BMM 280 Microbiologia Bsica Curso de Medicina - 2009

Roteiros das aulas prticas de Virologia Prtica 4: Diagnstico rpido das viroses

Os mtodos de diagnstico laboratorial para identificao de vrus podem ser classificados em clssicos e rpidos. Os mtodos clssicos so baseados no isolamento de vrus em sistemas celulares, seguido de tipagem dos vrus por antisoros especficos. A identificao de um vrus pelos mtodos clssicos leva no mnimo duas semanas, quando no meses. Estes mtodos so muitos importantes para a pequisa, ou para estudos epidemiolgicos mas tm pouca utilidade no diagnstico clnico.

Os mtodos de diagnstico rpido so importantes em situaes nas quais a etiologia de uma doena viral deve ser determinada com rapidez e preciso, para a interveno imediata do clnico, ou na preveno de doenas, como na triagem de sangue para reposio. Apresentam grande utilidade na identificaao de infeces por vrus que no podem ser facilmente cultivados, como por exemplo os vrus da hepatite A, hepatite B, HIV, rotavrus, entre outros. No diagnstico rpido, vrus, antgenos virais, anticorpos do tipo IgM ou IgG so detectados diretamente em amostras provenientes dos pacientes.

A microscopia eletrnica foi a primeira tcnica a ser aplicada no diagnstico rpido dos vrus. importante para o estabelecimento da etiologia de vrias doenas, entre elas a varola que, apesar de erradicada, ainda deve ser tratada como uma emergncia virolgica em casos suspeitos, devido sua alta taxa de contgio. uma tcnica utilizada na identificao de uma srie de vrus causadores de gastrenterites infantis, como os rotavrus e adenovrus, que so de dficil cultivo. As principais limitaes da microscopia eletrnica so: a disponibilidade do microscpio, aparelho caro e s existente em centros mais especializados e a dificuldade em se examinar um grande nmero de amostras.

Existem diversas tcnicas laboratoriais que podem ser utilizadas no diagnstico rpido das viroses. Entre elas podemos citar: a reao de fixao do complemento, a aglutinao de partculas de ltex, a hemaglutinao, a reao de imunofluorescncia, o radioimunoensaio, os ensaios imunoenzimticos e mais recentemente, a reao de PCR.

As tcnicas mais utilizadas so: - a reao de hemaglutinao: aplicada no diagnstico de vrus do sarampo, da rubola, da influenza,

etc, ou para a deteco de anticorpos contra estes vrus; - o ensaio imunoenzimtico: utilizado para deteco de antgenos virais ou anticorpos contra

hepatites, rotavrus, adenovrus, citomegalovrus, HIV, etc. - a PCR: importante na determinao da carga viral do HIV, mas tem sido padronizada para a

deteco de inmeros vrus.

Diagnstico laboratorial para HIV O HIV um vrus da famlia Retroviridae, gnero Lentivirus.

A partcula viral esfrica, envelopada, medindo de 80 a 100 nm de dimetro. O core interno tem morfologia icosadrica, sendo constitudo pelo cpside, em forma de cone, e pela matriz, de morfologia esfrica. O cpside formado pela protena p24 e abriga o genoma viral. A matriz formada pela proteina p17. O genoma viral constitudo por duas cpias de RNA de fita simples, de polaridade positiva. A cada fita de RNA encontra-se associada a transcriptase reversa (RT 66 kDa) e a integrase (IN 32kDa). O genoma viral encontra-se recoberto pela protena de nucleocpside (p7). O capsdeo abriga, ainda, a protease (p11). O envoltrio lipoprotico apresenta duas protenas glicosiladas, sendo a mais externa a gp120, utilizada no reconhecimento do receptor e a mais interna a gp41, uma protena transmembrana que atua como protena de fuso. A antigenicidade destas protenas permite o diagnstico da infeco baseado na procura dos anticorpos especficos contra o vrus, seja por ensaio imunoenzimtico ou atravs da reao de western-blot. A resposta imune varia de acordo com a carga viral ou a imunocompetncia do hospedeiro.

O diagnstico da infeco por HIV mais frequentemente realizado pela deteco do anticorpo especfico presente no soro do paciente. O ensaio imunoenzimtico (ELISA- Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) utilizado para a triagem de rotina. Detecta anticorpos contra uma ou mais protenas virais, mas pode fornecer resultados falso-positivos. Todo resultado positivo pelo ELISA precisa ser confirmado por um ensaio mais especfico, como a reao de Western-blot, que determina os anticorpos especficos contra cada uma das protenas virais. Recentemente, o desenvolvimento de ELISAS de 4 gerao, que detectam anticorpos anti HIV e protenas do HIV proporcionaram uma deteco mais precoce da soro-converso, reduzindo o perodo da janela imunolgica, bem como a diminuram a ocorrncia de resultados falso positivos.

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Exerccio prtico 1: Determinao de anticorpos anti-HIV atravs do ensaio

imunoenzimtico.

Observao importante: Esta aula uma simulao dos testes utilizados em rotina e NENHUM material infeccioso ser manipulado. Entretanto deve-se tomar CUIDADO ao manipular alguns dos reagentes (OPD-ortofenildiamina e o cido sulfrico 2M) usados durante o experimento.

1. Uma microplaca foi sensibilizada com uma mistura de antgenos de HIV: protenas p24 e gp160

(precursora da gp120 e da pg41) purificadas, obtidas a partir de vrus cultivados em clulas. Esta

mistura de antgenos virais foi distrubuda nas fileiras A, C, E e G da placa.

2. Como controle de especificidade foram colocados antgenos celulares, obtidos de clulas no

infectadas, nas fileiras B, D, F e H. 3. As amostras de soro dos pacientes (301 a 306), bem como as amostras de soro controle positivo e

soro negativo foram adicionadas, em duplicata, s cavidades contendo antgenos virais, assim como, s cavidades controle celular (100 l por cavidade), utilizando para cada amostra 4 cavidades, conforme o esquema da placa abaixo.

4. A microplaca foi incubada por 90 min. a 37C. 5. A seguir, a placa foi lavada, por 3 vezes, com tampo fosfato (PBS-Tween 20). 6. Para detectar a presena dos anticorpos, foram adicionados a cada cavidade 100 l de soro de

cabra anti-IgG humana, conjugado peroxidase. 7. A microplaca foi incubada por 60 min. a 37C. 8. A seguir, a placa foi lavada, por 3 vezes, com tampo fosfato.

Etapas a serem executadas durante a aula: 9. Adicionar a mistura substrato + cromgeno, gua oxigenada + OPD (ortofenilenodiamina) no volume

de 100 l (2 gotas) por cavidade utilizada. 10. Incubar temperatura ambiente at o desenvolvimento de colorao amarela nos controles

positivos. 11. Para parar a reao, adicionar 50 l (1 gota) de cido sulfrico 2M a cada cavidade. 12. So consideradas positivas as amostras que apresentarem colorao amarelo-marron.

Princpio do teste: sanduche indireto ELISA

Ag. HIV Ac. Anti-HIV Conjugado OPD Bloqueio

90 a 37C 60 a 37C 15 a 20-25C Leitura

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

12 A

B

controle

positivo

controle

negativo

301

302

303

304

305

306 G

H

C

D

E

F

+ H2SO4

Exerccio prtico 2: Determinao de anticorpos anti-HIV atravs da reao de Western-blot

(Demonstrao). A tcnica de Western blot tem sido utilizada na caracterizao do perfil antignico do HIV e

na descrio da resposta imune para este vrus em pessoas expostas ou infectadas. Devido a seu alto custo mas grande sensibilidade, comumente utilizada apenas como teste confirmatrio, sendo o ensaio imunoenzimtico (ELISA) utilizado rotineiramente como teste de triagem.

O princpio da reao o mesmo do ensaio imunoenzimtico, mas na reao Western-blot as protenas virais so separadas pelo sua massa (kDa) em tiras de nitrocelulose. O preparo destas fitas, contendo as protenas virais, feito pelas indstrias produtoras de kits de diagnstico. No laboratrio clnico a reao feita a partir da adio do soro do paciente.

1. O HIV cultivado da linhagem celular H9 de linfcitos T. O vrus parcialmente purificado inativado por tratamento com psoralen e luz utravioleta e rompido pela ao de detergente.

2. Os extratos proticos so aplicados num gel de SDS-poliacrilamida.

3. As protenas virais so separadas de acordo com o peso molecular, atravs de eletroforese. 4. As protenas so transferidas do gel para uma membrana de nitrocelulose ou nylon, em cuba de

transferncia, por aplicao de uma corrente eltrica. 5. A membrana ento lavada, bloqueada (com protenas, ex: leite, para minimizar a ligao

inespecfica de imunoglobulinas), cortada em fitas e acondicionada.

No momento do teste: 6. Para cada amostra de soro utilizada uma fita em separado. As fitas de nitrocelulose so

incubadas na presena do soro ou plasma dos pacientes, assim como, com os soros controles, por 2 hs a 37

oC.

7. A seguir, as fitas so lavadas, por 3 vezes, com tampo fosfato (PBS-Tween 20). 8. Para detectar a presena dos anticorpos, adicionado soro detector: soro de cabra anti IgG

humana, conjugado peroxidase e as fitas so incubadas por 30 min. a 37oC, e lavadas.

9. A reao revelada com soluo de substrato: tampo citrato contendo H2O2 e 4-cloro-1-naftol (cromgeno), por 10 a 15 minutos temperatura ambiente, e lavadas com gua.

10. Para leitura da reao feita analise das bandas proteicas reveladas, e a presena ou ausncia de anticorpos para HIV determinada pela comparao de cada fita de nitrocelulose teste com os padres de bandas dos controles positivos Cada banda visualizada na fita teste deve ser relacionada com um peso molecular das protenas virais, baseando-se em sua posio e por comparao com a fita contendo o controle positivo altamente reativo (forte).

Resultados do Western-blot

Exemplos: Fortemente positivos Fracamente positivos Negativo

Padro observado Resultado

Nenhuma banda presente Negativo.

Uma bandas presente em gp41 ou gp120/160, e a banda p24 presente. Normalmente gp 120/160 e gp 41 apresentam-se difusas.

Positivo para HIV-1.

Bandas presentes com padro diferente do esperado. Indeterminado.

p55

p51

p39

gp160

gp120

gp41

p24

p18

p65

Banda especfica de HIV-2

Controle de soro

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QUESTES PARA O RELATRIO

Parte 1: 1. No ELISA quais os resultados obtidos para os controles positivos e negativos? 2. Qual o resultado obtido para as 6 amostras testadas? 3. Considerando estes resultados quais as amostras que devero ser submetidas a testes

confirmatrios (Western-blot)?

Parte 2. 1. Quais os diagnsticos finais das amostras analisadas?