Bioqumica Geral e Experimental 2

Prtica 7

Respirao Celular em

Leveduras: Transporte de

Eltrons

Data de realizao: 14/05/2015

Data de entrega: 21/05/2015

Docente: Denise Bevilaqua

Alunos: Gabriel Martins de Alvarenga

Samir Prioto Tayar

Weslei Bruno Botero

1) Explique cada etapa do procedimento para isolamento das mitocndrias de

leveduras.

R: O procedimento iniciado com a suspenso das clulas de levedura em gua

gelada (para evitar degradaes), seguida de uma homogeneizao no vrtex e

centrifugao por 15 minutos a 4000 rpm, esta etapa tem objetivo de lavar as clulas de

levedura, pois como so produzidas industrialmente, podem ter muitas impurezas.Aps

repetir o processo de lavagem, a levedura foi suspendida em soluo de sorbitol, para

preservar o equilbrio osmtico.

Aps a obteno da suspenso de levedura limpa, ela foi colocada em almofariz

com areia para macerao em benho de gelo. Esta etapa tem como objetivo quebrar a

parede celular da levedura e liberar as mitocndrias que estavam na clula para a

soluo. O almofariz foi limpo com sorbitol para se aproveitar todos os resduos da

macerao.

Aps obter os resduos da macerao, a soluo foi centrifugada a 4000 rpm por

5 minutos a 4C, nesta etapa os detritos celulares e a areia foram sedimentados e

separados da soluo contendo as mitocndrias (que no sedimentaram, pois a

centrifugao no tinha fora G suficiente para isso). A temperatura de 4C importante

para se evitar a degradao da mitocndria pelo oxignio e por enzimas.

O sobrenadante obtido na centrifugao foi submetido a outro processo de

centrifugao, mas desta vez a 28.000xg por 30 minutos a 4C, esta etapa consegue

sedimentar as mitocndrias que estavam presentes na soluo pois a fora g muito

grande. Aps a centrifugao o sobrenadante foi descartado e o sedimentado que

continha as mitocndrias foi ressuspendido em banho de gelo para evitar degradao.

2) Explique os resultados sobre o efeito dos indicadores de oxido-reduo

(Procedimento 3), comparando a colorao observada em cada tubo.

R: A explicao para os resultados do efeito dos indicadores de xido-reduo

pode ser feita baseada na anlise da seguinte figura que relaciona todos os componentes

presentes na transferncia de eltrons da cadeia respiratria da levedura:

Observa-se que ao adicionar o indicador MTT (Metil tetrazlio) na presena de

mitocndrias, ouve a reduo do mesmo indicado pela mudana de colorao de

amarelo (forma oxidada) para uma tonalidade verde escura muito intensa (forma

reduzida).

Essa observao experimental, juntamente com a informao de que o potencial

de reduo deste indicador de -0,12V, permite-nos fazer a afirmao de que o mesmo

inibe a transferncia dos eltrons do FMN para o centro de ferro-enxofre, visto que o

potencial de reduo para que este processo ocorra superior ao potencial necessrio

para a reduo MTT.

J quando analisamos o efeito da adio do indicador DCPI

(Diclorofenolindofenol), observa-se que a soluo tambm sofre uma mudana de

colorao quando comparada com seu branco, pois este ltimo apresenta colorao azul

(forma oxidada), enquanto o tubo contendo mitocndrias mostra-se com ausncia de

colorao (forma reduzida).

Assim como no caso do indicador MTT, o que ocorre que um pouco mais adiante

no processo de transferncia de eltrons da cadeia respiratria da levedura, o indicador

de DCPI inibe a etapa na qual o eltron passa de um centro ferro-enxofre para o

citocromo c1, visto que o potencial de reduo deste indicador, +0,22V, inferior ao

potencial de reduo necessrio para a reduo do citocromo c1, que de +0,23V.

Por fim, observa-se que para os tubos contendo o indicador ferricianto, uma

mudana de colorao ocorre, visto que a forma oxidada do mesmo indicada na figura

1 pela colorao levemente amarelada, seguida da comparao com um tubo de ensaio

onde encontram-se as mitocndrias, evidenciando a mudana de colorao que vai do

amarelo (forma oxidada) para incolor (forma reduzida). Novamente, pode-se atribuir esta

mudana de colorao devido a inibio da transferncia de eltrons na sequncia

representada na figura 1 da cadeia respiratria da levedura. O indicador de ferrocianina,

por possuir um potencial de reduo inferior (+0,38V) ao potencial de reduo do

citocromo c2 (+0,55), inibe tal processo fazendo com que todos os eltrons passem a

reduzi-lo.

3) Pelos resultados obtidos no procedimento 4, explique o ponto de ao da

azida e do malonato na fosforilao oxidativa.

R: Primeiramente vamos avaliar a inibio que as azidas provocam na cadeia

respiratria de eltrons.

As azidas causam inibio no grupamento prosttico dos citocromos c e b

presentes no complexo citocromo-oxidase (Complexo IV) da cadeia de transporte de

eltrons. Desse modo, aps a utilizao de azida nos trs primeiros tubos, a

transferncia de eltrons da ubiquinona para o citocromo c deve ser inibida.

Essa transferncia ocorre em uma etapa posterior reduo dos indicadores, de

modo que o ferricianeto, DCPI e MMT apresentao a colorao reduzida.

O malonato pode inibir especificamente a enzima succinato-desidrogenase de

modo competitivo, pelo fato de esse composto se mostrar estruturalmente parecido

com o substrato e tambm conseguir se ligar ao stio ativo dessa enzima.

A succinato-desidrogenase uma enzima presente na membrana mitocrondrial

interna e participa do ciclo do cido ctrico convertendo uma molcula de succinato

em fumarato, resultando na reduo do transportador de eltrons FADH2.

Essa enzima mostra-se importante tambm na cadeia transportadora de eltrons,

devido ao fato de que promove a passagem de eltrons para uma molcula de FAD

presente dentro do complexo II, de modo que esse eltron posteriormente doado a

uma ubiquinona.

Como temos uma ao competitiva, espera-se uma menor quantidade de

succinato produzido nessa etapa e consequentemente a passagem de eltrons com

uma velocidade mais lenta. Desse modo, os indicadores utilizados para a verificao

do efeito do malonato devero apresentar coloraes intermedirias, indicando uma

reduo em pequena quantidade.

Devido a ao do malonato, espera-se uma menor quantidade de succinato sendo

oxidada no complexo II da cadeia transportadora de eltron, o que deve resultar em

colorao intermedirias para os trs indicadores utilizados.

Desse modo, devido a ao do malonato observou-se uma pequena

oxidao do ferricianeto, apresentando colorao ainda levemente amarelada.

Para o DCPI e o MMT, observaram-se coloraes intermedirias entre a forma

reduzida e oxidada.

4) Observando a figura presente no roteiro, explique a diferena entre os

desacopladores e inibidores na respirao celular (O2 consumido e a ATP

sintetizado)

R: Inibidores so espcies que bloqueiam uma determinada reao ou enzima da

cadeia de transporte de eltrons e da fosforilao oxidativa. Desse modo, aps a adio

de um inibidor no meio, temos que a sntese de ATP e a produo de O2 param ao mesmo

tempo.

Desacopladores so substncias que eliminam a relao entre a produo de O2

e a sntese de ATP, permitindo cada um desses produtos se formarem

independentemente.

No caso do grfico apresentado no roteiro, verifica-se que aps a adio de uma

espcie inibidora (oligomicina) a produo de ATP cessada. Isso ocorre pelo fato de

que esse inibidor mostra-se especfico para a ATP-Sintase. Devido a relao entre os

dois sistemas, a quantidade de oxignio tambm se mantm constante.

Aps a adio de uma espcie descopladora, entretanto, a produo de oxignio

continua normalmente.