFÍDICA IN VIVO DO EXTRATO AQUOSO

DAS FOLHAS DE J. mollissima ................................................................................................. 73

5.2.1 Inibição das atividades defibrinogenante e trombocitopênica induzidas pela peçonha de B.

jararaca ...................................................................................................................................... 73

5.2.2 Inibição das alterações hematológicas induzidas pela peçonha de B. jararaca ................ 74

5.2.3 Inibição das alterações bioquímicas induzidas pela peçonha de B. jararaca .................... 75

5.2.4 Inibição do estresse oxidativo hepático induzido pela peçonha de B. jararaca ................ 77

5.2.5 Inibição do estresse oxidativo renal induzido pela peçonha de B. jararaca ..................... 77

5.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIESCORPIÔNICA IN VIVO DO EXTRATO


5.3.1 Inibição do edema pulmonar induzido pela peçonha de T. serrulatus .............................. 78

5.3.2 Efeitos do extrato de J. mollissima frente as citocinas pró-inflamatórias ......................... 79

5.3.3 Inibição das alterações bioquímicas induzidas pela peçonha de T. serrulatus .................. 80

5.3.4 Inibição do estresse oxidativo hepático induzido pela peçonha de T. serrulatus .............. 82

5.3.5 Inibição do estresse oxidativo renal induzido pela peçonha de T. serrulatus ................... 84



6 DISCUSSÃO .................................................................................................................................. 89

7 CONCLUSÕES ........................................................................................................................... 101

7 REFERÊNCIAS .......................................................................................................................... 104

ANEXOS ......................................................................................................................................... 117

20

Introdução

1 INTRODUÇÃO

21

Introdução

INTRODUÇÃO

Os acidentes causados por animais peçonhentos são um grande problema de saúde pública

em muitas regiões do mundo, devido à frequência com que ocorrem, a morbi-mortalidade que

ocasiona e as sequelas deixadas nas vítimas. Por essas razões, esses acidentes são considerados

como sendo uma doença negligenciada principalmente na África, América Latina, Ásia e Oceania

(FONSECA et al., 2009). No Brasil, cerca de 90 % dos acidentes ofídicos são causados por

serpentes do gênero Bothrops (BRASIL, 2001; BRASIL, 2005; BERNARDE, 2011). Os efeitos

locais (dor, edema, hemorragia e necrose tecidual) e sistêmicos (distúrbios da coagulação

sanguínea, alterações cardiovasculares, renais e choque) causados pela peçonha das serpentes do

gênero Bothrops é devido aos inúmeros componentes proteicos e não-proteicos (carboidratos,

lipídios, nucleotídeos, aminas biogênicas e vários íons), que fazem parte da sua constituição

(PINHO; PEREIRA, 2001; BOCHNER; STRUCHINER, 2002; GUTIÉRREZ, 2002). No Brasil,

os escorpiões de importância em saúde pública são os do gênero Tityus, sendo as principais

espécies: T. serrulatus, T. bahiensis, T. stigmurus e T. obscurus. O envenenamento causado por

Tityus, em especial T. serrulatus, induz uma intensa resposta inflamatória com liberação de vários

mediadores inflamatórios, enzimas proteolíticas e neurotoxinas, que geram um quadro clínico

grave e até fatal do paciente (BRASIL, 2009).

Atualmente, a soroterapia antiveneno (SAV), por via endovenosa, é o único tratamento

cientificamente validado para se tratar acidentes por animais peçonhentos. Porém essa terapia não

é eficaz para neutralizar os efeitos locais causados pela peçonha e, além disso, apresenta outras

desvantagens como, por exemplo: o difícil acesso em algumas regiões, riscos de reações

imunológicas, são eficientes até determinado tempo após a inoculação e apresentam um custo

elevado (BRASIL, 2001; GUTIÉRREZ; LOMONTE, 1989).

Por apresentar essas desvantagens, vários investigadores tentam buscar novos compostos,

a partir de plantas, que atenuem os efeitos tóxicos das peçonhas, para complementar a soroterapia

e nesse sentido, vários estudos farmacológicos vêm demonstrando que extratos e frações de

algumas plantas utilizadas na medicina tradicional possuem propriedades, antibacteriana, anti-

inflamatória e antiofídica (MORS et al., 2000; JANUÁRIO et al., 2004; FÉIX-SILVA et al., 2014;

GOMES et al., 2016). Sendo assim, o objetivo do presente estudo visa neutralizar as alterações

sistêmicas induzida pelas peçonhas de B. jararaca e T. serrulatus com o extrato aquoso das folhas

de Jatropha mollissima (Pohl) Bail. Vale salientar que J. mollissima é utilizada na medicina

popular para diversos fins destacando-se: inflamação, cicatrização e contra picadas de serpentes

(LEAL; AGRA, 2005). Nesse sentido, espera-se contribuir para o desenvolvimento de novas

alternativas para complementar a soroterapia.

22

Fundamentação teórica

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

23


FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

1 SERPENTES

As serpentes são animais vertebrados que compõem o reino Animalia, filo Chordata,

subfilo Vertebrata, classe Reptilia, subclasse Lepidosauria, ordem Squamata e subordem

Serpentes. No mundo, cerca de 3 mil espécies de serpentes (14 % consideradas peçonhentas) são

conhecidas e distribuídas entre 20 famílias e 465 gêneros (PINHO; OLIVEIRA; FALEIROS,

2004). Segundo Cardoso et al. (2003), as serpentes podem ser classificadas como: peçonhentas e

não peçonhentas. As peçonhentas são aquelas que produzem toxinas nas glândulas especializadas

e têm estruturas apropriadas para inoculá-las (ferrões, espinhos e dentes), enquanto que as não

peçonhentas produzem as toxinas, porém não têm um aparato para a inoculação. As serpentes

possuem um par glândulas secretórias que derivam das glândulas salivares e estão localizadas atrás

dos olhos, na mandíbula superior, conectadas a dutos que levam a secreção tóxica para a base de

dentes utilizados para a inoculação. Essas glândulas produzem e armazenam uma secreção tóxica,

que são secretadas quando há uma contração muscular no momento da picada (JUNQUEIRA; HO,

2002; NORRIS; BUSH; CARDWELL, 2016; WARRELL, 2010). Na literatura, estudos mostram

que as serpentes utilizam as suas peçonhas como forma de defesa contra os seus predadores,

imobilização das suas presas e para auxiliar na digestão (BRODIE, 2009; KANG et al., 2011).

Outras características importantes das serpentes peçonhentas que se destacam, são: a presença da

fosseta loreal, a dentição e a cauda diferenciada.

Figura 1: Características dos gêneros das serpentes peçonhentas

Fonte: Adaptado de Brasil (2001).

A: Morfologia da cabeça da serpente peçonhenta: presença da fosseta loreal, dentição (presa) desenvolvida e móvel.

Ausência de fosseta loreal no gênero Micrurus, com dentição pouco desenvolvida e fixa.

B: Morfologia da cauda dos gêneros Bothrops, Lachesis e Crotalus.

24


A fosseta loreal é um órgão termo sensorial rico em terminações nervosas e localiza entre

as narinas e os olhos. A dentição das serpentes peçonhentas pode se apresentar de quatro formas:

áglifa, se caracteriza por um maxilar sem dentes sulcados para inoculação do veneno; opistóglifa,

os dentes estão na região posterior da mandíbula; proteróglifa, os dentes são pequenos e maciços,

sendo um par de dentes dianteiros semi-caniculados, de tamanho semelhante aos outros e que

limita a injeção da peçonha; solenóglifa, têm um par de dentes dianteiros caniculados, maiores

que os outros dentes, e com capacidade de se movimentar para frente no momento da picada.

Esse tipo de dentição é a mais eficiente na inoculação da peçonha (BRASIL, 2001; PINHO;

PERREIRA, 2001).

Em relação ao corpo, elas apresentam um corpo alongado coberto de escamas córneas,

hemipênis bifurcado e com espinho. A cauda pode se apresentar lisa (Bothrops), com chocalho ou

guizo (Crotalus) e ainda com escamas eriçadas (Lachesis). No que diz respeito a sua reprodução,

elas podem ser vivíparas (Bothrops e Crotalus) ou ovíparas (Micrurus e Lachesis) (BRASIL, 2001;

PINHO; PERREIRA, 2001; CISCOTTO, 2005). Vale salientar que, as serpentes do gênero

Micrurus, embora sejam peçonhentas, não possuem a fosseta loreal e possuem dentes inoculadores

pouco desenvolvidos e fixos na região anterior da boca (BRASIL, 2001; PINHO; PERREIRA,

2001). É de suma importância o conhecimento das características morfológicas desses animais

visto que, auxilia no reconhecimento de serpentes peçonhentas.

O Brasil apresenta uma das mais ricas faunas de serpentes no mundo sendo conhecidas 403

espécies, pertencentes a dez famílias: Anomalepididae (6 espécies), Leptotyphlopidae (14

espécies), Typhlopidae (6 espécies), Aniliidae (1 espécie), Tropidophiidae (1 espécie), Boidae (12

espécies), Colubridae (34 espécies), Dipsadidae (237 espécies), Elapidae (33 espécies) e Viperidae

(31 espécies). Dessas, 64 espécies são peçonhentas e responsáveis pelo ofidismo. (BRASIL, 2001,

2005; BERNANDE, 2014; UETZ, 2017). No Brasil, 4 gêneros de serpentes peçonhentas adquirem

importância epidemiológica, sendo eles: Bothrops, Crotalus, Lachesis e Micrurus, (BRASIL,

2005; BRASIL, 2001).

O gênero Crotalus (Viperidae) tem cinco subespécies, entre elas: Crotalus durissus

cascavella, C. d. collilineatus, C. d. marajoenis, C. d. ruruima e C. d. terrificus. A espécie Crotalus

durissus é popularmente conhecida como cascavel, maracá, cascavel-quatro-ventas e possui um

ruído parecido a um chocalho. Esse gênero tem preferência por áreas secas, pedregosas, campos

abertos e ocorrem nas regiões áridas e semi-áridas do Nordeste, áreas abertas do Sul, Sudeste e

Norte. As espécies desse gênero são responsáveis pela maior letalidade, devido à evolução do

quadro clínico do paciente para insuficiência renal aguda (BRASIL, 2001; BERNADE, 2011).

As serpentes do gênero Lachesis é conhecida como surucucu, surucucu-pico-de-jaca e

25


malha-de-fogo. Geograficamente, ocorre na Amazônia, na mata Atlântica e da Paraíba até o Norte

do Rio de Janeiro e é responsável por aproximadamente 0,95 % de letalidade (BRASIL, 2001).

As serpentes da família Elapidae têm em torno de um metro e são encontradas em todo

Brasil por várias denominações populares, como: coral, coral verdadeira ou boicorá. Pertencem ao

gênero Micrurus e Leptomicrurus. Como características morfológicas apresentam o que se

chamam de anéis, de cores variadas, em qualquer combinação (vermelhos, pretos e brancos)

envolvendo toda a circunferência do corpo. São responsáveis 0,52 % de letalidade (BRASIL,

2005).

2 OFIDISMO

Os acidentes ofídicos são um grave problema de saúde pública e social em todo mundo,

especialmente na África, América Latina, Ásia e partes da Oceania. Embora o número exato de

acidentes por serpentes ainda seja desconhecido, cerca de 5 milhões de pessoas são acometidas a

cada ano e pelo menos 125 mil pessoas morrem em decorrência do ofidismo, com cerca de 400

mil amputações e outras deficiências permanentes (GUTIÉRREZ et al., 2015; WHO, 2016). Na

Europa, esses acidentes são relativamente raros, enquanto que na África a notificação é escassa ou

inexistente. Já na Ásia, o ofidismo provoca de 25 mil a 35 mil óbitos por ano. Na América do Sul,

especialmente no Brasil, cerca de 20 mil casos são notificados por ano, fazendo do Brasil o país

que mais tem casos de ofidismo na América Latina (ALBUQUERQUE et al., 2013; ANTUNES

et al., 2010). Devido a fatores como: à frequência com que ocorrem, a morbi/mortalidade que

ocasiona e as sequelas deixadas nas vítimas, o ofidismo está na lista de Doenças Tropicais

Negligenciadas desde o ano de 2009 (FONSECA et al., 2009; LALLOO, 2009; GUTIÉRREZ et

al., 2013).

No Brasil, os dados sobre acidentes por animais peçonhentos são coletados através do

Sistema de Notificação de Informação de Agravos de Notificação (SINAN/MS), Sistema Nacional

de Informações Tóxico-Farmacológicas (SINITOX/Fiocruz/MS), Sistema de Informação

Hospitalares do Sistema Único de Saúde/MS e o Sistema de Informações sobre Mortalidade/MS

(SIM). Contudo, os dados epidemiológicos disponíveis estão aquém da realidade epidemiológica

do Brasil devido a inadequação da coleta de dados e subnotificação de casos, tendo em vista, as

dificuldades de acessos aos serviços de saúde (BOCHNER; STRUCHINER, 2002; LEMOS et al.,

2009; CHIPPAUX, 2015).

No SINAN foram registrados no ano de 2015, um total de 24,467 casos de acidentes

ofídicos no Brasil. No mesmo ano, foram registrados 107 óbitos, onde a região Norte apresentou

uma incidência de 55,4, o Nordeste 11,0, Sudeste 7,1, Sul 8,4 e o Centro-Oeste 18,6 (SINAN,

26


2016). A ocorrência do ofidismo varia de acordo com a época do ano, estando relacionado a fatores

climáticos de cada região do país (BOCHNER; STRUCHINER, 2002; BRASIL, 2001)

Esses acidentes acometem principalmente indivíduos de áreas rurais de sexo masculino, na

faixa etária de 15 a 49 anos, sendo os membros inferiores (dedos de mãos e pés) as partes mais

comprometidas. Os indivíduos afetados muitas das vezes desenvolvem complicações locais

(especialmente acidentes causados por serpentes do gênero Bothrops) devido ao uso de torniquete

no local da picada e a falta e/ou atraso da soroterapia específica (BRASIL, 2009; CHIPPAUX,

2015).

O gênero Bothrops é o responsável pela maior parte dos acidentes (GUTIÉRREZ, 2011;

BRASIL, 2005). A maioria dos acidentes são considerados leves (50,7 %), embora haja casos

considerados moderados (36,1 %), graves (6,8 %) e com pouca frequência à morte (0,4 %)

(BOCHNER; STRUCHINER, 2002; BRASIL, 2009, 2010). A gravidade do quadro irá depender

da espécie envolvida, a quantidade de peçonha inoculada e do membro atingido. Outro fator

importante é o tempo decorrido entre o acidente e o atendimento (BERNARDE, 2014)

A peçonha das serpentes é uma mistura complexa de componentes proteicos e não

proteicos (Figura 2). As proporções desses compostos variam entre as famílias das serpentes,

gêneros e espécies e entre as mesmas espécies. A composição da peçonha pode ainda variar em

função da idade, sexo, hábitos alimentares, distribuição geográfica e a sazonalidade (FURTADO;

TRAVAGLIA-CARDOSO; ROCHA, 2016).

A porção não proteica (0,5 % a 1 %) abrange componentes orgânicos (aminas biogênicas,

aminoácidos livres, carboidratos e nucleosídeos) e componentes inorgânicos (cálcio, sódio,

potássio, fósforo, magnésio e pequenas quantidades de metais como zinco, ferro, cobre, cobalto e

manganês) (WARRELL, 2010). Os componentes não proteicos são pouco expressivos em

quantidade e em ação biológica, porém apresentam função coadjuvante na ação enzimática.

Componentes inorgânicos agem estabilizando algumas proteínas do veneno, enquanto que os íons

possivelmente atuam nos mecanismos catalíticos de alguns componentes enzimáticos, como as

metaloprotease e as fosfolipases (BRAUD; BOM; WISNER, 2000; AIRD, 2002).

27


Figura 2: Representação esquemáticas dos principais componentes proteicos e não proteicos das peçonhas

ofídicas

Fonte: Adaptado de Ramos; Selistre-de-Araujo (2006).

A porção proteica é a mais importante do ponto de vista biológico, constituindo

aproximadamente 95 % do seu peso seco. É constituída por várias proteínas com ou sem efeito

enzimático e peptídeos, sendo esta responsável por quase a totalidade dos efeitos biológicos da

peçonha (CHIPPAUX; GOYFFON, 1998; SLAGBOOM et al., 2017).

As principais toxinas presentes na peçonha são as fosfolipases A2 (PLA2s), metaloproteases

(SVMPs), serinoproteases (SVSPs), hialuronidases, L-aminoácido-oxidases (LAAOs),

acetilcolinesterases (AChEs) e nucleotidases. Já as proteínas desprovidas da atividade enzimáticas

contêm toxinas específicas, podendo afetar as funções vitais de nervos, músculos, coração e

28


permeabilidade das membranas. Como exemplo temos as lectinas tipo C, neurotoxinas e

cardiotoxinas (GUTIÉRREZ, 2002; RAMOS; SELISTRE-DE-ARAUJO, 2006; KANG et al.,

2011). Os efeitos tóxicos do envenenamento ofídico levam a um imediato e proeminente dano

tecidual local (edema, hemorragia, mionecrose e dermonecrose) e sistêmicos (distúrbios na

coagulação, alterações cardiovasculares, hipotensão, dano no miocárdio, choque hipovolêmico,

alterações renais, alterações neurotóxicas; rabdomiólise generalizada com mioglobinúria e

hemólise intravascular) (SLAGBOOM et al., 2017; WARRELL, 2012). De forma resumida, a

Figura 2 apresenta os principais componentes da peçonha ofídica.

3 SERPENTE Bothrops jararaca

O gênero Bothrops pertencente à família Viperidae, compreende mais de 60 espécies no

Brasil (incluindo os gêneros Bothriopsis e Bothrocophias), sendo as principais: B. erythromelas

(principal espécie do Nordeste), B. jararaca (principal espécie do Sudeste), Bothrops atrox

(encontrado na região Norte), B. jararacussu (predominante nas regiões Sul e Sudeste); B. moojeni

(principal espécie dos cerrados). Jararaca, jararaca-da-seca, ouricana, jararacuçu, urutu-cruzeira,

jararaca-do-rabo-branco, surucucurana, são algumas denominações utilizadas popularmente

(BRASIL, 2001, 2005). Esse gênero, de um modo em geral, apresenta como característica cauda

lisa, ausência de chocalho e dependendo da região podem apresentar cores variadas. Habitam em

zonas rurais e periferias de grandes cidades e tem preferência por ambientes úmidos e locais com

propagação de roedores. Quando ameaçada é muito agressiva e têm hábitos predominantemente

noturnos (BRASIL, 2001; PINHO; PERREIRA, 2001).

A espécie B. jararaca (Figura 3) é conhecida popularmente por jararaca e é a responsável

por maior número de acidentes ofídicos na região Sudeste. Essa espécie aparece em todo o

território nacional principalmente na Bahia, Minas Gerais, Espirito Santo, Rio de Janeiro, São

Paulo, Santa Catarina e Rio Grande do Sul. Possui aproximadamente 1 metro de comprimento e

se adapta facilmente em locais comum ao homem (BRASIL, 2001; PINHO; PERREIRA, 2001;

BRASIL, 2005;

.

29


Figura 3: Serpente Bothrops jararaca

Fonte: Treknature.com

3.1 PRINCIPAIS TOXINAS DA PEÇONHA BOTRÓPICA

A seguir, as metaloproteases, serinoproteases, fosfolipases A2, as hialuronidases e as L-

aminoácido-oxidases serão descritas em maiores detalhes, visto que elas são primordiais na

peçonha botrópica e apresentam uma ampla variedade de efeitos biológicos.

3.1.1 Metaloproteases (SVMPs)

A peçonha ofídica contém em sua composição, aproximadamente 30 % de metaloproteases

(SVMPs), as quais desempenham um papel central no envenenamento. Elas têm uma massa

molecular entre 20 a 100 kDa, são dependentes de zinco e por esse motivo são fortemente inibidas

pelos agentes quelantes de metais como o EDTA. De acordo com a organização de seu domínio

catalítico (composto por aproximadamente 215 aminoácidos), são classificadas em três grupos

principais (P-I, P-II e P-III) (KANG et al., 2011; TAKEDA; TAKEYA; IWANAGA, 2012;

MARKLAND; SWENSON, 2013). As proteases da classe P-I apresentam 20 a 30 kDa de peso

molecular, possuem apenas um domínio proteinase na sua forma madura e a ação hemorrágica é

baixa ou ausente, porém induzem lesão local. A P-II apresenta a massa molecular variando de 30

a 60 kDa e alta atividade hemorrágica, possuindo um domínio proteinase e um domínio

desintegrina (responsável pela ação antiagregante plaquetária). A P-III possuem a massa molecular

entre 60 a 90 kDa, são extremamente hemorrágicas, contém três domínios: proteinase, um

semelhante à desintegrina e o outro rico em cisteína) (GUTIÉRREZ; RUNCAVADO, 2000;

TAKEDA; TAKEYA; IWANAGA, 2012).

30


As SVMPs são importantes na fisiologia do envenenamento, visto que elas causam o

edema, a hemorragia local e sistêmica, ativam o sistema complemento, mionecrose, coagulopatias

e levam a necrose tecidual. Sendo assim, um dos mecanismos propostos para a ação das SVMPs é

que elas agem sobre as células endoteliais dos capilares e degradam da membrana basal e a matriz

extracelular. Essa degradação da membrana se dá diretamente no colágeno do tipo IV, laminina e

fibronectina e consequentemente leva a lise das células endoteliais dos capilares e o

extravasamento de plasma e células sanguíneas para os tecidos conectivos (SERRANO; FOZ,

2005; RAMOS; SELISTRE-DE-ARAUJO, 2006). Entretanto, algumas SVMPs não possuem

atividade hemorrágica, mas desiquilibram a homeostase através de efeitos pro-coagulantes ou

anticoagulantes, pró-inflamatórios e de inibição da agregação plaquetária (BJARNASON; FOX,

1994; GUTIÉRREZ et al., 2005).

3.1.2 Serinoproteases (SVSPs)

As serinoproteases são enzimas abundantes em peçonhas ofídicas, podendo representar até

20 % do conteúdo total de proteínas. São sintetizadas como os zimogênios e consideradas

glicoproteínas de cadeia única. SVSPs são enzimas proteolíticas semelhantes à tripsina, com cerca

de 30 a 60 kDa, possuem aproximadamente 235 aminoácidos e 12 resíduos de cisteína (KANG et

al., 2011). As SVSPs são dependentes dos cofatores Ca2+, Zn2+ e fosfolipídios, e são capazes de

hidrolisar ligações peptídicas utilizando mecanismo covalentes de catálise, através dos resíduos

formados por serina, histidina e aspartato (SERRANO; MAROUN, 2005; ZELANIS et al., 2015).

O resíduo de serina é altamente reativo e tem a função de formar o complexo acil-enzima

transitório, por outro lado os resíduos de histidina e aspartato estabilizam esse complexo formado

pela serina no sítio ativo da enzima, formando a tríade Histidina-Aspartato-Serina. Compostos

que têm a capacidade de modificar o resíduo ativos de serina ou o uso de inibidores competitivos

podem inibir a ação das SVSPs (SERRANO; MAROUN, 2005).

As SVSPs estão relacionadas com às desordens hemostáticas causada pela peçonha,

interferindo na cascata da coagulação sanguínea, através da degradação proteolítica, ativação/

inibição da agregação plaquetária, coagulação e fibrinólise. Essas enzimas isoladas não são letais,

porém quando associadas com as outras enzimas da peçonha contribuem para o efeito tóxico

encontrado no quadro do envenenamento (SERRANO; MAROUN, 2005; ZAQUEO et al., 2014).

3.1.3 Fosfolipases A2 (PLA2s)

As fosfolipases A2 (PLA2s) são enzimas termoestáveis que causam a hidrólise da ligação

éster sn-2-acil de fosfolipídios de membranas celulares, em uma reação dependente de cálcio, e

31


consequentemente libera os lisofosfolipídeos e os ácidos graxos (KINI, 2003; GUTIÉRREZ;

LOMONTE, 2013). PLA2s estão amplamente distribuídas na natureza, podendo ser classificadas

como PLA2s intracelulares (encontradas em várias células, dependentes do cálcio, pesando 85 kDa

e estão envolvidas no metabolismo e remodelamento de fosfolipídios, bem como na sinalização

celular) e PLA2s extracelulares (encontradas em secreções pancreáticas, exsudatos inflamatórios

e nas peçonhas de répteis e insetos. São estáveis, pesando 12 a 15 kDa, cálcio-dependentes e agem

hidrolisando os fosfolipídios) (OWNBY et al., 1999; CASTRO et al., 2000)

Na peçonha ofídica, as PLA2s são proteínas de baixo peso molecular (14 kDa), apresentam

pontes de dissulfeto e produzem efeitos biológicos, tais como edematogênico, miotóxico,

cardiotóxico, neurotóxico, hemolítico, anticoagulante e indutor/inibidor da agregação plaquetária,

o que demonstra a toxicidade dessas toxinas (OWNBY et al., 1999; DE PAULA et al., 2009;

GUTIÉRREZ; LOMONTE, 2013). Gutiérrez e Lomonte (2013) correlacionaram as PLA2s com os

efeitos inflamatórios desencadeados pelos acidentes botrópicos e observaram que as PLA2s

causaram uma significativa migração leucocitária, edema, dor, miotoxicidade e necrose tecidual.

As PLA2s podem conter um resíduo de ácido aspártico conservado na posição 49 (PLA2s

Asp49) ou a substituição por um resíduo de lisina (PLA2s Lys49). As PLA2s Asp49 possuem alta

atividade enzimática, interagindo com os componentes da membrana, causando hidrólise dos

fosfolipídios e provocando uma desorganização da membrana celular. Essas enzimas não são

consideradas hemolíticas e a presença de aspartato é essencial para a ligação do cálcio e outras

enzimas. As PLA2s Lys49 são cataliticamente inativas, porém ativas biologicamente (LOMONTE;

ÂNGULO, CALDERÓN, 2003; LOMONTE; RANGEL, 2012)

3.1.4 Hialuronidases

As hialuronidases ofídicas são glicoproteínas pesando em torno de 28 a 70 kDa com a

função de hidrolisar preferencialmente o ácido hialurônico presente na matriz extracelular,

desestruturando a integridade estrutural dessa matriz. Conhecidas como enzimas de

“espalhamento,” exercem a sua função facilitando a difusão das toxinas na corrente sanguínea. Por

si só, elas são de baixa toxicidade, porém associadas as outras toxinas essas enzimas apresentam

um alto grau de toxicidade (KEMPARAJU; GIRISH, 2006; BOLDRINI-FRANÇA et al., 2017).

3.1.5 L-aminoácido-oxidases (LAOOs)

As L-aminoácido-oxidases (LAAOs) são encontradas em plantas, insetos, fungos, bactérias

e na peçonha de serpentes (responsáveis pela coloração amarela das peçonhas). As LAAOs

ofídicas são proteínas diméricas, pesando entre 60 e 150 kDa e que tem como cofatores a flavina-

32


adenina dinucleotídeo ou a flavina mononucleotídeo (IZIDORO et al., 2014). Essas enzimas

catalisam a oxidação de L-aminoácidos, produzindo um aminoácido intermediário através da

redução do cofator flavina. Este por sua vez sofre uma hidrólise não enzimática e produz α-

cetoácidos e amônia. Durante a reoxidação do cofator FAD é produzido peróxido de hidrogênio

(H2O2) a partir do oxigênio (POLLEGIONI et al., 2013; IZIDORO et al., 2014). As LAAOs

contribuem para toxicidade das peçonhas por causa da produção de peróxido de hidrogênio durante

a reação de óxido redução (TOYAMA et al., 2006; RODRIGUES et al., 2009). Já foram descritas

outras atividades como a citotoxicidade, ativação ou inibição da agregação plaquetária

(RODRIGUES et al., 2009), efeitos antiparasitário, antibacteriano e antiviral para essas enzimas

(IZIDORO et al., 2014).

4 EFEITOS LOCAIS DO ENVENENAMENTO BOTRÓPICO

Os efeitos locais de maior importância decorrentes do envenenamento botrópico são:

inflamação (dor e edema), hemorragia local e a miotoxicidade/mionecrose (GUTIÉRREZ, 2016;

GUTIERREZ; OWNBY, 2003)

A inflamação no envenenamento botrópico é caraterizado pelo rápido aparecimento da dor,

edema e recrutamento de células inflamatórias que é devido a ação das toxinas que agem

diretamente nas células endoteliais de capilares e vênulas, liberação da histaminas, PLA2s que

ativam a síntese de prostaglandinas, liberação das cininas, citocinas e a participação dos

componentes do sistema complemento (C3a e C5a) (GUTIÉRREZ, 2016; GUTIÉRREZ;

LOMONTE, 1989). O edema formado durante o quadro de envenenamento, pode levar a isquemia

e compressão neural, ocasionando a síndrome compartimental que irá resultar em perda

permanente de tecidos e amputação do membro afetado (ARAÚJO et al., 2007; GUTIÉRREZ et

al., 2009; TEIXEIRA et al., 2009). Uma das limitações do soro antiofídico é que ele não consegue

reverter o dano local tecidual já estabelecido, por ter baixa ação contra os mediadores inflamatórios

endógenos (ARAÚJO et al., 2007; GUTIÉRREZ; LOMONTE, 1989).

SVMPs e PLA2s atuam na inflamação induzindo a mionecrose, hemorragia, degradação

da matriz extracelular e dano a vasos linfáticos, que levam a geração da dor e edema

(GUTIÉRREZ, 2016; TEIXEIRA et al., 2009).

Hemorragia local é outro achado no envenenamento botrópico, estando associado a ação

de SVMPs hemorrágicas (hemorraginas). Essas toxinas causam proteólise dos componentes da

lâmina basal de microvasos, levando ao extravasamento de sangue para a pele (GUTIÉRREZ et

al., 2016). SVMPs do tipo P-I apresentam menor capacidade de induzir a hemorragia do que as

metaloproteases do tipo P-III, e isso se deve a existência de exosítios nos domínios adicionais das

33


P-III, que colaboram para a ligação destas toxinas a alvos da lâmina basal (ESCALANTE et al.,

2011). A enzima hialuronidase, também presente na peçonha botrópica, participa do aparecimento

deste efeito local, uma vez que atua como fator de espalhamento, aumentando a ação de

metaloproteases hemorrágicas (GUTIERREZ, 2016).

A miotoxicidade pode ser considerada uma das alterações mais relevantes do

envenenamento botrópico, uma vez que esse efeito local pode causar perdas permanentes do

tecido, levando a amputação (GAY et al., 2013; HERRERA et al., 2016). Este efeito local tem

como principais agentes as PLA2s e as SVMPs (GUTIERREZ et al., 2010). PLA2s são capazes

de provocar mionecrose local e danos aos vasos linfáticos (GUTIERREZ; OWNBY, 2003). Já as

SVMPs levam a hemorragia, degradação da matriz extracelular e necrose do tecido (GUTIERREZ;

OWNBY, 2003). Essa alteração pode ocorrer de forma direta, onde as PLA2s Asp49 ou Lys49

ligam-se na membrana plasmática das células musculares esqueléticas, levando a perturbações na

membrana destas células, desencadeando assim, eventos intracelulares degenerativos em cadeia,

principalmente a perda do controle da permeabilidade a íons e macromoléculas, que resultam na

morte celular por necrose (GUTIÉRREZ, 2016). SVMPs hemorrágicas induzem a miotoxicidade

indireta, que podem levar a necrose muscular (GUTIÉRREZ; LOMONTE, 1989; GUTIÉRREZ et

al., 2009).

5 EFEITOS SISTÊMICOS DO ENVENENAMENTO BOTRÓPICO

Os efeitos sistêmicos do envenenamento compreendem alterações em diferentes sistemas

como: hematológico, cardiovascular, hepático, urinário, respiratório, imunológico, digestório e

nervoso. Os mecanismos que levam à essas alterações são complexos, tendo a participação direta

ou indireta de várias toxinas da peçonha nas células (PINHO, PEREIRA, 2001). Após o

envenenamento fraquezas, falta de apetite, aumento da frequência cardíaca e respiratórias,

gengivorragia, hematúria e púrpuras podem ser observados. A liberação de acetilcolina liberada

durante o envenenamento pode levar ao aumento de secreção lacrimal, salivar, nasal, brônquica e

gástricas, ocasiona tremores, espasmos musculares e priapismo, bem como a redução da

frequência cardíaca (BRASIL, 2001)

5.1 Alterações do Sistema Hemostático

5.1.1 Coagulação sanguínea – uma breve revisão

A hemostasia é composta por uma série de processos fisiológicos complexo, pelo qual o

organismo controla a perda de sangue através de um vaso lesado, evitando que ela se prolongue

por um tempo maior. Para isso, após uma lesão, é necessário que ocorra a formação do coágulo e

34


após endotélio ser reparado, o coágulo é desfeito (JACKSON, 2002; LORENZI, 2006). Interações

entre as células sanguíneas (plaquetas), endotélio vascular, fatores de coagulação e a fibrinólise,

são alguns dos mecanismos hemostático, que podem ser divididos em duas fases: a hemostasia

primaria e secundária. A hemostasia primária inicia após a lesão do endotélio vascular. O colágeno

exposto do vaso danificado interage com as plaquetas circulantes, o que permitir maior contato

entre as plaquetas circulantes e o local lesionado, formando um tampão primário. As plaquetas são

então ativadas e liberam grânulos com a capacidade de agregação e adesão de mais plaquetas

(LORENZI, 2006).

A hemostasia secundária inicia com a ativação da cascata de coagulação. O fator tecidual

(FT) entra em contato com a circulação sanguínea, ativa a cascata da coagulação, que resulta na

formação de fibrina, que vai formar redes entre as plaquetas agregadas formando assim um coagulo

denso, firme e com a capacidade de parar o sangramento. Por fim, ocorre a fibrinólise,

caracterizada como o mecanismo da dissolução do coágulo formado, o que permite a recanalização

do vaso lesado, a fim de que o fluxo sanguíneo seja restabelecido (JACKSON, 2002; LORENZI,

2006). O atua modelo da cascata de coagulação é baseado no controle por componentes celulares,

e pode ser divididos em três etapas, sendo ela iniciação, amplificação e propagação, envolvendo

os Fatores II, VII, IX e X com a associação a cofatores, representados por Fator V e VIII

(LEONARDI; KRIZAL, 2011).

Na etapa de iniciação a coagulação sanguínea inicia quando o Fator VII plasmático entra

em contato como FT exposto na região intravascular. Esse contato ativa o Fator VII (VIIa) e o

complexo formado ativa pequenas quantidades de Fator IX e X, formando Fator IXa e Xa. O Fator

Xa se liga ao Fator Va para formar o complexo protrombinase. O Fator IXa se move para a

superfície das plaquetas e se ligam ao Fator VIIIa, formando o complexo “tenase intrínseco”, que

também vai formar Fator Xa. O complexo “protrombinase” formado converte o Fator II em Fator

IIa na superfície das plaquetas. Na fase de amplificação, a trombina gerada ativa plaquetas e

expõem parcialmente o Fator V em suas superfícies, fazendo com que a trombina ative o Fator XI,

V e VIII. A ativação do Fator VIII leva a dissociação do complexo Fator de Von Willebrand

(CWF)/Fator III permitindo o vWF mediar adesões plaquetárias adicionais e agregação ao sítio da

lesão. A fase de propagação ocorre na superfície das plaquetas e tem como finalidade a formação

da rede de fibrina (MOERLOOSE; BOEHLEN, 2009; SAJEVIC; LEONARDI; KRIZAJ, 2011).

Formado o coágulo de fibrina e plaquetas ocorre a atenuação do processo de coagulação

para evitar oclusão trombótica nos vasos. Após esse processo, ocorre a remoção do coagulo da

circulação sanguínea pela fibrinólise (FRANCO, 2001; MOERLOOSE; BOEHLEN, 2009).

A hemostasia pode ser facilmente afetada pelas peçonhas ofídicas diminuindo a

35


coagulabilidade sanguínea, provocando danos nos vasos sanguíneos e provocando quadros

trombóticos. Essas ações são mediadas pelas enzimas SVSPs e SVMPs que são consideradas como

essenciais pelas atividades hemostáticas das peçonhas. Quanto a sua ação, essas enzimas são

denominadas com enzimas semelhantes à trombina da peçonha ofídica (SVTLEs), enzimas

fibrinogenoliticas, enzimas ativadoras de fatores de coagulação, enzimas ativadoras de plaquetas,

enzimas anticoagulantes e hemorraginas (LEONARDI; KRIZAJ, 2011).

SVTEs são enzimas pró-coagulantes que catalisam a liberação de FpA, FoB da molécula

do fibrinogênio. São as principais ativadoras da coagulação sanguínea de peçonhas ofídicas.

SVTEs são serinoproteases semelhantes à trombina, visto que ela tem a capacidade de coagular o

fibrinogênio (LEONARDI; KRIZAJ, 2011). In vitro, as SVTEs são pró-coagulantes e convertem

o fibrinogênio em fibrina, porém in vivo causam incoagulabilidade sanguínea por meio de um

processo de coagulopatia de consumo semelhante a coagulação intravascular disseminada

(KORNALÍK, 1985). Essas enzimas não ativam o Fator XIII, levando a um coágulo facilmente

quebrável e facilmente susceptível a ação das enzimas fribrinolíticas. Essas enzimas também são

denominadas de proteases trombicas ou enzimas coagulantes de fibrinogênio SAJEVIC;

LEONARDI; KRIZAJ, 2011; ULLAH et al., 2018). SVTLEs não ativam outros fatores de

coagulação e somente algumas induzem agregação plaquetária. Geralmente, não são inibidas pelos

inibidores da trombina (exemplo, antitrombina e heparina). Em conjunto com as enzimas

fibrinogenolítias, são as principais toxinas responsáveis pela elevação do tempo de coagulação

sanguínea em acidentes ofídicos. (GUTIÉRREZ; ESCALANTE; RUCAVADO, 2009; KINI;

KOH, 2016).

Enzimas fibrinogenolíticas clivam as regiões C-terminais das cadeias Aα, Bβ e γ do

fibrinogênio, em lugares diferentes dos que a trombina age. Desse modo, essas enzimas tornam o

fibrinogênio incoagulável contribuindo para a coagulopatia e distúrbios hemorrágicos. Devido a

ação proteolítica sobre o fibrinogênio essas enzimas não chegam a formar fibrina. (SWENSON;

MARKLAND JR, 2005). Uma parte dessas enzimas são SVMPs e outra pequena parte são as

SVSPs. As SVMPs fibrinogenolíticas que possuem atividade hemorrágica são chamadas de

hemorraginas. Elas atuam degradando as proteínas da membrana basal dos vasos sanguíneos,

levando ao extravasamento de sangue. (GUTIÉRREZ; ESCALANTE; RUCAVADO, 2009; KINI;

KOH, 2016). Além da ação anticoagulante, já foi observado para que a peçonha ofídica contém as

SVSPs ou SVMPs ativadoras de diversos fatores de coagulação (Fator V, X, XI e XII), bem como

ativadoras da protrombina (OUYANG; TENG; HUANG, 1992; SAJEVIC; LEONARDI;

KRIZAJ, 2011).

36


5.2 Alterações Hematológicas

As alterações hematológicas causada pela peçonha botrópica é preocupante e vários autores

já demonstraram alterações nas series vermelha, branca e nas plaquetas. Vários estudos realizados

anteriormente demonstraram que as peçonhas botrópicas causavam hemólise quando em contato

com as hemácias de diversos animais (SWITH; FIGGE, 1991; RUIZ DE TORRENT et al., 1999).

A hemólise pode ser entendida por dois mecanismos, sendo o primeiro a hemólise direta mediada

por ação das hemorraginas, que são potentes SVMPs que degradam proteína da matriz dos vasos,

levando ao rompimento dos capilares; ou a hemólise indireta, mediada pelas PLA2s que converte

a lectina em lisolectina. Esses dois mecanismos degradam a membrana dos eritrócitos causando a

liberação de hemoglobina (CADILLO; FERREYRA; ZAVALETA, 1991; MELO et al., 2004).

Um estudo observou que cachorros inoculados com a peçonha da serpente B. jararaca por

via intravenosa apresentou a presença de hemólise em algumas amostras de sangue, diminuição

das hemácias, hematócritos e hemoglobina. Foi observado ainda leucocitose, neutofilia, linfonenia

e monocitose (SANO-MARTINS et al., 1995). Outro estudo mostrou que bovinos inoculados com

a peçonha de B. alternatus apresentou redução dos eritrócitos, volume globular e hemoglobina,

apresentando anemia grave devido à perda de sangue causada pela hemorragia local e sistêmicas

(OLIVEIRA et al., 2010). Lemos; Oliveira (2009) inocularam peçonha de B. moojeni em

camundongos swiss pela via intraperitoneal e verificaram que houve uma redução das hemácias,

mas sem significância estatística. Alterações nas células brancas após o envenenamento botrópico

se caracterizam por uma discreta/ moderada leucocitose, neutrofilia, linfopenia e monocitose.

Segundo esses autores, essas alterações estão relacionadas com o intenso processo inflamatório

local, além de liberação dos mediadores inflamatórios. (SANTOS et al., 2003; CALDAS et al.,

2008; SANO-MARTINS et al., 1995).

No envenenamento botrópico as plaquetas também são células alvo. As alterações

encontradas estão relacionadas com o número e a agregação plaquetária. Peçonha botrópica causa

plaquetopenia por depleção, principalmente devido a coagulação intravascular disseminada. Essa

coagulação ocorre por ação da peçonha sobre o fator X que transforma a protrombina em trombina

e o fibrinogênio em fibrina. Assim, desencadeia a desfibrinação e a coagulação intravascular

disseminada que secundariamente produz uma coagulopatia de consumo com manifestações

hemorrágicas (BOFF, 2004; 2005). A trombocitopenia pode ocorrer também pela ação direta das

SVSPs ou PLA2s sobre as plaquetas. Ou ainda o consumo das plaquetas pela ação da SVMPs

sobre os vasos. Com essa ruptura as plaquetas migram para o local lesado, formando um tampão

hemostático que leva ao decréscimo do nível das plaquetas circulantes (MOUNIER et al., 1994).

Mendes et al. (2010) observaram a diminuição do número de plaquetas e da concentração

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do fibrinogênio plasmático em camundongos inoculados com a peçonha botrópica pela via

intramuscular. Oliveira et al. (2010) também observaram a redução significativa de plaquetas após

3 horas de inoculação da peçonha de B. alternatus por via intramuscular em bovinos.

6 ESCOPIONISMO

Os escorpiões ou lacraus são animais invertebrados, carnívoros, perigosos, com hábitos

noturnos, alimentando-se principalmente de grilos ou baratas e cuja característica mais marcante

é a toxicidade de sua peçonha (MARCUSSI et al., 2011). Têm como habitat savanas, florestas

tropicais, desertos, cavernas, sendo distribuídos em todo o mundo, com exceção da Antártica

(BRASIL, 2001; KOMPOSCH, 2010). Em geral, as características morfológicas (Figura 5) são

semelhantes para todas as espécies, como o esqueleto externo (quitinoso), quatro pares de pernas

(responsáveis pela locomoção), um par de quelíceras (órgão pré-bucais) e um par de peldipalpos

(utilizadas para segurar as suas presas) (ALMEIDA, 2010).

Figura 4: Morfologia do escorpião Tityus serrulatus

Fonte: Adaptada do Ministério da Saúde, 2009.

O corpo é formado pelo prossoma (cefalotórax), o mesossoma (tronco) e o metassoma

(cauda). O prossoma é coberto por uma carapaça onde se encontram um par de olhos medianos e

até seis pares de olhos laterais. No mesossoma e no metassoma podem existir até 12 segmentos, e

no final da cauda encontra-se o telson (aparato constituído por um ferrão utilizado na alimentação

e na defesa) e uma vesícula (contém duas glândulas responsáveis pela produção e armazenamento

da peçonha). A vesícula tem uma forma globular e vai se afunilando até formar um espinho curvo,

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denominado de acúleo (BRASIL, 2001; 2009; MARCUSSI et al., 2011). Muitas espécies se

proliferaram e se adaptaram a vida urbana, possivelmente devido à ocupação rápida e

desorganizada do homem nas regiões ocupadas originalmente por esses animais, a ausência de

infraestrutura e saneamento, bem como alimentação farta e ausência de predadores. Os escorpiões

podem sobreviver vários meses sem alimento e mesmo sem água, o que torna o seu combate muito

difícil (BRASIL, 2001; 2009).

No Brasil, 53% dos acidentes por animais peçonhentos são causados por escorpiões, e por

esse motivo são considerados um grave problema de saúde pública devido à alta incidência em

várias regiões e o ao seu potencial de induzir manifestações clínicas graves, podendo ser fatais, na

faixa etária pediátrica e em idosos principalmente (BRASIL, 2011; 2012; ZULIANI et al., 2013).

Com a implantação das notificações dos acidentes escorpiônicos em 1988, o Sistema Brasileiro de

Agravos de Notificação (SINAN) notificou um aumento significativo de novos casos no ano de

2017, principalmente na região Nordeste (56,269 casos), Sudeste (55,230 casos) e Centro-Oeste

(6,344 casos) (BRASIL, 2018).

Dados do SINAN indicam a ocorrência de 125,156 casos notificados e 158 óbitos no ano

de 2017, representado um aumento de 33,509 casos de envenenamento, quando comparado ao ano

de 2016 (91,647casos). No ano de 2017, o Estado de Minas Gerais ficou em primeiro lugar, com

o maior número de casos com os acidentes com escorpião (28,478 casos); Em segundo São Paulo

(21,614 casos); Terceiro Pernambuco (14,736 casos), quarto Bahia (14,229 casos), quinto Alagoas

(9,185 casos) e no sexto lugar está o Rio grande do Norte (4,471 casos) (BRASIL, 2018). Nos

meses mais quentes e chuvosos, o aumento dos acidentes com os escorpiões é mais frequente o

que leva a um quadro grave no perfil epidemiológico. Na maioria dos casos, as picadas são

benignas e atingem predominantemente os membros superiores, 65% das quais acometendo mão

e antebraço (BRASIL 2001; 2009).

Atualmente, 2,069 espécies de escorpiões distribuídas no mundo são descritas quanto a sua

classificação filogenética e taxonômicas, sendo distruibuidos em: 15 famílias e 197 gêneros. O

destaque vai para a família Buthidae, com 84 gêneros e aproximadamente 900 espécies

consideradas altamente perigosas para os homens, sendo pertecentes aos gêneros: Tityus,

Androctonus, Buthus, Centruroides, Hottentota, Leiurus, Parabuthus e Mesobuthus (BRASIL,

2001; CHIPPAUX; GOYFFON, 2008; DI et al., 2014). No Brasil os escorpiões de importância

médica pertencem ao gênero Tityus, com 22 espécies descritas no país e representam cerca de 60%

da fauna escorpiônica neotropical (BRASIL, 2009; PUCCA et al., 2015c). As principais espécies

desse gênero são: T. serrulatus, T. bahiensis, T. stigmurus, T. cambridgeis e T. fasciolatus

(BRASIL 2001; 2009).

39


7 ESCORPIÃO Tityus serrulatus

O escorpião Tityus serrulatus (Figura 6) pertence ao reino Animalia, filo Arthropoda, classe

Arachnida, ordem Scorpiones, família Buthidae, gênero Tityus é popularmente conhecido como o

escorpião amarelo e está amplamente distribuído em todo o território nacional. O T. serrulatus,

diferente dos outros da mesma espécie, apresentam uma peculiaridade que é a “serrilha” (pequenos

dentes/serras) localizados na fase dorsal dos segmentos distais do telson e também responsável

pelo nome serrulatus. Possui pernas e cauda amarelo-claro, tronco escuro e pode chegar até 7 cm

de comprimento na fase adulta (BRASIL 2001; 2009).

Figura 5: Escorpião Tityus serrulatus

Fonte: Adaptado de NENCIONI et al., 2018.

As vítimas dos acidentes causados com T. serrulatus apresentam uma diversidade de

sintomas, o que demonstra a alta complexidade da peçonha dessa espécie. No geral, a peçonha

apresenta ação em todos os sistemas biológicos como: nervoso, cardiovascular, respiratório,

muscular, imune, urinário, endócrino, digestivo, tegumentar, esquelético e reprodutivo (PUCCA

et al., 2015a). No envenenamento, os sinais e sintomas clínicos aparecem de forma precoce, devido

a rápida distribuição da peçonha no organismo afetado (CUPO; HERING, 2007). As principais

manifestações clínicas podem ser locais (dor, hiperemia, sudorese, piloereção, eritema e o edema)

ou sistêmicas (vômitos, náuseas, diarreia, sudorese intensa, agitação, arritmias respiratória,

priaprismo, hiper e hipotensão e sialorreia). Nos casos mais graves podem aparecer: edema

pulmonar agudo, alterações cardíacas, crises convulsivas, espasmos, tremores e o óbito (BRASIL

40


2001; 2009). Vale ressaltar que, os casos mais graves, normalmente, ocorrem em crianças (baixa

massa corpórea) e em idosos (sistema imune debilitado) (CHIPPAUX; GOYFFON, 2008;

VENANCIO et a., 2013).

7.1 Peçonha de Tityus serrulatus

A peçonha do escorpião é o resultado da secreção de um par de glândulas e do acúleo

(responsável pela inoculação da peçonha na presa) que se localiza no télson. A sua principal função

consiste no ataque, na imobilização da presa e na defesa contra os predadores (MENDES, 2007).

A peçonha é uma substância com o aspecto leitoso e opalescente, composta por: muco insolúvel,

mucopolissacarídeos, peptídeos natriuréticos, inibidores de calicreína, aminas, lipídeos, proteínas

de alto peso molecular, hialuronidases, metaloproteases, serinoproteases, sais inorgânicos,

peptídeos e proteínas de baixa massa molar com atividades neurotóxicas. Vale salientar que a

composição da peçonha pode variar de acordo com o gênero, a idade e dentro de indivíduos da

mesma espécie. Isso se deve a variação genética, hábitos alimentares, região geográfica e

condições ambientais (COLOGNA et al., 2009; PUCCA et al., 2015a). Nas últimas décadas, os

estudos funcionais e estruturais das neurotoxinas apresentam um maior destaque. Mais de 20

toxinas do T. serrulatus já foram isoladas e descritas, como: Ts1→Ts16, Ts19 Frag-I e Frag-II,

Ts17→Ts19 (obtidas por técnicas ômicas) e Ts20. Essas toxinas interagem especificamente com

os canais de sódio (Na+), potássio (K+), cloro (Cl-) e cálcio (Ca2+) interferindo na permeabilidade

iônica de membranas de células excitáveis (COLOGNA et al., 2011; ALVERENGA et al., 2012;

PUCCA et al., 2014). Sabe-se que os canais iônicos sensíveis a voltagem são responsáveis pela

passagem seletiva de íons como o Na+, K+, Cl- e Ca+ que são de extrema importância para a

atividade celular. Esses canais mudam a sua conformação em função do potencial de membrana o

que leva a um eficiente e rápido movimento de íons específicos a favor do gradiente eletroquímico.

O resultado é a despolarização ou a repolarização da membrana, desencadeados por correntes

iônicas que passa por dentro ou por fora da célula. As neurotoxinas com ação nesses canais alteram

o mecanismo dos mesmos e geram uma intensa despolarização e liberação massiva de

neurotransmissores (GORDON et al., 1998; POSSANI et al., 1999).

As toxinas que atuam em canais para o sódio dependentes de voltagem são as responsáveis

pelos principais sinais e sintomas no envenenamento. A Ts1, também conhecida como

Tityustoxina, é a mais abundante e de maior toxicidade. Apresenta 60 a 76 resíduos de

aminoácidos, ligados por 4 pontes de sulfeto. É classificada como uma β-neurotoxina que altera

os canais de sódio e bloqueia o pico da corrente (ARANTES et al., 1989; BORDON et al., 2015;

PEIGNEUS et al., 2015). A Ts2 é classificada como uma α-neurotoxina que inibe a inativação dos

41


canais de sódio. A Ts3 também é uma α-neurotoxina que atua nos canais de sódio e que induz a

liberação de catecolaminas, aceticolina, óxido nítrico, aspartato e glutamato. As Ts4 e Ts5 alteram

especificamente os canais de sódio e inibem a inativação desse canal, respectivamente

(COLOGNA et al., 2012; BORDON et al., 2015; PUCCA et al 2015b, 2015d). As toxinas

Ts6→Ts9 têm atividade específica para os canais de potássio (BLAUSTEIN et al., 1991;

NOVELO et al., 1999). As Ts10 e Ts14 potencializam a ação das bradicininas e estão relacionadas

com a vasodilatação e a inflamação. As Ts11→Ts13 ainda não apresentaram as suas funções

esclarecidas. As Ts15 e Ts16 fazem o bloqueio dos canais de potássio (COLOGNA et al., 2009).

Há poucos estudos sobre as toxinas de escorpiões que atum nos canais para o cloro e o cálcio

(NUNES, 2008). Outro componente relevante para a peçonha de T. serrulatus são as

hialuronidases. Essas enzimas são as responsáveis pela aceleração e degradação da matriz

extracelular e se difundem rapidamente até aos tecidos e órgãos em um curto intervalo de tempo

(PESSINI et al., 2001). Beltrazi (2007), demonstrou a presença de enzimas com atividade

proteolítica capazes de ativar o sistema complemento, o que favorece a inflamação no quadro de

envenenamento por peçonhas de T. serrulatus.

8 INFLAMAÇÃO EM RESPOSTA AO ENVENENAMENTO ESCORPIÔNICO

Inflamação é o conjunto de fenômenos bioquímicos, morfológicos e fisiológicos,

sucessivos, complexos e estereotipados que ocorrem no tecido vascularizado, em resposta a um

agente infeccioso, a um antígeno ou mesmo a um agente irritante de natureza física, mecânica ou

traumática, visando destruir, diluir ou isolar o agente lesivo (QUEIROZ, 2011). É uma reação de

defesa e reparo do dano tecidual, ocorrendo no tecido conjuntivo vascularizado com a participação

de células que exercem funções importantes na inflamação como, por exemplo: proteínas

plasmáticas, os leucócitos do sangue, as células das paredes vasculares e as células da matriz

extracelular (MEC) (BECHARA e SZABÓ, 2006). Vale salientar que, embora a inflamação

auxilie na remoção das infecções e inicie o processo de reparo, a reação inflamatória, contudo,

pode lesar os tecidos normais. A reação inflamatória, devido ao seu papel de destruição de

organismos, possui um caráter potencialmente lesivo ao tecido circunjacente. Logo, essa resposta

deve ser bem ordenada e controlada pelo organismo, papel esse exercido por uma grande variedade

de mecanismos celulares e humorais (solúveis), que são ativados quando ocorre uma agressão aos

tecidos e que devem ser imediatamente desativados quando o agente lesivo for afastado. A falha

em qualquer um destes mecanismos de controle retira o caráter protetor da resposta inflamatória,

transformando-a em uma entidade nosológica (LAPA et al., 2007; KUMAR, et al., 2008; SILVA,

2005).

42


O processo inflamatório pode ser agudo ou crônico. A primeira é relativamente curta, com

a duração de minutos, horas ou alguns dias. Tem como característica exsudação de líquido e

proteínas plasmáticas (causando edema), e a migração de leucócitos, predominantemente

neutrófilos. A segunda é mais longa e está associada à presença de linfócitos e macrófagos,

proliferação de vasos sanguíneos, fibrose e necrose tecidual, podendo cooperar com os processos

de reparo tecidual (ROBERTS; MORROW, 2005; LAPA et al., 2007). A inflamação aguda é uma

resposta rápida ao agente agressor, sendo esta responsável a levar os leucócitos e proteínas

plasmáticas para o local da lesão. Pode ser desencadeada por vários estímulos, entre eles infecções

(sendo esta a principal causa da inflamação), trauma e a agentes químicos; necrose tecidual; corpos

estranhos e reações imunológicas (contra substâncias ambientais ou contra os próprios tecidos).

Esse processo se caracteriza por quatro principais eventos: alteração no calibre vascular, que leva

a um aumento do fluxo sanguíneo; alteração estrutural (aumento da permeabilidade vascular);

migração de leucócitos da microcirculação e seu acúmulo nos focos da agressão (ROBERTS;

MORROW, 2005).

A inflamação aguda caracteriza-se ainda pelos sinais cardinais entre eles: calor, rubor, dor,

edema e perda de função. Esses sinais acontecem devido à vasodilatação dos vasos, aumento da

permeabilidade, ação dos mediadores químicos da inflamação, liberação de substâncias

(bradicinina e prostaglandinas) e exsudado leucocitário. Nesse caso, os neutrófilos são as células

predominantes no infiltrado inflamatório durante as primeiras 6 a 24 horas, sendo substituídos em

48 horas por monócitos (ROBERTS; MORROW, 2005; SILVA, 2005 KUMAR et al., 2008).

Após a lesão ocorre uma vasoconstrição arteriolar e venular transitória, seguida de uma

vasodilatação primeiramente nas arteríolas, levando a um aumento do fluxo sanguíneo e em

seguida a abertura de novos leitos capilares na região. Essa reação é responsável pelo calor e rubor.

O aumento do fluxo sanguíneo e a vasodilatação arteriolar provoca um aumento na pressão

hidrostática intravascular dando origem a saída do transudato (ultrafiltrado do plasma com

algumas proteínas). Do aumento da permeabilidade vascular resulta o extravasamento de líquido

rico em proteínas (exsudato) para o interstício, caracterizando o edema. Esse extravasamento de

líquido se dá pela contração das células endoteliais (vênulas) que forma lacunas intercelulares e

alongamento da junção intercelular. Esse mecanismo é desencadeado pela histamina, bradicinina

e leucotrienos, dentre muitos outros mediadores químicos (ROBERTS; MORROW, 2005;

MURPHY; WARD, 2006). Na resposta inflamatória é de extrema importância a participação dos

leucócitos, já que eles interagem com os agentes ofensivos, ingerindo ou destruindo os mesmos.

Contudo, uma vez ativos se corre o risco de se ter um agravo no quadro inflamatório, visto que

podem prolongar a inflamação e lesar os tecidos normais do hospedeiro. Por isso, deve-se

43


assegurar que o recrutamento e a ativação dos leucócitos ocorram apenas quando necessário

(MAHAJAN et al., 2005; YAN; HASSON, 2007). Os eventos de recrutamento consistem em:

marginação, rolagem, adesão e migração através do endotélio. Após a diminuição da velocidade

do fluxo sanguíneo, ocasionada pela vasodilatação, os leucócitos se acumulam na parede dos

capilares e vênulas, sendo esse processo denominado de marginação. Subsequentemente essas

células rolam em fileiras ao longo da superfície do endotélio (ROBERTS; MORROW, 2005;

KUMAR et al., 2008). Esse processo é denominado de rolagem. Logo em seguida os leucócitos

aderem firmemente na superfície endotelial, sendo essa etapa mediada pelas integrinas

(glicoproteínas). Após a adesão firme, os leucócitos imitem pseudópodes nas junções endoteliais

e se posicionam entre as células edoteliais e a membrana basal, escapando para o espaço

extravascular. Esse processo é chamado de migração. Por fim, são atraídos para o local da agressão

pelas quimiocinas (citocinas quimioatraentes), processo esse denominado de quimiotaxia

(ROBERTS; MORROW, 2005; KUMAR et al., 2008). Após os processos de recrutamento, os

leucócitos são ativados e essa ativação resulta em muitas das suas funções como: fagocitose das

substâncias nocivas; produção de substâncias que destroem os micróbios fagocitados e removem

tecidos mortos e a produção de mediadores que amplificam a reação inflamatória (citocinas e os

metabólitos do ácido araquidônico) (KUMAR et al., 2008).

A inflamação aguda possui normalmente três resultados, embora as suas consequências

sejam modificadas pela intensidade e pela natureza da lesão, local e tecido modificado, e a

habilidade do hospedeiro. Dentre esses resultados temos a resolução, a progressão para a

inflamação crônica e a cicatrização ou fibrose. Na resolução, há pouca destruição tecidual e o

tecido substitui a célula lesada rapidamente. Há ainda a neutralização e decomposição dos

medidores químicos, normalização da permeabilidade vascular, produção de mediadores que

inibem a inflamação e morte dos leucócitos. Na progressão para a inflamação crônica, o agente

nocivo não é removido e ocorre principalmente em infecções virais e doenças autoimunes. Já na

cicatrização ou fibrose, ocorre uma extensa destruição tecidual ou tecidos que não se regeneram

(MAHAJAN et al., 2005; KUMAR et al., 2008).

A inflamação é controlada pela presença de um grupo de substâncias (exógenas ou

endógenas) denominada de mediadores químicos, que atuam em várias etapas da reação

inflamatória. Essas substâncias se originam do plasma, das células ou nos locais de inflamação.

São divididas em grupos sendo: grupos de aminas vasoativas; metabólitos do ácido araquidônico

(AA); fator de ativação plaquetária (FAP); citocinas; óxido nítrico; enzimas lisossômicas dos

leucócitos; proteínas do sistema complemento e proteínas da coagulação (MURPHY; WARD,

2006; COLEMANN, 2001). O tipo e a quantidade relativa de cada mediador variam conforme a

44


fase de desenvolvimento da resposta e, em certos aspectos, conforme o tipo de estímulo que

desencadeou o processo. Mediadores de ação rápida, tais como aminas vasoativas, modulam a

resposta imediata. Em seguida, mediadores, como os leucotrienos e interleucinas, são liberados e

passam a controlar o acúmulo e a ativação de células no local inflamado. Uma vez que os

leucócitos tenham chegado à sede da lesão, eles passam a produzir novos mediadores que irão

determinar a evolução do processo (ABBAS, 2008; COLEMANN, 2001).

As citocinas são mediadores polipeptídicos liberados por células do sistema imune como

produtos finais da resposta celular. Elas têm a ação direta nos receptores celulares, mas podem

induzir a formação de outras citocinas. As citocinas IL-6 e TNF-α são liberados por macrófagos

ativados, sendo mediadores centrais da inflamação (ABBAS, 2008; COLEMANN, 2001). As

TNFα e a IL-1β são citocinas pró-inflamatórias que induzem as quimiocinas que são fundamentais

nos processos de quimioatração e migração das células para o local da inflamação. A IL-12 é

produzida por células dendríticas, células B e macrófagos, e induz a resposta imune celular pelos

linfócitos Th1, que por sua vez produzem IFN-α, que atua sobre os macrófagos. Dessa forma,

aumenta a produção de óxido nítrico o que leva a eliminação de microrganismo (SPELLBERG;

EDWARDS, 2001).

O uso de anti-inflamatórios justifica-se principalmente quando a inflamação perdeu seu

papel protetor ou quando suas manifestações são exacerbadas ao ponto de se tornarem incômodas

ou limitantes para o indivíduo. Neste contexto, a dor e a febre inflamatória são os componentes da

resposta que mais frequentemente determina a interferência clínica do processo inflamatório

(ROBERTS; MORROW, 2005). Dentre os anti-inflamatórios disponíveis, os mais comuns são os

anti-inflamatórios não-esteroidais (AINEs). Os AINEs atualmente disponíveis inibem, em sua

maioria, tanto a atividade da cicloxigenase 1 (COX-1, constitutiva) quanto a da cicloxigenase 2

(COX-2, induzida na presença de inflamação) e, portanto, a síntese de prostaglandinas e de

tromboxano (ROBERTS; MORROW, 2005). Acredita-se que a inibição da COX-2 possa mediar,

pelo menos em parte, a ação antipirética, analgésica e anti-inflamatória dos AINEs, entretanto, a

inibição simultânea da COX-1 resulta em efeitos colaterais indesejáveis, particularmente os que

levam ao desenvolvimento de úlceras gástricas em decorrência da produção diminuída de

prostaglandinas, o que torna uma das principais desvantagens do uso desses medicamentos

(CARVALHO, 2006; KUMAR et al., 2008). Também existem outras classes de anti-inflamatórios

importantes na clínica, que agem por mecanismos diferentes dos AINEs, que são os

glicocorticóides e os imunossupressores (ROBERTS; MORROW, 2005). Para se estudar os

diversos eventos que ocorrem no desenvolvimento do processo inflamatório podem ser utilizados

diferentes modelos experimentais, seja a aplicação de culturas de células, modelos in vivo ou

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modelos in vitro. Apesar de ser uma situação artificial em que as condições experimentais podem

ser controladas, o que pode ser ou não uma vantagem, o modelo experimental permite a

representação de um dado fenômeno em si, com o mínimo de interferência de fatores ambientais,

genéticos e outros. Assim, o desenvolvimento de fármacos anti-inflamatórios tem se apoiado nos

modelos experimentais de inflamação. Diversos modelos podem ser utilizados nos estudos das

diferentes fases da inflamação em condições diversas, em animais sadios ou com doenças

concomitantes associadas como diabetes, septicemia, câncer, asma, artrite, colite entre outras

(SOUZA et al., 2003).

Dentre os modelos mais conhecidos temos: modelo da quimiotaxia in vitro, marcação

vascular pelo carvão coloidal em cremáster de ratos, modelo experimental com lamínulas de vidro,

edema de orelha, cicatrização, edema de pata e a quimiotaxia in vivo (peritonite e pleurisia)

(DUNDER et al., 2010; SILVA, 2005; SOUZA et al., 2003). Para indução da inflamação, vários

agentes flogísticos podem ser utilizados, dentre eles, carragenina (utilizada neste trabalho),

dextrana, LPS, bem como os próprios mediadores da inflamação, como serotonina,

prostaglandinas ou histamina, de acordo com os mediadores da resposta inflamatória que se quer

avaliar (SOUZA et al., 2003; MUJUMDAR; MISAR, 2004; LAPA et al., 2007).

A resposta inflamatória induzida por T. serrulatus pode ativar o eixo neuroendócrino e a

liberação de mediadores inflamatórios como: cininas, eicosanoides, fatores de ativação de

plaquetas, óxido nítrico e citocinas. O equilíbrio entre as citocinas pró-inflamatórias e anti-

inflamatórias durante o envenenamento é o que vai determinar o grau da inflamação. No

envenenamento humano com T. serrulatus, níveis altos de TNF-α. IL-1β, IL-6 e IL-8 são

observados no soro (PETRICEVICH, 2010; FIALHO, 2001). Já existem alguns estudos sobre os

efeitos inflamatórios locais provocados pelo T. serrulatus. Nascimento et al. (2005) demonstraram

a participação de alguns mediadores inflamatórios (eicosanóides, histamina e serotonina) no

edema induzido por este escorpião. No modelo de pata induzido por peçonha de T. serrulatus,

Pessini et al. (2008) observaram a participação de cininas e óxido nítrico durante o processo

inflamatório local, e descobriram que a COX-2 não está envolvida na resposta inflamatória

provocada por essa peçonha. Severino et al. (2009) observaram uma rápida formação de edema de

pata após injeção dessa peçonha, que durou por 24 horas. Além disso, por meio de análise

histopatológica das patas, observaram a participação de neutrófilos, mastócitos e macrófagos,

fatores de ativação de plaquetas e óxido nítrico endógeno, que tem papel importante na gênese do

edema.

Quanto às neurotoxinas específicas do T. serrulatus, Pessini et al. (2003) relataram o

aumento de proteína C-reativa, citocinas (IL-6, IL-1α e TNF-α), além de leucocitose, com

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predomínio de polimorfonucleares em animais injetados com a toxina TsTX-I por via

intraperitoneal no lavado peritoneal e no sangue. Zoccal et al. (2011) observaram que, in vitro, as

toxinas Ts1, Ts2 e Ts6 induziram a formação de corpos lipídicos, que podem estar relacionados

com a produção de eicosanoides. Ts1 e Ts6 também aumentaram a produção de óxido nítrico,

TNF-α, IL-6. Já Ts2 inibiu a produção destes mediadores inflamatórios e aumentou a produção de

IL-10. A inflamação induzida por este escorpião também envolve proteínas de fase aguda, o

sistema complemento e o recrutamento de leucócitos (FIALHO et al., 2011). A literatura também

já mostrou a participação de interleucinas IL-1α, IL-6, IFN-γ, além do fator estimulador de

colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) no soro de pacientes envenenados por T.

serrulatus (ZOCCAL et al., 2013).

9 ESTRESSE OXIDATIVO

O estresse oxidativo ocorre devido um desequilíbrio entre a geração de compostos

oxidantes e o desempenho dos sistemas antioxidante. Esse desequilíbrio leva à formação de

radicais livres e/ou espécies reativas não radicais, provenientes do metabolismo de oxigênio

(BARREIROS et al., 2006; BARBOSA et al., 2010).

Os radicais livres são moléculas orgânicas ou inorgânicas, bem como átomos, gerados no

citoplasma de células, mitocôndrias e que possuem um ou mais elétrons desemparelhados em seu

orbital mais externo, o que os transforma em moléculas altamente instáveis e de meia vida curta.

Sua formação decorre das reações óxido-redução, na qual pode haver a doação ou o recebimento

dos elétrons isolados (HALLIWELL, 2012). Os radicas livres podem ter seus elétrons

desemparelhados em átomos de oxigênio (EROs) ou nitrogênio (ERNs) (BARREIROS; DAVID;

DAVID, 2006). As espécies reativas de oxigênio (EROs) são moléculas derivadas do oxigênio

molecular, e incluem o ânion, radical hidroxila e peróxido de hidrogênio, enquanto que as espécies

de reativas de nitrogênio (ERNs) são geradas do óxido nítrico, e incluem o peroxinitrito, nitrito e

nitrato (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006). A produção dessas duas espécies reativas pelas

células, tem muita importância na fagocitose, reatividade vascular, sinalização celular e

manutenção da homeostasia (HALLIWELL, 2012). Para manter o seu equilíbrio, as células

possuem um mecanismo antioxidante bastante eficiente. Assim sendo, há estresse oxidativo

quando ocorre um aumento exacerbado de produção de EROs e ERNs, levando a um desequilíbrio

entre os mecanismos pró-oxidantes e antioxidantes, prevalecendo os mediadores pró-oxidantes.

Como consequência, essas espécies reativas afetam as proteínas, lipídeos, carboidratos e ácidos

nucleicos, alterando funções e estruturas celulares (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006).

Para manter o equilíbrio homeostático, é fundamental a existência de um sistema

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fisiológico que regule de forma eficaz a produção dessas espécies reativas: o sistema antioxidante.

Antioxidantes são substâncias que retardam ou impedem a oxidação através da doação de

átomos de hidrogênio ou elétrons às espécies reativas, quelam íons metálicos, removem as EROs

e ERNs do organismo, reparam as lesões causadas pelas espécies reativas e estimulas a produzam

de antioxidantes enzimáticos (HALLIWELL, 2012). O sistema antioxidante é constituído de

compostos enzimáticos e não enzimáticos. Dentro dos compostos enzimáticos, encontram-se a

superóxido dismutase, que catalisa a reação de dismutação produzindo o peróxido de hidrogênio,

a catalase, que decompõe o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio e por fim a glutationa

peroxidase e a glutationa redutase, que na presença de glutationa reduzida (GSH) catalisam a

conversão do peróxido de hidrogênio e outros hidroperóxidos (BARREIROS; DAVID; DAVID,

2006). A glutationa reduzida é um tripeptídeo, formado por glicina, ácido glutâmico e cisteína. É

o principal tampão tiol redutor do meio intracelular, através da doação de hidrogênios e participa

de vários processos detoxificadores, gerando uma glutationa oxidada, que é convertida a sua forma

original pela glutationa-redutase, através de NADPH. Já os antioxidantes não enzimáticos são

compostos por substâncias endógenas ou exógena (dietética), por exemplo, as vitaminas A, C e E

cobre, zinco, entre outros. (RIBEIRO et al., 2005; BURTON e JAUNIAUX, 2011). Um dos

marcadores detectáveis de estresse oxidativo em amostras biológicas é o malondialdeído, um

aldeído de cadeia pequena e baixa massa molecular produzido durante a peroxidação lipídica

(LIMA et al., 2001). O malondialdeído é formado quando o radical hidroxila ataca os ácidos graxos

poli-insaturados de membrana celulares, alterando sua permeabilidade e estrutura. Quando há

baixa de peroxidação lipídica, a célula estimula a sua manutenção e sinaliza mecanismos

antioxidantes para a resposta contra o estresse oxidativo, mas em situações onde há um aumento

de produção e, consequentemente, o dano celular é irreparável, a célula sofre necrose ou entra em

apoptose (LIMA et al., 2001).

10 SOROTERAPIA

Atualmente, o soro antiofídico, administrado por via endovenosa, é o único tratamento

específico e cientificamente validado para se tratar acidentes ofídicos, sendo utilizados a mais de

100 anos (HAWGOOD, 1999). O primeiro estudo utilizando a soroterapia foi desenvolvida por

Sewall, em 1887, onde o mesmo demostrou a resistência de pombos, sem aparente influência da

saúde desses animais, injetados com doses diluídas da peçonha da serpente Sistrurus catenatus

(HAWGOOD, 1999). Em 1894, Calmette demostrou que doses repetidas da peçonha de Naja

tripudians injetadas em cavalos conferiam imunidade e destes obteve o soro que neutralizava a

peçonha dessa serpente. Já em 1896, Calmette iniciou a produção do primeiro soro antiofídico para

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o uso médico (HAWGOOD, 1999; 1992). No Brasil, a produção de soro antiofídico foi implantada

pelo médico sanitarista Vital Brazil, em 1901, utilizando o mesmo protocolo de Calmette. Desde

a implantação do tratamento com a soroterapia, foi observado uma redução significativa do

número de óbitos causados por animais peçonhentos (VILAR et al., 2005; GUTIÉRREZ; LEÓN,

2009). O protocolo de produção do soro antiofídico é relativamente simples. O soro antiveneno é

uma solução purificada de imunoglobulinas específicas, onde doses da peçonha são inoculadas em

animais (equinos, normalmente), que produzem anticorpos contra as proteínas imunogênicas da

peçonha. Após isso, é realizada a sangria nesses animais e a separação do plasma e das hemácias,

sendo estas devolvidas ao animal. O plasma é separado e purificado até se obter o anticorpo (IgG).

Em seguida é feia a clivagem da molécula IgG com a enzima pepsina ou papaína, removendo-se

a fração Fc (alergênica) e utilizando apenas a fração F(ab’)2. Esses passos de purificação se dão

na tentativa de reduzir os riscos de reações alergênicas. Antes do envasamento final, o soro é

submetido à cultura bacteriológica em meio apropriado e estudos toxicológicos (BRASIL, 2001;

VILAR et al., 2005; GUTIÉRREZ; LEÓN, 2009).

Os soros podem ser classificados em monovalentes ou polivalentes, quando para sua

produção são utilizadas peçonhas de uma única espécie ou espécies diferentes, respectivamente.

No Brasil, o soro é produzido, em três principais centros: Fundação Ezequiel Dias (FUNED), em

Belo Horizonte; Instituto Vital Brazil, em Niterói; e Instituto Butantan, em São Paulo. São

distribuídos pelo Ministério da Saúde para os demais Estados. Com isso, o Brasil alcançou a

autossuficiência na produção de soro e constituiu mecanismos para a vigilância de acidentes

ofídicos em grande parte território nacional (ARAÚJO et al., 2008; CARDOSO et al., 2009).

Os soros antiofídicos produzidos para neutralizar as peçonhas dos principais gêneros de

serpentes de importância médica, no Brasil são: Antibotrópico (SAB): neutraliza as peçonhas de

serpentes do gênero Bothrops. O antígeno é composto por uma mistura de peçonhas de B. jararaca

(50%), B. moojeni (12,5 %), B. neuwiedi (12,5 %), B. alternatus (12,5 %) e B. jararacussu (12,5

%); Antielapídico (SAE), neutraliza as peçonhas de serpentes do gênero Micrurus. Os antígenos

utilizados na imunização são as peçonhas de M. corallinus (50 %) e M. frontalis (50 %);

Antilaquético (SAL), neutraliza a peçonha de serpentes Lachesis. O antígeno é a peçonha de L.

muta; Anticrotálico (SAC), neutraliza as peçonhas de serpentes do gênero Crotalus. Os antígenos

utilizados na imunização são as peçonhas de Crotalus durissus terrificus e C. d. collilineatus, em

iguais quantidades; Antibotrópico-láquetico (SABL), neutraliza as peçonhas de serpentes do

gênero Laquesis e grupo botrópico. O antígeno é composto por mistura de peçonhas de Laquesis

muta muta (40%) e 60% de antígeno botrópico; Antibotrópico-crotálico (SABC), neutraliza as

peçonhas de serpentes do gênero Crotalus e do grupo botrópico. O antígeno é composto por

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mistura de peçonhas do gênero C. d. terrificus (40 %) e do grupo botrópico (60 %) (BRASIL,

2001; VILAR et al., 2005; GUTIÉRREZ; LEÓN, 2009).

A soroterapia deve ser realizada o mais rápido possível e a dose administrada varia de

acordo com a identificação da serpente, tempo decorrido entre o acidente e o atendimento médico,

evolução do quadro clínico e na concentração do soro (CHIPPAUX; GOYFFON, 1998; BRASIL,

2005). O tratamento deve ser realizado em conjunto com o uso de anti-inflamatórios, antibióticos

(caso necessário) e a profilaxia contra o tétano. A hidratação e a internação do paciente por pelo

menos 72 horas do ocorrido é importante para o controle clínico e laboratorial (PINHO; PEREIRA,

2001). O tratamento específico para acidentes botrópicos deve ser feito em ambiente hospitalar e

consiste na administração do soro antibotrópico (SAB) ou, na falta deste, das associações

antibotrópico-crotálico (SABC) ou antibotrópico-laquético (SABL). Por serem de origem equina,

esses soros podem desencadear reações colaterais graves e essas reações podem ser classificadas

como precoces (choque anafiláticos) ou tardias (doença do soro) (Brasil, 2005).

Normalmente, o choque anafilático ocorre imediatamente ou duas horas após a

administração do soro e os sintomas podem limitar-se à pele ou evoluir para hipotensão,

taquicardia e choque. No caso dos pacientes que desenvolvem a doença do soro, essa reação pode

aparecer de 5 a 24 dias após o tratamento com o soro e apresentar sintomas como: febre, urticária,

artralgia, linfoadenomegalia, urticária e proteinúria (BRASIL, 2001; CHUNG, 2013; WEN et al.,

2015). A maioria desses sintomas é devido a formação de complexo imune entre os anticorpos do

soro e os antígenos da peçonha, com a ativação e consumo do sistema complemento através da

ligação das proteínas deste sistema ao domínio Cγ2 da fração Fc da imunoglobulina G (IgG) do

equino (BRASIL, 2001; FRY et al., 2003).

Apesar de reduzir os efeitos sistêmicos e letalidade do envenenamento botrópico, diversos

estudos têm demonstrado que a soroterapia é pouco eficaz na neutralização dos efeitos locais,

efeitos estes que na maioria das vezes, são responsáveis pela morbidade observada nos acidentados

(DA SILVA et al., 2007; SEGURA et al., 2010). Além disso, outras limitações como: o alto custo

da produção, o prazo de validade, a termolabilidade dos soros geram dificuldades na distribuição

e na estocagem, a indisponibilidade e acessibilidades do soro por algumas regiões do país, pode

levar ao agravamento do quando clínico, visto que o tempo entre a picada e o tratamento é de

extrema importância para a eficiência da soroterapia (WEN et al., 2009; CUPO, 2015;

GUTIÉRREZ et al., 2015). Além do que, certos pacientes que recebem a soroterapia podem

desenvolver reações alérgicas como febre e urticária, porém em raros casos pode ocorrer anafilaxia

e levar o paciente ao óbito (GUTIÉREZ et al., 2013).

O tratamento do envenenamento escorpiônico basicamente consiste e três tipos de

50


procedimentos, sendo eles: sintomático (alívio principalmente da dor com a injeção da lidocaína a

2% sem vasoconstritor no local da picada ou uso de analgésicos); manutenção das funções vitais

(consiste no diagnóstico e tratamento de precoce das complicações, sobretudo em crianças) e o

tratamento específico. O tratamento específico consiste na administração do soro antiescorpiônico

(SAEEs) ou antiaracnídico (SAAr), nos casos mais graves (BRASIL, 2001; MENDES, 2007;

PUCCA, 2012).

De acordo com o Ministério da Saúde em 2009, dos 125 óbitos registrados, 108 vitimados

receberam o tratamento. De um modo geral, os agravamentos são causados pela demora e pela

baixa qualidade nos atendimentos. Tendo em vista a problemática descrita anteriormente, torna-se

importante a busca por novos tratamentos (termoestáveis, alta disponibilidade e acessibilidade, de

baixo custo e com poucas reações adversas) que possam complementar e/ou ser uma alternativa à

atual soroterapia para neutralização dos efeitos biológicos e toxicológicos das peçonhas nas

vítimas de acidentes com serpentes e escorpiões. Em virtude disso é muito comum que em

comunidades tradicionais as plantas medicinais sejam o único tratamento para as vítimas de

envenenamento por serpentes (BRASIL, 2010).

11 PLANTAS MEDICINAIS: TRATAMENTO ALTERNATIVO A SOROTERAPIA

O Brasil possui uma vasta diversidade vegetal, sendo a sua maioria, plantas consideradas

como fonte rica em componentes farmacologicamente ativos. Em várias partes do mundo,

principalmente, na África, América do Sul e na Ásia é comum o uso tradicional de plantas

medicinais com propriedades antiofídicas, isto porque o acesso à soroterapia convencional é

restrito ou nulo (DE PAULA, 2010; GOMES et al., 2010; MORS et al., 2000).

Estudos anteriores mostram que diversos componentes químicos encontrados nas plantas

como, por exemplo, flavonoides, alcaloides, ligninas taninos, terpernóides, atuam diretamente

como inibidores enzimáticos, inativadores químicos ou imunomoduladores, que se interagem

diretamente com macromoléculas alvo, inibindo a peçonha (MORS est al., 2000). Por esse motivo,

é cada vez maior o interesse de se estudar a espécie de plantas antiofídicas com o objetivo de

caracterizar substância biologicamente ativa capazes de neutralizar os diversos efeitos locais e

sistêmicos provocados pelas peçonhas de serpentes. Por outro lado, as espécies vegetais

apresentam vantagens por se tratar de uma terapia de baixo custo, ser acessível e por ser capaz de

neutralizar as toxinas presentes na peçonha (MARCUSSI et al., 2007; MORS est al., 2000)

Atualmente, cerca de 850 espécies de plantas, distribuídas em 94 famílias, principalmente

Asteraceae (9%), Leguminosae (7,8%) e Euphorbiaceae (4,5%), apresentam potencial terapêuticos

antiofídico. Sendo assim, o extrato vegetal pode ser uma alternativa complementar ao tratamento

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ofídico, por disponibilizar um amplo espectro de componentes químicos de interesse medicinal

(MARCUSSI et al., 2007; MORS est al., 2000).

Vários grupos de pesquisas têm demonstrado uma excelente atividade antiofídica

produzida por vários extratos de plantas (FÉLIX-SILVA et al., 2014; FERNANDES et al., 2011;

MAGALHÃES et al., 2011).

12 ESPÉCIE VEGETAL Jatropha mollissima (Pohl) Baill

12.1 Família: Euphorbiace

A família Euphorbiaceae pertencente à ordem Malpighiles, compreende a 307 gêneros e

6.900 espécies de ervas, subarbustos, árvores e trepadeiras distribuídas principalmente nos trópicos

e subtrópicos. Em número de espécies é a segunda família mais representativa da Caatinga,

perdendo apenas para Leguminosae. Acalypha, Croton, Euphorbia, Macaranga, Jatropha,

Phyllanthus e Mallotus. Quanto as suas características botânicas são plantas tóxicas latescentes

que faz despertar na população uma preocupação quanto ao seu uso (LEAL; AGRA, 2005;

SANTOS et al., 2005). Contudo, as espécies dessa família vêm sendo cada vez mais estudadas,

pelo fato de possuírem substâncias ativas com diferentes propriedades farmacológicas incluindo,

ação anti-inflamatória, antibacteriana, antitumoral e inseticida, e, além disso, as espécies da família

Euphorbiaceae vêm sendo utilizadas como fonte alternativa no desenvolvimento de

biocombustíveis para produção de óleos, empregada como cercas-vivas e fonte de renda na

agricultara familiar em vários países. (LEAL; AGRA, 2005).

12.2 Gênero: Jatropha

O gênero Jatropha L., subfamília Crotonoideae, tribo Jatropheae está representada por 165

a 175 espécies distribuídas nas regiões semiáridas tropicais da África e das Américas. Esse gênero

possui dez seções, dez subseções e dois subgêneros sendo: Jatropha (distribuídas na África, Índia,

América do Sul, Antilhas, América Central e Caribe) e Curcas (distribuído apenas no México,

Arizona e Texas) (LEAL; AGRA, 2005). O nome “Jatropha” é derivado das palavras gregas

“jatros”, que significa “médico” e “trophe” que significa “alimento”, que pode estar relacionado aos

usos medicinais populares deste gênero (SABANDAR et al., 2013). No Brasil, as espécies mais

comuns desse gênero são: Jatropha gossypiifolia, Jatropha mollissima, Jatropha curcas, Jatropha

mutabilis e Jatropha ribifolia (PIMENTEL et al., 2012). A maior parte das espécies desse gênero

são cultivadas não só devido às suas características ornamentais, mas também devido ao seu uso

tradicional para: tratamento de feridas, inflamações da pele, reumatismo, picadas de cobra, cancro

na garganta, purgativo, entres outros (PLETSCH; CHARLWOOD, 1997; LEAL; AGRA, 2005).

52


A atividade biológica dessas espécies está associada com os diterpenoides presente no seu extrato

e no seu látex. Constituintes químicos como flavonoides, ligninas, glicosídeos, cianógenos, ésteres

de forbol e seus derivados, saponinas, taninos e alcaloides, são alguns dos componentes cujo a

atividade biológica já foi comprovada (LEAL; AGRA, 2005).

12.3 Espécie Vegetal Jatropha mollissima (Pohl) Baill.

• Informações botânicas

A espécie vegetal Jatropha mollissima (Figura 7), pertence ao gênero Jatropha, subgênero

Jatropha, seção Peltatae. No Brasil é popularmente conhecida como pinhão-bravo ou pinhão-de-

purga, sendo um arbusto com cerca 3 metros de altura, lactescente, bem ramificado com folhas

pentalobadas, fruto capsular com até três sementes de coloração marrom. A descrição morfológica

de J. mollissima foi realizada por Leal; Agra (2005) como:

Arbusto com látex avermelhado, 2,0-3,0 m de comprimento; ramos

cilíndricos, glabros, suculentos, estriados; estípulas caulinares, 2,0-4,0 mm,

espinhosas, lignificadas, persistentes; estí- pulas nectaríferas foliares,

filiformes, dissectas, glandular-estipitadas. Folhas peltadas; pecíolo 4,0-10,0

cm, cilíndrico, puberulento, tricomas simples unisseriados; lâmina 3,0-15,0 x

4,0-10,0 cm, orbicular, 5-palmatilobada, subcrassas; lobos elípticos,

puberulentos, tricomas simples, unisseriados, denteados, glandular-

estipitados, base aguda, ápice glandular-acuminado, broquidródroma.

Brácteas, 4,0-3,0 x 2,0-1,5 mm, elípticas, nectaríferas, glandular-estipitadas.

Pedúnculo cilíndrico, 4,0-2,0 cm, puberulento. Inflorescências em corimbos,

terminais, bracteados; 2 flores pistiladas circundadas por 4 flores

estaminadas; pedicelos 0,4-1,5 cm, cilíndricos, glabrescentes. Brácteas florais

0,2-1,0 cm, aciculares, puberulentas, glandular-estipitadas. Flores

estaminadas e pistiladas pentâmeras, cálice 0,5-1,5 cm, sépalas soldadas no

1/4 basal, lobos ovalelípticos, estipitados, glabros; corola até 2,0 cm, pétalas

livres, 0,5-1,0 cm, oblongas, face externa avermelhada e a interna amarela,

glabra. Flores estaminadas marginais, estames-8, isodínamos, filetes 6,0 mm,

concrescidos na base, cilíndricos, glabros; antera 0,3-0,5 mm, sagitada,

rimosa. Flores pistiladas centrais, estiletes-3, conatos na base, colunares, ca.

2,0cm; estigmas-2, bífidos, ovário trilocular, uniovular; disco hipógino,

glabro. Fruto capsular, 1,5-3,0 cm, trilocular, glauco, com deiscência

explosiva; sementes-3, oblongas, 0,8-1,0 cm, glabras, carúncula evidente, ca.

de 1/5 do tamanho da semente; testa lisa, brilhante, marrom-ferrugínea.

(LEAL; AGRA, 2005)

Possui vários sinônimos dentre eles: Adenophorum mollissimum Pohl, Adenophorum luxurians

Pohl, Jatropha pohliana müll, Jatropha luxurians (Pohl) Baill. Essa espécie vegetal tem uma ampla

distribuição, ocorrendo no Brasil em todos os estados do Nordeste, com exceção do Maranhão (LEAL;

53


AGRA, 2005).

Figura 6: Jatropha mollissima (Pohl) Baill

Fonte: Autoria própria.

• Usos populares

J. mollissima é utilizada pela população local para diversos males destacando-se:

inflamação renal, inapetência, cicatrização, contra picadas de serpentes e vermífugo veterinário.

As suas sementes são comercializadas para extração dos óleos e para uso veterinário como

purgativo. O óleo das sementes também é empregado para fabricação de tintas, lubrificantes,

sabões e iluminação doméstica (AGRA et al., 2007; ALBUQUERQUE et al., 2007; LEAL;

AGRA, 2005; LYRA et al., 2011; VILAR, 2004;).

• Constituintes químicos

Estudos anteriores relatam uma vasta composição química de J. mollissima, mostrando a

presença de: alcalóides, esteróides, β-sitosterol, triterpeno, ácido 3-o-acetil-aleuritólico, alcanóis,

1-dotriacontanol, 1-octacosanol, 1- triacontanol, flavonas, orientina, isoorientina, vitexina e

isovitexina e proteídeos, compostos esses que assumem as principais atividades farmacológicas

dessa espécie (LEAL; AGRA, 2005). Gomes et al. (2016) observaram a presença majoritária de seis

flavonoides entre eles o schaftosídeo, isoschaftosídeo, isoorientina, orientina, vitexina, e isovitexina

no extrato aquoso das folhas de J. mollissima.

54


• Estudos farmacológicos

Alguns trabalhos relatam propriedades terapêuticas de J. mollissima como: atividade

hipotensora e estimulante dos músculos lisos do intestino e do útero, antioxidante, antiproliferativa

e moluscicida (ARAUJO, 2008; FERREIRA JÚNIOR, 2011; LEAL; AGRA, 2005; Melo, 2010;

VILAR, 2004). Já foi relatado na literatura o potencial do extrato aquoso das folhas de J. mollissima

em reverter os efeitos causados pelas serpentes B. erythromelas e B. jararaca, podendo ser

considerado, assim, uma espécie com atividade antiofídica (GOMES et al., 2016); FÉLIX-SILVA et

al., 2018). Vale salientar que foi a partir dos relatos populares é que se começou a investigar as

propriedades dessa espécie, contudo, ainda se desconhecem muitas informações sobre ela,

principalmente sobre suas atividades biológicas (LEAL; AGRA, 2005).

13 FLAVONOIDES

Os flavonoides são uma classe muito importantes de produtos naturais distribuídos no reino

vegetal. São pigmentos naturais, com baixa toxicidade e estão presentes em toda as partes das

plantas, desde as raízes até as folhas, flores, frutos e sementes. São coloridos (amarelos), atuando

na atração de insetos para a polinização das plantas, na sinalização entre plantas e micróbios, na

fertilidade de algumas espécies e na proteção à radiação ultravioleta (MACHADO et al., 2008;

SAXENA; SAXENA; PRADHAN, 2012).

Essa ampla classe de substância, cuja a síntese não ocorre na espécie humana, possui

propriedades farmacológicas, como ação anti-inflamatória, antimicrobianas, antitrombóticas,

antialérgicas, antiviral, anticancerígenas e antioxidantes (CARLO et al., 1999; HODEK; TREFIL;

STIBOROVÁ, 2002; DORNAS et al., 2007; JIMÉNEZ; MARTÍNEZ; FONSECA, 2009).

A partir da via dos fenilpropanóides (via metabólica do ácido shiquímico), eles são

biossintetizados sendo considerados uma importante classe de polifenóis, com relativa abundância

entre os metabólitos secundários e fazendo deles bons marcadores quimiotaxonômicos

(DEGÁSPARI; WASZCZYNSKYJ, 2004; GOBBO-NETO; LOPES, 2007). Os flavonoides são

derivados das flavonas e ocorrem nas plantas em uma variedade de forma estruturais, todas

contendo 15 átomos de carbono em seu núcleo básico arranjados na configuração C3-C6-C3

(núcleo Flavilium). São dois anéis aromáticos (A e B), e um anel pirano (C) acoplado ao anel A

(Figura 8). A biossíntese das várias classes de flavonoides pode sofrer várias modificações,

incluindo: adição ou redução, metilação de grupos hidroxila, hidroxilação, dimerização e

glicosilação (HODEK; TREFIL; STIBOROVÁ, 2002; WILLIAMS, 2006; SAXENA; SAXENA;

PRADHAN, 2012). Apresentam ainda diferentes graus de oxidação na cadeia carbônica que liga

os dois anéis aromáticos, formando as classes: flavonóis, flavonas, isoflavonas, flavanonas,

55


flavanóis, flavanodióis, antocianidinas auronas e chalconas (RICE-EVANS; MILLER;

PAGANGA, 1996).

Figura 7: Núcleo fundamental dos flavonoides.


Na presença de um açúcar (D-glicose, L-ramnose, glicoramnose, gaçactose ou arabinose)

na sua estrutura química são chamados de heterosídeos e na sua ausência são denominados de

aglicona (RICE-EVANS; MILLER; PAGANGA, 1996; WILLIAMS, 2006). Por possuírem

propriedades químicas dos fenóis, são relativamente solúveis em água, principalmente quando

possuem moléculas de açucares ligadas à sua estrutura. São levemente ácidos e como são polares

ou moderadamente polares, são solúveis em etanol, metanol, butanol e combinações de solvente

com a água (YAO et al., 2004). Sendo assim, a atividade biológica dos flavonoides e de seus

metabólitos depende da sua estrutura química e dos vários substituintes da molécula, que irão

modular a polaridade, toxicidade e direcionamento intracelular destes compostos (MIDDLETON;

KANDASWAMI; THEOHARIDES, 2000; HAVSTEEN, 2002).

Dentre os interesses farmacêuticos, os flavonoides têm um lugar de destaque devido as

propriedades antitumorais, antialérgicas, antivirais e anti-inflamatórias. Devido a sua capacidade

de estabilizar as espécies reativas de oxigênios e nitrogênio, os flavonoides têm sido considerados

potentes antioxidantes naturais. Acredita-se que quando os flavonoides são ingeridos de forma

regular através da alimentação diária, podem auxiliar na prevenção de doenças cardiovascular, e

na regulação da permeabilidade capilar, impedindo a saída de proteínas e células sanguíneas,

permitindo o fluxo constante de oxigênio, dióxido de carbono e de nutrientes essenciais (RICE-

56


EVANS; MILLER; PAGANGA , 1996; PACKER; HIRAMATSU; YOSHIKAWA, 1999; YAO

et al., 2004)

57

Objetivos

3 OBJETIVOS

58

Objetivos

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar a eficácia inibitória do extrato aquoso das folhas e Jatropha mollissima (Pohl)

Baill, frente à toxicidade sistêmica produzida pela peçonha da serpente Bothrops jararaca e do

escorpião Tityus serrulatus.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Avaliar a citotoxicidade do extrato aquoso das folhas de J. mollissima;

• Avaliar a capacidade do extrato aquoso das folhas de J. mollissima em inibir as alterações

hematológicas, hemostáticas e bioquímicas induzida pela peçonha de B. jararaca;

• Avaliar a capacidade do extrato aquoso das folhas de J. mollissima em inibir o estresse

oxidativo hepático e renal in vivo induzido pela peçonha de B. jararaca;

• Avaliar a capacidade do extrato aquoso das folhas de J. mollissima em inibir o edema

pulmonar e alterações bioquímicas induzidos pela peçonha de T. serrulatus;

• Avaliar a capacidade do extrato aquoso das folhas de J. mollissima em inibir o estresse

oxidativo hepático e renal in vivo induzido pela peçonha de T. serrulatus;

• Avaliar a atividade antioxidante do extrato aquoso das folhas de J. mollissima in vitro e

correlacioná-las com a atividade antiofídica e antiescorpiônica.

59

Material e Métodos

4 MATERIAL E MÉTODOS

60

Material e Métodos

4 MATERIAL E MÉTODOS

1 MATERIAL

1.1 Material Vegetal

As amostras de Jatropha mollissima foram coletadas no interior do Estado do Rio Grande

do Norte, no município Rafael Godeiro, com as seguintes coordenadas geográficas latitude: 6° 04’

40” S e longitude: 37° 42’ 54’’ W. A autorização da coleta foi obtida do Sistema de Autorização

e Informação em Biodiversidade (Sisbio), sob número 35017 e Autorização de Acesso e de

Remessa de Componente do Patrimônio genético (processo 010844/2013-9). Uma parte da

amostra foi enviada para o Herbário Parque das Dunas do Centro de Biociências da UFRN e a

identificação botânica foi realizada pelo professor Dr. Jomar Gomes Jardim. Após a confirmação

da espécie, o material vegetal foi depositado no mesmo herbário sob exsicata de número 16879.

As folhas foram separadas dos galhos e secas em temperatura ambiente, em local arejado

e ao abrigo da luz por aproximadamente 30 dias e, em seguida, trituradas com o auxílio de um

liquidificador industrial. No final da trituração, foi obtido um pó fino com aproximadamente 3200

g e logo após armazenado ao abrigo de luz, umidade e calor.

1.2 Peçonhas e Soros Antivenenos

Foi utilizada peçonha liofilizada de Bothrops jararaca (comprado no Sigma® Aldrich

(St.Louis, MO)). A peçonha liofilizada de Tityus serrulatus foi cedida pelo Instituto Butantan. O

uso científico do material foi realizado mediante Autorização de Acesso e de Remessa de

Componente do Patrimônio Genético (processo 010844/2013-9). Nos dias dos experimentos, as

peçonhas foram preparadas em tampão fosfato-salino (PBS) e a quantidade da peçonha foi

expressa em conteúdo de proteína, determinado pelo método do Bradford. A albumina bovina foi

utilizada como padrão (BRADFORD, 1976). Para os experimentos com a peçonha da serpente foi

utilizado o soro antibotrópico-crotálico (comprado na farmácia veterinária, RN/Natal), enquanto

que o soro antiaracnídico foi cedido pelo Instituto Butantan e utilizado para os experimentos com

a peçonha do escorpião.

1.3 Animais de Experimentação

Foram utilizados camundongos Swiss de ambos os sexos, de 6 a 8 semanas de vida, pesando

25-35 g procedentes do Biotério do Centro de Ciências da Saúde (CCS) da UFRN. Os animais

foram mantidos em condições controladas de temperatura, iluminação (ciclo claro/escuro) e

61

Material e Métodos

umidade, com livre acesso a água e comida conforme preconiza as normas do Colégio Brasileiro

de Experimentação Animal (COBEA) (BRASIL, 2008). Nos dias dos experimentos os animais

foram mantidos na sala de experimentação durante pelo menos uma hora antes da realização dos

testes, para a adaptação. Ao fim dos experimentos, todos os animais foram eutanasiados pela via

intraperitoneal (i.p.) com uma combinação de cetamina (90 mg/ Kg, i.p.) e xilazina (10 mg/Kg

i.p.). O protocolo experimental do estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais

da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEUA-UFRN) (protocolo nº 053/2014).

2 MÉTODOS

2.1 Preparação do Extrato Aquoso das Folhas de J. mollissima

Para a preparação do extrato foram utilizadas as folhas secas e trituradas. O extrato foi

preparado por decocção com água destilada na proporção 1:10 (droga vegetal: solvente, p/v). O

decocto foi filtrado a vácuo, obtendo-se então o extrato aquoso das folhas de J. mollissima. O

extrato foi liofilizado para ser utilizado nos experimentos in vitro e in vivo. No processo de

liofilização o extrato foi previamente congelado no freezer a -80ºC e após a secagem armazenado

no freezer a -20°C. Para o experimento in vivo e in vitro o extrato liofilizado foi dissolvido em

PBS para se obter as concentrações adequadas para cada dose.

2.2 ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE IN VITRO

2.2.1 Atividade hemolítica

O ensaio foi realizado conforme previamente descrito na literatura (GAUTHIER et al.,

2009). Primeiramente, foi feito um preparo de suspensão de eritrócitos humanos, onde o sangue

colhido em tubos com ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) foram centrifugados a 1.500

rpm por 10 minutos. O plasma obtido e a camada superior de células foram descartados. Os

eritrócitos foram ressuspensos a 10 % (v/v) PBS, homogeneizados e novamente centrifugados a

3000 rpm por 10 minutos. Este processo foi repetido até o sobrenadante ficar límpido. Por fim, os

eritrócitos foram ressuspensos a 10 % (v/v) em PBS. Para o ensaio hemolítico, 230 μL do extrato

de J. mollissima em diferentes concentrações (62,5, 125, 250, 500 e 1000 μg/mL) foram colocados

em microtubos e em seguida 20 μL da suspensão de eritrócitos. Para o controle de 100% de

hemólise foram preparados microtubos com a suspensão de eritrócitos e água purificada. Para os

brancos, foram preparados microtubos com o extrato e o PBS. Após esse processo, os microtubos

foram incubados a 37ºC por 60 minutos e centrifugados a 1.300 g por 3 minutos a temperatura

62

Material e Métodos

ambiente. Por fim, 100 μL do sobrenadante dessas amostras foram lidos em leitora de microplaca

a 540 nm.

Experimento envolvendo coleta de sangue humano foi realizado com a aprovação do

Comitê de ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CAAE

88074318.3000.5292).

2.2.2 Citotoxicidade frente às células MDCK

Para analisar a viabilidade celular, as células MDCK foram tratadas em cultura com

diferentes concentrações do extrato e avaliadas pelo método colorimétrico do brometo de 3-[4,5-

dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT) (MOSMANN, 1983). Para adesão das células a

placa de 96 poços, aproximadamente 5 x 103 células por poço foram adicionadas com meio

suplementado (10 % de soro fetal bovino (SFB)) em um volume final de 100 μL/poço. Após adesão

das células e remoção do meio de cultivo, foi realizado o carenciamento celular ao utilizar apenas

meio de cultivo livre de SFB, durante 24 horas. Transcorrido o tempo de carenciamento, o meio

foi removido e diferentes concentrações do extrato foram adicionadas em meio de cultivo mais

SFB a 10 % em um volume final de 100 μL/poço. Após 24 horas, MTT (5 mg/mL) foi adicionado

as células, e incubados por mais 4 horas. Percorrido este período, o meio foi aspirado e foi

adicionado 100 μL do ácido clorídrico HCl 0,04 N em álcool isopropílico para dissolver os cristais

de formazan formados e precipitados. A quantificação da absorbância foi feita em leitor de placa

de 96 poços em comprimento de onda de 562 nm. O ensaio foi realizado em triplicata. A

absorbância do controle negativo (ausência do extrato) foi considerada como 100 % de viabilidade

celular e os valores das células tratadas foram calculadas como a porcentagem em relação ao

controle negativo.


Bothrops jararaca COM O EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE J. mollissima

2.3.1 Desenho experimental - Peçonha de B. jararaca

Para os experimentos foi utilizado o protocolo de pós-tratamento (injeção intraperitoneal

da peçonha de B. jararaca (PBj) e imediatamente após a administração dos tratamentos (PBS, o

extrato de J. mollissima (EJm) e o soro antibotrópico-crotálico) de cada grupo. Foram utilizados 5

animais para cada grupo, conforme apresentado na Figura 9. Estudo piloto foi realizado, a fim de

se encontrar a concentração de peçonha (5 μg/animal) que produzisse efeitos sistêmicos

significativos, sem levar a morte dos animais. Após seis horas da injeção de PBj e os tratamentos,

63

Material e Métodos

foi feita a coleta do sangue pelo plexo retro-orbital dos animais para as analisar os parâmetros

hemostáticos, hematológicos e bioquímicos. No final dos experimentos, todos os animais foram

eutanasiados. O fígado e o rim foram coletados para avaliar o estresse oxidativo.

Figura 8: Desenho experimental da peçonha de B. jararaca


2.3.2 Avaliação das alterações hemostáticas e hematológicas

Para avaliar esses parâmetros, 750 µL do sangue foi coletado com 12,5 µL de citrato de

sódio e 10 µL de SABC (soro antibotrópico-crotálico) (SENISE; YAMASHITA; SANTORO,

2015). Após a coleta, foi feita a homogeneização por inversão e logo em seguida uma parte do

sangue total foi retirado para avaliar os parâmetros hemostáticos. Para isso, o sangue total foi

centrifugado a 1.500 g por 15 minutos a 22ºC. Após esse tempo, o plasma citratado foi obtido para

a dosagem da concentração do fibrinogênio e o tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA).

Foi utilizado o coagulômetro digital (Laser Sensor Clotimer, CLOT, São Paulo, SP, Brasil), e kits

comerciais da Labtest (Vista Alegre, MG, Brasil), conforme as orientações do fabricante. A outra

parte do sangue foi utilizado para avaliar os parâmetros hematológicos, dentre eles: hemácias,

hemoglobina, hematócrito, plaquetas, leucócitos totais e índices hematimétricos, em um aparelho

hematológico automatizado ABX Micros 60 (HORIBA ABX Diagnostics, Kyoto, Japan).

2.3.3 Avaliação das alterações bioquímicas

Para avaliar os parâmetros bioquímicos, após a coleta do sangue (sem anticoagulante e

SABC), o mesmo foi incubado a 37ºC por 30 minutos e centrifugado a 3.000 g por 15 minutos a

22ºC. Após a obtenção do soro, foi feita a dosagem da ureia, creatinina, ácido úrico, lactato

desidrogenase (LDH), alanina aminotrasferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) e

64

Material e Métodos

amilase. As análises foram feitas em um analisador automatizado Labmax Plenno® (Labtest,

Lagoa Santa, MG, Brasil), e foi utilizado kits comerciais, conforme as orientações do fabricante

(Labtest, Lagoa Santa, MG, Brasil).

2.4 AVALIAÇÃO DO ESTRESSE OXIDATIVO HEPÁTICO E RENAL INDUZIDO PELA

PEÇONHA DE Bothrops jararaca COM O EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE J.

mollissima

2.4.1 Preparo dos homogenatos dos órgãos

O fígado e o rim de cada animal foram acondicionados em microtubos e foi adicionado o

tampão PBS (1 mL/ g de tecido). Após isso, as amostras foram cortadas com o auxílio de uma

tesoura e homogeneizadas no ultra-turrax T10, em banho de gelo, por 30 segundos, na velocidade

máxima. Após a homogeneização, uma última etapa de agitação em vórtex na velocidade máxima

por 30 segundos foi realizada, e em seguida as amostras foram sonicadas por 30 segundos em

banho de água gelada. Finalmente, as amostras foram centrifugadas a 10.000 g por 10 minutos a

4ºC. O sobrenadante foi utilizado para a avaliação do estresse oxidativo.

2.4.2 Dosagem de proteína dos órgãos

O sobrenadante obtido da etapa anterior foi utilizado para dosagem de proteínas usando o

reagente de Bradford. Para tal, 10 μL do sobrenadante (fígado e rim de cada animal), juntamente

com 200 μL reagente Bradford foram adicionados em uma microplaca de 96 poços. Após isso, a

placa foi agitada suavemente por 1 minuto e em seguida protegida da luz, e em repouso por 5

minutos. A leitura foi feita utilizando a absorbância de 590 nm, em uma leitora de microplacas

(Epoch-Biotek®, Winooski, VT, USA), em triplicata.

2.4.3 Dosagem de nitrito

Para a dosagem de nitrito, foi utilizado o método de Griess, conforme previamente descrito

na literatura (GREEN et al., 1981). Primeiramente, em uma microplaca de 96 poços, foram

aplicados 50 μL do sobrenadante (fígado e rim de cada animal), em triplicata. Em seguida, foram

adicionados aos poços 50 μL de sulfanilamida (sulfanilamida 1% em ácido fosfórico 5 %), e a

placa foi incubada por 5 minutos a temperatura ambiente. Após isso, foram adicionados 50 μL da

solução dihidrocloridrato de N-1-naftiletilenodiamina 0,1 % (NEED), ao abrigo da luz. A

absorbância foi mensurada a 540 nm em uma leitora de ELISA, em duplicata, utilizando a curva

padrão de nitrito de sódio.

65

Material e Métodos

2.4.4 Dosagem de malondialdeído

A determinação da peroxidação lipídica foi conduzida conforme descrito por Buege et al.

(1978), com algumas modificações. Primeiramente, foram adicionados em microtubos 100 μL do

sobrenadante (fígado ou rim de cada animal) e 200 μL do reagente composto de ácido

tricloroacético 15 % p/v, ácido tiobarbitúrico 0,375 % p/v e ácido hidroclorídrico 0,25 N. Estes

foram agitados no vórtex por 30 segundos e incubados a 95°C por 60 minutos. Após isso, os tubos

foram incubados em banho de gelo por 20 minutos e por fim, as amostras foram centrifugadas a

10.000 g, a 4ºC, por 10 minutos e o sobrenadante foi lido a 535 nm, na leitora de microplacas. O

teor de espécies reativas do oxigênio foi expresso em termos de malonildialdeído (MDA),

utilizando seu coeficiente de extinção molar a 535 nm que é igual a 156000 M-1cm-1.

2.4.5 Dosagem de glutationa reduzida

A determinação da glutationa reduzida foi realizada conforme descrito por Beutler et al.

(1963), com algumas modificações. Inicialmente, 50 μL do sobrenadante (fígado e rim de cada

animal) com 50 μL de ácido tricloroacético 15 % foram colocadas em microtubos. As misturas

foram homogeneizadas no vórtex por 30 segundos e, em seguida, centrifugadas a 10.000 g, a 4ºC,

por 10 minutos. Após isso, foram retirados 10 μL do sobrenadante e misturados com 190 μL ácido

5,5-ditiobis-(2-nitrobenzóico) (DTNB) 0,1 mM em uma microplaca de 96 poços. A microplaca foi

incubada a temperatura ambiente, ao abrigo de luz, durante 30 minutos em agitação constante.

Finalmente, a absorbância das amostras foi lida a 412 nm, na leitora de microplacas. Os níveis de

glutationa reduzida foram expressos em termos de tiolato, utilizando o seu coeficiente de extinção

molar a 412 nm que é igual a 14150 M-1cm-1.


Tityus serrulatus COM O EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE J. mollissima

2.5.1 Desenho experimental - Peçonha de T. serrulatus

Para os experimentos foram utilizados dois protocolos de tratamento, o pré-tratamento

(administração dos respectivos tratamentos de cada grupo (PBS e extrato (JM))) e 1 hora depois

a injeção subcutânea da peçonha) e o pós-tratamento (injeção subcutânea da peçonha e

imediatamente a administração dos tratamentos de cada grupo (PBS, extratos, soro antiaracnídico

e dexametasona). Foram utilizados 5 animais para cada grupo, conforme apresentado na Figura

10. Estudo piloto foi realizado, a fim de se encontrar a concentração de peçonha que produzisse

efeitos sistêmicos significativos, sem levar a morte dos animais. Após duas horas da injeção de

66

Material e Métodos

peçonha de T. serrulatus (TsV) foi feita a coleta do sangue pelo plexo retro-orbital dos animais

para a analisar os parâmetros bioquímicos. No final do experimento, todos os animais foram

eutanasiados e foi feita a coleta do pulmão (para avaliar o edema pulmonar), fígado e rim para

avaliar o estresse oxidativo.

Figura 9: Desenho experimental da peçonha de T. serrulatus


2.5.2 Avaliação do edema pulmonar induzido por T. serrulatus

O edema pulmonar da peçonha foi determinado conforme descrito previamente na

literatura, com pequenas modificações (PESSINI et al., 2003). Após 2 horas, os animais foram

eutanasiados, pesados, o pulmão inteiro foi coletado e pesado. A massa do pulmão foi utilizada

para o cálculo da Razão Pulmão-Corpo (peso do pulmão/peso do corpo do animal x 100) que foi

comparado um grupo controle sem a peçonha. O pulmão foi processado para posterior análise de

citocinas e da enzima mieloperoxidase (MPO).

2.5.3 Dosagem de citocinas pró-inflamatórias no tecido pulmonar

O pulmão de cada animal foi acondicionado em microtubos e foi adicionado o tampão PBS

(1 mL/g tecido). Após isso, as amostras foram cortadas com o auxílio de uma tesoura e

67

Material e Métodos

homogeneizadas no ultra-turrax T10, em banho de gelo, por 30 segundos, na velocidade máxima.

Após a homogeneização, uma última etapa de agitação em vórtex na velocidade máxima por 30

segundos foi realizada e sonicadas por 30 segundos em banho de água gelada. As amostras foram

centrifugadas a 10.000 g por 10 minutos a 4ºC. O pellet obtido foi reservado para a quantificação

de MPO. Sobrenadante obtido foi utilizado para a quantificação de citocinas IL-1β e IL-6 através

do ensaio imunoabsorção enzimática (ELISA) e a outra parte utilizada para a dosagem de

proteínas, conforme o item 2.4.2.

2.5.4 Dosagem da enzima mieloperoxidase (MPO) no pulmão

Ao pellet obtido durante o experimento da etapa anterior (2.5.3) foi adicionado a solução

brometo de hexadeciltrimetilamônio 0,5% em tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,0. Em

seguida, as amostras foram agitadas no vórtex, na velocidade máxima, por 30 segundos.

Posteriormente, as amostras foram homogeneizadas no ultra-turrax T10, em banho de gelo, por 30

segundos, na velocidade máxima. Após a homogeneização, uma última etapa de agitação em

vórtex na velocidade máxima por 30 segundos foi realizada. Após isso, as amostras foram

sonicadas por 30 segundos, e então foram realizados três ciclos de congelamento-descongelamento

(-80ºC, 15 minutos/ temperatura ambiente). Por fim, as amostras foram novamente sonicadas por

30 segundos em banho de água gelada e centrifugadas a 10.000 g por 10 min a 4ºC. O sobrenadante

obtido foi utilizado para a quantificação da enzima MPO. Para tal, foram misturados 20 μL de cada

sobrenadante juntamente com 200 μL de substrato (peróxido de hidrogênio 0,0005% e o-

dianisidina 0,167 mg/mL em tampão fosfato de potássio 50 mM pH 6,0) em uma microplaca de

96 poços, e imediatamente foi feita a leitura cinética, até cinco minutos, de um em um minuto, a

460 nm, em uma leitora de microplacas (Epoch-Biotek®, Winooski, VT, USA), em duplicata.

Uma unidade de MPO foi definida como o equivalente ao consumo de 1 μmol de peróxido de

hidrogênio por minuto, sendo que 1 μmol de peróxido de hidrogênio fornece uma mudança de

absorbância de 1,13 × 10-2 (DO/min) (POSADAS et al., 2004).

2.5.5 Avaliação das alterações bioquímicas

Para avaliar os parâmetros bioquímicos, as amostras de sangue foram coletadas em

microtubos sem o anticoagulante, incubadas a 37ºC por 30 minutos a 3.000 g por 15 minutos a

22ºC, para a obtenção dos soros. Para tal, kits comerciais foram utilizados e as amostras foram

analisadas em um analisador automatizado Labmax Pleno® (Labtest, Lagoa Santa, MG, Brasil).

Os parâmetros analisados foram: AST, ALT, amilase, ureia, creatinia, LDH e creatina quinase

(CK).

68

Material e Métodos

2.6 AVALIAÇÃO DO ESTRESSE OXIDATIVO HEPÁTICO E RENAL INDUZIDOS

PELA PEÇONHA DE Tityus serrulatus COM O EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE

J. mollissima

Os experimentos foram realizados conforme os procedimentos dos itens 2.4.1;2;3;4;5.


AQUOSO DAS FOLHAS DE J. mollissima

2.7.1 Capacidade antioxidante total

O ensaio é baseado na redução de Molibdênio+6 para Molibdênio+5 pelo extrato de J.

mollissima e subsequente formação de um complexo esverdeado Fosfato/Molibdênio+5 em pH

ácido (PRIETO; PINEDA; AGUILAR, 1999). Os tubos contendo diferentes massas do ácido

ascórbico (controle positivo), extrato e a solução reagente (0.6 M ácido sulfúrico, 28 mM fosfato

de sódio e 4 mM molibdato de amônia) foram incubados a 95º C por 90 min. Posteriormente, os

tubos foram resfriados a temperatura ambiente e a absorbância de cada solução foi lida a 695 nm.

Como branco, foi utilizando o reagente nas mesmas condições sem a presença do extrato. Os

resultados tomam como base a atividade do ácido ascórbico, um composto com atividade

antioxidante conhecida. A capacidade antioxidante total é expressa em miligrama equivalente em

ácido ascórbico por grama do extrato.

2.7.2 Sequestro de radicais hidroxila

A atividade sequestradora dos radicais hidroxila do extrato de J. mollissima foi investigada

usando a reação de Fenton (Fe2+ + H2O → Fe3+ + OH- + OH.). Esses resultados são expressos

como porcentagem de inibição dos radicais hidroxila. Radicais hidroxila foram gerados usando o

método previamente descrito (SMIRNOFF; CUMBES, 1989), com pequenas modificações. Em 3

mL de tampão fosfato de sódio (150 mM, pH 7,4), foi adicionado sulfato ferroso 10 mM, EDTA

10 mM, salicilato de sódio 2 mM, 30 % peróxido de hidrogênio e variadas concentrações do

extrato. No tubo controle, tampão fosfato substituiu o peróxido de hidrogênio. As soluções foram

incubadas a 37 ºC por 1 hora, e a presença dos radicais hidroxila foi monitorada a 510 nm. O ácido

gálico foi utilizado como controle positivo.

2.7.3 Sequestro de radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)

A habilidade sequestradora do extrato de J. mollissima sobre o radical DPPH foi realizada

69

Material e Métodos

de acordo com o método descrito anteriormente, e com algumas modificações (HVATTUM;

STENSTROM; EKEBERG, 2014). Para tal, uma solução metanólica de DPPH foi adicionada nos

tubos contendo diferentes concentrações do extrato. Logo em seguida, os tubos foram protegidos

da luz e após 30 minutos, foi realizada a leitura da absorbância a 517 nm. O resultado foi expresso

como porcentagem de inibição dos radicais DPPH.

2.7.4 Quelação de ferro

A habilidade quelante do extrato de J. mollissima sobre os íons ferro foi investigada,

conforme o método descrito anteriormente, e com pequenas modificações (WANG et al., 2008).

Cloreto de ferro 2 mM, ferrozina 5 mM e diferentes concentrações do extrato foram colocadas em

tubos e em seguida incubados por 10 min à temperatura ambiente. As absorbâncias das amostras

foram lidas a 562 nm. A atividade quelante foi expressa como porcentagem de quelação em relação

a um branco (ausência do extrato).

2.7.5 Quelação de cobre

A ação quelante do extrato de J. mollissima sobre os íons cobre foi determinada pelo

método de violeta de pirocatecol (ANTON, 1960). Concentrações diferentes do extrato, foram

misturados com o tampão acetato de sódio 50mM pH 6, violeta de pirocatecol 4 mM e 100 μL de

sulfato de cobre penta-hidratado (50 μg/mL, w/v no tampão acetato). Toda a solução foi

homogeneizada e lidas a 632 nm. A atividade quelante foi expressa como porcentagem de quelação

em relação a um branco (ausência do extrato).

2.7.6 Poder redutor

O poder redutor do extrato de J. mollissima foi quantificado de acordo com metodologia

previamente descrita (WANG et al., 2008). Diferentes concentrações do extrato foram adicionadas

em tampão fosfato 200 mM, pH 6,6 e ferricianeto de potássio 1 %. Em seguida, foram incubados

por 20 min a 50ºC. A reação foi interrompida pela adição da solução de ácido tricloroacético 10

%, e posteriormente misturada com água destilada e cloreto férrico 0,1 %. As absorbâncias das

amostras foram lidas a 700 nm.

2.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Todos os resultados foram analisados como média ± erro padrão da média (EPM), com

n=4/5 animais por grupo experimental. Análise de variância (ANOVA) de uma via seguido de

teste de Tukey foi realizada utilizando o software GraphPad Prism versão 5.00 (San Diego, CA,

70

Material e Métodos

EUA). Valores de P menores que 0,05 foram considerados significativos.

71

Resultados

5 RESULTADOS

72

Resultados

5 RESULTADOS

5.1 ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE IN VITRO

5.1.1 Atividade hemolítica

O extrato de J. mollissima não apresentou atividade hemolítica significativa frente os

eritrócitos (Figura 11). Quando comparado com a água (controle positivo) ele reduziu

significativamente o percentual da hemólise (p < 0,05), sendo essa redução semelhante ao PBS

(controle negativo). Outro ponto observado foi que a maior concentração do extrato (1000 µ/mL)

reduziu ainda mais a hemólise em comparação com o controle negativo.

Figura 10: Atividade hemolítica do extrato aquoso das folhas de J. mollissima

Fonte: Resultados experimentais.

Valores expressos como média ± erro médio padrão com n = 3. ***p < 0,001 comparando ao controle

negativo (PBS) e às diferentes concentrações de extratos de J. mollissima (EJm) após teste de Tukey

(Anova).

5.1.2 Citotoxicidade frente às células MDCK

Quanto aos efeitos citotóxicos frente às células MDCK, as concentrações testadas do

extrato de J. mollissima não apresentou toxicidade. Em todas as concentrações a reação de MTT

revelou 100 % de viabilidade celular (Figura 12).

73

Resultados

Figura 11: Citotoxicidade frente às células MDCK


Valores expressos como média ± erro médio padrão com n = 3.

5.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOFÍDICA IN VIVO DO EXTRATO AQUOSO

DAS FOLHAS DE J. mollissima

5.2.1 Inibição das atividades defibrinogenante e trombocitopênica induzidas pela

peçonha de B. jararaca

Após 6 horas de envenenamento com a peçonha de B. jararaca foi observado que o grupo

PBj apresentou uma diminuição significativa nos níveis de TTPA, fibrinogênio e plaquetas,

quando comparado ao grupo PBS. Contundo, na presença do extrato de J. mollissima, o grupo

EJm prolongou o tempo de TTPA; agiu aumentando a concentração do fibrinogênio e os números

das plaquetas circulantes em comparação com o grupo PBJ (p < 0,05) (Figura 13 A, B e C). Foi

observado que o grupo soro agiu de forma semelhante ao grupo EJm, não apresentando diferença

estatística significativa (p > 0,05).

74

Resultados

Figura 12: Inibição das atividades defibrinogenante e trombocitopênica da peçonha de B. jararaca com o

extrato aquoso das folhas de J. mollissima


Valores expressos como média ± EPM (n = 4/ grupo).

A: Tromboplastina parcial ativada (TTPA). B: Fibrinogênio plasmático. C: Contagem de plaquetas. Extrato

de J. mollissima (EJm). * p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 comparados ao grupo controle PBj (injeção

de peçonha com administração oral de PBS) após teste de Tukey (ANOVA de uma via).

5.2.2 Inibição das alterações hematológicas induzidas pela peçonha de B. jararaca

Após 6 horas da administração da peçonha pela via intraperitoneal, foi avaliada a inibição

das alterações hematológicas pelo extrato de J. mollissima. Não foi observada diferença estatística

para os valores hematológicos de contagem de eritrócitos, hemoglobina, hematócrito e índices

hematimétricos (VCM, HCM e CHCM) (dados não mostrados).

Além da avaliação da série vermelha, foram avaliadas as alterações na série branca (Figura

14). O grupo PBj quando comparado com o grupo PBS apresentou um aumento significativo dos

neutrófilos segmentados e monócitos, porém não apresentou efeito sobre os leucócitos e os

linfócitos. Como observado na Figura 14 B e D, os grupos EJm e soro tiveram uma ação contra a

peçonha diminuindo significativamente os neutrófilos e os monócitos (p < 0,05), quando

comparados ao grupo PBj, mas não apresentaram diferença significativa em leucócitos e linfócitos.

Observa-se ainda que, os grupos EJm e soro agiram de forma semelhante (p > 0,05).

75

Resultados

Figura 13: Inibição das alterações hematológicas induzida da peçonha de B. jararaca com o extrato aquoso

das folhas de J. mollissima



A: Leucócitos totais. B: Neutrófilos segmentados. C: Linfócitos. D: Monócitos. Extratos de J. mollissima

(EJm). *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 comparados ao grupo controle PBj (injeção de peçonha com

administração oral de PBS) após teste de Tukey (ANOVA de uma via).

5.2.3 Inibição das alterações bioquímicas induzidas pela peçonha de B. jararaca

Em relação às alterações bioquímicas (Figura 15) foi observado que o grupo PBj aumentou

consideravelmente a concentração de todos os analitos testado, em comparação ao grupo PBS. Os

grupos EJm e soro apresentaram resultados semelhantes, diminuindo significativamente os níveis

de ácido úrico, ureia, amilase, LDH e as transaminases (AST e ALT), quando comparado ao grupo

PBj (p < 0,05). Também foi visto que, os grupos EJm e soro causaram uma ligeira diminuição na

concentração da creatinina, porém essa diminuição não foi significativa quando comparados ao

grupo PBJ.

76

Resultados

Figura 14: Inibição das alterações hematológicas induzida da peçonha de B. jararaca com o extrato aquoso




A: Creatinina. B: Ácido úrico. C: Ureia. D: Amilase. E: Aspartato aminotransferase (AST). B: Alanina

aminotransferase (ALT). G: Lactato desidrogenase (LDH). *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001

comparados ao grupo controle PBj (injeção de peçonha com administração oral de PBS) após teste de Tukey

(ANOVA de uma via).

77

Resultados

5.2.4 Inibição do estresse oxidativo hepático induzido pela peçonha de B. jararaca

O grupo PBj produziu um aumento considerável da concentração de malondialdeído

(Figura 16 A) e do nitrito (Figura 16 B) quando comparado ao grupo PBS, mas diminuiu os níveis

de TNB/GSH (Figura 16 C). Os grupos EJm e soro por sua vez, reduziram significativamente

concentração de malondialdeídos e nitrito, quando comparados ao grupo PBj (p < 0,05). Não

houve diferença significativa entre os grupos EJm e soro (p > 0,05). Por fim, somente o grupo

EJm produziu um aumento significativo da concentração de TNB (p < 0,05) (Figura 16 C)

Figura 15: Inibição do estresse oxidativo hepático induzido pela peçonha de B. jararaca com o extrato

aquoso das folhas de J. mollissima



MDA: malondialdeído. TNB: tiolato; PBj: peçonha de B. jararaca; Ejm: extrato aquoso de J. mollissima

*P < 0,05, **P < 0,01 e ***P < 0,001 comparados ao grupo controle PBj (injeção de peçonha com


5.2.5 Inibição do estresse oxidativo renal induzido pela peçonha de B. jararaca

Na avaliação do estresse oxidativo renal (Figura 17), os resultados foram semelhantes aos

encontrados no estresse hepático. O grupo PBj produziu um aumento considerável da concentração

de malondialdeído (Figura 17 A) e do nitrito (Figura 17 B) quando comparado ao grupo PBS,

porém diminuiu os níveis de TNB (Figura 17 C). Os grupos EJm e soro por sua vez, reduziram

significativamente concentração de malondialdeído e nitrito, quando comparados ao grupo PBj (p

78

Resultados

< 0,05). Não houve diferença significativa entre os grupos EJm e soro (p > 0,05). Somente o grupo

EJm produziu um aumento significativo da concentração de TNB (p < 0,05) (Figura 16 C).

Figura 16: Inibição do estresse oxidativo renal induzido pela peçonha de B. jararaca com o extrato aquoso




MDA: malondialdeído. TNB: tiolato; PBj: peçonha de B. jararaca; Ejm: extrato aquoso de J. mollissima

*p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 comparados ao grupo controle PBj (injeção de peçonha com


5.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIESCORPIÔNICA IN VIVO DO EXTRATO


5.3.1 Inibição do edema pulmonar induzido pela peçonha de T. serrulatus

A inibição do edema pulmonar foi avaliada, e como pode ser observado nos gráficos

(Figura 18 A e B) o grupo TsV aumentou o edema em comparação ao grupo PBS. Já os grupos

JM 100 e 200 mg/kg, tanto no protocolo de pré ou pós-tratamento, diminuíram de forma

significativa o edema causado no pulmão, quando comparados ao grupo TsV (p < 0,05). Observa-

se também que, no protocolo de pós-tratamento os grupos JM 100 e 200 mg/kg se comportaram

de forma similar ao grupo da dexametasona (medicamento padrão) (p > 0,05).

Quanto a atividade da enzima MPO (Figura 18 C e D), observa-se que os grupos JM 100 e

79

Resultados

200 mg/kg (nos dois protocolos de tratamento) inibiram de forma significativa a atividade da

MPO, quando comparadas ao grupo TsV (p < 0,05), que por sua vez aumentou em duas vezes os

níveis de MPO em relação ao grupo PBS. No protocolo de pós-tratamento os grupos JM 100 e 200

mg/kg se comportaram de forma similar ao grupo da dexametasona (p > 0,05).

Figura 17: Inibição do edema pulmonar induzido pela peçonha de T. serrulatus com o extrato aquoso das

folhas de J. mollissima


Edema pulmonar: (A), protocolo de pré-tratamento; (B), protocolo de pós-tratamento. PBS (solução

salina), TsV (peçonha de T. serrulatus); (C e D), dosagem de MPO (enzima mieloperoxidaxe) JM (J.

mollissima); Dexa (dexametasona). Valores expressos como média ± EPM com n=5. ***p < 0,001 quando

comparados ao grupo controle (TsV), após teste de Tukey (ANOVA).

5.3.2 Efeitos do extrato de J. mollissima frente as citocinas pró-inflamatórias

Na Figura 19, observa-se que o grupo TsV produziu um aumento das citocinas IL-6 e IL-

1β em comparação ao grupo PBS. Quanto a IL-6 observa-se que os grupos JM 100 e 200 mg/kg,

em ambos os protocolos, diminuíram de forma significativa a produção dessa citocina, quando

comparados ao grupo TsV (p < 0,05). Observa-se também que, no protocolo de pós-tratamento os

grupos JM 100 e 200 mg/kg se comportaram de forma similar ao grupo da dexametasona (p >

0,05) (Figura 19 A e B).

80

Resultados

Quanto a citocina IL-1β (Figura 19 C e D), no protocolo de pós-tratamento os grupos JM

100 e 200 mg/kg reduziram de forma significativa essa citocina, em comparação ao grupo TsV. Já

no protocolo de pré-tratamento, observa-se que houve uma redução da citocina IL-1β, porém

somente o grupo JM 100 mg/kg foi estatisticamente significativo em comparação ao grupo TsV

(p < 0,05). Os grupos JM 100 e 200 mg/kg se comportaram de forma similar ao grupo da

dexametasona (p > 0,05).

Figura 18: Efeito do extrato aquoso das folhas de J. mollissima frente as citocinas pró-inflamatórias IL-6

e IL-1β induzidas pela peçonha de T. serrulatus


(A e B), dosagem da concentração de citocinas IL-6, em pictogramas por mL, com o protocolo de pré e

pós-tratamento, respectivamente; (C e D), dosagem da concentração de citocinas IL-1β, em pictogramas

por mL, com o protocolo de pré e pós-tratamento. PBS (solução salina), TsV (peçonha de T. serrulatus);

JM (J. mollissima); Dexa (dexametasona). Valores expressos como média ± erro médio padrão com n=5.

*p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 quando comparados ao grupo controle (TsV), após teste de Tukey

(ANOVA).

5.3.3 Inibição das alterações bioquímicas induzidas pela peçonha de T. serrulatus

Em relação aos parâmetros bioquímicos, observa-se que o grupo TsV produziu um

aumento em todos os analitos testados (LDH, CK, Ureia, creatina, AST e amilase) em comparação

ao grupo PBS. Os grupos JM 100 e 200 mg/kg, em ambos os protocolos, diminuíram de forma

81

Resultados

significativa os níveis de LDH e ureia, quando comparados ao grupo TsV (p < 0,05). Essa

diminuição também ocorreu para o grupo da dexametasona, que se assemelhou ao extrato (p >

0,05) (Figura A e C).

Os níveis de CK e creatinina foram reduzidos nos grupos da dexametasona e JM 100 e 200

mg/kg pré. No protocolo de pós tratamento somente o grupo JM 100 mg/Kg diminuiu de forma

significativa os níveis de CK e creatinina (p < 0,05) (Figura 20 B e D).

Os níveis de AST foi reduzido nos grupos da dexametasona e JM 100 e 200 mg/kg pós. No

protocolo de pré-tratamento somente o grupo JM 100 diminuiu de forma significativa os níveis de

AST (p < 0,05) (Figura 20 E). Por fim, somente os grupos da dexametasona e JM 100 mg/kg pré

foram eficazes na redução dos níveis da amilase, em comparação ao grupo TsV (p < 0,05) (Figura

20 F).

Figura 19: Inibição das alterações bioquímicas induzidas pela peçonha de T. serrulatus pelo extrato aquoso


82

Resultados


(A) LDH; (B) CK; (C) Ureia; (D) Creatinina; e (E) AST; (F) Amilase. Protocolo de pré e pós-tratamento;

PBS (solução salina), TsV (peçonha de T. serrulatus); JM (J. mollissima); Dexa (dexametasona). Valores

expressos como média ± erro médio padrão com n=5. *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 quando

comparados ao grupo controle (TsV), após teste de Tukey (ANOVA).

5.3.4 Inibição do estresse oxidativo hepático induzido pela peçonha de T. serrulatus

Após 6 horas do envenenamento, foi observado um aumento da concentração de nitrito e

malondialdeído no grupo TsV, quando comparado ao grupo PBS e uma redução dos níveis de

TNB. Os grupos JM 100 e 200 mg/kg, em ambos os protocolos, diminuíram a concentração do

nitrito e malondialdeído de forma significativa (Figura 21 A, B, C e D). No protocolo de pós

tratamento, os grupos soro e dexametasona também diminuíram os níveis do nitrito e

malondialdeído quando comparados ao grupo TsV (p < 0,05) e quando comparados aos grupos do

extrato foi observado que não houve diferença estatística (p > 0,05).

Por fim, os grupos JM 100 e 200 mg/kg pré e JM 200 pós, aumentaram significativamente

a concentração de GSH. Esse aumento também aconteceu para os grupos soro e dexametasona,

quando comparados ao grupo TsV (p < 0,05) (Figura 21 E e F)

83

Resultados

Figura 20: Inibição do estresse oxidativo hepático induzido pela peçonha de T. serrulatus com o extrato

de J. mollissima


MDA: malondialdeído. TNB: tiolato; PTs: peçonha de T. serrulatus; JM: extrato aquoso de J. mollissima. *p < 0,05,

**p < 0,01 e ***p < 0,001 quando comparados ao grupo controle (TsV), após teste de Tukey (ANOVA). (TsV) por one-way ANOVA seguido pelo teste de Tukey. Valores apresentados como média ± erro padrão da média

(n = 5/grupo).

84

Resultados

5.3.5 Inibição do estresse oxidativo renal induzido pela peçonha de T. serrulatus

Após 6 horas do envenenamento, foi observado um aumento da concentração de nitrito e

malondialdeído no grupo TsV, quando comparado ao grupo PBS e uma redução dos níveis de

TNB. Nos protocolos de pré e pós-tratamento, todas as doses do extrato testadas diminuíram a

concentração do nitrito de forma significativa, com exceção do extrato na dose de 200 mg/Kg pós.

O grupo soro e dexametasona também diminuíram os níveis do nitrito quando comparados ao

grupo da peçonha TsV (p < 0,05) (Figura 22 A e B)

Em relação à peroxidação lipídica, nos protocolos de pré e pós-tratamento, todas as doses

do extrato testadas diminuíram a concentração do malondialdeído de forma significativa (Figura

22 C e D), com exceção do grupo JM 200 mg/Kg pós. O grupo soro e dexametasona não

diminuíram os níveis do malondialdeído quando comparados ao grupo TsV. Por fim, os grupos

JM 100 e 200 mg/kg, em ambos os protocolos, grupo soro e dexametasona, aumentaram

significativamente a concentração de GSH, em comparação ao grupo TsV (p < 0,05) (Figura 22 E

e F)

85

Resultados

Figura 21: Inibição do estresse oxidativo renal induzido pela peçonha de T. serrulatus com o extrato de J.

mollissima


MDA: malondialdeído. TNB: tiolato; PTs: peçonha de T. serrulatus; Ejm: extrato aquoso de J. mollissima.

*p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 quando comparados ao grupo controle (TsV), após teste de Tukey

(ANOVA). por one-way ANOVA seguido pelo teste de Tukey. Valores apresentados como média ± erro

padrão da média (n = 5/grupo).



A atividade antioxidante do extrato das folhas de J. mollissima foi avaliada em seis

diferentes ensaios: capacidade antioxidante total; sequestro de radicais hidroxila e DPPH; quelação

de ferro e de cobre; e o poder redutor (Figura 23).

No ensaio de capacidade antioxidante total, o extrato apresentou atividade antioxidante de

86

Resultados

207,5 ± 0,0002 mg equivalente em ácido ascórbico por grama do extrato. O extrato apresentou

significativa capacidade de sequestrar os radicais livres hidroxila e DPPH, conforme mostra a

Figura 23 A e B. No que diz respeito ao sequestro do radical hidroxila, a partir da concentração de

1 mg/mL do extrato ocorreu aproximadamente 51,9 ± 2,99 % de sequestro desse radical. Quanto

ao DPPH, o extrato na concentração de 0,25 mg/mL foi suficiente para o sequestro de

aproximadamente 69,6 ± 3,00 % desse radical.

Figura 22: Avaliação da atividade antioxidante in vitro de J. mollissima


Valores expressos como média ± erro médio padrão com n = 3. Extratos de J. mollissima (EJm).

87

Resultados

O extrato apresentou atividade quelante para os íons cobre (Figura 23 C) e ferro (Figura 23

D) de forma significativa. A menor concentração do extrato utilizada foi suficiente para quelar

79,4 ± 0,96 % de cobre. Quanto ao ferro, 0,5 mg/mL do extrato apresentou 73,3 ± 3,4 % de

quelação desse íon. Por fim, o extrato também apresentou um significativo poder redutor (Figura

23 D), quando comparado ao ácido ascórbico. Como observado na figura, o extrato apresentou

atividade redutora de forma dose dependente. Na concentração de 2 mg/Kg o extrato apresentou

atividade de 75,02 ± 3,66 %.

88

Discussão

6 DISCUSSÃO

89

Discussão

6 DISCUSSÃO

Produtos naturais vegetais sempre foram usados pela humanidade para o tratamento de suas

enfermidades, fato que se reflete na população mundial atual pela existência de muitas substâncias

comercializadas serem sintetizadas a partir de precursores naturais. O uso popular deve ser

encarado como uma pré-triagem quanto a utilidade terapêutica, o que acaba consistindo em um

valioso atalho para a descoberta de novas moléculas.

Em muitos países, os extratos de plantas são utilizados popularmente para tratar acidentes

com animais peçonhentos. Estudos como o nosso indicam a importância de uma avaliação

científica básica desses extratos que podem confirmar os efeitos biológicos atribuídos pela

população.

Na literatura é comum encontrar estudos avaliando a toxicidade das plantas do gênero

Jatropha. Geralmente, a toxicidade desse gênero está associada às sementes e ao látex, levando

muitas vezes aos sintomas como dor abdominal, diarreia, náuseas, vômitos e em casos mais graves

alterações cardiovasculares e renais (DEVAPPA; MAKKAR; BECKER, 2010; MARIZ et al.,

2010; SABANDAR et al., 2013).

Estudos avaliando a toxicidade dos extratos etanólicos das espécies vegetais J.

gossypiifolia e J. mollissima revelaram uma notada toxicidade para essas espécies (MARIZ et al.,

2010; MARIZ et al., 2012; RIBEIRO, 2014; BRANQUEHAIS et al., 2016). Pesquisas recentes

estão avaliando a toxidade desse gênero utilizando o extrato aquoso. Nagaharika et al. (2013)

mostraram que o extrato aquoso de J. gossypiifolia, 2 g/Kg, administrado oralmente em ratos, não

apresentou toxicidade oral aguda significativa. Félix-Silva et al. (2014) avaliaram a atividade

hemolítica e a citotoxicidade frente as células HEK-293 e demonstraram que o decocto das folhas

de J. gossypiifolia não apresentou toxicidade. Costa (2018) avaliou a toxicidade aguda do extrato

etanólico de J. mollissima (300 e 2000 mg/Kg) em camundongos swiss, por via oral, e observou

que o extrato não causou mortalidade e nem morbidade a nenhum dos animais que receberam as

doses testadas.

Tendo em vista a toxicidade das espécies desse gênero e o fato de não ter na literatura

estudos avaliando a toxicidade do extrato aquoso das folhas de J. mollissima, foram realizados

dois modelos de citotoxicidade in vitro (atividade hemolítica e citotoxicidade frente às células

MDCK). O estudo avaliou várias concentrações do extrato e demonstrou que não houve efeito

citotóxico. Na Figura 11, onde foi avaliado a atividade hemolítica, foi observado que o extrato

apresentou o mesmo percentual de hemólise que o PBS (controle negativo), o que pode sugerir

uma provável ação citoprotetora do extrato. Já na avaliação da citotoxicidade frente às células

90

Discussão

MDCK (Figura 12), observou-se que o extrato apresentou 100 % de viabilidade celular em todas

as concentrações testadas, demonstrando que o extrato não altera a atividade mitocondrial das

células em cultura. De fato, esses resultados estão de acordo com a literatura, onde estudos

utilizando os extratos aquosos das folhas da outra espécie do gênero (J. gossypiifolia), apresentou

atividade protetora contra hemólise e 100% de viabilidade celular frente às células de rim

embrionário humano (NAGAHARIKA et al., 2013; FÉLIX-SILVA et al., 2014).

Esses resultados dão respaldo ao estudo, sugerindo que o extrato aquoso das folhas de J.

mollissima apresentam nenhuma/ pouca toxicidade, provavelmente devido o farmacógeno e o

solvente extrator (água) para o preparo do extrato, uma vez que já se sabe que há diferença na

constituição química de um extrato utilizando diferentes solventes para a extração ou utilizando

diferentes partes da espécie vegetal. Esse motivo pode explicar a toxicidade demonstrada nos

estudos anteriores para o extrato de J. mollissima, uma vez que, esses estudos utilizaram diferente

farmacógeno e extratos etanólicos (RIBEIRO, 2014; BRANQUEHAIS et al., 2016).

No presente estudo, a atividade antiofídica foi avaliada mostrando a capacidade do extrato

aquoso das folhas de J. mollissima em inibir os distúrbios hemostáticos, hematológicos,

bioquímicos e o estresse oxidativo hepático e renal produzidos pelo envenenamento botrópico.

Nos últimos anos, algumas espécies vegetais, como a J. elliptica, J. mollissima e J.

gossypiifolia vêm demonstrando atividade antiofídica significativas (VILAR; CARVALHO,

FURTADO, 2007; DE PAULA et al., 2010; GOMES et al., 2016; FÉLIX-SILVA et al., 2017;

FÉLIX-SILVA et al., 2018; XAVIER-SANTOS et al., 2018). É importante ressaltar que estudos

que avaliam a inibição dos efeitos sistêmicos produzidos por serpentes do gênero Bothrops com o

extrato aquoso das folhas de J. mollissima ainda não foram encontrados na literatura.

Peçonha botrópica apresentam em sua composição várias enzimas proteolíticas, sendo as

SVSPs e SVMPs as enzimas mais importantes e responsáveis pelos efeitos sistêmicos durante o

envenenamento botrópico. Por isso, moléculas que têm atividade antiofídica devem ter a

capacidade de inibir essas enzimas e reverter os efeitos produzidos por essa peçonha (GUTIÉREZ;

LOMONTE, 1989; MARKLAND, 1998; SAJEVIC; LEONARDI; KRIZAJ, 2001). As toxinas

hemorrágicas e defibrinogenantes da peçonha ofídica têm a capacidade de degradar a caseína,

fibrinogênio, colágeno, entre outros, sendo responsáveis pelos distúrbios hemostáticos decorrentes

da picada (MARKLAND, 1998). Peçonhas botrópicas podem afetar a hemostasia alterando a

coagulabilidade sanguínea, provocando danos aos vasos sanguíneos resultando em sangramento

ou atuando sobre as plaquetas (SAJEVIC; LEONARDI; KRIZAJ, 2011). As SVSPs e SVMPs,

enzimas semelhantes à trombina, enzimas fibrinogenolíticas ou enzimas ativadoras de fatores de

coagulação são as principais enzimas responsáveis por esses efeitos (MATSUI; FUJIMURA;

91

Discussão

TITANI, 2000; SAJEVIC; LEONARDI; KRIZAJ, 2011). Além dos efeitos sobre fatores de

coagulação sanguínea, diversas toxinas, tais como algumas SVMPs, fosfolipases A2 (PLA2),

moléculas semelhantes à lectinas do tipo C (CTLs) e desintegrinas são conhecidas por agirem

sobre plaquetas, induzindo ou inibindo a agregação plaquetária, o que contribui para a

coagulopatia através da depleção dos níveis de plaquetas funcionais (SLAGBOOM et al., 2017).

Dentre as células sanguíneas, as plaquetas são aquelas que mais sofrem alterações quantitativas e

qualitativas durante o envenenamento. Sabe-se que a plaquetopenia é uma das manifestações

sistêmicas mais frequentes observadas em envenenamentos com a peçonha botrópica e que a

depleção de plaquetas pode gerar graves complicações nos acidentados, uma vez que elas são

primordiais durante a hemostasia normal (SANTORO et al., 2008).

Estudos anteriores demonstram que os coelhos apresentaram uma significativa redução de

plaquetas após três horas da inoculação da peçonha de B. jararaca (SANTORO et al., 2004). Outro

estudo observou que peçonha de B. caribbaeus também induziu uma notável plaquetopenia em

camundongos três horas após a administração intravenosa com o consumo plaquetário de 95 % em

comparação ao grupo salina (HERRERE et al., 2012).

Nesse estudo, a peçonha de B. jararaca quando administrada em camundongos, pela via

intraperitoneal, produziu significativos efeitos sistêmicos observados com os efeitos descritos no

envenenamento humano e em estudos anteriores. Conforme a Figura 13, o extrato de J. mollissima

agiu tanto sobre o efeito da peçonha sobre o fibrinogênio como sobre as plaquetas, sugerindo um

efeito protetor desse extrato frente à coagulopatia produzida por B. jararaca. Esse resultado

corrobora com resultados anteriores de nosso grupo sobre a efetividade do extrato de J.

gossypiifolia em inibir a atividade defibrinogenante da peçonha da serpente B. jararaca (FÉLIX-

SILVA et al., 2014). Esse resultado sugere que o extrato esteja agindo sobre as enzimas

semelhantes à trombina (SVTLEs), SVSPs, SVMPs ou então sobre as enzimas fibrinogenolíticas

normalizando os níveis de fibrinogênio e plaquetas circulantes e assim inibindo a

incoagulabilidade sanguínea. Além disso, o extrato foi capaz de inibir o efeito da peçonha

prolongando o tempo TTPA. A atividade frente ao TTPA pode ser relacionada a uma maior

afinidade dos constituintes químicos do extrato a algum ou alguns dos fatores da via de ativação

por contato (via intrínseca) e/ou da via comum da coagulação (MAO et al. 2009). Além disso,

pode-se sugerir que o extrato poderia ter relação com uma possível ação fibrinolítica, levando a

hidrolise dos coágulos de fibrina.

Na série branca, o extrato de J. mollissima reduziu a infiltração de neutrófilos segmentados

e os monócitos causados pela peçonha, sugerindo uma ação anti-inflamatória desse extrato (Figura

14). De fato, esse resultado está de acordo com os estudos anteriores que demonstram uma

92

Discussão

significativa atividade anti-inflamatória para o extrato de J. mollissima e J. gossypiifolia (FÉLIX-

SILVA et al., 2014; GOMES et al., 2016).

Em relação as alterações bioquímicas, foram dosados os parâmetros indicativos de função

hepática, renal, muscular e pancreática. Observou-se que a peçonha de B. jararaca induziu o

aumento de níveis de ácido úrico, ureia, AST, ALT, LDH e amilase, indicando que a peçonha

apresenta um forte efeito nos danos hepático, renal, pancreático, muscular e/ou cardíaco (Figura

15). De fato, esses resultados corroboram com o que já foi visto na literatura.

Estudo anteriores mostram que pacientes picados por B. jararacussu, tiveram

concentrações elevadas de marcadores de função renal (creatinina e ureia). A LDH teve suas

concentrações aumentadas, indicando dano muscular e/ou cardíaco, corroborado pelo aumento na

concentração de ureia (MILANI et al., 1997). Segundo Mcpherson (2007), ALT é uma enzima

mais específica da função hepática. O aumento de AST e ALT pode indicar um dano hepático

agudo. Experimentos em camundongos observou o aumento de AST, após a inoculação da

peçonha de B. jararacussu, indicando um possivelmente dano da musculatura esquelética e do

miocárdio (BENVENUTI et al., 2003; ZENI et al., 2007). A ureia sérica é amplamente utilizada

na prática clínica como medida de disfunção renal. Ela não é utilizada como marcador da função

renal, pois sua produção depende do fígado, mas associada a outros parâmetros bioquímicos (ALT

e ácido úrico) é indicativa do dano hepático (MCPHERSON; PINCUS, 2007). Os valores de

creatinina e ácido úrico elevados, além de aumentarem os indícios de disfunção renal, também

estão relacionados a danos musculares (RIELLA, 1996; MCPHERSON; PINCUS, 2007).

No presente estudo, o extrato de J. mollissima foi capaz de reduzir significativamente os

efeitos da peçonha de B. jararaca. O extrato diminuiu os níveis de ácido úrico e ureia servindo

como indicativo da melhoria na função renal dos animais. Os níveis de ALT e AST também foram

reduzidos indicando uma melhoria do dano hepático; a amilase e LDH reduzidas foram indicativos

de que o extrato teve um efeito protetor no dano pancreático e muscular e/ou cárdico,

respectivamente (Figura 15).

O estresse oxidativo é uma das ações fisiopatológicas, frequentemente estudado nos

acidentes ofídicos (SILVA et al., 2011; STRAPAZZON et al., 2014; AL-QURAIDHY; DKHIL;

ABDEL, 2014) assim como os compostos antioxidantes que possam tornar compostos terapêuticos

complementares a soroterapia. (MORS et al., 2000).

Santhosh et al. (2013) observaram o estresse oxidativo e alterações em leucócitos,

eritrócitos e plaquetas importantes, após injetar a peçonha da serpente Daboia russeli em

camundongos. Essas alterações foram revertidas após o tratamento com um antioxidante natural

(crocina), indicando uma relação entre o estresse oxidativo e as alterações hematológicas para esse

93

Discussão

modelo de envenenamento. Estudos in vitro e in vivo já demonstraram que peçonhas das serpentes

B. jararaca, B. jararacussu, Vipera russeli, Naja haje e Crotalus durissus terrificus são capazes

de aumentar a produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ALEGRE et al., 2010;

SILVA et al., 2011; SANTHOSH et al., 2013).

Algumas enzimas presentes na peçonha ofídica podem ter relação com estresse oxidativo.

As PLA2s demostraram induzir a geração de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, por meio

de peroxidação lipídica destruindo a membrana celular e liberando o ácido araquidônico, e

consequentemente, formando os eicosanoides (DRAY, 1995; HALLIWELL, 2001; CHO et al.,

2008). As LAOOs liberam o peróxido de hidrogênio que interferem na membrana plasmáticas, nas

proteínas e em ácidos nucleicos o que pode levar a necrose e apoptose induzidos pelo

envenenamento (IZIDORO et al., 2014).

No presente estudo, foi observado o aumentou as espécies reativas e a diminuição da

capacidade antioxidante da peçonha de B. jararaca em amostras do fígado e do rim, o que

demonstra que o envenenamento por essa peçonha induz um importante desequilíbrio no estado

redox. Em contrapartida, a administração do extrato de J. mollissima levou a uma diminuição das

espécies reativas e o aumento os níveis de GSH, o que pode estar relacionado com as suas ações

antioxidantes, sequestro e neutralização de radicais livres e quelação de metais.

Outro fato importante, é que as plaquetas são altamente suscetíveis as influências do

estresse oxidativo, causando distúrbios como a plaquetopenia e alterações na adesão e agregação

das mesmas (PIETRAFORTE et al., 2014). Como visto, a peçonha de B. jararaca causou uma

plaquetopenia após 6 horas em camundongo, porém, os animais tratados com a J. mollissima

tiveram um aumento da concentração das plaquetas. O que pode ainda fortalecer a ideia de que o

extrato de J. mollissima além de exercer um efeito protetor frente à coagulopatia, inibe as espécies

reativas de oxigênio e nitrogênio produzidas por peçonhas de B. jararaca. Vale ainda ressaltar,

que o extrato de J. mollissima e o soro antibotrópico-crotálico apresentaram resultados

semelhantes significativos, em todos os ensaios realizados, demonstrando que essa espécie pode

ter compostos bioativos que possam agir como coadjuvantes para complementar a soroterapia.

Gomes et al. (2016) observaram que o extrato aquoso das folhas de J. mollissima inibiu os efeitos

locais induzidos pela peçonha de B. erythromelas e B. jararaca, em camundongos.

Com relação ao uso como antiescorpiônico dessa espécie, no entanto, há escassez de

trabalhos com este enfoque, o que impulsionou o estudo dessa planta. Sendo assim, o próximo

passo foi avaliar o efeito antiescorpiônico do extrato de J. mollissima sobre a inflamação e o

estresse oxidativo causados pelo envenenamento induzido pela peçonha de T. serrulatus. O

envenenamento por escorpiões é um problema de saúde pública importante. Após o

94

Discussão

envenenamento, a liberação de citocinas pode contribuir para a inflamação e ativação de

macrófagos, bem como para a indução da resposta imune (PETRICEVICH, 2010). A peçonha

desse animal consiste em uma mistura de neurotoxinas que atuam em vários canais iônicos

dependentes de voltagem, importante na resposta imunitária (PETRICEVICH, 2010). Durante o

envenenamento observa-se o aumento dos níveis séricos de várias citocinas nas primeiras horas,

decorrentes do aumento do número dos leucócitos (PESSINI, 2003). A resposta inflamatória

sistêmica, como o edema pulmonar decorrente do envenenamento por T. serrulatus, é a principal

causa de morte especialmente em crianças e está associada em amplificação dos níveis de citocinas

e quimiocinas (PESSINI et al., 2003). As citocinas pró-inflamatórias induzem as manifestações

inflamatórias locais e sistêmicas, com a migração dos leucócitos para o tecido afetado. Estudos

mostram que a peçonha de T. serrulatus induz uma reação inflamatória alta, revelados por níveis

de citocinas IL-6, IL-1β e IL-12 e aumento da migração de células para os tecidos

(PETRICEVICH, 2005). Outra espécie escorpiônica (Androctonus amoreuxi) produziu em

coelhos aumento considerável na contagem total de leucócitos uma hora após aplicação da

peçonha. A peçonha de T. serrulatus induz reações inflamatórias sistêmicas e localizadas com

envolvimento de interleucinas, cininas e aminas bioativas (PESSINI et al, 2006; PESSINI et al,

2008), levando ao recrutamento de neutrófilos do compartimento marginal para a circulação.

Coelho et al. (2007) demonstraram que o edema pulmonar, comum em acidentes escorpiônicos,

ocorre em associação com grande influxo de neutrófilos. A enzima mieloperoxidase (MPO) está

presente nos grânulos azurófilos de neutrófilos, participando assim de vários processos

fisiológicos, dentre eles o processo inflamatório (REAL MARTINEZ et al., 2015). Esta enzima

pode ser considerada um marcador de infiltração celular, principalmente de neutrófilos no tecido

inflamado. Sendo assim, é vista como um marcador indireto de leucócitos ativados, estando

relacionada aos processos de migração celular e exsudação (SILVA, 2011). Nessa abordagem, o

edema pulmonar foi estudado (Figura 18) e pode-se observar que o extrato de J. mollissima inibiu

de forma significativa o edema pulmonar, resultado da inibição de várias citocinas (entre elas, IL-

6 e IL-1β), proteínas e enzimas inflamatórias, sugerindo que está espécie apresenta um alto

potencial anti-inflamatório. Esses resultados corroboram com os resultados da atividade

antiofídica apresentado nesse trabalho, que demonstrou que o extrato diminui a participação de

células inflamatórias induzidas por B. jararaca. Outro ponto importante, é que o extrato se

comportou de forma semelhante a dexametasona (medicamente de referência). Dexametasona é

um corticosteroide com principal atividade glicocorticoide. Os glicocorticoides exercem potentes

efeitos anti-inflamatórios inibe a ação enzimática da PLA2s. Deste modo é impedida a liberação

do ácido araquidônico e, como consequência, não são formados seus metabólitos, como

95

Discussão

prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos, que são mediadores da inflamação (ROBERTS;

MORROW, 2005). Assim sendo, pode-se sugerir que o extrato esteja agindo pela mesma via da

dexametasona.

A inibição das enzimas e proteínas séricas com J. mollissima foram avaliadas após o

envenenamento com a peçonha de T. serrulatus. A enzima creatina quinase (CK) é produzida nas

células musculares estriadas e está presente no cérebro, nos músculos esquelético e cardíaco e

principalmente no coração (CARDINET, 1997; KRAMER; HOFFMANN, 1997). O

envenenamento escorpiônico pode causar danos ao miocárdio, resultando em aumento sérico da

CK, fato comprovado em crianças (AMARAL et al., 1991), coelhos (ABDOON; FATANI, 2009)

e ratos (PINTO et al., 2010). A LDH catalisa a oxidação reversível de piruvato a L-lactato e possui

uma série de isoenzimas presentes nos eritrócitos, hepatócitos, músculos e miocárdio

(GONZÁLEZ; SCHEFFER, 2003; KANECO, 2008). A lesão muscular detectada horas após sua

inoculação da peçonha de Leiurus quinquestriatus quinquestriatus, levou o aumento sérico de

LDH e CK em coelhos (ABDOON; FATANI, 2009). A aspartato amino-transferase (AST) é outro

parâmetro bioquímico encontrado principalmente no fígado, eritrócitos, musculatura esquelética e

cardíaca, e se localiza no citosol e nas mitocôndrias das células. Geralmente é utilizada para avaliar

lesão muscular em conjunto com CK e LDH (GONZÁLEZ; SCHEFFER, 2003; COLVILLE,

2005). A avaliação dos níveis da ureia e da creatinina também foram avaliados. O aumento da

concentração da ureia sanguínea reflete mecanismos renais e extra renais, como catabolismo

tecidual devido à febre, exercícios, refeição a base de proteínas aumentando o aporte de

aminoácidos, desidratação, diminuição da função cardíaca e hipovolemia. (GONZÁLEZ;

SCHEFFER, 2003). Revelo et al. (1996) e Alves et al. (2005) demonstraram em ratos que a

distribuição no organismo da peçonha do escorpião T. serrulatus é rápida, atingindo concentração

máxima nos rins em 15 minutos. Os efeitos tóxicos são devido a menor taxa de filtração

glomerular, deposição de proteínas nos túbulos renais e aumento da pressão hidrostática, com

decorrente aumento sérico de creatinina e ureia (KANEKO, 2008). O último parâmetro estudado

foi a amilase que é uma enzima produzida pelo pâncreas exócrino e outros tecidos, cuja função é

catalisar a hidrólise do amido e glicogênio para formação de maltose e glicose. Seu aumento está

relacionado com a inflamação do pâncreas (KRAMER; HOFFMANN, 1997). No escorpionismo

a ocorrência de pancreatite é relatada, porém se desconhece o seu mecanismo (NOVAES et al.,

2002).

No presente estudo a espécie J. mollissima reduziu os níveis das enzimas e das proteínas

séricas de forma significativa quando comparada ao grupo TsV (Figura 20). Sendo assim, sugere-

se que a espécie em estudo esteja inibindo os efeitos tóxicos causadas nos músculos,

96

Discussão

principalmente o músculo cardíaco, fígado, rins, pulmões e pâncreas decorrente do envenenamento

da peçonha de T. serrulatus.

Já existem estudos que relatam a presença de estresse oxidativo após envenenamento com

alguns animais, como escorpiões e serpentes. Sahnoun et al. (2007) notou que, após administração

da peçonha do escorpião B. occitanus tunetanus em ratos, houve um aumento de malondialdeído,

indicador de peroxidação lipídica, principalmente após cinco minutos da injeção da peçonha, que

pode ser explicado pela rápida difusão da peçonha pelos tecidos.

Fátima e Mohamed (2014) observaram a presença de estresse oxidativo 30 minutos após

administração da peçonha do escorpião Androctonus australis Hector, no modelo de edema de

pata, através do aumento de malondialdeído.

Santhosh et al. (2013) observou que, em sangue de animais tratados com a peçonha de uma

espécie de serpente da família Viperidae, a Vipera russelli, houve uma disfunção oxidativa com o

aumento de espécies reativas de oxigênio, e níveis de hidroperóxidos.

A peroxidação lipídica se inicia quando radicais livres agem sobre lipídios insaturados de

membranas celulares, gerando principalmente os radicais alquila, alcoxila e peroxila, levando a

destruição das estruturas dessas membranas, falência de mecanismos de troca de metabólitos, e

em casos graves, à morte celular (LIMA, SAES; ABDALLA, 2001). Dentre os produtos gerados

pela peroxidação lipídica está o malondialdeído e a sua concentração vem sendo utilizada para

medir a intensidade da peroxidação lipídica em sistemas biológicos, células e tecidos (MAFRA,

ABDALLA; COZZOLINO, 1999). Os antioxidantes (superóxido dismutase, catalase, glutationa

peroxidase e Vitamina E) protegem os sistemas biológicos contra efeitos deletérios (JORDAO et

al., 1998).

No estudo observou-se que a peçonha de T. serrulatus aumento consideravelmente a

concentração de nitrito e malondialdeído e que diminuiu os níveis de GSH nos órgãos (fígado e

rim). Porém, após a administração do extrato os níveis de concentração do nitrito e malondialdeído

reduziram significativamente. Outro ponto importante é que o extrato aumentou

consideravelmente a concentração de GSH nos animas (Figura 21 e 22). Esses resultados sugerem

uma atividade antioxidante presente nos compostos da espécie J. mollissima e vai de acordo com

os resultados das alterações bioquímicas que mostraram que o extrato de J. mollissima diminuiu

os efeitos tóxicos hepáticos e renais produzidos pelas peçonhas de B. jararaca e T. serrulatus.

Gomes et al. (2016) observou a presença de seis flavonoides (schaftosídeo, isoschaftosídeo,

isoorientina, orientina, vitexina e isovitexina) presentes no extrato aquoso das folhas de J.

mollissima, considerando esses compostos o metabólito majoritário dessa espécie.

Os flavonoides são compostos fenólicos que ocorrem em plantas, e vários estudos relatam

97

Discussão

as possíveis atividades destes como compostos anti-inflamatório, antioxidante, antialérgicos,

antitrombolítico, antiviral, antitumoral, antiofídico, antiescorpiônico e imunomodulador

(HARBORNE, 1999; ANDERSEN; MARKHAM, 2006; LIMA et al., 2015; BITENCOURT et al,

2015). Desde a década 30 estão sendo usados no tratamento de fragilidade de vasos capilares e

púrpura hemorrágica por serem capazes de recuperar a resistência capilar e também por inibirem

a atividade de hialuronidases (SIMÕES, 2003). Além disso, eles têm a capacidade de quelar os

metais e promover pontes de hidrogênio forte dos grupos fenólicos com as amidas de cadeia

proteica. Essa propriedade quelante é de extrema importância no envenenamento causados por

animais peçonhentos, uma vez que, as toxinas (SVMPs e PLA2s) presentes na peçonha são

dependentes de íons (MORS et al., 2000; GOMES et al., 2010). Dados da literatura sugerem que

estes metabólitos possam ser quelantes naturais dos íons impedindo a catálise destas enzimas.

Contudo, uma possível interação direta dos componentes de extratos vegetais com as proteínas

presentes nos na peçonha não está descartada (BORGES et al., 2001; BIONDO et al., 2003).

Mors e colaboradores (2000) listam algumas classes de metabólitos (terpenóides,

flavonoides, além de outras substâncias fenólicas) como responsáveis pelas inibições das toxinas

de peçonha.

Pereanez et al. (2014), demonstrou uma significativa inibição frente às PLA2s ofídicas.

Outro estudo mostrou a capacidade dos flavonoides em inibir as PLA2s e hialuronidases da

peçonha ofídica (CARVALHO et al., 2013; SANTHOSH et al, 2013). Belchor et al. (2017)

demonstraram o potencial da quercetina e seu derivados como inibidores de PLA2s da peçonha de

B. jararacussu, ao modificarem a estrutura e as atividades dessa enzima.

Considerando que os flavonoides são os compostos majoritários do extrato aquoso das

folhas de J. mollissima, pode-se sugerir que a inibição das peçonhas de B. jararaca e T. serrulatus

estão relacionadas a ação quelante de metais, anti-inflamatória, antioxidante e inativação

enzimática destes metabólitos secundários frente às toxinas que são consideradas peças chaves

para o envenenamento.

Esses resultados demonstram a potencialidade do extrato aquoso das folhas de J.

mollissima em inibir os efeitos sistêmicos produzidos pela serpente B. jararaca e pelo escorpião

T. serrulatus. Vale salientar que muitas das vezes, essa inibição foi igual ao até mesmo superior a

soroterapia, mostrando que o uso dessa espécie pode ser utilizado como complemento a

soroterapia. A fim de identificar, compreender e propor possíveis mecanismos de ação envolvidos

na atividade antipeçonhenta do extrato de J. mollissima, foi avaliada a sua atividade antioxidante

e quelante de metais. No nosso estudo, foi observado que o extrato apresentou significativa

atividade antioxidante, in vitro, em todos os testes realizados (Figura 23). Ele foi capaz de quelar

98

Discussão

os íons metálicos (cobre e ferro), bem como sequestrar os radicais livres hidroxila e DPPDH.

Segundo Gomes et al. (2010), hipóteses como: precipitação de proteínas, inativação

enzimática, quelação de metais, degradação proteolítica, ação antioxidante ou a junção dessas

hipóteses são alguns dos mecanismos utilizados pelos constituintes das plantas que neutralizam as

ações tóxicas das peçonhas. Outro fato importante é que muitas plantas podem ser utilizadas para

minimizar os feitos do envenenamento, principalmente os efeitos locais, uma vez que sozinhas,

elas não inibem a peçonha (GOMES et al., 2010; GOMES et al., 2016; FÉLIX-SILVA et al. 2014).

Estudos mostram que algumas toxinas como as SVMPs e as PLA2s são enzimas que

necessitam de íons metálicos (zinco e cálcio, respectivamente), como cofatores essenciais para a

sua atividade). Pereanez et al. (2013) demonstrou a inibição dos efeitos enzimáticos da

metaloprotease isolada do veneno da serpente B. asper, pelo ácido glicólico (agente antioxidante

e quelante de metais). Félix-Silva et al. (2014) demonstrou que o extrato das folhas de J.

gossypiifolia apresentou afeito quelante contra o cobre e o ferro, corroborando com os resultados

presentes nesse estudo. Outro ponto importante do nosso estudo foi a capacidade do extrato em

inibir os radicais livres hidroxila e DPPH. O estresse oxidativo gerado durante o envenenamento,

como consequência das alterações locais e sistêmicas da peçonha, produz radicais livres, que agem

formando peróxidos lipídicos. Então acredita-se, que a inibição da peroxidação lipídica durante o

envenenamento é importante para se ter uma melhora do quadro (CHATTERJEE;

CHAKRAVARTY; FOMES, 200; SHENOY et al., 2013). De fato, o nosso estudo corrobora com

os estudos da literatura, uma vez que que o extrato de J. mollissima produziu a inibição da

peroxidação lipídica in vivo, em ambas as peçonhas utilizadas, mostrando a ação antioxidante. Foi

demonstrando que o extrato de J. mollissima aumentou ou níveis da glutationa reduzida que é um

potente antioxidante durante o estresse oxidativo.

Félix-Silva et al. (2014) também demonstrou que o extrato das folhas de J. gossypiifolia

apresentou a capacidade e sequestrar os radicais livres hidroxila e superóxido, novamente

corroborando com os resultados presentes nesse estudo. Shenoy et al. (2013) observou que a

enzima catalase (enzima antioxidante) diminuiu 24 horas após a injeção intraperitoneal da peçonha

Doboia russelli em camundongos, aumentando significativamente os níveis dessa enzima quando

os animais foram tratados com o extrato etanólico de frutos de Piper longum L.

Sendo assim, esses resultados dão suporte para sugerir que os compostos, especialmente

os flavonoides, presentes no extrato das folhas de J. mollissima podem estar agindo através de uma

possível quelação dos metais presentes nas peçonhas ou então atuando inibindo o estresse

oxidativo (ação antioxidante) produzido durante o envenenamento de animais peçonhentos.

Em suma, esse estudo demonstra a potencialidade do extrato aquoso das folhas de J.

99

Discussão

mollissima em inibir os efeitos sistêmicos in vivo induzidos pela peçonha da serpente B. jararaca

e do escorpião T. serrulatus. No entanto, mais ensaios são necessários para entender os

mecanismos de ação dos compostos da espécie vegetal J. mollissima, assim como outros ensaios

direcionados para outros efeitos tóxicos das peçonhas são importantes para se explorar mais ações

terapêuticas desse extrato.

100

Conclusão

7 CONCLUSÕES

101

Conclusão

7 CONCLUSÕES

✓ O extrato aquoso das folhas de J. mollissima não apresentou atividade hemolítica e nem a

atividade citotóxica frente as células MDCK, podendo indicar baixa toxicidade do extrato;

✓ O extrato aquoso das folhas de J. mollissima foi capaz de inibir a atividade

defibrinogenante in vivo da peçonha de B. jararaca, indicando o seu potencial no

tratamento da incoagulabilidade sanguínea induzida pelo envenenamento botrópico;

✓ O extrato aquoso das folhas de J. mollissima inibiu as alterações hematológicas produzidas

durante o envenenamento por B. jararaca;

✓ O extrato aquoso das folhas de J. mollissima inibiu as alterações bioquímicas induzidas

pela peçonha de B. jararaca;

✓ O extrato aquoso das folhas de J. mollissima inibiu o estresse oxidativo hepático e renal

induzido pela peçonha de B. jararaca;

✓ O extrato aquoso das folhas de J. mollissima nas doses, 100 e 200 mg/kg, no protocolo de

pré e pós-tratamento administrado por via oral, promoveu a inibição do edema pulmonar e

da enzima mieloperoxidase induzida por T. serrulatus (p < 0,05). J. mollissima revelou um

efeito anti-edematogênico estatisticamente semelhante ao efeito induzido pela

dexametasona (p > 0,05), o que mostra a potencialidade do extrato como anti-inflamatório;


pré e pós-tratamento administrado por via oral, promoveu a inibição das enzimas IL-6 e

IL-1β induzida por T. serrulatus (p < 0,05). J. mollissima foi estatisticamente semelhante

ao efeito induzido pela dexametasona (p > 0,05), o que mostra a potencialidade do extrato

como anti-inflamatório;


pré e pós-tratamento administrado por via oral, promoveu a inibição das e proteínas séricas

induzida por T. serrulatus (p < 0,05). J. mollissima foi estatisticamente semelhante ao

efeito induzido pela dexametasona (p > 0,05), o que mostra a potencialidade do extrato

102

Conclusão

como anti-inflamatório;

✓ O extrato aquoso das folhas de J. mollissima inibiu o estresse oxidativo hepático e renal

induzido pela peçonha de T. serrulatus;

✓ O extrato aquoso das folhas de J. mollissima apresentou significativa atividade

antioxidante em diferentes modelos, o que justifica parcialmente a atividade

antipeçonhenta apresentada;

✓ Em suma, o presente estudo demonstrou o potencial das folhas de J. mollissima em inibir

os efeitos biológicos produzidos pela peçonha da serpente B. jararaca e do escorpião T.

serrulatus. Vale ressaltar que, estudos seguintes serão realizados com o objetivo de isolar

e caracterizar os compostos bioativos responsáveis por atividade antiofídica e

antiescorpiônica da espécie vegetal J. mollissima.

103

Referência

7 REFERÊNCIAS

104

Referência

7 REFERÊNCIAS

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117

Anexo

ANEXOS

1.1 ESBOÇO DO ARTIGO

EFFECT OF TREATMENT WITH AQUEOUS LEAF EXTRACT OF

Jatropha mollissima (Pohl) Baill. AGAINST THE TOXIC EFFECTS OF

Bothrops jararaca SNAKE VENOM AND Tityus serrulatus SCORPION

VENOM IN MICE

Jacyra Antunes dos Santos Gomes1, Fabiana de Oliveira Yamashita1, Júlia Gabriela Ramos

Passos1, Juliana Félix-Silva2, Jacinthia Beatriz Xavier Santos1, Manoela Torres-Rêgo1, Rony

Lucas da Silva Viana3, Lucas Alighieri Neves Costa Batista3Hugo Rocha3, Arnóbio Antônio da

Silva-Júnior1, Matheus de Freitas Fernandes-Pedrosa1

1Laboratório de Tecnologia & Biotecnologia Farmacêutica (TecBioFar), Faculdade de Farmácia, Universidade

Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Natal, RN, Brazil 2UNIFACEX - Centro Universitário Facex, Natal, RN, Brazil 3Departamento de Bioquímica, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Natal, RN, Brazil

* Corresponding author. Av. Gal. Cordeiro de Farias, s/n, Petrópolis, CEP 59012-570, Natal, RN, Brazil. Tel: + 55 84

33429820. Fax: + 55 84 33429822.

Abstract. Accidents caused by venomous animals are a serious public health problem. In Brazil, most

accidents are associated with snakes of the genus Bothrops and the scorpion of the genus Tityus. Currently,

the main available treatment is the antivenom serum therapy, which has some limitations, such as inability

to neutralize local effects, risks of immunological reactions, high cost and difficult access in some regions.

In this context, the search for new complementary alternatives to treat venomous animals is relevant.

Jatropha mollissima (Pohl) Baill., (Euphorbiaceae), a medicinal plant popularly known in Brazil as "pinhão

bravo" is very used in folk medicine as antiophidic and anti-inflammatory. Given the relevance of systemic

effects of B. jararaca venom and T. serrulatus venom envenoming, the aim of the present work was

evaluate the inhibitory efficacy of aqueous extract from leaves of J. mollissima upon systemic effects

induced by these venoms. The effect of oral treatment with aqeous extract upon hematological, hemostatic,

biochemical alterations and oxidative stress in response to B. jararaca vemom injection was evaluated in

mice; and pulmonary edema, biochemical alterations and oxidative stress produced in response to T.

serrulatus venom. Extract reduced significantly the effect of venom upon fibrinogen, platelets and activated

partial thromboplastin time (APTT), indicating the action of extract upon hemostatic effects of B. jararaca

venom. The extract also inhibited B. jararaca venom effects on leukocyte blood series, which indicates

benefitial effects upon inflammatory processes. The extract was also able to reduce significantly the renal,

hepatic, muscular and pancreatic toxicity of B. jararaca venom, by reverting the effects upon serum levels

of urea, uric acid, alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), lactate

dehydrogenase (LDH) and amylase. The extract inhibited the hepatic and renal oxidative stress of B.

jararaca venom, indicating a possible antioxidant action. In addition, pulmonary edema induced by T.

serrulatus venom was inhibited significantly by extract. Myeloperoxidase and IL-6 and IL-1β cytokines

were reduced in the presence of extract, indicating benefitial effects upon inflammatory processes. The

extract was also able to reduce significantly the renal, hepatic, muscular and pancreatic toxicity of T.

serrulatus venom, by reverting the effects upon serum levels LDH, creatine kinase (CK), urea, creatinine,

AST and amylase suggesting an inhibition of hepatic, renal and pancreatic damage. The extract inhibited

the hepatic and renal oxidative stress of T. serrulatus venom, indicating a possible antioxidant action. In

vitro, J. mollissima was able to inhibit hemolysis and cytotoxicity against MDCK cells, indicating that the

absence of toxicity and, finally, the extract showed antioxidant activity in different models. Thus, it is

concluded that the extract of J. mollissima posseses compounds able of decresae systemic alterations

induced by B. jararaca and T. serrulatus, indicating the potentiality of this vegetal species as a source of

http://unifacex.com.br/

118

Anexo

bioactive molecules against bothropic and scorpionic venoms.

Keywords: Bothrops jararaca, Tityus serrulatus, Jatropha mollissima, atividade antiofídica, Anti-scorpion

activity, systemic effects, antioxidante activity.

País: Irlanda

ISSN: 0378-8741

Fator de impacto (2016): 2,981

Qualis CAPES (Ciências Biológicas II): B1

Homepage: https://www.journals.elsevier.com/journal-of-

ethnopharmacology

119

Anexo

1.2 ARTIGOS ACEITOS

120

Anexo

121

Anexo

122

Anexo

123

Anexo

124

Anexo

1.3 ARTIGOS PARA A SUBMISSÃO

125

Anexo

126

Anexo

127

Anexo

128

Anexo

Documents

POTENCIAL DA ESPÉCIE VEGETAL Jatropha mollissima (Pohl ... · redução dos níveis séricos de LDH, creatina quinase (CK), Ureia, creatinina, AST e amilase induzidas pela peçonha