INTRODUÇÃO

Relatório da aula prática da Disciplina de Bioquímica Celular e

Metabólica realizada no dia 03 de setembro de 2010 sob a coordenação do

Professor Alexandre Manoel Kirilo Vergueiro Júnior, tendo como objetivo o

preparo do Tampão EDTA e TAE

TAMPÃO EDTA

FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

EDTA (do inglês Ethylenediamine tetraacetic acid) ácido

etilenodiamino tetra-acético é um composto orgânico que age como agente

quelante, formando complexos muito estáveis com diversos íons metálicos.

Entre eles estão magnésio e cálcio, em valores de pH acima de 7 e manganês,

ferro(II), ferro(III), zinco, cobalto, cobre(II), chumbo e níquel em valors de pH

abaixo de 7. O EDTA é um ácido que atua como ligante hexadentado, ou seja,

pode complexar o íon metálico através de seis posições de coordenação, que

são elas: através de quatro ânions carboxilato (-COO-), após a saída dos 4H+

dos grupos carboxílicos, e também através dos dois N.

EDTA é predominantemente sintetizado do 1,2-diaminoetano

(etilenodiamina), formaldeído (metanal), água e cianeto de sódio0. O trabalho

pioneiro sobre o desenvolvimento do EDTA foi realizado por Gerold

Schwarzenbach nos anos 1940.

Para descrever EDTA e suas várias formas protonadas, químicos usam

um acrônimo que distingue entre EDTA4−, a base conjugada que é o ligante, e

H4EDTA, o precursor do ligante.

É usado como descolorante para cabelos; pode ser também utilizado na

fabricação de pães e derivados na industria alimentícia. Também é usado

durante tratamento endodôntico por ter uma função quelante e retirar íons

cálcio (Ca2+). Essa afinidade com o cálcio, faz com que seja também utilizado

como anticoagulante.

PREPARO

MATERIAL UTILIZADO

1. 18,61g de Sal Dissódico (EDTA);

2. Ácido Clorídrico (HCl);

3. Hidróxido de Sódio (NaOH);

4. Becker de vidro;

5. Água destilada;

6. Bastão de Vidro;

7. Copo descartável;

8. Papel toalha;

9. pHmetro;

PROCEDIMENTOS

Foi solicitado o preparo do Tampão EDTA 0,5M em pH 8,0. O PM foi de

372,24, V= 100 ml e M= 0,5.

Fórmula:

Pesou-se 18,61g do sal dissódico (EDTA) em balança de precisão o qual

foi transferido para um Becker de 80 ml de capacidade, onde foi adicionada a

água destilada até a marca de 80 ml. Com o bastão de vidro foi necessário

misturar (mexer) a solução até a sua total homogeneização. Em seguida o

Professor apresentou o pHametro, aparelho que serve pare medir o pH de uma

solução e demonstrou a sua ulitização, através da calibração do aparelho para

pH neutro (pH 7) em uma solução com esse pH. Ao mergulhar o eletrodo na

solução constatou-se que esta apresentava pH 10, mas o ideal seria o pH 8.

Para que se obtivesse esse pH adicionou-se NaOH por algumas vezes,

agitando intensamente com o bastão de vidro afim de que a torne homogênea.

Nesse momento foi informado que se caso o pH ficasse abaixo do desejado

seria necessário adicionar HCl (Ácido Clorídrico), pois este diminui o pH

enquanto o NaOH (Hidróxido de Sódio) o eleva.

Finalmente a equipe obteve o pH 8.1, momento em que a solução foi

transferida para a proveta onde teve seu volume acrescido de água destilada

M = m → 0,5 = m → M = 18,6 P.W.V 372,24

até a marca de 100mL. Em seguida foram transferidos 10 ml da solução para

uma proveta de 10mL para uso posterior e o restante para uma garrafa âmbar.

PREPARO DO TAE

FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

Tampão TAE (tampão Tris-Acetato-EDTA) é uma solução tampão usada

em eletroforese em agarose, tipicamente para a separação de ácidos nucleicos

tais como o DNA e RNA. Ele é feito de tampão acetato da base Tris,

normalmente a pH 8.0, e EDTA, os quais sequestram cátions divalentes. TAE

tem uma mais baixa capacidade que TBE e facilmente pode se exaurir, mas

DNA de dupla cadeia linear migra mais rápido em TAE.

Tampão TAE é usado tanto como um tampão de corrida como em gel de

agarose. TAE tem sido usado em várias concentrações para estudar

mobilidade de DNA livre com e sem cloreto de sódio. Métodos em eletroforese

em gel em gradiente denaturado para análise de mutações em amplo espectro

têm sido também descritos.

TAMPÃO TAE (50X)

242 g TRIS base (2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol) (= 2 moles)

57,1 ml ácido acético glacial

100 ml de solução de EDTA dissódico (Na2 EDTA) 0,5 M (pH 8.0)

Água destilada até 1 litro

Para preparar solução a 0.5 M de Na2 EDTA (pH 8.0) adicionar 186.1 g

de etilenodiaminotetraacetato dissódico a 800 ml de água destilada. Agitar

vigorosamente. Ajustar o pH a 8,0 com hidróxido de sódio, NaOH (aprox. 20 g

de NaOH). Esterilizar por autoclavagem.

Observação: O sal dissódico do EDTA não irá permanecer em solução até o

pH da solução ser ajustado a aproximadamente 8,0 pela adição de NaOH.

MATERIAL UTILIZADO

1. 10 ml de EDTA 0,5M (produzido anteriormente);

2. 24,2g de TRIS;

3. 5,7 ml de Ácido Acético Glacial (Ácido Etanóico)

PROCEDIMENTOS

Foram medidos 5,7 ml de Ácido Acético Glacial na proveta, onde foram

adicionados 10 ml da solução EDTA. Nessa mesmo composto foi adicionado

Tampão TRIS (24,2g) e foi completado com água destilada até 60ml em um

Becker de capacidade 80ml. A solução foi misturada com bastão de vidro

durante o tempo necessário a sua total homogeinação que pôde ser observada

pela aparência translúcida. Até esse estágio foi necessário adicionar mais água

destilada até a marca dos 80ml, capacidade do Becker.

Na finalização a solução foi transferida para uma proveta para que fosse

aferida a marca de 100ml, a qual foi atingida com a adição de água destilada.

Então, cada equipe produziu 100ml, o que gerou o total de 400ml de

TAE concentrado que será utilizado na Eletroforese.