Preparação dos extratos de proteases vegetais

Foi utilizado 100 g de mamão verde, sem casca + 100 ml de solução de tampão fosfato

- (extrato que tem como fonte enzimática a papaína) e 100 g de abacaxi + 100 ml de solução

de tampão fosfato - (extrato que tem como fonte enzimática a bromelina). Cada uma das

soluções foi homogeneizada e filtrada para a obtenção do extrato.

Foi preparada uma solução de 10 ml de coalho comercial (renina), utilizando 0,1 g de coalho

em pó.

Procedimento III: Verificação da ação de diferentes enzimas proteolíticas na coagulação

da caseína do leite

a) Tubo 1.

8 ml de leite (10%)

2,5 ml de CaCl2 (0,5%)

Incubado em banho-maria a 40ºC por 10 minutos para manter a temperatura, após

isso, foi acrescentado 2,5 ml de papaína.

Esse tubo foi mantido em repouso (fixo), ou seja, não foi agitado.

Resultado: Não houve coagulação.

b) Tubo 2.

8 ml de leite (10%)

2,5 ml de CaCl2 (0,5%)

Incubado em banho-maria a 40ºC por 10 minutos para manter a temperatura, após

isso, foi acrescentado 2,5 ml de papaína.

Esse tubo não foi mantido fixo, foi agitado vagarosamente em tempos alternados.

Resultado: Não houve coagulação.

c) Tubo 3.

8 ml de leite (10%)

2,5 ml de CaCl2 (0,5%)

Incubado em banho-maria a 40ºC por 10 minutos para manter a temperatura, após

isso, foi acrescentado 2,5 ml de bromelina.

Esse tubo foi mantido em repouso (fixo), ou seja, não foi agitado.

Resultado: A reação de coagulação iniciou-se após 8 minutos, porém a consistência

ainda não estava completamente formada.

d) Tubo 4.

8 ml de leite (10%)

2,5 ml de CaCl2 (0,5%)

Incubado em banho-maria a 40ºC por 10 minutos para manter a temperatura, após

isso, foi acrescentado 2,5 ml de bromelina.

Esse tubo não foi mantido fixo, foi agitado vagarosamente em tempos alternados.

Resultado: Após a adição da bromelina, a reação de coagulação iniciou-se em 2

minutos.

e) Tubo 5.

8 ml de leite (10%)

2,5 ml de CaCl2 (0,5%)

Incubado em banho-maria a 40ºC por 10 minutos para manter a temperatura, após

isso, foi acrescentado 2,5 ml de coalho.

Esse tubo foi mantido em repouso (fixo), ou seja, não foi agitado.

Resultado: Com 4 minutos a consistência do coágulo apresentou-se mais formada que

a bromelina mantida na mesma condição (fixa).

f) Tubo 6.

8 ml de leite (10%)

2,5 ml de CaCl2 (0,5%)

Incubado em banho-maria a 40ºC por 10 minutos para manter a temperatura, após

isso, foi acrescentado 2,5 ml de coalho.

Esse tubo não foi mantido fixo, foi agitado vagarosamente em tempos alternados.

Resultado: A reação de coagulação iniciou-se com 2 minutos e 35 segundos.

g) Tubo 7.

(Tubo Controle)

8 ml de leite (10%)

2,5 ml de CaCl2 (0,5%)

2,5 ml de água

Resultado: Não houve coagulação.

Observações:

No tubo 1 e no tubo 2 não houve coagulação, isso pode ter ocorrido pela deficiência na

quantidade de enzimas para iniciar a reação de coagulação, já que para fazer o extrato foi

utilizado mamão verde sem casca para a obtenção da enzima proteolítica papaína (E.C.

3.4.22.2).

No tubo 3, 4, 5 e 6 a coagulação que era esperada foi atingida. A enzima coagulante

atuou sobre a caseína do leite em presença de íons de cálcio e iniciou a reação de coagulação

que engloba outros componentes do leite (água, gordura, sais, proteínas e etc.). A adição de

CaCl2 é importante pois sua principal função é proporcionar ao coágulo uma característica de

resistência.

No tubo 7, que foi caracterizado como tubo controle, foi adicionado água no lugar de

uma das enzimas proteolíticas, consequentemente não houve coagulação porque não tinha

enzimas para iniciar a reação de coagulação.

Procedimento IV: Efeito da concentração de coalho na coagulação do leite

Procedimento V: Efeito da concentração de cálcio na coagulação do leite

a) Tubo 1

8 ml de leite em pó desnatado a 10%

2 ml de Cacl2 de concentração de 0,15%

2 ml de solução renina

Temperatura: 40oC durante 10 minutos

Resultado: Tempo de início da coagulação: 35 minutos

b) Tubo 2

8 ml de leite em pó desnatado a 10%

2 ml de Cacl2 de concentração de 0,25%

2 ml de solução renina

Temperatura: 40oC durante 10 minutos

Resultado: Tempo de início da coagulação: 17 minutos

c) Tubo 3

8 ml de leite em pó desnatado a 10%

2 ml de Cacl2 de concentração de 0,5%

2 ml de solução renina

Temperatura: 40oC durante 10 minutos

Resultado: Tempo de início da coagulação: 5 minutos

d) Tubo 4

8 ml de leite em pó desnatado a 10%

2 ml de Cacl2 de concentração de 0,75%

2 ml de solução renina

Temperatura: 40oC durante 10 minutos

Resultado: Tempo de início da coagulação: 25 minutos

Observações:

O início da coagulação no tubo IV apresentou o tempo fora do padrão normal. A

explicação para isso é que ao submeter a 40oC não agitaram o tubo após introduzir a renina

antes do aquecimento e agitando minutos após o aquecimento quebrando suas ligações e,

assim, rompendo sua estrutura ocasionando numa coagulação de tempo mais demorado do

que o considerado o normal, pois quanto maior a concentração de Cacl2 mais rápido é o tempo

de coagulação.

e) Tubo 5

8 ml de leite em pó desnatado a 10%

2 ml de Cacl2 de concentração de 1%

2 ml de solução renina

Temperatura: 40oC durante 10 minutos

Resultado: Tempo de início da coagulação: 1 minuto e 37 segundos

f) Tubo 6 (controle)

8 ml de leite em pó desnatado a 10%

2 ml de água destilada

2 ml de solução renina

Temperatura: 40oC durante 10 minutos.

Resultado: Não houve coagulação

No processo de coagulação do leite, a presença de cálcio solúvel, sob a forma

ionizada, com duas cargas positivas, é essencial. O cálcio estabelece uma ponte entre as

micelas de para-caseína, formando uma rede, a coalhada. As caseínas alfa e beta são sensíveis

ao cálcio e se insolubilizam (coagulam) em sua presença; no leite estão proteínas do cálcio

pela capa-caseína, que as envolve, como um colóide protetor. A renina hidrolisa a capa-

caseína e expõe as outras frações ao cálcio solúvel na fase aquosa, provocando a coagulação

do leite. O coalho predispõe o leite à coagulação, mas para que esta se dê, deve ser

complementada pela ação do cálcio. Como o tratamento térmico do leite (pasteurização) uma

pequena parte do cálcio é insolubilizado (precipitação), adicionando-se cálcio complementar

ao leite, sob a forma de cloreto de cálcio. O cloreto de cálcio proporciona a formação de uma

coalhada mais firme e compacta, evita a perda de sólidos no soro, reduz o tempo de

coagulação e melhora a expulsão do soro. O cálcio reage com os fosfatos do leite,

transformando-os em fosfato tricálcico, liberando prótons H+ no leite, provocando um ligeiro

abaixamento do pH.

Observou-se que diferentes concentrações de cálcio são determinantes no processo de

coagulação do leite, pois influencia na velocidade de coagulação. Ao adicionar cálcio, na

forma de cloreto de cálcio, em diferentes concentrações e submetendo-os ao aquecimento

nota-se que quanto maior a concentração de cloreto de cálcio mais ligeira é a reação

promovendo, assim, coágulo em tempos consideravelmente rápidos, pois o processo foi

submetido na sua velocidade máxima que é de 40ºC e nessa temperatura a coagulação ocorre

demasiadamente rápida e em temperaturas mais altas retêm ligeiramente mais cálcio.

Gráfico:

Observações:

O tempo de coagulação do tubo IV (0,75%) não foi acrescentado no gráfico, pois o

mesmo apresentou tempo fora do padrão normal. O tempo de coagulação foi de 25 minutos, a

velocidade de reação deveria ter sido maior, ou seja, a reação de coagulação deveria ter

iniciado antes desse tempo. Não acrescentando esse valor, é possível obter uma linha de

tendência com os outros valores, como mostra o gráfico acima.

Procedimento VI: Efeito da temperatura na atividade da renina

Tubo I: 8 ml de leite em pó desnatado a 10%

2 ml de Cacl2 de concentração de 0,5%

2 ml de solução de renina

Temperatura ambiente: 30oC durante 10 minutos

Não houve coagulação

Tubo II: 8 ml de leite em pó desnatado a 10%

2 ml de Cacl2 de concentração de 0,5%

2 ml de solução de renina

Temperatura: 40oC durante 10 minutos

Tempo de início da coagulação: 05 minutos e 52 segundos

Tubo III: 8 ml de leite em pó desnatado a 10%

2 ml de Cacl2 de concentração de 0,5%

2 ml de solução de renina

Temperatura: 60oC durante 10 minutos

Tempo de início da coagulação: 05 minutos e 02 segundos

Tubo IV: 8 ml de leite em pó desnatado a 10%

2 ml de Cacl2 de concentração de 0,5%

2 ml de solução de renina

Temperatura: 80oC durante 10 minutos

Tempo de início da coagulação: 2 minutos

Tubo V: 8 ml de leite em pó desnatado a 10%

2 ml de Cacl2 de concentração de 0,5%

2 ml de solução de renina

Temperatura: 100oC durante 10 minutos

Tempo de início da coagulação: 25 segundos

Nesse processo o coalho natural, chamado de renina, é uma enzima proteolítica que

contém duas enzimas: a quimiosina e a pepsina. A primeira ação do coalho é provocar a

desestabilização das micelas de caseína rompendo a caseína kappa em um ponto determinado

de sua molécula, expondo as demais caseínas ao cálcio iônico presente no leite. A ação da

enzima gera um glicomacropeptídeo, proveniente da proteólise na fração kappa, mais as

demais frações de caseína, denominadas de paracaseínas, que irão formar o paracaseinato de

cálcio. O paracaseinato de cálcio formado se agrega em um só bloco reticular, tomando uma

aparência semi-sólida que é, então, o coágulo desejado. O segundo papel do coalho é

hidrolizar os enlaces peptídicos seguindo uma ordem específica que é característica da enzima

utilizada. Esta ação começa lentamente já na coagulação e continua durante a maturação do

queijo. A consistência do gel vai aumentando gradativamente, à medida que aumenta a rigidez

dos retículos de caseinato de cálcio, chegando a um ponto considerado ótimo. As condições

ótimas para ação do coalho é entre 40ºC, enquanto temperaturas inferiores a 10ºC não se

produz a coagulação.

Observou-se que quanto maior a temperatura menor o tempo de coagulação do leite,

ou seja, mais rápido formará coágulos. No tubo I submetido a uma temperatura de 30oC não

houve coagulação, pois não foi conduzida ao aquecimento no qual aceleraria o processo e nos

tubos II, III e IV apresentaram ordem decrescente nos valores da temperatura. No tubo V por

ser submetido a alta temperatura, 100oC, o tempo de coagulação durou segundos notando,

assim, o quanto a temperatura também interfere na coagulação.

Gráfico:

Observações:

O valor de 30°C não foi inserido no gráfico, pois não houve coagulação.

Referencias:

http://www.deag.ufcg.edu.br/rbpa/rev122/Art1221.pdf

http://www.lume.ufrgs.br/bitstream/handle/10183/26095/000756935.pdf?sequence=1

http://www.cca.ufscar.br/~vico/O%20LEITE%20E%20SEUS%20DERIVADOS.pdf

http://professor.ucg.br/SiteDocente/admin/arquivosUpload/8930/material/TCCFernand

aMorais%20%20PRODU%C3%87%C3%83O%20DE%20QUEIJOS%20GOUDA,%20GRU

Y%C3%89RE,%20MUSSARELA%20E%20PRATO.pdf