Produção de proteínas Produção de proteínas recombinantes em microrganismosrecombinantes em microrganismos

Prof. Fabricio Rochedo Conceiçãofabricio.rochedo@ufpel.edu.br

05 de abril de 2011

Graduação em BiotecnologiaDisciplina de Biotecnologia Microbiana II

Proteína recombinante

Proteína produzida a partir da expressão de uma moléculade DNA recombinante em um sistema

de expressão adequado.

DNA recombinante

Molécula de DNA produzida a partir da combinação de seqüências de DNA provenientes de diferentes fontes.

Por que produzir e purificar proteínas recombinantes?

Estudos bioquímicos

Determinação da estrutura 3D

Aplicações biotecnológicas - Terapia - Vacinas - Diagnóstico...

Alternativa para as seguintes limitações:

Quantidade

Dificuldade de purificação a partir do tecido original

Contaminação (príons, vírus, oncogenes...)

Estabilidade: proteínas recombinantes podem ser engenheiradas

Processo completamente controlado

Alguns microrganismos não são cultiváveis in vitro ou são fastidiosos

Mycoplasma hyopneumoniae

Pneumonia Micoplásmica Suína

Clostridium sp.

Botulismo

Enterite necrótica das aves

Enterite suína

Toxina botulínica

Sistemas de expressão heteróloga

***Animais e plantas

Produção de proteínas recombinantes em bactérias

Depois do Homo sapiens, a bactéria E. coli é o organismo mais estudado!

Escherichia coli Bacillus subtilis

Relação volume meio – capacidade do frasco

0,2 (20%)

Inóculo – 5 a 10%

Algumas companhias que comercializam vetores de expressão

http://www.promega.com

http://www.neb.com

http://www.stratagene.com

http://www.invitrogen.com

Vantagens Desvantagens

Genética e fisiologia bem conhecidas Não faz certas modificações pós-traducionais

Enorme variedade de vetores disponíveis

Atividade biológica pode diferir da proteína natural

Fácil controle da expressão gênica A bactéria apresenta alto conteúdo de endotoxinas

Facilidade de manutenção em laboratório Falta de um mecanismo de secreção

Alta produção de proteínas heterólogas Formação de corpos de inclusão

Expressão heteróloga em E. coli

*** Alternativas

-Minimizar a proteólise-Maximizar a expressão-Minimizar “vazamento” de expressão (importante para expressão de proteínas tóxicas)-Facilitar o folding-Solubilidade

Vantagens Desvantagens

Não patogênico (sem LPS); GRAS Proteases extracelulares

Codon usage adequado Plasmídeos instáveis

Possibilidade de secreção da proteína Expressão geralmente menor que E. coli

Biologia Molecular e Fisiologia conhecidas

Alta produção de proteínas heterólogas

Expressão heteróloga em B. subtilis

*** Alternativas

LEVEDURASLEVEDURAS

Multiplicação rápida

Manipulação simplificada

Altas densidades celulares

Unicelulares

Não Patogênicas (GRAS)

Fisiologia e genética bem conhecida

Realiza modificações pós-traducionais

Promotores “fortes” (constitutivos ou induzíveis)

PRINCIPAIS ESPÉCIES UTILIZADAS

PRINCIPAIS ESPÉCIES UTILIZADAS

Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris Pichia methanolica Hansenula polymorpha (Pichia augusta) Kluyveromyces lactis Schizosaccharomyces pombe Schwanniomyces occidentalis Yarrowia lipolytica

DESVANTAGENSDESVANTAGENS

Hiperglicosilação – mais de 100 resíduos de manose

Alteração da antigenicidade da proteína

Alteração da estrutura 3D

Produção de Etanol – tóxico

Falha na secreção de proteínas

Alternativa: outras espécies de leveduras

PROTEÍNAS EXPRESSASPROTEÍNAS EXPRESSAS

Vacinas Antígeno do vírus da Hepatite B (1986)Proteína de envelope do HIV-1

Diagnóstico Proteína do vírus da Hepatite CAntígenos do HIV-1

Agentes terapêuticos humanos

InsulinaGM-CSFFator de crescimentoSoro albumina humana

Metilotrófica – metanol como fonte única de

carbono

Glicosilação mais estável e semelhante a de

mamíferos

Fermentação pobre – não produz etanol e atinge

altas densidades celulares

Alta produtividade: até 12g de proteína

recombinante por litro de cultivo!

Desvantagens

Proteólise de proteínas secretadas

Poucos vetores disponíveis (Invitrogen)

Necessita o uso de fermentadores para atingir

alta densidade celular – no entanto não realiza

fermentação. Precisa de oxigênio!

METABOLISMO DO METANOLMETABOLISMO DO METANOL

Álcool Oxidase

Dois genes: AOX1 e AOX2

AOX1 é mais expresso e altamente induzido na

presença de metanol

Enzima tem baixa afinidade por metanol,

formando formaldeído. Compensa produzindo

grande quantidade de AOX (~30% do total de prot)

METABOLISMO DO METANOLMETABOLISMO DO METANOL

METABOLISMO DO METANOLMETABOLISMO DO METANOL

Vantagem

Fonte de carbono de custo reduzido

Só passa a ser utilizado quando já há alta

densidade celular

Desvantagem

Inflamável e tóxico

Controle rígido dos níveis de oxigênio (~30%)

FENÓTIPOSFENÓTIPOS

Mut = Metanol Utilization

Mut+ - crescimento rápido em metanol

MutS – crescimento lento em metanol

CEPASCEPAS

CLONAGEM - INTEGRAÇÃOCLONAGEM - INTEGRAÇÃO

PROTEÍNAS EXPRESSAS EM PICHIA

PROTEÍNAS EXPRESSAS EM PICHIA